CN111272937B - 磷酸氯喹片中有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种磷酸氯喹片中有关物质的检测方法，通过紫外检测器串联电雾式检测器(CAD)，能够迅速、便捷、准确地计算各杂质的紫外相对响应因子，从而准确测定磷酸氯喹片中已知和未知杂质的含量，方法灵敏度高、专属性强从而实现对磷酸氯喹片有关物质有效控制。本发明方法包括以下步骤：供试品溶液的制备：取磷酸氯喹片，用流动相溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液；系统适应性溶液制备：取供试品溶液，置紫外灯照射，得到系统适应性溶液；对照溶液的制备：取供试品溶液，用流动相稀释，得到对照溶液；对照品溶液的制备：取磷酸氯喹对照品，用流动相溶解，作为对照品溶液；将系统适应性溶液、供试品溶液、对照溶液和对照品溶液注入液相色谱仪进行测定。

Description

磷酸氯喹片中有关物质的检测方法
技术领域
本发明涉及生物医药检测技术领域，特别是涉及一种磷酸氯喹片中有关物质的检测方法。
背景技术
磷酸氯喹(chloroquine phosphate)，化学名为：N,N-二乙基-N4-(7-氯-4喹啉基)-1,4-戊二胺二磷酸盐，是由主环4,7-二氯喹啉和侧链2-氨基-5-二乙胺基戊烷结合制成，结构式如下：
磷酸氯喹用于治疗对氯喹敏感的恶性疟、间日疟及三日疟，并可用于疟疾症状的抑制性预防，也可治疗肠外阿米巴病、结缔组织病、光敏感性疾病(如日晒红斑)等。此外，体外实验显示氯喹对新冠病毒有良好抑制作用；临床结果初步显示，磷酸氯喹对新冠肺炎有一定的诊疗效果。
有关物质研究是药品质量研究中关键性的项目之一，其含量是反映药品纯度的直接指标。有关物质主要是在生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以及贮藏过程中的降解产物等。据文献报道，磷酸氯喹对光不稳定，光照条件下逐渐变色，并产生降解产物。
经检索，中国药典2015版和欧洲药典EP 9.0收载磷酸氯喹片的有关物质测定方法均为薄层色谱法(TLC法)。TLC法是一种检测有关物质的常用方法，具有快速、简便、易于操作等优点，尤适于检测无紫外吸收的物质。各国药典在采用TLC检测有关物质时，均采用了系列对照品溶液进行梯度点样的方法来“半定量”地评估杂质量，但仅对最大杂质斑点作了限定，且仅仅通过目视斑点颜色深浅进行判定，而无其他任何具体要求，因此很难对药品质量作出准确的评价。此外，目前磷酸氯喹片有关物质检测相关研究文献中，方文仅等(中国医药工业杂志.1997，28(12)：548-550)采用气相色谱法、薄层色谱法等方法测定了磷酸氯喹原料的有关物质，初步确定在磷酸氯喹中除含5-氯同分异构体外，还含有其他的同分异构体及脱乙基物，但只进行了定性分析；陈祝康等(中国医药工业杂志.2007，38(5)：372-380)以乙腈-磷酸二氢钾溶液为流动相建立了一种高效液相法(HPLC法)测定磷酸氯喹的有关物质，但也仅仅是对最大单杂、总杂进行了简单定量分析，并未对各杂质的相对保留时间、相对响应因子进行确认。因此不能全面有效地衡量磷酸氯喹片质量的优劣。
此外，由于杂质对照品价格昂贵且较难获得，仅靠自身对照法(不加校正因子)又难以准确测定各已知和未知杂质的含量。
故开发一种能够将磷酸氯喹片中各有关物质进行有效分离，灵敏度更高、专属性更强，而且能够迅速、便捷、准确地测定磷酸氯喹片中已知和未知杂质含量的检测方法，从而实现对磷酸氯喹片有关物质有效控制，保证磷酸氯喹片的质量，有效解决上述技术问题，具有重要的现实意义。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种磷酸氯喹片中有关物质的检测方法，该检测方法灵敏度高、分析时间短、分离度较好、专属性强，能在效地检测磷酸氯喹片中已知和未知杂质的含量，确保产品的安全性和有效性。
具体技术方案如下：
一种磷酸氯喹片中有关物质的检测方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取磷酸氯喹片，用流动相溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
系统适应性溶液的制备：取供试品溶液，置紫外灯下照射，滤过，取续滤液作为系统适应性溶液；
对照溶液的制备：取供试品溶液，用流动相稀释，得到对照溶液；
对照品溶液的制备：取磷酸氯喹对照品，用流动相溶解，作为对照品溶液；
将系统适应性溶液、供试品溶液、对照溶液和对照品溶液注入液相色谱仪进行测定；
