CN111225984A - 核酸探针、使用uv光将核酸固定到固体载体的方法、包括固定化核酸探针的固体载体以及包括固体载体的测试装置 - Google Patents
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Abstract
公开了核酸探针、将核酸固定到固体载体的方法、包含固定化核酸探针的固体载体和包括固体载体的测试装置。所述核酸探针包含末端锚链部分和捕获部分,其中所述末端锚链部分包含至少18个核苷酸的序列或与其具有至少90%的相似性的序列,所述序列由最多5个X型碱基的核苷酸的片段与(多个)胞嘧啶型碱基(C)的中间核苷酸和任选的一个鸟嘌呤型碱基(G)的核苷酸组成,其中每个X型碱基彼此独立地指定为胸腺嘧啶型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)。使用UV光将所述核酸探针固定在固体载体上。还公开了一种测试系统,其包括具有至少一个超临界角荧光结构(SAF结构)的固体载体。
Description
技术领域
总体而言,本发明涉及将核酸探针固定到固体基材,如微流体盒。这样的核酸探针可有利地应用于捕获目标组分和/或用于杂交分析目的。
背景技术
用于研究和/或检测生物分子的分析装置是非常重要的工具。近年来,已开发并销售了不同类型的携带用于杂交分析的固定化探针的装置。
已经提出了几种用于改进分析装置和固定期望的探针的尝试。一些现有技术的方法包括将核苷酸的序列直接合成到载体结构上。其他和更有效的方法包括首先提供核酸探针,例如通过将其从天然来源分离或通过合成来提供核酸探针。
A.B.Steel等人的DOI:http://dx.doi.org/10.1016/S0006-3495(00)76351-X;“Immobilization of Nucleic Acids at Solid Surfaces:Effect of OligonucleotideLength on Layer Assembly”.Biophysical Journal Vol.79,August 2000p.975-981公开了对DNA长度和锚定基团的存在对金表面上预合成的寡核苷酸的组装的影响的研究。该研究表明硫醇锚定基团显著增强寡核苷酸固定,但对于更长的链长,增强作用降低。对于长过24个碱基的链,表面覆盖随探针长度开始显著降低。
Anke Pierik等人的DOI:10.1021/ac902561w;“Immobilization ofOligonucleotides with Homo-oligomer Tails onto Amine-Functionalized SolidSubstrates and the Effects on Hybridization”.Anal.Chem.,2010,82(4),pp1191–1199公开了对DNA光化学(254nm UV)固定到胺官能化基材上的研究。结论是连接于杂交序列的尿嘧啶、胸腺嘧啶,以及在有限的程度上的鸟嘌呤的短均聚物序列(尾)改善固定。提出了解释这些核苷酸接枝到胺官能化基材上的可能机理。
EP2334810中公开了一种类似的固定方法。其中公开的发明关注使用更长的波长,即300-500nm来固定核酸,并且认为使用这样的长波长的光降低了引起核酸分子损害的风险。所公开的方法包括以下步骤:
(a)提供具有唯一一种碱基类型的核苷酸的片段的核酸,其中唯一一种碱基类型的核苷酸的片段至少位于核酸的3’或5’末端;和
(b)通过光交联将核酸固定在固体载体上,其中光交联在约300-500nm的波长,优选在365nm的波长下进行,其中唯一一种碱基类型的核苷酸的片段具有约7至约100个核苷酸的长度,并且所述交联使用约0.5焦耳/cm2至约10焦耳/cm2范围内的量的能量进行。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单且有效的将核酸探针固定到固体基材的供选择的方法。
在一个实施方案中,目的是提供一种将核酸探针固定到固体基材的方法,其中所述基材不需要预处理,例如包括固体载体的胺官能化或硫醇官能化的预处理,并且优选地,其中所述基材是热塑性且可注射成型的材料的基材,其在通过注射成型制备后不需要任何表面官能化。
在一个实施方案中,目的是提供一种将核酸探针固定到固体基材的方法,其中所述基材在通过UV光固定后不需要洗涤。由此,可以以降低的成本来制备携带固定化探针的最终装置载体。
本发明的目的是提供一种探针,其包含用于高效地将核酸探针固定至基材的末端锚链部分,并且其中所述基材有利地不需要预处理。
这些目的已经通过如权利要求书中所定义的和本文以下描述的本发明或其实施方案实现。
本发明提供了一种将核酸探针固定到固体载体的新的且有效的方法。本发明的发明人已经发现了用于将核酸探针固定到固体载体的新的锚定改变,其中固定化效率出乎意料地高,并且对核酸探针的不期望的损害的风险非常低。
将核酸探针固定到固体载体的方法包括:
·提供包含末端锚链部分和捕获部分的核酸探针,
·将所述核酸探针施加到所述固体载体的表面上,和
·通过使其经受UV光将所述核酸探针的锚链部分锚定到所述固体载体。
所述核酸探针的末端锚链部分包含N个核苷酸的序列或与其具有至少90%的相似性的序列,所述序列由X型碱基的核苷酸的片段与(多个)胞嘧啶型碱基(C)的中间核苷酸和任选的一个鸟嘌呤型碱基(G)的核苷酸组成。所述X型碱基的核苷酸的片段彼此独立地包含1至5个核苷酸。N为至少18,并且每个X型碱基彼此独立地指定为胸腺嘧啶型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)。在一个实施方案中,N为至少20。
在一个实施方案中,所述末端锚链部分具有至多1个或不含G型碱基的核苷酸。
通过对N个核苷酸的序列中与1至5个X型碱基的核苷酸的片段和(多个)C型碱基的中间核苷酸的组成不同的核苷酸的数目n进行计数,并计算相似性百分比100*(N-n)/N,来确定相似性百分比。
术语(多个)特定碱基类型的核苷酸,如(多个)分别的胞嘧啶型碱基(C)、胸腺嘧啶型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)的核苷酸在本文中用于包括包含特定碱基类型的核苷酸,以及本领域技术人员已知的能够与互补碱基相互作用的其化学衍生物,包括其在功能上等价的衍生物或修饰物。术语“在功能上等价的”涉及碱基与互补碱基建立非共价连接的能力,其在化学上类似于作为其来源的核苷酸或碱基的非共价连接。这样的在功能上等价或修饰的碱基可以仍然能够与互补碱基进行杂交结合。
术语“末端锚链部分”、“聚尾”或仅“锚改变”在本文中可互换使用。
术语“目标组分”是指可以由捕获部分捕获和/或例如通过杂交、引物延伸或其他反应在捕获部分合成的任何组分。
术语“远端”和“近端”应相对于光发射器装置或与微创手术结合使用的任何其他装置的取向来解释。
术语“约”通常用于包括在测量不确定度内的情形。当用于范围时,术语“约”在本文中应被认为是指在测量不确定度内的情形包括在该范围内。
应强调的是,当在本文中使用时,术语“包含(comprises)/包含(comprising)”应将其解释为开放性术语,即应认为其指定具体描述的(多个)特征,例如(多个)元件、(多个)单元、(多个)整数、(多个)步骤、(多个)组分及其(多个)组合的存在,但不排除一个或多个其他描述的特征的存在或加入。
除非另有说明或从上下文清楚可见,否则术语“基本上”是指包括通常的测量不确定度,或产品差异和公差,取较大者。
术语“本质上”在本文中应认为其是指包括实际上与所讨论的目的无关的变化。
在整个说明书或权利要求书中,单数涵盖复数,除非上下文另外指定或要求。
短语“实施方案”应解释为包括本发明的实施例,该实施例包括所提到的实施方案的(多个)特征。
可以在本发明的范围内以各种方式组合本文所述的本发明的所有特征和本发明的实施方案,包括范围和优选范围,除非有不组合这样的特征的特殊原因。
通过提供新的核酸探针,本发明的发明人已经对将核酸固定到固体基材的技术做出了巨大且有价值的贡献。发明人提供的方法具有几个非常有价值的优点,其将在下文进一步解释。
在一个实施方案中,核酸探针的末端锚链部分包含所述N个核苷酸的序列,所述序列由X型碱基的核苷酸的片段与(多个)胞嘧啶型碱基(C)的中间核苷酸组成。已显示X型碱基和C型碱基的组合对于获得高固定效率非常有利。因此,在一个实施方案中,N个核苷酸的至少约90%,如至少约95%,如每个彼此独立地具有X型碱基或C型碱基的核苷酸。
所述X型碱基的核苷酸的片段中的每个片段包含至少一个X型碱基的核苷酸。所述X型碱基的核苷酸的片段可以具有相同或不同的长度。在一个实施方案中,X型碱基的核苷酸的片段中的一些,例如每第二个或每第三个具有第一长度,并且X型碱基的核苷酸的片段中的其他一些,例如每第二个或每第三个具有第二更长的长度。
已经发现,当核酸探针包含一个或多个包含2-5个核苷酸的X型碱基的核苷酸的片段时,可以大大降低产生假阴性的探针脱离的风险。
有利地,所述N个核苷酸的序列包含少于10%,优选少于5%的具有嘌呤核碱基的核苷酸,如1个或0个具有嘌呤核碱基的核苷酸。
具有嘌呤核碱基的核苷酸是腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)。已经发现具有嘌呤核碱基的核苷酸通常降低核酸探针的固定效率。据认为这可能是因为核酸探针的高固定效率是由通过在嘧啶的C=C双键处的反应形成共价键而导致的。因此,具有嘌呤核碱基的核苷酸将不通过该反应与固体载体结合。
