CN111154669B - 一种沙福芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2019818。本发明的菌株具有较强的解无机磷和有机磷功能，能产生吲哚乙酸、纤维素酶、蛋白酶、噬铁素。本发明同时涉及了包含该菌株的菌剂以及该菌株在促进植物生长，提高植物体抗病、抗旱等抗逆性中的应用。

Description

一种沙福芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株沙福芽孢杆菌及其应用，特别涉及该株沙福芽孢杆菌的功能及其菌剂在植物促生中的应用。
背景技术
根际促生菌被界定为在一定条件下有利于植物生长的自由生活在土壤、根际、根表、叶际的细菌。这些细菌能够固氮、溶磷、溶铁，并产生植物激素，如生长素、赤霉素、细胞分裂素和乙烯。此外，它们还能提高植物的抗逆性，包括干旱、高盐、重金属毒害和农药。
磷是植物生长所必需的第二大营养元素，涉及到植物的多重新陈代谢，包括能量传递、信号传递、呼吸作用、大分子物质合成和光合作用。然而，95%~99%的磷是是被土壤中的钙离子和植物所产植酸所固定，以不溶态、固化、沉淀的形式存在，因此植物很难吸收。植物只能以（H2PO4 −）和（HPO4 2−）的形式吸收。
土壤中存在大量的解磷微生物，它们对磷的循环和植物生长发育有重要作用，解磷微生物可以分为解磷细菌、真菌和放线菌，其中，解磷细菌包括肠细菌属（Enterbacter sp）、土壤杆菌属（Agrobacterium sp）、欧文氏菌属（Erwinia sp）、假单胞菌属（Pseudomonas sp）、沙雷氏菌属（Serratia sp）、黄杆菌属（Flavobacterium sp）、芽孢杆菌属（Bacillus sp）、微球菌属（Micrococcus sp）、固氮菌属（Azotobacter sp）、色杆菌属（Chromabacterium sp）、沙门氏菌属（Salmonella sp）、产碱菌属（Alcaligenes sp）、节细菌属（Arthrobacter sp）、硫杆菌属（Thiobacillus sp）、埃希氏菌属（Escherichia sp）；解磷真菌方面的相关研究报道不多，大多为曲霉属（Aspergillus sp）、根霉属（Rhizopus sp）、镰刀菌属（Fusarium sp）、青霉属（Penicillium sp）、小菌核菌属（Sclerotium sp）、AM菌根菌（Arbuscular mycorrhiza）等；解磷放线菌的研究主要侧重于链霉菌属（Streptomyces sp）。但在已有报道和公开的专利中沙福芽孢杆菌Bacillus safensis 虽然也有解磷和植物促生的能力，但是未见报道能同时具备解无机磷和有机磷能力，同时还具备产IAA、嗜铁素、纤维素酶、蛋白酶的能力，并且促生效果明显。也未见利用解磷微生物提高土壤中的可溶性磷含量，进而增加作物的产量的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有较强的解无机磷和有机磷功能，能产生吲哚乙酸、纤维素酶、蛋白酶，且能够提高植物体抗病、抗旱等抗逆性的沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06以及包含该菌株的菌剂。
本发明采用如下技术方案：
一种沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期为2019年10月14日，保藏编号为CCTCCNo：M 2019818。
进一步的，该菌株可溶解无机磷和有机磷。
进一步的，该菌株可产蛋白酶。
进一步的，该菌株可产纤维素酶。
进一步的，该菌株可产噬铁素。
进一步的，该菌株可产吲哚乙酸。
进一步的，该菌株可在pH10的环境中生长。
一种上述沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06在农作物种植和生物肥料中的应用。
特别的，该菌株在提高农作物产量以及提高农作物抗逆性中的应用。
一种上述沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06在农业堆肥中的应用。
特别的，该菌株在控制微生物肥料中的病原菌中的应用。
特别的，该菌株在降解农业废弃物中的蛋白质和纤维素中的应用。
一种包含上述沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06制备的菌剂。
菌剂的具体制备方法包括如下步骤：
（1）菌种活化：将沙福芽孢杆菌Bacillu ssafensis XWY06接种于LB液体培养基中，28℃培养12h，进行活化；
（2）种子液的培养：将活化好的菌株以0.2~0.9%的接种量接种于种子液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为200rpm，培养时间为12h；
种子培养基组成为：蛋白胨 10~18g/L，酵母膏 6~8g/L，葡萄糖 1~3g/L，蔗糖6~9g/L，NaCl 0.2~0.9g/L，pH为7.0~7.5；
（3）发酵培养：把经步骤（2）培养好的种子液以5~10％的接种量接入发酵罐中，28℃，搅拌速度为120~200rpm，调节通风量保证在溶氧50%~80%之间、罐压0.03~0.08MPa；
发酵36 h菌量可以达到1010cfu/ml，待芽孢量达到90%~100%时可以停止发酵，降温放罐，得到沙福芽孢杆菌Bacillu ssafensis XWY06的1010cfu/mL菌液；
（4）根据需求制成固体或者液体菌剂。
本发明的有益效果在于：本发明的沙福芽孢杆菌Bacillu ssafensis XWY06菌株不仅具有较强的解无机磷和有机磷功能，还能产生吲哚乙酸、纤维素酶、蛋白酶，所述菌株应用在农作物种植中不仅能较大程度提高农作物产量，还能提高植物体抗病、抗旱等抗逆性。此外，菌株还可以在碱性环境下很好的生长，发挥功能。