液相色谱测定的流动相为体积比为35±10：65±10的三氟乙酸水溶液和乙腈的混合液。
在其中一些实施例中，液相色谱测定的流动相为体积比为35±5：65±5的三氟乙酸水溶液和乙腈的混合液。进一步地，液相色谱测定的流动相为体积比为35±2：65±2的三氟乙酸水溶液和乙腈的混合液。
在其中一些实施例中，所述液相色谱测定的流动相中三氟乙酸水溶液的体积分数为0.05％～0.2％，优选体积分数为0.1±0.02％。
在其中一些实施例中，所述流动相的流速为0.5ml/min～2ml/min，优选流速为0.8ml/min～1.2ml/min，更优选流速为1.0ml/min。
在其中一些实施例中，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱；所述色谱柱的长度为150mm或者250mm，色谱柱的内径为4.6μm，所述色谱填料粒径为5μm。
在其中一些实施例中，所述液相色谱的色谱条件还包括：以紫外检测器串联电雾式(CAD)检测器为检测器；色谱柱温度为25～40℃，优选色谱柱温度为30℃。
在其中一些实施例中，样品进样量10～30μl，优选样品进样量为20μl。
在其中一些实施例中，所述供试品溶液中磷酸氯喹的浓度为1.5～3.5mg/ml；所述对照溶液中磷酸氯喹的浓度为0.015～0.035mg/ml。
在其中一些实施例中，所述对照品溶液中，磷酸氯喹对照品的浓度分别为1～3μg/ml。
在其中一些实施例中，所述紫外检测波长为260±20nm。
在其中一些实施例中，所述电雾式(CAD)检测器的检测条件为：雾化温度为30～40℃，输出范围为100±5pA，优选雾化温度为35℃。
在其中一些实施例中，所述有关物质的紫外相对响应因子(RRFs)的计算公式为：
在其中一些实施例中，所述有关物质的含量为：根据自身对照法计算出各杂质含量，再乘以其紫外相对响应因子。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明方法的专属性好，各杂质和磷酸氯喹之间均达到有效分离，各杂质与主峰之间、各杂质间分离度好。
2、在药学研究中，经常需要估算未知化合物的紫外相对响应因子(RRFs)，这可能带来潜在的质量平衡问题。本发明方法通过紫外检测器串联CAD检测器，能够迅速、便捷、准确地计算各杂质的紫外相对响应因子，从而准确测定磷酸氯喹片中已知和未知杂质的含量。针对在相同浓度的化合物等度洗脱，CAD可以提供近乎一致的响应，所以CAD的相对量与化合物的相对量有关。基于UV峰面积和相对响应，各杂质的紫外相对响应因子(RRFs)计算公式为：再根据自身对照法计算出各杂质含量，乘以紫外相对响应因子，从而迅速、便捷、准确地测定磷酸氯喹片中已知和未知杂质含量。
3、本发明方法通过紫外检测器串联CAD检测器，即可快速测定各杂质的紫外相对响应因子，避免了杂质对照品购买昂贵、难以获得等问题。而且相对于通过杂质对照品进行线性回归得到相对响应因子，本发明方法更加迅速、便捷和准确，并可推广用于其他品种的杂质相对响应因子和杂质含量的测定。
4、本发明方法选择流动相为三氟乙酸水溶液和乙腈的混合溶液，既可以实现上述专属性好、分离度好、准确度高的检测效果，并且无需调节流动相pH，操作简单易行。
5、本发明方法适用于本品的杂质控制，能够满足有关物质检查的要求。
附图说明
图1为实施例1的本发明HPLC系统适用性色谱图；
图2为实施例1的TF0006批对照溶液HPLC图谱(紫外检测器)；
图3为实施例1的TF0006批对照溶液HPLC图谱(CAD检测器)；
图4为实施例1的TF0006批供试品溶液HPLC图谱(紫外检测器)；
图5为实施例1的TF0006批供试品溶液HPLC图谱(CAD检测器)；
图6为对比例1的TF0006批磷酸氯喹片有关物质的薄层色谱图；
图7为实施例2中方法专属性考察HPLC图谱(空白溶剂)；
图8为实施例2中方法专属性考察HPLC图谱(破坏性试验-未破坏)；
图9为实施例2中方法专属性考察HPLC图谱(破坏性试验-氧化破坏)；
图10为实施例2中方法专属性考察HPLC图谱(破坏性试验-酸破坏)；
图11为实施例2中专属性考察HPLC图谱(破坏性试验-碱破坏)；
图12为实施例2中专属性考察HPLC图谱(破坏性试验-紫外破坏)。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例中检测仪器为Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪及其Chromeleon 7工作站；磷酸氯喹对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号：100421-201802；苯酚为Sigma-Aldrich，GR级(含量≧99.0％)；乙腈为色谱纯；磷酸氯喹片(TF0006批)由广州白云山光华制药有限公司提供。
