CN111122728B - 一种桂枝茯苓胶囊的检测方法 - Google Patents

一种桂枝茯苓胶囊的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111122728B
CN111122728B CN201911349655.9A CN201911349655A CN111122728B CN 111122728 B CN111122728 B CN 111122728B CN 201911349655 A CN201911349655 A CN 201911349655A CN 111122728 B CN111122728 B CN 111122728B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
capsule
cassia twig
phase
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911349655.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111122728A (zh
Inventor
肖伟
张探
张弟
谭维
周军
王振中
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN201911349655.9A priority Critical patent/CN111122728B/zh
Publication of CN111122728A publication Critical patent/CN111122728A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111122728B publication Critical patent/CN111122728B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/32—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/047—Standards external
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G01N2030/146—Preparation by elimination of some components using membranes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/32—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed
    • G01N2030/324—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed speed, flow rate

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种桂枝茯苓胶囊的检测方法，包括如下步骤：取桂枝茯苓胶囊供试品和对照品进行检测，该检测的色谱条件为：色谱柱选自规格为3.0×50mm、1.8μm的Agilent Eclipse Plus C18；流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、A相为1mM甲酸水；流速为0.2～0.4mL/min；柱温为35～45℃；根据检测结果，获得桂枝茯苓胶囊的成分信息或含量信息。本发明提出的分析方法可以通过一次正离子和负离子检测快速、准确地完成对桂枝茯苓胶囊中多个有效成分的分析。

Description

一种桂枝茯苓胶囊的检测方法
技术领域
本发明涉及分析技术领域，特别涉及一种桂枝茯苓胶囊的检测方法。
背景技术
桂枝茯苓胶囊处方源于汉代张仲景的经典名方《金匮要略》桂枝茯苓丸，有着两千余年的临床用药历史，是历代医家治疗妇科疾病的良方。桂枝茯苓胶囊是在桂枝茯苓丸基础上经过工艺改进、质量标准提高、药理毒理及临床研究研制而成的，具有活血化瘀、缓消癥块之功效，主要用于治疗妇科原发性痛经、子宫肌瘤、慢性盆腔炎包块、子宫内膜异位症、卵巢囊肿等。桂枝茯苓胶囊于2006年11月通过美国FDA IND审查，2007年4月在美国启动Ⅱ期临床试验研究，现已基本完成Ⅱb期临床试验。
虽然桂枝茯苓胶囊在临床应用中表现出较好的疗效，现已对桂枝茯苓胶囊的物质基础及作用机制、生产工艺、质量控制及临床应用等进行了一系列研究工作，但仍有许多工作尚需深入开展。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在结合采用LC/MS/MS技术建立一种获得桂枝茯苓胶囊成分信息或含量信息的方法。
本发明提出了一种桂枝茯苓胶囊的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
取桂枝茯苓胶囊供试品和对照品进行检测，该检测的色谱条件为：色谱柱选自规格为3.0×50mm、1.8μm的Agilent Eclipse Plus C18；流动相中的B相为1mM甲酸的甲醇、A相为1mM甲酸水；流速为0.2～0.4mL/min；柱温为35～45℃；梯度洗脱条件如下：
正离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000021
负离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000022
