CN111201046A - 脂肪组织产品以及产生方法 - Google Patents

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提供了用于处理组织的组合物和方法。所述组合物可以包括来源于脂肪组织的适合于注射、小体积植入或用作软组织再生材料的组织基质。还提供了用于产生这样的组合物的方法。

Description

脂肪组织产品以及产生方法
本公开内容根据35USC§119要求于2017年10月18日提交并且通过引用并入本文的美国临时申请62/573,892的优先权。
本公开内容涉及组织基质，并且更具体地，涉及用于治疗或再生脂肪组织的可注射材料。
目前存在对于用于组织治疗的改善的可注射材料的需求。例如，为了治疗多种面部特征(例如，线条、皱纹、不足的体积或不太理想的形状或形式)，可以使用可注射材料诸如基于透明质酸的材料。这样的材料，尽管有效，但可能提供仅暂时的改善，最终被身体吸收(resorb)，并且可能不诱导组织诸如脂肪组织的再生。此外，尽管已经进行了开发用于组织治疗和再生的基于脂肪的材料的工作，当前的材料不适于小体积治疗或注射，或未被证明对脂肪再生非常有效。
因此，本公开内容提供了用于注射、小体积植入或填充较大空隙或用基于脂肪的组织产品增加体积的组合物。本公开内容还提供了用于产生这样的组合物的方法。
本公开内容提供了用于从脂肪组织基质产生可注射产品的方法。所述方法可以包括选择脂肪组织；机械加工(mechanically processing)脂肪组织以减小组织尺寸；处理经机械加工的组织以从组织中去除大体上全部细胞物质；将组织悬浮在溶液中以形成悬浮液；处理悬浮液以产生具有微孔结构的稳定化的三维结构；以及机械加工稳定化的三维结构以产生颗粒。
本公开内容还提供了组织产品组合物。所述组合物可以包括颗粒状组织基质，其中组织产品组合物包含已经被形成为多孔海绵并且然后形成为颗粒的脂肪无细胞组织基质，并且其中颗粒状组织基质包含具有在约0.05mm和3mm之间的最长尺寸的颗粒。
本公开内容还提供了使用所公开的产品的治疗方法。
可以理解，前述一般描述和以下详细描述两者仅为示例性的和解释性的，并且不会限制如所要求权利的本发明。
附图简述
并入并构成本说明书的一部分的附图举例说明了本公开内容的示例性实施方案，并且与说明书一起用来解释本公开内容的原理。
图1是概述根据本公开内容的实施方案用于产生脂肪组织基质海绵的方法的流程图；
图2是概述根据本公开内容的实施方案用于产生可注射的脂肪组织基质产品的方法的流程图；
图3图示了根据多种实施方案产生的大块脂肪组织基质海绵；
图4是在通过研磨脂肪组织基质海绵之后产生的具有在2mm和3mm之间的尺寸的颗粒状组织基质的放大视图；
图5图示了通过研磨或破碎脂肪组织基质海绵以产生在100微米和300微米之间的颗粒来产生的一组无细胞组织基质颗粒，以及在其水合后的糊状/布丁状可注射材料；
图6图示了根据所公开的实施例的方法产生的脂肪组织基质颗粒的扫描电子显微术(SEM)和原子力显微术照片；
图7A图示了根据所公开的实施例产生的脂肪组织基质材料的差示扫描量热法曲线；
图7B是根据所公开的实施例产生的脂肪组织基质材料的Mason三色染色的切片；
图7C图示了在使用或不使用电子束消毒(e-beam sterilization)的情况下根据所公开的实施例产生的脂肪组织的胶原酶消化曲线；
图8A是根据所公开的实施例产生的脂肪组织基质材料的苏木精和伊红(“H&E”)染色的切片；
图8B是根据所公开的实施例产生的脂肪组织的DNA和脂质含量测量的表格；
图8C是根据所公开的实施例产生的脂肪组织基质材料的免疫染色部分，该脂肪组织基质材料的MHC-1&II染色与天然脂肪对照相比为阴性；
图9提供了根据所公开的实施例产生的脂肪组织基质与天然脂肪对照相比并且使主要细胞外基质蛋白(例如，I型、III型和IV型)胶原经受免疫组织学分析的组织学图像；
图10提供了根据所公开的实施例产生的支持三种不同细胞类型(例如，成脂间充质干细胞、内皮细胞和真皮成纤维细胞)在体外生长的脂肪组织基质的光学显微图像；
图11提供了在裸鼠中皮下植入之后如根据所附的实施例制备的可注射脂肪组织基质的外植体的大体照片(gross photograph)；
图12图示了图11中描绘的外植体的Masson三色染色；
图13是图示了如在所公开的实施例中所描述的，在大鼠皮下植入持续四周或八周之后剩余的外植体体积的柱状图；
图14A是如在所附的实施例中描述的八周外植体的Masson三色染色的切片；
图14B是如在所附的实施例描述的八周外植体的另一个Masson三色染色的切片；
图14C是如在所附的实施例中描述的八周外植体的另一个Masson三色染色的切片；
图15提供了在储存1.5年之后在湿脂肪组织基质产品中形成的聚集体的显微图像；
图16是在具有或不具有HA作为可流动的载体的情况下脂肪基质产品的注射力的图；以及
图17是如在实施例中所描述的四周HA-脂肪外植体的H&E染色的切片。
某些示例性实施方案的详细描述
现将对于根据本公开内容的某些示例性实施方案做出详细参考，其中某些实施例被图示在附图中。在可能的情况下，相同的附图标记将在所有附图中用于指代相同或相似的部分。
在本申请中，单数的使用包括复数，除非另外具体陈述。在本申请中，“或”的使用意指“和/或”，除非另外陈述。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。本文中所描述的任何范围将被理解为包括端点和端点之间的所有值。
本文中所使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。在本申请中引用的所有文件或文件部分(包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍以及专著)据此为了任何目的通过引用以其整体明确地并入。
如本文中所使用的“组织产品”将指包含细胞外基质蛋白的任何人类或动物组织。“组织产品”可以包括无细胞或部分脱细胞的组织基质，以及已经用外源细胞重新填充的脱细胞的组织基质。
如本文中所使用的，术语“无细胞组织基质”指的是来源于人类或动物组织的细胞外基质，其中该基质保留了用作支持组织再生的支架所需的大量的天然胶原和糖蛋白。“无细胞组织基质”不同于纯化的胶原材料诸如酸提取的纯化胶原，其大体上不含其他基质蛋白，并且由于纯化方法而不保留组织基质的天然微结构特征。尽管被称为“无细胞组织基质”，但是将理解的是，这样的组织基质可以与外源细胞组合，该外源性细胞包括例如干细胞，或者来自可以被植入“无细胞组织基质”的患者的细胞。“脱细胞的脂肪组织基质”将被理解为指已经从其去除所有细胞以产生脂肪细胞外基质的基于脂肪的组织。“脱细胞的脂肪组织基质”可以包括完整的基质或如本文所讨论的已经进一步加工的基质，包括机械加工、海绵的形成和/或进一步加工以产生颗粒状基质。
