BR112020003614A2 - método para imobilizar uma sonda de ácido nucleico, suporte sólido, sonda de ácido nucleico, e, dispositivo de teste. - Google Patents

Abstract

  São descritos sondas de ácido nucleico, um método para imobilizar o ácido nucleico a um suporte sólido, um suporte sólido que compreende uma sonda de ácido nucleico imobilizada, e um dispositivo de teste que compreende um suporte sólido. A sonda de ácido nucleico inclui uma porção de cadeia de ancoragem terminal, e uma porção de captura em que a porção de cadeia de ancoragem terminal inclui uma sequência de pelo menos 18 nucleotídeos composta por trechos de até 5 nucleotídeos de tipo de base X, com nucleotídeo(s) intermediário(s) de tipo de base Citosina (C) e, opcionalmente, um nucleotídeo de tipo de base Guanina (G), ou uma sequência com pelo menos 90% de similaridade ao mesmo; em que cada tipo de base X, independentemente uma da outra, designa tipo de base Timina (T) ou tipo de base Uracila (U). A sonda de ácido nucleico é imobilizada ao suporte sólido com uso de luz UV. É ainda descrito um sistema de teste, que compreende um suporte sólido, que tem pelo menos uma estrutura de fluorescência de ângulo supercrítico (estrutura SAF).

Description

MÉTODO PARA IMOBILIZAR UMA SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO, SUPORTE SÓLIDO, SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO, E, DISPOSITIVO DE TESTE CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente invenção refere-se, geralmente, à imobilização de sondas de ácidos nucleicos em substratos sólidos, tais como um cartucho microfluídico. Tais sondas de ácidos nucleicos podem ser aplicadas de maneira vantajosa para captura de componentes alvo e/ou para de testes de hibridação.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[002] Os dispositivos de teste para uso na investigação e/ou detecção de biomoléculas são ferramentas muito importantes. Diferentes tipos de dispositivos que transportam sondas imobilizadas para testes de hibridação foram desenvolvidos e comercializados nos últimos anos.

[003] Várias tentativas de melhoramento dos dispositivos de teste e para imobilizar as sondas desejadas foram sugeridas. Alguns métodos da técnica anterior compreendem sintetizar uma sequência de nucleotídeos diretamente na estrutura de suporte. Outro, e mais efetivo método compreende, primeiro, fornecer de uma sonda de ácido nucleico, por exemplo, pelo isolamento dela a partir de uma fonte natural ou por síntese.

[004] A.B. Steel er al DOL http://dx.doi.org/10.1016/S0006- 3495(00)76351-X; “Immobilization of Nucleic Acids at Solid Surfaces: Effect of Oligonucleotide Length on Layer Assembly”. Biophysical Journal Volume 79, agosto de 2000 páginas 975 a 981 divulgam um estudo do efeito do comprimento do DNA e da presença de um grupo de ancoragem na montagem de oligonucleotídeos pré-sintetizados em uma superfície de ouro. O estudo mostra que o grupo de ancoragem de tiol aumenta fortemente a imobilização dos oligonucleotídeos, mas que o aumento é reduzido para comprimentos de trechos mais longos. Para trechos com mais de 24 bases, a cobertura da superfície começa a declinar notavelmente com o comprimento da sonda.

[005] Anke Pierik et al. DOI: 10.1021/ac902561w; “Immobilization of Oligonucleotides with Homo-oligomer Tails onto Amine-Functionalized Solid Substrates and the Effects on Hybridization”. Anal. Chem., 2010, 82 (4), páginas 1.191 a 1.199 divulgam um estudo de imobilização fotoquímica de DNA (254 nm UV) em substratos com funcionalização amina. Concluiu-se que sequências curtas de homo-oligômeros (caudas) de uracilas, timinas e, em extensão limitada, guaninas, ligadas a uma sequência de hibridização, melhoram a imobilização. Foi proposto um mecanismo possível explica enxerto desses nucleotídeos em substratos com funcionalização amina.

[006] Um método de imobilização semelhante é descrito em EP2334810. A invenção divulgada no presente documento foca no uso de comprimentos de onda mais longos para imobilizar ácidos nucléicos, a saber, 300 a 500 nm, e é considerado que, ao usar tal comprimento de onda de luz tão longo, o risco de causar danos às moléculas de ácido nucleico é reduzido. O método descrito compreende as etapas de: (a) fornecer a um ácido nucleico um trecho de nucleotídeos de apenas um tipo de base, em que o trecho de nucleotídeos de apenas um tipo de base está localizado pelo menos na terminação 3º ou 5º do ácido nucleico; e (b) imobilizar o ácido nucleico no suporte sólido por reticulação pela luz, em que a reticulação pela luz é realizada em um comprimento de onda de cerca de 300 a 500 nm, preferivelmente, em um comprimento de onda de 365 nm, em que o trecho de nucleotídeos de apenas um tipo de base tem um comprimento de cerca de 7 a cerca de 100 nucleotídeos, e a reticulação é realizada com uso de uma quantidade de energia na faixa de cerca de 0,5 Joule/cm? a cerca de 10 Joule/em?.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[007] O objetivo da invenção é fornecer um método alternativo de imobilização de sondas de ácido nucleico a substratos sólidos, o que é simples e eficaz.

[008] Em uma modalidade, é um objetivo fornecer um método de imobilização de sondas de ácido nucleico a substratos sólidos, em que o substrato não requer pré-tratamentos, tais como pré-tratamentos que compreendem funcionalização amina ou funcionalização tiol do suporte sólido e, preferivelmente, onde o substrato por de material moldável termoplástico e injetado que não requer nenhuma funcionalização de superfície após ser produzido por moldagem por injeção.

[009] Em uma modalidade, é um objetivo fornecer um método de imobilização de sondas de ácido nucleico a substratos sólidos, em que o substrato não requer lavagem após a imobilização pela luz UV. Deste modo, o suporte de dispositivo final que transporta as sondas imobilizadas pode ser produzido a custo reduzido.

[0010] O objetivo da invenção é fornecer uma sonda que compreende uma porção da cadeia de ancoragem terminal para imobilizar a sonda de ácido nucleico a um substrato com alta efetividade e em que o substrato, vantajosamente, não requer pré-tratamento.

[0011] Estes objetivos foram alcançados pela invenção ou por modalidades da mesma, como definido nas reivindicações e descrito no presente documento, abaixo.

[0012] A invenção fornece um método novo e eficaz para imobilizar uma sonda de ácido nucleico a um suporte sólido. Os inventores da invenção encontraram uma nova alteração de ancoragem para imobilizar uma sonda de ácido nucleico a um suporte sólido onde a eficiência da imobilização é surpreendentemente alta e o risco de danos indesejados na sonda de ácido nucleico é muito baixo.

[0013] O método para imobilizar uma sonda de ácido nucleico a um suporte sólido, o método compreende fornecer a sonda de ácido nucleico para compreender uma porção de cadeia de ancoragem terminal, e uma porção de captura aplicar a sonda de ácido nucleico a uma superfície do suporte sólido, e ancorar a porção da cadeia de ancoragem da sonda de ácido nucleico ao suporte sólido ao submetê-la à luz UV.

[0014] A porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico compreende uma sequência de N nucleotídeos, composta por trechos de nucleotídeos de tipo de base X, com nucleotídeo(s) intermediário(s) de tipo de base Citosina (C) e, opcionalmente, um nucleotídeo de tipo de base Guanina (G) ou uma sequência com pelo menos 90% de similaridade ao mesmo. Os trechos de nucleotídeos de tipo de base X, independentemente uns dos outros, compreendem de 1 a 5 nucleotídeos. N é pelo menos 18 e cada tipo de base X, independentemente uma da outra, designa tipo de base Timina (T) ou tipo de base Uracila (U). Em uma modalidade, N é pelo menos 20.

[0015] Em uma modalidade, a porção de cadeia de ancoragem terminal tem, no máximo, 1, ou é livre de nucleotídeos de tipo de base G.

[0016] A similaridade percentual é determinada pela contagem do número n de nucleotídeos na sequência de N nucleotídeos que diferem na composição de trechos de 1 a 5 nucleotídeos de tipo base X com nucleotídeo(s) intermediário(s) de tipo base C e calculando a percentual de similaridade 100*(N-n)/N.

[0017] Os termos nucleotídeo(s) de um tipo de base específico, tal como o tipo de base o respectivo tipo de base Citosina (C), tipo de base Timina (T) ou tipo de base Uracila (U) são, no presente documento, usados para incluir nucleotídeos que compreendem o tipo de base específico além do derivado químico do mesmo, conhecido por uma pessoa versada na técnica, que seja capaz de interagir com uma base complementar, o que inclui derivados funcionalmente equivalentes ou modificações dos mesmos. O termo “funcionalmente equivalente” refere-se à capacidade da base de estabelecer uma conexão não covalente com uma base complementar, que é semelhante quimicamente à conexão não covalente do nucleotídeo ou da base da qual é derivada. Tais bases modificadas ou funcionalmente equivalentes podem ainda ser capazes de realizar uma ligação de hibridização com uma base complementar.

[0018] Os termos “porção de cadeia de ancoragem terminal”, “policauda” ou simplesmente “mudança de ancoragem” são, no presente documento, usados de forma intercambiável.

[0019] O termo “componente alvo” significa qualquer componente que pode ser capturado por e/ou ser sintetizado na porção de captura, por exemplo, por hibridização, extensão do primer ou outras reações.

[0020] Os termos “distal” e “proximal” devem ser interpretados em relação à orientação do dispositivo de transmissão óptica ou de qualquer outro dispositivo usado em conexão com cirurgia minimamente invasiva.

[0021] O termo “cerca de” é geralmente usado para incluir o que está dentro das incertezas de medição. Quando usado em intervalos, o termo “cerca de” deve, no presente documento, ser considerado como significando que o que está dentro das incertezas de medição, está incluído no intervalo.

[0022] Deve-se destacar que o termo “compreende/que compreende”, quando usado no presente documento, deve ser interpretado como um termo aberto, isto é, deve ser utilizado para especificar a(s) característica(s) especificamente declarada(s), tais como elemento(s), unidade(s), número(s) inteiro(s), etapa(s) componente(s) e combinação (s) do(s) mesmo(s), mas não impede a presença ou adição de uma ou mais dentre outras características declaradas.

[0023] A não ser que diferentemente especificado ou claro a partir do contexto, o termo “substancialmente” significa que as incertezas comuns da medição, ou variações e tolerâncias do produto, o que for maior, estão compreendidas.

[0024] O termo “essencialmente” deve, no presente documento, ser entendido como significando que as variações que são praticamente irrelevantes para a finalidade em questão estão incluídas.

[0025] Ao longo da descrição ou das reivindicações, o singular abrange o plural, a não ser que diferentemente especificado ou exigido pelo contexto.

[0026] A frase “uma modalidade” deve ser interpretada para incluir exemplos da invenção que compreendem a(s) característica(s) da modalidade mencionada.

[0027] Todas as características da invenção e modalidades da invenção como descritas no presente documento, incluindo faixas e faixas preferenciais, podem ser combinadas de várias formas dentro do escopo da invenção, a não ser que haja razões específicas para não combinar tais características.

[0028] Ao fornecer a nova sonda de ácido nucleico, os inventores da presente invenção realizaram uma grande e valiosa contribuição à técnica de imobilizar ácidos nucleicos a substratos sólidos. O método fornecido pelos inventores tem várias vantagens muito valiosas, as quais serão explicadas mais abaixo.

[0029] Em uma modalidade, a porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico compreende a referida sequência auxiliar de N nucleotídeos, composta por trechos de nucleotídeos de tipo de base X com nucleotídeo(s) intermediário(s) de tipo de base Citosina (C). A combinação de tipo de base X e tipo de base C mostrou ser muito vantajosa para a obtenção de eficiência de imobilização alta. Assim, em uma modalidade, pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95%, tal como cada um dos N nucleotídeos são, independentemente um do outro, de tipo de base X ou de tipo de base C.

[0030] Os trechos de nucleotídeos de tipo de base X compreendem pelo menos um nucleotídeo de tipo de base X para cada trecho. Os trechos de nucleotídeos de tipo de base X podem ter comprimentos iguais ou diferentes. Em uma modalidade, alguns, tais como cada segundo ou cada terceiro dos trechos de nucleotídeos de tipo de base X têm um primeiro comprimento, e alguns outros, tais como cada segundo ou cada terceiro dos trechos de nucleotídeos de tipo de base X, têm um segundo comprimento mais longo.

[0031] Verificou-se que quando a sonda de ácido nucleico compreende um ou mais trechos de nucleotídeo de tipo de base X, que compreende de 2 a 5 nucleotídeos, o risco de descolamento de sondas, que dão falso negativo, pode ser altamente reduzido.

[0032] Vantajosamente, a sequência de N nucleotídeos compreende menos que 10%, preferivelmente, menos que 5% de nucleotídeos com bases nitrogenadas púricas, tais como 1 ou zero nucleotídeos com bases nitrogenadas púricas.

[0033] Os nucleotídeos com bases nitrogenadas púricas são Adenina (A) e Guanina (G). Verificou-se que nucleotídeos com bases nitrogenadas púricas, geralmente reduzem a eficiência de imobilização da sonda de ácido nucleico. Acredita-se que isso pode ser porque a alta eficiência de imobilização da sonda de ácido nucleico é causada pela formação de ligações covalentes por reações nas ligações duplas C=C da pirimidina. Assim, os nucleotídeos com bases nitrogenadas púricas não serão ligados ao suporte sólido por esta reação.

[0034] Vantajosamente, a sequência de N nucleotídeos compreende exclusivamente nucleotídeos com bases nitrogenadas pirimídicas.

[0035] Em uma modalidade, a porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico compreende uma sequência de pelo menos N nucleotídeos, composta por trechos de 2 a 5 nucleotídeos de tipo de base X, com nucleotídeo(s) intermediário(s) de tipo de base C.