根据检测结果，获得桂枝茯苓胶囊的成分信息或含量信息。
本发明另一具体实施方式中，所述供试品的制备为：称取桂枝茯苓胶囊0.2g，用甲醇溶液20mL超声提取30min，在3000rpm下离心10min，取上清并经0.2μm滤膜过滤后进样分析。
本发明另一具体实施方式中，所述流速为0.3mL/min，柱温为40℃。
本发明另一具体实施方式中，所述对照品选自丹皮酚、桂皮醛、茯苓酸、桂皮酸、苦杏仁苷、芍药苷、苯甲酸、芍药苷内酯、去氢土莫酸、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷中的一种或多种。
所述对照品溶液的制备包括：将各对照品置于容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，超声使其溶解后，配制成一定浓度如1.0mg/mL的储备液，然后用50％甲醇梯度稀释得到一系列的对照品溶液。
前述方法中，含量信息可利用前述检测条件建立一种或多种对照品的标准曲线，从而根据供试品检测结果计算有效成分的含量。
本发明另一具体实施方式中，所述桂枝茯苓胶囊供试品和对照品可选地包括内标物，所述内标物可选地为甲苯磺丁脲。
本发明还提出了一种桂枝茯苓胶囊化学成分分析方法，其特征在于，用LC/MS/MS对桂枝茯苓胶囊进行分析，其中，色谱条件和质谱条件分别为：
色谱条件：色谱柱选自规格为3.0×50mm、1.8μm的Agilent Eclipse Plus C18；流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、A相为1mM甲酸水；流速为0.2～0.4mL/min；柱温为35～45℃；梯度洗脱条件如下：
正离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000031
负离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000032
质谱条件：选用电喷雾离子源，正离子源参数：喷雾电压4500V，辅助气N2150 Arb，辅助气N2260 Arb，辅助气加热温度500℃，气帘气35Arb，碰撞气N2Medium，扫描方式为多重离子反应监测；负离子源参数：喷雾电压-4500V，辅助气1N250 Arb，辅助气2N260 Arb，辅助气加热温度500℃；气帘气35Arb，碰撞气N2Medium，扫描方式为多重离子反应监测。
利用该化学成分分析方法不仅可以迅速分离桂枝茯苓胶囊化学成分中各主要化学成分，还可获得桂枝茯苓胶囊化学成分中各主要化学成分的具体信息。
本发明另一具体实施方式中，所述流速为0.3mL/min，柱温为40℃。
本发明还提出了一种桂枝茯苓胶囊的生物分析方法，其特征在于，该方法包括，用LC/MS/MS对取处理后的桂枝茯苓胶囊血浆样品和标准血浆样品进行检测，该方法的色谱条件：色谱柱选自规格为3.0×50mm、1.8μm的Agilent Eclipse Plus C18；流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、A相为1mM甲酸水；流速为0.2～0.4mL/min；柱温为35～45℃；梯度洗脱条件如下：
正离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000041
负离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000042
质谱条件：选用电喷雾离子源，正离子源参数：喷雾电压4500V，辅助气N2150 Arb，辅助气N2260 Arb，辅助气加热温度500℃，气帘气35Arb，碰撞气N2Medium，扫描方式为多重离子反应监测；负离子源参数：喷雾电压-4500V，辅助气1N250 Arb，辅助气2N260 Arb，辅助气加热温度500℃；气帘气35Arb，碰撞气N2Medium，扫描方式为多重离子反应监测根据检测结果，获得桂枝茯苓胶囊在体内的成分信息或含量信息；
根据检测结果，获得桂枝茯苓胶囊在体内的成分信息或含量信息。
本发明一具体实施方式中，所述标准血浆样品为加入对照品的空白血浆。
本发明一具体实施方式中，所述桂枝茯苓胶囊血浆样品为给药后一定时间内所取得的血浆。
本发明另一具体实施方式中，所述对照品选自丹皮酚、桂皮醛、茯苓酸、桂皮酸、苦杏仁苷、芍药苷、苯甲酸、芍药苷内酯、去氢土莫酸、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷中的一种或多种。
本发明另一具体实施方式中，所述对照品选自去氢土莫酸、桂皮酸、苦杏仁苷、芍药苷、苯甲酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷和丹皮酚；同时，可根据各对照品得到各自的标准曲线，并通过标准曲线计算血浆样品中具体成分的含量，从而开展指标性成分/活性成分的药动学研究。
本发明另一实施方式中，所述处理为：取血浆样品，加入内标溶液，沉淀蛋白，振荡后离心，取上清液；该内标液选自甲苯磺丁脲。
本发明另一实施方式中，所述处理后的桂枝茯苓胶囊血浆样品和/或标准血浆样品还包括内标物，所述内标物可选地为甲苯磺丁脲。
本发明检测的目标成分包括正离子源(丹皮酚、桂皮醛)和负离子源(茯苓酸、桂皮酸、苦杏仁苷、芍药苷、苯甲酸、芍药苷内酯、去氢土莫酸、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷)，本发明通过筛选得到的分析方法可以通过一次正离子和负离子检测快速、准确地完成对桂枝茯苓胶囊中多个有效成分的分析。而且，本发明选择了合适的样品处理方式，以及合适的对照品以及内标物，能快速、准确地检测桂枝茯苓胶囊给药后血浆样品的主要有效成分的含量，而且选择了多达8个指标作为标性成分/活性成分的研究对象，更为准确地反映了桂枝茯苓胶囊在体内的药动学特征。上述方法的精密度、准确度及回收率等均良好，满足样品的检测要求，因而可应用于制剂的质量评价。
