JP7264877B2 - 核酸プローブ、及び固形担体に核酸プローブを固定する方法 - Google Patents
核酸プローブ、及び固形担体に核酸プローブを固定する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7264877B2 JP7264877B2 JP2020511487A JP2020511487A JP7264877B2 JP 7264877 B2 JP7264877 B2 JP 7264877B2 JP 2020511487 A JP2020511487 A JP 2020511487A JP 2020511487 A JP2020511487 A JP 2020511487A JP 7264877 B2 JP7264877 B2 JP 7264877B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- nucleotides
- acid probe
- base type
- item
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
- B01J2219/00572—Chemical means
- B01J2219/00576—Chemical means fluorophore
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00709—Type of synthesis
- B01J2219/00711—Light-directed synthesis
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/0072—Organic compounds
- B01J2219/00722—Nucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
- C12Q2565/518—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the immobilisation of the nucleic acid sample or target
Description
(a)1つの塩基タイプのみのヌクレオチドストレッチを有する核酸を提供する工程であって、1つの塩基タイプのみのヌクレオチドストレッチが少なくとも核酸の3’又は5’末端に位置する、工程と、
(b)光で架橋することにより固形担体上に核酸を固定する工程であって、光で架橋することが約300~500nmの波長で、好ましくは365nmの波長で実施され、1つの塩基タイプのみのヌクレオチドストレッチが約7~約100ヌクレオチドの長さを有し、且つ架橋することが約0.5ジュール/cm2~約10ジュール/cm2の範囲内のエネルギー量を用いて実施される、工程と、
を含む。
ある実施形態では、固形基材に核酸プローブを固定する方法であって、基材が、前処理、たとえば、固形担体のアミン官能基化又はチオール官能基化を含む前処理を必要としないものである、好ましくは、基材が、射出成形により作製された後でなんら表面官能基化を必要としない熱可塑性・射出成形性材料である、方法を提供することが目的である。
本発明は、固形担体に核酸プローブを固定する新しい有効な方法を提供する。本発明の発明者らは、固定効率が驚くほど高い且つ核酸プローブの望ましくない損傷リスクが非常に低い、固形担体に核酸プローブを固定するための新規なアンカーチェンジを見いだした。
・末端アンカー鎖部分とキャプチャー部分とを含むように核酸プローブを提供することと、
・固形担体の表面上に核酸プローブを適用することと、
・UV光に暴露することにより固形担体に核酸プローブのアンカー鎖部分をアンカーすることと、
を含む。
パーセント類似性は、塩基タイプCの中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプXの1~5ヌクレオチドのストレッチの組成と異なるNヌクレオチドの配列中のヌクレオチドの数nをカウントして類似性パーセント100×(N-n)/Nを計算することにより決定される。
「標的成分」という用語は、キャプチャー部分よりキャプチャーされうる及び/又はハイブリダイゼーション、プライマー伸長、他の反応などによりキャプチャー部分で合成されうるいずれかの成分を意味する。
「約」という用語は、一般的には、測定不確実性の範囲内のものを含むように用いられる。範囲で用いられた場合、「約」という用語は、本明細書では、測定不確実性の範囲内のものがその範囲に含まれることを意味するものとみなすべきである。
本明細書又は特許請求の範囲の全体を通じて、とくに明記されていない限り又は文脈上必要とされない限り、単数は複数を包含する。
範囲及び好ましい範囲を含めて、本明細書に記載の本発明の特徴及び本発明の実施形態はすべて、かかる特徴を組み合わせない特別な理由がない限り、本発明の範囲内で各種方法で組み合わせうる。
ある実施形態では、核酸プローブの末端アンカー鎖部分は、塩基タイプCの中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプXの2~5ヌクレオチドのストレッチで構成された少なくともNヌクレオチドの配列を含む。
ある実施形態では、塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチは、等しい長さ、好ましくは塩基タイプXの2ヌクレオチドの長さ、塩基タイプXの3ヌクレオチドの長さ、又は塩基タイプXの4ヌクレオチドの長さである。
(-(X)Y-(C)Z-)M
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む。式中、Yは1~5の整数であり、Zは1~5の整数であり、Y≧Zであり、且つMは4~20の整数である。
ある実施形態では、Z=1である。ある実施形態では、Z=2である。ある実施形態では、Y=2且つM≧10、たとえばM≧12、たとえばM≧14である。ある実施形態では、Y=3且つM≧6、たとえばM≧8、たとえばM≧10である。ある実施形態では、Y=4且つM≧4、たとえばM≧6、たとえばM≧8である。
(-(X)Y2-(C)Z-(X)Y2-)M
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む。式中、Y2は1~4の整数であり、Zは1~4の整数であり、且つMは4~20の整数である。
ある実施形態では、Y又はY2の数はZの数よりも大きく、好ましくはY又はY2の数はZの数の少なくとも2倍である。
ある実施形態では、塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチは、塩基タイプUのヌクレオチドのストレッチである。
「LNA」という用語は、ロックド核酸を意味する。典型的には、ロックド核酸は、修飾によりアクセス不能にしたRNAヌクレオチドである。LNAヌクレオチドのリボース部分は、たとえば、2’炭素と4’炭素とを接続する追加のブリッジで修飾される。
「CNA」という用語は、アミノシクロヘキシルエタン酸核酸を意味する。そのうえさらに、この用語は、シクロペンタン核酸、すなわち、2’-デオキシカルバグアノシンなどを含む核酸分子を意味する。
ある実施形態では、核酸プローブのキャプチャー部分である本明細書に定義される核酸分子は、短いオリゴヌクレオチド、長いオリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドの形態でありうる。
ある実施形態では、核酸プローブは、天然源から得られるか又は全合成若しくは部分合成される。
ある実施形態では、全核酸プローブは一本鎖である。
キャプチャー部分は、原理的には、標的成分をキャプチャー可能ないずれかの種類の部分でありうる。
ある実施形態では、キャプチャー部分は、スペーサ、たとえば脱塩基スペーサ、たとえばある繰返し数のスペーサを介して末端アンカー鎖部分に結合される。
ある実施形態では、核酸プローブは、5’末端及び3’末端の両方に末端アンカー鎖部分を含み、且つキャプチャー部分は、末端アンカー鎖部分間に位置し、それらの間に任意選択的にスペーサを有する。
「スポッティング」及び「プリンティング」という用語は、本明細書では同義的に用いられる。
スポッティングは、たとえば、コンピュータープリンターと同一の技術を用いてインクの代わりにプローブ溶液のナノリットル~ピコリットルの体積のドロップレットを固形担体の表面上に吐出するスポッティングロボット及び/又はインクジェットプリンターを用いて実施しうる。代替的に、こうしたプローブは、ピンを用いて固形担体の表面上の特定の位置に直接適用可能である。
実際には、固形担体は、いずれの種類の材料であってもそれらの組合せであってもよい。有利には、固形担体は、ポリマー担体又はガラス担体であり、好ましくは、担体は、ポリスチレン(PS)、環状オレフィンコポリマー(COC)、ポリカーボネート(PC)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、又は上述したポリマーの1つ以上を含む混合物を含む。
好ましい実施形態では、固形担体は、ポリスチレン(PS)を含むか又はポリスチレン(PS)である。好ましくは、核酸プローブがスポットされた固形担体の少なくとも表面はPS表面である。一般的には、基材は非発泡体であり、略低摩擦の平滑表面を有することが望ましい。
そのため、ある実施形態では、固形担体表面は、アミン基、メチレン基、チオール基、エポキシ基、ジアゾ基、又はアミド基の1つ以上を本質的に含まず、好ましくは、担体表面は、アミン基、メチレン基、チオール基、エポキシ基、ジアゾ基、又はアミド基のすべてを本質的に含まない。
ある実施形態では、固形担体は、チャネルを画定するチャネル表面を備えたチャネルを含むカートリッジの一部であるか又は一部を形成し、固形基材の表面は、チャネル表面の少なくとも一部を形成する。
有利には、固形基材は、以下にさらに記載される試験デバイスの一部であるか又は一部を形成する。