有利地,所述N个核苷酸的序列仅包含具有嘧啶核碱基的核苷酸。
在一个实施方案中,所述核酸探针的末端锚链部分包含至少N个核苷酸的序列,所述序列由2至5个X型碱基的核苷酸的片段与(多个)C型碱基的中间核苷酸组成。
有利地,所述末端锚链部分的核苷酸的数目N不应太低,因为这可能导致末端锚链部分与固体载体之间的结合太弱。然而,还期望所述核酸探针的核苷酸的总数不太高,因为这可能导致每单位面积的固定化核酸探针的数目可能少和/或核酸探针可能彼此之间部分阻挡,从而导致相对较弱的固定。有利地,N为至少26,例如至少30,例如至少34,例如至少38,例如至少40。
通常,认为将末端锚链的核苷酸的数目N增加至60以上不导致固定效率的进一步提高。在一个实施方案中,末端锚链的核苷酸的数目N小于50。
有利地,X型碱基的核苷酸的片段彼此独立地被1-4个C型碱基的核苷酸隔开。
在一个实施方案中,X型碱基的核苷酸的片段具有相等的长度,优选2个X型碱基的核苷酸的长度、3个X型碱基的核苷酸的长度或4个X型碱基的核苷酸的长度。
已经发现,当末端锚链部分包含X型碱基的核苷酸和C型碱基的核苷酸的重复子序列时,可以获得非常高的固定效率,并且甚至当经受温度变化,例如在热循环过程,例如在用于扩增DNA片段的PCR(聚合酶链反应)中应用的热循环中提供的温度变化时,固定化核酸探针脱离的风险也非常低。
在非常合适的实施方案中,N个核苷酸的序列包含根据下式的碱基类型的核苷酸的重复子序列:
(-(X)Y-(C)Z-)M,
其中Y是1至5的整数,Z是1至5的整数,Y≥Z,并且M是4至20的整数。
有利地,Y是2至5的整数,Z是1至4的整数,Y>Z,并且M是4至20的整数。
在一个实施方案中,Z=1。在一个实施方案中,Z=2。在一个实施方案中,Y=2并且M≥10,例如M≥12,例如M≥14。在一个实施方案中,Y=3并且M≥6,例如M≥8,例如M≥10。在一个实施方案中,Y=4并且M≥4,例如M≥6,例如M≥8。
在另一个非常合适的实施方案中,N个核苷酸的序列包含根据下式的碱基类型的核苷酸的重复子序列:
(-(X)Y2-(C)Z-(X)Y2-)M,
其中Y2是1至4的整数,Z是1至4的整数,并且M是4至20的整数。
优选地,Y2是2至3的整数,Z是1至3的整数。在一个实施方案中,Y2≥Z,优选地Y2>Z。在一个实施方案中,Y2=2并且M≥10,例如M≥12,例如M≥14。在一个实施方案中,Y2=3并且M≥4,例如M≥6,例如M≥8。
已经发现,为了获得非常高和稳定的固定效率,优选其中X型碱基的数目大于C型碱基的数目的实施方案。
在一个实施方案中,Y或Y2的数值大于Z的数值,优选地,Y或Y2的数值是Z的数值的至少两倍。
在一个实施方案中,X型碱基的核苷酸的片段是T型碱基的核苷酸的片段。
在一个实施方案中,X型碱基的核苷酸的片段是U型碱基的核苷酸的片段。
由于末端锚链部分与固体载体的结合被认为是由定位在嘧啶的C=C双键上的反应形成共价键而导致的结合,因此认为U型碱基的核苷酸将具有对应于T型碱基的核苷酸的结合效率的结合效率。
在一个实施方案中,X型碱基的核苷酸的片段包含T型碱基的核苷酸和U型碱基的核苷酸二者,如交替的T型碱基的核苷酸和U型碱基的核苷酸。
末端锚的N个核苷酸的序列可以位于核酸探针的任一端。在一个实施方案中,末端锚的N个核苷酸的序列位于5′端。在一个实施方案中,末端锚的N个核苷酸的序列位于3′端。
在一个实施方案中,核酸探针在其5′端或在其3′端均具有末端锚,其中在各自5′端和3′端的N个核苷酸的序列可以彼此相同或不同。
核酸探针的捕获部分可以包含DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA;其寡核苷酸、其部分;或其任意组合。
在一个实施方案中,捕获部分包含2’O-甲基RNA,其为常用的RNA的类似物,其中将甲基添加到核苷的核糖部分的2’羟基,从而形成甲氧基。
DNA可以是例如A-DNA、B-DNA或Z-DNA的形式。RNA可以是例如p-RNA,即吡喃糖基-RNA的形式,或结构修饰形式,像发夹RNA或茎-环RNA。
术语“PNA”是指肽核酸,其是类似于DNA或RNA的人工合成的聚合物,用于生物学研究和医学治疗,但未知其天然存在。PNA主链可以由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成。
术语“HNA”是指己糖醇核酸,即由标准核碱基和磷酸化的1,5-脱水己糖醇骨架构建的DNA类似物。
术语“LNA”是指锁核酸。通常,锁核酸是修饰的,因此是不可进入的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分可以例如用连接2’和4’碳的额外的桥接来修饰。
术语“ANA”是指阿拉伯糖核酸或其衍生物。
术语“CNA”是指氨基环己基乙烷酸核酸。此外,该术语涉及环戊烷核酸,即包含例如2’-脱氧羰基鸟苷(deoxycarbaguanosine)的核酸分子。
在一个实施方案中,核酸探针的捕获部分可以包含DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA和ANA或其部分中的任一个的组合。
在一个实施方案中,如本文所定义的核酸分子的核酸探针的捕获部分可以是短寡核苷酸、长寡核苷酸或多核苷酸的形式。
在一个实施方案中,核酸探针的捕获部分是单链的。在一个实施方案中,核酸探针的捕获部分是双链的。
在一个实施方案中,核酸探针是从天然来源获得的,或是完全或部分合成的。
通常,期望核酸探针的至少末端锚链部分是至少部分合成的,优选完全合成的。
在一个实施方案中,整个核酸探针是单链的。
在一个实施方案中,核酸探针在其长度的至少一部分中,例如在其捕获部分的一部分中是双链的。
捕获部分原则上可以是能够捕获目标组分的任何种类的部分。
在一个实施方案中,捕获部分包含引物,例如适用于引物延伸的引物。引物延伸是一种用于例如定位RNA的5'端的技术。引物延伸可以例如用于确定转录的起始位点。
在一个实施方案中,捕获部分包含杂交链部分,所述杂交链部分包含核苷酸的序列,如适用于与目标核酸探针的互补区杂交和/或适用于进行聚合酶链反应(PCR)分析的核苷酸的序列。当由固定到固体载体的引物/探针进行PCR时,它也可以被称为固相PCR或SP-PCR。
在一个实施方案中,捕获部分适用于在诸如微阵列杂交、PCR、LAMP、WGA(全基因组扩增)、HDA、固相PCR的应用的情况下使互补目标DNA退火。
环介导等温扩增(LAMP)使用4-6个引物,所述引物识别目标DNA的6-8个不同区域。链置换DNA聚合酶引发合成,引物中的两个形成环结构,以促进随后的数轮扩增。LAMP快速、灵敏,且扩增如此大量,使得肉眼可以看到反应过程中产生的焦磷酸镁,使得LAMP非常适合现场诊断。
链置换扩增(SDA)依赖于链置换DNA聚合酶,通常是Bst DNA聚合酶、大片段或Klenow片段(3'-5'外切-),由链限制的限制性内切核酸酶或切刻酶在包含于引物中的位点处产生的切口处起始。每个聚合酶置换步骤都再生切口位点,导致指数扩增。SDA通常用于临床诊断。
解旋酶依赖性扩增(HDA)利用解旋酶的双链DNA解链活性来分离链,通过链置换DNA聚合酶实现引物退火和延伸。像PCR一样,该系统仅需要两种引物。HDA已用于几种诊断设备和FDA批准的测试中。
切刻酶扩增反应(NEAR)使用链置换DNA聚合酶,在切刻酶产生的切口处开始,由目标序列迅速产生许多短核酸。此过程非常快速且灵敏,能够在数分钟内实现小目标量的检测。NEAR通常用于临床和生物安全应用中的病原体检测。
实时聚合酶链反应(实时PCR)也称为定量聚合酶链反应(qPCR),是一种基于聚合酶链反应(PCR)的分子生物学实验室技术。它在PCR期间,即实时监视目标DNA分子的扩增,而不是像在常规PCR中那样,在其结束时监视目标DNA分子的扩增。
有利地,捕获部分包含至多约200个核苷酸并且优选更短的核苷酸链。在一个实施方案中,捕获部分包含具有约4至约100个核苷酸,例如约10至约50个核苷酸,例如约20至约30个核苷酸的核苷酸链。
捕获部分可以直接连接到末端锚链部分。
在一个实施方案中,捕获部分通过间隔子,如脱碱基间隔子,如重复数目的间隔子连接到末端锚链部分。
间隔子的实例包括间隔子C3、PC(可光裂解的)间隔子、己二醇间隔子、间隔子9、间隔子18、1’,2’-二脱氧核糖(d间隔子)和核苷酸(A、T、G、C)间隔子。
间隔子C3是三碳间隔子,用于将短的间隔子臂掺入寡核苷酸中。如果需要更长的间隔子,可将间隔子C3以连续添加的方式掺入。间隔子9是9个原子(6个碳+3个氧)长的三甘醇链,用于将间隔子臂掺入寡核苷酸中。每当需要更长的间隔子时,间隔子9可以以连续添加的方式掺入。间隔子18是18个原子(12个碳+6个氧)长的六甘醇链,用于将长间隔子臂掺入寡核苷酸中。每当需要更长的间隔子时,间隔子18可以以连续添加的方式掺入。
这些和其他合适的间隔子可以例如购自Gene Link,Inc.NY,USA或Bio-SynthesisInc.TX USA。
在一个实施方案中,末端锚链部分位于核酸探针的5'端或3'端,而捕获部分H位于5'端和3′端中的另一个。
在一个实施方案中,核酸探针在5′端和3′端均包含末端锚链部分,并且捕获部分位于任选地具有介于中间的(多个)间隔子的末端锚链部分之间。