[0036] O número N de nucleotídeo da porção da cadeia de ancoragem do terminal não deve ser muito baixo porque isso pode resultar em uma ligação muito fraca entre a porção de cadeia de ancoragem terminal e o suporte sólido. No entanto, também é desejado que o número total de nucleotídeos da sonda de ácido nucleico não seja muito alto, uma vez que isso pode resultar em que o número de sondas de ácido nucleico imobilizadas por unidade de área possa ser baixo e/ou que as sondas de ácido nucleico podem bloquear parcialmente um pelo outro, resultando, assim, em uma imobilização relativamente fraca. É vantajoso que N seja pelo menos 26, bem como pelo menos 30, bem como pelo menos 34, bem como pelo menos 38, bem como pelo menos 40.

[0037] De forma geral, acredita-se que aumentar o número N de nucleotídeo da cadeia de ancoragem terminal para além de 60 não resulta em aumento adicional da eficiência da imobilização. Em uma modalidade, o número N de nucleotídeo da cadeia de ancoragem terminal é menor que 50.

[0038] Vantajosamente, os trechos de nucleotídeos de tipo de base X, independentemente uns dos outros, são separados por 1 a 4 nucleotídeo(s) de tipo de base C.

[0039] Em uma modalidade, os trechos de nucleotídeos de tipo de base X são de mesmo comprimento, preferivelmente, um comprimento de 2 nucleotídeos de tipo de base X, um comprimento de 3 nucleotídeos de tipo de base X, ou um comprimento de 4 nucleotídeos de tipo de base X.

[0040] Verificou-se que onde a porção de cadeia de ancoragem terminal compreende uma subsequência de nucleotídeo repetitiva do tipo de base X, e nucleotídeo do tipo de base C, pode ser obtida uma eficiência de imobilização muito alta e o risco de descolamento da sonda de ácido nucleico imobilizada é muito baixo, mesmo quando submetido a mudanças de temperatura, tais como as fornecidas em processos de termociclagem, tal como a termociclagem aplicada em PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)

para amplificação de segmentos de DNA.

[0041] Em uma modalidade altamente adequada, a sequência de N nucleotídeos compreende repetir as subsequências de nucleotídeos de tipos de base de acordo com a fórmula COOY-(C)z-)um, em que Y é um número inteiro de 1 a 5, Z é um número inteiro de 1a 5, Y>Z e M é um número inteiro de 4 a 20.

[0042] Vantajosamente, Y é um número inteiro de 2 a 5, Z é um número inteiro de 1 a 4, Y>Z e M é um número inteiro de 4 a 20.

[0043] Em uma modalidade Z=1. Em uma modalidade Z=2. Em uma modalidade Y=2 e M>10, tal como M>12, tal como M> 14. Em uma modalidade Y=3 e M> 6, tal como M> 8, tal como M> 10. Em uma modalidade Y=4 e M> 4, tal como M> 6, tal como M> 8.

[0044] Em outra modalidade altamente adequada, a sequência de N nucleotídeos compreende repetir as subsequências de nucleotídeos de tipos de base de acordo com a fórmula CXA)v2-(C)7-0)v2 -)u, em que Y, é um número inteiro de 1 a 4, Z é um número inteiro de 1 a 4, e M é um número inteiro de 4 a 20.

[0045] Preferivelmente, Y, é um número inteiro de 2 a 3, Zé um número inteiro de 1 a 3. Em uma modalidade Y,>Z, preferivelmente, Y;>Z. Em uma modalidade Y;=2 e M>10, tal como M>12, tal como M> 14. Em uma modalidade Y,=3 e M> 4, tal como M>6, tal como M> 8.

[0046] Verificou-se que, nas modalidades em que o número de base tipo X é maior que o número de base tipo C, é preferida para a obtenção de uma eficiência de imobilização muito alta e estável.

[0047] Em uma modalidade, o número de Y ou Y; é maior que o número de Z, preferivelmente, o número de Y ou Y, é, pelo menos, duas vezes o número de Z.

[0048] Em uma modalidade, os trechos de nucleotídeos de tipo de base X são trechos de nucleotídeos de tipo de base T.

[0049] Em uma modalidade, os trechos de nucleotídeos de tipo de base X são trechos de nucleotídeos de tipo de base U.

[0050] Uma vez que a ligação porção de cadeia de ancoragem terminal ao suporte sólido seja uma ligação causada pela formação de covalências de vínculo por reações localizadas nas ligações duplas C=C da pirimidina, acredita-se que nucleotídeos de tipo de base U terão uma eficiência de ligação correspondente à eficiência de ligação de nucleotídeos do tipo base T.

[0051] Em uma modalidade os trechos de nucleotídeos de tipo de base X compreendem tanto nucleotídeos de tipo de base T quanto nucleotídeos de tipo de base U, bem como alternâncias de nucleotídeos de tipo de base T e nucleotídeos de tipo de base U.

[0052] A sequência de N nucleotídeos da ancoragem terminal pode ser localizada em ambas as extremidades da sonda de ácido nucleico. Em uma modalidade, a sequência de N nucleotídeos da ancoragem terminal está localizada na extremidade 5". Em uma modalidade, a sequência de N nucleotídeos da ancoragem terminal está localizada na extremidade 3º.

[0053] Em uma modalidade, a sonda de ácido nucleico apresenta uma ancoragem terminal em ambas as extremidades: 5º e 3º, em que a sequência de N nucleotídeos nas respectivas extremidade 5' e a extremidade 3º, pode ser igual ou diferente uma da outra.

[0054] A porção de captura da sonda de ácido nucleico pode compreender DNA, RNA, PNA, CNA, HNA, LNA ou ANA; um oligonucleotídeo do mesmo, uma fração do mesmo; ou quaisquer combinações do mesmo.

[0055] Em uma modalidade, a porção de captura compreende 2º'O- metil RNA, que é comumente usado como análogo do RNA, onde um grupo metila é adicionado à 2º hidroxila da metade da ribose do nucleosídeo do mesmo, o que forma um grupamento metóxi.

[0056] O DNA pode ser na forma de, por exemplo, A-DNA, B-DNA ou Z-DNA. O RNA pode ser na forma de, por exemplo, p-RNA, isto é piranosil-RNA ou formas estruturalmente modificadas, como RNA hairpin ou um RNA stem-loop.

[0057] O termo “PNA” significa um ácido nucleico peptídico, que é um polímero sintetizado artificialmente, semelhante ao DNA ou RNA que é usado em pesquisas biológicas e tratamentos médicos, mas que não é conhecido por ocorrer naturalmente. O esqueleto PNA pode ser composto por unidades repetidas de N-(2-aminoetil)-glicina presas por ligações peptídicas.

[0058] O termo “HNA” significa um ácido nucleico hexitol, isto é, um análogo de DNA que é construído a partir de padrões de bases nitrogenadas e um esqueleto fosforilado de 1,5-anidrohexitol.

[0059] O termo “LNA” significa um ácido nucleico bloqueado.

Tipicamente, um ácido nucleico bloqueado é um nucleotídeo de RNA modificado e, portanto, inacessível. A fração ribose de um nucleotídeo LNA pode, por exemplo, ser modificada com uma ponte extra que conecte os carbonos 2º e 4º.

[0060] O termo “ANA” significa um ácido nucleico arabinóico ou derivados do mesmo.

[0061] O termo “CNA” significa um ácido nucleico do ácido aminociclohexiletano. Além disso, o termo refere-se a um ácido nucleico de ciclopentano, isto é, uma molécula de ácido nucleico que compreende, por exemplo, 2º -deoxicarbaguanosina.

[0062] Em uma modalidade, a porção de captura da sonda de ácido nucleico pode compreender qualquer uma das combinações de DNA, RNA, PNA, CNA, HNA, LNA e ANA ou frações das mesmas.

[0063] Em uma modalidade, a porção de captura da sonda de ácido nucleico, as moléculas de ácido nucleico como definidas no presente documento, podem ser na forma de oligonucleotídcos curtos, oligonucleotídeos longos ou polinucleotídeos.

[0064] Em uma modalidade, a porção de captura da sonda de ácido nucleico é de fita simples. Em uma modalidade, a porção de captura da sonda de ácido nucleico é de dupla fita.

[0065] Em uma modalidade, a sonda de ácido nucleico é obtida a partir de uma fonte natural ou é total ou parcialmente sintetizada.

[0066] Geralmente, é desejado que pelo menos a porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico seja pelo menos parcialmente sintetizada, preferivelmente, totalmente sintetizada.

[0067] Em uma modalidade, toda a sonda de ácido nucleico é de fita simples.

[0068] Em uma modalidade, a sonda de ácido nucleico é de dupla fita em pelo menos uma parte de seu comprimento, tal como em uma parte da sua porção de captura.

[0069] A porção de captura pode, em princípio, ser qualquer tipo da fração capaz de capturar um componente alvo.

[0070] Em uma modalidade, a porção de captura compreende um primer, tal como um primer adaptado para uma extensão de primer. À extensão de primer é uma técnica usada, por exemplo, para mapear as extremidades 5º do RNA. A extensão de primer pode, por exemplo, ser usada para determinar o local de início da transcrição.

[0071] Em uma modalidade, a porção de captura compreende uma porção de cadeia de hibridização que compreende uma sequência de nucleotídeos, tal como uma sequência de nucleotídeos adaptados para hibridização de uma região complementar de uma sonda de ácido nucleico alvo e/ou adaptada para realizar uma análise da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Quando a PCR é realizada a partir de um primer/sonda imobilizada a um suporte sólido, também pode ser referido a uma PCR de fase sólida ou SP-PCR.

[0072] Em uma modalidade, a porção de captura é adaptada para emparelhar o DNA alvo complementar com aplicação, tal como hibridização por microarranjo, PCR, LAMP, WGA (amplificação do genoma completo), HDA, PCR de fase Sólida.

[0073] A Amplificação Isotérmica Mediada por Loop (LAMP) usa de 4 a 6 primers que reconhecem de 6 a 8 regiões distintas do DNA alvo. Uma DNA polimerase, que desloca a fita, inicia a síntese e 2 dos primers formam estruturas em arco para facilitar os ciclos subsequentes de amplificação. O LAMP é rápido, sensível e a amplificação é tão extensa que o pirofosfato de magnésio produzido durante a reação pode ser visto a olho nu, o que torna o LAMP adequado para diagnósticos em campo.

[0074] A Amplificação por Deslocamento de Fita (SDA) baseia-se em uma polimerase de DNA de deslocamento de fita, tipicamente Bst DNA Polimerase, fragmento grande ou fragmento de Klenow (3-5 “exo), para iniciar em nicks criados por uma endonuclease de restrição de fita limitada ou enzima de nick em um local contido em um primer. O local de nicking é regenerado a cada passo de deslocamento da polimerase, resultando em amplificação exponencial. O SDA é tipicamente usado em diagnósticos clínicos.

[0075] A Amplificação Dependente de Helicase (HDA) emprega a atividade de desenrolamento da fita dupla de DNA de uma helicase para separar as fitas, o que permite o emparelhamento e a extensão do primer por uma polimerase de DNA que desloca a fita. Como a PCR, este sistema requer apenas dois primers. O HDA foi empregado em vários dispositivos de diagnóstico e testes aprovados pela FDA.

[0076] A Reação de Amplificação da Enzima de Nick (NEAR) emprega uma DNA polimerase de deslocamento de fita iniciada em um nick criado por uma enzima de nicking, que produz rapidamente muitos ácidos nucleicos curtos da sequência alvo. Esse processo é extremamente rápido e sensível, e permite a detecção de pequenas quantidades de alvo em minutos. O NEAR é comumente usado para detecção de patógenos em clínicas e aplicações de biossegurança.

[0077] A reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real), também conhecida como reação em cadeia da polimerase quantitativa (QPCR), é uma técnica laboratorial de biologia molecular baseada na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Ela monitora a amplificação de uma molécula de DNA alvo durante a PCR, isto é, em tempo real, e não ao final, como na PCR convencional.

[0078] Vantajosamente, a porção de captura compreende uma cadeia de nucleotídeos até cerca de 200 nucleotídeos e, preferivelmente, mais curta. Em uma modalidade, a porção de captura compreende uma cadeia de nucleotídeos que tem de cerca de 4 a cerca de 100 nucleotídeos, bem como de cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos, bem como de cerca de 20 a cerca de nucleotídeos.

[0079] A porção de captura pode ser diretamente associada à porção de cadeia de ancoragem terminal.

[0080] Em uma modalidade a porção de captura está associada à porção de cadeia de ancoragem terminal por meio de um espaçador, tal como um espaçador abásico, bem como um número respectivo de espaçadores.

[0081] Exemplos de espaçadores incluem um Espaçador C3, um espaçador PC (foto-clivável), um espaçador de hexanodiol, um Espaçador 9, um Espaçador 18, um 1º,2”-Dideoxiribose (dSpacer), e espaçadores nucleotídeos (A, T, G, O).

[0082] Um Espaçador C3 é um espaçador de três carbonos que é usado para incorporar um braço espaçador curto em um oligonucleotídeo. O Espaçador C3 pode ser incorporado em adições consecutivas se um espaçador maior por necessário. O Espaçador 9 é uma cadeia de trietilenoglicol com 9 átomos de comprimento (6 carbonos + 3 oxigênios) e é usada para incorporar um braço espaçador em um oligonucleotídeo. O Espaçador 9 pode ser incorporado em adições consecutivas sempre que um espaçador maior por necessário. O Espaçador 18 é uma cadeia de hexaetilenoglicol com 18 átomos de comprimento (12 carbonos + 6 oxigênios) e é usado para incorporar um braço espaçador longo em um oligonucleotídeo. O Espaçador 18 pode ser incorporado em adições consecutivas sempre que um espaçador maior por necessário.

[0083] Estes e outros espaçadores adequados podem, por exemplo, ser adquiridos da Gene Link, Inc. NY, EUA ou da Bio-Synthesis Inc. TX, EUA.

