CN111187340A - 阳离子α-螺旋聚多肽 - Google Patents

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CN111187340A CN202010065093.1A CN202010065093A CN111187340A CN 111187340 A CN111187340 A CN 111187340A CN 202010065093 A CN202010065093 A CN 202010065093A CN 111187340 A CN111187340 A CN 111187340A
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Abstract

阳离子α‑螺旋聚多肽。提供了一种阳离子α‑螺旋聚多肽，所述聚多肽具有：(1)α‑螺旋多肽主链，(2)侧接于所述多肽主链的亲水性基团，和(3)侧接于所述多肽主链的下式(I)表示的疏水性基团，式中：n表示0‑20的整数，R1表示具有1‑20个碳原子的、卤代或未卤代的烷基。
Figure DDA0002375725820000011

Description

阳离子α-螺旋聚多肽
技术领域
本申请涉及阳离子α-螺旋聚多肽，更具体涉及用于细胞膜和/或粘液层穿透的阳离子α-螺旋聚多肽。
背景技术
基因治疗是近些年来被广泛研究的治疗疾病的方法。典型的基因材料包括DNA、mRNA、siRNA以及miRNA等。成功的基因治疗需要合适的基因载体将基因高效的递送到细胞内。常见的基因递送载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒基因载体具有较高的转染效率，但是其安全性却是一个不可忽视的问题。非病毒基因载体包括阳离子聚合物和脂质体等。阳离子聚合物具有丰富的正电荷，同核酸分子有着很好的复合能力，已经被证实具有基因转染效果。但是，大部分的阳离子聚合物却很难从内含体中逃逸出来，因此，它的基因转染效果较差。
多肽作为基因载体，由于其生物相容性高，近年来备受关注。如组氨酸(Biochimica EtBiophysica Acta-Biomembranes,2006,1758:301-307)、赖氨酸(Biochemical and Biophysical Research Communications,2007,357:511-516)和精氨酸(Bioconjugate Chemistry,2001,12:1005-1011；Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research,2003,1640:129-136)构成的多肽均可用作为基因的载体。在多肽作为基因载体的设计中，赖氨酸与组氨酸用来与DNA结合，而组氨酸可用作内涵体释放DNA。多肽序列中还可引入半胱氨酸，在多肽/DNA复合体中，半胱氨酸中的二硫键可发生交联反应，有效增加复合体稳定性。此外，Niidome等(Biomaterials,2000,21:1811-1819)设计了两亲性阳离子多肽KALA作为基因载体，该多肽分子可以形成alpha螺旋结构，能有效穿过细胞膜提高基因表达效率。专利申请CN101235384A公布了一种新型非病毒阳离子型基因载体的制备方法；专利申请CN1844170A公布了一种温敏聚异丙基丙烯酰胺-聚赖氨酸缀合物转基因载体的制备；专利申请CN1462763A公布了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒与制备方法及作为基因载体的应用；专利申请US7112442和US6387700公布了由色氨酸、半胱氨酸和赖氨酸组成的多肽作为基因的载体材料。
和众多的阳离子载体一样，阳离子α-螺旋聚多肽同样具有丰富的正电荷。但同传统的阳离子聚合物不同，聚多肽的α-螺旋构象使得其具有刚性的棒状结构。因此阳离子聚合物可以在细胞膜上“打孔”，避免被内涵体所“捕获”，从而使得材料的转染效率大大提高。在基因递送的过程中，有两道主要的屏障。除了上述的细胞膜以外，黏液层也是常常面对的屏障之一。尽管阳离子α-螺旋聚多肽具有高效的穿膜能力，但在穿透黏液层的过程中会吸附黏液层中带有负电的蛋白，从而使得阳离子聚多肽不稳定，导致转染失败。
本领域急需一种新的阳离子α-螺旋聚多肽，其能克服上述问题，用于有效穿透细胞膜和/或黏液层。
发明内容
本申请的发明人发现，通过对阳离子α-螺旋聚多肽进行特定的官能化，就能解决上述问题，例如有效穿透细胞膜和/或黏液层。
基于上述发现，本申请提供了一种阳离子α-螺旋聚多肽，所述聚多肽具有：(1)α-螺旋多肽主链，(2)侧接于所述多肽主链的亲水性基团，和(3)侧接于所述多肽主链的下式(I)表示的疏水性基团：
Figure BDA0002375725800000021