附图说明
图1为本发明正离子色谱条件1的色谱图；
图2为本发明正离子色谱条件1的色谱图；
图3为本发明正离子色谱条件1的色谱图；
图4为本发明正离子色谱条件1的色谱图；
图5为本发明正离子色谱条件1的色谱图；
图6为本发明正离子色谱条件1的色谱图；
图7为本发明丹皮酚的色谱图：A：空白样品；B：加入IS的样品；C：加入标准溶液和IS的样品；
图8为本发明桂皮醛的色谱图：A：空白样品；B：加入IS的样品；C：加入标准溶液和IS的样品；
图9为本发明桂皮酸的色谱图：A：空白样品；B：加入IS的样品；C：加入标准溶液和IS的样品；
图10为本发明茯苓酸的色谱图：A：空白样品；B：加入IS的样品；C：加入标准溶液和IS的样品；
图11为本发明苦杏仁苷的色谱图：A：空白样品；B：加入IS的样品；C：加入标准溶液和IS的样品；
图12为本发明芍药苷的色谱图：A：空白样品；B：加入IS的样品；C：加入标准溶液和IS的样品；
图13为本发明苯甲酸的色谱图：A：空白样品；B：加入IS的样品；C：加入标准溶液和IS的样品；
图14为本发明芍药内酯苷的色谱图：A：空白样品；B：加入IS的样品；C：加入标准溶液和IS的样品；
图15为本发明去氢土莫酸的色谱图：A：空白样品；B：加入IS的样品；C：加入标准溶液和IS的样品；
图16为本发明氧化芍药苷的色谱图：A：空白样品；B：加入IS的样品；C：加入标准溶液和IS的样品；
图17为本发明苯甲酰芍药苷的色谱图：A：空白样品；B：加入IS的样品；C：加入标准溶液和IS的样品；
图18为本发明苯甲酰氧化芍药苷的色谱图：A：空白样品；B：加入IS的样品；C：加入标准溶液和IS的样品；
图19为本发明雌性SD大鼠灌胃给予0.5g/kg桂枝茯苓胶囊后的时间-血药浓度曲线；
图20为本发明雌性SD大鼠灌胃给予1.5g/kg桂枝茯苓胶囊后的时间-血药浓度曲线；
图21为本发明雌性SD大鼠灌胃给予3g/kg桂枝茯苓胶囊后的时间-血药浓度曲线。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
其次，需要注意的是，本发明所涉及的未注明的浓度均为体积百分含量(v/v)。其它除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。另，本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明。
实施例1生物样品中桂枝茯苓胶囊的相关物质的浓度测定方法
1、实验材料
1.1标准品及试剂
标准品：桂皮酸(中检院)；桂皮醛(中检院)；丹皮酚(中检院)；苦杏仁苷(中检院)；芍药苷(中检院)；苯甲酸(中检院)；茯苓酸(成都曼思特生物科技有限公司)；芍药内酯苷(成都曼思特生物科技有限公司)；苯甲酰芍药苷(成都曼思特生物科技有限公司)；氧化芍药苷(成都曼思特生物科技有限公司)；去氢土莫酸(天津万象恒远科技有限公司)；苯甲酰氧化芍药苷(江苏康缘药业股份有限公司)。
试剂：IS甲苯磺丁脲(sigma)HPLC级乙腈(默克)；HPLC级甲醇(默克)；MS级甲酸(默克)
1.2仪器
AB API5500质谱仪，ESI离子源(美国AB公司)；-70℃超低温冰箱(海尔)；XW-80A型微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；Centrifuge 5424型高速离心机(eppendorf)；Mettler AE 240型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)
2、实验方法
2.1溶液的配制
2.1.1标准工作液的配制
标准品储备液：分别精密称取丹皮酚、桂皮醛、茯苓酸、桂皮酸、苦杏仁苷、芍药苷、苯甲酸、芍药苷内酯、去氢土莫酸、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷5mg、将其置于5mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，超声使其溶解后，配制成浓度为1.0mg/mL的储备液。
内标储备液(IS-SS)：精密称取甲苯磺丁脲5mg、将其置于5mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，超声使其溶解后，配制成浓度为1.0mg/mL的储备液。
标准品工作液：用50％甲醇梯度稀释，配制成20、10、5、2、1、0.4、0.2、0.08μg/mL的一系列混合工作液。
2.1.2内标(IS)溶液的配制
取浓度为1mg/mL甲苯磺丁脲对照品溶液5μL，加甲醇1000mL，稀释成浓度为5ng/mL的内标工作液。
2.2生物样品前处理
取大鼠血浆样品50μL，加入150μL的内标溶液，沉淀蛋白，充分振荡5min，13000rpm离心10min后，取上清液进样分析。
2.3分析条件
2.3.1色谱条件筛选
正离子色谱条件1：色谱柱选自规格为3.0×50mm、1.8μm的Agilent SB C18；流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、A相为1mM甲酸水；流速为0.3mL/min；柱温为40℃。梯度洗脱条件如下：