附图说明
图1为XWY06的无机磷溶解圈。
图2为XWY06的有机磷溶解圈。
图3为XWY06、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的溶磷能力对比图。
图4为XWY06的蛋白溶解圈。
图5为XWY06的纤维素溶解圈。
图6为XWY06的噬铁素晕圈。
图7为XWY06的产IAA的空白对比图。
图8为XWY06的pH 10.0生长对比图。
图9为XWY06的部分16Sr RNA序列。
图10为XWY06的rpoA基因序列。
图11为XWY06对试管苗的促生效果图。
图12为 XWY06对植株茎高和根长的促生效果。
图13 为XWY06对植株鲜重的增加效果。
图14为 XWY06对植株干重的增加效果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。
本发明提供一种沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期为2019年10月14日，保藏编号为CCTCC No：M 2019818。
该沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06分离自新疆阿克苏地区阿瓦提县。
具体方法如下：从新疆阿克苏地区阿瓦提县采集土壤，取10g加入内装100 ml 无菌生理盐水的三角瓶中，静止20 min后，28℃，200rpm摇床震荡30 min，取1 ml加入9 ml无菌生理盐水中，再依次稀释102，103，104倍，分别取以上土壤悬浮液100 µl在LB培养基（酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂15 g/L）平板上均匀涂板，28℃培养箱内培养48h，用无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化后，保存备用。
实施例1 溶磷功能
首先将沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06菌株在LB培养基上活化。
将活化后的菌株接种到NY/T 1847-2010中附录A所示溶磷培养基（葡萄糖 10.00g，(NH4)2SO4 0.50 g，MnSO4·7H2O 0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.30g，FeSO4·4H2O 0.036g，MnSO4·4H2O 0.03g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0。无机磷源选用磷酸钙，添加量10g；有机磷源选用植酸钙，添加量2g。固体培养基： 按比例添加 1.5%的琼脂粉）中。
经检测，沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06同时具有溶解无机磷和有机磷的能力，其中溶解无机磷的溶解圈直径达到1.2cm，见图1所示，溶解有机磷的溶解圈直径达到0.9cm，见图2所示。其它解磷菌如枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等解磷能力都不如沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06。具体数据如图3所示。
在确定了菌株具有溶磷功能之后再定量测定菌株的溶磷能力大小，将菌株在LB液体培养基上活化后，接种到液体的溶磷培养基上，28℃摇培7天，用钼锑抗比色法测定发酵上清液中的有效磷含量，取100 μl上清液，放入50 ml容量瓶中，用水稀释至约30 ml，加入二硝基酚指示剂2滴，滴加4 mol/L NaOH直至溶液刚转为黄色，再加入2 mol/L（1/2 H2SO4）1滴，使溶液的黄色刚刚退去。加入5.00 ml钼锑抗显色剂，用水定容，充分摇匀。在室温高于15 ℃处放置30 min后，取200µl加至96孔板，用酶标仪，在882 nm波长处测读吸光度。
结果显示，沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06菌株溶解无机磷的能力达到458.2mg/L，溶解有机磷的能力达到98.7mg/L。
实施例2 产蛋白酶
首先将沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06菌株在LB培养基上活化。
将活化后的菌株接种到蛋白酶检测用培养基（胰蛋白胨 5.00 g，酵母提取物3.00 g，葡萄糖 1.00 g，琼脂 15.00 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0，121℃ 高压灭菌30 min 。将灭菌的检测培养基冷却至约50 ℃时，将脱脂牛奶按10%的比例加入培养基混匀后倒入培养皿，待其冷却后备用）上，28℃培养48h，观察有无溶解圈出现。
结果显示，沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06具有很好的溶解蛋白的能力，高产蛋白酶，其溶解圈直径达到2.4cm，如图4所示。沙福芽孢杆菌Bacillus safensisXWY06高产蛋白酶，可以用于蛋白酶的提取，应用于食品工业或者洗涤工业等蛋白酶领域，同时也可以用于农业上微生物肥料中对病原菌细胞膜降解以控制病害，以及堆肥中农业废弃物中蛋白质的降解。
实施例3 产纤维素酶