紫外光は、C=C二重結合に局在する反応により共有結合の形成を誘発すると考えられる。ピリミジンダイマーは、光化学反応を介してDNA中のチミン塩基又はシトシン塩基から形成された損傷から形成された分子損傷である。したがって、理論上、DNA分子自体の損傷は、実際にはプローブとPSとの間の結合を形成する。
新規な核酸プローブは、増加した固定効率で固形担体に固定可能である。核酸プローブは、末端アンカー鎖部分とキャプチャー部分とを含み、核酸プローブの末端アンカー鎖部分は、塩基タイプシトシン(C)の中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチで構成されたNヌクレオチドの配列又はそれに対して少なくとも90%の類似性を有する配列を含み、塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチは、互いに独立して2~5ヌクレオチドを含み、Nは少なくとも18である。
とくに好ましい核酸プローブは、Nヌクレオチドの配列が式
(-(X)Y-(C)Z-)M
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む核酸プローブである。式中、Y、Z、及びMは、以上に記載した通りである。
(-(X)Y2-(C)Z-(X)Y2-)M
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む核酸プローブである。式中、Y2、Z、及びMは、以上に記載した通りである。
試験デバイスは、以上に記載の固形担体でありうる固形担体を含む。固形担体は、少なくとも1つの超臨界角蛍光構造体(SAF構造体)を含む。SAF構造体は、切頭体角α、トップ表面、トップ直径D、及び高さhを有する円錐状切頭体形状を有する。
一般的には、切頭体角αは、約30度~約70度、たとえば約35~約65、たとえば約40度~約60度、たとえば約40度又は約60度であることが望ましい。SAF構造体がポリスチレンであり且つSAF構造体の表面で空気/ポリスチレン界面を取り囲んでそれを形成する空気と併用するように適合化された実施形態では、切頭体角αは有利には約35度~約55度である。SAF構造体がポリスチレンであり且つSAF構造体の表面で空気/ポリスチレン界面を取り囲んでそれを形成する水(たとえば水性サンプル流体)と併用するように適合化された実施形態では、切頭体角αは有利には約55度~約65度である。
有利には、SAF構造体の高さhは、少なくとも約0.2mm、たとえば約0.25mm~約0.5mm、たとえば約0.3mm~約0.35mmである。最適なシグナルを得るために高さが重要でありうることを見いだした。
たとえば、Cy3は、緑黄色の蛍光を発し(約550nm励起、約570nm発光)、一方、Cy5は、赤色領域に蛍光を発する(約650励起、670nm発光)。
ある実施形態では、SAF構造体は、1.1以下のアスペクト比D/hを有するPS SAF構造体である。
有利には、トップ表面凹部は、SAF構造体の中心軸に平行な中心軸を有する。凹部中心軸は、有利には、SAF構造体の中心軸から多くとも約0.2mmのオフセット、たとえば多くとも約0.1mmのオフセットを有する。好ましくは、表面凹部の中心軸は、SAF構造体の中心軸に一致する。
凹部のエッジは、シャープであっても丸形であってもよい。ある実施形態では、凹部は丸形凹部エッジを有し、好ましくは、凹部エッジは、約0.1mm以下、たとえば0.01~0.8mmの丸形半径Rを有する丸形である。
本発明のさらなる適用可能範囲は、これ以降に与えられた説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲に含まれる各種の変更形態及び修正形態は、この説明及び実施例から当業者には明らかになるであろうから、説明及び具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すが単に例示を目的として与えられているにすぎないことを理解すべきである。
この実施例では、核酸プローブ又は番号6、9、10、1、2、3、4、5、7、8(図1に示される順に)のポリテールを含む核酸プローブ。
固定効率は、以下の式:
実施例2
この実施例は、図3に示されるプロセス図に従って行った。
スポットしUV架橋した後、異なるポリテール/プローブのシグナルを顕微鏡により得た。次いで、0.1×生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)緩衝液で5分間及びミリQ(MilliQ)水でさらに5分間にわたりスライドを洗浄し、装着されていないプローブ及び蛍光シグナルを除去した。
実施例3
固定され洗浄されたポリテール/核酸プローブは、その後、厳しいSP-PCRサーモサイクラー処理条件に対応する処理条件に付した。
洗浄後及びとくにPCRサーモサイクラー処理後の固定効率は両方とも、本発明の核酸プローブではきわめて高いことが分かる。特に、上述した好ましい核酸プローブは、並外れた高い固定効率を示す。
次のものを含む3つの異なる核酸プローブを合成した。a)本発明のある実施形態に係る第1の核酸プローブは、ヌクレオチド配列40TTTTC8 (配列番号18)のポリテールとhilA遺伝子を標的とするキャプチャー部分とを有し、b)本発明のある実施形態に係る第2の核酸プローブは、ヌクレオチド配列42TTCCTT7 (配列番号22)のポリテールとhilA遺伝子を標的とするキャプチャー部分とを有し、且つc)比較核酸プローブは、ヌクレオチド配列20T10C10 (配列番号1)のポリテールとサルモネラ属(Salmonella)種を検出するためのhilA遺伝子を有するキャプチャー部分とを有していた。核酸プローブを図6に示す。
25μLのSP-PCR反応混合物を調製した。SP-PCR混合物は、1×フュージョン(Phusion)(登録商標)ヒト検体PCR緩衝液(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(Thermo Fisher Scientific))、400nM hilAフォワードプライマー及び1600nM hilAリバースプライマー、並びに0.05U/μLフュージョン(Phusion)ホットスタートII高忠実度DNAポリメラーゼ(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(Thermo Fisher Scientific))からなる。ジーン・フレーム(Gene Frame)(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(Thermo Fisher Scientific))を用いて固形担体プライマーアレイを取り囲む25μL反応チャンバーを形成した。ピペットによりジーン・フレームにPCRマスターミックスをロードし、カバースリップでシールした。PSスライドに核酸プローブをスポットした。フラットベッドPCRサーモサイクラーでSP-PCRを行った。厚さ1cmのポリスチレン断熱フォームのピースを用いてPCRサーモサイクラーの蓋からスライドを分離した。SP-PCR条件は、94℃で2分間、続いて94℃で10秒間、60℃で20秒間、72℃で20秒間の30サイクル、次いで、94℃で10秒間、65℃で20秒間、72℃で20秒間のさらなる15PCRサイクルであった。SP-PCRを増強するために後段の15PCRサイクルでより高いアニーリング温度を使用した。SP-PCR後、0.1×SSC及び0.1%ナトリウムドデシルスルフェート(SDS)(プロメガ(Promega)、米国ウィスコンシン州)でチャンバーを5分間洗浄し、次いで、脱イオン水で濯ぎ、そして室温で乾燥させた。スライドのスキャニングの準備ができた。
図9bに示されるSP-PCRを実施するための第2のプロセススキームは、新規なSP-PCRプロセスであり、これは本発明のおかげで利用可能になった。核酸プローブ及び本発明の方法により提供される高い固定効率のおかげで、今や、UV架橋(固定)後の洗浄なしで及び/又はPS-PCR手順後の洗浄なしでSP-PCRを実施しうる。
実施例5
実施例5では、本発明の実施形態を提示する実施例5の2つの核酸プローブを使用した。すなわち、核酸プローブa)として、本発明のある実施形態に係る第1の核酸プローブは、ヌクレオチド配列40TTTTC8 (配列番号18)のポリテールとhilA遺伝子を標的とするキャプチャー部分とを有し、核酸プローブb)として、本発明のある実施形態に係る第2の核酸プローブは、ヌクレオチド配列42TTCCTT7 (配列番号22)のポリテールとhilA遺伝子を標的とするキャプチャー部分とを有していた。
洗浄前及び洗浄後の結果を図10aに示す。図10bは、洗浄あり及び洗浄なしでシグナル-バックグラウンドの平均を示しており、非洗浄サンプルでは偽陽性の量が比較的少ないことが分かる。
固定のためにいくつかの異なる標識ポリテール/核酸プローブを異なるUV暴露時間及び異なるUV照射量に付した。使用したポリテール/核酸プローブは図1に示した。
各ポリテール/核酸プローブの4つのスポットを3分間にわたり8W UVエミッターからのUV暴露に付した。各ポリテール/核酸プローブの4つのスポットを8分間にわたり16W UVエミッターからのUV暴露に付した。
この試験では配列40T/C(40TC20とも呼ばれる)(配列番号5)を有する標識ポリテールを使用した。実施例1に記載したように固形担体にポリテールのサンプルをプロットしたが、異なるUV暴露を用いた。
3つの異なる核酸プローブを合成した。また、c)比較核酸プローブは、ヌクレオチド配列20T10C10 (配列番号1)のポリテールとサルモネラ属(Salmonella)種を検出するためのhilA遺伝子を有するキャプチャー部分とを有する。核酸プローブを図6に示す。
図14a~14cには、16W UVエミッターを用いて異なるUV暴露時間で洗浄前及び洗浄後に得られた固定されたポリテールの画像が示される。
異なる長さのポリテールを有する核酸プローブを試験した。核酸プローブは、ボルデテラ属(Bordetella)細菌を標的とするBrtz遺伝子を含んでいた。