对于某些应用,期望核酸探针包含标记。在其他应用或相同应用中,目标组分带有标记。在两者都带有标记的情况下,可能期望标记是不同的。(多种)标记在原则上可以是任何种类的标记。
在一个实施方案中,核酸探针包含标记,如放射性标记或荧光标记,如花青染料,例如Cy3(1,1′-双(3-羟基丙基)-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青)或Cy5(1,1′-双(3-羟基丙基)-3,3,3′,3′-四甲基吲哚二羰花青)。
花青染料是寡核苷酸的重要化学修饰,其在可见光波长下表现出强烈且稳定的荧光。花青染料具有尖吸收带、高消光系数、优异的抗光漂白性,并使DNA和其他低聚物具有强荧光,使得甚至可以观察单个分子。
核酸探针可通过诸如点样的任何方法沉积到固体载体的表面上。
术语“点样”和“印刷”在本文中可互换使用。
有利地,点样包含将溶剂中的核酸探针点样到固体基材的表面上。
点样可以例如使用点样机器人和/或喷墨打印机来进行,所述点样机器人和/或喷墨打印机例如使用与计算机打印机相同的技术,以将纳升至皮升体积的探针溶液液滴(而不是墨水)排出到固体载体的表面上。供选择地,可以采用销将这些探针直接施加到固体载体的表面上的特定位置。
有利地,核酸探针在溶剂中沉积在固体载体上。溶剂中的核酸探针的最佳浓度在很大程度上取决于核酸探针的长度。然而,还已经发现当使用具有如上所述的优选末端锚链部分的核酸探针时,核酸探针的浓度可以增加。
在一个实施方案中,核酸探针在溶剂中以至多100μM的浓度,例如以约1μM至约80μM,如约3μM至约70μM,如约5μM至约60μM的浓度点样。在一个实施方案中,核酸探针在溶剂中以至多约800ng/μL,如约1ng/μL至约500ng/μL的浓度点样。
单个斑点可以例如具有约0.1nL至约1nL,如约0.05nL至约1nL,如约0.1nL至约0.8nL,如约0.3nL至约0.6nL的体积。
合适的溶剂的实例包括SSC(柠檬酸钠盐水)、DMSO(二甲基亚砜)、NaHPO4(磷酸氢二钠)、SDS(十二烷基硫酸钠)和NaOH(氢氧化钠)。另外的实例包括Triton X-100与SSC的组合。
在被点样到固体载体上之后,例如通过使其干燥将核酸探针干燥。此后,使包含核酸探针的固体载体经受UV处理。
实际上,固体载体可以是任何种类的材料或其组合。有利地,固体载体是聚合物载体或玻璃载体,优选地,载体包含聚苯乙烯(PS)、环烯烃共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或包含前述聚合物中的一种或多种的混合物。
固体载体可以是分层载体。
在优选的实施方案中,固体载体包含聚苯乙烯(PS)或是聚苯乙烯(PS)固体载体。优选地,至少核酸探针点样的固体载体的表面是PS表面。通常,期望基底是不发泡的,并且具有通常低摩擦且光滑的表面。
固体载体可以有利地是注射成型的固体载体。注射成型的固体载体可以任选地用富氧等离子体进行成型后的表面改性,以在固体载体的表面引入极性基团。当表面适应亲水特性时,这可能尤其是有利的。
由于核酸的固定效率,可能不需要对固体载体进行任何预处理或向固体载体添加任何官能团。
因此,在一个实施方案中,固体载体表面基本上不含胺基、亚甲基、硫醇基、环氧基、重氮基或酰胺基中的一种或多种,优选地,载体表面基本上不含胺基、亚甲基、硫醇基、环氧基、重氮基或酰胺基中的全部。
固体载体可以有利地是盒、ELISA分析板、比色皿、微孔板或其任意组合,或盒、ELISA分析板、比色皿、微孔板或其任意组合的形成部件。
这样的分析装置是众所周知的,并且原则上,这些中的任一种都可以形成固体载体。
在一个实施方案中,固体载体是盒或盒的形成部件,所述盒包括通道,所述通道具有限定通道的通道表面,其中固体基材的表面形成通道表面的至少一部分。
在一个实施方案中,通道包括反应区段,并且所述方法包括将核酸探针固定到通道的反应区段内的表面。反应区段可以是通道的长度区段。
在一个实施方案中,反应区段包括至少一个光学元件。光学元件可以有利地被构造成重定向固定化核酸探针的荧光标记(荧光团)或连接到固定化核酸探针的荧光标记(荧光团)发出的光,并且优选地使其准直。
在一个实施方案中,光学元件包括透镜结构和/或超临界角荧光结构(SAF结构),SAF结构优选具有顶表面,并且所述方法包括将核酸探针固定到顶表面。
光学元件有利地具有截头圆锥形状,如下文进一步所述的。
有利地,固体基材是下文进一步描述的测试装置或是形成下文进一步描述的测试装置的形成部件。
固体载体可以有利地是微流体盒,例如WO17133741中公开的微流体盒,WO17133741通过引用在此并入。在一个实施方案中,由在WO17133741中公开的(多个)SAF结构提供固体载体,并且将核酸探针固定到(多个)SAF结构的(多个)顶表面。
已经发现,可以使用相对低剂量的UV光将核酸探针固定到固体载体上,从而确保损坏核酸探针的捕获部分的风险相对低,或甚至避免。
在一个实施方案中,通过使核酸的锚链部分经受具有约250nm至500nm范围内的波长,优选具有约254nm、约265nm和/或约365nm中至少一个的波长的UV光,将其锚定到固体载体。
在一个实施方案中,通过使用非常少量的能量,例如约0.2焦耳/cm2至约1焦耳/cm2,例如约0.3焦耳/cm2或更多,使核酸的锚链部分经受UV光,将其锚定到固体载体。
在一个实施方案中,通过使用约0.4焦耳/cm2至约15焦耳/cm2,如约1焦耳/cm2至约10焦耳/cm2,如约1.5焦耳/cm2至约6焦耳/cm2,如约1.6焦耳/cm2至约3焦耳/cm2,如约1.7焦耳/cm2至约2焦耳/cm2的量的能量,使核酸的锚链部分经受UV光,将其锚定到固体载体。
在一个实施方案中,通过将带有点样并干燥的核酸探针的固体载体暴露于UV照射至少30秒,例如约1至约8分钟,例如约2至约6分钟,来固定核酸探针。UV照射可以例如由UV发射器,例如3-12W UV发射器,例如5-10W UV发射器提供。
仅少量发射的UV光到达并影响核酸探针。因此,当计算固体载体每单位面积经受的能量的量时,必须考虑UV发射器与固体载体之间的距离以及所发射的光束的发散度。
本发明还包括固体载体,其包含通过上文公开的方法获得的固定化核酸探针。
认为紫外光通过位于C=C双键上的反应诱导共价键的形成。嘧啶二聚体是由DNA中的胸腺嘧啶或胞嘧啶碱基通过光化学反应形成的损害而形成的分子损害。因此,理论上,DNA分子本身的损害实际上在探针和PS之间产生结合。
如上所述,核酸探针的末端锚链部分导致对固体载体,如PS固体载体的固定效率提高。据推测这是因为UV光通过位于C=C双键上的反应诱导共价键的形成。如以下实施例所示,与20T10C10聚尾相比,42TTCCTT7聚尾将固定效率提高了至少18倍。聚尾的命名如下。第一个数字表示末端锚链部分(聚尾)的总长度,字母表示核苷酸类型,上角标数字表示重复提及的核苷酸序列的次数。
固体载体表面的结构和结合可以例如使用通过X射线光电子能谱的表面分析来检查。如Janez Kova的“SURFACE CHARACTERIZATION OF POLYMERS BY XPS AND SIMSTECHNIQUES”,Materials and technology 45(2011)3,191-197中所述。
本发明还包括如上文所公开的核酸探针。
新的核酸探针能够以提高的固定效率固定到固体载体。核酸探针包含末端锚链部分和捕获部分,其中核酸探针的末端锚链部分包含N个核苷酸序列或与其具有至少90%的相似性的序列,所述序列由X型碱基的核苷酸的片段与(多个)胞嘧啶型碱基(C)的中间核苷酸组成,其中X型碱基的核苷酸的片段彼此独立地包含2至5个核苷酸,其中N为至少18。
优选的核酸探针是如上文所述的核酸探针。
特别优选的核酸探针是其中N个核苷酸的序列包含根据下式的碱基类型的核苷酸的重复子序列的核酸探针:
(-(X)Y-(C)Z-)M,
其中Y、Z和M如上文所述。
另一种特别优选的核酸探针是其中N个核苷酸的序列包含根据下式的碱基类型的核苷酸的重复子序列的核酸探针:
(-(X)Y2-(C)Z-(X)Y2-)M,
其中Y2、Z和M如上文所述。
本发明还涉及一种适合用于上文所述方法的测试装置。
所述测试装置包括固体载体,其可以是如上文所述的固体载体。固体载体包括至少一个超临界角荧光结构(SAF结构)。SAF结构具有截头圆锥形状,其具有截头锥角α、顶表面、顶径D和高度h。
最佳的截头锥角通常将等于荧光团发射其大部分光的角度。该角度取决于SAF结构以及围绕并与SAF结构接触的介质(即空气或样品流体,例如水或水性流体)的两个各自的折射率,所述介质通常具有与水相同的折射率。已经发现,对于水/PS界面最好是60度,而对于空气/PS界面约50度较好。
截头锥角α可以例如为约40°至约70°,如约55°至约65°,如约60°。
通常,期望截头锥角α为约30°至约70°,如约35至约65,如约40°至约60°,如约40°或约60°。在(多个)SAF结构为聚苯乙烯SAF结构并且适用于与围绕SAF结构的表面并在SAF结构的表面处形成空气/聚苯乙烯界面的空气一起使用的实施方案中,截头锥角α有利地为约35°至约55°。在(多个)SAF结构为聚苯乙烯SAF结构并且适用于与围绕SAF结构的表面并在SAF结构的表面处形成空气/聚苯乙烯界面的水(例如,水性样品流体)一起使用的实施方案中,截头锥角α有利地为约55°至约65°。
在使用中,可以将核酸探针点样到SAF结构的顶表面上并例如如本文其他地方所述干燥。
有利地,SAF结构的高度h为至少约0.2mm,例如约0.25mm至约0.5mm,例如约0.3mm至约0.35mm。已经发现,高度对于获得最佳信号可能是重要的。
有利地,顶径为约0.05mm至约0.5mm,例如约0.1mm至约0.3mm。通常,期望一个或优选多个SAF结构相对小,因为这使得在同一测试装置上有更多的SAF结构。由此,可以使用一个测试装置进行几个测试。然而,在顶径很小的情况下,核酸探针中的一些可以被点样在顶表面的边缘或甚至顶表面的附近。因此,具有非常小的顶径,例如其中D小于约0.2的SAF结构的点样稳健性可能小。
已经发现,通过确保至少一个SAF结构与其顶径相比相对高,所获得的读出信号具有非常好的强度。有利地,SAF结构的顶径与高度的宽高比D/h为约1.1或更小,如约1.05或更小,如约1或更小。
固体载体可以优选为聚合物载体或玻璃载体。优选地,所述载体包含聚苯乙烯(PS)、环烯烃共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或包含前述聚合物中的一种或多种的混合物或组合。
载体材料可以有利地至少对于预期被读出或用于激发的(多个)信号波长是透明的。
例如,Cy3发出黄绿色荧光(~550nm激发,~570nm发射),而Cy5在红色区域发出荧光(~650激发,670nm发射)。
在一个实施方案中,载体材料对于在可见范围之内和之外的一个或多个波长是透明的。
在一个实施方案中,SAF结构是宽高比D/h为约1.1或更小的PS SAF结构。
在一个实施方案中,至少一个SAF结构的顶表面具有顶表面凹部。已经发现,这样的顶表面凹部可以改善SAF结构的点样稳健性,并确保点样的核酸探针根据需要位于SAF结构的中央。因此可以减少丢失信号的风险。
顶表面凹部有利地是圆形的。然而,其可以具有其他形状,例如椭圆形或有角的形状。
有利地,顶表面凹部具有中心轴,该中心轴与SAF结构的中心轴平行。凹部中心轴有利地从SAF结构的中心轴最多偏移约0.2mm,例如最多偏移约0.1mm。优选地,表面凹部的中心轴与SAF结构的中心轴重合。
有利地,凹部具有基本上平的凹部底面。凹部可以例如具有直径d,该直径d是顶径D的约10%或更多,例如顶径D的约15%至约80%,例如约20%至约50%。通常希望凹部直径d为约0.01至约0.2,例如约0.25至约0.1。
有利地,围绕顶表面处的凹部的边缘具有至少0.01mm的宽度。实际上,生产具有顶表面凹部和宽度小于0.005的围绕边缘的SAF结构可能是昂贵的。另一方面,非常大的边缘宽度,例如0.1或更大,或者甚至0.2或更大,可能导致非常小的凹部直径d,这对于一些应用可能是不希望的。
已经发现,凹部有利地不应太高,因为这会降低读出信号。期望的是,凹部高度h1优选应小于SAF高度h的25%,例如小于SAF高度h的20%。
在一个实施方案中,凹部高度h1为约0.05mm或更小,如约0.02或更小。
凹部的边缘可以是锐利的或圆形的。在一个实施方案中,凹部具有圆形的凹部边缘,优选地,凹部边缘是圆形的,具有约0.1mm或更小,例如在0.01mm和0.8mm之间的圆角半径R。
在优选的实施方案中,凹部具有截头圆锥形状,其顶表面由底面形成的表面形成。因此,凹部截头圆锥形状相对于SAF截头圆锥形状倒置翻转。
优选地,凹部截头圆锥形状具有凹部截头锥角θ,其为约40°至约70°,如约55°至约65°,如约60°。已发现在凹部截头锥角θ接近截头锥角α,例如相差最多5度,优选相差最多2度的情况下,信号可以增加。优选地,凹部截头锥角θ与截头锥角α基本相同。
优选地,测试装置是盒或盒的形成部件,所述盒包括通道,所述通道具有限定通道的通道表面,其中包括至少一个SAF结构的固体基材形成所述通道表面的至少一部分。
所述盒可以有利地作为WO2017/133741中所述的微流体盒,不同之处在于(多个)SAF结构如本文所述。
附图简述
将参考附图,通过以下对本发明的实施方案和实施例的说明性且非限制性描述进一步阐明本发明的上述和/或另外的目的、特征和优点。
图1是显示根据本发明的一个实施方案的微流体盒的示意性俯视图、在第一实施例中测试的多个标记的聚尾的图。
图2是显示在第一实施例中各个标记的聚尾的固定百分比的图。
图3是在另外的实施例中应用的流程图。
图4是显示在另外的实施例中测试的许多标记的聚尾的固定百分比的图。
图5是在另外的实施例中聚尾的斑点的图像。
图6显示了本发明的实施方案的两种核酸探针和一种具有对比聚尾(末端锚链部分)的核酸探针。
图7显示了不同浓度的图6a和6b的核酸探针的图像,其中核酸探针被标记。
图8是对照探针和两个不同捕获部分—靶向沙门氏菌的Flic基因和靶向博德特氏菌的Brfz基因的图像。
图9a显示用于进行SP-PCR的第一流程方案。
图9b显示用于进行SP-PCR的第二流程方案。
图10a是带有点样的核酸探针的固体载体的图像,其在洗涤和不洗涤的情况下进行SP-PCR。
图10b是图10a的图像的平均信号减去背景的图。
图11是显示许多标记的聚尾和核酸探针的固定百分比的图,其中使用不同的UV暴露时间固定聚尾/核酸探针。
图12显示标记的聚尾的作为UV暴露时间的函数的固定百分比。
图13a-13e是在洗涤之前和之后在不同的UV暴露时间下获得的许多固定化聚尾和核酸探针的图像,其中所使用的UV发射器是8W UV发射器。
图14a-14c是在洗涤之前和之后在不同的UV暴露时间下获得的许多固定化聚尾和核酸探针的图像,其中所使用的UV发射器是16W UV发射器。
图15a是显示具有不同聚尾的许多标记的核酸探针的信号减去背景的图。
图15b是图15a的固定化核酸探针的图像。
图16a是显示使用不同的UV暴露时间并因此不同的UV剂量固定到固体载体的标记的核酸探针的信号减去背景的图,其中固定化核酸探针已经进行了SP-PCR。
图16b是图16a的固定化核酸探针的图像。
图17是包括固定化核酸探针的SAF结构的横截面视图。
图18是盒的反应通道的区段的透视图,其中反应区段包括具有固定化核酸探针的SAP结构,所述SAP结构已经进行了SP-CPR。
图19是SAF结构的透视图,其示出虚线的顶部以显示截头锥角α。
图19a-19d示出截头锥角为60度的标准SAF结构。
图20a-20e显示具有顶表面凹部的SAF结构。
图21a-21d显示具有顶表面凹部的另一SAF结构。
图22显示实施例11中使用的七种不同的SAF结构。
图23显示实施例11的信号强度结果。
图24显示实施例11的变异系数结果。
为了清楚起见,这些图是示意性的且简化的。贯穿全文,相同的附图标记用于相同或相应的部分。
根据下文给出的描述,本发明的进一步的适用范围将变得显而易见。然而,应当理解,描述和具体实施例虽然显示了本发明的优选实施方案,但是仅通过示例说明的方式给出,因为根据该描述和实施例,在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
使用了将TC标记的DNA寡核苷酸连接在各种基底上的简单UV交联流程方案。使用的流程方案对应于Sun Y,Perch-Nielsen I,Dufva M,等人的“Direct immobilization ofDNA probes on non-modified plastics by UV irradiation and integration inmicrofluidic devices for rapid bioassay”.Anal Bioanal Chem.2012;402(2):741-748.doi:10.1007/s00216-011-5459-4中描述的流程方案。
已显示该技术不仅具有高通用性,而且具有与其他技术相当的高热稳定性。在这项研究中,此方法用于将不同标记的聚尾和标记的核酸探针固定到PS固体载体。以下实施例中使用的标记是荧光染料。使用“Quasar 570”和“Cy3”作为荧光染料。
实验中使用了许多不同标记的聚尾和核酸探针,包括以下在表1中列出的。
表1:用于洗涤和热循环实验的用荧光染料标记的不同聚尾。
5、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22和29号聚尾核酸探针和包含所述聚尾的核酸探针是本发明的实施例。其余的核酸探针或包含聚尾的核酸探针是对比例。
实施例1
在该实施例中,6、9、10、1、2、3、4、5、7、8号聚尾核酸探针或包含所述聚尾的核酸探针(按图1所示的顺序)。
在含0.04%Triton X-100(Sigma-Aldrich,USA)的5×柠檬酸钠盐水(SSC)缓冲液(Promega,WI,USA)中稀释聚尾/核酸探针。使用非接触式sciFLEXARRAYER S11点样机(Scienion,Germany)将聚尾/核酸探针溶液点样到清洁的PS载玻片上。将每种聚尾/核酸探针溶液以四个连续的点点样。干燥后,将载玻片在紫外线交联剂(UVP,Fisher Scientific,Denmark)中暴露于具有1.8焦耳/cm2的能量的254nm下的UV辐射,以将聚尾/核酸探针固定到基材表面上。
之后,使用获自Millipore Corporation的milliQ水将固体载体(PS载玻片)洗涤5分钟。MilliQ水是各种官方机构(例如ISO 3696)所定义的“1类”“超纯”水。
UV暴露后,如下测量并确定固定效率(固定百分比)
固定效率按以下公式计算:
结果显示在图2中。可以看出,聚尾40TC20(上文列出的5号聚尾)具有比对比聚尾高得多的固定效率。
实施例2
该实施例是按照图3所显示的流程图进行的。
使用不同长度和构型的TC聚尾/具有不同聚尾的核酸探针。所使用的标记的聚尾/核酸探针如下(如图4所示,按从左到右的顺序提及):12、5、13、14、15、16、17、18、22、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30号。
使用与实施例1中所述相同的程序固定聚尾/核酸探针。此后,洗涤固体载体。
在点样和UV交联后,通过显微镜获得不同的聚尾/探针的信号。接下来,用0.1x柠檬酸钠盐水(SSC)缓冲液洗涤载玻片5分钟,再在MilliQ水中洗涤5分钟,以去除未连接的探针和荧光信号。
对固体载体成像并按以下公式计算固定效率:
每种聚尾/核酸探针洗涤后的固定效率如图4的第一列所示。
实施例3
然后使固定并洗涤的聚尾/核酸探针经受与严苛的SP-PCR热循环仪处理条件相对应的处理条件。
通过94℃持续2分钟,接着是30个94℃持续10秒、60℃持续20秒,72℃持续20秒的循环的PCR程序,然后是另外15个94℃持续10秒、65℃持续20秒、72℃持续20秒的PCR循环,使固定化聚尾/探针经受不同的温度。在平板PCR热循环仪(Proflex,Thermo fisher)中测试聚尾,并获得荧光信号。
PCR热循环仪处理后的固定效率计算如下:
每种聚尾/核酸探针在PCR热循环仪处理后的固定效率如图4的第二列所示。
可以看出,对于本发明的核酸探针,在洗涤之后,特别是在PCR热循环仪处理之后,固定效率都高得多。特别地,上文提及优选的核酸探针显示出非常高的固定效率。
在实施例2和3中获得的PS载玻片固体载体的图像显示在图5中。显然,带有具有更多T型碱基的聚尾的核酸探针具有异常高的固定效率。
实施例4
合成了3种不同的核酸探针,包括a)根据本发明的一个实施方案的第一核酸探针,其具有核苷酸序列40TTTTC8的聚尾和靶向hilA基因的捕获部分,b)根据本发明的一个实施方案的第二核酸探针,其具有核苷酸序列42TTCCTT7的聚尾和靶向hilA基因的捕获部分,和c)对比核酸探针,其具有核苷酸序列20T10C10的聚尾和具有hilA基因的捕获部分,用于检测沙门氏菌属。核酸探针如图6所示。
将核酸探针以1μM至60μM范围内的不同浓度点样到固体载体(PS基材)。
制备25μL SP-PCR反应混合物。SP-PCR混合物由人样本PCR缓冲液(Thermo Fisher Scientific)、400nM hilA正向和1600nM hilA反向引物和0.05U/μLPhusion Hot Start II高保真DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)组成。使用基因框架(Thermo Fisher Scientific)在固体载体引物阵列周围形成25μL反应室。通过移液器将PCR预混合物装载到基因框架中,并用盖玻片密封。PS载玻片用核酸探针点样。SP-PCR在平板PCR热循环仪中进行,其中一块1厘米厚的聚苯乙烯绝缘泡沫用于将载玻片与PCR热循环仪的盖子隔开。SP-PCR条件为:94℃ 2分钟,接着是30个94℃持续10秒、60℃持续20秒、72℃持续20秒的循环,然后是另外的15个94℃持续10秒、65℃持续20秒、72℃持续20秒的PCR循环。在随后的15个PCR循环中使用较高的退火温度以增强SP-PCR。SP-PCR后,用0.1×SSC和0.1%的十二烷基硫酸钠(SDS)(Promega,WI,USA)洗涤反应室5分钟,然后用去离子水冲洗并在室温下干燥。载玻片准备用于扫描。
在SP-PCR之后,使用显微镜(ZEISS Axiovert 200,Germany)扫描载玻片。使用ImageJ软件(Molecular devices)分析微阵列图像。绘制一个圆圈并调节到斑点的大小,并将平均光强度值确定为信号。在附近绘制的另一个圆圈用作背景。本研究中的信号定义为阵列上4个斑点的信号,扣除平均背景。
图7显示在PS-PCR之后在不同核酸探针浓度下得到的固定效率。可以容易地看出,本发明的核酸探针具有比对比核酸探针高得多的固定效率。
图8是对照探针和两个不同捕获部分—靶向沙门氏菌的Flic基因和靶向博德特氏菌的Brtz基因的图像。使用聚尾42TTCCTT7作为对照探针。
如图7所示,靶向沙门氏菌属的聚尾42TTCCTT7在SP PCR后显示与之前大致相同的圆形,这意味着42TTCCTT7聚尾有助于将整个探针以非常高的结合效率固定在表面上。
图9a中显示的用于进行SP-PCR的第一种流程方案是标准流程方案。
图9b中显示的用于进行SP-PCR的第二种流程方案是新的SP-PCR方法,该方法由于本发明已经成为可用的。由于核酸探针和本发明的方法提供的高固定效率,现在可以在UV交联(固定)后在不洗涤的情况下和/或在PS-PCR过程后在不洗涤的情况下进行SP-PCR。
图10a是带有点样的核酸探针的固体载体的图像,其在洗涤和不洗涤的情况下进行SP-PCR。
实施例5
在实施例5中,使用代表本发明的实施方案的实施例5的两种核酸探针,即核酸探针a)根据本发明的一个实施方案的第一核酸探针,其具有核苷酸序列40TTTTC8的聚尾和靶向hilA基因的捕获部分,和b)根据本发明的一个实施方案的第二核酸探针,其具有核苷酸序列42TTCCTT7的聚尾和靶向hilA基因的捕获部分。
按照实施例4的过程,使用60μM的核酸探针浓度进行点样和SP-PCR过程。
洗涤之前和洗涤之后的结果显示于图10a中。图10b显示了在洗涤和不洗涤的情况下信号减去背景的平均值,并且可以看出,未洗涤样品中有相对少量的假阳性。
实施例6
使许多不同标记的聚尾/核酸探针经受不同的UV暴露时间和不同的UV剂量以进行固定。使用的聚尾/核酸探针如图1所示。
如实施例1中所述将聚尾/核酸探针点样到固体载体上,但是使用不同的UV暴露。
使每种聚尾/核酸探针的四个斑点经受来自8W UV发射器的UV暴露3分钟。使每种聚尾/核酸探针的四个斑点经受来自16W UV发射器的UV暴露8分钟。
结果显示在图11中,其中每种聚尾/核酸探针的左图为8W UV发射器处理3分钟,并且每种聚尾/核酸探针的右图为16W UV发射器处理8分钟。看来8W UV发射器处理3分钟比16W UV发射器处理8分钟更好。
实施例7
在该测试中使用了具有序列40T/C的标记的聚尾(也称为40TC20)。如实施例1中所述将聚尾的样品点样到固体载体上,但是使用不同的UV暴露。
对于某些样品,使用8W UV发射器,对于其他样品,使用16W UV发射器。暴露时间如图12所示变化,其中将洗涤后的固定效率作为两个发射器中每一个的暴露时间的函数作图。
可以看出,较低的瓦数(8瓦UV发射器)优于较高瓦数的发射器。此外,8W发射器在3分钟左右具有最佳的固定,这意味着可以在相当低的UV剂量下将核酸探针固定,这是非常有利的,因为由此可以减少或甚至避免损害捕获部分的风险。
在本发明的实施方案中使用核苷酸序列40TTTTC8的聚尾和靶向hilA基因的捕获部分。
合成了3种不同的核酸探针和c)具有核苷酸序列20T10C10的聚尾和具有用于检测沙门氏菌属的hilA基因的捕获部分的对比核酸探针。所述核酸探针如图6中所示。
在图13a-13e中,显示使用8W UV发射器在洗涤之前和之后在不同的UV暴露时间下获得的固定化聚尾的图像。
在图14a-14c中,显示使用16W UV发射器在洗涤之前和之后在不同的UV暴露时间下获得的固定化聚尾的图像。
实施例8
测试了具有不同长度的聚尾的核酸探针。核酸探针包含靶向博德特氏菌的Brtz基因。
根据实施例1中描述的方法将核酸探针点样、固定和洗涤。图15a显示各种核酸探针的信号减去背景。可以看出具有非常短的聚尾的核酸探针难以固定,并且具有18个核苷酸或更多的聚尾的本发明的实施方案的核酸探针显示出有效的固定。图15b是固定化核酸探针的图像。
实施例10
测试了具有聚尾42TTCCTT7和靶向支气管败血性博德特氏菌的捕获部分的本发明的一个实施方案的核酸探针样品。
根据实施例1中所述的方法,将核酸探针样品点样、固定并洗涤,但是使用不同的UV暴露时间。固定后,如实施例2所述使样品经受PS-PCR处理。
在PS-PCR处理后,确定每个样品的信号减去背景信号。图16a显示了结果,并且可以看出,可以使用非常低的UV剂量获得本发明的实施方案的核酸探针的有效固定。
图16b是固定化核酸探针的图像。
SAF结构1对应于WO17133741中公开的SAF结构,并且进一步的细节可以在该文献中找到。SAF结构被安装到微流体盒的通道的反应区段的底部2。本发明的一个实施方案的用荧光团标记的核酸探针3安装在SAF结构1的顶表面。
SAF结构1具有带顶表面的截头圆锥形状。SAF结构1具有突出的高度、顶表面直径和底径。被激发的荧光团各向异性地以高于超临界角(θc)的角度向SAF结构中发射光—该SAF结构的折射率高于反应区段中的样品、空气或液体。使发出的光准直,并且可以作为光圈由读取器读出。
图18是具有盒的边缘12的反应通道的区段的透视图,其中反应区段包括已进行SP-CPR的具有固定化核酸探针的SAP结构11。
图19显示了SAF结构,示出虚线的顶部,以显示截头锥角α。SAF结构21具有底部周边24,其安装至固体载体的其余部分或与固体载体的其余部分整合在一起。SAF结构在其底部周边具有底径db。SAF结构具有顶表面23,其具有直径D。从底部到顶表面,SAF结构具有高度h。示出的顶部是虚构的顶部,显示其来示出截头锥角。