“无细胞的”或“脱细胞的”组织基质将被理解为指其中细胞使用光学显微术不可见的组织基质。
多种人类和动物组织可以用于产生用于治疗患者的产品。例如，已经产生了用于再生、修复、增大(augmentation)、强化和/或治疗由于多种疾病和/或结构损伤(例如，由于创伤、外科手术、萎缩和/或长期磨损和退化)而已经被损伤或缺失的人体组织的多种组织产品。这样的产品可以包括，例如，无细胞组织基质、组织同种异体移植物或异种移植物和/或重建的组织(即，已经接种了细胞以产生可存活的材料的至少部分脱细胞的组织)。
已经产生了多种组织产品用于治疗软组织和硬组织。例如，
Figure BDA0002442444410000051
和STRATTICETM(LIFECELL CORPORATION,BRANCHBURG,NJ)是分别由人类和猪真皮制成的两种真皮无细胞组织基质。尽管这样的材料对于治疗某些类型的状况是非常有用的，但是对于某些应用而言，具有不同生物学性质和机械性质的材料可能是合意的。例如，
Figure BDA0002442444410000052
和STRATTICETM已经被用于辅助治疗结构缺陷和/或为组织提供支持(例如，用于腹壁或在乳房重建中)，并且它们的强度和生物学性质使它们非常适合于这样的用途。然而，当期望的结果是产生具有存活的脂肪细胞的脂肪组织时，这样的材料对于含脂肪的组织的再生、修复、替换和/或增大可能不是理想的。因此，本公开内容提供了可用于治疗涉及含脂肪的组织的组织缺陷/瑕疵的组织产品。本公开内容还提供了用于产生这样的组织产品的方法。
组织产品可以包括已经被加工以去除至少一些细胞组分的脂肪组织。在一些情况下，全部或大体上全部的细胞物质被去除，从而留下脂肪细胞外基质蛋白。此外，产品可以被加工以去除一些或全部细胞外和/或细胞内脂质。然而，在一些情况下，细胞外脂质和/或细胞内脂质的完全去除可以损害脂肪基质的结构和功能。例如，被化学或酶促处理持续延长的时间段的脂肪组织可能已经变性或以其他方式损伤胶原，或者可能耗尽脂肪再生所需的蛋白。因此，在一些情况下，产品包含一定水平的残余脂质。剩余的脂质含量可以是例如按产品的重量计的约5％、6％、7％、8％、9％或10％。如下文进一步所描述的，细胞外基质蛋白可以被进一步处理以产生三维多孔材料或海绵状材料，并且所述多孔材料或海绵状材料可以被进一步加工以产生可注射产品。
如所提到的，本公开内容的组织产品由脂肪组织形成。脂肪组织可以来源于人类或动物来源。例如，人类脂肪组织可以从尸体获得。此外，人类脂肪组织可以从活体供体(例如，用自体组织)获得。脂肪组织还可以从动物诸如猪、猴子或其他来源获得。如果使用动物来源，则可以进一步处理组织以去除抗原组分诸如1,3-α-半乳糖部分，其存在于猪和其他哺乳动物中，但不存在于人类或灵长类动物中。参见Xu,Hui等人,“A Porcine-DerivedAcellular Dermal Scaffold that Supports Soft Tissue Regeneration:Removal ofTerminal Galactose-α-(1,3)-Galactose and Retention of Matrix Structure,”Tissue Engineering,第15卷,1-13(2009)，其在此通过引用以其整体并入。此外，脂肪组织可以从已经被遗传修饰以去除抗原部分的动物获得。
用于产生本公开内容的组织产品的示例性方法在图1和图2中图示。图1提供了一个流程图，图示了可以用于产生合适的脂肪组织海绵的基本步骤，然后脂肪组织海绵可以被进一步加工以产生可注射的或可植入的颗粒。如所示出的，该方法可以包括多个步骤，但是将理解的是，取决于所使用的特定组织、期望的应用或其他因素，可以添加或替代另外的或可选择的步骤。
如所示出的，方法100通常可以开始于步骤110，其中组织被接收。组织可以包括多种脂肪组织类型，包括例如人类或动物脂肪组织。合适的组织来源可以包括同种异体移植物组织、自体移植物组织或异种移植物组织。当使用异种移植物时，该组织可以包括来自动物的脂肪，所述动物包括猪、牛、狗、猫、家养或野生来源，和/或任何其他合适的哺乳动物或非哺乳动物脂肪来源。
组织可以使用任何期望的技术从动物来源收获，但是如果可能的话，通常可以使用无菌(aseptic)或消毒(sterile)技术获得。组织可以储存在寒冷的或冷冻的条件中，或者可以被立即加工以防止由于延长的储存引起的任何不期望的变化。
在接收组织之后，组织最初可以在步骤120经受机械尺寸减小和/或在步骤130经受机械脱脂(defatting)。机械尺寸减小可以包括使用手动刀片或任何其他合适的研磨方法对组织进行粗糙的(gross)或大的切割。
在步骤130的机械脱脂在组织产生中可能是重要的。具体地，为了帮助脂质去除，脂肪可以经受多种机械加工条件。例如，机械加工可以包括研磨、共混、切碎、磨碎或以其他方式加工组织。机械加工可以在允许一定程度加热的条件下进行，这可以帮助释放或去除脂质。例如，机械加工可以在可允许脂肪组织加热至高达122℉(50℃)的条件下进行。施加外部热量可能不足以释放脂质；因此，在机械破坏期间生成的热可能是帮助去除脂质所优选的。在一些实例中，在机械加工期间加热可以是温度上升的脉冲，并且持续时间可以是短的。该热脉冲可以引起从被机械破坏破损的脂肪细胞释放的脂质液化，这然后可以引起有效的相分离用于主体脂质去除(bulk lipid removal)。在实例中，当加工猪脂肪组织时，在该方法期间达到的温度高于100℉，并且不可以超过122℉(50℃)。所达到的温度范围可以根据脂肪组织的来源来调节。例如，当加工较低饱和的组织，例如灵长动物组织时，温度可以被进一步降低至约80℉、90℉、100℉、110℉或120℉。可选择地，该方法可以被选择以确保脂肪达到最低温度诸如80℉、90℉、100℉、110℉或120℉。
在一些情况下，机械脱脂可以在添加很少洗涤液或不添加洗涤液的情况下通过机械加工组织进行。例如，组织可以在不使用溶剂的情况下通过研磨或共混进行机械加工。可选择地，当研磨组织需要水分时，例如为了增加流动性或降低粘度，可以使用水，包括纯水或盐水或包括盐水或磷酸盐缓冲盐水的其他缓冲液。在一些实例中，组织可以通过添加一定量的生物相容性溶剂，诸如盐水(例如，生理盐水、磷酸盐缓冲盐水或包括盐和/或去污剂的溶液)进行加工。包括盐和/或去污剂的促进细胞裂解的其他溶液也可以是适合的。
