CN111150732B - 盐酸小檗碱在制备抑制或干预蜂房哈夫尼亚菌生物被膜药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及盐酸小檗碱在制备抑制或干预蜂房哈夫尼亚菌属药物中的用途。本发明公开了盐酸小檗碱可以抑制或干预蜂房哈夫尼亚菌形成的生物被膜，从而影响其增殖。因此，盐酸小檗碱具备开发成抑制或干预蜂房哈夫尼亚菌属药物的潜力。

Description

盐酸小檗碱在制备抑制或干预蜂房哈夫尼亚菌生物被膜药物 中的用途

技术领域

本发明涉及盐酸小檗碱的新医药用途，尤其涉及盐酸小檗碱在制备抑制或干预蜂房哈夫尼亚菌生物被膜药物中的用途，属于盐酸小檗碱的新医药用途领域。

背景技术

蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei)是兼性厌氧型革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，属于肠杆菌科蜂房哈夫尼亚属唯一一种细菌，既是细菌性食品污染菌，又是条件致病菌(PadillaD et al.Veterinary Microbiology，2013，163(1/2)：200-201)。目前已有研究表明，蜂房哈夫尼亚菌能够形成生物被膜(Biofilm，BF)来抵抗外界不良环境，进而维持其生长繁殖(Tan J et al.Sensors(Basel)，2014，14：6788-6796)。生物被膜的形成与多种因素有关，其中，群体感应(Quorum sensing，QS)是近年来发现的影响生物被膜的重要因素之一，细菌之间的群体感应是指细菌菌群通过感应环境中特定信号分子的浓度来调节群体密度的一种相互作用机制(An D et al.Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America，2006，103(10)：3828-3233)。细菌的群体感应系统通过影响细菌生长、增殖、生物膜形成、毒力功能、抗生素合成等生物学功能，最终实现其对环境变化的适应(Miller MB et al.Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America，Cell，2002，110(3)：303-314)。

盐酸小檗碱是毛茛科黄连属植物黄连的主要成分，具有抗微生物、抗心律失常、降血脂、抗炎、抗肿瘤、镇静催眠等多种功效(张日东，等.现代生物医学进展，2010，17(10)：3350-3352；韩有为，等.中西医结合心脑血管病杂志，2010，8(3)：340-342)。迄今为止，尚无盐酸小檗碱抑制蜂房哈夫尼亚菌或干预哈夫尼亚菌生物被膜的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供盐酸小檗碱在制备抑制蜂房哈夫尼亚菌或干预蜂房哈夫尼亚菌生物被膜药物中的新用途，盐酸小檗碱通过作用于QS系统，有效抑制或干预蜂房哈夫尼亚菌生物被膜的形成。

本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案实现的：

本发明通过建立蜂房哈夫尼亚菌生物被膜体外模型，研究盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌生物被膜的体外干预作用。

通过测定OD值，确定盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌的最低抑菌浓度(Minimuminhibit concentration，MIC)，通过结晶紫法研究盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌生物被膜形成的影响。结果表明，1/2 MIC处理蜂房哈夫尼亚菌48h后测得的OD值(0.802±0.117)与阴性对照组(0.927±0.155)相比，差异有统计学意义。

通过牛津杯法测定蜂房哈夫尼亚菌生物被膜的泳动能力。结果显示，1/2 MIC时，其泳动直径(0.723±0.093)与对照组(2.265±0.505)相比，差异有统计学意义。

综上所述，盐酸小檗碱有成为QS信号系统抑制剂的潜力，通过影响QS系统干预生物被膜的形成。因此，盐酸小檗碱可以用于制备抑制蜂房哈夫尼亚菌的药物。

本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明中盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌生物被膜的形成有显著抑制作用，相比其他化学合成的物质，无毒副作用，化学性质稳定，刺激性小。

附图说明

图1为盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌的影响(n＝6，

)；

图2为亚MIC下盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌生物被膜的影响(n＝4，

)；

图3为亚MIC下盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌泳动能力的影响(n＝3，

)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会伴随着描述而更为清楚。但是因该理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、材料

1.1实验菌株

蜂房哈夫尼亚菌菌株由志愿者体内分离，经过16sRNA测序技术鉴定为Hafniaalvei。

1.2药物及材料

1.2.1药物

盐酸小檗碱对照品

1.2.2培养基及试剂

氯化钠、酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂、RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)、AO/EB染色试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，批号：E607308-0100)、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(Accurate Biotechnology(Hunan)Co.Ltd，批号：A1A0291)、Evo M-MLV反转录试剂盒(Accurate Biotechnology(Hunan)Co.Ltd，批号：AG11705)、pH 7.4磷酸盐缓冲溶液(PBS)为本发明人配制。

1、实验方法

1.1盐酸小檗碱溶液的制备

称取盐酸小檗碱对照品0.1g，溶于10mL LB培养基中，制成浓度为10mg/mL的盐酸小檗碱溶液。取1mL浓度为10mg/mL的盐酸小檗碱溶液于15mL离心管中，加入9mL LB培养基，配制成浓度为1mg/mL的盐酸小檗碱溶液。重复上述操作，分别配制质量浓度为0.1mg/mL、1*10^-2mg/mL、1*10^-3mg/mL、1*10^-4mg/mL、1*10^-5mg/mL的盐酸小檗碱溶液。

1.2盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌的MIC确定

取蜂房哈夫尼亚菌单菌落接种于LB培养基中，28℃培养24h，取100μl菌液于96孔板中，置于酶标仪下检测OD值，经检测当OD₆₀₀＝1时，菌浓度为10⁵CFU/mL。分别取质量浓度为0.1mg/mL、1*10^-2mg/mL、1*10^-3mg/mL、1*10^-4mg/mL、1*10^-5mg/mL的盐酸小檗碱溶液和LB培养基各90μL加入96孔板中，然后在每孔内加入经检测OD₆₀₀＝1的菌液各10μL。每组重复3次，于28℃培养24h。放入酶标仪中，检测其在600nm波长处的吸光度。

1.3盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌生物被膜的体外干预作用

配制质量浓度为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32MIC的盐酸小檗碱的LB溶液和LB培养基，分别于1.5mL EP管中加入800μL，再加入200μL浓度为10⁵CFU/mL的蜂房哈夫尼亚菌菌液，每组重复6次。于28℃培养48h。取PBS溶液吹洗3次，于60°烘箱干燥30min，之后每管加入结晶紫溶液1mL，染色30min，弃去染液，蒸馏水冲洗3次，晾干。每管中加入200μL浓度为33％的乙酸溶液，待完全溶解后，测定其在595nm波长处的吸光度。

1.4盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌泳动能力的抑制作用

配制质量浓度为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32MIC的盐酸小檗碱的LB溶液的固体培养基和LB固体培养基，在培养皿中央放置牛津杯，杯中加入100μL浓度为10⁵CFU/mL的蜂房哈夫尼亚菌菌液。每组重复3次，于28℃静置培养24h，测量其生长直径，统一以最长直径为准。

2、实验结果

2.1盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌的MIC

由图1可知，当盐酸小檗碱浓度为0.1mg/mL时，OD值(0.106±0.006)与空白对照组OD值(0.927±0.155)相比，P＜0.05，有统计学意义，故盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌的MIC为0.1mg/mL。

2.2盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌生物被膜的体外干预作用

不同浓度盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌生物被膜形成的影响，结果见图2。由图2可知，亚MIC下，盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌生物被膜的形成有抑制作用，且随着浓度增加，抑制作用逐渐增强。

2.3盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌泳动能力的抑制作用

不同浓度盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌泳动能力的影响，结果见图3。由图3可知，亚MIC下，盐酸小檗碱对蜂房哈夫尼亚菌的泳动能力有抑制作用，且随着浓度增加，抑制作用逐渐增强。

综上所述，盐酸小檗碱有成为QS信号系统抑制剂的潜力，通过影响QS系统干预生物被膜的形成。

Claims (1)

1.盐酸小檗碱在制备抑制蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei)所形成的生物被膜的药物中的用途。

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