[0084] Em uma modalidade, a porção de cadeia de ancoragem terminal está localizada na extremidade 5' ou na extremidade 3º da sonda de ácido nucleico e a porção de captura H está localizada na outra dentre a extremidade 5' e a extremidade 3'.

[0085] Em uma modalidade, a sonda de ácido nucleico compreende uma porção de cadeia de ancoragem terminal em ambas as extremidades: 5' e 3', e a porção de captura está localizada entre as porções de cadeia de ancoragem terminal opcionalmente com espaçador(es) intermediário(s).

[0086] Para certas aplicações, é desejado que a sonda de ácido nucleico compreenda um marcador. Em outra aplicação ou na mesma aplicação, o componente alvo carrega um marcador. Onde ambos carregam um marcador, pode ser desejado que os marcadores sejam diferentes. O(s) marcador(es) pode(m), em princípio, ser qualquer tipo de marcador.

[0087] Em uma modalidade, a sonda de ácido nucleico compreende um marcador, tal como um marcador radioativo ou um marcador fluorescente, tal como um corante de cianina, por exemplo, Cy3 (1,1'-bis(3-hidroxipropil)- 3,3,3',3"-tetrametilindocarbocianina) ou Cy5(1,1'-bis(3-hidroxipropil)- 3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina).

[0088] Os corantes de cianina são modificações químicas importantes de oligonucleotídeos que exibem fluorescência intensa e estável a comprimentos de onda de luz visível. Os corantes de cianina possuem bandas de absorção nítidas, altos coeficientes de extinção, excelente resistência à fotodegradação e tornam o DNA e outros oligômeros altamente fluorescentes, de modo que até moléculas isoladas podem ser observadas.

[0089] A sonda de ácido nucleico pode ser depositada na superfície do suporte sólido por qualquer método, tal como marcação.

[0090] Os termos “marcar” e “imprimir” são, no presente documento, usados de forma intercambiável.

[0091] Vantajosamente a marcação compreende marcar a sonda de ácido nucleico em um solvente na superfície do substrato sólido.

[0092] A marcação pode, por exemplo, ser realizada pelo uso de um robô de marcação e/ou uma impressão de jato de tinta que, por exemplo, use a mesma tecnologia que as impressoras de computador para expulsar as gotas de volume de nanolitro a picolitro da solução da sonda, em vez de tinta, na superfície do suporte sólido. Como alternativa, essas sondas podem ser aplicadas com um pino diretamente em um local específico na superfície do suporte sólido.

[0093] Vantajosamente, a sonda de ácido nucleico é depositada no suporte sólido em um solvente. A concentração ideal da sonda de ácido nucleico no solvente depende, em grande parte, do comprimento da sonda de ácido nucleico. No entanto, verificou-se também que, quando usadas sondas de ácido nucleico que tem preferência por porções de cadeia de ancoragem terminal, como descrito acima, a concentração da sonda de ácido nucleico pode ser aumentada.

[0094] Em uma modalidade, a sonda de ácido nucleico é marcada no solvente em uma concentração superior a 100 um, bem como em uma concentração de cerca de 1 um a cerca de 80 um, bem como de cerca de 3 um a cerca de 70 um, bem como de cerca de 5 um cerca de 60 um. Em uma modalidade, a sonda de ácido nucleico é marcada no solvente em uma concentração de até cerca de 800 ng/ul, bem como de cerca de 1 ng/ul a cerca de 500 ng/ul.

[0095] As marcas individuais podem, por exemplo, ter um volume de cerca de 0,1 nl a cerca de 1 nl, bem como de cerca de 0,05 nl a cerca de 1 nl, bem como de cerca de 0,1 nl a cerca de 0,8 nl, bem como de cerca de 0,3 nl a cerca de 0,6 nl.

[0096] Exemplos de solventes adequados incluem SSC (citrato de sódio salino), DMSO (dimetilsulfóxido), NaHPO;, (fosfato de sódio dibásico), SDS (dodecilsulfato de sódio) e NaOH (hidróxido de sódio). Um outro exemplo inclui Triton X-100 em combinação com SSC.

[0097] Após ser marcada no suporte sólido, a sonda de ácido nucleico é seca, por exemplo, permitindo que a mesma seque. Depois disso, o suporte sólido que compreende a sonda de ácido nucleico é submetido ao tratamento UV.

[0098] Na prática, o suporte sólido pode ser de qualquer tipo de material ou combinação dos mesmos. Vantajosamente o suporte sólido é um suporte de polímero ou um suporte de vidro, preferivelmente, o suporte compreende poliestireno (PS), copolímero de olefina cíclica (COC), policarbonato (PC), Poli(metacrilato de metila) (PMMA) ou uma mistura que compreende um ou mais dentre os polímeros mencionados anteriormente.

[0099] O suporte sólido pode ser um suporte em camadas.

[00100] Em uma modalidade preferencial, o suporte sólido compreende ou é feito de poliestireno (PS). Preferivelmente, pelo menos a superfície do suporte sólido no qual a sonda de ácido nucleico é marcada é uma superfície de PS. Geralmente, é desejado que o substrato esteja em estado não espumado, e tenha geralmente uma baixa fricção e superfície lisa.

[00101] O suporte sólido pode, vantajosamente, ser um suporte sólido moldado por injeção. O suporte sólido moldado por injeção pode, opcionalmente, ser submetido à modificação de superfície pós-moldagem com plasma rico em oxigênio para introduzir grupos polares na superfície do suporte sólido. Isto pode, em particular, ser uma vantagem quando a superfície é adaptada a um caráter hidrofílico.

[00102] Devido à eficiência da imobilização do ácido nucleico, pode não ser necessário fazer qualquer pré-tratamento ou adicionar qualquer grupo funcional ao suporte sólido.

[00103] Assim, em uma modalidade, a superfície do suporte sólido é essencialmente livre de um ou mais de grupamento amina, grupamento metileno, grupamento tiol, grupamento epóxi, grupamento diazo ou grupamento amida, preferivelmente, o suporte de superfície é essencialmente livre de todos dentre grupamento amina, grupamento metileno, grupamento tiol, grupamento epóxi, grupamento diazo ou grupamento amida.

[00104] O suporte sólido pode, vantajosamente, ser ou fazer parte de um cartucho, uma placa de teste ELISA, uma cubeta, uma microplaca ou qualquer combinação das mesmas.

[00105] Tais dispositivos de teste são geralmente conhecidos e, em princípio, qualquer um destes pode formar o suporte sólido.

[00106] Em uma modalidade, o suporte sólido é ou faz parte de um cartucho que compreende um canal, com um canal de superfície que define o canal, em que a superfície do substrato sólido forma pelo menos uma parte do canal de superfície.

[00107] Em uma modalidade, o canal compreende uma seção de reação e o método compreende imobilizar a sonda de ácido nucleico a uma superfície dentro da seção de reação do canal. A reação pode ser uma seção do comprimento do canal.

[00108] Em uma modalidade, a seção de reação compreende pelo menos um elemento óptico. O elemento óptico pode, vantajosamente, ser construído para redirecionar e, preferivelmente, colimar a luz emitida a partir de um marcador fluorescente (fluoróforo) ou conectado à sonda de ácido nucleico imobilizada.

[00109] Em uma modalidade, o elemento óptico compreende uma estrutura de lentes e/ou uma estrutura de fluorescência de ângulo supercrítico (estrutura SAF), a estrutura SAF preferivelmente, tem uma superfície superior e o método compreende imobilizar a sonda de ácido nucleico à superfície superior.

[00110] O elemento óptico vantajosamente tem um formato tronco- cônico, como descrito mais abaixo.

[00111] Vantajosamente, o substrato sólido é ou faz parte do dispositivo de teste descrito mais abaixo.

[00112] O suporte sólido pode vantajosamente ser um cartucho microfluídico, tal como o cartucho microfluídico descrito no documento WO17133741, que é aqui incorporado por referência. Em uma modalidade, o suporte sólido é fornecido pela(s) estruturaís) SAF como descrito no documento WO1l713374] e a sonda de ácido nucleico é imobilizada na(s) superfície(s) superior(es) da(s) estrutura(s) SAF.

[00113] Verificou-se que a sonda de ácido nucleico pode ser imobilizada no suporte sólido com uso de uma dose relativamente baixa de luz UV o que garante, assim, que o risco de dano à porção de captura da sonda de ácido nucleico seja relativamente baixo ou mesmo evitado.

[00114] Em uma modalidade, a porção da cadeia de ancoragem do ácido nucleico é ancorada ao suporte sólido ao submetê-la à luz UV que compreende comprimento de onda na faixa de cerca de 250 nm a 500 nm, preferivelmente, que compreende comprimento de onda de pelo menos um dentre cerca de 254 nm, cerca de 265 nm e/ou cerca de 365 nm.

[00115] Em uma modalidade, a porção da cadeia de ancoragem do ácido nucleico é ancorada ao suporte sólido por meio da submissão da mesma à luz UV com uso de uma quantidade de energia muito baixa, por exemplo, de cerca de 0,2 Joule/cm? a cerca de 1 Joule/cm?, bem como cerca de 0,3 Joule/cm? ou mais.

[00116] Em uma modalidade, a porção da cadeia de ancoragem do ácido nucleico é ancorada ao suporte sólido ao submetê-la à luz UV com uso de uma quantidade de energia de cerca de 0,4 Joule/cm? a cerca de 15 Joule/cm?, bem como de cerca de 1 Joule/cm? a cerca de 10 Joule/cm?, bem como de cerca de 1,5 Joule/cm? a cerca de 6 Joule/cm?, bem como de cerca de 1,6 Joule/cm? a cerca de 3 Joule/cm?, bem como de cerca de 1,7 Joule/cm? a cerca de 2 Joule/em?.

[00117] Em uma modalidade, a sonda de ácido nucleico é imobilizada ao expor o suporte sólido que transporta a sonda de ácido nucleico marcada e seca a uma iluminação UV por pelo menos 30 segundos, bem como por cerca de 1 a cerca de 8 minutos, bem como cerca de 2 a cerca de 6 minutos. À iluminação UV pode, por exemplo, ser fornecida por um emissor UV, tal como um emissor UV de 3 a 12 W, tal como um emissor UV de 5 a 10 W.

[00118] Apenas uma pequena quantidade da luz UV emitida atinge e afeta a sonda de ácido nucleico. Assim, ao calcular a quantidade de energia à qual o suporte sólido é submetido por unidade de área, a distância entre o emissor UV e o suporte sólido, além da divergência do feixe emitido, devem ser levadas em consideração.

[00119] A invenção também compreende um suporte sólido que compreende uma sonda de ácido nucleico imobilizada obtida pelo método descrito acima.

[00120] Acredita-se que a luz ultravioleta induza a formação de vínculos covalentes pelas reações localizadas nas ligações duplas C=C. Os dímeros de pirimidina são lesões moleculares formadas a partir de lesões formadas a partir de bases de timina ou citosina no DNA por meio de reações fotoquímicas. Então, teoricamente, o dano da própria molécula de DNA cria a ligação entre a sonda e o PS.

[00121] Como explicado acima, a porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico resulta em uma eficiência de imobilização aumentada para o suporte sólido, tal como um suporte sólido PS. A hipótese é que isso ocorre porque a luz UV induz a formação de vínculos covalentes por reações localizadas nas ligações duplas C=C. Como mostrado nos exemplos abaixo, a policauda 42TTCCTT (SEQ ID NO:22) aumentou em pelo menos 18 vezes a eficiência imobilizada em comparação com a policauda 20T"ºC!º (SEQ ID NO:1). A nomenclatura das policaudas é como se segue. O primeiro número indicado é o comprimento total da porção de cadeia de ancoragem terminal (policauda), as letras indicam os tipos de nucleotídeos e o número elevado indica o número de vezes que a sequência de nucleotídeos mencionada é repetida.

[00122] A estrutura e ligação na superfície do suporte sólido podem, por exemplo, ser examinadas com uso de Análise de Superfície por Espectroscopia de Fotoelétrons de Raios-X, por exemplo, como descrito em “SURFACE CHARACTERIZATION OF POLYMERS BY XPS E SIMS TECHNIQUES” por Janez Kova, Materials and technology 45 (2011) 3, páginas 191 a 197.

[00123] A invenção também compreende uma sonda de ácido nucleico como descrito acima.

[00124] A nova sonda de ácido nucleico é capaz de ser imobilizada a um suporte sólido com uma eficiência de imobilização aumentada. A sonda de ácido nucleico compreende uma porção de cadeia de ancoragem terminal, e uma porção de captura, em que a porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico compreende uma sequência de N nucleotídeos composta por trechos de nucleotídeos de tipo de base X com nucleotídeo(s) intermediário(s) de tipo de base Citosina (C) ou uma sequência com pelo menos 90% de similaridade ao mesmo, em que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X, independentemente uns dos outros, compreendem de 2 a 5 nucleotídeos, em que N é pelo menos 18.

[00125] Preferivelmente, as sondas de ácido nucleico são como as sondas de ácidos nucleicos descritas acima.

[00126] Uma sonda de ácido nucleico particularmente preferida é uma sonda de ácido nucleico onde a sequência de N nucleotídeos compreende repetir as subsequências de nucleotídeos de tipos de base de acordo com a fórmula COOY-(C)z-)u, em que Y, Z e M são como descritos acima.

[00127] Outra sonda de ácido nucleico particularmente preferida é uma sonda de ácido nucleico onde a sequência de N nucleotídeos compreende repetir as subsequências de nucleotídeos de tipos de base de acordo com a fórmula COD v2-(C)7-0)Dv2 Ju, em que Y,, Z e M são como descritos acima.

[00128] A invenção também se relaciona a um dispositivo de teste, que é adequado para uso no método descrito acima.

[00129] O dispositivo de teste compreende um suporte sólido que pode ser o suporte sólido descrito acima. O suporte sólido compreende pelo menos uma estrutura de fluorescência de ângulo supercrítico (estrutura SAF). À estrutura SAF tem um formato tronco-cônico, com um ângulo de tronco a, uma superfície superior, um diâmetro superior D e uma altura h.