图19a-19d示出了包括顶表面33的标准SAF结构31。SAF结构与固体载体32的其余部分整合在一起。仅显示了固体载体的其余部分中的一些。如上所述,固体载体可以形成具有通道的盒,或者它可以是其一部分。
图19a是SAF结构31的透视图。
图19b是SAF结构31的俯视图。
图19c是SAF结构31的侧视图。
图19d是在图19c的A-A截面中看到的SAF结构31的横截面视图。
SAF结构具有高度h和顶径D。D和h可以彼此单独地如本文中别处所公开的。示出SAF结构31,其具有60度的截头锥角。应该理解的是,SAF结构可以具有如本文别处所公开的另一截头锥角。
可以看出顶表面是平的。
在一个实施方案中,SAF结构31具有以下尺寸:
D=0.2mm;h=0.25mm,并且SAF截头锥角α是60度。
图20a-20d示出了优选的SAF结构41,该SAF结构41包括具有凹部44的顶表面43。该SAF结构与固体载体42的其余部分整合在一起。
图20a是SAF结构41的透视图。
图20b是SAF结构41的俯视图。
图20c是SAF结构41的侧视图。
图20d是在图20c的截面A-A中看到的SAF结构41的横截面视图。
图20e显示图20a的一部分,其中标记了凹部边缘宽度W。凹部边缘宽度W有利地是至少约0.008,例如至少约0.01,例如至少约0.015。
该SAF结构具有高度h和顶径D。D和h可以彼此单独地如本文别处所公开的。SAF结构高度h由不带凹部44的顶表面43确定。
凹部具有高度h1,其可以如本文别处所公开的。
凹部基本上是圆形的,并且被定位成使得其中心轴与SAF的中心轴重合。凹部具有高度h1,其可以如本文别处所公开的。
可以看出,凹部底面基本上是平的。凹部直径d在凹部的底面确定,并且可以是如本文别处所公开的。
凹部具有截头圆锥形状,其顶表面由底面形成。
在所显示的实施方案中,截头锥角θ和截头锥角α均为60度。应理解,凹部截头锥角θ和SAF截头锥角α可以具有如本文别处所公开的(多个)其他值。
凹部提高点样的稳健性并增加了读出信号强度。
在一个实施方案中,SAF结构41具有以下尺寸:
D=0.2mm,h=0.25mm,d=0.05mm,h1=0.01mm,SAF截头锥角α为60度,且凹部截头锥角θ为60度。
在另一个实施方案中,SAF结构41具有以下尺寸:
D=0.2mm,h=0.3mm,d=0.05mm,h1=0.01mm,SAF截头锥角α为60度,且凹部截头锥角θ为60度。
图21a-21d示出了另一个优选的SAF结构51,其包括具有凹部54的顶表面53。该SAF结构与固体载体52的其余部分整合在一起。
图21a是SAF结构51的透视图。
图21b是SAF结构51的俯视图。
图21c是SAF结构51的侧视图。
图21d是在图21c的截面A-A中看到的SAF结构51的横截面视图。
该SAF结构具有高度h和顶径D。D和h可以彼此单独地如本文别处所公开的。该SAF结构高度h由不带凹部54的顶表面53确定。
凹部54具有高度h1,其可以如本文别处所公开的。
凹部基本上是圆形的,并且被定位成使得其中心轴与SAF的中心轴重合。凹部具有高度h1,其可以如本文别处所公开的。
可以看出,凹部底面基本上是平的。凹部直径d在凹部的底面确定,并且可以如本文别处所公开的。
凹部具有圆的凹部边缘,该凹部边缘具有圆角半径R,其可以如本文别处所公开的。
在一个实施方案中,SAF结构51具有以下尺寸:
D=0.2mm;h=0.25mm,d=0.08mm,h1=0.01mm,凹部边缘为圆形,半径R=0.05,并且SAF截头锥角α为60度。
在另一个实施方案中,SAF结构51具有以下尺寸:
D=0.2mm;h=0.3mm,d=0.08mm,h1=0.01mm,凹部边缘为圆形,半径R=0.05mm,并且SAF截头锥角α为60度。
实施例11
由聚苯乙烯制备了七个盒。每个盒具有微流体通道,所述微流体通道具有反应区段和从反应区段中的壁突出的八个相同的SAF结构。
第一盒的SAF结构成形为图22中的1号SAF结构;第二盒的结构成形为图22中的2号SAF结构,依此类推。
3号SAF结构是图19a-19d所显示的类型。
5号SAF结构是图21a-21d中所显示的类型,并且6号SAF结构是图20a-20e所显示的类型。
将等量的Cy3标记的寡核苷酸点样到各个SAF结构中的每个的顶表面上,并使其干燥。
在第一轮测试中,使反应室保持充满空气。使Cy3标记经受激发波长(~550nm)的光,并检测SAF结构发射信号的信号强度。
对于每个盒,均确定了平均SAF结构的空气/PS界面强度信号。
在第二轮测试中,将各个盒的反应室充满水。使Cy3标记经受激发波长(~550nm)的光,并检测SAF结构发射信号的信号强度。
对于每个盒,均确定了平均SAF结构的水/PS界面强度信号。
结果如图23中所示。
确定各个盒的SAF结构的变异系数(CoV)。
可以看出,1号和2号SAF结构对空气/PS界面信号具有相对高的光强度。但是,对于空气/PS界面信号强度和水/PS界面信号二者,CoV都相对高。
6号SAF结构对于水/PS界面信号和CoV具有最高的光强度。但是,对于空气/PS界面信号强度和水/PS界面信号,CoV都相对高。
然而,样品6的CoV相对高。认为该CoV值相对高的原因是一些SAF结构在其与其余的固体载体整合在一起的底部周边处有小表面波纹和/或突起,可能导致信号损失。因此,期望通过减小顶径与高度宽高比D/h,可以减轻这种可能的光信号损失。认为通过将高度增加到例如约0.3mm,信号可以增加,并且CoV可以降低。
5号SAF结构对于水/PS界面信号具有最高的光强度和低CoV。
认为凹部的圆形边缘确保了非常有效且稳健的点样,从而有助于低CoV。
6号SAF结构对于水/PS界面信号和CoV具有最高的光强度。但是,对于空气/PS界面信号强度和水/PS界面信号,CoV都相对高。
Claims (100)
1.一种将核酸探针固定到固体载体的方法,所述方法包括:
·提供包含末端锚链部分和捕获部分的核酸探针,
·将所述核酸探针施加到固体载体的表面上,和
·通过使所述核酸探针的锚链部分经受UV光将其锚定到固体载体,
其中,所述核酸探针的末端锚链部分包含N个核苷酸的序列或与其具有至少90%的相似性的序列,所述N个核苷酸的序列由X型碱基的核苷酸的片段与(多个)胞嘧啶型碱基(C)的中间核苷酸和任选的一个鸟嘌呤型碱基(G)的核苷酸组成,其中所述X型碱基的核苷酸的片段彼此独立地包含1至5个核苷酸,其中N为至少18,并且其中每个X型碱基彼此独立地指定为胸腺嘧啶型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)。
2.权利要求1所述的方法,其中所述核酸探针的末端锚链部分包含由X型碱基的核苷酸的片段与(多个)胞嘧啶型碱基(C)的中间核苷酸组成的N个核苷酸的辅助序列。
3.权利要求1或权利要求2所述的方法,其中所述N个核苷酸的序列包含少于5%的具有嘌呤核碱基的核苷酸,如1个或0个具有嘌呤核碱基的核苷酸。
4.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N个核苷酸的序列仅包含具有嘧啶核碱基的核苷酸。
5.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述核酸探针的末端锚链部分包含至少N个核苷酸的序列,所述序列由2至5个X型碱基的核苷酸的片段与(多个)C型碱基的中间核苷酸组成。
6.前述权利要求中任一项所述的方法,其中N为至少20,例如至少26、例如至少30、例如至少34、例如至少38、例如至少40。
7.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述X型碱基的核苷酸的片段彼此独立地由1-4个C型碱基的核苷酸隔开。
8.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述X型碱基的核苷酸的片段具有相等的长度,优选2个X型碱基的核苷酸的长度、3个X型碱基的核苷酸的长度或4个X型碱基的核苷酸的长度。
9.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N个核苷酸的序列包含根据下式的碱基类型的核苷酸的重复子序列:
(-(X)Y-(C)Z-)M,
其中Y是1至5的整数,Z是1至5的整数,Y≥Z,并且M是4至20的整数。
10.权利要求9所述的方法,其中Y是2至5的整数,Z是1至4的整数,Y>Z,并且M是4至20的整数。
11.权利要求9或权利要求10所述的方法,其中Z=1。
12.权利要求9或权利要求10所述的方法,其中Z=2。
13.权利要求9-12中任一项所述的方法,其中
Y=2并且M≥10,例如M≥12,例如M≥14
或
Y=3并且M≥6,例如M≥8,例如M≥10
或
Y=4并且M≥4,例如M≥6,例如M≥8。
14.前述权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述N个核苷酸的序列包含根据下式的碱基类型的核苷酸的重复子序列:
(-(X)Y2-(C)Z-(X)Y2-)M,
其中Y2是1至4的整数,Z是1至4的整数,并且M是4至20的整数。
15.权利要求14所述的方法,其中Y2是2至3的整数,Z是1至3的整数。
16.权利要求14或权利要求15所述的方法,其中Y2≥Z,优选地,Y2>Z。
17.权利要求14-16中任一项所述的方法,其中