正离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000091
得到的图谱如图1所示，由图1可知：该梯度洗脱下丹皮酚和桂皮醛峰形太差和保留时间太短均达不到分析要求。
正离子色谱条件2：色谱柱选自规格为3.0×50mm、1.8μm的Agilent Eclipse PlusC18；流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、A相为1mM甲酸水；流速为0.3mL/min；柱温为40℃。梯度洗脱条件如下：
正离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000092
得到的图谱如图2所示，由图2可知：更换色谱柱和更改梯度洗脱下丹皮酚和桂皮醛峰形有拖尾和保留时间拖后，均达不到分析要求。
正离子色谱条件3：色谱柱选自规格为3.0×50mm、1.8μm的Agilent Eclipse PlusC18；流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、A相为1mM甲酸水；流速为0.3mL/min；柱温为40℃。梯度洗脱条件如下：
正离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000101
得到的图谱如图3所示，由图3可知：更改梯度洗脱下丹皮酚和桂皮醛峰形和保留时间均达到分析要求。
负离子色谱条件1：色谱柱选自规格为3.0×50mm、1.8μm的Agilent SB C18；流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、A相为1mM甲酸水；流速为0.3mL/min；柱温为40℃。梯度洗脱条件如下：
负离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000102
得到的图谱如图4所示，由图4可知：该梯度洗脱下只有内标甲苯磺丁脲峰形和保留时间达到分析要求；其他成分峰形太差和保留时间太短均达不到分析要求。
负离子色谱条件2：色谱柱选自规格为3.0×50mm、1.8μm的Agilent SB C18；流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、A相为1mM甲酸水；流速为0.3mL/min；柱温为40℃。梯度洗脱条件如下：
负离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000103
Figure BDA0002334324420000111
得到的图谱如图5所示，由图5可知：更改流动相浓度梯度使待测物的保留时间处于一个合适的时间，但是待测化合物的分型均出现不同程度的前拖尾现象，均不符合分析要求。
负离子色谱条件3：色谱柱选自规格为3.0×50mm、1.8μm的Agilent Eclipse PlusC18；流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、A相为1mM甲酸水；流速为0.3mL/min；柱温为40℃。梯度洗脱条件如下：
负离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000112
得到的图谱如图6所示，由图6可知：更改色谱柱后待测物的峰形较色谱条件2有很大改善，待测物的峰形和保留时间均符合分析要求。
根据前述筛选过程，本发明优选的色谱条件如下：
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(3.0×50mm，1.8μm)；流动相：B相1mM甲酸甲醇、A相1mM甲酸水；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量：2μL；梯度洗脱条件如表1、2所示：
表1正离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000113
表2负离子色谱洗脱条件
Figure BDA0002334324420000121
2.3.2质谱条件
选用电喷雾离子源(ESI)，正离子源参数：喷雾电压(IonSpray Voltage/IS)4500V；辅助气1(Ion Source Gas 1/GS 1，N2)50Arb；辅助气2(Ion Source Gas 2/GS 2，N2)60Arb；辅助气加热温度(Temperature/TEM)500℃；气帘气(Curtain Gas/CUR)35Arb；碰撞气(Collision Gas/CAD，N2)Medium；扫描方式为多重离子反应监测(MRM)；所检测化合物的离子对，碰撞电压(Collision Energy/CE)和去簇电压(Declustering Potential/DP)见表3。负离子源参数：喷雾电压(IonSpray Voltage/IS)-4500V；辅助气1(Ion Source Gas1/GS 1，N2)50Arb；辅助气2(Ion Source Gas 2/GS 2，N2)60Arb；辅助气加热温度(Temperature/TEM)500℃；气帘气(Curtain Gas/CUR)35Arb；碰撞气(Collision Gas/CAD，N2)Medium；扫描方式为多重离子反应监测(MRM)；所检测化合物的离子对，碰撞电压(Collision Energy/CE)和去簇电压(Declustering Potential/DP)见表4。
表3正离子化合物及IS质谱检测参数