[00130] O ângulo de tronco ideal, normalmente, será igual ao ângulo no qual o fluoróforo emite a maior parte de sua luz. Este ângulo depende de dois índices de refração da respectiva estrutura SAF e do meio que circunda e em contato com a estrutura SAF, isto é, ar ou fluido de amostra, tal como água ou um fluido aquoso, que normalmente tem um índice de refração idêntico à água. Verificou-se que a temperatura de 60 graus é melhor para a interface água/PS, enquanto cerca de 50 graus é melhor para a interface ar/PS.

[00131] O ângulo de tronco a pode, por exemplo, ser de cerca de 40º a cerca de 70º, bem como de cerca de 55º a cerca de 65º, bem como cerca de 60º.

[00132] De forma geral, é desejado que o ângulo de tronco a seja de cerca de 30º a cerca de 70º, bem como de cerca de 35 a cerca de 65, bem como de cerca de 40º a cerca de 60º, bem como cerca de 40º ou cerca de 60º. Em uma modalidade onde a estrutura SAF é feita de poliestireno e é adaptada para uso com ar que circunda e forma uma interface ar/poliestireno na superfície da estrutura SAF, o ângulo de tronco a é, vantajosamente, de cerca de 35º a cerca de 55º. Em uma modalidade onde a(s) estrutura(s) SAF é(são) feita(s) de poliestireno e é adaptada para uso com (por exemplo, um fluido de amostra aquoso) que circunda e forma uma interface ar/poliestireno na superfície da estrutura SAF o ângulo de tronco a é, vantajosamente, de cerca de 55º a cerca de 65º.

[00133] Em uso, a sonda de ácido nucleico pode ser marcada na superfície superior da estrutura SAF e seca, por exemplo, como descrito em outro lugar no presente documento.

[00134] Vantajosamente, a altura h da estrutura SAF é pelo menos cerca de 0,2 mm, bem como de cerca de 0,25 mm a cerca de 0,5 mm, bem como de cerca de 0,3 mm a cerca de 0,35 mm. Verificou-se que a altura pode ser importante para obter um sinal ideal.

[00135] Vantajosamente, o diâmetro superior é de cerca de 0,05 mm a cerca de 0,5 mm, bem como de cerca de 0,1 mm a cerca de 0,3 mm. Geralmente, é desejado que uma ou, preferivelmente, mais estrutura(s) SAF seja(m) relativamente pequena(s), porque isso permite mais estruturas SAF no mesmo dispositivo de teste. Deste modo, vários testes podem ser realizados com uso de um dispositivo de teste. No entanto, onde o diâmetro superior for muito pequeno, algumas das sondas de ácido nucleico podem ser marcadas na borda da superfície superior ou mesmo ao lado da superfície superior. Portanto, uma estrutura SAF com um diâmetro superior muito pequeno, por exemplo, onde D é menor que cerca de 0,2, pode ter uma baixa robustez para marcação.

[00136] Verificou-se que, ao garantir que pelo menos uma estrutura SAF seja relativamente alta comparada ao seu diâmetro superior, o sinal de leitura obtido possui uma intensidade muito boa. Vantajosamente, a estrutura SAF tem um diâmetro superior à proporção de aspecto de altura D/h, que é de cerca de 1,1 ou menos, bem como cerca de 1,05 ou menos, bem como cerca de 1 ou menos.

[00137] O suporte sólido pode, preferivelmente, ser um suporte de polímero ou um suporte de vidro. Preferivelmente, o suporte compreende poliestireno (PS), copolímero de olefina cíclica (COC), policarbonato (PC), Poli(metacrilato de metila) (PMMA) ou uma mistura ou uma combinação que compreende um ou mais dentre os polímeros mencionados anteriormente.

[00138] O material de suporte pode, vantajosamente, ser transparente, pelo menos para o sinal de comprimento de onda(s), que se espera que seja lido ou usado para excitação.

[00139] Por exemplo, Cy3 fluoresce amarelo esverdeado (excitação —550 nm, emissão -570 nm), enquanto Cy5 é fluorescente na região vermelha (excitação -650, emissão 670 nm).

[00140] Em uma modalidade, o material de suporte é transparente para um ou mais comprimentos de onda dentro e fora da faixa visível.

[00141] Em uma modalidade, a estrutura SAF é uma PS estrutura SAF com um aspecto de proporção D/h, que é de cerca de 1,1 ou menos.

[00142] Em uma modalidade, a superfície superior de pelo menos uma estrutura SAF tem um recesso na superfície superior. Verificou-se que tal recesso da superfície superior pode melhorar a robustez da marcação da estrutura SAF e garantir que a sonda de ácido nucleico marcada esteja localizada na estrutura SAF tão centralmente quanto desejado. O risco de perda do sinal pode ser reduzido.

[00143] O recesso na superfície superior é, vantajosamente, circular. No entanto, pode ter outras formas, tais como oval ou angular.

[00144] Vantajosamente, o recesso na superfície superior tem um eixo geométrico central, que é paralelo com o eixo geométrico central da estrutura SAF. O recesso eixo geométrico central é, vantajosamente, no máximo cerca de 0,2 mm, tal como, no máximo, cerca de 0,1 mm a partir do eixo geométrico central da estrutura SAF. Preferivelmente, o eixo geométrico central do recesso de superfície coincide com o eixo geométrico central da estrutura SAF.

[00145] Vantajosamente, o recesso tem um piso de recesso substancialmente plano. O recesso pode, por exemplo, ter um diâmetro d, que cerca de 10% do diâmetro superior D ou mais, bem como de cerca de 15% a cerca de 80%, bem como de cerca de 20% a cerca de 50 do diâmetro superior D. Um diâmetro d do recesso de cerca de 0,01 a cerca de 0,2, bem como de cerca de 0,25 a cerca de O,1 é, geralmente, desejado.

[00146] Vantajosamente, a borda que circunda o recesso na superfície superior tem uma largura de pelo menos 0,01 mm. Na prática, pode ser custoso produzir a estrutura SAF com um recesso na superfície superior e uma borda que circunda com uma largura abaixo de 0,005. Por outro lado, uma largura de borda muito grande, como 0,1 ou maior ou mesmo 0,2 ou maior, pode resultar em um diâmetro d de recesso muito pequeno que, para algumas aplicações, pode ser indesejado.

[00147] Verificou-se que o recesso, vantajosamente, não deve ser muito alto, uma vez que isso pode reduzir o sinal de leitura. É desejado que a altura h1 do recesso seja, preferivelmente, menor que 25% da altura h SAF, tal como menor que 20% da altura h SAF.

[00148] Em uma modalidade, a altura hl do recesso é cerca de 0,05 mm ou menos, bem como cerca de 0,02 ou menos.

[00149] A borda do recesso pode ser afiada ou arredondada. Em uma modalidade o recesso tem borda de recesso arredondada, preferivelmente, a borda de recesso é arredondada com um raio de arredondamento R, que é cerca de 0,1 mm ou menos, tal como entre 0,01 e 0,8 mm.

[00150] Em uma modalidade preferencial, o recesso tem um formato tronco-cônico, com uma superfície superior formada pela superfície formada pelo piso. Portanto, o recesso em forma tronco-cônico, é colocada de cabeça para baixo em relação à SAF em forma cônica e fuste.

[00151] Preferivelmente, o recesso em forma tronco-cônico, tem um ângulo de tronco 69 de recesso, que é de cerca de 40º a cerca de 70º, bem como de cerca de 55º a cerca de 65º, bem como cerca de 60º. Verificou-se que o sinal pode ser aumentado quando o recesso do ângulo de tronco 9 é próximo ao ângulo de tronco a, tal como até 5 graus de diferença, preferivelmente, até 2 graus de diferença. Preferivelmente, o recesso ângulo de tronco 0 é substancialmente idêntico ao ângulo de tronco a.

[00152] Preferivelmente, o dispositivo de teste é, ou faz parte de um cartucho que compreende um canal com um canal de superfície que define o canal, em que o substrato sólido que compreende a pelo menos uma estrutura SAF forma pelo menos uma parte do canal de superfície.

[00153] O cartucho pode, vantajosamente, ser o cartucho microfluídico descrito no documento WO 2017/133741, com a diferença que a(s) estrutura(s) SAF é/são como descritas no presente documento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00154] Os objetos, características e vantagens acima e/ou adicionais da presente invenção serão elucidados pela descrição ilustrativa que se segue e não se limita a descrição de modalidades e exemplos da presente invenção, com referência aos desenhos anexos.

[00155] A Figura | é um diagrama que mostra um número de policaudas marcadas testadas em um primeiro exemplo, uma vista superior esquemática de um cartucho de microfluido de acordo com uma modalidade da invenção.

[00156] A Figura 2 é um diagrama que mostra o percentual da imobilização das respectivas policaudas marcadas no primeiro exemplo.

[00157] A Figura 3 é um diagrama de processo aplicado em um exemplo adicional.

[00158] A Figura 4 é um diagrama que mostra o percentual da imobilização de um número de policaudas marcadas testadas em um exemplo adicional.

[00159] A Figura 5 apresenta imagens das marcas das policaudas em um exemplo adicional.

[00160] A Figura 6 mostra duas sondas de ácido nucleico de modalidades da invenção e uma sonda de ácido nucleico que tem uma policauda comparativa (porção de cadeia de ancoragem terminal)

[00161] A Figura 7 mostra imagens de diferentes concentrações das sondas de ácido nucleico das Figuras 6a e 6b onde as sondas de ácido nucleico estão marcadas.

[00162] A Figura 8 é uma imagem de uma sonda de controle e duas porções de captura diferentes - um gene Flic que alveja Salmonella e um gene Brfz que alveja as bactérias Bordetella.

[00163] A Figura 9a mostra um primeiro esquema de processo para a realização de SP-PCR.

[00164] A Figura 9b mostra um segundo esquema de processo para a realização de SP-PCR.

[00165] A Figura 10a apresenta imagens de um suporte sólido com sondas de ácido nucleico marcadas, sujeitas à SP-PCR com e sem lavagem.

[00166] A Figura 10b é um gráfico do sinal médio menos o fundo das imagens da Figura 10a.

[00167] A Figura 11 é um diagrama que mostra o percentual da imobilização de um número de policaudas marcadas e sondas de ácido nucleico, onde as policaudas /sondas de ácido nucleico são imobilizadas com uso de diferentes tempos de exposição UV.

[00168] A Figura 12 mostra a porcentagem de imobilização em função do tempo de exposição à UV para uma policauda marcada.

[00169] As Figuras 13a-13e são imagens de um número de policaudas imobilizadas e sondas de ácido nucleico obtidas em diferentes tempos de exposição à UV antes e após a lavagem, em que o emissor de UV utilizado foi um emissor de UV de 8 W.

[00170] As Figuras 14a-14c são imagens de um número de policaudas imobilizados e sondas de ácido nucleico obtidas em diferentes tempos de exposição à UV antes e após a lavagem, em que o emissor de UV usado foi um emissor de UV de 16 W.

[00171] A Figura 15a é um diagrama que mostra o sinal menos o plano de fundo para um número de sondas marcadas de ácido nucleico com diferentes policaudas.

[00172] A Figura 15b são imagens da sonda de ácido nucleico imobilizada da Figura 15a.

[00173] A Figura l16a é um diagrama que mostra o sinal menos o plano de fundo para uma sonda marcada de ácido nucleico imobilizada no suporte sólido usando diferentes tempos de exposição à UV e, portanto, a dosagem de UV, onde a sonda de ácido nucleico imobilizada foi submetida a SP-PCR.

[00174] A Figura 16b apresenta imagens da sonda de ácido nucleico imobilizada da Figura l6a.

[00175] A Figura 17 é uma vista em corte transversal de uma estrutura SAF que compreende sondas de ácido nucleico imobilizadas.

[00176] A Figura 18 é uma vista em perspectiva de uma seção de um canal de reação de um cartucho, onde a seção de reação compreende

Estruturas SAP com sonda de ácido nucleico imobilizadas, que foram submetidas à SP-PCR.

[00177] A Figura 19 é uma vista em perspectiva de uma estrutura SAF ilustrada com uma parte superior pontilhada para mostrar o ângulo de tronco a.

[00178] As Figuras 19a-19d ilustram uma estrutura SAF padrão com um ângulo de tronco de 60 graus.

[00179] As Figuras 20a-20e mostram uma estrutura SAF com um recesso na superfície superior.

[00180] As Figuras 21a-21d mostram outra estrutura SAF com um recesso na superfície superior.

[00181] A Figura 22 mostra sete diferentes estruturas SAF usadas no exemplo 11.

[00182] A Figura 23 mostra o resultado da intensidade do sinal do exemplo 11.

[00183] A Figura 24 mostra o resultado do coeficiente de variação do exemplo 11.

[00184] As Figuras são esquemáticas e simplificadas para maior clareza. Ao longo do documento, os mesmos números de referência são usados para partes idênticas ou correspondentes.

[00185] Um escopo adicional de aplicabilidade da presente invenção se tornará aparente a partir da descrição dada a seguir. No entanto, deve-se entender que a descrição e exemplos específicos, embora indiquem modalidades preferidas da invenção, são dados apenas como ilustração, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica desta descrição e exemplos.

[00186] Foi usado um esquema simples de processo de reticulação UV para anexar oligonucleotídeos de DNA marcados com TC em vários substratos. O esquema de processo usado corresponde ao esquema de processo descrito em Sun Y, Perch-Nielsen 1, Dufva M, et al. “Direct immobilization of DNAs probes on non-modified plastics by UV irradiation and integration in microfluídic devices por rapid bioassay”. Anal Bioanal Chem. 2012;402(2):741-748. doi: 10.1007/s00216-011-5459-4.