实施例1磷酸氯喹片中有关物质的检测方法
1、色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱(色谱柱的长度为150mm或者250mm，色谱柱的内径为4.6μm，所述色谱填料粒径为5μm)；以紫外检测器串联CAD检测器为检测器，紫外检测波长260nm，CAD检测器雾化温度为35℃、输出范围为100pA；以0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液：乙腈的(体积比)＝35：65为流动相；流速1.0ml/min；柱温30℃；进样量20μl。
实验步骤如下：
(1)供试品溶液制备：取磷酸氯喹片研细，精密称取适量(约相当于磷酸氯喹0.10g)，置50ml量瓶中，用流动相稀释，超声使溶解，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
(2)系统适应性溶液制备：取上述供试品溶液，置紫外灯365nm照射24小时，过0.45μm孔径有机滤膜后，即得；
(3)对照溶液制备：精密量取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，加入流动相定容，摇匀，即得；
(4)对照品溶液：取磷酸氯喹对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含2.0μg的溶液，作为对照品溶液，取20μl注入液相色谱仪；
(5)精密量取系统适应性溶液、对照溶液、对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
系统适用性试验结果如表1所示，各杂质间、杂质与主峰分离度均大于1.5。应用上述检测方法，测定所得系统适用性色谱图见说明书附图1。
表1磷酸氯喹与各杂质的分离情况
各杂质相对保留时间如表2所示，磷酸氯喹杂质7不得过0.5％，其他杂质不得超过0.1％，总杂不得过2.0％。
表2各杂质相对保留时间及限度
杂质编号 相对保留时间 限度
杂质1 0.17±0.017 0.1
杂质2 0.20±0.020 0.1
杂质3 0.23±0.023 0.1
杂质4 0.29±0.029 0.1
杂质5 0.35±0.035 0.1
杂质6 0.44±0.044 0.1
杂质7 0.58±0.058 0.5
磷酸氯喹 1.0±0.10 -
其他单杂 - 0.1
总杂 - 2.0
TF0006批磷酸氯喹片对照溶液的HPLC图谱(紫外检测器、CAD检测器)如说明书附图2、附图3所示，峰面积如表3所示。
表3 TF0006批对照溶液中磷酸氯喹的保留时间和峰面积
TF0006批磷酸氯喹片供应品溶液的HPLC图谱(紫外检测器、CAD检测器)如说明书附图4、附图5所示，按自身对照法加紫外相对响应因子计算供试品溶液中各杂质含量，有关物质的紫外相对响应因子(RRFs)计算公式为：所述有关物质的含量为：根据自身对照法计算出来的各杂质含量，再乘以其紫外相对响应因子，结果如表4所示。
表4供试品溶液中各杂质峰面积和含量
结论：该检测方法色谱条件下，各杂质与主峰以及各杂质之间均能较好的分离；按本方法计算杂质2、3、4、5均在0.01～0.02％，杂质7含量为0.485％，结果较现有检测方法更直观、准确，可用于磷酸氯喹片的有关物质控制。
对比例1(现有检测方法)
取TF0006批次磷酸氯喹片细粉适量，精密称定，加水适量，超声使磷酸氯喹溶解，用水制成每1ml中含50mg的溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取适量，用水分别稀释制成每1ml中含0.5mg、0.25mg和0.125mg的溶液作为对照溶液(1)、(2)和(3)。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述四种溶液各2μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-环己烷-二乙胺(5：4：1)为展开剂，展开，晾干，置紫外灯(254nm)下检视。对照溶液(3)应显一个明显斑点，供试品溶液如显杂质斑点，深于对照溶液(2)所显主斑点颜色且浅于对照溶液(1)所显主斑点颜色的杂质斑点不得多于1个，其他杂质斑点不得深于对照溶液(2)所显主斑点的颜色。
按上述步骤操作，记录薄层色谱图，如说明书附图6所示。
