CN101555245A - 水飞蓟宾甲醚在制备抗白血病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水飞蓟宾甲醚在制备抗白血病药物中的应用。具体而言，本发明涉及一个水飞蓟宾衍生物7，20－二甲基水飞蓟宾的新型制备方法，以及该化合物或其可药用盐在制备防治淋巴性白血病和髓细胞白血病的医药用途，该化合物由天然药物水飞蓟宾经单步反应而得。经药理实验证明，该化合物对可移植性小鼠淋巴性白血病P388细胞及人急性髓细胞(早幼粒)白血病细胞株HL－60细胞的体外增殖均有强效抑制作用，其IC₅₀值分别为7.1±1.8和5.5±1.9微摩尔/升。

Description

水飞蓟宾甲醚在制备抗白血病药物中的应用

技术领域

本发明涉及天然药物化学和药理学领域，具体而言，本发明涉及7，20-二甲基水飞蓟宾或其可药用盐的新型制备方法及其在制备防治淋巴性白血病和髓细胞白血病药物中的用途，该化合物由天然药物水飞蓟宾经单步反应而得。经药理实验证明，该化合物对可移植性小鼠淋巴性白血病P388细胞及人急性髓细胞(早幼粒)白血病细胞株HL-60细胞的体外增殖均有强效抑制作用，因而可以预期用于制备治疗相关的白血病的药物用途。

背景技术

白血病(leukemia)，即俗称的血癌，属于造血系统的恶性疾病，是国内十大高发恶性肿瘤之一。其致病原因在于造血组织中某类细胞在骨髓或其它造血组织中异常增殖，并进一步侵犯人体内各内脏组织，导致正常造血细胞受到抑制，临床上产生的症状通常包括发烧、出血、贫血和肝脏、脾脏与淋巴结肿大的情形。白血病以发病快慢及受累细胞的不同可分为四种主要类型。依肿瘤发展情形可分为急性与慢性白血病，急性白血病发展快；慢性白血病发展慢。若再由异常细胞的来源来分类，又可再个别细分为骨髓性与淋巴球性白血病。淋巴细胞性白血病累及淋巴细胞；髓性(髓细胞性)白血病累及髓细胞。髓细胞发育成粒细胞，又称中性粒细胞。白血病的成因是多重性的，各类型白血病的成因及临床表现皆不尽相同。

迄今用于白血病临床的化疗药物包括烷化基、抗代谢药、抗生素及激素和杂类等，但是不可否认的是：这些药物副作用较强，且对起重要防御作用的淋巴细胞、骨髓造血细胞的破坏较大，使机体对癌和其它病原菌等感染失去抵抗力，因此临床上白血病忠者死于肺炎、败血症、尿毒症等化疗副作用的病例较为多见。80年代以来，科研人员从天然药物中提取研制了多种抗白血病制剂，并对中药及天然药物的抗白血病作用进行了实验研究，发现天然药物副作用较小，可与纯化疗药物互为补充。因此，从天然药物及先导化合物中发现和优化抗白血病活性化合物，已经成为抗白血病治疗的重要途径之一。

水飞蓟素(Silymarin)和水飞蓟宾(Silybin)都是菊科植物水飞蓟Silybummarianum(L.)Gaertn中提取得到的物质。水飞蓟素由水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟丁等黄酮木质素类化合物组成，其中水飞蓟宾含量最高。水飞蓟素已收入我国药典，而水飞蓟素和水飞蓟宾的临床应用方面，其在美国和欧洲已进入临床试验II期[Ramasamy等，Cancer Letters，2008，352]。其他研究也多处报道水飞蓟宾用于治疗各种癌症的可能，例如膀胱癌[Tyagi，A等，Carcinogenesis，2004，25，1711]；HepG2型及Hep3B型肝细胞癌[Varghese，L等，Clin.Cancer Res.，2005，11，8441]；子宫颈癌[Huang，Q等，J Asian Nat.Prod.Res.，2005，7，701]；前列腺癌[Davis-Searles，P.R.等，Cancer Res.，2005，65，4448]。此外，水飞蓟宾还被报道用于癌症辅助治疗[Giacomelli，S等，LifeSci.，2002，70，1447；Tyagi，A.K.等，Oncol.Res.2003，11，493]。然而，虽说迄今为止水飞蓟素和水飞蓟宾类黄酮木质素化合物的相关文献报道已经超过1500篇，但是以其为母体进行结构改造的衍生物及相关之活性报道并不多见。