[00187] A técnica demonstrou ter não apenas alta versatilidade, mas também alta estabilidade térmica comparada a outras. Neste estudo, este método foi utilizado para imobilizar diferentes policaudas marcadas e sondas marcadas de ácido nucleico em um suporte sólido PS. Os marcadores usados nos exemplos abaixo foram corantes de fluorescência. “Quasar 570” e “Cy3” foram usados como corantes de fluorescência.

[00188] Um número de diferentes policaudas marcadas e sondas de ácido nucleico foram usados nas experiências, incluindo o que segue listado na tabela 1. TABELA 1: DIFERENTES POLICAUDAS ROTULADAS COM

CORANTE DE FLUORESCÊNCIA PARA EXPERIMENTOS DE LAVAGEM E TERMOCICLAGEM. 4 Policandae porção de so captura opcional 20TYC qTTTTTTTTTT , 1 (SEQTD NO:1) TTTTTTTTTTCCCCCCCCCC/3'cy3 30TSCS , 2 (SEQID NO:2) TTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCCCCe3'ey3 40T2C? TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT , 3 (SEQID NO:3) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCCeeeeeeees'ea 4 60TɺC TTTTTTTTTTTITTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCCeceeee (SEQID NO:4) CCCCCCCeeeecer3'ey3 40TC” , (SEQIDNO:5) TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCIC3'cy3 20Tº , 6 (SEQTD NO:6) TTTITTTITTTITITTIIITT13'cy3 7 20TºCYhilA — TTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCGGTTTAATCGTCCGGTCGTAGTGGT (SEQ ID NO:7) GTCTCCGCCAGCGCCGCAACCTACGACTCATACA/3'cy3 8 20TYC!Y MC — TTTTTTITTTCCCCCCCCCCACTTACGCTGCAAGTAAAGCCGAAG (SEQID NO:8) GTCACAACTTTAAAGCACAGCCTGATCTGGCGGAA/3'cy3 20C” ev 9 (SEQTD NO:9) CCCCCCEcocecececeeecs'cy3 208? ; (SEQIDNO:10) AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'-Cy3 20G?” ; u (SEGID NO) GGCECECCGCGGEGGGGGGG-3"-Cy3 40CT” 12 (SEQIDNO:12, CTCETCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCICTCTCTCTCTCT-quasar 570

13 40TTCC CCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCC -quasar 570 7 (SEQ ID NO:13) quasar- 14 42TTTCCC' — TTTCCCTTTCCCTTTCCCTTTCCCTTTCCCTTTCCCTTTCCC-quasar (SEQ ID NO: 14) 570 40TTTTCCCCC (SEQIDNO:15) — TTTTCCCCTTTTCCCCTTTTCCCCTTTTCCCCTTTTCCCC-quasar 570 16 42TTCY TTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTICTTC-quasar (SEQ1ID NO:16) 570 n7 40TTTCO TTTCITTCTTICITICITICTTTCITTCITTCTITCITTC-quasar 570 (SEQ ID NO:17) quasar 18 AOTTTTÇÃO TTTTCTTTTICTITTCTTITICTITTICITTICITTTCITTTC-quasar 570 (SEQ ID NO: 180) Tquasar 39TCC? 19 (SEQID NO:19) — TCCTCCTCCTCCTCCTCCTCETCCTCCTCCTCCTCCTCC-quasar 570 40TCCC" TCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCC-quasar (SEQ ID NO:20) s70 39TCT! 21 (SEQIDNO.21) — TCITCITCITCITCITCITCITCITCITCITCITCITCT-quasar 570 22 42TTCCTT? TTCCTTTTCCTTTTICCTTITCCTTTTCCTTTTCCTTTTCCTT-quasar (SEQ ID NO:22) 570 23 40TA? TATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA-quasar (SEQ ID NO:23) 570 24 40TG” TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-quasar (SEQ ID NO:24) s70 40AG? AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG- (SEQ ID NO:25) quasar 570 26 40GC” GCGCGCGCGCGCECECECECGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC- (SEQ ID NO:26) quasar 570 27 40AC” ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC- (SEQ ID NO0:27) quasar 570 28 39TCG" TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG-quasar 570 (SEQ ID NO:28) 29 40TTCG" TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCG-quasar (SEQ ID NO:29) s70 40TAGC! TAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGC-quasar : (SEQ ID NO:30) s570

[00189] As sondas de ácido nucleico que compreendem policaudas de números 5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 e 29 são exemplos das invenções. As sondas de ácido nucleico remanescentes, que compreendem policaudas, são exemplos comparativos. EXEMPLO |

[00190] Neste exemplo, as sondas de ácido nucleicos compreendem policaudas de números 6, 9, 10, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 (na ordem mostrada na Figura 1).

[00191] As policaudas/sondas de ácido nucleico foram diluídas em tampão (Promega, WI, EUA) com 5 x citrato de sódio salino (SSC) com 0,04% Triton X-100 (Sigma-Aldrichh EUA). As soluções de policaudas/sondas de ácido nucleico foram marcadas em lâminas PS limpas,

sem contato, com uso de uma máquina sciFLEXARRAYER S11 (Scienion, Alemanha). Cada solução de policauda/sonda de ácido nucleico foi marcada em quatro locais consecutivos. Após a secagem, as lâminas foram expostas à irradiação UV a 254 nm, com energia de 1,8 Joule/em? em um Ultraviolet Crosslinkers (UVP, Fisher Scientific, Dinamarca) para imobilizar as policaudas/sondas de ácido nucleico na superfície do substrato.

[00192] Depois disso, o suporte sólido (lâmina PS) foi lavado por 5 minutos, com água milliQ, obtida da Millipore Corporation. A água MilliQ era água “ultrapura' do “Tipo 1”, conforme definido por várias autoridades (por exemplo ISO 3696), Após a exposição UV, a eficiência de imobilização (porcentagem de imobilização) foi medida e determinada da forma como se segue

[00193] A eficiência da imobilização foi calculada como a equação abaixo: TEBAS = Eficiência da imobilização de lavagem.

[00194] Os resultados são mostrados na Figura 2. Pode ser visto que a policauda 40TC” (a policauda de número 5, conforme listado acima) tem uma eficiência de imobilização muito maior do que as policaudas comparativas. EXEMPLO 2

[00195] Este exemplo foi conduzido seguindo o diagrama de processo mostrado na Figura 3.

[00196] Diferentes — comprimentos e configurações de TC policaudas/sondas de ácido nucleico com diferentes policaudas foram usadas. As policaudas marcadas/sonda de ácido nucleico usadas foram como se segue (mencionada na ordem da esquerda para a direita, conforme mostrado na Figura 4) Números 12, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 22, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26,

27,28,29,30.

[00197] As policaudas/sondas de ácido nucleico foram imobilizadas com uso do mesmo procedimento descrito no exemplo 1. Depois disso, o suporte sólido foi lavado.

[00198] Os sinais de diferentes policaudas/sondas foram obtidos por microscópio após marcação e reticulação UV. Em seguida, as lâminas foram lavadas com tampão de citrato de sódio salino (SSC) 0,1 x por 5 minutos e mais 5 minutos em água MilliQ para remover a sonda não acoplada e o sinal de fluorescência.

[00199] O suporte sólido foi convertido em imagem e a eficiência da imobilização foi calculada como a equação abaixo: SUE SSENDISpADESARTD TE oia Get õc tina óIs E Zotéz - EI. = Eficiência da imobilização de lavagem.

[00200] A eficiência da imobilização após lavagem de cada uma das policaudas/sonda de ácido nucleico é mostrada nas primeiras colunas da Figura 4. EXEMPLO 3

[00201] As imobilizadas e lavadas policaudas/sondas de ácido nucleico foram, posteriormente, submetidas a condições de tratamento correspondentes a condições de tratamento com termociclador SP-PCR severas.

[00202] As policaudas/sondas imobilizadas foram submetidas a diferentes temperaturas pelo programa de PCR a 94ºC por 2 minutos seguido por 30 ciclos de 94ºC por 10 segundos, 60ºC por 20 segundos, 72ºC por 20 segundos, então outros 15 Ciclos de PCR de 94ºC por 10 segundos, 65ºC por segundos, 72ºC por 20 segundos. A policauda foi testada em um termociclador PCR de leito plano (Proflex, Thermo fisher) e o sinal de fluorescência foi obtido.

[00203] A eficiência imobilizada após o tratamento com termociclador de PCR foi calculada forma que se segue:

Fla pica A na See Sc tina óIS FZ EI. = Eficiência da imobilização de termociclador (2).

[00204] A eficiência da imobilização após o tratamento com termociclador de PCR para cada policaudas/sonda de ácido nucleico é mostrada como as segundas colunas na Figura 4.

[00205] Pode ser visto que a eficiência da imobilização após a lavagem e, em particular, após o tratamento com termociclador de PCR é muito maior para as sondas de ácido nucleico da presente invenção. Em particular, as sondas de ácido nucleico preferidas acima mencionadas mostram uma alta extraordinária de eficiência de imobilização.

[00206] As imagens adquiridas do suporte sólido das lâminas PS nos exemplos 2 e 3 são mostradas na Figura 5. Claramente, as sondas de ácido nucleico com policaudas com mais tipo de base T têm uma excepcionalmente alta eficiência da imobilização. EXEMPLO 4

[00207] Foram sintetizadas 3 diferentes sondas de ácido nucleico que compreendem a) uma primeira sonda de ácido nucleico, de acordo com uma modalidade da invenção, tem uma policauda com sequência de nucleotídeo 40TTTTC* (SEQ ID NO:18) e uma porção de captura marcada com um gene hilA, b) uma segunda sonda de ácido nucleico, de acordo com uma modalidade da invenção, tem uma policauda com sequência de nucleotídeo 42TTCCTT” (SEQ ID NO:22) e uma porção de captura marcada com o gene hilA e c) uma sonda de ácido nucleico comparativa com uma policauda de sequência de nucleotídeo 20T"ºC'!º (SEQ ID NO:1) e uma porção de captura com gene hilA por detecção de Salmonella spp. As sondas de ácido nucleico são mostradas na Figura 6.

[00208] As sondas de ácido nucleico foram marcadas a um suporte sólido (Substrato PS) em diferentes concentrações na faixa de 1 um a 60 um.

[00209] Foram preparados 25 ul de mistura de reação SP-PCR. À mistura SP-PCR consiste em 1 x Phusion& Human Specimen PCR Buffer (Thermo Fisher Scientific), 400 nM de hilA seguido de 1600 nM hilA primer reverso, e 0,05 U/ul Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific). Um Gene Frame (Thermo Fisher Scientific) foi usado para criar uma câmara de reação 25 ul que circunda o suporte sólido primer teste. A mistura principal de PCR foi carregada por pipeta na Gene Frame e selada com uma lamínula. A lâmina PS foi marcada com as sondas de ácido nucleico. A SP-PCR foi realizada em um termociclador de PCR de leito plano, onde um pedaço de espuma de isolamento de poliestireno com 1 cm de espessura foi usado para separar as lâminas da tampa do termociclador de PCR. As condições de SP-PCR foram: 94ºC 2 minutos seguido por 30 ciclos de 94º"C por 10 segundos, 60ºC por 20 segundos, 72ºC por 20 segundos, então outros 15 Ciclos de PCR de 94ºC por 10 segundos, 65ºC por segundos, 72'C por 20 segundos. Uma alta temperatura de emparelhamento foi usada nos 15 ciclos de PCR posteriores para melhorar o SP-PCR. Após o SP-PCR, a câmara foi lavada com 0,1 x SSC e 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS) (Promega, WI, EUA) por 5 minutos depois enxaguada com água deionizada e seca à temperatura ambiente. A lâmina estava pronta para digitalização.

[00210] Após o SP-PCR, as lâminas foram digitalizadas com uso de um microscópio (ZEISS Axiovert 200, Alemanha). A imagem do microarranjo foi analisada com uso do software ImageJ (Molecular devices). Um círculo foi desenhado e ajustado ao tamanho do ponto e o valor médio da intensidade da luz foi determinado como sinal. Outro círculo foi desenhado próximo foi usado como plano de fundo. O sinal neste estudo foi definido como o sinal dos 4 pontos na matriz, subtraindo o fundo médio.

[00211] A Figura 7 mostra o resultado de eficiência da imobilização nas diferentes concentrações de sonda de ácido nucleico após a PS-PCR. Pode ser visto facilmente que as sondas de ácido nucleico da invenção têm uma eficiência de imobilização muito maior do que a sonda de ácido nucleico comparativa.

[00212] A Figura 8 é uma imagem de uma sonda de controle e duas porções de captura diferentes - um gene Flic que alveja salmonelas e um gene Brtz que alveja as bactérias Bordetella. Como sonda de controle, foi utilizada a policauda42TTCCTT (SEQ ID NO:22).

[00213] Como mostrado na Figura 7, a policauda 42TTCCTT (SEQ ID NO:22) que alveja Salmonella spp. mostrou aproximadamente a mesma forma circular após SP PCR do que antes, o que significa que a policauda 42TTCCTT (SEQ ID NO:22) ajuda toda a sonda a ser imobilizada na superfície com uma eficiência de ligação muito alta.

[00214] O primeiro esquema de processo para executar SP-PCR mostrado na Figura 9a é um esquema de processo padrão.

[00215] O segundo esquema de processo para a realização de SP-PCR mostrado na Figura 9b é um novo processo de SP-PCR, que foi disponibilizado devido à presente invenção. Graças à alta eficiência de imobilização fornecida pelas sondas de ácido nucleico e ao método da invenção, o SP-PCR pode agora ser realizado sem lavagem após a reticulação UV (imobilização) e/ou sem lavagem após o procedimento de PS-PCR.

[00216] A Figura 10a apresenta imagens de um suporte sólido com sondas de ácido nucleico marcadas sujeitas a SP-PCR com e sem lavagem. EXEMPLO 5

[00217] No exemplo 5, as duas sondas de ácido nucleico do exemplo 5, que representam modalidades da invenção, a saber, a sonda de ácido nucleico a) uma primeira sonda de ácido nucleico de acordo com uma modalidade da invenção tem uma policauda com sequência de nucleotídeo 40TTTTC* (SEQ ID NO:18) e uma porção de captura alvo com um gene hilA e b) uma segunda sonda de ácido nucleico de acordo com uma modalidade da invenção tem uma policauda com sequência de nucleotídeo 42TTCCTT (SEQ ID NO:22) e uma porção de captura marcada com o gene hilA, foram usadas.