在机械加工和脂质去除之后，脂肪可以在步骤140被洗涤。例如，组织可以用具有多种生物相容性缓冲液用一次或更多次冲洗来洗涤。例如，合适的洗涤溶液可以包括盐水、磷酸盐缓冲盐水或其他合适的生物相容性材料或生理溶液。在实例中，水可以用作冲洗剂以进一步破坏细胞，之后可以引入磷酸盐缓冲盐水或任何其他合适的盐水溶液以允许基质蛋白返回到生物相容性缓冲液中。
洗涤可以连同离心或从组织中分离脂质的其他方法一起进行。例如，在一些实施方案中，材料用水或另一种溶剂稀释。然后，将稀释的材料离心，并且游离脂质将流到顶部，同时细胞外基质蛋白作为沉淀物被沉积。然后，可以将蛋白质沉淀物重悬，并且可以重复洗涤和离心，直到去除足够量的脂质。
在任何洗涤之后，脂肪可以被处理以从脂肪组织中去除一些或全部细胞，如在步骤150所指示的。细胞去除方法可以包括许多合适的过程。例如，从脂肪组织中去除细胞的合适的方法可以包括用去污剂诸如脱氧胆酸、聚乙二醇或其他去污剂以足以破坏细胞和/或去除细胞组分的浓度和次数处理。
在细胞去除之后，取决于所使用的组织或所期望的最终结构，可以并入另外的加工和/或洗涤步骤，如在步骤160所指示的。例如，可以进行另外的洗涤或处理以去除抗原材料诸如α-1,3-半乳糖部分，其可以存在于非灵长动物组织上。此外，在洗涤步骤期间、之前和/或之后，可以使用另外的溶液或试剂来加工材料。例如，酶、去污剂和/或其他剂可以在一个或更多个步骤中使用，以进一步去除细胞物质或脂质、去除抗原材料和/或减少该材料的细菌或其他生物负载。例如，可以包括使用去污剂诸如十二烷基硫酸钠或Triton的一个或更多个洗涤步骤，以帮助去除细胞和脂质。此外，酶诸如脂肪酶、DNA酶、RNA酶、α-半乳糖苷酶或其他酶可以用于确保核物质、来自异种来源的抗原、残余的细胞组分和/或病毒的破坏。此外，酸性溶液和/或过氧化物可以用于帮助进一步去除细胞物质和破坏细菌和/或病毒或其他潜在的感染因子。
在去除脂质和细胞组分之后，材料然后可以被形成为多孔材料或海绵状材料。通常，首先将细胞外基质重悬在水性溶剂中以形成浆液状材料，如在步骤170所指示的。使用足够量的溶剂以允许材料形成液体物质，该液体物质可以被倒入具有期望的组织产品的尺寸和形状的模具中。所添加的水或溶剂的量可以基于最终材料的期望的孔隙度而变化。在一些情况下，浆液状材料可以具有按重量计约2％至约10％、优选地约2％至约5％的固体浓度。在一些情况下，重悬的细胞外基质可以通过研磨、切割、共混或其他方法机械处理另外一次或更多次，并且经处理的材料可以被离心并重悬一次或更多次，以进一步去除细胞物质或脂质(如果需要的话)和/或控制细胞外基质的粘度。
在任何另外的洗涤和研磨步骤完成后，重悬的材料被放置在容器或模具中以形成多孔的海绵状产品，如在步骤180所指示的。通常，多孔材料或海绵状材料通过干燥材料以留下具有多孔结构的三维基质而形成。在一些实施方案中，该材料是冷冻干燥的。冷冻干燥可以允许产生通常符合模具的形状的三维结构，如图3中所示出的。具体的冷冻干燥方案可以基于所使用的溶剂、样品尺寸和/或优化加工时间而变化。一种合适的冷冻干燥方法可以包括经过20-40分钟时间段将材料冷却至-10℃；将样品在-10℃保持持续120-180分钟，并且将样品进一步冷却至-40℃以确保完全冷冻；施加真空；将温度升高至-5℃并且保持持续30-60小时；将温度升高至25℃并且保持持续6-12小时。然后，冷冻干燥的样品可以从冷冻干燥器中取出，并且在氮气下包装在箔袋中。
在形成固体或海绵之后，所述材料可以任选地被稳定化，如在步骤190所指示的。在一些情况下，稳定化可以包括另外的方法诸如交联、用脱水热(DHT)工艺处理或其他合适的稳定化方法。例如，通常，当形成为多孔基质时，机械加工的组织当被植入身体内、变湿或被放置于溶液中时可以形成更加油灰状(putty-like)或糊状的材料。因此，可能会失去期望的形状和尺寸。此外，可能会失去对于支持细胞附着、组织生长、血管形成和组织再生可以是重要的多孔结构。因此，材料可以被进一步加工以稳定材料的尺寸、形状和结构。
在一些实施方案中，材料被交联用于稳定化。在一些实施方案中，材料在冷冻干燥之后被交联。然而，材料也可以在冷冻干燥方法之前或期间被交联。交联可以以多种方式进行。在一种实施方案中，交联通过使材料与交联剂诸如戊二醛、京尼平、碳二亚胺(例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC))和二异氰酸酯接触来实现。此外，交联可以通过在真空中加热材料来进行。例如，在一些实施方案中，材料可以在减压或真空中被加热至70℃至120℃之间，或80℃和110℃之间，或至约100℃，或指定范围之间的任何值。此外，其他交联方法或方法的组合可以用于产生任何所公开的产品，所述其他交联方法包括紫外辐照、γ辐照和/或电子束辐照。此外，真空不是必要的，但可以缩短交联时间。此外，可以使用更低或更高的温度，只要不发生基质蛋白的熔化和/或为交联提供足够的时间。
在多种实施方案中，可以控制交联方法以产生具有所期望的机械特征、生物学特征和/或结构特征的组织产品。例如，交联可以影响材料的整体强度，并且该方法可以被控制以产生期望的强度。此外，交联的量可以影响产品当被植入时维持期望的形状和结构(例如，孔隙度)的能力。因此，交联的量可以被选择，以在被植入体内时、当与水性环境接触时、和/或当被压缩(例如，被周围组织或材料压缩)时，产生稳定的三维形状。
过度交联可以改变细胞外基质材料。例如，过度交联可以损害胶原或其他细胞外基质蛋白。当组织产品被放置在脂肪组织部位或其他解剖位置时，受损的蛋白可能不支持组织再生。此外，过度交联可以引起材料变脆或变弱。因此，交联的量可以被控制以产生期望的稳定性水平，同时维持期望的生物学特征、机械特征和/或结构特征。
示例性的交联方法可以包括使如上文所讨论地产生的冷冻干燥的材料与戊二醛或EDC接触。例如，可以使用0.1％的戊二醛溶液，并且可以将组织浸没在该溶液中持续约18小时，随后在水中大量冲洗以去除该溶液。可选择地，或组合地，可以使用脱水热(DHT)工艺。例如，一个示例性的脱水热工艺包括在100℃和～20英寸的Hg处理材料持续18小时，随后浸没在水中。最终的交联组织产品可以被储存在薄膜袋中。