水飞蓟宾类化合物具有确切的疗效，故而以此天然药物为先导化合物(Lead compound)进一步开发，寻找水飞蓟宾类新的衍生物，使其能够具有更高或者更新的抗肿瘤药理活性，以期获取自主知识产权的抗肿瘤新药，实属必要。我们前期报道了在水飞蓟宾的B环和E环上进行了一系列衍生物的合成，发现在B环上引入甲氧基，可显著提高其清除超氧阴离子自由基的活性[杨雷香，赵昱等，“Synthesis and Antioxidant Properties Evaluation of NovelSilybin Analogue”，Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry，2006，21(4)，399-404.]。在此系列衍生物的研究工作包括了7，20-二甲基水飞蓟宾。

发展对人体肿瘤细胞反应最为接近的抗癌药物筛选体系及敏感试验检测体系，是当前许多肿瘤药理学工作者的目标。利用接种人体肿瘤细胞的裸鼠进行筛选是其中一个方向，但裸鼠试验费用昂贵，无法推广使用，尤其不适宜初筛。故而，细胞水平上的筛选为抗肿瘤药物研究者广泛采用的检测模型。其中，筛选具有抗淋巴白血病癌活性的化学物质，主要采用可移植性小鼠白血病模型P388细胞进行检测。而人急性髓细胞(早幼粒)白血病细胞株(HL-60细胞)是近期广泛接受的人体内肿瘤细胞检测体系。我们同时采用了这两种白血病相关肿瘤细胞株作为筛选模型，对本发明的7，20-二甲基水飞蓟宾进行了针对小鼠P388细胞及人HL-60细胞的体外增殖抑制试验，发现其对二者均具有超乎寻常的强效抑制作用，其对两种肿瘤细胞的抑制率强于阳性对照药物顺铂。说明其有望成为防治淋巴性白血病和急性髓细胞性白血病的创新型药物，从而完成本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种式(I)所示的7，20-二甲基水飞蓟宾的制备方法；其特征在于：水飞蓟宾与过量的碳酸钾和碘甲烷作用，用丙酮作溶剂，室温下反应；

式(I)

其中C10，C11位同时是R构型或者同时是S构型，反应时间是从15分钟至72小时，碘甲烷的摩尔数是起始物水飞蓟宾摩尔数的2至4倍，碳酸钾的摩尔数是水飞蓟宾摩尔数的1至6倍。

本发明的再一个目的是提供了式(I)所示之7，20-二甲基水飞蓟宾或其可药用盐用于制备防治白血病药物中的用途。其中白血病是指淋巴性白血病和急性髓细胞白血病。

本发明的又一个目的是提供了一种用于防治白血病的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的式(I)所示之7，20-二甲基水飞蓟宾或其可药用盐和可药用辅料。其中白血病是指淋巴性白血病和急性髓细胞白血病。根据本发明，该药物组合物中可加入各种药用赋形剂，添加剂及载体。其剂型可以制成注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂，或控释或缓释剂型或纳米制剂。

本发明的有益之处在于：用新的制备方法制备出7，20-二甲基水飞蓟宾，将产率提高至60％以上，且该方法制备成本低廉、反应条件温和。药效学实验证明该化合物在制备防治淋巴性白血病和急性髓细胞白血病创新药物的应用方面的巨大潜力，对于开发抗白血病药物提供了新的物质基础。因此，具有潜在的社会效益和经济效益。本发明涉及的化合物来源于天然药物，经半合成制备而得。其原料来源易得、价廉，合成方法简便、成本低、污染小，利于节能减排条件下的大规模生产，产业化前景明确。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明的实质，下面首先用实施例的形式说明化合物制备的过程，实施例给出了化合物的部分物理和化学及波谱学数据。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。