[00218] A marcação e o procedimento SP-PCR foram realizados seguindo o procedimento do exemplo 4, com uso de uma concentração da sonda de ácido nucleico de 60 um.

[00219] O resultado é mostrado na Figura 10a antes da lavagem e após a lavagem. A Figura 10b mostra a média do sinal menos fundo com lavagem e sem lavagem, e pode ser visto que há uma quantidade relativamente baixa de um falso positivo nas amostras não lavadas.

EXEMPLO 6

[00220] Um número diferente de policaudas/sondas de ácido nucleico marcas foram submetidas a tempo de exposição UV diferente e diferentes doses de UV por imobilização. A policauda/sondas de ácido nucleico usadas foram as mostradas na Figura 1.

[00221] A policauda/sondas de ácido nucleico foram marcadas ao suporte sólido como descrito no exemplo 1, mas com exposições UV diferentes.

[00222] Quatro pontos de cada policauda/sonda de ácido nucleico foram submetidos a uma exposição UV de um emissor 8 W UV por 3 minutos. Quatro pontos de cada policauda/sonda de ácido nucleico foram submetidos a uma exposição UV a partir de um emissor 16 W UV por 8 minutos.

[00223] O resultado é mostrado na Figura 11, onde o gráfico na esquerda por cada policauda/sonda de ácido nucleico é o emissor 8 W UV por 3 minutos de tratamento e o gráfico à direita por cada policauda /sonda de ácido nucleico é o emissor 16 W UV por 8 minutos de tratamento. Parece que o emissor de 8 W UV por 3 minutos de tratamento é melhor que o emissor de 16 W UV por 8 minutos de tratamento.

EXEMPLO 7

[00224] Uma policauda marcada com a sequência 40 T/C (também chamada 40TC”º (SEQ ID NO:5)) foi usada nesse teste. Amostras da policauda foram marcadas ao suporte sólido a como descrito no exemplo 1, mas com exposição à UV diferente.

[00225] Para algumas amostras, foi utilizado o emissor UV de 8 W e, para outras, foi utilizado o emissor UV de 16 W. O tempo de exposição foi variado, como mostrado na Figura 12, onde a eficiência da imobilização após a lavagem é plotada em função do tempo de exposição de cada um dos dois emissores.

[00226] Pode ser visto que o watt mais baixo (emissor de UV de 8 watts) é melhor que o emissor de watt mais alto. Além disso, o emissor de 8 W possui uma imobilização ideal em torno de 3 minutos, o que significa que a sonda de ácido nucleico pode ser imobilizada com uma dose de UV bastante baixa, o que é altamente vantajoso, uma vez que o risco de danificar a porção de captura pode ser reduzido ou mesmo evitado.

[00227] Em uma modalidade da invenção, o ácido nucleico tem uma policauda com sequência de nucleotídeo 40TTTTC* (SEQ ID NO:18), e uma porção de captura alvo com uma gene hilA é usada.

[00228] São sintetizadas 3 sondas de ácido nucleico diferentes e c) uma sonda de ácido nucleico comparativa com uma policauda de sequência de nucleotídeo 20T"ºC!º (SEQ ID NO: 1) e uma porção de captura com gene hilA por detecção de Salmonella spp. As sondas de ácido nucleico são mostradas na Figura 6.

[00229] Nas Figuras 13a-13e, são mostradas as imagens das policaudas imobilizadas obtidas nos diferentes tempos de exposição à UV, antes e após a lavagem, com uso do emissor de UV de 8W.

[00230] Nas Figuras 14a-14c, são mostradas as imagens das policaudas imobilizadas obtidas nos diferentes tempos de exposição à UV antes e após a lavagem usando o emissor de UV de 16 W. EXEMPLO 8

[00231] Sondas de ácido nucleico com diferentes comprimentos de policaudas foram testadas. As sondas de ácido nucleico compreendem o gene Brtz, que tem, por alvo, a bactéria Bordetella.

[00232] As sondas de ácido nucleico foram marcadas, imobilizadas e lavadas de acordo com o processo descrito no exemplo 1. A Figura l15a mostra o sinal menos o fundo das várias sondas de ácido nucleico. Pode-se observar que as sondas de ácido nucleico com policaudas muito curtas são difíceis de imobilizar e que as sondas de ácido nucleico das modalidades da invenção com policaudas de 18 nucleotídeos ou mais mostram uma imobilização eficaz. A Figura 15b contém imagens das sondas de ácido nucleico imobilizadas.

EXEMPLO 10

[00233] Amostras de uma sonda de ácido nucleico de uma modalidade da invenção que tem a policauda 42TTCCTT' (SEQ ID NO:22) e a porção de captura que tem, por alvo, a bactéria Bordetella bronchiseptica foram testadas.

[00234] As amostras da sonda de ácido nucleico foram marcadas, imobilizadas e lavadas de acordo com o processo descrito no exemplo 1, mas usando um tempo de exposição à UV diferente. Após a imobilização, as amostras foram submetidas ao tratamento com PS-PCR, conforme descrito no exemplo 2.

[00235] Após o tratamento com PS-PCR, o sinal menos o sinal de fundo para cada amostra foi determinado. A Figura 16a mostra os resultados e pode-se ver que um efeito de imobilização das sondas de ácido nucleico se as modalidades da invenção puderem ser obtidas com uso de dosagem muito baixa de UV.

[00236] A Figura 16b apresenta imagens da sonda de ácido nucleico imobilizadas.

[00237] A estrutura SAF 1 corresponde às estruturas SAF descritas no documento WO17133741 e detalhes adicionais podem ser encontrados neste documento. A estrutura SAF é montada no fundo 2 de uma seção de reação de um canal de um cartucho microfluídico. As sondas de ácido nucleico 3 marcadas com fluoróforos e de uma modalidade da invenção são montadas em uma superfície superior da estrutura SAF 1.

[00238] A estrutura SAF 1 tem um formato cônico, fuste, com a superfície superior. A estrutura SAF 1 tem uma altura saliente, um diâmetro de superfície superior e um diâmetro de fundo. Os fluoróforos excitados emitem luz anisotropicamente na estrutura SAF - que possui um índice de refração mais alto que a amostra, o ar ou o líquido na seção de reação - com um ângulo acima de um ângulo supercrítico (Oc). A luz emitida é colimada e pode ser lida por um leitor como um círculo de luz.

[00239] A Figura 18 é uma vista em perspectiva de uma seção de um canal de reação com a bordas 12 de um cartucho, onde a seção de reação compreende Estruturas SAP 11 com sonda de ácido nucleico imobilizadas, que foram submetidas à SP-PCR.

[00240] A Figura 19 mostra uma estrutura SAF ilustrada com uma parte superior pontilhada para mostrar o ângulo de tronco a. A estrutura SAF 21 tem uma periferia inferior 24 onde é montada ou integrada com a parte restante do suporte sólido. Na sua periferia inferior, a estrutura SAF tem um diâmetro inferior dv. A estrutura SAF tem uma superfície superior 23 com um diâmetro D. Da parte inferior à superfície superior, a estrutura SAF tem a altura h. A parte superior ilustrada é uma parte superior imaginária, mostrada para ilustrar o ângulo de tronco.

[00241] As Figuras 19a-19d ilustram uma estrutura SAF padrão 31, que compreende a superfície superior 33. A estrutura SAF é integrada com uma parte restante do suporte sólido 32. Apenas uma parte restante do suporte sólido é mostrada. Como explicado acima, o suporte sólido pode formar um cartucho com um canal ou pode ser parte do mesmo.

[00242] A Figura 19a é uma vista em perspectiva da estrutura SAF 31.

[00243] A Figura 19b é uma vista superior da estrutura SAF 31.

[00244] A Figura 19c é uma vista lateral da estrutura SAF 31.

[00245] A Figura 19d é uma vista em corte transversal da estrutura SAF 31 vista da seção A-A da Figura 19c.

[00246] A estrutura SAF tem uma altura h e um diâmetro superior D. D e h podem ser individualmente um do outro, como descrito em outras partes do presente documento. A estrutura SAF 31 é ilustrada com um ângulo de tronco de 60 graus. Deve ser entendido que a estrutura SAF pode ter outro ângulo de tronco, como descrito em outras partes no presente documento.

[00247] Pode ser visto que a superfície superior é plana.

[00248] Em uma modalidade, a estrutura SAF 31 tem as seguintes dimensões: D=0,2 mm; h =0,25 mm e a SAF ângulo de tronco a é 60 graus.

[00249] As Figuras 20a-20d ilustram uma estrutura SAF 41 preferida, que compreende superfície superior 43 com um recesso 44. A estrutura SAF é integrada com uma parte restante do suporte sólido 42.

[00250] A Figura 20a é uma vista em perspectiva da estrutura SAF 41.

[00251] A Figura 20b é uma vista superior da estrutura SAF 41.

[00252] A Figura 20c é uma vista lateral da estrutura SAF 41.

[00253] A Figura 20d é uma vista em corte transversal da estrutura SAF 41 vista da seção A-A da Figura 20c.

[00254] A Figura 20e mostra uma parte da Figura 20a, onde a largura da borda do recesso W é marcada. A largura da borda do recesso W é, vantajosamente, pelo menos cerca de 0,008, tal como pelo menos cerca de 0,01, tal como pelo menos cerca de 0,015.

[00255] A estrutura SAF tem uma altura h e um diâmetro superior D. D e h podem, individualmente um do outro, ser como divulgado em outras partes no presente documento. A altura h da estrutura SAF é determinada a partir da superfície superior 43 sem o recesso 44.

[00256] O recesso tem uma altura hl, que pode ser as descrito em outras partes no presente documento.

[00257] O recesso é substancialmente circular e está localizado de tal modo que seu eixo geométrico central coincide com o eixo geométrico central de SAF. O recesso tem uma altura hl, que pode ser as descrita em outras partes no presente documento.

[00258] Como pode ser visto, o piso do recesso é substancialmente plano. O diâmetro d do recesso determinado no piso do recesso e pode ser como descrito em outras partes no presente documento.

[00259] O recesso tem um formato tronco-cônico, com uma superfície superior formada pelo piso.

[00260] Na modalidade mostrada, o ângulo de tronco 6 e o ângulo de tronco a são, ambos 60 graus. Deve ser entendido que o ângulo de tronco 8 do recesso e o ângulo de tronco a de SAF podem ter outro(s) valor(es) como descrito em outras partes no presente documento.

[00261] O recesso aumenta a robustez da detecção e aumenta a intensidade do sinal de leitura.

[00262] Em uma modalidade, a estrutura SAF 41 tem as seguintes dimensões: D=0,2 mm, h =0,25 mm, d =0,05 mm, h1 = 0,01 mm, ângulo de tronco a SAF é de 60 graus e o ângulo de tronco 6 do recesso é 60 graus.

[00263] Em outra modalidade, a estrutura SAF 41 tem as seguintes dimensões: D=0,2 mm, h =0,3 mm, d =0,05 mm, h1 = 0,01 mm, o ângulo de tronco a SAF é 60 graus e o ângulo de tronco 0 do recesso é 60 graus.

[00264] As Figuras 21la-21d ilustram outra estrutura SAF 51 preferencial, que compreende superfície superior 53 com um recesso 54. À estrutura SAF é integrada com uma parte restante do suporte sólido 52.

[00265] A Figura 21a é uma vista em perspectiva da estrutura SAF 51.

[00266] A Figura 21b é uma vista superior da estrutura SAF 51.

[00267] A Figura 21c é uma vista lateral da estrutura SAF 51.

[00268] A Figura 21d é uma vista em corte transversal da estrutura SAF 51 vista da seção A-A da Figura 21c.

[00269] A estrutura SAF tem uma altura h e um diâmetro superior D. D e h podem, individualmente um do outro, ser como descrito em outras partes no presente documento. A altura h da estrutura SAF é determinada a partir da superfície superior 53 sem o recesso 54.

[00270] O recesso 54 tem uma altura h1, que pode ser como descrito em outras partes no presente documento.

[00271] O recesso é substancialmente circular e está localizado que tal modo que seu eixo geométrico central coincide com o eixo geométrico central de SAF. O recesso tem uma altura h1l, que pode ser as descrito em outras partes no presente documento.

[00272] Como pode ser visto, o piso do recesso é substancialmente plano. O diâmetro d do recesso é determinado no piso do recesso e pode ser como descrito em outras partes no presente documento.

[00273] O recesso tem borda de recesso arredondada e um raio de arredondamento R, que pode ser como descrito em outras partes no presente documento.

[00274] Em uma modalidade, a estrutura SAF 51 tem as seguintes dimensões: D=0,2 mm; h =0,25 mm, d =0.08 mm, h1 = 0,01 mm, a borda de recesso é arredondada com um raio R=0,05 mm e o ângulo de tronco a SAF é 60 graus.

[00275] Em outra modalidade, a estrutura SAF 51 tem as seguintes dimensões:

44 / 45 D=0,2 mm; h =0,3 mm, d =0.08 mm, h1 = 0,01 mm, a borda de recesso é arredondada com um raio R=0,05 mm e o ângulo de tronco a SAF é 60 graus. EXEMPLO 11

[00276] Sete cartuchos foram produzidos a partir de poliestireno. Cada cartucho tinha um canal microfluídico com uma seção de reação e oito estruturas SAF idênticas saindo da parede na seção de reação.

[00277] As estruturas SAF do primeiro cartucho foram moldadas como a estrutura SAF no. 1 na Figura 22; as estruturas do segundo cartucho foram modeladas como a estrutura SAF no.2 na Figura 22 e assim por diante.