式中：n表示0-20的整数，R1表示具有1-20个碳原子的、卤代或未卤代的烷基。
附图说明
图1描述了实施例1中γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体(POBLG-NCA)的核磁图谱。
图2描述了实施例2中聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸苄酯)(PPOBLG)的核磁图谱。
图3描述了实施例2中3F-N3的核磁图谱。
图4描述了实施例3中7F-N3的核磁图谱。
图5-9描述了实施例4中水溶性阳离子α-螺旋聚多肽的核磁图谱。
图10描述了对比例1中水溶性阳离子α-螺旋聚多肽的核磁图谱。
图11描述了对比例2中水溶性阳离子α-螺旋聚多肽的核磁图谱。
图12描述了实施例5中的纳米复合物在RAW264.7细胞上的细胞毒性测试图。
图13描述了实施例5中的纳米复合物在RAW264.7细胞上的细胞摄取水平图。
图14描述了实施例5中的纳米复合物在RAW264.7细胞上的流式图。
图15描述了实施例5中纳米复合物在RAW264.7细胞中的内含体/溶酶体逃逸情况图。
图16描述了实施例5中的纳米复合物在RAW264.7细胞上的ELISA实验结果图。
图17描述了实施例6中的纳米复合物在体外上皮细胞穿透能力的实验图。
图18描述了实施例6中的纳米复合物在CF粘液中的多粒子追踪实验图。
图19描述了实施例6中的纳米复合物同0.3％和0.5％的黏蛋白的相互作用结果图。
图20描述了实施例6中的纳米复合物在CF粘液中的荧光共振能量转移实验图。
图21描述了实施例6中的纳米复合物在在小鼠肺组织中的western blot结果图。
图22为通过ELISA实验测定的给药后小鼠肺组织中TNF-α和IL-6的表达水平图。
图23为通过PCR实验测定的小鼠肺组织中TNF-α的表达水平图。
图24为给药后小鼠肺组织中的MPO表达水平图。
图25为给药前后小鼠肺组织的湿/干重比图。
图26为给药前后动脉血中的离子浓度及气体分压的变化图。
图27为给药前后小鼠肺组织的HE染色图。
具体实施方式
在本文中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。
在本文中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
在本文中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
在本文中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
在本文中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。
在本文中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。
在本文中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
在本文中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。
在本文中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。
如果没有特别指出，本文所述的百分数(包括重量百分数)的基准都是所述组合物的总重量。
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。
如果没有特别指出，本文所述的“残基”表示化合物或单体在反应之后形成的产物(例如聚合物)中的相应部分。
在本文中，除非有其他说明，“氨基酸”一般包括氨基酸及其衍生物。
本申请一方面提供了一种阳离子α-螺旋聚多肽，所述聚多肽具有：(1)α-螺旋多肽主链，(2)侧接于所述多肽主链的亲水性基团，和(3)侧接于所述多肽主链的下式(I)表示的疏水性基团：
Figure BDA0002375725800000051
式中：n表示0-20的整数，R1表示具有1-20个碳原子的、卤代或未卤代的烷基。
α-螺旋多肽主链
所述多肽主链可以衍射自天然氨基酸序列，也可以通过人工合成的氨基酸序列。通常，所述多肽主链包括10-300个氨基酸的残基，优选20-300个氨基酸的氨基，更优选20-200个氨基酸的残基，还要更优选50-200个氨基酸的残基。
所述氨基酸可以是天然存在的氨基酸，也可以是人工合成的氨基酸。在本申请的一个优选实例中，所述氨基酸是天然存在的氨基酸及其衍生物，例如丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、色氨酸等、及其衍生物。在本申请的另一个优选实例中，所述氨基酸是谷氨酸、谷氨酰胺、及其衍生物。