实施例1：式(I)化合物即7，20-二甲基水飞蓟宾的制备

在干燥的反应瓶中，0.96克水飞蓟宾溶于15毫升丙酮中，加入0.55克碳酸钾以及0.63克碘甲烷，室温搅拌反应1小时。静置，过滤，母液无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得棕黄色固体。经200～300目硅胶(22克)柱层析，石油醚∶醋酸乙酯＝2∶1洗脱，得到浅黄色固体0.622克。收率61％。

化合物(I)，即2-[2，3-二氢-3-(4-甲氧基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6-]-3，5-二羟基-7-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮：Rf(石油醚∶醋酸乙酯＝2∶1)0.19；核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ：3.53(多重峰，2H，H-23a)，3.75(单峰，3H，OCH₃)，3.83(单峰，3H，OCH₃)，3.84(多重峰，2H，H-23b)，3.85(单峰，3H，OCH₃)，4.15(多重峰，1H，H-10)，4.98(双峰，J＝7.8Hz，2H，H-1)，4.52(多重峰，H-3)，4.99(双峰，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.78(单峰，1H，20-OH)，5.98(双峰，J＝2.2Hz，1H，H-6)，6.06(双峰，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.10(多重峰，3H，H-2′，H-2″& H-2″′)，6.90～7.25(多重峰，6H，芳香环Ar-H-13，H-15，H-16，H-18，H-21，& H-22)，11.70(单峰，1H，5-OH)，12.60(单峰，1H，3-OH)；电喷雾质谱ESI-MS：511(M+H)⁺。

本发明中的式(I)化合物和其可药用盐具有重要的生物活性，本发明人通过药效学试验，发现式(I)所示之7，20-二甲基水飞蓟宾化合物不仅对可移植性小鼠淋巴性白血病P388细胞的生长具有非常强的抑制作用，而且对人急性髓细胞(早幼粒)白血病细胞株(HL-60细胞)的生长也具有较为强效的抑制作用，说明该化合物有望发展为细胞毒类治疗人白血病尤其是淋巴性白血病及急性髓细胞白血病的药物。

本发明中制备得到的7，20-二甲基水飞蓟宾化合物或其可药用盐用制药领域中的常规方法，结合中、西药制药中常规的可药用辅料，可以制成各种药物组合物，如注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂，或控释或缓释剂型或纳米制剂。这些药物组合物可以用于预防或/和治疗人白血病尤其是淋巴性白血病及急性髓细胞白血病。

本发明的7，20-二甲基水飞蓟宾化合物或其可药用盐，还可以与现已上市或正在临床试验的维拉帕米(VRP)、环孢菌素A(CsA)、三苯氧胺、汉防己甲素(TrD)、川芎嗪(TMP)、苦参碱(MAT)、蝙蝠葛碱(DRC)、蝙蝠葛苏林碱(DRS)、槲皮素(quercetin，QT)、冬凌草甲素、板蓝根组酸活性单体-5b、布拉他辛(bullatacin)、大黄素、小檗胺和砒霜的有效成分三氧化二砷(As₂O₃)联合使用，制备得到具有抑制P388和/或HL-60细胞生长活性的细胞毒类药物组合物，可预期用于制备治疗人淋巴性白血病及急性髓细胞白血病的药物。

本发明所制备的7，20-二甲基水飞蓟宾化合物或其可药用盐还可以与已上市的细胞毒类抗肿瘤药物如喜树碱类化合物及其半合成衍生物伊立替康和拓扑替康；高喜树碱类化合物(homocam ptothecin，HCPT)，氟替康(diflomotecan)；胸苷酸合成酶抑制剂如雷替曲塞、AG337，多靶点抗叶酸剂(MTA)培美曲塞(pemetrexed，商品名Alimta)等；铂类抗肿瘤药物如顺铂和第三代铂类抗肿瘤药物如奥沙利铂、萘达铂和赛特铂(satrapiatin，JM-216)；以及其他机制的抗肿瘤药物如紫杉醇(Paclitaxel)类、足叶乙苷(Etoposide)、脱氧胞昔类吉西他滨(Gemcitabine)、长春新碱类如Vinorebine等联合使用，制备得到具有肿瘤生长抑制作用的抗肿瘤组合物。