[00278] A estrutura SAF no. 3 no. 3 era do tipo mostrado nas Figuras 19a-19d.

[00279] A estrutura SAF no. 5 era do tipo mostrado nas Figuras 21a- 21d e a estrutura SAF no. 6 era do tipo mostrado nas Figuras 20a-20e.

[00280] Uma quantidade igual de oligo Cy3-rotulado foi marcado na superfície superior de cada uma das estruturas SAF respectivas e deixada secar.

[00281] Na primeira rodada de teste, as câmaras de reação foram mantidas cheias de ar. Os Cy3-rotulados foram submetidos à luz no comprimento de onda de excitação (-550 nm) e as intensidades de sinal de emissão dos sinais da estrutura SAF foram detectadas.

[00282] Para cada cartucho, foi determinado o sinal médio de intensidade da interface ar/PS da estrutura SAF.

[00283] Na segunda rodada de teste, as câmaras de reação dos respectivos cartuchos foram preenchidas com água. Os Cy3-rotulados foram submetidos à luz no comprimento de onda de excitação (-550 nm) e as intensidades de sinal de emissão dos sinais da estrutura SAF foram detectadas.

[00284] Para cada cartucho, foi determinado o sinal médio de intensidade da interface água/PS da estrutura SAF.

[00285] Os resultados são mostrados na Figura 23.

[00286] O coeficiente de variação (CoV) foi determinado para as estruturas SAF dos respectivos cartuchos.

[00287] Pode-se ver que as estruturas SAF nos. 1 e 2 apresentaram intensidades de luz relativamente altas para os sinais da interface ar/PS. Tanto para as intensidades de sinal da interface ar/PS quanto para os sinais da interface água/PS, o CoV era relativamente alto.

[00288] As estruturas SAF no. 6 apresentaram a maior intensidade de luz para os sinais da interface água/PS e o CoV. Tanto para as intensidades de sinal da interface ar/PS quanto para os sinais da interface água/PS, o CoV era relativamente alto.

[00289] O CoV para a amostra 6 foi, no entanto, relativamente alto. Acredita-se que a razão para este CoV relativamente alto é que algumas das estruturas SAF em sua periferia inferior, onde estão integradas ao restante suporte sólido, apresentavam pequenas ondulações de superfície e/ou saliências, o que pode resultar em perda de sinal. Portanto, espera-se que, diminuindo diâmetro superior à proporção de aspecto de altura D/h, essa possível perda de sinal de luz possa ser mitigada. Acredita-se que, aumentando a altura, por exemplo, para cerca de 0,3 mm, o sinal pode aumentar e o CoV pode diminuir.

[00290] As estruturas SAF no. 5 apresentavam uma intensidade de luz mais alta e um CoV baixo para os sinais da interface água/PS.

[00291] Acredita-se que as bordas redondas do recesso garantam uma marcação muito eficaz e robusta, o que aumenta o baixo CoV.

[00292] As estruturas SAF no. 6 apresentaram a maior intensidade de luz para os sinais da interface água/PS e o CoV. Tanto para as intensidades de sinal da interface ar/PS quanto para os sinais da interface água/PS, o CoV era, contudo, relativamente alto.

Claims (100)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para imobilizar uma sonda de ácido nucleico a um suporte sólido, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a sonda de ácido nucleico para compreender uma porção de cadeia de ancoragem terminal, e uma porção de captura aplicar a sonda de ácido nucleico a uma superfície do suporte sólido, e ancorar a porção da cadeia de ancoragem da sonda de ácido nucleico ao suporte sólido ao submetê-la à luz UV, em que a porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico compreende uma sequência de N nucleotídeos composta por trechos de nucleotídeos de tipo de base X, com nucleotídeo(s) intermediário(s) de tipo de base Citosina (C) e, opcionalmente, um nucleotídeo de tipo de base Guanina (G), ou uma sequência com pelo menos 90% de similaridade ao mesmo, em que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X, independentemente um do outro, compreendem de 1 a 5 nucleotídeos, em que N é pelo menos 18 e em que cada tipo de base X, independentemente uma da outra, designa tipo de base Timina (T) ou tipo de base Uracila (U).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico compreende a sequência auxiliar de N nucleotídeos, composta por trechos de nucleotídeos de tipo de base X com nucleotídeo(s) intermediário(s) de tipo de base Citosina (C).

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de N nucleotídeos compreende menos que 5% de nucleotídeos com bases nitrogenadas púricas, tais como | ou zero nucleotídeos com bases nitrogenadas púricas.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sequência de N nucleotídeos compreende —* exclusivamente — nucleotídeos “com bases nitrogenadas pirimídicas.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico compreende uma sequência de pelo menos N nucleotídeos, composta por trechos de 2 a 5 nucleotídeos de tipo de base X, com nucleotídeo(s) intermediário(s) de tipo de base C.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que N é pelo menos 20, tal como pelo menos 26, tal como pelo menos 30, tal como pelo menos 34, tal como pelo menos 38, tal como pelo menos 40.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X, independentemente uns dos outros, são separados por 1 a 4 nucleotídeo(s) de tipo de base C.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X são de mesmo comprimento, preferivelmente, um comprimento de 2 nucleotídeos de tipo de base X, um comprimento de 3 nucleotídeos de tipo de base X, ou um comprimento de 4 nucleotídeos de tipo de base X.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sequência de N nucleotídeos compreende repetir as subsequências de nucleotídeos de tipos de base de acordo com a fórmula CODY-(C)z-)m, em que Y é um número inteiro de | a 5, Z é um número inteiro de 1a 5, Y>Z e M é um número inteiro de 4 a 20.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que Y é um número inteiro de 2 a 5, Z é um número inteiro de 1 a

4, Y>Z e M é um número inteiro de 4 a 20.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que Z=1.

12. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que Z=2.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que Y=2 e M>10, tal como M>12, tal como M> 14 ou Y=3 e M>6, tal como M> 8, tal como M> 10 ou Y=4 e M> 4, tal como M> 6, tal como M> 8

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores | a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência de N nucleotídeos compreende repetir as subsequências de nucleotídeos de tipos de base de acordo com a fórmula COD v2-(C)7-)Dv2 Ju, em que Y, é um número inteiro de 1 a 4, Z é um número inteiro de 1 a 4, e M é um número inteiro de 4 a 20.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que Y, é um número inteiro de 2 a 3, Z é um número inteiro de 1 a3.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que Y;>Z, preferivelmente, Y;>Z.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que Y,=2 e M>10, tal como M>12, tal como M> 14 ou Y,=3 e M>4, tal como M>6, tal como M> 8.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o número de Y ou Y, é maior que o número de Z, preferivelmente, o número de Y ou Y; é, pelo menos, duas vezes o número de Z.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X são trechos de nucleotídeos de tipo de base T.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores | a 18, caracterizado pelo fato de que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X são trechos de nucleotídeos de tipo de base U.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 18, caracterizado pelo fato de que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X compreendem ambos: nucleotídeos de tipo de base T e nucleotídeos de tipo de base U, bem como alternâncias de nucleotídeos de tipo de base T e nucleotídeos de tipo de base U.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sequência de N nucleotídeos da ancoragem terminal está localizada na extremidade 5º ou na extremidade 3º ou em que a sonda de ácido nucleico apresenta uma ancoragem terminal em ambas as extremidades: 5*' e 3º, em que a sequência de N nucleotídeos na extremidade 5º e na extremidade 3', respectivamente, pode ser igual ou diferente uma da outra.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sonda de ácido nucleico compreende DNA, RNA, PNA, CNA, HNA, LNA ou ANA; um oligonucleotídeo do mesmo, uma fração do mesmo; ou quaisquer combinações do mesmo.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sonda de ácido nucleico é obtida a partir de uma fonte natural ou é total ou parcialmente sintetizada, preferivelmente, a sonda de ácido nucleico ou pelo menos a porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico é pelo menos parcialmente sintetizada, preferivelmente, totalmente sintetizada.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sonda de ácido nucleico é de fita simples.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a sonda de ácido nucleico é de dupla fita em pelo menos uma parte de seu comprimento, tal como em uma parte da sua porção de captura.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de captura compreende um primer, tal como um primer adaptado para uma extensão de primer.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de captura compreende uma porção de cadeia de hibridização que compreende uma sequência de nucleotídeos, tal como uma sequência de nucleotídeos adaptados para hibridização de uma região complementar de uma sonda de ácido nucleico alvo e/ou adaptada para realizar uma análise da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de captura compreende uma cadeia de nucleotídeos que tem de cerca de 4 a cerca de 100 nucleotídeos, bem como de cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos, bem como de cerca de 20 a cerca de 30 nucleotídeos.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de captura está diretamente associada à porção de cadeia de ancoragem terminal.

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 29, caracterizado pelo fato de que a porção de captura está associada à porção de cadeia de ancoragem terminal por meio de um espaçador, tal como um espaçador abásico, bem como um número respectivo de espaçadores.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de cadeia de ancoragem terminal está localizada na extremidade 5' ou na extremidade 3º da sonda de ácido nucleico e a porção de captura H está localizada na outra dentre a extremidade 5' e a extremidade 3º.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sonda de ácido nucleico compreende uma porção de cadeia de ancoragem terminal em ambas as extremidades: 5º e 3, e a porção de captura está localizada entre as porções de cadeia de ancoragem terminal opcionalmente com espaçador(es) intermediário(s).

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sonda de ácido nucleico compreende um marcador, tal como um marcador radioativo ou um marcador fluorescente, tal como um corante de cianina, por exemplo, Cy3 (1,1'-bis(3- hidroxipropil)-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina) ou Cy5(1,1'-bis(3- hidroxipropil)-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina).

35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sonda de ácido nucleico é depositada na superfície do suporte sólido por marcação, preferivelmente, a marcação compreende marcar a sonda de ácido nucleico em um solvente na superfície do suporte sólido.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a sonda de ácido nucleico é marcada no solvente em uma concentração superior a 100 um, bem como em uma concentração de cerca de 1 um a cerca de 80 um, bem como de cerca de 3 um a cerca de 70 um, bem como de cerca de 5 um a cerca de 60 um.

37. Método de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que a sonda de ácido nucleico localizada é seca antes de ser exposta à luz UV.

38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é um suporte de polímero ou um suporte de vidro, preferivelmente, o suporte compreende poliestireno (PS), copolímero de olefina cíclica (COC), policarbonato (PC), Poli(metacrilato de metila) (PMMA) ou uma mistura que compreende um ou mais dentre os polímeros mencionados anteriormente.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido compreende ou é feito de poliestireno (PS), preferivelmente, pelo menos a superfície do suporte sólido é uma superfície de PS, preferivelmente, o substrato em não espumado.

40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é um suporte sólido moldado por injeção, opcionalmente submetido à modificação de superfície pós-moldagem com plasma rico em oxigênio para introduzir grupos polares.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a superfície do suporte sólido é essencialmente livre de um ou mais dentre grupamento amina, grupamento metileno, grupamento tiol, grupamento epóxi, grupamento diazo ou grupamento amida, preferivelmente, a superfície de suporte é essencialmente livre de todos dentre grupamento amina, grupamento metileno, grupamento tiol, grupamento epóxi, grupamento diazo ou grupamento amida.

42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é pelo menos uma parte de um cartucho que compreende um canal com um canal de superfície que define o canal, em que a superfície do substrato sólido forma pelo menos uma parte do canal de superfície.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o canal compreende uma seção de reação, o método compreende imobilizar a sonda de ácido nucleico a uma superfície dentro da seção de reação do canal.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a seção de reação compreende pelo menos um elemento óptico, o elemento óptico, preferivelmente, é construído para redirecionar e, preferivelmente, colimar a luz emitida a partir de um marcador fluorescente (fluoróforo) ou conectado à sonda de ácido nucleico imobilizada.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o elemento óptico compreende uma estrutura de lentes e/ou uma estrutura de fluorescência de ângulo supercrítico (estrutura SAP), a estrutura SAF preferivelmente tem uma superfície superior e o método compreende imobilizar a sonda de ácido nucleico à superfície superior.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o elemento óptico tem um formato tronco-cônico, com um ângulo de tronco a, uma superfície superior, um diâmetro superior D e uma altura h, preferivelmente, o ângulo de tronco a é de cerca de 30º a cerca de 70º, bem como de cerca de 35 a cerca de 65, bem como de cerca de 40º a cerca de 60º, bem como cerca de 40º ou cerca de 60º, bem como cerca de 35º a cerca de 55º para uma interface ar/poliestireno ou cerca de 55º a cerca de 65º para uma interface água/poliestireno.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a altura h é pelo menos cerca de 0,2 mm, bem como de cerca de 0,25 mm a cerca de 0,5 mm, bem como de cerca de 0,3 mm a cerca de 0,35 mm.

48. Método de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracterizado pelo fato de que o diâmetro superior é de cerca de 0,05 mm a cerca de 0,5 mm, bem como de cerca de 0,1 mm a cerca de 0,3 mm.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma estrutura SAF tem um diâmetro superior à proporção de aspecto de altura D/h que é de cerca de 1,1 ou menos, bem como cerca de 1,05 ou menos, bem como cerca de 1 ou menos, preferivelmente, a estrutura SAF um polímero de estrutura SAF, mais preferivelmente, a estrutura SAF é feita de poliestireno (PS).

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 49, caracterizado pelo fato de que a superfície superior pelo menos da estrutura SAF tem um recesso na superfície superior, o recesso na superfície superior é, preferivelmente, circular, mais preferivelmente, o recesso na superfície superior tem um eixo geométrico central paralelo com um eixo geométrico central da estrutura SAF e preferivelmente, no máximo cerca de 0,2 mm, bem como no máximo cerca de 0,1 mm a partir do eixo geométrico central da estrutura SAF, mais preferivelmente, o eixo geométrico central do recesso de superfície coincide com o eixo geométrico central da estrutura SAF.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o recesso tem um piso de recesso substancialmente plano, preferivelmente, o recesso tem um diâmetro d, que cerca de 10% do diâmetro superior D ou mais, bem como de cerca de 15% a cerca de 80%, bem como de cerca de 20% a cerca de 50 do diâmetro superior D, preferivelmente, a borda que circunda o recesso na superfície superior tem uma largura de pelo menos 0,01 mm.