在形成固体或海绵之后，组织产品然后可以被进一步加工以产生可注射形式。用于形成可注射形式的示例性方法由方法200阐释，如图2中所示出的。将理解的是，“可注射的”可以包括用注射器、套管或针注射的材料，但是可以产生具有适合于包括手动插入(例如，用手或其他主体仪器诸如披针(spatula)、管或配备成操作可流动的材料的其他装置)的其他施用模式的尺寸和机械性质的所公开的材料。
用于产生注射剂(the injectable)的方法通过获得大块海绵开始，如在步骤210所指示的。获得大块海绵可以使用参考图1描述的方法或其合适的变化形式来进行。在本公开内容的一个方面中，该方法可以从稳定的(猪或人类)脂肪组织基质海绵开始。
在获得大块海绵材料之后，该材料可以经受尺寸减小或颗粒形成，如在步骤220所指示的。尺寸减小或颗粒形成可以包括机械切割、研磨或共混，以产生具有期望的尺寸和尺寸分布的颗粒。在本公开内容的一些方面中，当初始材料是干海绵时，研磨可以是优选的以将干海绵减小至更小的颗粒。尺寸减小可以在室温进行。
值得注意的是，已经发现海绵尺寸的减小应该被完成以维持颗粒内的多孔海绵结构。因此，颗粒应该足够大以维持海绵结构，以便支持脂肪形成。多孔结构的失去或缺少可以导致不支持脂肪生长的组合物。例如，颗粒可以由海绵形成，使得颗粒具有至少0.5微米、1微米、2微米、3微米、4微米或更大的尺寸。颗粒尺寸可以基于海绵微观结构来选择。
继续参考图2，在下一步骤230中，尺寸选择可以是期望的。例如，稳定化的海绵，在研磨或以其他方式处理以产生颗粒后，可以然后被筛分或以其他方式分选以获得作为可流动的/可注射的脂肪组织基质材料的颗粒的期望尺寸。在一些实例中，可以期望具有不同颗粒尺寸的一种或更多种可注射脂肪组织基质海绵来适应不同的针尺寸。在这种情况下，材料被筛分以实现优选的颗粒尺寸范围。在实施方案中，颗粒尺寸可以在50微米至2,800微米的范围内。例如，经研磨的海绵可以被筛分以回收(retrieve)具有以下优选尺寸的颗粒：细颗粒(例如，50-100微米)；中等颗粒(例如，0.4mm至0.6mm)；大颗粒(例如，0.8mm至1mm)；以及较大的颗粒(例如，2.8mm至3.4mm)。在本公开内容的一些方面中，在此范围的颗粒尺寸可以不引起不同的生物学响应。换句话说，例如，尺寸在50微米至2,800微米的范围内的颗粒的生物学响应可能没有差异。可能需要特定尺寸的注射针的不同应用可以选择特定尺寸的颗粒，而不需要考虑生物学响应是否将是不同的。
在选择了颗粒的尺寸后，在下一步骤240，颗粒可以被水合和/或添加到另一种载体至期望的程度，以产生流动性和期望程度的固体含量。例如，经筛分的颗粒可以用盐水或其他材料水合，以产生5-12％的固体浓度。此外，可以使用或添加其他载体，包括基于透明质酸的材料(例如，
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ALLERGAN或类似材料)。在一些其他实例中，颗粒可以使用水、盐水、磷酸盐缓冲盐水或任何其他合适的生理溶液来水合。在本公开内容的一些实例中，步骤240可以在步骤230之前进行，因为颗粒可以在进行尺寸选择之前和/或在颗粒被筛分之前被水合或添加至载体。
示例性颗粒状材料在图4和图5中阐释。图4是在通过研磨脂肪组织基质海绵产生之后，具有在2mm和3mm之间的尺寸的颗粒状组织基质的放大视图；图5图示了通过研磨或破碎脂肪组织基质海绵以产生在100微米和300微米之间的颗粒产生的一组无细胞组织基质颗粒，以及在其水合之后的糊状/布丁状可注射材料；
根据本公开内容的某些方面，可以使用具有期望的组织基质固体含量的材料。例如，可以使用5％至12％固体的材料，并且7.5-10％的材料是期望的。在另一个实例中，5％至10％固体的材料可以使用合适的载体来促进注射并且防止颗粒消散远离注射部位。合适的载体可以是可流动的载体，例如可流动的透明质酸载体。在一些实例中，透明质酸载体是非交联的透明质酸载体。在一些其他实例中，透明质酸载体是交联的透明质酸载体。
如本文中所使用的，“基于透明质酸的材料”是包含透明质酸(HA)的材料。HA指的是透明质酸并且还可以指其任何盐，包括但不限于透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁、透明质酸钙及其组合。HA及其药学上可接受的盐两者都可以被包括在基于透明质酸的材料中。示例性的基于HA的材料作为
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和JUVEDERM
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商业销售。应当理解，基于透明质酸的材料可以包括另外的剂诸如例如利多卡因。
本文中表示HA的“分子量”的所有数字将被理解为表示以道尔顿计的重均分子量(Mw)。
HA的分子量使用以下Mark Houwink关系式(Mark Houwink relation)由特性粘度测量值计算：特性粘度(m3/kg)＝9.78 x 10-5 x Mw0.690。特性粘度根据欧洲药典(HA专著编号1472,01/2009)所定义的程序测量。
如本文中所使用的高分子量HA描述了具有至少约100万道尔顿(Mw≥106Da或1MDa)至约4.0MDa的分子量的HA材料。可以掺入本发明的组织产品组合物中的高分子量HA可以具有在约1.5MDa至约3.0MDa的范围内的分子量，或者高分子量HA可以具有约2.0MDa的重均分子量。在另一个实例中，高分子量HA可以具有约3.0MDa的分子量。
如本文中所使用的低分子量HA描述了具有小于约1.0MDa的分子量的HA材料。低分子量HA可以具有在约200,000Da(0.2MDa)至小于1.0MDa之间的分子量，例如在约300,000Da(0.3M Da)至约750,000Da(0.75MDa)之间，高达但不超过0.99MDa的分子量。优选地，在低分子量HA材料和高分子量HA材料的分子量分布之间不存在重叠。优选地，低分子量HA和高分子量HA的混合物具有双峰分子量分布。混合物还可以具有多峰分布。
在本发明的一个方面中，脂肪组织产品组合物包含具有高分子量组分和低分子量组分的HA，并且高分子量组分可以具有重均分子量是低分子量组分的重均分子量的至少两倍的重均分子量。例如，组合物中高分子量HA与低分子量HA的分子量比可以为至少2:1。例如，组织产品组合物可以包括具有低分子量组分和高分子量组分的HA，所述低分子量组分具有约500,000Da的重均分子量，且所述高分子量组分具有约或至少约1.0MDa的重均分子量。在另一个实例中，根据本发明的组织产品组合物可以包括具有低分子量组分和高分子量组分的HA，所述低分子量组分具有约800,000Da的重均分子量，且所述高分子量组分具有约或至少约1.6MDa的重均分子量。应当理解，许多不同类型的HA可以被掺入脂肪组织产品组合物，并且前述实例不意图是限制性的。