所述多肽主链可包括一种或多种氨基酸的残基。在本申请的一个优选实例中，所述多肽主链包括一种氨基酸的残基。在本申请的另一个优选实例中，所述多肽主链包括两种、三种或四种氨基酸的残基。在本申请的另一个优选实例中，所述多肽主链包括谷氨酸和/或谷氨酰胺的残基，优选地，所述多肽主链还可包括其他氨基酸(例如精氨酸、色氨酸、赖氨酸等等)的残基。
在本申请的一个实例中，所述多肽主链包括聚谷氨酸及其衍生物。所述聚谷氨酸的衍生物包括但不限于聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸苄酯)(PPOBLG)、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)(PBLG)、聚(L-谷氨酸-γ-炔丙酯)(PPLG)、聚(γ-3-氯丙基-L-谷氨酸酯)(PCPLG)、聚(γ-3-氯己基-L-谷氨酸酯)(PCHLG)。
由氨基酸形成α-螺旋多肽主链的方法是本领域已知的。例如可参见CN104211751A(其全文以引用的方式插入于此)。
侧接于所述多肽主链的亲水性基团
所述亲水性基团可以是本领域常用的任何亲水性基团。在本申请的一个实例中，所述亲水性基团具有胍基部分、胺基部分或季铵基部分。
在本申请的一个实例中，所述亲水性基团可由下式表示：
Figure BDA0002375725800000061
式中：X表示连接基团；R2、R3和R4各自表示氢或非氢取代基，其中R2、R3和R4中至少一个不为氢。
在一个实例中，X表示具有1-20个碳原子的亚烃基(例如具有1-20个碳原子的亚烷基，优选具有1-10个碳原子的亚烷基，更优选具有1-4个碳原子的亚烷基)、羧酸酯基、醚基或单键。在另一个实例中，R2、R3和R4各自表示非氢取代基(例如具有1-20个碳原子的烷基，优选具有1-10个碳原子的烷基，更优选具有1-4个碳原子的烷基)。
在本申请的另一个优选实例中，所述亲水性基团选自下式：
Figure BDA0002375725800000062
Figure BDA0002375725800000071
在本申请的一个实例中，所述亲水性基团的接枝率为0.01-0.99，优选0.1-0.9，更优选0.2-0.8，还要更优选为0.3-0.6。
接枝率的计算方法是通过核磁共振氢谱的积分面积所得，接枝率(％)＝1-(Hn/2)/[(Hd+Hg)/4]。其中，Hn指的是化学位移在2.90-3.10ppm处的积分面积，Hd和Hg指的化学位移4.70-5.10ppm处的积分面积。
侧接于所述多肽主链的疏水性基团
侧接于所述多肽主链的疏水性基团可由下式表示：
Figure BDA0002375725800000072
式中：n表示0-20的整数，R1表示具有1-20个碳原子的、卤代或未卤代的烷基。
在一个优选实例中，n表示1-10的整数，更优选2-8的整数。
在一个优选实例中，R1表示具有1-10个碳原子的、卤代或未卤代的烷基，优选具有1-8个碳原子的、卤代或未卤代的烷基。在另一个优选的实例中，所述卤代是氟代、氯代、溴代或碘代。
在本申请的一个实例中，所述疏水性基团的接枝率为0.01-0.99，优选0.01-0.8，更优选0.01-0.6，还要更优选为0.01-0.5。
接枝率的计算方法是通过核磁共振氢谱的积分面积所得，接枝率(％)＝1-(Hn/2)/[(Hd+Hg)/4]。其中，Hn指的是化学位移在2.90-3.10ppm处的积分面积，Hd和Hg指的化学位移4.70-5.10ppm处的积分面积。
优选地，本申请的阳离子α-螺旋聚多肽可具有下式结构：
Figure BDA0002375725800000073
Figure BDA0002375725800000081
式中，R5表示本申请所述的亲水性基团；R6表示本申请所述的疏水性基团。
式中，n表示聚多肽的聚合度(优选1—300的整数)；x表示疏水性侧基的接枝率(例如0.01-0.99，优选0.01-0.8，更优选0.01-0.6，还要更优选为0.01-0.5)；y表示侧链碳原子的个数(例如0-20的整数，优选1-15的整数，更优选1-10的整数，还要更优选1-6的整数)。
根据上述水溶性阳离子α-螺旋聚多肽的亲疏水侧基种类以及接枝率不同，我们将该聚多肽简称为PmFx或PmHx，其中m代表疏水侧基上氟或者氢原子的个数，例如m＝1-20的整数(例如3,5,7,9,11等)。x代表疏水侧基(包括含氟链或者烷基链)的接枝率，例如x＝0-0.8(例如0,0.06,0.07,0.16,0.18,0.31,0.34等)中的非零数字。例如，如果接枝率为0.06，则x＝6；接枝率为0.16，则x＝16，依此类推。