52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o diâmetro d do recesso é de cerca de 0,01 a cerca de 0,2, bem como de cerca de 0,25 a cerca de 0,1.

53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 52, caracterizado pelo fato de que o recesso tem uma altura h1l, que é cerca de 0,05 mm ou menos, bem como cerca de 0,02 ou menos.

54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 53, caracterizado pelo fato de que o recesso tem borda de recesso arredondada, preferivelmente, a borda de recesso é arredondada com um raio de arredondamento R que é cerca de 0,1 mm ou menos, tal como entre 0,01 e 0,8 mm.

55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 53, caracterizado pelo fato de que o recesso tem um formato tronco- cônico, com uma superfície superior formada pela superfície formada pelo referido piso, preferivelmente, o recesso em forma tronco-cônico, tem um ângulo de tronco 8 de recesso que é de cerca de 40º a cerca de 70º, bem como de cerca de 55º a cerca de 65º, bem como cerca de 60º, mais preferivelmente, o recesso ângulo de tronco 8 é substancialmente idêntico ao ângulo de tronco a.

56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção da cadeia de ancoragem do ácido nucleico é ancorada ao suporte sólido ao submetê-la à luz UV, que compreende comprimento de onda na faixa de cerca de 250 nm a 500 nm, preferivelmente, que compreende comprimento de onda de pelo menos um dentre cerca de 254 nm, cerca de 265 nm e/ou cerca de 365 nm.

57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção da cadeia de ancoragem do ácido nucleico é ancorada ao suporte sólido ao submetê-la à luz UV com uso de uma quantidade de energia de cerca de 0,2 Joule/cm? a cerca de 15 Joule/cm?, bem como de cerca de 1 Joule/cm? a cerca de 10 Joule/cm?, bem como de cerca de 1,5 Joule/cm? a cerca de 6 Joule/cm?, bem como de cerca de 1,6 Joule/em? a cerca de 3 Joule/em?, bem como de cerca de 1,7 Joule/em? a cerca de 2 Joule/cm?.

58. Suporte sólido caracterizado pelo fato de que compreende uma sonda de ácido nucleico imobilizada, o substrato sólido é obtido por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.

59. Sonda de ácido nucleico adequada para ser imobilizada a um suporte sólido, a sonda de ácido nucleico que compreende uma porção de cadeia de ancoragem terminal, e uma porção de captura, caracterizada pelo fato de que a porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico compreende uma sequência de N nucleotídeos composta por trechos de nucleotídeos de tipo de base X com nucleotídeo(s) intermediário(s) de tipo de base Citosina (C) ou uma sequência com pelo menos 90% de similaridade ao mesmo, em que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X, independentemente uns dos outros, compreendem de 2 a 5 nucleotídeos, em que N é pelo menos 18 e em que cada tipo de base X, independentemente uma da outra, designa tipo de base Timina (T) ou tipo de base Uracila (U).

60. Sonda de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que a porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico compreende a sequência auxiliar de N nucleotídeos composta por trechos de nucleotídeos de tipo de base X com nucleotídeo(s) intermediário(s) de tipo de base Citosina (C).

61. Sonda de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 59 ou 60, caracterizada pelo fato de que a sequência de N nucleotídeos compreende menos que 5% de nucleotídeos com bases nitrogenadas púricas, tais como 1 ou zero nucleotídeos com bases nitrogenadas púricas.

62. Sonda de ácido nucleico, de qualquer uma das reivindicações 59 a 61, caracterizada pelo fato de que a sequência de N nucleotídeos — compreende — exclusivamente — nucleotídeos “com bases nitrogenadas pirimídicas.

63. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 62, caracterizada pelo fato de que a porção de cadeia de ancoragem terminal da sonda de ácido nucleico compreende uma sequência de pelo menos N nucleotídeos composta por trechos de 2 a 5 nucleotídeos de tipo de base X com nucleotídeo(s) intermediário(s) de tipo de base C.

64. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 63, caracterizada pelo fato de que N é pelo menos 20, tal como pelo menos 26, tal como pelo menos 30, tal como pelo menos 34, tal como pelo menos 38, tal como pelo menos 40.

65. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 64, caracterizada pelo fato de que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X, independentemente uns dos outros, são separados por 1 a 4 nucleotídeo(s) de tipo de base C.

66. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 65, caracterizada pelo fato de que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X são de mesmo comprimento, preferivelmente, um comprimento de 2 nucleotídeos de tipo de base X, um comprimento de 3 nucleotídeos de tipo de base X ou um comprimento de 4 nucleotídeos de tipo de base X.

67. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 66, caracterizada pelo fato de que a sequência de N nucleotídeos compreende repetir as subsequências de nucleotídeos de tipos de base de acordo com a fórmula CODY-(O)z-)m, em que Y é um número inteiro de | a 5, Z é um número inteiro de 1a 5, Y>Z e M é um número inteiro de 4 a 20.

68. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 67, caracterizada pelo fato de que Y é um número inteiro de 2 a 5, Z é um número inteiro de 1 a 4, Y>Z e M é um número inteiro de 4 a

20.

69. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 ou 68, caracterizada pelo fato de que Z=1 ou Z=2.

70. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 69, caracterizada pelo fato de que Y=2 e M>10, tal como M>12, tal como M> 14 ou Y=3 e M>6, tal como M> 8, tal como M> 10 ou Y=4 e M> 4, tal como M> 6, tal como M> 8

71. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 66, caracterizada pelo fato de que a sequência de N nucleotídeos compreende repetir as subsequências de nucleotídeos de tipos de base de acordo com a fórmula COD 2-(C)7-0) 2 -)u, em que Y, é um número inteiro de 1 a 4, Z é um número inteiro de 1 a 4, e M é um número inteiro de 4 a 20.

72. Sonda de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que Y, é um número inteiro de 2 a 3, Zé um número inteiro de 1 a 3.

73. Sonda de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 71 ou 72, caracterizada pelo fato de que Y;>Z, preferivelmente, Y,=2 e M>10, tal como M>12, tal como M> 14 ou Y,=3 e M>4, tal como M>6, tal como M> 8.

74. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 73, caracterizada pelo fato de que o número de X é maior que o número de Z, preferivelmente, o número de X é, pelo menos, duas vezes o número de Z

75. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 74, caracterizada pelo fato de que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X são trechos de nucleotídeos de tipo de base T.

76. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 74, caracterizada pelo fato de que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X são trechos de nucleotídeos de tipo de base U.

77. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 74, caracterizada pelo fato de que os trechos de nucleotídeos de tipo de base X compreendem ambos: nucleotídeos de tipo de base T e nucleotídeos de tipo de base U, bem como alternâncias de nucleotídeos de tipo de base T e nucleotídeos de tipo de base U.

78. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 77, caracterizada pelo fato de que a sequência de N nucleotídeos da ancoragem terminal está localizada na extremidade 5º ou na extremidade 3' ou em que a sonda de ácido nucleico apresenta uma ancoragem terminal em ambas as extremidades: 5º e 3º, em que a sequência de N nucleotídeos nas respectivas extremidade 5º e extremidade 3º pode ser igual ou diferente uma da outra.

79. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 78, caracterizada pelo fato de que a sonda de ácido nucleico compreende DNA, RNA, PNA, CNA, HNA, LNA ou ANA; um oligonucleotídeo do mesmo, uma fração do mesmo; ou quaisquer combinações do mesmo.

80. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 79, caracterizada pelo fato de que a porção de captura compreende um primer, tal como um primer adaptado para uma extensão de primer.

81. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 80, caracterizada pelo fato de que a porção de captura compreende uma porção de cadeia de hibridização, que compreende uma sequência de nucleotídeos, tal como uma sequência de nucleotídeos adaptados para hibridização de uma região complementar de uma sonda de ácido nucleico alvo e/ou adaptada para realizar uma análise da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

82. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 81, caracterizada pelo fato de que a porção de captura compreende uma cadeia de nucleotídeos que tem de cerca de 4 a cerca de 100 nucleotídeos, bem como de cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos, bem como de cerca de 20 a cerca de 30 nucleotídeos.

83. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 82, caracterizada pelo fato de que a porção de captura está diretamente associada à porção de cadeia de ancoragem terminal.

84. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 82, caracterizada pelo fato de que a porção de captura está associada à porção de cadeia de ancoragem terminal por meio de um espaçador, tal como um espaçador abásico, tal como um número respectivo de espaçadores.

85. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 84, caracterizada pelo fato de que a porção de cadeia de ancoragem terminal está localizada na extremidade 5º ou na extremidade 3º da sonda de ácido nucleico e a porção de captura H está localizada na outra dentre a extremidade 5' e a extremidade 3º.

86. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 85, caracterizada pelo fato de que a sonda de ácido nucleico compreende uma porção de cadeia de ancoragem terminal em ambas as extremidades: 5º e 3', e a porção de captura está localizada entre as porções de cadeia de ancoragem terminal opcionalmente com espaçador(es) intermediário(s).

87. Sonda de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 86, caracterizada pelo fato de que a sonda de ácido nucleico compreende um marcador, tal como um marcador radioativo ou um marcador fluorescente, tal como um corante de cianina, por exemplo, Cy3 (1,1"-bis(3-hidroxipropil)-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina) ou Cy5(1,1"- bis(3-hidroxipropil)-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina).

88. Dispositivo de teste, caracterizado pelo fato de que compreende um suporte sólido, o suporte sólido compreende pelo menos uma estrutura de fluorescência de ângulo supercrítico (estrutura SAF), a estrutura SAF tem um formato tronco-cônico, com um ângulo de tronco a, uma superfície superior, um diâmetro superior D e uma altura h, preferivelmente, o ângulo de tronco a é de cerca de 30º a cerca de 70º, bem como de cerca de 35 a cerca de 65, bem como de cerca de 40º a cerca de 60º, bem como cerca de 40º ou cerca de 60º, bem como cerca de 35º a cerca de 55º para uma interface ar/poliestireno ou cerca de 55º a cerca de 65 º para uma interface água/poliestireno.

89. Dispositivo de teste de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a altura h é pelo menos cerca de 0,2 mm, bem como de cerca de 0,25 mm a cerca de 0,5 mm, bem como de cerca de 0,3 mm a cerca de 0,35 mm.

90. Dispositivo de teste de acordo com a reivindicação 88 ou 89, caracterizado pelo fato de que o diâmetro superior é de cerca de 0,05 mm a cerca de 0,5 mm, bem como de cerca de 0,1 mm a cerca de 0,3 mm.

91. Dispositivo de teste de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 90, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma estrutura SAF tem um diâmetro superior à proporção de aspecto de altura D/h, que é de cerca de 1,1 ou menos, bem como cerca de 1,05 ou menos, bem como cerca de 1 ou menos, preferivelmente, a estrutura SAF um polímero de estrutura SAF.

92. Dispositivo de teste de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 91, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é um suporte de polímero ou um suporte de vidro, preferivelmente, o suporte compreende poliestireno (PS), copolímero de olefina cíclica (COC), policarbonato (PC), Poli(metacrilato de metila) (PMMA) ou uma mistura ou uma combinação que compreende um ou mais dentre os polímeros mencionados anteriormente.

93. Dispositivo de teste de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 92, caracterizado pelo fato de que a estrutura SAF é feita de poliestireno (PS).

94. Dispositivo de teste de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 93, caracterizado pelo fato de que a superfície superior de pelo menos uma estrutura SAF tem um recesso na superfície superior, o recesso na superfície superior é, preferivelmente, circular, mais preferivelmente, o recesso na superfície superior tem um eixo geométrico central paralelo com um eixo geométrico central da estrutura SAF e preferivelmente, no máximo cerca de 0,2 mm, tal como, no máximo, cerca de 0,1 mm a partir do eixo geométrico central da estrutura SAF, mais preferivelmente, o eixo geométrico central do recesso de superfície coincide com o eixo geométrico central da estrutura SAF.

95. Dispositivo de teste de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o recesso tem um piso de recesso substancialmente plano, preferivelmente, o recesso tem um diâmetro d, de cerca de 10% do diâmetro superior D ou mais, bem como de cerca de 15% a cerca de 80%, bem como de cerca de 20% a cerca de 50% do diâmetro superior D, preferivelmente, a borda que circunda o recesso na superfície superior tem uma largura de pelo menos 0,01 mm.

96. Dispositivo de teste de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o diâmetro d do recesso é de cerca de 0,01 a cerca de 0,2, bem como de cerca de 0,25 a cerca de 0,1.

97. Dispositivo de teste de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 96, caracterizado pelo fato de que o recesso tem uma altura h1l, que é cerca de 0,05 mm ou menos, bem como cerca de 0,02 ou menos.

98. Dispositivo de teste de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 97, caracterizado pelo fato de que o recesso tem borda de recesso arredondada, preferivelmente, a borda de recesso é arredondada com um raio de arredondamento R que é de cerca de 0,1 mm ou menos, tal como entre 0,01 e 0,8 mm.

99. Dispositivo de teste de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 98, caracterizado pelo fato de que o recesso tem um formato tronco-cônico, com uma superfície superior formada pela superfície formada pelo referido piso, preferivelmente, o recesso em forma tronco- cônico, tem um ângulo de tronco 6 de recesso que é de cerca de 40º a cerca de 70º, bem como de cerca de 55º a cerca de 65º, bem como cerca de 60º, mais preferivelmente, o recesso ângulo de tronco 6 é substancialmente idêntico ao ângulo de tronco a.

100. Dispositivo de teste de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 99, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de teste é pelo menos uma parte de um cartucho que compreende um canal com um canal de superfície que define o canal, em que o substrato sólido que compreende a pelo menos uma estrutura SAF forma pelo menos uma parte do canal de superfície.