结论：检测结果为按现有检测方法TF0006批次产品只有一个明显斑点，而按本发明检测HPLC方法检测TF0006批次产品杂质2、3、4、5均在0.01～0.02％，杂质7含量为0.485％，杂质检出个数较多，且数字更易直观理解。
由此说明本发明检测方法更适用于磷酸氯喹片有关物质控制。
实施例2：方法学考察
1、系统适应性考察：
(1)供试品溶液制备：取TF0006批磷酸氯喹片研细，精密称取适量(约相当于磷酸氯喹0.10g)，置50ml量瓶中，用流动相稀释，超声使溶解，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
(2)系统适应性溶液制备：取上述供试品溶液，置紫外灯365nm照射24小时，过0.45μm孔径有机滤膜后，即得；
(3)对照溶液制备：精密量取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，加入流动相定容，摇匀，即得；
(4)对照品溶液：取磷酸氯喹对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含2.0μg的溶液，作为对照品溶液，取20μl注入液相色谱仪；
(5)精密量取系统适应性溶液、对照溶液、对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
表5有关物质考察-系统适用性
(6)精密量取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，考察峰面积及保留时间的相对标准偏差，结果见表6。
表6有关物质考察-系统适用性精密度
从表5可知，主峰出峰时间为19.433min，理论塔板数为8113，分离度为10.49，各杂质与主峰之间分离度较好，各杂质之间分离度较好；从表6可知，本发明方法的精密度试验结果保留时间和峰面积的RSD值均小于2％，表明系统适用性良好。
2、专属性考察-破坏试验
(1)未破坏溶液：精密称取本品适量(约0.1mg)，置50mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.45μm孔径有机滤膜后，即得。
(2)氧化破坏：精密称取本品适量(约0.1mg)，置50mL量瓶中，加入30％双氧水5mL，水浴90℃破坏20min，冷却至室温，再加入流动相稀释至刻度，摇匀，过0.45μm孔径有机滤膜后，即得。
(3)酸破坏实验：精密称取本品适量(约0.1mg)，置50mL量瓶中，加入1.0mol/L的HCL 5mL，水浴100℃破坏30min，冷却至室温，用1.0mol/L的NaOH中和，再加入流动相稀释至刻度，摇匀，过0.45μm孔径有机滤膜，即得。
(4)碱破坏实验：精密称取本品适量(约0.1mg)，置50mL量瓶中，加入1.0mol/L的NaOH 5mL，水浴100℃破坏30min，冷却至室温，加入1.0mol/L的HCl中和至pH为7，再加流动相稀释至刻度，摇匀，过0.45μm孔径有机滤膜后，即得。
(5)紫外破坏实验：精密称取本品适量(约0.1mg)，置50mL量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，置紫外灯365nm照射24小时，过0.45μm孔径有机滤膜后，即得。
分别取上述未破坏溶液、氧化破坏、酸破坏、碱破坏及紫外破坏供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果详见说明书附图7～12。
结论：在氧化、酸、碱、紫外照射下样品均有不同程度的降解，但不明显；各降解样品中，各降解杂质与主峰和其他杂质均能较好地分离，且主峰峰纯度合格，物料基本守恒，表明方法专属性良好。
3、检测限和定量限
取磷酸氯喹对照品适量，精密称定，加流动相溶解配制为适宜浓度的溶液。精密量取上述溶液20μl，注入液相色谱仪，考察信噪比，并逐步稀释，直到信噪比约为10，即为定量限浓度；继续稀释到信噪比约为3，即为检测限浓度。结果见表7。
表7有关物质考察-检测限和定量限
结论：检测灵敏度高，定位准确，相当于主成分0.010％均能准确定量，能够满足磷酸氯喹片有关物质检查。
4、线性与范围
据文献报道，磷酸氯喹原料合成过程中可能会产出中间原料苯酚。通过对照品添加方式确认了苯酚为本发明方法中的杂质2。
为进一步验证本发明方法的准确性，特对比了以苯酚及磷酸氯喹对照品进行线性回归得到的紫外相对响应因子与本发明方法测得的紫外相对响应因子。
对照品线性溶液：取苯酚、磷酸氯喹对照品适量，精密称定，加流动相溶解配制为10.0、5.0、2.5、1.2、0.6、0.2μg/ml定量限浓度的溶液。