制备本申请所述阳离子α-螺旋聚多肽的方法是常规的。例如本参考本领域中的现有技术(“Efficient Gene Delivery Mediated by a Helical Polypeptide:Controllingthe Membrane Activity via Multivalency and Light-Assisted PhotochemicalInternalization(PCI)”，Xin Xu,etc.,ACS Appl.Mater.Interfaces 2018,10,256-266；"The effect of side-chain functionality and hydrophobicity on the genedelivery capabilities of cationic helical polypeptides",Rujing Zhang etc.,Biomaterials 35(2014)3443e3454)。以下反应流程例举了部分本申请所述阳离子α-螺旋聚多肽的制备：
Figure BDA0002375725800000091
Figure BDA0002375725800000101
优选地，在上述反应流程中，侧基含三键的聚多肽PPOBLG同侧基含叠氮的阳离子和含氟小分子通过点击化学反应制备而成。
本申请所述的水溶性阳离子α-螺旋聚多肽可以和核酸药物通过电荷相互作用复合形成纳米复合物。因此，本申请另一方面提供了一种纳米药物，包括阳离子α-螺旋聚多肽和核酸药物。
本申请还公开了一种纳米药物的制备方法，其包括：将本申请所述水溶性阳离子α-螺旋聚多肽溶于水中形成溶液，然后与核酸药物溶液混合，得到纳米药物。
上述技术方案中，所述核酸药物选自DNA；siRNA；mRNA；miRNA以及核酸适配体等。本申请所述的阳离子α-螺旋聚多肽与核酸药物的质量比为(2-20)：1，优选的质量比为(10-20)：1，更优选的质量比为15：1。
本申请还公开了上述水溶性阳离子α-螺旋聚多肽在制备核酸药物载体中的用途。
本申请进一步公开了上述水溶性阳离子α-螺旋聚多肽或者纳米药物在制备基因药物中的应用。
本发明的优势在于，该阳离子聚合物具有α-螺旋构象以及丰富的正电荷，能够很好的复合核酸药物(例如siRNA)形成稳定的纳米复合物，并且可以很好的穿透细胞膜和/或黏液层(例如肺部、眼部、肠道、阴道、鼻子等等)。在例如肺部基因递送的过程中，所述纳米复合物可同时具有穿透黏液层和细胞膜两道屏障的能力，该纳米复合物的转染效果以及治疗效果同常规阳离子聚多肽相比，也有了显著的提高。
实施例
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例中：
L-谷氨酸、醋酸铜、对羟基苯甲醇、溴化亚铜、五甲基二亚乙基三胺、丁酸酐、脂多糖等购买于阿拉丁试剂。
三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐、九氟烷基磺酸酐、18-冠醚-6、溴丙炔、三光气、4-二甲氨基吡啶、6-氯-1-己醇等购买于安耐吉化学。
所有使用玻璃仪器购买于欣维尔。
分析天平购买于Sartorius(型号：BSA224S)。
离心机购买于Thermo SCIENTIFIC(型号：MULTIFUGE X1R)。
磁力搅拌器购买于IKA(型号：RH digital)。
旋转蒸发仪购买于IKA(型号：RV10)。
PrimeScript RT kit以及SYBR Premix Ex Taq kit购买于宝日医(北京，中国)。
ELISA kits购买于Invitrogen(Carlsbad,CA)。
MPO kit购买于eBioscience(San Diego,CA,USA)。
TNF-αsiRNA(siTNF-α),阴性对照siRNA(siNC)购买于吉玛基因(上海，中国)。
实施例1
将L-谷氨酸(14.7g,100mmol)溶于水(375mL)中，并搅拌加热至70℃后溶解。将醋酸铜(18.6g,103mmol)的水溶液(375mL)逐滴的加入到L-谷氨酸溶液中。室温下反应48小时后抽滤，分别用水、乙醇和乙醚洗2次，得到蓝色固体，即L-谷氨酸铜盐(Ⅱ)络合物，真空干燥后备用。
将对羟基苯甲醇(9.3g,0.075mol)溶于丙酮(150mL)中，加入碳酸钾(15.2g,0.11mol)和18-冠醚-6(0.01g)，并向溶液中缓慢加入溴丙炔(6.75mL,0.09mol)。溶液在75℃回流反应12小时后，抽滤除去不溶物，通过旋转蒸发仪除去丙酮。用二氯甲烷(80mL)溶解粗产物，用15％氢氧化钠(50mL*3)和饱和氯化钠(50mL*2)洗涤有机相后，加入无水硫酸钠进行干燥。溶液过滤并旋蒸后得到化合物1。
Figure BDA0002375725800000121
将化合物1(8.5g,52mmol)溶解于二氯甲烷中，在冰浴条件下缓慢滴加氯化亚砜(6mL,68mmol)，随后在室温下搅拌反应3.5小时。反应完毕后，加入水(100mL)淬灭剩余的氯化亚砜，并用饱和氯化钠(50mL*3)洗涤有机相。加入硫酸钠干燥有机相后，过滤并旋蒸除去二氯甲烷得到化合物2。
Figure BDA0002375725800000131