Y2=2并且M≥10,例如M≥12,例如M≥14
或
Y2=3并且M≥4,例如M≥6,例如M≥8。
18.前述权利要求中任一项所述的方法,其中Y或Y2的数值大于Z的数值,优选地,Y或Y2的数值是Z的数值的至少两倍。
19.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述X型碱基的核苷酸的片段是T型碱基的核苷酸的片段。
20.前述权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述X型碱基的核苷酸的片段是U型碱基的核苷酸的片段。
21.前述权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述X型碱基的核苷酸的片段包含T型碱基的核苷酸和U型碱基的核苷酸二者,如交替的T型碱基的核苷酸和U型碱基的核苷酸。
22.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述末端锚的N个核苷酸的序列位于5′端或3′端,或其中所述核酸探针在其5′端或在其3′端均具有末端锚,其中各自在5′端和3′端的所述N个核苷酸的序列可以彼此相同或不同。
23.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述核酸探针包含DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA;其寡核苷酸、其片段;或其任意组合。
24.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述核酸探针是从天然来源获得的,或是完全或部分合成的,优选地,所述核酸探针或至少所述核酸探针的末端锚链部分至少是部分合成的,优选是完全合成的。
25.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述核酸探针是单链的。
26.前述权利要求1-24中任一项所述的方法,其中所述核酸探针在其长度的至少一部分中,如在其捕获部分的一部分中是双链的。
27.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述捕获部分包含引物,如适用于引物延伸的引物。
28.前述权利要求中任一项所述的方法,其中捕获部分包含杂交链部分,所述杂交链部分包含核苷酸的序列,如适用于与目标核酸探针的互补区杂交和/或适用于进行聚合酶链反应(PCR)分析的核苷酸的序列。
29.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述捕获部分包含具有约4至约100个核苷酸,如约10至约50个核苷酸,如约20至约30个核苷酸的核苷酸链。
30.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述捕获部分直接连接到末端锚链部分。
31.前述权利要求1-29中任一项所述的方法,其中所述捕获部分通过间隔子,如脱碱基间隔子,如重复数目的间隔子连接到末端锚链部分。
32.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述末端锚链部分位于核酸探针的5′端或3′端,并且所述捕获部分H位于5′端和3′端中的另一个。
33.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述核酸探针在5′端和3′端均包含末端锚链部分,并且所述捕获部分位于任选地具有介于中间的(多个)间隔子的末端锚链部分之间。
34.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述核酸探针包含标记,如放射性标记或荧光标记,如花青染料,例如Cy3(1,1′-双(3-羟基丙基)-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青)或Cy5(1,1′-双(3-羟基丙基)-3,3,3′,3′-四甲基吲哚二羰花青)。
35.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述核酸探针通过点样沉积在固体载体的表面上,优选地,所述点样包括将在溶剂中的核酸探针点样到固体载体的表面上。
36.权利要求35所述的方法,其中所述核酸探针在溶剂中以最高100μM的浓度,如约1μM至约80μM,如约3μM至约70μM,如约5μM至约60μM的浓度点样。
37.权利要求35或权利要求36所述的方法,其中所述点样的核酸探针在其经受UV光之前被干燥。
38.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述固体载体是聚合物载体或玻璃载体,优选地,所述载体包括聚苯乙烯(PS)、环烯烃共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或包含前述聚合物中的一种或多种的混合物。
39.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述固体载体包含聚苯乙烯(PS)或是聚苯乙烯(PS)固体载体,优选地,至少所述固体载体的表面是PS表面,优选地,所述基材是不发泡的。
40.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述固体载体是注射成型的固体载体,任选地用富氧等离子体对其进行成型后的表面改性以引入极性基团。
41.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述固体载体表面基本上不含胺基、亚甲基、硫醇基、环氧基、重氮基或酰胺基中的一种或多种,优选地,所述载体表面基本上不含胺基、亚甲基、硫醇基、环氧基、重氮基或酰胺基中的全部。
42.前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述固体载体是盒的至少一部分,所述盒包括通道,所述通道具有限定通道的通道表面,其中所述固体基材的表面形成通道表面的至少一部分。
43.权利要求42所述的方法,其中所述通道包括反应区段,所述方法包括将核酸探针固定到通道的反应区段内的表面。
44.权利要求43所述的方法,其中所述反应区段包括至少一个光学元件,所述光学元件优选被构造成重定向固定化核酸探针的荧光标记(荧光团)或连接到固定化核酸探针的荧光标记(荧光团)发出的光,并且优选使其准直。
45.权利要求44所述的方法,其中所述光学元件包括透镜结构和/或超临界角荧光结构(SAF结构),所述SAF结构优选具有顶表面,并且所述方法包括将核酸探针固定到顶表面。
46.权利要求45所述的方法,其中所述光学元件具有截头圆锥形状,其具有截头锥角α、顶表面、顶径D和高度h,优选地,所述截头锥角α为约30°至约70°,如约35至约65,如约40°至约60°,如约40°或约60°,如对于空气/聚苯乙烯界面为约35°至约55°或对于水/聚苯乙烯界面为约55°至约65°。
47.权利要求46所述的方法,其中所述高度h为至少约0.2mm,如约0.25mm至约0.5mm,如约0.3mm至约0.35mm。
48.权利要求46或权利要求47所述的方法,其中所述顶径为约0.05mm至约0.5mm,如约0.1mm至约0.3mm。
49.权利要求46-48中任一项所述的方法,其中所述至少一个SAF结构的顶径与高度宽高比D/h为约1.1或更小,如约1.05或更小,如约1或更小,优选地,所述SAF结构是聚合物SAF结构,更优选地,所述SAF结构是聚苯乙烯(PS)SAF结构。
50.权利要求46-49中任一项所述的方法,其中所述至少一种SAF结构的顶表面具有顶表面凹部,所述顶表面凹部优选是圆形的,更优选地,所述顶表面凹部具有与SAF结构的中心轴平行的中心轴,并且优选地从所述SAF结构的中心轴最多偏移约0.2mm,如最多偏移约0.1mm,更优选地,所述表面凹部的中心轴与SAF结构的中心轴重合。
51.权利要求50所述的方法,其中所述凹部具有基本上平的凹部底面,优选地,所述凹部具有直径d,其为顶径D的约10%或更多,如顶径D的约15%至约80%,如约20%至约50,优选地,围绕所述顶表面处的凹部的边缘具有至少0.01mm的宽度。
52.权利要求51所述的方法,其中所述凹部直径d为约0.01至约0.2,如约0.25至约0.1。
53.权利要求50-52中任一项所述的方法,其中所述凹部具有高度h1,其为约0.05mm或更小,如约0.02或更小。
54.权利要求50-53中任一项所述的方法,其中所述凹部具有圆形的凹部边缘,优选地,所述凹部边缘是圆形的,具有约0.1mm或更小,如0.01至0.8mm的圆角半径R。
55.权利要求50-53中任一项所述的方法,其中所述凹部具有截头圆锥形状,其顶表面由所述底面形成的表面形成,优选地,所述凹部截头圆锥形状具有约40°至约70°,如约55°至约65°,如约60°的凹部截头锥角θ,更优选地,所述凹部截头锥角θ基本上与截头锥角α相同。
56.前述权利要求中任一项所述的方法,其中通过使所述核酸的锚链部分经受UV光,将其锚定到固体载体上,所述UV光具有约250nm至500nm范围内的波长,优选具有约254nm、约265nm和/或约365nm中至少一种的波长。