ポリテール42TTCCTT7 (配列番号22)とボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)細菌を標的とするキャプチャー部分とを有する本発明のある実施形態の核酸プローブのサンプルを試験した。
SAF構造体1は、国際公開第17133741号に開示されたSAF構造体に対応しており、さらなる詳細は、この文献に見いだしうる。SAF構造体は、マイクロ流体カートリッジのチャネルの反応セクションのボトム2に取り付けられる。フルオロフォアで標識された本発明のある実施形態の核酸プローブ3は、SAF構造体1のトップ表面に取り付けられる。
図19bはSAF構造体31の上面図である。
図19cはSAF構造体31の側面図である。
SAF構造体は、高さh及びトップ直径Dを有する。D及びhは、本明細書の他の箇所に互いに個別に開示されうる。SAF構造体31は、60度の切頭体角で例示される。SAF構造体は、本明細書の他の箇所に開示される他の切頭体角を有しうることを理解すべきである。
ある実施形態では、SAF構造体31は、次の寸法:D=0.2mm、h=0.25mmを有するとともに、SAF切頭体角αは60度である。
図20aはSAF構造体41の斜視図である。
図20cはSAF構造体41の側面図である。
図20dは、図20cのセクションA-Aに見られるSAF構造体41の断面図である。
凹部は実質的に丸形であり、その中心軸はSAFの中心軸に一致するように位置決めされる。凹部は、本明細書の他の箇所に開示される通りでありうる高さh1を有する。
凹部は、フロアにより形成されたトップ表面を有する円錐状切頭体形状を有する。
ある実施形態では、SAF構造体41は、次の寸法:D=0.2mm、h=0.25mm、d=0.05mm、h1=0.01mmを有し、SAF切頭体角αは60度であり、且つ凹部切頭体角θは60度である。
図21bはSAF構造体51の上面図である。
図21cはSAF構造体51の側面図である。
D及びhは、本明細書の他の箇所に互いに個別に開示されうる。D及びhは、本明細書の他の箇所に互いに個別に開示されうる。SAF構造体の高さhは、凹部54を含まないトップ表面53から決定される。
凹部は実質的に丸形であり、その中心軸はSAFの中心軸に一致するように位置決めされる。凹部は、本明細書の他の箇所に開示される通りでありうる高さh1を有する。
凹部は、本明細書の他の箇所に開示される通りでありうる丸形半径Rを有する丸形凹部エッジを有する。
ポリスチレンから7つのカートリッジを作製した。各カートリッジは、反応セクションと、反応セクションの壁から突出する8つの同一のSAF構造体と、を有するマイクロ流体チャネルを有していた。
SAF構造体no.5は、図21a~21dに示されるタイプであり、SAF構造体no.6は、図20a~20eに示されるタイプであった。
第1の試験ラウンドでは、反応チャンバーは、空気が充填された状態を維持した。Cy3標識を励起波長(約550nm)の光に暴露し、SAF構造体発光シグナルのシグナル強度を検出した。
第2の試験ラウンドでは、それぞれのカートリッジの反応チャンバーに水を充填した。Cy3標識を励起波長(約550nm)の光に暴露し、SAF構造体発光シグナルのシグナル強度を検出した。
結果を図23に示す。
それぞれのカートリッジのSAF構造体で変動率(CoV)を決定した。
凹部の丸形エッジにより非常に効率的且つロバストなスポッティングが確保され、低いCoVが付与されると考えられる。
(付記)
上記実施形態及び変更例から把握できる技術的思想について記載する。
[項目1]
固形担体に核酸プローブを固定する方法であって、
・末端アンカー鎖部分とキャプチャー部分とを含むように前記核酸プローブを提供することと、
・前記固形担体の表面上に前記核酸プローブを適用することと、
・UV光に暴露することにより前記固形担体に前記核酸プローブのアンカー鎖部分をアンカーすることと、を含み、
前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプシトシン(C)の中間ヌクレオチドと任意選択的に塩基タイプグアニン(G)の1ヌクレオチドとを伴う塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチで構成されたN個のヌクレオチドの配列又はそれに対して少なくとも90%の類似性を有する配列を含み、前記塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチが、互いに独立して1~5ヌクレオチドを含み、Nが少なくとも18であり、且つ各塩基タイプXが、互いに独立して塩基タイプチミン(T)又は塩基タイプウラシル(U)を表す、方法。
[項目2]
前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプシトシン(C)の中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチで構成されたN個のヌクレオチドの前記配列を含む、項目1に記載の方法。
[項目3]
前記N個のヌクレオチドの配列が、プリン核酸塩基を有するヌクレオチドを5%未満、たとえば、プリン核酸塩基を有するヌクレオチドを1又は0個含む、項目1又は項目2に記載の方法。
[項目4]
前記N個のヌクレオチドの配列が、ピリミジン核酸塩基を有するヌクレオチドを排他的に含む、項目1~3のいずれか一項に記載の方法。
[項目5]
前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプCの中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプXの2~5ヌクレオチドのストレッチで構成された少なくともN個のヌクレオチドの配列を含む、項目1~4のいずれか一項に記載の方法。
[項目6]
Nが少なくとも20、たとえば少なくとも26、たとえば少なくとも30、たとえば少なくとも34、たとえば少なくとも38、たとえば少なくとも40である、項目1~5のいずれか一項に記載の方法。
[項目7]
前記塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチが、塩基タイプCの1~4ヌクレオチドにより互いに独立して分離される、項目1~6のいずれか一項に記載の方法。
[項目8]
前記塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチが、等しい長さ、好ましくは塩基タイプXの2ヌクレオチドの長さ、塩基タイプXの3ヌクレオチドの長さ、又は塩基タイプXの4ヌクレオチドの長さである、項目1~7のいずれか一項に記載の方法。
[項目9]
前記N個のヌクレオチドの配列が、式
(-(X) Y -(C) Z -) M
(式中、Yは1~5の整数であり、Zは1~5の整数であり、Y≧Zであり、且つMは4~20の整数である)で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む、項目1~8のいずれか一項に記載の方法。
[項目10]
Yが2~5の整数であり、Zが1~4の整数であり、Y>Zであり、且つMが4~20の整数である、項目9に記載の方法。
[項目11]
Z=1である、項目9又は項目10に記載の方法。
[項目12]
Z=2である、項目9又は項目10に記載の方法。
[項目13]
Y=2且つM≧10、たとえばM≧12、たとえばM≧14であるか、又は
Y=3且つM≧6、たとえばM≧8、たとえばM≧10であるか、又は
Y=4且つM≧4、たとえばM≧6、たとえばM≧8である、項目9~12のいずれか一項に記載の方法。
[項目14]
前記N個のヌクレオチドの配列が、式
(-(X) Y2 -(C) Z -(X) Y2 -) M (式中、Y 2 は1~4の整数であり、Zは1~4の整数であり、且つMは4~20の整数である)で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む、項目1~7のいずれか一項に記載の方法。
[項目15]
Y 2 が2~3の整数であり、且つZが1~3の整数である、項目14に記載の方法。
[項目16]
Y 2 ≧Z、好ましくはY 2 >Zである、項目14又は項目15に記載の方法。
[項目17]
Y 2 =2且つM≧10、たとえばM≧12、たとえばM≧14であるか又は
Y 2 =3且つM≧4、たとえばM≧6、たとえばM≧8である、項目14~16のいずれか一項に記載の方法。
[項目18]
Y又はY 2 の数がZの数よりも大きい、好ましくはY又はY 2 の数がZの数の少なくとも2倍である、項目1~17のいずれか一項に記載の方法。
[項目19]
前記塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチが塩基タイプTのヌクレオチドのストレッチである、項目1~18のいずれか一項に記載の方法。
[項目20]
前記塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチが塩基タイプUのヌクレオチドのストレッチである、項目1~18のいずれか一項に記載の方法。
[項目21]
前記塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチが、塩基タイプTのヌクレオチドと塩基タイプUのヌクレオチドとの両方を含む、たとえば塩基タイプTのヌクレオチドと塩基タイプUのヌクレオチドとを交互に含む、項目1~18のいずれか一項に記載の方法。
[項目22]
前記末端アンカーのN個のヌクレオチドの配列が5’末端若しくは3’末端に位置するか、又は前記核酸プローブがその5’末端若しくはその3’末端の両方に末端アンカーを有し、前記5’末端及び前記3’末端それぞれのN個のヌクレオチドの配列が互いに等しくても異なっていてもよい、項目1~21のいずれか一項に記載の方法。
[項目23]
前記核酸プローブが、DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA、又はANA、それらのオリゴヌクレオチド、それらの断片、又はそれらのいずれかの組合せを含む、項目1~22のいずれか一項に記載の方法。