将L-谷氨酸铜盐(Ⅱ)络合物(3.29g,6.7mmol)和L-谷氨酸(1.99g,13.4mmol)加入DMF(12mL)和水(2mL)的混合溶液中，并缓慢加入四甲基胍(3.4mL,27mmol)，室温搅拌2小时直至固体溶解。随后一次性加入DMF(10mL)和化合物2(6.5g,36mmol)，在40℃下避光搅拌反应48小时。接着加入丙酮(200mL)，在室温下搅拌过夜后，离心得到粗产物(5000rpm,5min,25℃)。粗产物用丙酮洗涤4次(直至上清无黄色)，新配制的EDTA二钠盐洗涤4次，抽滤，真空干燥得最终产物化合物3。
Figure BDA0002375725800000132
将化合物3(1.15g,4.0mmol)溶于无水四氢呋喃(25mL)中，随后加入三光气(0.52g)，并在40℃下反应3小时。用旋转蒸发仪除去溶剂，粗产物进行柱分离(乙酸乙酯为洗脱剂)和重结晶3次(乙酸乙酯:正己烷＝1:5)得到γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体(POBLG-NCA)，其核磁谱图见图1。
Figure BDA0002375725800000133
在手套箱中，将γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体(0.86g,2.71mmol)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，加入正丁胺/无水N,N-二甲基甲酰胺引发剂(CI＝0.1mol·L-1,271μL,0.027mmol)，室温搅拌反应72小时至反应完全。随后将反应液逐滴加入去离子水(80mL)中使沉淀，抽滤得到聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸苄酯)(PPOBLG)，为其核磁谱图见图2。
Figure BDA0002375725800000141
聚多肽的分子量及分子量分布通过凝胶渗透色谱(Agilent Technology,SantaClara,CA,USA)测得的，测试温度设置为60℃，测试样品浓度为5毫克/毫升，流速设置为1毫升/分钟，测试所用流动相为含0.05摩尔/升溴化锂的N,N-二甲基甲酰胺溶液。测得的聚合物的聚合度为130，分子量分布宽度为1.10。
聚多肽的构象是通过圆二色谱测得的，仪器型号为JASCO J-700CD光谱仪。将水溶性聚多肽溶于去离子水中，配制成浓度为0.2毫克/毫升的溶液，将该溶液置于路径长度为1mm的石英池中测定吸收曲线，并根据公式计算出每种多肽的平均残留摩尔摩尔椭圆率：椭圆率([θ]单位为deg·cm2·dmol-1)＝(毫度×重复单元分子量)/(以毫米为单位的路径长度×聚合物浓度)。聚多肽的螺旋度根据以下公式计算：螺旋度＝(-[θ222]+3,000/39,000,[θ]222表示圆二色谱图上横坐标为222nm处的纵坐标的值。测得的聚多肽的螺旋度范围为50-75％，且当含氟的侧基相同时，聚多肽的螺旋度随着含氟量的增加而减小，当聚合物上含氟量相同时，聚多肽的螺旋度随着氟原子的个数增加而增加。
实施例2
将6-氯-1-己醇(1g,7.32mmol)，三氟乙酸酐(2g,9.51mmol)，吡啶(1.74g,21.96mmol)和4-二甲氨基吡啶(60mg,0.488mmol)在冰浴条件下混合，室温反应84小时。将混合物溶于二氯甲烷(50mL)，分别用饱和氯化钠(50mL×1)、1N盐酸(50mL×4)、饱和氯化钠(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到化合物9。
Figure BDA0002375725800000142
将化合物9(0.8g,3.44mmol)，叠氮化钠(1.12g,17.19mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，60℃下反应48小时。反应结束后，将混合物溶于正己烷(50mL)中，用饱和氯化钠(50mL×4)洗涤除去无机盐和N,N-二甲基甲酰胺。无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发仪除去溶剂，得化合物10(3F-N3)，其核磁谱图见图3。
Figure BDA0002375725800000151
另外，5F-N3用同样的方法制备而得。
Figure BDA0002375725800000152
实施例3
将6-氯-1-己醇(1g,7.32mmol)，七氟丁酸酐(3.60g,8.78mmol)，吡啶(1.74g,21.96mmol)和4-二甲氨基吡啶(60mg,0.488mmol)在冰浴条件下混合，室温反应84小时。将混合物溶于二氯甲烷(50mL)，分别用饱和氯化钠(50mL×1)、1N盐酸(50mL×4)、饱和氯化钠(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，用旋转蒸发仪除去溶剂。为了进一步除去过量的七氟丁酸酐，将粗产物溶于20mL的去离子水中，在60℃下反应1小时使酸酐彻底水解，将反应液溶于二氯甲烷(50mL)，分别用饱和碳酸氢钠(50mL×2)和饱和氯化钠(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，用旋转蒸发仪蒸除溶剂得到化合物11
Figure BDA0002375725800000153
将化合物11(1.87g,3.44mmol)，叠氮化钠(1.12g,17.19mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，60℃下反应48小时。反应结束后，将混合物溶于正己烷(50mL)中，用饱和氯化钠(50mL×4)洗涤除去无机盐和N,N-二甲基甲酰胺。无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发仪除去溶剂，得化合物12(7F-N3)，其核磁谱图为图4。
Figure BDA0002375725800000161
另外，7H-N3用同样的方法制备而得。
Figure BDA0002375725800000162
实施例4
以含氟聚多肽P7F7的合成为例，在手套箱中，将聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸苄酯)(PPOBLG)(20mg,0.073mmol)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，加入N3-6-G(13.31mg,0.068mmol)、化合物12(7F-N3)(2.73mg,0.005mmol)，N,N,N',N',N”-五甲基二亚乙基三胺(34μL)和溴化亚铜(18mg)，反应在室温下搅拌24小时。反应结束后，打开瓶盖使体系暴露在空气中以终止反应，加入1N盐酸溶液(3mL)，在水中透析3天(透析袋分子量为3.5kDa)后冻干得到水溶性阳离子α-螺旋聚多肽，其核磁谱图为图5。
Figure BDA0002375725800000163
其他的水溶性阳离子α-螺旋聚多肽P3F7、P3F16、P3F31、P5F6、P5F16、P5F34、P7F18、P7F34用相同的方法制备，其核磁谱图为图6-9。
对比例1
在手套箱中，将聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸苄酯)(PPOBLG)(20mg,0.073mmol)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，加入N3-6-G(26.62mg,0.136mmol)、N,N,N',N,'N”-五甲基二亚乙基三胺(34μL)和溴化亚铜(18mg)，反应在室温下搅拌24小时。反应结束后，打开瓶盖使体系暴露在空气中以终止反应，加入1N盐酸溶液(3mL)，在水中透析3天(透析袋分子量为3.5kDa)后冻干得到水溶性阳离子α-螺旋聚多肽PG1，其核磁谱图为图10。
Figure BDA0002375725800000171
对比例2
将聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸苄酯)(PPOBLG)(20mg,0.073mmol)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，加入N3-6-G(13.31mg,0.068mmol)、7H-N3(1.07mg,0.005mmol)，N,N,N',N',N”-五甲基二亚乙基三胺(34μL)和溴化亚铜(18mg)，反应在室温下搅拌24小时。反应结束后，打开瓶盖使体系暴露在空气中以终止反应，加入1N盐酸溶液(3mL)，在水中透析3天(透析袋分子量为3.5kDa)后冻干得到水溶性阳离子α-螺旋聚多肽P7H7，其核磁谱图为图11。
Figure BDA0002375725800000172
实施例5
以实施例4、对比例1和2的水溶性阳离子α-螺旋聚多肽分别同siRNA复合，制备一种纳米药物。配制浓度为1mg/mL的聚多肽溶液和浓度为0.1mg/mL的siRNA溶液，将两者按照质量比(15：1)混合后，涡旋15s，37℃孵育30分钟后得到纳米复合物。
将RAW264.7细胞以每孔1×104个接种到96孔板内，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后培养基替换成无血清的DMEM。将上述纳米复合物(质量比为15/1)按照每孔0.1μg siNC加入到孔中，孵育4小时。最后将无血清的DMEM换成含血清的DMEM继续孵育20小时。用MTT测定法测定细胞的活力，以无任何处理的细胞作为参照，结果表示为对照细胞的百分比。结果见图12。结果表明所有的纳米复合物对细胞的毒性作用均很小。PEI是一个商业化的转染试剂聚乙烯亚胺。