57.前述权利要求中任一项所述的方法,其中通过使用约0.2焦耳/cm2至约15焦耳/cm2,如约1焦耳/cm2至约10焦耳/cm2,如约1.5焦耳/cm2至约6焦耳/cm2,如约1.6焦耳/cm2至约3焦耳/cm2,如约1.7焦耳/cm2至约2焦耳/cm2的量的能量,使所述核酸的锚链部分经受UV光,将其锚定到固体载体。
58.一种包括固定化核酸探针的固体载体,所述固体基材可通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得。
59.一种适合被固定到固体载体的核酸探针,所述核酸探针包含末端锚链部分和捕获部分,其中所述核酸探针的末端锚链部分包含N个核苷酸的序列或与其具有至少90%的相似性的序列,所述N个核苷酸的序列由X型碱基的核苷酸的片段与(多个)胞嘧啶型碱基(C)的中间核苷酸组成,其中所述X型碱基的核苷酸的片段彼此独立地包含2至5个核苷酸,其中N为至少18,并且其中每个X型碱基彼此独立地指定为胸腺嘧啶型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)。
60.权利要求59所述的核酸探针,其中所述核酸探针的末端锚链部分包含由X型碱基的核苷酸的片段与(多个)胞嘧啶型碱基(C)的中间核苷酸组成的N个核苷酸的辅助序列。
61.权利要求59或权利要求60所述的核酸探针,其中所述N个核苷酸的序列包含少于5%的具有嘌呤核碱基的核苷酸,如1个或0个具有嘌呤核碱基的核苷酸。
62.权利要求59-61中任一项所述的核酸探针,其中所述N个核苷酸的序列仅包含具有嘧啶核碱基的核苷酸。
63.权利要求59-62中任一项所述的核酸探针,其中所述核酸探针的末端锚链部分包含至少N个核苷酸的序列,所述序列由2至5个X型碱基的核苷酸的片段与(多个)C型碱基的中间核苷酸组成。
64.权利要求59-63中任一项所述的核酸探针,其中N为至少20,例如至少26、例如至少30、例如至少34、例如至少38、例如至少40。
65.权利要求59-64中任一项所述的核酸探针,其中所述X型碱基的核苷酸的片段彼此独立地由1-4个C型碱基的核苷酸隔开。
66.权利要求59-65中任一项所述的核酸探针,其中所述X型碱基的核苷酸的片段具有相等的长度,优选2个X型碱基的核苷酸的长度、3个X型碱基的核苷酸的长度或4个X型碱基的核苷酸的长度。
67.权利要求59-66中任一项所述的核酸探针,其中所述N个核苷酸的序列包含根据下式的碱基类型的核苷酸的重复子序列:
(-(X)Y-(C)Z-)M,
其中Y是1至5的整数,Z是1至5的整数,Y≥Z,并且M是4至20的整数。
68.权利要求59-67中任一项所述的核酸探针,其中Y是2至5的整数,Z是1至4的整数,Y>Z,并且M是4至20的整数。
69.权利要求67-68中任一项所述的核酸探针,其中Z=1或Z=2。
70.权利要求67-69中任一项所述的核酸探针,其中
Y=2并且M≥10,例如M≥12,例如M≥14
或
Y=3并且M≥6,例如M≥8,例如M≥10
或
Y=4并且M≥4,例如M≥6,例如M≥8。
71.权利要求59-66中任一项所述的核酸探针,其中所述N个核苷酸的序列包含根据下式的碱基类型的核苷酸的重复子序列:
(-(X)Y2-(C)Z-(X)Y2-)M,
其中Y2是1至4的整数,Z是1至4的整数,并且M是4至20的整数。
72.权利要求71所述的核酸探针,其中Y2是2至3的整数,Z是1至3的整数。
73.权利要求71或权利要求72所述的核酸探针,其中Y2≥Z,优选地
Y2=2并且M≥10,例如M≥12,例如M≥14
或
Y2=3并且M≥4,例如M≥6,例如M≥8。
74.权利要求59-73中任一项所述的核酸探针,其中X的数值大于Z的数值,优选地,X的数值至少是Z的数值的两倍。
75.权利要求59-74中任一项所述的核酸探针,其中所述X型碱基的核苷酸的片段是T型碱基的核苷酸的片段。
76.权利要求59-74中任一项所述的核酸探针,其中所述X型碱基的核苷酸的片段是U型碱基的核苷酸的片段。
77.权利要求59-74中任一项所述的核酸探针,其中所述X型碱基的核苷酸的片段包含T型碱基的核苷酸和U型碱基的核苷酸二者,如交替的T型碱基的核苷酸和U型碱基的核苷酸。
78.权利要求59-77中任一项所述的核酸探针,其中所述末端锚的N个核苷酸的序列位于5′端或3′端,或其中所述核酸探针在其5′端或在其3′端均具有末端锚,其中各自在5′端和3′端的所述N个核苷酸的序列可以彼此相同或不同。
79.权利要求59-78中任一项所述的核酸探针,其中所述核酸探针包含DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA;其寡核苷酸、其部分;或其任意组合。
80.权利要求59-79中任一项所述的核酸探针,其中所述捕获部分包含引物,如适用于引物延伸的引物。
81.权利要求59-80中任一项所述的核酸探针,其中捕获部分包含杂交链部分,所述杂交链部分包含核苷酸的序列,如适用于与目标核酸探针的互补区杂交和/或适用于进行聚合酶链反应(PCR)分析的核苷酸的序列。
82.权利要求59-81中任一项所述的核酸探针,其中所述捕获部分包含具有约4至约100个核苷酸,如约10至约50个核苷酸,如约20至约30个核苷酸的核苷酸链。
83.权利要求59-82中任一项所述的核酸探针,其中所述捕获部分直接连接到末端锚链部分。
84.权利要求59-82中任一项所述的核酸探针,其中所述捕获部分通过间隔子,如脱碱基间隔子,如重复数目的间隔子连接到末端锚链部分。
85.权利要求59-84中任一项所述的核酸探针,其中所述末端锚链部分位于核酸探针的5′端或3′端,并且所述捕获部分H位于5′端和3′端中的另一个。
86.权利要求59-85中任一项所述的核酸探针,其中所述核酸探针在5′端和3′端均包含末端锚链部分,并且所述捕获部分位于任选地具有介于中间的(多个)间隔子的末端锚链部分之间。
87.权利要求59-86中任一项所述的核酸探针,其中所述核酸探针包含标记,如放射性标记或荧光标记,如花青染料,例如Cy3(1,1′-双(3-羟基丙基)-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青)或Cy5(1,1′-双(3-羟基丙基)-3,3,3′,3′-四甲基吲哚二羰花青)。
88.一种测试装置,其包括固体载体,所述固体载体包括至少一个超临界角荧光结构(SAF结构),所述SAF结构具有截头圆锥形状,其具有截头锥角α、顶表面、顶径D和高度h,优选地,所述截头锥角α为约30°至约70°,如约35至约65,如约40°至约60°,如约40°或约60°,如对于空气/聚苯乙烯界面为约35°至约55°或对于水/聚苯乙烯界面为约55°至约65°。
89.权利要求88所述的测试装置,其中所述高度h为至少约0.2mm,如约0.25mm至约0.5mm,如约0.3mm至约0.35mm。
90.权利要求88或权利要求89所述的测试装置,其中所述顶径为约0.05mm至约0.5mm,如约0.1mm至约0.3mm。
91.权利要求88-90中任一项所述的测试装置,其中所述至少一个SAF结构的顶径与高度宽高比D/h为约1.1或更小,如约1.05或更小,如约1或更小,优选地,所述SAF结构是聚合物SAF结构。
92.权利要求88-91中任一项所述的测试装置,其中所述固体载体是聚合物载体或玻璃载体,优选地,所述载体包括聚苯乙烯(PS)、环烯烃共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或包含前述聚合物中的一种或多种的混合物或组合。
93.权利要求88-92中任一项所述的测试装置,其中所述SAF结构为聚苯乙烯(PS)SAF结构。
94.权利要求88-93中任一项所述的测试装置,其中所述至少一个SAF结构的顶表面具有顶表面凹部,所述顶表面凹部优选是圆形的,更优选地,所述顶表面凹部具有与SAF结构的中心轴平行的中心轴,并且优选地从所述SAF结构的中心轴最多偏移约0.2mm,如最多偏移约0.1mm,更优选地,所述表面凹部的中心轴与SAF结构的中心轴重合。
95.权利要求94所述的测试装置,其中所述凹部具有基本上平的凹部底面,优选地,所述凹部具有直径d,其为顶径D的约10%或更多,如顶径D的约15%至约80%,如约20%至约50,优选地,围绕所述顶表面处的凹部的边缘具有至少0.01mm的宽度。
96.权利要求95所述的测试装置,其中所述凹部直径d为约0.01至约0.2,如约0.25至约0.1。
97.权利要求88-96中任一项所述的测试装置,其中所述凹部具有高度h1,其为约0.05mm或更小,如约0.02或更小。
98.权利要求88-97中任一项所述的测试装置,其中所述凹部具有圆形的凹部边缘,优选地,所述凹部边缘是圆形的,具有约0.1mm或更小,如0.01至0.8mm的圆角半径R。
99.权利要求88-98中任一项所述的测试装置,其中所述凹部具有截头圆锥形状,其顶表面由所述底面形成的表面形成,优选地,所述凹部截头圆锥形状具有约40°至约70°,如约55°至约65°,如约60°的凹部截头锥角θ,更优选地,所述凹部截头锥角θ基本上与截头锥角α相同。
100.权利要求88-99中任一项所述的测试装置,其中所述测试装置是盒的至少一部分,所述盒包括通道,所述通道具有限定通道的通道表面,其中所述包括至少一个SAF结构的固体基材形成通道表面的至少一部分。
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