CN111265545A - 一种治疗肺肿瘤的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗肺肿瘤的组合物，所述组合物由蝙蝠葛苏林碱和顺铂组成；药味少，有利于质量控制；蝙蝠葛苏林碱与顺铂联合应用，无论是细胞水平还是动物水平，对非小细胞肺癌均有较好的杀伤效果，可诱导肿瘤细胞凋亡，增强抗肿瘤效果，说明蝙蝠葛苏林碱能增效顺铂，改善顺铂在临床上的耐药问题；所述组合物对于治疗肺肿瘤，特别是非小细胞肺癌具有重要意义，具有巨大的社会价值和经济价值。

Description

一种治疗肺肿瘤的组合物

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种组合物，具体涉及一种治疗肺肿瘤的组合物。

背景技术

肺癌是全世界常见的人类死亡原因之一，其中非小细胞肺癌(non-small celllung cancer,NSCLC)是最常见的肺癌类型，发病率和死亡率都很高。此外，由于环境等因素的影响，肺癌的发生率呈逐年递增之势，因此探索有效的肺癌治疗策略刻不容缓。现如今，癌症的首要医治方法有三种：手术、化疗和放疗。手术和放疗通常用于去除肿瘤细胞病灶，而化疗药物可以在全身扩散并且有效地杀死肿瘤细胞，所以化疗主要用于临床实践中的术后辅助治疗。对于晚期癌症患者来说，即使已经难以根除癌细胞，但也可以通过化疗缓解癌症带来的痛苦并改善生活质量。

顺铂是治疗肺癌最常用的化疗药物之一，临床研究表明顺铂确实可以延长患者的生存期，然而长期的化疗会导致非小细胞肺癌对化疗药产生耐药性，且经结构修饰过的二代顺铂、三代顺铂类药物均存在耐药性的问题，这已经成为影响非小细胞肺癌化疗效果的主要障碍。故寻找可增强顺铂化疗效果的药物已迫在眉睫。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种可增强顺铂化疗效果的，用于治疗肺肿瘤的药物。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种治疗肺肿瘤的组合物，由蝙蝠葛苏林碱和顺铂组成。

蝙蝠葛苏林碱能增效顺铂，联合应用可改善顺铂在临床上的耐药问题，对于有效利用顺铂治疗肺肿瘤具有重要的意义。

作为本发明的优选实施方式，所述组合物中，蝙蝠葛苏林碱和顺铂按摩尔浓度比为蝙蝠葛苏林碱：顺铂＝1:2.5～10。

本发明还要求保护所述的组合物在制备治疗肺肿瘤的药物中的应用。

作为本发明的优选实施方式，所述肺肿瘤为非小细胞肺癌。

进一步地，本发明还要求保护一种用于治疗肺肿瘤的药物制剂，所述药物制剂包括如所述的组合物。

作为本发明的优选实施方式，所述药物制剂还包括药学上可接受的载体或辅料。

作为本发明的优选实施方式，所述载体为生理盐水。

作为本发明的优选实施方式，所述药物制剂为用于治疗非小细胞肺癌的药物制剂。

本发明还要求所述药物制剂的剂型，所药物制剂的剂型为注射剂。

本发明所述组合物由蝙蝠葛苏林碱和顺铂组成，药味少，有利于质量控制；蝙蝠葛苏林碱与顺铂联合应用，无论是细胞水平还是动物水平，对非小细胞肺癌的治疗均有较好的杀伤效果，可诱导肿瘤细胞凋亡，增强抗肿瘤效果，说明蝙蝠葛苏林碱能增效顺铂，改善顺铂在临床上的耐药问题；所述组合物对于治疗肺肿瘤，特别是非小细胞肺癌具有重要意义，具有巨大的社会价值和经济价值。

附图说明

图1为CCK-8实验各组药物对非小细胞肺癌细胞生长的抑制情况。

图2为各组药物处理后非小细胞肺癌细胞的凋亡率结果。

图3为各组药物处理后非小细胞肺癌细胞的凋亡相关蛋白的表达情况。

图4为药物处理后各组动物体重变化情况。

图5为药物处理后各组动物移植瘤的体积及重量的变化结果。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1本发明所述组合药物在体外对非小细胞肺癌细胞的抑制作用

1、实验药物的具体使用方法

(1)蝙蝠葛苏林碱药物：溶于DMSO溶液中，制配成10mM的贮存液，于-20℃冰箱保存；使用时用完全培养基稀释成5μM的工作液。

(2)顺铂药物：溶于DMSO溶液中，制配成10mM的贮存液，于-20℃冰箱保存；使用时用完全培养基稀释成相应的工作液。

2、实验方法：

2.1CCK-8实验

将内非小细胞肺癌细胞(A549或NCI-H1299细胞系)接种于培养皿中，按表1将细胞分成多个测试组，每组设3-6个复孔(细胞密度大约为8000个/孔)；并设置无细胞组，用无菌PBS填充。

表1各组细胞加入药物的终浓度(单位μM)

将各组细胞于37℃培养，细胞贴壁后按表1加入相应的药物；5％CO₂、37℃培养箱内继续培养24h后，每孔加入培养基体积10％的CCK-8溶液，继续培养2h。用酶联免疫检测仪(酶标仪)检测各孔在450nm处的吸光度，通过计算得到各组细胞的增殖情况。细胞生长抑制率I计算公式如下：

I(％)＝1-A_x/A₀，

其中，A_x为各组细胞测得的吸光度，A₀为空白对照组细胞测得的吸光度。

Q＝E_ab/(E_a+E_b-E_a×E_b),其中E_a and E_b分别代表药物a和b的作用效果(抑制率),E_ab代表a、b两种药物的联合效果.如果Q>1.15,则a、b之间是协同效果.如果0.85<Q<1.15,则a、b之间是相加效果.如果Q<0.85,则a、b之间是拮抗效果.

2.2细胞凋亡实验

将对数生长期的非小细胞肺癌细胞，取2*10⁶个细胞加入含有6mL DMEM培养基的培养皿内，设置为单染组；并将剩余的对数生长期的非小细胞肺癌细胞分为双阴性组、空白对照组、蝙蝠葛苏林碱组、顺铂组、联合组，按3×10⁵/孔的密度将细胞接种于6孔细胞培养板内，培养过夜后加入相应的药物；其中，空白对照组和双阴性组不加入药物，蝙蝠葛苏林碱组加入终浓度为5μM的蝙蝠葛苏林碱，顺铂组加入终浓度为25μM的顺铂，联合组加入终浓度为5μM的蝙蝠葛苏林碱和终浓度为25μM的顺铂；继续置于37℃、5％CO₂及饱和湿度的环境下,静置培养24h。

单染组细胞处理：分为PI⁺、AnnexinⅤ⁺两个样品，分别加入2mL 70％乙醇，悬空滴加200μL从培养皿中消化下来的细胞悬液，吹打混匀，破壁处理，5min-10min，吸出乙醇；各加入2mL PBS混匀洗涤一次，3000r，5min，离心；倒出培养基，各加入600μL 1×loadingbuffer，混匀，移至1.5mL EP管。其余各组细胞药物处理后，弃培养基，用PBS漂洗细胞，并用胰酶消化、收集细胞沉淀。各加入600μL 1×loading buffer(SDS蛋白上样缓冲液)，混匀，移至1.5mL EP管。

双阴组不作任何处理，按Annexin V⁺、空白对照组、蝙蝠葛苏林碱组、顺铂组、联合组的顺序先加入3μL Annexin V染液(快速，可不避光)，避光孵育20min；再按PI⁺、空白对照组、蝙蝠葛苏林碱组、顺铂组、联合组的顺序加入5μL PI染液。用BD C5流式细胞仪检测。

2.3免疫印迹实验

将生长良好的非小细胞肺癌细胞按表1分组，每组按3×10⁵/孔的密度接种于6孔细胞培养板内，培养过夜后，按表1分别加入相应终浓度的药物，继续培养24小时，收集细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解细胞30min后收集细胞裂解蛋白液，通过免疫印迹实验检测各组蛋白液中的相关蛋白(Cleaved-PARP、Cleaved-Cas3、cyto-c、Bax、COX4、Bal-2)的表达量。

3、统计学分析处理及其结果：

实验结果为至少进行三次平行实验分析得到，数据用均数±标准差

表示。

CCK-8实验结果如表2、图1(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。Q>1.15代表协同作用。)。由表2、图1可见，本发明所述组合物中的蝙蝠葛苏林碱可显著提高顺铂对非小细胞肺癌细胞的敏感性，两者具有协同增效作用，抑制非小细胞肺癌细胞的生长的效果明显优于单一的蝙蝠葛苏林碱和顺铂。

表2各组细胞的生长抑制率(％)

项目	A549细胞	NCI-H1299细胞
			空白对照组	0.13±1.26	0.28±2.01
蝙蝠葛苏林碱组	5.61±1.59	0.79±1.37
			低顺铂组	16.55±0.99	20.05±3.22
中顺铂组	37.23±0.88	40.67±1.00
			高顺铂组	56.70±1.07	62.72±0.73
组合物I组	29.77±2.17	37.77±0.78
			组合物II组	52.89±0.99	64.06±2.16
组合物III组	61.60±1.03	84.42±0.44

各组细胞的细胞凋亡实验结果如表3、图2(***p<0.001。Q>1.15代表协同作用。)。

表3各组细胞的凋亡率(％)

组别	A549细胞	NCI-H1299细胞
			对照组	6.07±1.77	5.43±1.17
蝙蝠葛苏林碱组	4.69±1.57	10.68±1.28
			顺铂组	10.10±2.18	7.15±1.06
联合组	20.51±3.27	28.96±2.18

各组细胞的蛋白表达情况如图3。由图1、图2可见，本发明所述组合物中的蝙蝠葛苏林碱可显著提高顺铂对非小细胞肺癌细胞的敏感性，两者具有协同增效作用，抑制非小细胞肺癌细胞的生长的效果明显优于单一的蝙蝠葛苏林碱和顺铂。由图3可得，本发明所述药物组合物蝙蝠葛苏林碱联合顺铂作用于非小细胞肺癌细胞后，细胞内凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP含量明显升高，且呈现出顺铂的浓度依赖性递增(图3A)；同时联合用药后，胞浆组分中细胞色素c(Cytochrome C，cyto-c)、线粒体组分中促凋亡Bax的蛋白含量均明显升高，而全蛋白组分中癌基因且抑凋亡蛋白Bcl-2的蛋白含量明显下调(图3B)。CytochromeC释放到胞浆可以触发Caspase相关的凋亡级联反应；Bax定位于线粒体上可以使线粒体通透性升高诱发CytochromeC从线粒体释放入胞浆；Bcl-2主要位于线粒体外膜上，可以阻止Bax的线粒体定位。

综上，说明联合药物能直接有效抑制肿瘤细胞生长，并促进其凋亡，且实验结果显示，蝙蝠葛苏林碱和顺铂具有协同增效的抗肿瘤作用。

实施例2动物实验

1、实验药物的具体使用方法

(1)蝙蝠葛苏林碱药物：溶于DMSO溶液中制配成20mg/ml的贮存液(置于-20℃/4℃冰箱保存)，使用时用生理盐水稀释成2mg/mL的工作液。

(2)顺铂药物：溶于DMSO溶液中制配成0.8mg/ml的贮存液(置于-20℃/4℃冰箱保存)，使用时用生理盐水稀释成0.08mg/mL的工作液。

2、实验方法：

2.1移植瘤模型的构建

裸鼠选用SPF级BALB/c-nu/nu，6周龄，雄性。选取对数生长期的非小细胞肺癌细胞(NCI-H1299细胞系)接种裸鼠，接种细胞浓度为5×10⁷个/mL，每只小鼠皮下接种100μL细胞液。待肿瘤体积生长至约60mm³时，将裸鼠随机分为按空白对照组(Ctrl)、蝙蝠葛苏林碱组、顺铂组、联合组，每组10只，并每天腹腔注射相应的药物；其中，空白对照组注入0.2ml生理盐水；蝙蝠葛苏林碱组注射20mg/kg蝙蝠葛苏林碱；顺铂组注射0.8mg/kg顺铂；组合物组注射20mg/kg蝙蝠葛苏林碱和0.8mg/kg顺铂。实验期间每天记录动物体重。

肿瘤增殖检测：每天测量肿瘤体积，计算公式如下：

肿瘤体积(V)＝1/2×L×D²，

其中，L为肿瘤长径，D为肿瘤短径。

药物处理2周后断颈法处死裸鼠，完整剥离裸鼠皮下肿瘤，拍照，并记录肿瘤重量。

3、统计学分析处理及其结果：

实验结果为进行三次平行实验分析得到，数据用均数±标准差

表示。

实验期间动物体重变化结果如图4所示，肿瘤增殖情况如图5(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。Q>1.15代表协同作用。)。如图4，可见实验期间，各组动物体重差异不大，说明各组药物对动物毒性较低。

各组小鼠肿瘤情况如图5(A为用药后各组小鼠肿瘤体积，B为用药后各组小鼠肿瘤肿瘤，C为实验期间各组小鼠肿瘤体积变化情况)如图5A，能直观地看出，相对于对照组，联合组小鼠身上的肿瘤明显更小(顺铂组、蝙蝠葛苏林碱组相对于对照组小鼠，肿瘤也有变小，但变化相对不明显)；由表4、图5B可见，联合组的肿瘤重量显著轻于对照组、蝙蝠葛苏林碱组或顺铂组。

表4各组小鼠试验后肿瘤重量

组别	重量(g)
		对照组	0.93±0.20
蝙蝠葛苏林碱组	0.86±0.28
		顺铂组	0.73±0.18
联合组	0.39±0.17

由图5C可见，从第8天开始，各组的平均肿瘤体积均有增大的趋势，但联合组的肿瘤体积明显比蝙蝠葛苏林碱组、顺铂组或对照组的增长趋更慢，说明联合组药物能够抑制实验动物体内的肿瘤生长。

综上，动物实验说明了蝙蝠葛苏林碱可显著提高顺铂对非小细胞肺癌的敏感性，两者具有协同增效作用，本发明所述组合物可有效治疗肺肿瘤。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种治疗肺肿瘤的组合物，其特征在于，由蝙蝠葛苏林碱和顺铂组成。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述蝙蝠葛苏林碱和顺铂按摩尔浓度比为蝙蝠葛苏林碱：顺铂＝1:2.5～10。

3.如权利要求1所述的组合物在制备治疗肺肿瘤的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肺肿瘤为非小细胞肺癌。

5.用于治疗肺肿瘤的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括如权利要求1或2所述的组合物。

6.如权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂还包括药学上可接受的载体或辅料。

7.如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述载体为生理盐水。

8.如权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为用于治疗非小细胞肺癌的药物制剂。

9.如权利要求5～8所述药物制剂的剂型，其特征在于，所药物制剂的剂型为注射剂。

Images