在一些示例性实施方案中，HA可以使用一种或更多种合适的交联剂交联。交联剂可以是已知适合于经由其羟基基团使多糖及其衍生物交联的任何剂。合适的交联剂包括但不限于1,4-丁二醇二缩水甘油醚(或1,4-双(2,3-环氧丙氧基)丁烷或1,4-双缩水甘油基氧基丁烷，所有这些通常被称为BDDE)、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(通常被称为EDC)。其他合适的透明质酸交联剂包括基于多官能PEG的交联剂如季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE)、二乙烯基砜(DVS)、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、亚苯基双-(乙基)-碳二亚胺和1,6六亚甲基双(乙基碳二亚胺)、己二酸二酰肼(ADH)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、六亚甲基二胺(HMDA)、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷或其组合。
在根据本发明形成的脂肪组织产品组合物的一种示例性实施方案中，脂肪组织产品组合物包括可流动的载体和与载体混合的多个脂肪组织基质颗粒，该可流动的载体包含基于透明质酸的材料。在一些示例性实施方案中，可流动的载体包含尚未与另外的剂混合的HA；在其他示例性实施方案中，可流动的载体包含与另外的剂混合的HA。另外的剂可以包括但不限于麻醉剂，例如氨基酰胺局部麻醉剂及其盐或氨基酯局部麻醉剂及其盐。例如，普鲁卡因、氯普鲁卡因、可卡因、环美卡因、二甲卡因、丙氧卡因、普鲁卡因、丙美卡因、丁卡因或其盐，或其任何组合。在一些实施方案中，麻醉剂可以包含阿替卡因、布比卡因、辛可卡因、依替卡因、左布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、哌罗卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、三甲卡因或其盐，或其任何组合。
可流动的载体最初可以呈可流动的液体溶液的形式，该可流动的液体溶液可以与脂肪基质颗粒混合以形成浆液。然后，形成的浆液可以被装载到注射器或其他注射装置中，用于向患者施用。在一些示例性实施方案中，可流动的载体可以是足以提供脂肪组织产品组合物的改善的可注射性的量的非交联的HA。在一些示例性实施方案中，可流动的载体可以是足以提供脂肪组织产品组合物的改善的可注射性的量的交联的HA。虽然可流动的载体在本文中被描述为包含HA，但是预期其他糖胺聚糖(GAG)，诸如HSGAG、CSGAG和/或硫酸角蛋白型GAG也可以用作可流动的载体。
虽然外科手术植入是用于植入脂肪组织基质材料以修复身体的某些区域的合适选项，但对于一些应用而言注射可以是优选的。发现与以其天然形式应用脂肪组织基质相比，将脂肪组织基质颗粒化对于应用和注射而言是一种改善，但是发现即使颗粒化的纯脂肪组织基质也不容易被应用或注射到患者。特别地，发现因为颗粒化的组织基质材料扩散或在储存之后聚集的趋势，颗粒化的组织基质材料的应用难以控制。此外，发现注射颗粒化的脂肪组织基质所需的注射力是相对高的，并且发现注射装载到注射装置诸如注射器中的所有颗粒化的组织基质是相对困难的。
为了解决注射脂肪组织基质材料的一些先前描述的问题，本文中描述的示例性实施方案提供了组织产品组合物，该组织产品组合物包括在包含基于透明质酸的材料的可流动的载体内混合的脂肪组织基质颗粒。所形成的组织产品组合物可以比纯的脂肪组织基质颗粒更容易应用，如本文中将进一步描述的，同时维持促进植入和/或注射区域的组织生长的特性。
在一种示例性实施方案中，脂肪组织基质颗粒和可流动的载体可以在通常无菌的条件下以大体积批次混合，以形成根据本发明的组织产品组合物。混合可以包括，例如，将脂肪组织基质颗粒和可流动的载体一起搅拌以形成浆液。混合的参数和技术可以根据可流动的载体和无细胞组织基质颗粒的性质以及各自在组织产品组合物中的一般量而改变，并且可以由本领域技术人员从常规实验中容易地得到。
为了配制根据本发明的组织产品组合物，可以使用不同类型的基于透明质酸的材料。在一些情况下，所有类型的HA最初在具有20mg HA/mL的浓度的溶液中。示例性的HA类型包括1型HA、2型HA、3型HA和4型HA。1型HA是具有320Pa的G’值的非交联的透明质酸；相比之下，2型HA和3型HA是用EDC交联剂交联的透明质酸，它们取决于交联程度具有不同的G’值和G”值。2型HA具有160Pa的G’值，并且3型HA具有在500-550之间的G’值。4型HA也是交联的。4型HA可以具有350Pa的G’值。
多种基于透明质酸的材料可以与脂肪组织基质颗粒混合，以产生下文的表1中描述的多种组织产品组合物。应当理解，本文所描述的基于透明质酸的材料仅是示例性的，并且其他基于透明质酸的材料可以与脂肪组织基质颗粒混合。此外，表1中给出的组合物仅是示例性的，并且组织产品组合物的其他制剂可以根据本发明形成。
表1
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现在转到表1，描述了根据本发明形成的组织产品组合物的示例性实施方案。代表多种组织产品组合物的组合物1-4在表1中示出，但是应当理解，可以根据本发明形成其他组织产品组合物。对于每种组合物1-4，源自猪脂肪组织并且当与可流动的载体组合时，脂肪组织基质颗粒产生脂肪组织基质浆液，其也可以被称为“可流动的脂肪组织基质”。在与以20mg HA/mL的浓度提供的可流动的载体混合之前，脂肪组织基质颗粒在水性缓冲液中为100mg/mL的浓度。如从表1中应当理解的是，脂肪基质:HA的比可以被调节，以产生具有不同流动性质的浆液，如本文中将进一步描述的。应当理解，本文描述的比可以按体积计或按质量计；在表1中示出的示例性实施方案中，该比作为体积脂肪基质:体积HA给出。如通过组合物1和组合物2所例示的，脂肪基质:HA的比可以是9:1；并且如通过组合物3和组合物4所例示的，脂肪基质:HA的比可以是4:1。应当理解，先前描述的比仅是示例性的，并且组织产品组合物的其他示例性实施方案可以具有包括所公开的比之间的任何值的其他的脂肪基质:HA的比。
根据本公开内容的某些方面，可以使用具有期望的组织基质颗粒固体含量的组织产品组合物。例如，取决于何种类型的基于透明质酸的材料与组织基质颗粒混合，5％至15％固体含量的材料，诸如7.5％至10％的固体含量的材料可以是期望的。在一些示例性实施方案中，组织产品组合物具有10％固体含量，对应于100mg/mL的无细胞脂肪基质颗粒。
如上文所讨论的，组织产品当被植入到患者内或患者上时应当具有支持细胞向内生长(in-growth)和组织再生的能力。此外，组织产品应当具有充当用于细胞(包括干细胞，诸如脂肪来源的干细胞)的生长和支持细胞(包括干细胞，诸如脂肪来源的干细胞)的生长的载体的能力。因此，上文讨论的方法不应当以不可接受的方式(例如，通过破坏蛋白结构和/或去除重要的糖胺聚糖和/或生长因子)改变细胞外基质蛋白。在一些实施方案中，产品将具有正常的胶原带，如通过透射电子显微术所证实的。
在多种实施方案中，组织产品用保留天然透明质酸和硫酸软骨素中的一种或两种的方法处理。因此，组织产品可以包括透明质酸和硫酸软骨素中的一种或两种。此外，可以选择保持天然生长因子的方法。例如，可以产生组织产品，使得组织产品包含一种或更多种生长因子，该生长因子选自PECAM-1、HGF、VEGF、PDGF-BB、卵泡抑素、IL-8和碱性FGF(FGF-basic)。
脂肪组织基质可以富含IV型胶原和VI型胶原。这两种类型的胶原相对于I型胶原之间的比可以不同于真皮基质，这可以是用于在体内区别脂肪基质和真皮基质的重要因素。
本文描述的组织产品可以用于治疗多种不同的解剖部位。例如，如通篇所讨论的，本公开内容的组织产品由脂肪组织基质生产。因此，据信当被植入到某些组织部位时，脂肪组织产品将提供与从其他组织类型产生的材料相比优越的再生能力。在一些情况下，组织产品可以被植入到主要是或明显是脂肪组织的组织部位中。在一些情况下，组织产品可以用作面部填充物，例如，以治疗线条、皱纹、空隙或疤痕(divot)，以增加体积或替换失去的组织。在一些情况下，组织部位可以包括乳房(例如，用于增大、替换切除的组织或围绕植入物放置)。此外，可以选择任何其他含脂肪组织的部位。例如，组织产品可以用于在面部、臀部、腹部、髋、大腿或具有与天然脂肪相似的结构和触感的另外的脂肪组织是期望的任何其他部位的重建或美容用途。在这些部位中的任一个中，组织可以用于减少或消除皱纹、下垂或不期望的形状。
当用于乳房组织替换或增大时，该组织可以提供相对于其他组织产品的优势。例如，尽管一些组织产品允许向内生长和组织形成，但是这些产品可以形成不模仿正常乳房质感和触感的显著纤维化组织，并且在放射学成像上呈现异常。由于本公开内容的组织产品由脂肪形成，它们可以支持脂肪组织的更正常的再生。
此外，组织产品可以用作细胞的载体。例如，产品可以被植入到任何部位中或如上文讨论地使用，但也可以用细胞接种。在一些情况下，细胞可以包括干细胞诸如脂肪来源的干细胞。此外，可以使用其他多能细胞，以及来自任何组织来源(例如，血液、骨髓、胎儿干细胞、脐带血细胞等)的细胞。细胞可以在植入之后或在植入之前接种到组织上。此外，细胞可以在植入之前在组织产品上培养，并且然后植入身体内或身体上。
如所讨论的，颗粒状组织基质产品还可以包括可流动的载体，以有助于组织产品的注射。在多种实施方案中，颗粒状组织基质和可流动的载体被包装在单独的容器中，并且不接触直到混合，然后立即注射。例如，颗粒状组织基质和可流动的载体被包装在多管式注射器的单独的管中，并且在注射内容物之前不久或当注射内容物时被混合。在其他实施方案中，颗粒状组织基质和可流动的载体被预先混合并包装在一起。材料可以被单独干燥或储存在生物相容性缓冲液中，该生物相容性缓冲液保持组织基质和/或载体的生物学性质，防止细菌生长或防止灭菌或储存期间的损伤。
以下实施例用于说明而决不限制本公开内容。
实施例：
A.脂肪组织材料的产生：
为了产生脂肪组织基质材料，首先将猪脂肪组织切成2英寸的条，并且在食品级绞肉机中粗糙地切碎。如果不准备用于进一步加工，则切碎的脂肪组织可以在-80℃冷冻。冷冻的材料可以在室温或4℃解冻过夜。预加工的材料用
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GM300(GRINDOMIX)以2000rpm，并且然后以4000rpm进一步粗糙地研磨，这提供了油与固体基质的相分离。通过离心收获脂肪基质固体并且用缓冲液洗涤。在室温用EDTA-Triton溶液将基质材料脱细胞过夜，在四小时更换一次溶液。基质蛋白再次经受洗涤。在洗涤期间，将基质沉淀物离心以沉淀组织基质并倾析所用的溶液。再次机械研磨悬浮液以进一步破坏基质纤维。在洗涤之后，将基质沉淀物以约～2-3％w/w的固体浓度重悬于20％PBS中。将浆液放置于金属托盘中并冷冻干燥以形成海绵，并且经受DHT处理以将材料稳定化。然后，将稳定化的海绵研磨并筛分，以获得期望的尺寸的颗粒作为可流动的/可注射的猪无细胞组织浆液(PATS)材料。颗粒化的材料被制成5-15％糊剂，并且通过电子束经受最终灭菌。
B.方法产生完整的胶原结构：
用上文所描述的方法产生的组织产品经受用扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)的分析。结果示出，组织产品是包含具有典型的胶原带模式(包括结构、孔隙度等)的胶原材料的多孔支架，如图6中示出的。显微术指示具有正常的带模式的完整胶原。
组织产品进一步经受差示扫描量热法(DSC)。如参考图7A图示的，DSC结果指示组织产品具有在61.5℃的起始熔化温度。在该实例中，组织产品的起始熔化温度与天然组织(例如，未加工的脂肪)相似。
该组织还经受Mason三色染色和胶原酶消化测定。胶原酶消化在如上文所描述地在使用或不使用电子束灭菌的情况下产生的组织上进行。染色和胶原酶消化的结果分别由图7B和图7C描绘。具体地，图7C描绘了根据所公开的实施例在使用或不使用电子束灭菌的情况下产生的脂肪组织的胶原酶消化曲线。在不使用电子束灭菌，并且仅使用DHT稳定化的情况下，随着消化的小时变化的剩余的固体的百分比在八小时之后下降至约18％。在使用电子束灭菌连同DHT稳定化的情况下，剩余的固体的百分比在相同的消化时间段之后接近约25％，略微高于仅DHT。
继续参考图7B和图7C，该材料具有三色染色，指示三色切片上的正常胶原以及即使在通过电子束最终灭菌之后未改变的胶原酶敏感性。通常，当胶原被三色染色时，正常的胶原应当显示为蓝色，而没有红色。总之，显微术、DSC、染色和胶原酶消化指示保存的胶原。