Figure BDA0002334324420000122
表4负离子化合物及IS质谱检测参数
Figure BDA0002334324420000123
Figure BDA0002334324420000131
2.4标准曲线
取90μL空白SD大鼠血浆若干份，分别依次加入10μL系列标准品工作液，配制成系列标准SD大鼠血浆样品，按本节“2.2”项下方法处理后进样分析。以样品浓度为自变量，样品中待测分析物和IS的峰面积比值为因变量，采用加权法(1/C)，计算待测分析物在SD大鼠血浆中的线性回归方程。
2.4.2精密度和准确度
取90μL空白SD大鼠血浆样品若干份，按本节“2.4.1”项下方法配制待测化合物低浓度(100ng/mL)、中浓度(500ng/mL)、高浓度(2000ng/mL)的质控样品，每一浓度水平平行制备6份，根据随行血浆标准曲线，计算每份血浆样品中待测化合物的测定浓度，并计算低、中、高浓度质控样品的精密度与准确度。
2.4.3基质效应考查
空白生物样品按“2.2”所述的方法经MeOH处理后取上清，加入150μL至2000、500、100ng/mL的50μL化合物标准溶液后进行LC/MS/MS分析。同时，分别用150μL含内标混合物的甲醇溶液加入至2000、500、100ng/mL的50μL化合物标准溶液制成对照样品后进行LC/MS/MS分析。分析过程中化合物与内标所受的基质效应按下式计算而得：
化合物的基质效应(％)＝(空白血浆处理后加入各化合物的色谱峰面积/对照溶液样品化合物色谱峰面积)×100％
2.4.4血样提取回收率
分别取2000、500、100ng/mL三种不同浓度的标准血浆样品(50μL)，加入150μL含IS混合物的甲醇溶液。按“2.2”方法进行样品前处理，进行LC/MS/MS分析。同时，50μL空白血浆样品按“2.2”所述的方法经甲醇沉淀处理后得到上清溶液，用其加入至2000、500、100ng/mL的50μL化合物标准溶液后进行LC/MS/MS分析。血浆中化合物和IS的提取回收率按下式计算而得：
化合物提取回收率(％)＝血浆样品的各化合物的色谱峰面积/处理后的空白血浆中加入化合物色谱峰面积×100％
3、实验结果
3.1方法特异性考察
在“2.2”条件下，各化合物的色谱保留时间(tR)分别为：丹皮酚2.20min；桂皮醛2.15min；桂皮酸5.14min；茯苓酸7.39min；苦杏仁苷3.37min；芍药苷3.85min；苯甲酸4.53min；芍药苷内酯3.58min；去氢土莫酸6.82min；氧化芍药苷3.16min、苯甲酰芍药苷5.16min；苯甲酰氧化芍药苷4.77min。甲苯磺丁脲正负离子的色谱保留时间(tR)分别为2.15min和5.40min。在服药前的空白血样中未测到各化合物，内源性物质对分析无明显干扰(图7-图18)。
3.2测定生物样品中各化合物浓度的线性回归方程
测定生物样品中各化合物浓度的线性回归方程见表5，结果表明上述各标准曲线线性良好，可用于定量分析。
表5各化合物浓度的线性回归方程
Figure BDA0002334324420000141
Figure BDA0002334324420000151
3.3各化合物与IS的基质效应及血样前处理过程中的提取回收率
分析过程中各化合物与IS所受的基质效应和血样处理过程中的提取回收率考察结果见表6。结果表明：该方法可以用来检测血浆中的桂枝茯苓胶囊的有效成分。
表6各化合物与IS的基质效应及血样前处理过程中的提取回收率
Figure BDA0002334324420000152
Figure BDA0002334324420000161
3.4准确性及精密度考查
分析生物样品中各化合物浓度的准确性和精密度见表7。
表7分析生物样品中各化合物浓度的准确性和精密度
Figure BDA0002334324420000162
Figure BDA0002334324420000171
实施例2桂枝茯苓胶囊SD大鼠药代动力学研究
1、实验材料
1.1药物及试剂
受试药物：桂枝茯苓胶囊
1.2动物
SD大鼠，体质量(250±20g)，18只，由南通大学提供，动物合格证号：SCXK(苏)2014--0001
2、SD大鼠体内的药代动力学研究
2.1给药方案与样品采集
18只SD大鼠，雌性，随机分成3组，实验前一天禁食12h以上，不禁水。随机分成三个实验组0.5mg/kg组、1.5mg/kg组和3mg/kg组。，灌胃体积为1mL/100g，灌胃给药后，分别于5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h取前肢静脉血0.2mL，EDTA抗凝，冰浴放置，4℃下于2小时内3500r·min-1离心10min收集上层血浆，-70℃冰冻保存。
2.2数据分析
数据处理均由AB Sciex Multi Quant 2.1软件自动计算获得，并采用DAS 3.2.8药代动力学软件，以非房室模型统计分析各给药条件下指标性成分的药代动力学参数
3、实验结果
图19～图21为雌性SD大鼠分别给药0.5、1.5、3g/kg后不同时间点的相关血药浓度-时间曲线。表13所列为利用DAS3.0程序进行非房室模型计算所得的给药后各化合物的药动学参数。结合大鼠给药桂枝茯苓胶囊后的体内物质暴露分析和血浆药动学研究结果可知，本发明的方法可以准确测得不同时间的桂枝茯苓胶囊有效成分的学药浓度，可选择的机体对给药桂枝茯苓胶囊暴露的药代markers包括：去氢土莫酸、桂皮酸、苦杏仁苷、芍药苷、苯甲酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷和丹皮酚，通过对这些成分进行药动学研究，可以更准确地反映药物的药动学特点，为桂枝茯苓胶囊的深入研究和质量控制提供依据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种桂枝茯苓胶囊的LC/MS/MS检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