将RAW264.7细胞以每孔1×104个接种到96孔板内，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后培养基替换成无血清的DMEM，将上述纳米复合物(质量比为15/1)按照每孔0.1μg Cy3-siRNA加入到孔中，孵育4小时。最后将无血清的DMEM换成含血清的DMEM继续孵育20小时。用冷的含20U/mL肝素钠的PBS溶液洗三次，用RIPA裂解液(100μL/well)裂解20分钟.用酶标仪测定Cy3-siRNA的含量，BCA试剂盒测定细胞内蛋白含量，以研究纳米复合物的细胞摄取效率。结果见图13。从图中不难发现，氟化修饰的阳离子聚多肽的细胞摄取水平均优于纯胍基的聚多肽PG1，其中P7F7具有最优的细胞摄取能力。此外，随着氟链长度的增加，细胞摄取水平呈升高的趋势，且随着含氟链接枝率的升高，细胞摄取水平呈下降的趋势。
通过流式细胞术也可以评价细胞摄取水平。将RAW264.7细胞以每孔2×105个接种到6孔板内，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后培养基替换成无血清的DMEM，将上述纳米复合物(质量比为15/1)按照每孔2μg Cy3-siRNA加入到孔中，孵育4小时。用冷的含20U/mL肝素钠的PBS溶液洗三次，最后通过流式细胞仪分析细胞的摄取情况。结果见图14。可以看到所有的阳离子聚多肽都具有较好的细胞摄取水平。
将RAW264.7细胞以每孔3×104个接种到24孔板内，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后培养基替换成无血清的DMEM，将上述纳米复合物(质量比为15/1)按照每孔1μg FAM-siRNA加入到孔中，孵育4小时。用冷的含20U/mL肝素钠的PBS溶液洗三次，Hoechst(5μg/mL)和Lysotracker Red(200nM)各染色30min和1h，共聚焦激光扫描显微镜下观察。利用ImageJ计算FAM-siRNA和Lysotracker Red的共定位率。结果见图15。可以看到，含氟聚合物形成的纳米复合物均可以很好的从内涵体中逃逸出来，而纯胍基的聚多肽形成的纳米复合物的内涵体逃逸能力较差。
将RAW264.7细胞以每孔1×104个接种到96孔板内，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后培养基替换成无血清的DMEM，将上述纳米复合物(质量比为15/1)按照每孔0.1μg-si TNF-α加入到孔中，孵育4小时。最后将无血清的DMEM换成含血清的DMEM继续孵育20小时。加入0.75ng/孔的LPS刺激5小时后，通过ELISA检测细胞外TNF-α的水平。结果见图16。可以看到，所有的含氟阳离子聚多肽的TNF-α的沉默水平均优于PG1，并且P3F16和P7F7具有最优的基因沉默效率，其中，两者的TNF-α蛋白可被抑制70％以上。
实施例6
Calu-3细胞以1.0×105细胞/cm2的密度接种在Transwell小室的上室中，下室加入300μL的培养基培养10-14天，且每日测量Calu-3细胞单层的跨膜电阻(TEER)直至不再增加，然后在新的孔中加入300μL的含1％BSA的KRB缓冲溶液，将Transwell孔转移到该孔中，将实施例5中的纳米复合物(质量比为15/1)按照每孔2μg FAM-siRNA加入到孔中，孵育4小时。取50μL的孔中的缓冲溶液，加入到黑板中，用酶标仪检测其荧光强度，并且利用公式Papp＝Q/Act计算其表观渗透系数Papp。其中Q是渗透的FAM-siRNA的总量(ng)，A是细胞单层的扩散面积(cm2)，c是上室FAM-siRNA的初始浓度(ng/cm3)，t是渗透的时间。结果见图17。可以看到，纯胍基聚多肽PG1形成的纳米复合物的表观渗透系数为0.13×10-9cm/s。而所有含氟聚多肽形成的纳米复合物的表观渗透系数均大于此值，其中P3F16和P7F7最大，分别为2.92和3.31×10-9cm/s，这分别为PG1的22和25倍。这表明，氟化修饰的纳米复合物可以很好的透过Calu-3细胞，而纯胍基形成的纳米复合物则因为同细胞相互作用而滞留。
利用多重粒子追踪实验来阐述实施例5中的纳米复合物在黏液层中的运动轨迹以及稳定性。将纳米复合物(质量比为15/1)按照每孔2μg Cy3-siRNA加入到浓度为5％的CF粘液中，室温孵育30分钟，在共聚焦激光扫描显微镜下观察粒子的运动轨迹。结果见图18。可以看到，纯胍基聚多肽形成的纳米复合物在黏液中的运动严重受阻，而含氟聚多肽形成的纳米复合物的运动却基本没有受到抑制，具体来说，P3F16/siRNA纳米复合物和P7F7/siRNA纳米复合物在τ＝1s时的<MSD>分别可达到2.276和3.583μm2，这分别为PG1/siRNA纳米复合物(0.015μm2)的152和239倍。