下面通过药理相关实施例进一步说明本发明。实施例给出了7，20-二甲基水飞蓟宾对可移植性小鼠淋巴性白血病P388及人急性髓细胞(早幼粒)白血病细胞株(HL-60细胞)体外增殖的抑制作用实验结果，说明其在防治人淋巴性白血病及人髓细胞白血病药物开发领域中的用途。实施例给出了化合物的部分活性数据。同样必须说明，本发明的这些药理相关实施例仍是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例2：7，20-二甲基水飞蓟宾对人急性髓细胞(早幼粒)白血病细胞株(HL-60细胞)体外增殖的抑制作用实验

2.1实验材料与样品

2.1.1细胞：HL-60细胞株购自中科院上海细胞所。

2.1.2实验试剂：

2.1.2.13-(4，5-dimethylthiagol-2-yl)-2，5-diphenyltetrogolium bromide(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，即MTT)购自Amresco公司；

2.1.2.2RPMI 1640培养基、小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；

2.1.2.3青霉素和链霉素由石家庄制药集团有限公司生产；

2.1.2.4其它试剂如二甲亚砜等均为国产分析纯，购自杭州华东医药试剂有限公司。

2.1.3实验仪器：

2.1.3.1酶标仪：Synergy-HT型，BIO-TEK公司；

2.1.3.2立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40BI型，上海申安医疗器材厂；

2.1.3.3超纯水系统：UPWS-I-60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；

2.1.3.4除菌过滤器：Sterifil500型，Millipore公司；

2.1.3.5气浴恒温振荡器：THZ-C，江苏省金坛市医疗仪器厂；

2.1.3.6CO₂细胞培养箱：MMM，德国公司；

2.1.3.7倒置显微镜：XD-2型，重庆光电仪器有限公司。

2.2细胞培养：

HL-60(人髓原细胞白血病)细胞用RPMI 1640培养基培养，培养基中含10％的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升的链霉素。细胞以每孔1×10⁴的浓度加入到96孔板中，在37℃含5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养24小时。

2.3细胞存活率(细胞毒性)的测定：

细胞存活率的测定方法用改良MTT法。细胞经24小时的孵育后，分别将新配的式(I)化合物7，20-二甲基水飞蓟宾的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中化合物的最终浓度分别为100微克/毫升、50微克/毫升、25微克/毫升、5微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT(5毫克/毫升)的生理盐水溶液，再继续在37℃，5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养3小时，每孔中加入150微升二甲亚砜，振荡溶解生成的MTT晶体甲臜(formazan)，所形成的甲臜用酶标仪在570nm波长下比色，细胞存活率由样品OD值对于对照OD值的比值计算。其中该化合物对HL-60细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)由剂量效应曲线得到。

2.4实验结果：

实验结果显示式(I)化合物7，20-二甲基水飞蓟宾对HL-60细胞生长抑制的的IC₅₀值为5.5±1.9μM(微摩尔/升)。本试验以抗肿瘤一线用药顺铂(DDP)作为阳性对照，阳性对照药物顺铂对HL-60细胞的IC₅₀为6.3±1.8μM。

2.5结果说明：

式(I)化合物7，20-二甲基水飞蓟宾对HL-60细胞的生长具有较为强效的抑制作用，其对HL-60细胞的生长抑制活性强于阳性对照药物顺铂，说明该化合物有着极佳的抑制急性髓原细胞白血病的活性，说明该化合物有望发展为细胞毒类治疗急性髓细胞白血病的药物。