取桂枝茯苓胶囊供试品和对照品进行检测，该检测的色谱条件如下：色谱柱选自规格为3.0×50 mm、1.8 µm的Agilent Eclipse Plus C18；流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、A相为1mM甲酸水；流速为0.2～0.4mL/min；柱温为35～45℃；梯度洗脱条件如下：
正离子色谱洗脱条件
时间（min） 流动相B（%） 0.0 2 1.0 100 4 100 6.0 2
洗脱出的物质为丹皮酚和桂皮醛；
负离子色谱洗脱条件
时间（min） 流动相B（%） 0.0 2 6.0 100 7.5 100 10.0 2
洗脱出的物质为茯苓酸、桂皮酸、苦杏仁苷、芍药苷、苯甲酸、芍药苷内酯、去氢土莫酸、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷和苯甲酰氧化芍药苷；
根据前述色谱条件，建立对照品的标准曲线，比对获得桂枝茯苓胶囊的成分含量信息。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品的制备为，称取桂枝茯苓胶囊0.2 g，用甲醇溶液20 mL超声提取30 min，在3000 rpm下离心10 min，取上清并经 0.2μm 滤膜过滤后进样分析。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流速为0.3mL/min，柱温为40℃。
4.一种桂枝茯苓胶囊的生物分析方法，其特征在于，该方法包括，用LC/MS/MS对处理后的桂枝茯苓胶囊血浆样品和标准血浆样品进行检测，该方法包括如下的色谱条件和质谱条件：
色谱条件：色谱柱选自规格为3.0×50 mm、1.8 µm的Agilent Eclipse Plus C18；流动相中的B相为1mM甲酸甲醇、A相为1mM甲酸水；流速为0.2～0.4mL/min；柱温为35～45℃；梯度洗脱条件如下：
正离子色谱洗脱条件
时间（min） 流动相B（%） 0.0 2 1.0 100 4 100 6.0 2
洗脱出的物质为丹皮酚和桂皮醛；
负离子色谱洗脱条件
时间（min） 流动相B（%） 0.0 2 6.0 100 7.5 100 10.0 2
洗脱出的物质为茯苓酸、桂皮酸、苦杏仁苷、芍药苷、苯甲酸、芍药苷内酯、去氢土莫酸、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷和苯甲酰氧化芍药苷；
质谱条件：选用电喷雾离子源，正离子源参数：喷雾电压4500 V，辅助气N2150 Arb，辅助气N2260 Arb，辅助气加热温度500℃，气帘气35 Arb，碰撞气N2Medium，扫描方式为多重离子反应监测；负离子源参数：喷雾电压-4500 V，辅助气1N250 Arb，辅助气2N260 Arb，辅助气加热温度500℃；气帘气35 Arb，碰撞气N2Medium，扫描方式为多重离子反应监测；
根据检测结果，获得桂枝茯苓胶囊的成分含量信息。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述标准血浆样品为加入对照品的空白血浆。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述处理为：取血浆样品，加入内标溶液，沉淀蛋白，振荡后离心，取上清液；该内标溶液选自甲苯磺丁脲。
7.根据权利要求4-5任一所述的检测方法，其特征在于，
处理后的桂枝茯苓胶囊血浆样品和/或标准血浆样品还包括内标物，所述内标物选自甲苯磺丁脲。
CN201911349655.9A 2019-12-24 2019-12-24 一种桂枝茯苓胶囊的检测方法 Active CN111122728B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911349655.9A CN111122728B (zh) 2019-12-24 2019-12-24 一种桂枝茯苓胶囊的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911349655.9A CN111122728B (zh) 2019-12-24 2019-12-24 一种桂枝茯苓胶囊的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111122728A CN111122728A (zh) 2020-05-08
CN111122728B true CN111122728B (zh) 2021-03-26

Family

ID=70500070

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911349655.9A Active CN111122728B (zh) 2019-12-24 2019-12-24 一种桂枝茯苓胶囊的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111122728B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1546129A (zh) * 2003-11-28 2004-11-17 江苏康缘药业股份有限公司 桂枝茯苓组合物的制备工艺及其用途