为了进一步验证纳米复合物同黏蛋白的相互作用，将实施例5的纳米复合物(质量比为15/1)按照每孔2μg Cy3-siRNA加入到浓度为0.3％和0.5％的黏蛋白中，涡旋，室温孵育30分钟，在1500rpm下离心2分钟，沉淀用PBS缓冲液洗2次，然后加入200μL的NaOH(5M)，孵育10分钟，用荧光光谱仪测量荧光强度。结果见图19。同样可以看到含氟聚多肽形成的纳米复合物的荧光值大大低于纯胍基聚多肽，说明氟化修饰后的纳米复合物在同黏蛋白的相互作用较小，可以在黏液层中稳定存在。
我们进一步通过荧光共振能量转移(FRET)探究纳米复合物在CF粘液中的稳定性。将Cy5标记的阳离子聚多肽同Cy3-siRNA复合制备成纳米复合物，室温孵育30分钟，然后将纳米复合物加入到5％的CF粘液中，在550nm的激发波长下测量667和568nm处的荧光强度。结果见图20。可以看到，含氟聚多肽形成的纳米复合物在4小时之后都有着较高的稳定性，这明显优于纯胍基聚多肽PG1。
将balb/c雄鼠通过气管给药的方式注射50μL的脂多糖LPS(5mg/mL)诱导急性肺损伤，2小时后，按照250μg/kg的剂量将实施例5中的纳米复合物(质量比为15/1)再次通过气管给药的方式注射到气管中，24小时后处死小鼠，收集肺组织及灌洗液，肺组织通过匀浆后离心，收集上清液，利用Western blot、ELISA、real time-PCR等测量基因转染效率。结果见图21-23。可以看到，含氟聚多肽形成的纳米复合物的转染效率明显优于纯胍基聚多肽形成的纳米复合物的转染效率。例如，P3F16/siTNF-α和P7F7/siTNF-α同PG1/siTNF-α相比，TNF-α的表达水平分别下降了5倍和15.46倍。给药后小鼠肺组织中IL-6的表达水平的最终结果和TNF-α的结果一致。利用MPO、干湿重、血气、HE染色等方法验证其治疗效果。结果见图24-27。可以看到，通过气管给药后，P3F16/siTNF-α和P7F7/siTNF-α同PG1/siTNF-α相比，MPO的表达水平大大降低；湿/干重比、血氧分压、二氧化碳分压以及pH也基本恢复到正常水平。并且给药后，通过HE分析可以看到，P3F16/siTNF-α和P7F7/siTNF-α组出现明显的好转，炎症症状明显缓解，组织破坏明显减少。

Claims (10)

1.一种阳离子α-螺旋聚多肽，所述聚多肽具有：(1)α-螺旋多肽主链，(2)侧接于所述多肽主链的亲水性基团，和(3)侧接于所述多肽主链的下式(I)表示的疏水性基团：
Figure FDA0002375725790000011
式中：n表示0-20的整数，R1表示具有1-20个碳原子的、卤代或未卤代的烷基。
2.如权利要求1所述的阳离子α-螺旋聚多肽，其特征在于，所述多肽主链包括10-300个氨基酸的残基，优选20-300个氨基酸的氨基，更优选20-200个氨基酸的残基，还要更优选50-200个氨基酸的残基。
3.如权利要求2所述的阳离子α-螺旋聚多肽，其特征在于，所述氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、色氨酸等、及其衍生物。
4.如权利要求1或2所述的阳离子α-螺旋聚多肽，其特征在于，所述α-螺旋多肽主链衍生自聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸苄酯)、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)、聚(L-谷氨酸-γ-炔丙酯)、聚(γ-3-氯丙基-L-谷氨酸酯)或聚(γ-3-氯己基-L-谷氨酸酯)。
5.如权利要求1或2所述的阳离子α-螺旋聚多肽，其特征在于，所述亲水性基团具有胍基部分、胺基部分或季铵基部分。
6.如权利要求1或2所述的阳离子α-螺旋聚多肽，其特征在于，所述亲水性基团可由下式表示：
Figure FDA0002375725790000021
式中：X表示连接基团；R2、R3和R4各自表示氢或非氢取代基，其中R2、R3和R4中至少一个不为氢。
7.如权利要求1或2所述的阳离子α-螺旋聚多肽，其特征在于，侧接于所述多肽主链的疏水性基团可由下式表示：
Figure FDA0002375725790000022
式中：n表示0-10的整数，R1表示具有1-10个碳原子的、氟代或未氟代的烷基。
8.一种纳米药物，包括权利要求1-7中任一项所述的阳离子α-螺旋聚多肽和核酸药物。
9.权利要求1-7中任一项所述的阳离子α-螺旋聚多肽在制备核酸药物载体中的用途。
10.权利要求1-7中任一项所述的阳离子α-螺旋聚多肽在制备基因药物中的应用。
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