实施例3：7，20-二甲基水飞蓟宾对可移植性小鼠淋巴性白血病P388的体外增殖的抑制作用实验

3.1实验材料与样品

3.1.1细胞：P388细胞购自中科院上海细胞所。

3.1.2实验试剂：

3.1.2.13-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)购自Amresco公司；

3.1.2.2RPMI 1640培养基、小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；

3.1.2.3青霉素和链霉素由石家庄制药集团有限公司生产；

3.1.2.4其它试剂如二甲亚砜等均为国产分析纯，购自杭州华东医药试剂有限公司。

3.1.3实验仪器：

3.1.3.1酶标仪：Synergy-HT型，BIO-TEK公司；

3.1.3.2立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40BI型，上海申安医疗器材厂；

3.1.3.3超纯水系统：UPWS-I-60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；

3.1.3.4除菌过滤器：Sterifil500型，Millipore公司；

3.1.3.5气浴恒温振荡器：THZ-C，江苏省金坛市医疗仪器厂；

3.1.3.6CO₂细胞培养箱：MMM，德国公司；

3.1.3.7倒置显微镜：XD-2型，重庆光电仪器有限公司。

3.2小鼠淋巴性白血病P388细胞培养：

P388细胞用RPMI 1640培养基培养，培养基中含10％小牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素。细胞以每孔5×10³个密度接种到96孔板中，在37℃，5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养24小时。

3.3细胞存活率的测定方法：

细胞存活率的测定方法用改良MTT法。细胞经24小时的孵育后，分别将新配的7，20-二甲基水飞蓟宾的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中化合物的最终浓度分别为100微克/毫升、50微克/毫升、25微克/毫升、5微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT(5毫克/毫升)的生理盐水溶液，再继续在37℃，5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养3小时，每孔中加入150微升二甲亚砜，振荡溶解生成的MTT晶体甲臜(formazan)，所形成的甲臜用酶标仪在570nm波长下比色，细胞存活率由样品OD值对于对照OD值的比值计算。其中化合物7，20-二甲基水飞蓟宾对P388细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)由剂量效应曲线得到。

3.4实验结果：

实验结果显示式(I)化合物7，20-二甲基水飞蓟宾对P388细胞生长抑制的的IC₅₀值为7.1±1.8μM(微摩尔/升)。本试验以抗肿瘤一线用药顺铂(DDP)作为阳性对照，阳性对照药物顺铂对P388细胞的IC₅₀为18.4±3.6μM。

3.5结果说明：

式(I)化合物7，20-二甲基水飞蓟宾对P388细胞的生长具有较为明确的抑制作用，其对P388细胞的生长抑制活性强于阳性对照药物顺铂，说明该化合物有着极佳的抑制淋巴性白血病的活性，有望发展为细胞毒类治疗淋巴性白血病的药物。

化合物7，20-二甲基水飞蓟宾不仅对髓原细胞HL-60细胞的生长具有强效的抑制作用，而且对淋巴性白血病P388细胞的生长也具有较为强效的抑制作用，说明该化合物或其可药用盐有望发展为细胞毒类药物，用于治疗急性髓细胞白血病和/或者淋巴性白血病白血病。

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例和药理实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims (6)

1.一种式(I)所示的7，20-二甲基水飞蓟宾的制备方法；其特征在于：水飞蓟宾用碳酸钾与碘甲烷作用，用丙酮作溶剂，室温下反应；

其中C10，C11位同时是R构型或者同时是S构型；反应时间是从15分钟至72小时；碘甲烷的摩尔数是起始物水飞蓟宾摩尔数的2至4倍；碳酸钾的摩尔数是水飞蓟宾摩尔数的1至6倍。

2.式(I)所示之7，20-二甲基水飞蓟宾或其可药用盐用于制备防治白血病药物中的用途。

3.根据权利要求2所述之用途，其中白血病是指淋巴性白血病和/或急性髓细胞白血病。

4.一种用于防治白血病的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的式(I)所示之7，20-二甲基水飞蓟宾或其可药用盐和可药用辅料。

5.根据权利要求4所述之药物组合物，其中白血病是指淋巴性白血病和/或急性髓细胞白血病。

6.根据权利要求4或5任一所述的药物组合物，其剂型是注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂，或控释或缓释剂型或纳米制剂。