C.所描述的方法在去除支架中的细胞、细胞残留物和油方面是有效的：
如所描述地产生的样品还经受苏木精和伊红染色(“H&E”)(如图8A中描绘的)，并经受DNA和脂质含量分析(如图8B中描绘的)，并且经受MHC I和II组分的免疫染色(示出了组织基质相对于天然脂肪对照)(如图8C中描绘的)。在H&E组织学上，组织产品示出多孔结构，没有细胞迹象。与该观察结果一致，组织产品具有显著低的残余DNA和游离油。通过免疫染色，组织产品对MHC-1&II染色是阴性的，表明所描述的方法在脱细胞化中是有效的。
D.组织产品保留天然脂肪的主要基质组分：
组织经受包括I型、III型和IV型的主要细胞外基质蛋白的免疫组织学分析。参考图9，脂肪组织产品(下排)保留了天然脂肪基质(上排)的原始特性。
E.组织产品支持多种组织细胞生长：
选择了三种不同的细胞类型来测试组织产品海绵是否具有支持脂肪组织、脉管系统和其他结缔组织如真皮组织的生长的潜力。具体地，测试了成脂间充质干细胞、内皮细胞和真皮成纤维细胞，其全部是从正常人类个体分离的原代细胞。组织产品用从这些组织分离的细胞接种，并培养持续1天、7天和16天。细胞生长用细胞增殖测定试剂盒定量。使用
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细胞增殖测定试剂盒，使用荧光染料通过DNA含量来对细胞增殖进行定量。分析组织产品的细胞生长。参考图10，将接种了细胞的支架用活-死染色溶液染色，并且在荧光显微术下观察细胞的生存力和生长。组织产品在体外支持所有三种类型的细胞生长。
F.组织产品保留体积和在体内支持的脂肪形成：
产品的生物学性能在皮下裸鼠模型中测试。如图11中示出的，该研究被设计成测试产品的不同制剂。
如实施例A中所描述地制造的产品被分组成五个不同的尺寸范围：组1：2.8-3.4mm；组2：0.8-1.0mm；组3：0.4-0.6mm；组4：0.05-0.1mm；和组5，0.1-1mm。第六组，组6实质上包括浆液和纤维，所述浆液和纤维是在脱细胞化方法之后直接获得的材料，没有进行冷冻干燥和后续步骤。将组6用作对照，用于与如在组1-5中的具有DHT稳定化的3D微孔结构的组织产品进行比较。组7包括通过类似的方法但由真皮无细胞组织基质制备的海绵。真皮组织是
Figure BDA0002442444410000211
组1-5首先在生理盐水中以按重量计10％固体含量水合，以制备可注射的糊剂，并且组6也被类似地调节至10％固体含量。组7是来自真皮海绵的5mm厚的10mm的片(punch)，并在PBS中水合。将每种可注射的脂肪材料(组1-6)的约0.5cc的等分试样和组7的10mm的片植入裸鼠的皮下区域，每组一式三份。
在第四周，收获外植体用于大体观察，并且使外植体经受组织学分析。图11图示了在裸鼠中皮下植入之后可注射的脂肪组织基质的外植体的大体观察。虚线指示植入的材料。所有外植体当被触诊时是柔软的。所有颗粒尺寸范围的可注射的脂肪持续至少4周。还观察到(数据未示出)具有特定颗粒尺寸的可注射的脂肪植入物良好地持续至少12周。
图12图示了在较低的放大率的外植体的另外的Masson三色染色。对于由稳定化的PATS海绵制备的组1-4，观察到伴随组织向内生长的强健的成脂响应(adipogenicresponse)。相比之下，缺少任何3D结构(即没有冷冻干燥和稳定化)的组6的脂肪组织基质浆液没有引起成脂响应(c)。
此外，如图12中示出的，组7还图示了当植入相同裸鼠模型的皮下空间时完整的海绵状猪真皮组织支架。Masson三色染色揭示了真皮支架中没有脂肪组织再生，尽管体积被保留。
还持续8周评价了代表性的可注射的脂肪基质产品连同组6的浆液的体积保留(组1：2.8-3.4mm；组2：0.8-1.0mm；组5：0.1-1.0mm)，如图13中图示的。组1、组2和组5(其全部是具有多孔微结构的颗粒)当与植入的体积相比时保留了超过84％的外植体体积长达八周。
对于组3：0.4-0.6mm和组4：0.05-0.1mm，将预期相似的结果，因为在4周这些组具有与组1、组2和组5相似的生物学响应。微观上，0.4-0.6mm颗粒具有的多孔微结构类似于组1、组2和组5的多孔微结构。尽管0.05-0.1mm颗粒太小而不具有完整的微孔，但是由于具有DHT的稳定化材料，大多数颗粒具有分支并且当彼此接触时可以形成相似的孔(数据未示出)，这与组6中的浆液材料根本上不同。相比之下，没有微孔结构的浆液形式的脂肪组织(例如，组6)的植入物难以找到或当触诊时非常平坦；因此，表明严重的植入物体积损失。外植体的重量随时间降低，并且在8周结束时仅剩余～38％，表明严重的植入物体积损失。
图14A-14C是来自组2的外植体的放大的Masson三色染色切片，示出了良好的脂肪形成。脂肪细胞是丰富且大的白色区域；并且血管形成是明显的。组5样品存在相似的组织学发现(图中未图示)。
总之，结果表明，测试的所有尺寸(例如，50μm-3.4mm)的脂肪组织基质颗粒保持体积(如图11和图13中图示的)，并且具有良好的细胞浸润和血管再生响应，直到8周，图12仅示出了四周时数据。然而，如通过图12中组6示出的，在对照组6中，在植入物中观察到来自用相同方法制备的相同材料，但没有经受冷冻干燥和DHT稳定化的浆液不具有脂肪组织向内生长响应。因此，结果表明微孔状的孔结构在脂肪形成期间可能是重要或显著的，因为组6缺少孔结构。此外，组6在8周结束时遭受明显的体积损失(图13)，这进一步表明组织产品的DHT稳定化对于体内的体积保留是重要的。此外，脂肪组织向内生长对脂肪基质是特异性的，并且如图12的组7中图示的，不存在于在使用相似方法用真皮无细胞基质制备的完整的海绵状支架中。
G.使用透明质酸(HA)作为载体增加脂肪组织产品的可注射性：
图15提供了与储存持续1.5年的组织基质相比，新鲜脂肪组织基质的图像，两者都如实施例A中描述地制备。图像以多种放大率提供。如图示的，湿形式的脂肪组织基质材料在储存1.5年之后包含10％的固体形成的聚集体。生物学测试表明，聚集不影响材料的生物学性能，诸如体积保留和裸鼠的皮下区域中的脂肪组织向内生长。然而，对于在临床环境的非侵入性递送，10％脂肪组织产品可能需要载体来促进可注射性。
为了促进脂肪组织材料的可注射性，将20mg/mL的非交联的透明质酸(HA)载体与新鲜制备的脂肪组织基质(10％，0.1-1.0mm)或1.5年的脂肪组织基质(10％，0.1-1mm)混合。混合材料中HA添加剂的最终浓度为2mg/mL。注射具有或不具有HA添加剂的脂肪材料所需的压缩载荷(N)在Instron型号5865材料测试仪(Instron Corporation,Norwood,MA)上评价。不具有HA的脂肪材料通过16G针或18G针注射，且具有HA添加剂的脂肪材料通过18G针注射。计算并绘制了对于具有或不具有HA添加剂的产品(n＝3)随时间的平均压缩力。
如表2中描绘的，在不具有HA作为载体的情况下，使用16G针注射新鲜的脂肪材料是流畅的，但是1.5年的脂肪遇到明显的阻力。在添加HA作为载体后，新鲜的脂肪材料和1.5年的材料两者变为可注射的。
表2
Figure BDA0002442444410000231
如图16描绘的，在没有HA作为载体的情况下，通过18G针以0.15mm/秒和0.25mm/秒两者的速度注射新鲜制备的脂肪材料遇到明显的阻力，而即使以0.25mm/秒的速度注射具有2mg/mL HA添加剂(最终浓度)的产品变得非常流畅。
为了评价脂肪产品与HA添加剂的混合物的生物学性能，将1:10的比的20mg/mL交联的透明质酸(4型HA)和脂肪组织基质(10％)混合，并且将混合物注射到裸鼠的皮下区域。在注射之后4周收获HA-脂肪产品混合物的外植体，并且如图17描绘的，在外植体中观察到强健的脂肪组织向内生长。
虽然本文中参考用于特定应用的说明性实施方案描述了本公开内容的原理，但是应当理解，本公开内容不限于此。本领域普通技术人员和得到本文提供的教导的人员将认识到另外的修改、应用、实施方案和等效物的替换落入本文描述的实施方案的范围内。因此，本发明不应被认为受前述描述的限制。

Claims (31)

1.一种用于产生组织产品的方法，所述方法包括：
选择脂肪组织；
机械加工所述脂肪组织以减小组织尺寸；
处理经机械加工的组织以从所述组织去除大体上全部的细胞物质；
将所述组织悬浮在溶液中以形成悬浮液；
处理所述悬浮液以产生具有微孔结构的稳定化的三维结构；以及
机械加工所述稳定化的三维结构以产生颗粒。
2.如权利要求1所述的方法，其中处理所述悬浮液以产生稳定化的三维结构包括干燥所述悬浮液。
3.如权利要求2所述的方法，其中干燥包括冷冻干燥。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中处理所述悬浮液以产生稳定化的三维结构包括交联所述组织。
5.如权利要求4所述的方法，其中交联包括用化学品、光活化的交联方法或加热中的至少一种处理。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述化学品包括戊二醛、京尼平、碳二亚胺和二异氰酸酯中的至少一种。
7.如权利要求4所述的方法，其中交联包括加热所述组织。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述组织在真空中被加热。
9.如权利要求4或7中任一项所述的方法，其中所述组织被加热至70℃至120℃。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述稳定化的三维结构当与水性环境接触时维持其微孔结构。
11.如权利要求10所述的方法，其中当被植入身体内时材料维持稳定的三维结构。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中机械加工所述稳定化的三维结构以产生颗粒包括产生一组包含在50微米至4mm之间的最长尺寸的颗粒。
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中机械加工所述稳定化的三维结构以产生颗粒包括产生一组包含在1.5mm至4mm之间的最长尺寸的颗粒。
14.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中机械加工所述稳定化的三维结构以产生颗粒包括产生一组包含在2mm至3.5mm之间的最长尺寸的颗粒。
15.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中机械加工所述稳定化的三维结构以产生颗粒包括产生一组包含在2mm至3mm之间的最长尺寸的颗粒。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中机械加工所述稳定化的三维结构以产生颗粒包括产生一组具有从所述稳定化的三维结构保留的微孔结构的颗粒。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述颗粒水合。
18.如权利要求17所述的方法，其中使所述颗粒水合包括将所述颗粒与一定质量的水性溶液组合，使得所述颗粒和水性溶液形成按重量计在5％和20％之间的颗粒的组合物。
19.如权利要求18所述的方法，其中使所述颗粒水合包括将所述颗粒与一定质量的水性溶液组合，使得所述颗粒和水性溶液形成按重量计在5％和12％之间的颗粒的组合物。
20.一种组织产品，所述组织产品通过如权利要求1-19中任一项所述的方法制备。
21.一种组织产品组合物，所述组织产品组合物包含：
颗粒状组织基质，其中所述组织产品组合物包含已经被形成为多孔海绵并且然后形成为颗粒的脂肪无细胞组织基质，并且其中所述颗粒状组织基质包含具有在约0.05mm和3mm之间的最长尺寸的颗粒。
22.如权利要求21所述的组织产品组合物，其中所述颗粒包含来源于所述多孔海绵的微孔结构。
23.如权利要求21-22中任一项所述的组织产品组合物，其中所述颗粒是干燥的。
24.如权利要求21-22中任一项所述的组织产品组合物，所述组织产品组合物还包含可流动的载体。
25.如权利要求24所述的组织产品组合物，其中所述可流动的载体包含水性流体。
26.如权利要求25所述的组织产品组合物，其中所述可流动的载体包含盐水。
27.如权利要求25或26所述的组织产品，其中所述组合物包含按重量计在80％-95％之间的水。
28.如权利要求25或26所述的组织产品，其中所述组合物包含按重量计在5％和15％之间的脂肪组织基质蛋白。
29.如权利要求24-26中任一项所述的组织产品，其中所述可流动的载体是可流动的透明质酸载体。
30.如权利要求29所述的组织产品，其中所述透明质酸是非交联的。
31.如权利要求29所述的组织产品，其中所述透明质酸是交联的。
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