CN111217874B - 一种从板蓝根中提取分离新葡萄糖芸苔素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药提取分离技术领域，具体涉及一种从板蓝根中提取新葡萄糖芸苔素的方法。所述方法包括以下步骤：粉碎；含水醇浸泡；热回流提取；DEAE Sephadex A‑25凝胶富集；脱盐、浓缩；75C18‑OPN柱色谱分离；Sephadex LH‑20柱色谱纯化；浓缩冷冻干燥。该方法条件温和，不破坏1‑甲基‑3‑吲哚基硫苷的结构。操作简单，适于大量制备。制备的新葡萄糖芸苔素纯度高。

Description

一种从板蓝根中提取分离新葡萄糖芸苔素的方法
技术领域
本发明属于中药提取分离技术领域，具体涉及一种从板蓝根中提取新葡萄糖芸苔素(俗名Neoglucobrassicin，化学名N-Methoxy-3-indolylmethylglucosinolate)的方法。
背景技术
现有技术公开了板蓝根是十字花科菘蓝属植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，味苦寒，具有清热解毒，凉血利咽之功效，是一种传统的抗病毒中药。现代药理学对板蓝根的研究表明，其具有良好的抗炎、抗病毒、解热以及提高免疫力等多种作用。硫代葡萄糖苷(glucosinolates,GLs,简称硫苷)作为板蓝根中一类重要的活性成分，被报道具有抗癌、抑菌、抗氧化等多种生物活性，从而受到学者的广泛关注，因此从中提取分离硫苷对板蓝根中硫苷类成分的深入研究具有重要意义。
基于现有技术的现状与基础，本申请的发明人拟提供一种从板蓝根中提取分离新葡萄糖芸苔素的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从板蓝根中提取分离新葡萄糖芸苔素(俗名Neoglucobrassicin，化学名N-Methoxy-3-indolylmethylglucosinolate)的方法，本方法通过加热回流法提取、DEAE SephadexA-25柱色谱富集、75C18-OPN柱色谱分离制备、Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，制得以下结构的硫苷；
经鉴定，所获硫苷类成分其结构如下述：
具体的，本发明的从板蓝根中提取分离新葡萄糖芸苔素的方法，其包括步骤：
(1)粉碎：将板蓝根药材打粉；
(2)浸泡：向步骤(1)所得板蓝根粉末中加入五倍体积的70％乙醇水溶液浸泡过夜；
(3)提取：将步骤(2)中板蓝根的醇水溶液加热回流提取2.5小时，过滤收集药材提取液，药渣中再次加入五倍体积70％乙醇水溶液浸泡12小时，再次加热回流提取2.5小时，过滤收集药材提取液，合并两次所得提取液；
(4)富集：将步骤(3)中所得提取液用处理过的DEAE SephadexA-25凝胶装填的色谱柱进行富集分离，经过吸附平衡、洗脱、解吸，得富集液；
(5)脱盐、浓缩：向步骤(4)所得富集液中加入两倍体积95％乙醇水，-4度静置30分钟，离心得上清液，浓缩；
(6)分离：将步骤(5)所得总硫苷提取液用处理过的75C18-OPN装填的色谱柱进行富集分离，经过吸附平衡、洗脱、解吸，得新葡萄糖芸苔素洗脱液；
(7)纯化：将步骤(6)所得新葡萄糖芸苔素洗脱液浓缩，用处理过的Sephadex LH-20装填的色谱柱进行纯化，以甲醇为流动相洗脱得新葡萄糖芸苔素洗脱液；(8)浓缩冷冻干燥：将步骤(7)中所得新葡萄糖芸苔素洗脱液浓缩至干，冷冻干燥得高纯度新葡萄糖芸苔素。
本发明中，所述DEAE SephadexA-25预处理过程是，两倍柱体积0.5M乙酸钠缓冲溶液冲洗色谱柱。
本发明中，所述步骤(4)富集过程的吸附平衡时间为8～10小时，洗脱过程依次为2倍柱体积70％乙醇水、6倍柱体积AcOH/EtOH/H2O(1：1：3)溶液、2倍柱体积H2O、10倍柱体积0.5M K2SO4乙醇水溶液(乙醇：水＝1：19)，仅收集K2SO4乙醇水洗脱部位。