[項目24]
前記核酸プローブが天然源から得られるか又は全合成若しくは部分合成される、好ましくは前記核酸プローブ又は前記核酸プローブの少なくとも末端アンカー鎖部分が少なくとも部分合成、好ましくは全合成される、項目1~23のいずれか一項に記載の方法。
[項目25]
前記核酸プローブが一本鎖である、項目1~24のいずれか一項に記載の方法。
[項目26]
前記核酸プローブにおいてその長さの少なくとも一部が、たとえばそのキャプチャー部分の一部が二本鎖である、項目1~24のいずれか一項に記載の方法。
[項目27]
前記キャプチャー部分が、プライマー伸長に適合化されたプライマーなどのプライマーを含む、項目1~26のいずれか一項に記載の方法。
[項目28]
キャプチャー部分が、標的核酸プローブの相補的領域にハイブリダイズするように適合化された及び/又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを実施するように適合化されたヌクレオチドの配列などのヌクレオチドの配列を含むハイブリダイゼーション鎖部分を含む、項目1~27のいずれか一項に記載の方法。
[項目29]
前記キャプチャー部分が、約4~約100ヌクレオチド、たとえば約10~約50ヌクレオチド、たとえば約20~約30ヌクレオチドを有するヌクレオチド鎖を含む、項目1~28のいずれか一項に記載の方法。
[項目30]
前記キャプチャー部分が前記末端アンカー鎖部分に直接結合される、項目1~29のいずれか一項に記載の方法。
[項目31]
前記キャプチャー部分が、スペーサ、たとえば脱塩基スペーサ、たとえばある繰返し数のスペーサを介して前記末端アンカー鎖部分に結合される、項目1~29のいずれか一項に記載の方法。
[項目32]
前記末端アンカー鎖部分が前記核酸プローブの5’末端又は3’末端に位置し、且つ前記キャプチャー部分Hが前記5’末端及び前記3’末端の他の一方に位置する、項目1~31のいずれか一項に記載の方法。
[項目33]
前記核酸プローブが5’末端及び3’末端の両方に末端アンカー鎖部分を含み、且つ前記キャプチャー部分が前記末端アンカー鎖部分の間に位置し、任意選択的にその間にスペーサを有する、項目1~32のいずれか一項に記載の方法。
[項目34]
前記核酸プローブが、マーカ、たとえば放射性マーカ又は蛍光マーカ、たとえばシアニン色素、たとえばCy3(1,1’-ビス(3-ヒドロキシプロピル)-3,3,3’,3’-テトラメチルインドカルボシアニン)又はCy5(1,1’-ビス(3-ヒドロキシプロピル)-3,3,3’,3’-テトラメチルインドジカルボシアニン)を含む、項目1~33のいずれか一項に記載の方法。
[項目35]
前記核酸プローブがスポッティングにより前記固形担体の表面上に堆積され、好ましくは、前記スポッティングが、前記固形担体の表面上に溶媒中の前記核酸プローブをスポットすることを含む、項目1~34のいずれか一項に記載の方法。
[項目36]
前記核酸プローブが、溶媒中に100μMまでの濃度で、たとえば約1μM~約80μM、たとえば約3μM~約70μM、たとえば約5μM~約60μMの濃度でスポットされる、項目35に記載の方法。
[項目37]
前記スポットされた核酸プローブが、UV光に暴露される前に乾燥される、項目35又は項目36に記載の方法。
[項目38]
前記固形担体がポリマー担体又はガラス担体であり、好ましくは、前記担体が、ポリスチレン(PS)、環状オレフィンコポリマー(COC)、ポリカーボネート(PC)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、又は上述したポリマーの1つ以上を含む混合物を含む、項目1~37のいずれか一項に記載の方法。
[項目39]
前記固形担体がポリスチレン(PS)を含むか又はポリスチレン(PS)であり、好ましくは、前記固形担体の少なくとも表面はPS表面、好ましくは非発泡基材である、項目1~38のいずれか一項に記載の方法。
[項目40]
前記固形担体が、極性基を導入するために任意選択的に酸素リッチプラズマで成形後表面改質に付された射出成形固形担体である、項目1~39のいずれか一項に記載の方法。
[項目41]
前記固形担体表面が、アミン基、メチレン基、チオール基、エポキシ基、ジアゾ基、又はアミド基の1つ以上を本質的に含まない、好ましくは、前記担体表面が、アミン基、メチレン基、チオール基、エポキシ基、ジアゾ基、又はアミド基のすべてを本質的に含まない、項目1~40のいずれか一項に記載の方法。
[項目42]
前記固形担体が、チャネルを画定するチャネル表面を備えたチャネルを含むカートリッジの少なくとも一部であり、前記固形基材の表面が、前記チャネル表面の少なくとも一部を形成する、項目1~41のいずれか一項に記載の方法。
[項目43]
前記チャネルが反応セクションを含み、前記方法が、前記チャネルの反応セクション内の表面に前記核酸プローブを固定することを含む、項目42に記載の方法。
[項目44]
前記反応セクションが少なくとも1つの光学エレメントを含み、前記光学エレメントが、好ましくは、前記固定された核酸プローブの又は核酸プローブに接続された蛍光マーカ(フルオロフォア)から発せられた光をリダイレクトするように、好ましくはコリメートするように構築される、項目43に記載の方法。
[項目45]
前記光学エレメントがレンズ構造及び/又は超臨界角蛍光構造体(SAF構造体)を含み、前記SAF構造体が好ましくはトップ表面を有し、且つ前記方法が、前記トップ表面に前記核酸プローブを固定することを含む、項目44に記載の方法。
[項目46]
前記光学エレメントが、切頭体角α、トップ表面、トップ直径D、及び高さhを有する円錐状切頭体形状を有し、好ましくは、前記切頭体角αが、空気/ポリスチレン界面の場合、約30°~約70°、たとえば約35~約65、たとえば約40°~約60°、たとえば約40°若しくは約60°、たとえば約35°~約55°である、又は水/ポリスチレン界面の場合、約55°~約65°である、項目45に記載の方法。
[項目47]
前記高さhが、少なくとも約0.2mm、たとえば約0.25mm~約0.5mm、たとえば約0.3mm~約0.35mmである、項目46に記載の方法。
[項目48]
前記トップ直径が、約0.05mm~約0.5mm、たとえば約0.1mm~約0.3mmである、項目46又は項目47に記載の方法。
[項目49]
前記少なくとも1つのSAF構造体が、約1.1以下、たとえば約1.05以下、たとえば約1以下のトップ直径対高さのアスペクト比D/hを有し、好ましくは前記SAF構造体がポリマーSAF構造体であり、より好ましくは前記SAF構造体がポリスチレン(PS)である、項目46~48のいずれか一項に記載の方法。
[項目50]
前記少なくとも1つのSAF構造体のトップ表面がトップ表面凹部を有し、前記トップ表面凹部が好ましくは丸形であり、より好ましくは前記トップ表面凹部が前記SAF構造体の中心軸に平行な中心軸を有し、且つ好ましくは前記SAF構造体の中心軸から多くとも約0.2mmのオフセット、たとえば多くとも約0.1mmのオフセットを有し、より好ましくは前記表面凹部の中心軸が前記SAF構造体の中心軸に一致する、項目46~49のいずれか一項に記載の方法。
[項目51]
前記凹部が実質的にフラットな凹部フロアを有し、好ましくは前記凹部が、前記トップ直径Dの約10%以上、たとえば前記トップ直径Dの約15%~約80%、たとえば約20%~約50の直径dを有し、好ましくは前記トップ表面の凹部を取り囲むエッジが少なくとも0.01mmの幅を有する、項目50に記載の方法。
[項目52]
前記凹部直径dが、約0.01~約0.2、たとえば約0.25~約0.1である、項目51に記載の方法。
[項目53]
前記凹部が、約0.05mm以下、たとえば約0.02以下の高さh1を有する、項目50~52のいずれか一項に記載の方法。
[項目54]
前記凹部が丸形凹部エッジを有し、好ましくは、前記凹部エッジが、約0.1mm以下、たとえば0.01~0.8mmの丸形半径Rを有する丸形である、項目50~53のいずれか一項に記載の方法。
[項目55]
前記凹部が、前記フロアにより形成された表面により形成されたトップ表面を有する円錐状切頭体形状を有し、好ましくは前記凹部の円錐状切頭体形状が、約40°~約70°、たとえば約55°~約65°、たとえば約60°である凹部切頭体角θを有し、より好ましくは前記凹部切頭体角θが、前記切頭体角αと実質的に同一である、項目50~53のいずれか一項に記載の方法。
[項目56]
前記核酸のアンカー鎖部分が、約250nm~500nmの範囲内の波長を含む、好ましくは約254nm、約265nm、及び/又は約365nmの少なくとも1つの波長を含むUV光に暴露することにより前記固形担体にアンカーされる、項目1~55のいずれか一項に記載の方法。
[項目57]
前記核酸のアンカー鎖部分が、約0.2ジュール/cm 2 ~約15ジュール/cm 2 、たとえば約1ジュール/cm 2 ~約10ジュール/cm 2 、たとえば約1.5ジュール/cm 2 ~約6ジュール/cm 2 、たとえば約1.6ジュール/cm 2 ~約3ジュール/cm 2 、たとえば約1.7ジュール/cm 2 ~約2ジュール/cm 2 のエネルギー量を用いてUV光に暴露することにより前記固形担体にアンカーされる、項目1~56のいずれか一項に記載の方法。
[項目58]
項目1~57のいずれか一項に記載の方法により得られる固形基材である、固定された核酸プローブを含む固形担体。
[項目59]
固形担体に固定するのに好適な核酸プローブであって、前記核酸プローブが末端アンカー鎖部分とキャプチャー部分とを含み、前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプシトシン(C)の中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチで構成されたN個のヌクレオチドの配列又はそれに対して少なくとも90%の類似性を有する配列を含み、前記塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチが互いに独立して2~5ヌクレオチドを含み、Nが少なくとも18であり、且つ各塩基タイプXが互いに独立して塩基タイプチミン(T)又は塩基タイプウラシル(U)を表す、核酸プローブ。