CN1843424A (zh) * 2006-02-13 2006-10-11 浙江大德药业集团有限公司 桂枝茯苓泡腾片及制备方法和质量控制方法
CN104815025A (zh) * 2015-05-25 2015-08-05 陈世忠 一种桂枝茯苓制剂的制备工艺和质量控制方法
CN106442759A (zh) * 2016-08-29 2017-02-22 江苏康缘药业股份有限公司 一种桂枝茯苓胶囊中多糖含量的检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002032438A1 (fr) * 2000-09-13 2002-04-25 Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Composition pharmaceutique traitant les maladies gynecologiques associees a la stase sanguine, les maladies cardio-vasculaires et cerebrales, les maladies respiratoires et autres maladies analogues

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1546129A (zh) * 2003-11-28 2004-11-17 江苏康缘药业股份有限公司 桂枝茯苓组合物的制备工艺及其用途
CN1843424A (zh) * 2006-02-13 2006-10-11 浙江大德药业集团有限公司 桂枝茯苓泡腾片及制备方法和质量控制方法
CN104815025A (zh) * 2015-05-25 2015-08-05 陈世忠 一种桂枝茯苓制剂的制备工艺和质量控制方法
CN106442759A (zh) * 2016-08-29 2017-02-22 江苏康缘药业股份有限公司 一种桂枝茯苓胶囊中多糖含量的检测方法

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
An UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of multiple constituents in Guizhi Fuling capsule with ultrafast positive/negative ionization switching;ZHANG Rong-Hua et al;《Chinese Journal of Natural Medicines》;20181231;第16卷(第4期);第0313-0320页 *
Comprehensive chemical profiling of Guizhi Fuling capsule by the combined use of gas chromatography–mass spectrometry with a deconvolution software and rapid-resolution liquid chromatography quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry;Ya-Qiong Wang et al;《Biomedical Chromatography》;20120202;第26卷;第1287页右栏第6段；第1288页左栏第3-4段；第1290页右栏第3段；第1293页左栏第1段，右栏第1段；图2，表2，表3 *
High-throughput metabolomics used to identify potential therapeutic targets of Guizhi Fuling Wan against endometriosis of cold coagulation and blood stasis;Xiu-hong Wu et al;《Royal Society of Chemistry》;20181231;第8卷;第19238-19250页 *
HPLC测定灌胃桂枝茯苓胶囊后Beagle犬血浆中的丹皮酚及其药物动力学研究;廖正根 等;《华西药学杂志》;20071231;第22卷(第6期);第621-623页 *
Pharmacokinetic–pharmacodynamic modeling to study the antidysmenorrhea effect of Guizhi Fuling capsule on primary dysmenorrhea rats;Yezhe Cheng et al;《Phytomedicine》;20181231;第48卷;第142页右栏第4段第3行；第143页右栏第1段 *
Simultaneous determination of seven bioactive components in Guizhi Fuling capsule by microwave-assisted extraction combined with ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry;Yang Sui et al;《Natural Product Research》;20161231;第30卷(第3期);第354-357页 *
Simultaneous determination of six bioactive constituents of GuizhiFuling Capsule in rat plasma by UHPLC–MS/MS: Application to apharmacokinetic study;Longshan Zhao et al;《Journal of Chromatography B》;20151231;第1001卷;第49-57页 *
Systematic screening and characterization of multiple constituents in Guizhi Fuling capsule and metabolic profiling of bioactive components in rats using ultra-high-performance liquid chromatography/quadrupole-time-of-flight mass spectrometry;Yu Zhang et al;《Journal of Chromatography B》;20171231;第1061-1062卷;第475-476页第2.3.2节；第476页第2.4节，第2.5.2节；第483页第3.3节第9-11行，16-18行；图2，表1 *
UPLC/Q-TOF-MS 快速分析桂枝茯苓胶囊的入血成分;尹权微 等;《中国实验方剂学杂志》;20161130;第22卷(第21期);第83-86页 *
Ya-Qiong Wang et al.Comprehensive chemical profiling of Guizhi Fuling capsule by the combined use of gas chromatography–mass spectrometry with a deconvolution software and rapid-resolution liquid chromatography quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry.《Biomedical Chromatography》.2012,第26卷第1286-1296页. *
桂枝茯苓胶囊主要效应成分在比格犬体内的药代动力学;朱克近 等;《中国中药杂志》;20110430;第36卷(第8期);第1015-1018页 *
液相色谱-质谱联用法对桂枝茯苓胶囊指纹图谱中特征峰的鉴定;王振中 等;《南京中医药大学学报》;20090531;第25卷(第3期);第194-196页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111122728A (zh) 2020-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107328871B (zh) Uplc-ms/ms联用检测人血浆和/或脑脊液中奥希替尼的药物浓度
CN108508107B (zh) 一种同时测定血浆中血必净注射液有效成分的方法
CN106814150B (zh) 一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素k1的方法
CN112415116B (zh) 一种大鼠血浆中芦荟苦素的lc-ms/ms测定方法
CN111122728B (zh) 一种桂枝茯苓胶囊的检测方法
CN112782322A (zh) 基于lc-ms同时测定人血浆中8种抗结核药物的方法
CN110988198A (zh) 一种痹痛宁胶囊的含量测定方法
CN117092228A (zh) 一种基于hplc-ms/ms联用检测生物样品中水黄皮素的方法
CN113740198B (zh) 测定马应龙麝香痔疮膏中黄凡士林含量的方法
CN111812240B (zh) 一种缩宫素及三种杂质的分离方法和应用
CN113030343B (zh) 一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法
CN107045031A (zh) 人血浆中沙格列汀和5‑羟基沙格列汀的lc‑ms/ms高通量检测方法
CN112540138A (zh) 一种血浆中丹酚酸b、阿司匹林、水杨酸的联合定量测定方法
CN109655535B (zh) 七味通痹口服液的检测方法
CN115561331A (zh) 一种测定组织中扶正化瘀制剂柚皮素和染料木素浓度的方法
CN109298081B (zh) 一种新利司他中杂质a生物样品的测定方法
CN117129597B (zh) 一种hplc-ms/ms法检测血浆中瑞卢戈利的方法
CN111679005A (zh) 血浆中甘草酸苷的检测方法
CN106568790B (zh) 一种结合1h-nmr和craft技术定性和定量分析天麻中有效成分的方法
CN113933415A (zh) 一种hplc-ms/ms测定人血浆中糠酸酯浓度的方法
CN117030905B (zh) 一种快速定量血浆中丁二酮浓度的lc-ms/ms分析方法
CN118330063A (zh) Lc-ms/ms法测定人血浆中吲哚美辛浓度的方法
CN109946408B (zh) 测定人血浆中连翘苷及代谢物苷元葡萄糖醛酸结合物、苷元硫酸结合物的检测方法
CN107632075A (zh) 金柴抗感胶囊三种成分含量同时测定方法及其hplc指纹图谱构建方法
CN110618221B (zh) 一种水产品中脱氢胆酸的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant