CN111141846A - 一种青蒿中青蒿素的含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种青蒿中青蒿素的含量测定方法,具体涉及青蒿药材质量控制技术领域。本发明硅胶层析柱法有效去除了石油醚提取液中的大部分杂质，避免了供试品溶液中杂质过多对色谱系统造成的污染和堵塞，并且供试品溶液色谱图基线平稳，青蒿素峰附近无杂质峰干扰，本发明的加标回收率实验结果表明所用的供试品溶液制备方法能有效地将青蒿素从青蒿干叶中提取出来，重复性实验结果表明供试品溶液制备方法可重复性高、稳定性高，上述实验结果也表明了液相色谱条件的准确性和可靠性。

Description

一种青蒿中青蒿素的含量测定方法
【技术领域】
本发明涉及青蒿药材质量控制技术领域，具体涉及一种青蒿中青蒿素的含量测定方法。
【背景技术】
青蒿为菊科艾属植物黄花蒿Artemisia annua L.的地上部分，青蒿素是青蒿中提取的用于治疗疟疾的主要成分。青蒿素是我国唯一获得国际承认的抗疟新药，青蒿素类药物治疗恶性疟疾效果显著，成为世界卫生组织推荐的抗疟药品，青蒿素类药品不仅对治疗疟疾效果显著，在抗肿瘤、治疗艾滋病、黑热病红斑狼疮等相关疾病方面也取得了进展。
目前，2015版中国药典对青蒿的质量控制尚存在不足，缺少其主要药效成分青蒿素的含量测定，这不利于青蒿药材的质量控制和高品质青蒿药材的培育。虽然近年来也有关于青蒿素含量测定的方法，包括紫外分光光度法、薄层色谱法，以及能进一步精确定量的高效液相色谱法，如中国专利公开号为CN103353498A、名为一种测定青蒿素浸膏中青蒿素含量的高效液相色谱方法，但从该专利的色谱图可以看出，青蒿素的色谱峰与其它杂质峰之间的分离度低、基线偏移严重，在定量的准确性上仍有待进一步提高。
因此，为了更好地对青蒿药材实现质量控制，以及为高品质青蒿药材的培育进行质量把关，有必要开发一种青蒿中青蒿素的含量测定方法。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对目前缺少能够准确测定青蒿药材中青蒿素含量的方法的问题，提供一种青蒿中青蒿素的含量测定方法。本发明有效去除了石油醚提取液中的大部分杂质，避免了供试品溶液中杂质过多对色谱系统造成的污染和堵塞，并且供试品溶液色谱图基线平稳，青蒿素峰附近无杂质峰干扰，本发明的加标回收率实验结果表明所用的供试品溶液制备方法能有效地将青蒿素从青蒿干叶中提取出来，重复性实验结果表明供试品溶液制备方法可重复性高、稳定性高，上述实验结果也表明了液相色谱条件的准确性和可靠性。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种青蒿中青蒿素的含量测定方法，包括以下步骤：
a.供试品溶液的制备：取青蒿干叶打成细粉，然后精密称取细粉置于圆底烧瓶中，加入石油醚提取两次，过滤，收集两次提取的滤液，合并滤液，然后加入石油醚定容，接着静置2小时以上，得提取液，之后将提取液加入硅胶层析柱中进行上样，吸附形成三条色带，采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱液进行洗脱，收集中间色带的洗脱液作为主成分溶液，再精密吸取主成分溶液体积的1/20-1/10于65-70℃蒸干得残渣，接着加入主成分溶液体积1/20-1/10的醇溶剂溶解残渣并定容，然后超声处理1-3分钟，再冷藏0.5-1.5小时以上，最后吸取上清液用微孔滤膜过滤，收集续滤液，得供试品溶液；
b.对照品溶液的制备：精密称取青蒿对照品，按料液比为1:1000-2000g/ml加入醇溶剂进行溶解，得对照品溶液；
c.样品测定：将对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱中，以峰面积外标法计算青蒿素的含量。
优化的，步骤a中所述细粉与第一次提取加入的石油醚的料液比为1:15-25g/ml，所述细粉与第二次提取加入的石油醚的料液比为1:10-20g/ml；步骤a中按定容后，细粉与石油醚的料液比为1：35-45g/ml加入石油醚定容。
进一步优化的，步骤a中所述提取两次的方法为：每次在60-70℃加热回流，加热煮沸后计时提取0.5-1.5小时。
更进一步优化的，步骤a中所述硅胶层析柱的填料为球形多孔层析硅胶、填料粒径为100-200目、填料填装量为每200ml提取液装填3-5g。
再更进一步优化的，步骤a中所述中间色带的洗脱液与提取液的体积比为0.5-1:1。
再更进一步优化的，步骤a中所述洗脱液中乙酸乙酯与石油醚的体积比为3-8：100。
再更进一步优化的，步骤a中所述洗脱液的洗脱流速为3-9ml/min。
再更进一步优化的，步骤c中所述样品测定的液相条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，流动相由乙腈和水组成，乙腈在流动相中的体积百分比为40％-60％，流速为0.6-1.0ml/min，波长为208-212nm，柱温为25-35℃。
再更进一步优化的，所述样品测定的液相条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，流动相由乙腈和水组成，乙腈在流动相中的体积百分比为44％，流速为0.7ml/min，波长为210nm，柱温为30℃。
再更进一步优化的，所述样品测定的液相条件还包括：进样量为5-10μl，分析时间为35-45min。
再更进一步优化的，所述醇溶剂为甲醇或乙醇。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
提供一种青蒿药材中青蒿素含量测定的准确定量方法，提高青蒿药材的质量控制的准确性，以及为高品质青蒿新品种培育提供质量保证。本发明通过硅胶层析柱将石油醚提取液中的多种杂质吸附，再通过洗脱液将青蒿素洗脱收集，而杂质仍然保留在层析柱上不被洗脱，使得供试品溶液杂质较少，能够避免色谱系统由于供试品溶液中杂质过多造成的污染和堵塞，并使得色谱图基线平稳，有利于提高色谱分析的含量测定准确性；在杂质的去除上，尤其是去除了与青蒿素色谱峰相邻的杂质，减少了相邻杂质峰对青蒿素峰峰面积的干扰，进一步提高了含量测定的准确性。同时，本发明的青蒿素含量测定结果准确可靠，加标回收率实验结果表明所用的供试品溶液制备方法能有效地将青蒿素从青蒿干叶中提取出来，重复性实验结果表明供试品溶液制备方法可重复性高、稳定性高，上述实验结果也表明了液相色谱条件的准确性和可靠性。
【附图说明】
图1流速为0.6ml/min的供试品溶液色谱图(过柱前)；
图2流速为0.7ml/min的供试品溶液色谱图(过柱前)；
图3流速为0.8ml/min的供试品溶液色谱图(过柱前)；
图4流速为1.0ml/min的供试品溶液色谱图(过柱前)；
图5对照品溶液色谱图；
图6供试品溶液色谱图(过柱后)。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1.实验材料
1.1仪器与材料
电子分析天平、200ml圆底烧瓶、200ml容量瓶、10ml容量瓶、冷凝回流提取装置、层析柱、移液管、蒸发皿、漏斗、超声仪、高效液相色谱仪、Gemini 5u C18 110A色谱柱
1.2试剂
石油醚、乙酸乙酯、甲醇、超纯水、乙腈、青蒿素对照品
1.3样品：青蒿干叶(批号：S18003、S18004、F18156、R18190、R18191)
2.样品制备
2.1对照品溶液的制备：取青蒿素对照品适量，精密称定，加入甲醇溶解并稀释成浓度为1-2mg/ml的溶液，然后用微孔滤膜过滤两次，取续滤液，得对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备
2.2.1提取液的制备
2.2.1.1提取溶剂筛选
取青蒿干叶打成细粉，取细粉约5.0g，精密成定，加入石油醚提取两次，提取温度为65℃、提取时间为1小时，合并两次提取液，对两次提取的石油醚体积进行如下筛选：条件1为第一次加入75ml，第二次加入50ml；条件2为第一次加入100ml，第二次加入80ml；条件3为第一次加入125ml，第二次加入100ml。得到的提取液过滤注入高效液相色谱仪，测定青蒿素含量。色谱条件为：Gemini 5u C18 110A色谱柱，流动相由乙腈和水组成，乙腈在流动相中的体积百分比为40％，流速为1.0ml/min，波长为210nm，柱温为30℃。
经过测定，发现条件1青蒿素提取不完全，条件3与条件2中青蒿素含量相差不大。为节省溶剂，故选择条件2为最佳石油醚提取体积。
2.2.1.2提取条件筛选
取青蒿干叶打成细粉，取细粉约5.0g，精密成定，加入石油醚提取两次，第一次加入100ml，第二次加入80ml，合并两次提取液。其中，对提取温度和时间作如下筛选：条件1提取温度为60℃，提取时间为0.5小时；条件2提取温度为65℃，提取时间为1小时；条件3提取温度为68℃，提取时间为1小时；条件4提取温度为70℃，提取时间为1.5小时；上述提取时间均为煮沸后再开始计时。得到的提取液过滤注入高效液相色谱仪，测定青蒿素含量。色谱条件为：Gemini 5u C18 110A色谱柱，流动相由乙腈和水组成，乙腈在流动相中的体积百分比为40％，流速为1.0ml/min，波长为210nm，柱温为30℃。
经过测定，发现条件1、条件2的青蒿素含量交底，条件4供试品溶液的杂质过多，但青蒿素含量与条件3差别不大。故选择供试品溶液中杂质较少的条件3作为最佳提取条件。
2.2.2过柱洗脱
2.2.2.1洗脱液的选择
采用2.2.1项下确定的方法制备得到提取液，然后加入到硅胶层析柱(层析柱的填料为球形多孔层析硅胶、粒径为100-200亩、填装量为3-5g)中，吸附后分成上、中、下三条色带，经过测定确定青蒿素在中间层，使用洗脱液将中间色带洗脱下来并收集，设置洗脱液的流速为3ml/min，然后用移液管精确吸取10ml的中间色带洗脱液置于蒸发皿，放在68℃恒温水浴锅蒸干，用甲醇少量多次轻轻刮洗倒入10ml容量瓶，定容至刻度，然后置于超声仪超声2min，使充分溶解，再冷藏放置1h以上，使杂质沉淀，接着吸取上清液用微孔滤膜过滤两次，取续滤液，得供试品溶液。其中，对以下三个体积比的洗脱液进行筛选：乙酸乙酯-石油醚为3:100，乙酸乙酯-石油醚为5:100，乙酸乙酯-石油醚为8:100。将得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定青蒿素含量。色谱条件为：Gemini 5u C18 110A色谱柱，流动相由乙腈和水组成，乙腈在流动相中的体积百分比为40％，流速为1.0ml/min，波长为210nm，柱温为30℃。
经过测定，发现在上述比例范围内，所测定的青蒿素含量差别不大，表明洗脱液中乙酸乙酯和石油醚的比例可以是一个可调整的适当范围，故确定以乙酸乙酯与石油醚的体积比为3-8:100的混合溶液作为洗脱液。
2.2.2.2洗脱条件的选择
采用2.2.1项下确定的方法制备得到提取液，然后加入到硅胶层析柱(层析柱的填料为球形多孔层析硅胶、粒径为100-200亩、填装量为3-5g)中，吸附后分成上、中、下三条色带，经过测定确定青蒿素在中间层，使用乙酸乙酯与石油醚的体积比为3-8:100的混合溶剂作为洗脱液将中间色带洗脱下来并收集，然后用移液管精确吸取10ml的中间色带洗脱液置于蒸发皿，放在68℃恒温水浴锅蒸干，用甲醇少量多次轻轻刮洗倒入10ml容量瓶，定容至刻度，然后置于超声仪超声2min，使充分溶解，再冷藏放置1h以上，使杂质沉淀，接着吸取上清液用微孔滤膜过滤两次，取续滤液，得供试品溶液。其中，对以下三个洗脱流速进行筛选：3ml/min、6ml/min、9ml/min。将得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定青蒿素含量。色谱条件为：Gemini 5u C18 110A色谱柱，流动相由乙腈和水组成，乙腈在流动相中的体积百分比为40％，流速为1.0ml/min，波长为210nm，柱温为30℃。
经过测定，发现3ml/min流速洗脱较慢，洗脱时间长、洗脱液用量大；9ml/min得到的供试品溶液中仍有部分杂质，而6ml/min最为合适，供试品溶液中杂质最少。故确定以6ml/min作为最佳洗脱流速。
因此，最终确定如下供试品溶液的制备方法：
①.提取液的制备：取青蒿干叶打成细粉，取细粉约5.0g，精密成定，置于200ml圆底烧瓶中，加入100ml石油醚；将圆底烧瓶置于68℃恒温水浴锅加热回流，煮沸后开始计时1小时，滤液倒入200ml容量瓶中；残渣留在圆底烧瓶里加入80ml石油醚继续做加热回流提取，煮沸后开始计时1小时，滤液倒入第一次提取的200ml容量瓶中，加石油醚定容至刻度，静置2h以上，使杂质沉淀，得提取液；
②.过柱洗脱：装柱填料为球形多孔层析硅胶，粒径100-200目，柱子装填量为3-5g，封口静置2小时以上，使硅胶沉淀；把200ml容量瓶中的滤液倒入已经整好的柱子过柱，吸附后分成上、中、下三条色带，青蒿素在中间层；用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱液洗脱，乙酸乙酯在洗脱液中的体积百分比为3％-8％之间，过柱的洗脱液流速6ml/min，观察颜色，待最低层流出完后，开始收集含有青蒿素的中间色带洗脱液100-200ml，洗脱液总用量为400-500ml；
③.浓缩稀释：用移液管精确吸取10ml的中间色带洗脱液置于蒸发皿，放在68℃恒温水浴锅蒸干，用甲醇少量多次轻轻刮洗倒入10ml容量瓶，定容至刻度，然后置于超声仪超声2min，使充分溶解，再冷藏放置1小时以上，使杂质沉淀，接着吸取上清液用微孔滤膜过滤两次，取续滤液，得供试品溶液。
3.色谱条件的确定
以2.2项下确定的方法制备供试品溶液，进行以下色谱条件的筛选。
3.1检测波长的选择
取供试品溶液注入高效液相色谱仪中，采用全波长扫描，分析208nm、210nm、212nm下的色谱图，使用的色谱条件为：Gemini 5u C18 110A色谱柱，流动相由乙腈和水组成，乙腈在流动相中的体积百分比为40％，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。
结果显示，波长为210nm条件下，杂质峰较少、基线较平稳，故确定210nm作为检测波长。
3.2洗脱程序的选择
取供试品溶液注入高效液相色谱仪中，分别采用乙腈与水体积比为40:60、44:56、60:40作为流动相进行分析，使用的色谱条件为：Gemini 5u C18 110A色谱柱，流动相由乙腈和水组成，波长为210nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。
结果显示，乙腈与水的体积比为44:56色谱图分离效果最佳，故确定最佳流动相由乙腈和水组成，乙腈在流动相中的体积百分比为44％。
3.3流速的选择
取供试品溶液注入高效液相色谱仪中，色谱条件为：Gemini 5u C18 110A色谱柱，流动相由乙腈和水组成，乙腈在流动相中的体积百分比为44％，波长为210nm，柱温为30℃。观察流速分别为0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min的色谱图并测定青蒿素含量，测定结果见表1。
表1四个流速下供试品的含量测定结果
Figure BDA0002351682800000071
Figure BDA0002351682800000081
备注：平行制备两份供试品溶液，分别采用上述4个流速注入高效液相色谱仪。
结果显示，四个不同流速的青蒿素含量相差不大，其中0.7ml/min的图谱最好，见图1-图4，故确定为最终流速。
3.3其他条件的确定
在上述确定的色谱条件基础上，对柱温、进样量、分析时间进行考察，从25℃、30℃、35℃三个柱温中，确定30℃下与0.7ml/min的流速配合最为适宜，青蒿素色谱峰峰形较好；进样量在5-10μl之间对于定量测定影响不大；分析时间在35-45min干扰较少、基线平稳。
综上分析，色谱条件确定为：采用Gemini 5u C18 110A色谱柱，动相由乙腈和水组成，乙腈在流动相中的体积百分比为44％，流速为0.7ml/min，波长为210nm，进样量为5-10μl，柱温为30℃，分析时间为35-45min。
4.含量测定
在上述色谱条件下，分别吸取供试品溶液和对照品溶液依次进样，测定峰面积。以峰面积外标法计算青蒿素含量。对照品溶液色谱图见图5，供试品溶液色谱图见图6。含量计算公式如下：
Figure BDA0002351682800000082
式中，S1：供试品溶液的峰面积；
S2：对照品溶液的峰面积；
C：对照品溶液的浓度，mg/ml；
W:青蒿干叶的质量，g；
V1:步骤②收集含有青蒿素的中间色带洗脱液的体积，ml；
V2:步骤③用甲醇溶解定容的体积，ml；
V3:步骤③用移液管精确吸取的体积，ml。
5.过硅胶层析柱前后对比实验
制备过硅胶层析柱与不过硅胶层析柱两份供试品溶液，按“3.色谱条件的确定”项下确定的条件依次将两份供试品溶液注入高效液相色谱仪，见图2和图6。
从图2和图6中可以看出，经过硅胶层析柱的净化作用，能够减少供试品溶液中的杂质，能够提高青蒿素含量测定的准确性，并能够避免色谱系统由于供试品溶液中杂质过多造成的污染和堵塞。
6.方法学考察
6.1重复性实验
精密称取同一批次青蒿干叶(S18003)6份，按“2.2供试品溶液的制备”’项下步骤①操作；再把每份分成2组，按“2.2供试品溶液的制备”’项下步骤②-③操作，将6份样品制成12份供试品溶液，并同时制备对照品溶液，按“3.色谱条件的确定”项下确定的条件依次将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，每份供试品溶液进2针，测定青蒿素含量和计算RSD值，见表2。
表2重复性实验测定结果
Figure BDA0002351682800000091
Figure BDA0002351682800000101
从上面的表2中，可看出这6份青蒿样品的含量均在16‰左右，每组的重现性RSD值都低于2％。
6.2加标回收率实验
精密称取同一批次青蒿干叶(S18003)8份，其中四份作为加标样，加标样在“2.2供试品溶液的制备”’项下步骤①操作开始时分别加入青蒿素对照品50.00mg、80.00mg、80.00mg和100.00mg的四个水平。8份样在完成步骤①的操作后，把每份样平行分成两组，按“2.2供试品溶液的制备”’项下步骤②-③操作，制得16份供试品溶液，并同时制备对照品溶液，按“3.色谱条件的确定”项下确定的条件依次将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，测定青蒿素含量，然后计算回收率。
表3加标回收实验测定结果
Figure BDA0002351682800000111
从上面的表3中，可看出四个水平回收率分别为101.39％、99.24％、97.54％、98.32％，平均回收率99.12％，说明方法准确。
7.多批次样品测定
取6批次青蒿干叶样品(批号：S18003、S18004、F18156、R18190、R18191)，按“2.2供试品溶液的制备”’项下方法制备，得到6个批次样品的供试品溶液，然后按“2.1对照品溶液的制备”项下方法制备对照品溶液。按“3.色谱条件的确定”项下确定的条件依次将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，测定青蒿素含量，见表4。
表4多批次青蒿干叶样品含量测定结果
样品名称 青蒿素含量‰
S18003 15.99
S18004 15.14
F18156 16.92
R18190 17.40
R18191 15.08
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (9)

1.一种青蒿中青蒿素的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.供试品溶液的制备：取青蒿干叶打成细粉，然后精密称取细粉置于圆底烧瓶中，加入石油醚提取两次，过滤，收集两次提取的滤液，合并滤液，然后加入石油醚定容，接着静置2小时以上，得提取液，之后将提取液加入硅胶层析柱中进行上样，吸附形成三条色带，采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱液进行洗脱，收集中间色带的洗脱液作为主成分溶液，再精密吸取主成分溶液体积的1/20-1/10于65-70℃蒸干得残渣，接着加入主成分溶液体积1/20-1/10的醇溶剂溶解残渣并定容，然后超声处理1-3分钟，再冷藏0.5-1.5小时以上，最后吸取上清液用微孔滤膜过滤，收集续滤液，得供试品溶液；
b.对照品溶液的制备：精密称取青蒿对照品，按料液比为1:1000-2000g/ml加入醇溶剂进行溶解，得对照品溶液；
c.样品测定：将对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱中，以峰面积外标法计算青蒿素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种青蒿中青蒿素的含量测定方法，其特征在于，步骤a中所述细粉与第一次提取加入的石油醚的料液比为1:15-25g/ml，所述细粉与第二次提取加入的石油醚的料液比为1:10-20g/ml；步骤a中按定容后，细粉与石油醚的料液比为1：35-45g/ml加入石油醚定容。
3.根据权利要求1所述的一种青蒿中青蒿素的含量测定方法，其特征在于，步骤a中所述提取两次的方法为：每次在60-70℃加热回流，加热煮沸后计时提取0.5-1.5小时。
4.根据权利要求1所述的一种青蒿中青蒿素的含量测定方法，其特征在于，步骤a中所述硅胶层析柱的填料为球形多孔层析硅胶、填料粒径为100-200目、填料填装量为每200ml提取液装填3-5g。
5.根据权利要求1所述的一种青蒿中青蒿素的含量测定方法，其特征在于，步骤a中所述洗脱液中乙酸乙酯与石油醚的体积比为3-8：100。
6.根据权利要求1所述的一种青蒿中青蒿素的含量测定方法，其特征在于，步骤a中所述洗脱液的洗脱流速为3-9ml/min。
7.根据权利要求1所述的一种青蒿中青蒿素的含量测定方法，其特征在于，步骤c中所述样品测定的液相条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，流动相由乙腈和水组成，乙腈在流动相中的体积百分比为40％-60％，流速为0.6-1.0ml/min，波长为208-212nm，柱温为25-35℃。
8.根据权利要求7所述的一种青蒿中青蒿素的含量测定方法，其特征在于，所述样品测定的液相条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，流动相由乙腈和水组成，乙腈在流动相中的体积百分比为44％，流速为0.7ml/min，波长为210nm，柱温为30℃。
9.根据权利要求1所述的一种青蒿中青蒿素的含量测定方法，其特征在于，所述醇溶剂为甲醇或乙醇。
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