[項目60]
前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプシトシン(C)の中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチで構成されたN個のヌクレオチドの前記配列を含む、項目59に記載の核酸プローブ。
[項目61]
前記N個のヌクレオチドの配列が、プリン核酸塩基を有するヌクレオチドを5%未満、たとえば、プリン核酸塩基を有するヌクレオチドを1又は0個含む、項目59又は項目60に記載の核酸プローブ。
[項目62]
前記N個のヌクレオチドの配列が、ピリミジン核酸塩基を有するヌクレオチドを排他的に含む、項目59~61のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目63]
前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプCの中間ヌクレオチドを伴う塩基タイプXの2~5ヌクレオチドのストレッチで構成された少なくともN個のヌクレオチドの配列を含む、項目59~62のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目64]
Nが少なくとも20、たとえば少なくとも26、たとえば少なくとも30、たとえば少なくとも34、たとえば少なくとも38、たとえば少なくとも40である、項目59~63のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目65]
前記塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチが、塩基タイプCの1~4ヌクレオチドにより互いに独立して分離される、項目59~64のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目66]
前記塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチが、等しい長さ、好ましくは塩基タイプXの2ヌクレオチドの長さ、塩基タイプXの3ヌクレオチドの長さ、又は塩基タイプXの4ヌクレオチドの長さである、項目59~65のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目67]
前記N個のヌクレオチドの配列が、式
(-(X) Y -(C) Z -) M (式中、Yは1~5の整数であり、Zは1~5の整数であり、Y≧Zであり、且つMは4~20の整数である)で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む、項目59~66のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目68]
Yが2~5の整数であり、Zが1~4の整数であり、Y>Zであり、且つMが4~20の整数である、項目59~67のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目69]
Z=1又はZ=2である、項目67~68のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目70]
Y=2且つM≧10、たとえばM≧12、たとえばM≧14であるか、又は
Y=3且つM≧6、たとえばM≧8、たとえばM≧10であるか、又は
Y=4且つM≧4、たとえばM≧6、たとえばM≧8である、項目67~69のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目71]
前記N個のヌクレオチドの配列が、式
(-(X) Y2 -(C) Z -(X) Y2 -) M (式中、Y 2 は1~4の整数であり、Zは1~4の整数であり、且つMは4~20の整数である)で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含む、項目59~66のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目72]
Y 2 が2~3の整数であり、Zが1~3の整数である、項目71に記載の核酸プローブ。
[項目73]
Y 2 ≧Z、好ましくは
Y 2 =2且つM≧10、たとえばM≧12、たとえばM≧14又は
Y 2 =3且つM≧4、たとえばM>=6、たとえばM≧8である、項目71又は項目72に記載の核酸プローブ。
[項目74]
Xの数がZの数よりも大きい、好ましくはXの数がZの数の少なくとも2倍である、項目59~73のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目75]
前記塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチが塩基タイプTのヌクレオチドのストレッチである、項目59~74のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目76]
前記塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチが塩基タイプUのヌクレオチドのストレッチである、項目59~74のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目77]
前記塩基タイプXのヌクレオチドのストレッチが、塩基タイプTのヌクレオチドと塩基タイプUのヌクレオチドとの両方を含む、たとえば塩基タイプTのヌクレオチドと塩基タイプUのヌクレオチドとを交互に含む、項目59~74のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目78]
前記末端アンカーのN個のヌクレオチドの配列が5’末端若しくは3’末端に位置するか、又は前記核酸プローブがその5’末端若しくはその3’末端の両方に末端アンカーを有し前記5’末端及び前記3’末端それぞれのN個のヌクレオチドの配列が互いに等しくても異なっていてもよい、項目59~77のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目79]
前記核酸プローブが、DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA、又はANA、それらのオリゴヌクレオチド、それらの断片、又はそれらのいずれかの組合せを含む、項目59~78のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目80]
前記キャプチャー部分が、プライマー伸長に適合化されたプライマーなどのプライマーを含む、項目59~79のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目81]
キャプチャー部分が、標的核酸プローブの相補的領域にハイブリダイズするように適合化された及び/又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを実施するように適合化されたヌクレオチドの配列などのヌクレオチドの配列を含むハイブリダイゼーション鎖部分を含む、項目59~80のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目82]
前記キャプチャー部分が、約4~約100ヌクレオチド、たとえば約10~約50ヌクレオチド、たとえば約20~約30ヌクレオチドを有するヌクレオチド鎖を含む、項目59~81のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目83]
前記キャプチャー部分が前記末端アンカー鎖部分に直接結合される、項目59~82のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目84]
前記キャプチャー部分が、スペーサ、たとえば脱塩基スペーサ、たとえばある繰返し数のスパッターを介して前記末端アンカー鎖部分に結合される、項目59~82のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目85]
前記末端アンカー鎖部分が前記核酸プローブの5’末端又は3’末端に位置し、且つ前記キャプチャー部分Hが前記5’末端及び前記3’末端の他の1つに位置する、項目59~84のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目86]
前記核酸プローブが5’末端及び3’末端の両方に末端アンカー鎖部分を含み、且つ前記キャプチャー部分が前記末端アンカー鎖部分間に位置し、任意選択的にその間にスペーサを有する、項目59~85のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目87]
前記核酸プローブが、マーカ、たとえば放射性マーカ又は蛍光マーカ、たとえばシアニン色素、たとえばCy3(1,1’-ビス(3-ヒドロキシプロピル)-3,3,3’,3’-テトラメチルインドカルボシアニン)又はCy5(1,1’-ビス(3-ヒドロキシプロピル)-3,3,3’,3’-テトラメチルインドジカルボシアニン)を含む、項目59~86のいずれか一項に記載の核酸プローブ。
[項目88]
固形担体を含む試験デバイスであって、前記固形担体が少なくとも1つの超臨界角蛍光構造体(SAF構造体)を含み、前記SAF構造体が、切頭体角α、トップ表面、トップ直径D、及び高さhを有する円錐状切頭体形状を有し、好ましくは、切頭体角αが、空気/ポリスチレン界面の場合、約30°~約70°、たとえば約35~約65、たとえば約40°~約60°、たとえば約40°又は約60°、たとえば約35°~約55°である、又は水/ポリスチレン界面の場合、約55°~約65°である、試験デバイス。
[項目89]
前記高さhが、少なくとも約0.2mm、たとえば約0.25mm~約0.5mm、たとえば約0.3mm~約0.35mmである、項目88に記載の試験デバイス。
[項目90]
前記トップ直径が、約0.05mm~約0.5mm、たとえば約0.1mm~約0.3mmである、項目88又は項目89に記載の試験デバイス。
[項目91]
前記少なくとも1つのSAF構造体が、約1.1以下、たとえば約1.05以下、たとえば約1以下のトップ直径対高さのアスペクト比D/hを有し、好ましくは前記SAF構造体がポリマーSAF構造体である、項目88~90のいずれか一項に記載の試験デバイス。
[項目92]
前記固形担体がポリマー担体又はガラス担体であり、好ましくは、前記担体が、ポリスチレン(PS)、環状オレフィンコポリマー(COC)、ポリカーボネート(PC)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、又は上述したポリマーの1つ以上を含む混合物若しくは組合せを含む、項目88~91のいずれか一項に記載の試験デバイス。
[項目93]
前記SAF構造体がポリスチレン(PS)である、項目88~92のいずれか一項に記載の試験デバイス。
[項目94]
前記少なくとも1つのSAF構造体のトップ表面がトップ表面凹部を有し、前記トップ表面凹部が好ましくは丸形であり、より好ましくは前記トップ表面凹部が前記SAF構造体の中心軸に平行な中心軸を有し、且つ好ましくは前記SAF構造体の中心軸から多くとも約0.2mmのオフセット、たとえば多くとも約0.1mmのオフセットを有し、より好ましくは前記表面凹部の中心軸が前記SAF構造体の中心軸に一致する、項目88~93のいずれか一項に記載の試験デバイス。
[項目95]
前記凹部が実質的にフラットな凹部フロアを有し、好ましくは前記凹部が、前記トップ直径Dの約10%以上、たとえば前記トップ直径Dの約15%~約80%、たとえば約20%~約50の直径dを有し、好ましくは前記トップ表面の凹部を取り囲むエッジが少なくとも0.01mmの幅を有する、項目94に記載の試験デバイス。
[項目96]
前記凹部直径dが、約0.01~約0.2、たとえば約0.25~約0.1である、項目95に記載の試験デバイス。
[項目97]
前記凹部が、約0.05mm以下、たとえば約0.02以下の高さh1を有する、項目88~96のいずれか一項に記載の試験デバイス。
[項目98]
前記凹部が丸形凹部エッジを有し、好ましくは、前記凹部エッジが、約0.1mm以下、たとえば0.01~0.8mmの丸形半径Rを有する丸形である、項目88~97のいずれか一項に記載の試験デバイス。
[項目99]
前記凹部が、前記フロアにより形成された表面により形成されたトップ表面を有する円錐状切頭体形状を有し、好ましくは前記凹部の円錐状切頭体形状が、約40°~約70°、たとえば約55°~約65°、たとえば約60°である凹部切頭体角θを有し、より好ましくは前記凹部切頭体角θが、前記切頭体角αと実質的に同一である、項目88~98のいずれか一項に記載の試験デバイス。
[項目100]
前記試験デバイスが、チャネルを画定するチャネル表面を備えたチャネルを含むカートリッジの少なくとも一部であり、前記少なくとも1つのSAF構造体を含む固形基材が、前記チャネル表面の少なくとも一部を形成する、項目88~99のいずれか一項に記載の試験デバイス。
Claims (23)
- 固形担体に核酸プローブを固定する方法であって、
・末端アンカー鎖部分とキャプチャー部分とを含むように前記核酸プローブを提供することと、
・前記固形担体の表面上に前記核酸プローブを堆積させることと、
・UV光に暴露することにより前記固形担体に前記核酸プローブのアンカー鎖部分をアンカーすることと、を含み、
前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、N個のヌクレオチドの配列を含み、Nが少なくとも18であり、
前記N個のヌクレオチドの配列が、式
(-(T)Y-(C)Z-)M
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含み、
式中、Yは1~5の整数であり、Zは1または2であり、Y≧Zであり、且つMは4~20の整数であり、または、
前記N個のヌクレオチドの配列が、式
(-(T)Y2-(C)Z-(T)Y2-)M
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含み、
式中、Y2は1~4の整数であり、Zは1~4の整数であり、且つMは4~20の整数であり、
塩基タイプTの数は、塩基タイプCの数よりも大きい、方法。 - 前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、塩基タイプTの2~5個のヌクレオチドのストレッチおよび塩基タイプCのヌクレオチドで構成された少なくともN個のヌクレオチドの配列を含み、
Nが少なくとも20である、請求項1に記載の方法。 - 前記N個のヌクレオチドの配列が、式
(-(T)Y-(C)Z-)M
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含み、
式中、
Yが2~5の整数であり、Zが1または2であり、且つY>Zである、請求項1または2に記載の方法。 - Y=2且つM≧10であるか、
又は
Y=3且つM≧6であるか、
又は
Y=4且つM≧4である、請求項3に記載の方法。 - 前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、配列番号16のポリヌクレオチド(42TTC 14 )、配列番号17のポリヌクレオチド(40TTTC 10 )、または配列番号18のポリヌクレオチド(40TTTTC 8 )を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記N個のヌクレオチドの配列が、式
(-(T)Y2-(C)Z-(T)Y2-)M
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含み、
式中、
Y2が2~3の整数であり、Zが1~3の整数であり、且つY 2 ≧Zである、請求項1または2に記載の方法。 - Y 2 =2且つM≧10、または
Y 2 =3且つM≧4である、請求項6に記載の方法。 - 前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、配列番号22のポリヌクレオチド(42TTCCTT 7 )または配列番号21のポリヌクレオチド(39TCT 13 )を含む、請求項1および6~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キャプチャー部分が、ヌクレオチドの配列を含むプライマー及び/又はハイブリダイゼーション鎖部分を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸プローブがスポッティングにより前記固形担体の表面上に堆積され、前記スポッティングが、前記固形担体の表面上に溶媒中の前記核酸プローブをスポットすることを含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固形担体がポリスチレン(PS)を含むか又はポリスチレン(PS)である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固形担体が、ポリスチレン(PS)、環状オレフィンコポリマー(COC)、ポリカーボネート(PC)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、又は上述したポリマーの1つ以上を含む混合物を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固形担体の表面が、1つ以上のアミン基を含まない、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固形担体が、チャネルを画定するチャネル表面を備えたチャネルを含むカートリッジの少なくとも一部であり、前記固形基材の表面が、前記チャネル表面の少なくとも一部を形成し、
前記チャネルが反応セクションを含み、前記方法が、前記チャネルの反応セクション内の表面に前記核酸プローブを固定することを含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。 - 前記反応セクションが少なくとも1つの光学エレメントを含み、
前記光学エレメントが超臨界角蛍光構造体(SAF構造体)を含み、前記SAF構造体がトップ表面を有し、且つ前記方法が、前記トップ表面に前記核酸プローブを固定することを含む、請求項14に記載の方法。 - 前記光学エレメントが、切頭体角α、トップ表面、トップ直径D、及び高さhを有する円錐状切頭体形状を有するSAF構造体である、請求項15に記載の方法。
- 前記切頭体角αが、30°~70°であり、前記少なくとも1つのSAF構造体がトップ表面凹部を有し、1.1以下のトップ直径対高さのアスペクト比D/hを有する、請求項16に記載の方法。
- 前記核酸のアンカー鎖部分が、250nm~500nmの範囲内の波長を含むUV光に暴露することにより前記固形担体にアンカーされる、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。
- 固形担体に固定するのに好適な核酸プローブであって、前記核酸プローブが末端アンカー鎖部分とキャプチャー部分とを含み、前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、N個のヌクレオチドの配列を含み、Nが少なくとも18であり、
前記N個のヌクレオチドの配列が、式
(-(T)Y-(C)Z-)M
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含み、