本发明中，所述步骤(6)中75C18-OPN预处理过程是，两倍柱体积0.3MK2SO4冲洗色谱柱，其富集过程的吸附平衡时间为2～10分钟，洗脱过程依次为两倍柱体积0.3M K2SO4冲洗，一倍柱体积纯水冲洗，两倍柱体积20％甲醇水冲洗，两倍柱体积甲醇冲洗，20％甲醇水洗脱得到新葡萄糖芸苔素洗脱液。
本发明中，所述步骤(7)中Sephadex LH-20的预处理是甲醇冲洗，纯化过程是甲醇洗脱。
本发明化合物制得的新葡萄糖芸苔素的NMR结构鉴定数据如表1所示。
表1.新葡萄糖芸苔素的NMR数据(400MHz，D2O)
本方法制得到的新葡萄糖芸苔素X-射线单晶衍射结果如图1所示。
本发明中，经q-1HNMR检测，所制得的新葡萄糖芸苔素纯度为91.82％。
本发明方法具有以下优点：
(1)本发明提取药材的方法，条件温和，不破坏新葡萄糖芸苔素的结构，能将其最大程度地从板蓝根中提取出来。
(2)本发明制备新葡萄糖芸苔素的方法，操作简单，适用于大规模制备。
(3)本发明制备新葡萄糖芸苔素的方法，所得新葡萄糖芸苔素纯度高，准确可靠。
附图说明
图1，是本方法制得的新葡萄糖芸苔素X-射线单晶衍射图。
具体实施方式
本发明使用的试剂均为常用试剂，可于试剂生产企业购买。
实施例1新葡萄糖芸苔素的提取
将6kg板蓝根药材打粉，向所得板蓝根粉末中加入30L 70％乙醇水溶液浸泡过夜。将板蓝根的醇水溶液加热回流提取2.5小时，过滤收集药材提取液，向药渣中再次加入30L70％乙醇水溶液浸泡12小时，之后加热回流提取2.5小时，过滤收集药材提取液，合并两次所得提取液。
实施例2新葡萄糖芸苔素的分离
用DEAE SephadexA-25凝胶装填柱子，柱体积约为500ml，用1000ml 0.5M HOAc-NaOAc预处理后，上样浓度为所得提取液的2倍，上样体积为2L，吸附平衡时间为8～10小时，1000ml 70％乙醇洗脱，时间约为80分钟，3000ml AcOH/EtOH/H2O(1：1：3)洗脱，时间约为300分钟，1000ml纯水洗脱，时间约80分钟，最后，解吸液为5000ml 0.5M K2SO4乙醇水溶液(乙醇：水＝1：19)，解吸液洗脱时间为600分钟；
向所得洗脱液中加入两倍体积95％乙醇水，析出K2SO4沉淀，-4℃静置30分钟，离心得上清液，50℃浓缩至原体积1/50～1/70，浓缩液存放于4℃冰箱；
用约50g 75C18-OPN装填柱子，采用纯水装填，100ml 0.3M K2SO4预处理，上样质量约为12g，吸附平衡时间为2～10分钟，100ml 0.3M K2SO4洗脱，时间约为40分钟，50ml纯水洗脱，时间约为20分钟，100ml 20％甲醇水洗脱，时间约为40分钟，100ml甲醇洗脱，时间约为40分钟，其中用20％甲醇水洗脱得到的流份包含新葡萄糖芸苔素；
将所得新葡萄糖芸苔素洗脱液40℃下浓缩至干，再加入约2～3ml甲醇复溶，采用甲醇预处理后的柱体积约500ml的Sephadex LH-20装填的柱子进行纯化，每5ml一个流份，甲醇洗脱时间为12小时；
采用HPLC检测，将其中所得含有新葡萄糖芸苔素的甲醇洗脱液在40℃下浓缩至干，-80℃冰箱冷冻12小时，干燥12小时，得到高纯度新葡萄糖芸苔素。
实施例3新葡萄糖芸苔素的鉴定
化合物新葡萄糖芸苔素的NMR结构鉴定数据如表1所示。
表1.新葡萄糖芸苔素的NMR数据(400MHz，D2O)
由所述方法制备得到的新葡萄糖芸苔素X-射线单晶衍射结果如图1所示：此外，经q-1HNMR检测，此方法制备所得新葡萄糖芸苔素纯度为91.82％。

Claims (6)

1.一种从板蓝根中提取分离新葡萄糖芸苔素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)粉碎：将板蓝根药材打粉；
(2)浸泡：向步骤(1)所得板蓝根粉末中加入五倍体积的70％乙醇水溶液浸泡过夜；
(3)提取：将步骤(2)中板蓝根的醇水溶液加热回流提取2.5小时，过滤收集药材提取液，药渣中再次加入五倍体积70％乙醇水溶液浸泡12小时，再次加热回流提取2.5小时，过滤收集药材提取液，合并两次所得提取液；
(4)富集：将步骤(3)中所得提取液用处理过的DEAE SephadexA-25凝胶装填的色谱柱进行富集分离，经过吸附平衡、洗脱、解吸，得富集液；
(5)脱盐、浓缩：向步骤(4)中所得富集液中加入95％乙醇水，-4℃静置30分钟，离心得上清液，浓缩；
(6)分离：将步骤(5)所得总硫苷提取液用处理过的75C18-OPN装填的色谱柱进行富集分离，经过吸附平衡、洗脱、解吸，得新葡萄糖芸苔素洗脱液，所述洗脱步骤采用的洗脱液为0.3M K2SO4、水、20％甲醇水、甲醇；
(7)纯化：将步骤(6)所得新葡萄糖芸苔素洗脱液浓缩，用处理过的Sephadex LH-20装填的色谱柱进行纯化，以甲醇为流动相洗脱得新葡萄糖芸苔素洗脱液；
(8)浓缩冷冻干燥：将步骤(7)中所得新葡萄糖芸苔素洗脱液浓缩至干，冷冻干燥得高纯度新葡萄糖芸苔素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中用到的分离硫苷的色谱柱填料是75C18-OPN，洗脱方法为：用50g 75C18-OPN装填柱子，采用纯水装填，100ml 0.3M K2SO4预处理，上样质量为12g，吸附平衡时间为2～10分钟，100ml 0.3M K2SO4洗脱，时间为40分钟，50ml纯水洗脱，时间为20分钟，100ml 20％甲醇水洗脱，时间为40分钟，100ml甲醇洗脱，时间为40分钟，其中用20％甲醇水洗脱得到的流份包含新葡萄糖芸苔素。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中：向所得板蓝根粉末中加入五倍体积的70％乙醇水溶液；
所述(3)提取中：将步骤(2)中板蓝根的醇水溶液加热回流提取2.5小时，过滤收集药材提取液，药渣中再次加入五倍体积70％乙醇水溶液浸泡12小时，再次加热回流提取2.5h，过滤收集药材提取液，合并两次所得提取液；
所述步骤(5)中：向步骤(4)中所得富集液中加入两倍体积95％乙醇水，-4℃静置30分钟，离心得上清液，50℃浓缩至原体积1/50～1/70。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用DEAE Sephadex A-25色谱柱：用DEAESephadexA-25凝胶装填柱子，柱体积为500ml，用1000ml 0.5M HOAc-NaOAc预处理后，上样浓度为所得提取液的2倍，上样体积为2L，吸附平衡时间为8～10小时，1000ml 70％乙醇洗脱，时间为80分钟，3000mlAcOH/EtOH/H2O(1：1：3)洗脱，时间为300分钟，1000ml纯水洗脱，时间80分钟，最后，解吸液为5000ml 0.5M K2SO4乙醇水溶液(乙醇：水＝1：19)，解吸液洗脱时间为600分钟。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用Sephadex LH-20为色谱填料：洗脱过程为，将所得新葡萄糖芸苔素洗脱液40℃下浓缩至干，再加入2～3ml甲醇复溶，采用甲醇预处理后的柱体积500ml的Sephadex LH-20装填的柱子进行纯化，每5ml一个流份，甲醇洗脱时间为12小时。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所获的新葡萄糖芸苔素其结构如下示：
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