首先将沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06菌株在LB培养基上进行活化，将活化后的菌株接种到纤维素检测用培养基上（MgSO4·7H2O 0.25g，K2HPO4 0.50g，羧甲基纤维素 1.88g，琼脂15.0g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0， 121℃ 高压灭菌30 min ）。28℃培养7天，7天后，每个平板中加入5 mL 0.2 mg/mL刚果红染液，染色1h，弃去刚果红染液后，加入1M NaCl洗涤1 h，弃去洗涤液，观察菌落周围水解圈的产生，出现水解圈表明纤维素酶的产生。
结果显示，沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06菌株具有很好的溶解纤维素的能力，其溶解圈直径达到4.3cm，如图5所示。沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06高产纤维素，可以降解病原真菌细胞壁，控制病害，也可以用于堆肥中纤维素的分解。
实施例4 产噬铁素
首先将沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06菌株在LB培养基上进行活化，将活化后的菌株接种于含CAS蓝色检测液的培养基中培养（将一定量的CAS蓝色检测液加入到酸水解酪蛋白和其它的无机盐组成的缺铁复杂培养基中，制成蓝色的检测平板）。若细菌产生嗜铁素，螯合培养基中的铁，则菌落周围产生黄色晕圈。
结果显示，沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06具有很好的螯合铁的能力。晕圈直径达到3.3cm，如图6所示。沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06会富集一部分铁离子到植物根部，促进植物对铁的吸收。
实施例5 产吲哚乙酸
首先将沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06菌株在LB液体培养基上进行活化。
将活化后的菌株按照1%的量接种于DF+培养基中（蛋白胨5.00 g，酵母提取物1.50g，牛肉膏1.50 g，NaCl 5.00 g,色氨酸 0.50 g 蒸馏水1000 mL，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌30 min）。28℃摇培7天，7天后，将发酵液取出，12000 rpm离心5 min，用Salkowkin比色法测定发酵液中IAA的含量。
结果显示，沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06产IAA的量为15.8mg/L，如图7所示。通过HPLC进一步分析确认菌株合成的为IAA，菌株培养7天后，12000rpm离心5min，取上清30mL，用两倍体积乙酸乙酯在恒温振荡器中充分萃取3次，合并萃取液用乙酸乙酯减压蒸馏器蒸馏，然后用5mL甲醇溶解、定容，经过0.22um滤膜过滤。参考连翠飞（2006）和高桂枝（2007）的方法进行样品检测。检测仪器：waters2998高效液相色谱，色谱柱：AgilertZorbax SB-C18 250 mm×4.6 mm，5 um。流动相，甲醇：乙腈：0.6%冰乙酸水溶液（50∶5∶45，v/v/v）。进样量：20 µl。流速0.8 mL/min。柱温：室温。检测波长：255 nm。检测结果为16.6mg/L，略高于比色法检测结果。
实施例6 耐碱环境
首先将沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06菌株在LB液体培养基上进行活化。
将活化后的菌株按照1%的量接种到pH 10.0的液体LB液体培养基中，28℃摇培48h，再次按照1%的接种量接种到液体LB培养基中，28℃摇培48h，测定其OD600值。
结果表明，沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06菌株摇培48h后其OD600达到1.16，表明菌株可以很好的在pH 10.0的环境中生长。如图8所示。
实施例7 菌株的鉴定
综合XWY06菌株的生理生化特性、分子生物学基因序列，将其鉴定为沙福芽孢杆菌Bacillus safensis。具体鉴定结果如下：
1、分子生物学
首先对菌株进行分子生物学的鉴定，扩增其16S rRNA基因序列和rpoA基因序列，并进行测序，基因序列如图8和图9所示。
16S使用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3'和1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'。25µl反应体系为2×taqMix 12.5µl，引物各1µl，primers 1.0，ddH2O 9.5。PCR反应条件为：94℃ 5 min 预变性，94℃变性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环后 72℃充分延伸5 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，用OMEGA公司的纯化试剂盒Gel Extraction Kit 纯化回收后连接TaKaRa公司的T载体 pMD18-T。在Invitrogen公司用ABI 3730 DNA测序仪进行测序，基因序列已经提交GenBank，基因收录号为：MN435380。
rpoA引物为BSL72：5'-CGTAGAGCCACTTGAGCG-3'和 BSR328：5'-CTGCCGTTACAGTTCCTT-3'，25µl反应体系为2×taqMix 12.5µl，引物各1µl，primers 1.0，ddH2O 9.5。PCR反应条件为：94℃ 3 min 预变性，94℃变性 30 s，61.7℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环后 72℃充分延伸5 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，用OMEGA公司的纯化试剂盒Gel Extraction Kit 纯化回收。在Invitrogen公司用ABI 3730DNA测序仪进行测序。
2、生理生化特性
在分子生物学的基础上再对菌株进行生理生化鉴定，首先对其进行革兰氏染色，结果菌株为革兰氏阳性；将菌株活化后接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，28℃培养48h，在培养基中加入2滴甲基红，变黄，呈阴性；将菌活化后接入淀粉的固体培养上，28℃培养48h后，用碘液染色，未见水解圈出现，淀粉水解阴性；用枪头取一个菌落放在载玻片上，加一滴3%的H2O2于菌落上，有气泡出现，表明菌株接触酶阳性；将菌株接种于明胶培养中，20℃培养7天，培养基出现融化现象表明明胶水解阳性；将菌接入以麦芽糖为唯一碳源的培养基中，28℃培养48h后，有菌生长，重新往复接种三次，结果还可生长，证明此菌可利用麦芽糖为唯一碳源；同上试验肌糖、蜜二糖、棉子糖全部程阳性；将菌接入丙氨酸盐培养基中，28℃培养7天，培养基变为蓝色，证明此菌可利用丙氨酸盐。菌株XWY06的生理生化结果如下表1所示。
表1 沙福芽孢杆菌Bacillus safensis XWY06的生理生化特性
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
实施例8 菌剂的制备
1、菌种活化
将沙福芽孢杆菌Bacillu ssafensis XWY06接种于LB液体培养基中，28℃培养12h。
2、种子液的培养
种子培养基组成为：蛋白胨 10~18g/L，酵母膏 6~8g/L，葡萄糖 1~3g/L，蔗糖6~9g/L，NaCl 0.2~0.9g/L，pH为7.0~7.5。将活化好的菌株以0.2~0.9%的接种量接种于种子液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为200rpm，培养时间为12h。
3、发酵罐发酵
发酵培养基组成为：黄豆粉8~15g/L，玉米浆6.5~14.5g/L，酵母膏2.0~3.2g/L，蛋白胨2.1~3.8g/L，蔗糖 4~7g/L，MgSO4·7H2O 0.05~0.1g/L，MnSO4·7H2O 0.012~0.03/L，CaCO3 3~8g/L，消泡剂0.8~1.6g/L，pH为7.0~7.5。把培养好的种子液以5~10％的接种量接入发酵罐中，28℃，搅拌速度为120~200rpm，调节通风量保证在溶氧50%~80%之间、罐压0.03~0.08MPa。发酵36 h菌量可以达到1010cfu/ml，待芽孢量达到90%~100%时可以停止发酵，降温放罐，得到沙福芽孢杆菌Bacillu ssafensis XWY06的1010cfu/mL菌液，根据需求制成固体或者液体菌剂。
实施例10 促生实验
选取饱满、健康玉米种子消毒、清洗、浸泡后放入28 ℃生化培养箱培养催芽24h左右。将沙福芽孢杆菌Bacillu ssafensis XWY06菌株从平板挑取单菌落于LB液体培养基中进行活化，将活化后的菌液按1%的接菌量接种于DF培养基中，28℃，150 rpm摇培72 h并将菌液稀释到107~102cfu/mL。按照专利《一种检测植物根际促生菌促生效果的方法》中检测方法进行，测定玉米幼苗茎高、根长、茎鲜重、根鲜重、茎干重、根干重。
结果显示，沙福芽孢杆菌Bacillu ssafensis XWY06菌株具有很好的促生效果，如图11所示。可以使玉米苗茎高增加30%、根长增加31%、茎鲜重增加43%、根鲜重增加33%、茎干重增加38%、根干重增加20%。如图12、图13、图14所示。
根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需说明的是，以上的实施例仅仅为了举例说明发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），其特征在于，保藏编号为CCTCC No：M2019818。
2.一种如权利要求1所述的沙福芽孢杆菌在生物肥料中的应用。
3.一种如权利要求1所述的沙福芽孢杆菌在农业堆肥中的应用。
4.一种包含权利要求1所述的沙福芽孢杆菌的菌剂。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，通过如下步骤制备：
（1）菌种活化：将保藏编号为CCTCC No：M2019818的沙福芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，28℃培养12h，进行活化；
（2）种子液的培养：将活化好的菌株以0.2~0.9%的接种量接种于种子液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为200rpm，培养时间为12h；
（3）发酵培养：把经步骤（2）培养好的种子液以5~10％的接种量接入发酵罐中，28℃，搅拌速度为120~200rpm，调节通风量保证在溶氧50%~80%之间、罐压0.03~0.08MPa；发酵36 h菌量达到1010cfu/ml，待芽孢量达到90%~100%时停止发酵，降温放罐，得到保藏编号为CCTCCNo：M2019818的沙福芽孢杆菌的1010cfu/mL菌液；
（4）根据需求制成固体或者液体菌剂。
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