式中、Yは1~5の整数であり、Zは1または2であり、Y≧Zであり、且つMは4~20の整数であり、または、
前記N個のヌクレオチドの配列が、式
(-(T)Y2-(C)Z-(T)Y2-)M
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含み、
式中、Y2は1~4の整数であり、Zは1~4の整数であり、且つMは4~20の整数であり、
塩基タイプTの数は、塩基タイプCの数よりも大きい、核酸プローブ。 - 前記N個のヌクレオチドの配列が、式
(-(T)Y-(C)Z-)M
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含み、
式中、
Y=2且つM≧10、
又は
Y=3且つM≧6、
又は
Y=4且つM≧4である、請求項19に記載の核酸プローブ。 - 前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、配列番号16のポリヌクレオチド(42TTC 14 )、配列番号17のポリヌクレオチド(40TTTC 10 )、または配列番号18のポリヌクレオチド(40TTTTC 8 )を含む、請求項19または20に記載の核酸プローブ。
- 前記N個のヌクレオチドの配列が、式
(-(T)Y2-(C)Z-(T)Y2-)M
で示される塩基タイプのヌクレオチドの繰返しサブ配列を含み、
式中、
Y2≧Zであり、
Y2=2且つM≧10であるか、
又は
Y2=3且つM≧4である、請求項19に記載の核酸プローブ。 - 前記核酸プローブの末端アンカー鎖部分が、配列番号22のポリヌクレオチド(42TTCCTT 7 )または配列番号21のポリヌクレオチド(39TCT 13 )を含む、請求項19または22に記載の核酸プローブ。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA201700464 | 2017-08-25 | ||
DKPA201700464 | 2017-08-25 | ||
PCT/DK2018/050207 WO2019037828A1 (en) | 2017-08-25 | 2018-08-24 | NUCLEIC ACID PROBE, METHOD FOR IMMOBILIZATION OF NUCLEIC ACID ON A SOLID SUPPORT USING UV LIGHT, SOLID SUPPORT COMPRISING AN IMMOBILIZED NUCLEIC ACID PROBE, AND TEST DEVICE COMPRISING A SOLID SUPPORT |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020536493A JP2020536493A (ja) | 2020-12-17 |
JP2020536493A5 JP2020536493A5 (ja) | 2021-09-16 |
JP7264877B2 true JP7264877B2 (ja) | 2023-04-25 |
Family
ID=65438431
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020511487A Active JP7264877B2 (ja) | 2017-08-25 | 2018-08-24 | 核酸プローブ、及び固形担体に核酸プローブを固定する方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11248257B2 (ja) |
EP (1) | EP3673082A4 (ja) |
JP (1) | JP7264877B2 (ja) |
KR (1) | KR20200037867A (ja) |
CN (1) | CN111225984A (ja) |
AU (1) | AU2018321760A1 (ja) |
BR (1) | BR112020003614A2 (ja) |
CA (1) | CA3073462A1 (ja) |
MX (1) | MX2020002124A (ja) |
TW (1) | TWI816692B (ja) |
WO (1) | WO2019037828A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2022547023A (ja) * | 2019-09-03 | 2022-11-10 | ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・コロラド、ア・ボデイー・コーポレイト | 感染の宿主rnaバイオマーカーの迅速な早期検出及びヒトにおけるcovid-19コロナウイルス感染の早期同定のためのシステム、方法、及び組成物。 |
KR20230038926A (ko) | 2021-09-13 | 2023-03-21 | 건국대학교 산학협력단 | 염 매개의 핵산 고정화 방법, 상기 방법에 따라 고정화된 포획 핵산을 포함하는 고형 지지체, 상기 고형 지지체를 포함하는 측방 유동 분석 스트립, 및 표적 핵산 검출 방법 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014057565A (ja) | 2012-09-14 | 2014-04-03 | Ngk Insulators Ltd | 標的核酸の検出方法 |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1989011548A1 (en) | 1988-05-20 | 1989-11-30 | Cetus Corporation | Immobilized sequence-specific probes |
US6238866B1 (en) * | 1996-04-16 | 2001-05-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Detector for nucleic acid typing and methods of using the same |
US20030185830A1 (en) | 1997-02-25 | 2003-10-02 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
US6900300B1 (en) * | 2000-09-19 | 2005-05-31 | Ingeneus Corporation | Quadruplex DNA and duplex probe systems |
US6221635B1 (en) | 1999-05-06 | 2001-04-24 | The Wistar Institute | Methods for solid-phase amplification of DNA template (SPADT) using multiarrays |
CA2375220A1 (en) | 1999-06-11 | 2000-12-21 | Narayan Baidya | Gene specific arrays and the use thereof |
WO2003008583A2 (en) | 2001-03-02 | 2003-01-30 | Sagres Discovery | Novel compositions and methods for cancer |
KR101002499B1 (ko) | 2001-03-23 | 2010-12-17 | 센텔리옹 에스아에스 | 2본쇄 dna 표적 서열을 3중 나선 상호작용에 의해 정제 및 검출하는 방법 |
FR2822476B1 (fr) | 2001-03-23 | 2004-04-02 | Aventis Pharma Sa | Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice |
US20030082571A1 (en) * | 2001-04-10 | 2003-05-01 | Kachab Edward Hanna | Linear nucleic acid and sequence therefor |
US7612194B2 (en) * | 2001-07-24 | 2009-11-03 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof |
CN1461811A (zh) * | 2002-05-31 | 2003-12-17 | 中科开瑞生物芯片科技股份有限公司 | 一种寡核苷酸探针的设计方法 |
WO2005040400A2 (en) * | 2003-10-24 | 2005-05-06 | Mmi Genomics, Inc. | Methods and systems for inferring traits to manage non-beef livestock |
US20080085839A1 (en) * | 2004-09-01 | 2008-04-10 | Holger Klapproth | Method For The Analysis Of Point Mutations |
EA011554B1 (ru) | 2004-09-17 | 2009-04-28 | Сентелион | Стабильные жидкие композиции плазмидной днк |
NZ560808A (en) | 2005-02-24 | 2009-04-30 | Univ Curtin Tech | Detection of DNA sequence motifs in ruminants |
EP3095873B1 (en) * | 2006-12-21 | 2018-04-18 | Gen-Probe Incorporated | Methods and compositions for nucleic acid amplification |