精密量取上述线性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，分别测定该杂质的峰面积，计算相应的含量。以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归分析，详细结果见表8。
表8线性回归方程
对照品名称 回归方程 相关系数(R2) 线性范围(μg/ml)
苯酚 Y＝0.382X+0.0782 0.9992 0.22～9.78
磷酸氯喹 Y＝0.530X+0.1305 0.9999 0.20～9.86
结论：
(1)通过对照品进行线性回归，得到上述校正曲线，苯酚、磷酸氯喹均在0.22～9.78μg/ml范围内线性关系良好；
(2)计算苯酚与磷酸氯喹的回归曲线斜率之比，得到苯酚的紫外相对响应因子为0.72，与前述本发明方法测得的杂质2(苯酚)的紫外相对响应因子0.73基本一致，表明本发明方法能准确用于定量，且相对于通过杂质对照品进行线性回归得到紫外相对响应因子，本发明方法更加迅速、便捷。
5、精密度试验
重复性：采用TF0006批磷酸氯喹片样品，平行配制样品6份，进行有关物质测定，考察方法重复性，结果见表9。
表9重复性试验
从上述结果可知，各杂质含量RSD均在5％以内，表明方法重复性良好。
中间精密度：不同的操作人员、不同日期和仪器，平行配制样品6份，进行有关物质测定，并结合重复性项下的6份样品结果，统计12份样品有关物质，考察方法中间精密度，结果见表10。
表10中间精密度
从上述表10的结果可知，各杂质含量的RSD均在10％以内，表明方法精密度良好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种磷酸氯喹片中有关物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取磷酸氯喹片细粉适量，用流动相溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
系统适应性溶液的制备：取供试品溶液，置紫外灯下照射，滤过，取续滤液作为系统适应性溶液；
对照溶液的制备：取供试品溶液，用流动相稀释，得到对照溶液；
对照品溶液的制备：取磷酸氯喹对照品，用流动相溶解，作为对照品溶液；
将系统适应性溶液、供试品溶液、对照溶液和对照品溶液注入液相色谱仪进行测定；
液相色谱测定的流动相为体积比为35±10：65±10的三氟乙酸水溶液和乙腈的混合液，所述三氟乙酸水溶液的体积分数为0.1±0.02%；
所述流动相的流速为0.8ml/min～1.2ml/min；
所述液相色谱的色谱条件还包括：以紫外检测器串联电雾式检测器为检测器；色谱柱温度为25～40℃；
所述电雾式检测器的检测条件为：雾化温度为30～40℃，输出范围为100±5pA；
所述有关物质的含量为：根据自身对照法计算出各杂质含量，再乘以其紫外相对响应因子；
所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱；所述色谱柱的长度为150mm或者250mm，色谱柱的内径为4.6 mm，色谱柱的填料粒径为5μm；
所述有关物质的紫外相对响应因子的计算公式为：。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为1.0ml/min。
3.根据权利要求1~2任一项所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱温度为30℃。
4.根据权利要求1~2任一项所述的检测方法，其特征在于，样品进样量为10～30μl。
5.根据权利要求1~2任一项所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液中磷酸氯喹的浓度为1.5~3.5mg/ml；所述对照溶液中磷酸氯喹的浓度为0.015~0.035mg/ml。
6.根据权利要求1~2任一项所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液中，磷酸氯喹对照品的浓度为1~3 μg/ml。
7.根据权利要求1~2任一项所述的检测方法，其特征在于，紫外检测波长为260±20nm。
8.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，雾化温度为35℃。
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