FR2929292A1 (fr) | 2008-03-28 | 2009-10-02 | Exonhit Therapeutics S A Sa | Procede et methodes de diagnostic de la maladie d'alzheimer |
EP2334810B1 (en) | 2008-10-01 | 2016-11-09 | Koninklijke Philips N.V. | Method for immobilizing nucleic acids on a support |
RU2582250C2 (ru) * | 2008-10-01 | 2016-04-20 | Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. | Способ тестирования и контроль качества нуклеиновых кислот на подложке |
CN102409101A (zh) | 2011-11-30 | 2012-04-11 | 上海翼和应用生物技术有限公司 | 通用荧光标记探针的pcr-ldr基因多态性测序方法 |
KR20150039540A (ko) | 2013-10-02 | 2015-04-10 | 주식회사 바이오이즈 | 변이관련 뉴클레오타이드가 있는 올리고뉴클레오타이드와 포착프로브를 이용한 뉴클레오타이드 변이 분석 방법 및 장치 |
TWI789343B (zh) | 2016-02-01 | 2023-01-11 | 丹麥商碩騰丹麥有限公司 | 微流體分析系統、執行分析的微流體匣及方法 |
-
2018
- 2018-08-24 KR KR1020207008587A patent/KR20200037867A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-08-24 MX MX2020002124A patent/MX2020002124A/es unknown
- 2018-08-24 AU AU2018321760A patent/AU2018321760A1/en active Pending
- 2018-08-24 US US16/111,856 patent/US11248257B2/en active Active
- 2018-08-24 WO PCT/DK2018/050207 patent/WO2019037828A1/en unknown
- 2018-08-24 EP EP18848995.9A patent/EP3673082A4/en active Pending
- 2018-08-24 CN CN201880067468.9A patent/CN111225984A/zh active Pending
- 2018-08-24 JP JP2020511487A patent/JP7264877B2/ja active Active
- 2018-08-24 CA CA3073462A patent/CA3073462A1/en active Pending
- 2018-08-24 BR BR112020003614-5A patent/BR112020003614A2/pt unknown
- 2018-08-25 TW TW107129706A patent/TWI816692B/zh active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014057565A (ja) | 2012-09-14 | 2014-04-03 | Ngk Insulators Ltd | 標的核酸の検出方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Tran Quang Hung et al.,A novel lab-on-chip platform with integrated solid phase PCR and Supercritical Angle Fluorescence (SAF) microlens array for highly sensitive and multiplexed pathogen detection.,Biosensors and Bioelectronics,2017年04月15日,Vol.90,p.217-223,doi: 10.1016/j.bios.2016.11.028 |
Yi Sun et al.,Direct immobilization of DNA probes on non-modified plastics by UV irradiation and integration in microfluidic devices for rapid bioassay.,Anal Bioanal Chem,2011年10月26日,Vol.402, No.2,p.741-748,doi: 10.1007/s00216-011-5459-4 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20190078151A1 (en) | 2019-03-14 |
EP3673082A4 (en) | 2021-05-26 |
BR112020003614A2 (pt) | 2020-10-27 |
WO2019037828A1 (en) | 2019-02-28 |
JP2020536493A (ja) | 2020-12-17 |
TWI816692B (zh) | 2023-10-01 |
CA3073462A1 (en) | 2019-02-28 |
AU2018321760A1 (en) | 2020-02-27 |
TW201912793A (zh) | 2019-04-01 |
EP3673082A1 (en) | 2020-07-01 |
US11248257B2 (en) | 2022-02-15 |
KR20200037867A (ko) | 2020-04-09 |
CN111225984A (zh) | 2020-06-02 |
MX2020002124A (es) | 2020-07-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10982280B2 (en) | Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding | |
US20200182866A1 (en) | System and method for nucleic acid detection using low binding surface | |
US20210373000A1 (en) | Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding | |
US20210123098A1 (en) | Methods for cellularly addressable nucleic acid sequencing | |
US20200263230A1 (en) | De novo surface preparation and uses thereof | |
US9868978B2 (en) | Single molecule sequencing of captured nucleic acids | |
JP7264877B2 (ja) | 核酸プローブ、及び固形担体に核酸プローブを固定する方法 | |
KR102607124B1 (ko) | 핵산 분석을 위한 다가 결합 조성물 | |
US20040235032A1 (en) | PCR amplification method, PCR primer set, PCR amplification product, and method for detection of nucleic acid using the amplification method | |
JP2006230335A (ja) | 遺伝子の検出方法 | |
JP2006174788A (ja) | Dna鎖伸長方法、dna鎖増幅方法およびdna鎖伸長用マイクロアレイ | |
JP2007330104A (ja) | Dna鎖伸長方法およびdna鎖伸長用アレイ | |
WO2012173015A1 (ja) | プローブセット及びその利用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200610 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210805 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210805 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220428 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220510 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220727 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220913 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221209 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230322 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230413 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7264877 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |