CN111117609B - 基于荧光共振能量转移比率定量检测核黄素的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属荧光探针技术领域,提供一种基于荧光共振能量转移比率定量检测核黄素的荧光探针及其制备方法和应用。以葡萄糖作碳源,乙二胺作氮源,浓磷酸作磷源,浓盐酸作氯源,通过酸碱中和反应放热碳化法制备氮磷氯共掺杂碳量子点NPCl‑CQDs,将NPCl‑CQDs粉末溶于超纯水,离心除去不溶物,过滤除去杂质,冷冻干燥得荧光探针NPCl‑CQDs固体粉末。利用比率荧光检测法确定核黄素浓度与NPCl‑CQDs荧光强度之间的线性关系。通过加标回收实验检测实际样品中核黄素的含量并计算加标回收率。操作简便,背景干扰低,灵敏度高,无需昂贵的仪器设备,检测成本低,可快速、高效、比率定量检测实际样品中核黄素的含量,有良好的重现性。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域,具体涉及一种基于荧光共振能量转移比率定量检测核黄素的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
核黄素,即维生素B2(Vitamin B2,VB2),是人体必需的13种维生素之一,它能够参与生物体内生物氧化与能量代谢,促进生长发育,维护皮肤和细胞膜的完整性,具有保护皮肤毛囊粘膜及皮脂腺的功能;能够参与细胞的生长代谢,是肌体组织代谢和修复的必需营养素;能够参与维生素B6和烟酸(VB3)的代谢,是B族维生素协调作用的一个典范。当生物体内缺乏核黄素时,就会影响机体的生物氧化,使代谢发生障碍。其病变多表现为口、眼和外生殖器部位的炎症,如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等,故其可用于上述疾病的防治。但是摄取过量的核黄素,可能会引起瘙痒、麻痹、流鼻血、灼热感、刺痛等症状。若正在服用抗癌药,如氨甲喋呤,过量的核黄素会减弱这些抗癌药物的效用。
目前已报道的检测核黄素的方法有:电化学法、分光光度法、免疫分析法、毛细管电泳法和高效液相色谱法等,虽然这些方法都有各自的优势,但是也存在一定的缺陷,比如步骤繁琐,耗时费力,仪器装置复杂昂贵,检测周期长,成本高,抗干扰能力弱以及准确度低等,限制了上述检测方法在实际中的应用。荧光法具有响应快、成本低和灵敏度高等优点,受到诸多研究者的青睐。因此,亟需发展一种快速、高效、荧光定量检测核黄素的方法。
碳量子点又称为碳纳米点,具有水溶性好、光致发光、荧光量子产率高、易于功能化、细胞毒性低、生物相容性好等优点。目前,碳量子点已被用于构筑了多种荧光探针,广泛用于各种金属离子、氨基酸、药物和环境污染物的检测。以其为基础,通过荧光共振能量转移,发展一种快速、高效、比率定量检测核黄素的方法具有重要的意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于荧光共振能量转移比率定量检测核黄素的荧光探针及其制备方法和应用。
本发明由如下技术方案实现的:一种基于荧光共振能量转移比率定量检测核黄素的荧光探针,以葡萄糖作为碳源,乙二胺作为氮源,浓磷酸作为磷源,浓盐酸作为氯源,通过酸碱中和反应放热碳化法制备氮磷氯共掺杂碳量子点NPCl-CQDs,将NPCl-CQDs粉末溶于超纯水,离心除去不溶物,过滤除去杂质,冷冻干燥得到荧光探针NPCl-CQDs固体粉末。
制备所述的基于荧光共振能量转移比率定量检测核黄素的荧光探针的方法,具体步骤如下:
(1)称量0.4 g葡萄糖,向其中加6 mL乙二胺,2 mL浓磷酸和2 mL浓盐酸,强酸(浓磷酸和浓盐酸)与强碱(乙二胺)中和放热,最高温度为90℃,将葡萄糖碳化得到棕色黏稠物;
(2)待反应体系温度冷却至室温后,将棕色黏稠物溶解于超纯水中,溶液在4000转/分钟下离心10分钟,上清液用0.45 µm微孔滤膜过滤,冷冻干燥,即得NPCl-CQDs固体粉末。
所用浓磷酸为85%的浓磷酸,浓度为14.63 mol/L;浓盐酸为36-38%的浓盐酸,浓度为12.0 mol/L。
所述的荧光探针定量检测核黄素的方法,具体步骤为:
(1)NPCl-CQDs储备液的制备:0.1 g NPCl-CQDs固体粉末中加入10 mL超纯水,超声使其充分溶解得到浓度为10 mg/mL的NPCl-CQDs储备液;
(2)核黄素储备液的制备:称取0.001 g 核黄素粉末,加入到20 mL超纯水中,超声使其充分溶解得到浓度为0.05 mg/mL(0.1328 mmol/L)的核黄素储备液;
(3)核黄素含量与NPCl-CQDs荧光强度的线性方程的获得:将若干体积的核黄素储备液加入到浓度为0.57 mg/mL的NPCl-CQDs溶液中,在368 nm激发波长下,记录NPCl-CQDs与核黄素混合溶液在453 nm和530 nm下的荧光强度比值I 530 nm /I 453 nm ;通过Origin 软件线性拟合核黄素浓度与I 530 nm /I 453 nm ,得到线性方程,当线性范围为0.50-10.18 μmol/L时,线性方程为:I 530 nm /I 453 nm = 0.1522c(核黄素) + 0.3674,R 2 = 0.9938;当线性范围为10.18-36.40 μmol/L时,线性方程为:I 530 nm /I 453 nm = 0.3809c(核黄素) - 2.2192,R 2 = 0.9910,最低检出限为7.50 nmol/L。其中,I 453 nm 为核黄素加入前后溶液在453 nm处的荧光强度,I 530 nm 为核黄素加入前后溶液在530 nm处的荧光强度。
利用所述的荧光探针定量检测核黄素的方法对待测样品检测,具体步骤如下:
(1)待测样品的检测:将待测样品溶于超纯水中,通过测量和计算加入样品前后NPCl-CQDs在530 nm和453 nm处比值的变化,代入线性方程即可得到样品中核黄素的含量;
(2)实际样品中核黄素的加标回收率的测定:向待测样品中加入NPCl-CQDs储备液,测得实际样品中核黄素的浓度,向体系中加入0.05 mg/mL核黄素储备液,测得加标浓度,计算得到实际样品中核黄素的加标回收率。
本发明的优点在于:碳源葡萄糖廉价易得,乙二胺、浓磷酸和浓盐酸均为普通试剂,容易采购。比率探针制备方法简单,无需昂贵仪器,可快速、高效、定量检测核黄素,所制备的荧光探针性能稳定,线性范围宽,抗干扰能力强,准确度和灵敏度高。
总之,与其他检测核黄素的方法相比,该方法具有快速有效,性能稳定,背景干扰低,无需昂贵的仪器设备,操作简便,检测成本低,灵敏度高等优点,为核黄素检测提供了一种全新的方法。
附图说明
图1为实施例1中所制备的NPCl-CQDs的紫外光谱图以及荧光光谱图;
图2为实施例1中所制备的NPCl-CQDs的激发波长依赖性光谱图;
图3为实施例2中各种金属离子(Fe3+,K+,Fe2+,Mg2+,Cu2+,Al3+,Ag+,Ca2+,Cr3+,Na+,Mn2+,Zn2+,Hg2+,Cd2+,Ba2+,Co2+)对核黄素检测的干扰实验结果图;
图4为实施例2中各种氨基酸(缬氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽)对核黄素检测的干扰实验结果图;
图5为实施例2中各种阴离子(Br-,I-,F-,CO3 2-,S2O3 2-,HCO3 2-,SO3 2-,NO3 -,HPO4 2-,NO2 -,H2PO4 -,Cl-)对核黄素检测的干扰实验结果图;
图6为实施例2中是其他B族维生素(VB1,VB3,VB7,VB9,VB12)对核黄素检测的干扰实验结果图;
图7为实施例3中利用核黄素滴定NPCl-CQDs溶液,NPCl-CQDs荧光强度的变化曲线图;
图8为实施例3中线性范围为0.50-10.18 μmol/L时核黄素浓度与NPCl-CQDs荧光强度的线性图;
图9为实施例3中线性范围为10.18-36.40 μmol/L时核黄素浓度与NPCl-CQDs荧光强度的线性图。
具体实施方式
实施例1:NPCl-CQDs的制备及表征
步骤一,称量0.4 g葡萄糖,向其中加入6 mL乙二胺、2 mL浓磷酸和2 mL浓盐酸,得到棕色黏稠物。
步骤二,待烧杯冷却至室温后,向其中加入30 mL超纯水,搅拌使其充分溶解,4000转/分钟离心10分钟,上清液用滤膜过滤,得到澄清的NPCl-CQDs溶液。
步骤三,冷冻干燥制得NPCl-CQDs固体粉末。
步骤四,称量0.1 g NPCl-CQDs固体粉末于烧杯中,向其中加入10 mL超纯水,超声使其充分溶解,得到浓度为10 mg/mL的NPCl-CQDs储备液。
性质表征见图1和图2。图1在NPCl-CQDs的紫外吸收光谱图中,有两个明显的吸收峰位于279 nm和317 nm,分别由C=O的n→π*跃迁和N/P/Cl掺杂产生的表面缺陷引起;图1中NPCl-CQDs的最佳激发和发射峰分别位于368 nm和453 nm。图2是NPCl-CQDs在不同激发波长下的发射光谱图,当激发波长从300 nm变化到430 nm时,发射波长由445 nm红移到488nm,说明NPCl-CQDs具有激发波长依赖性。
实施例2:核黄素检测的抗干扰实验
步骤一,分别准确称量一定质量金属离子(Fe3+,K+,Fe2+,Mg2+,Cu2+,Al3+,Ag+,Ca2+,Cr3+,Na+,Mn2+,Zn2+,Hg2+,Cd2+,Ba2+,Co2+)化合物,加入10 mL超纯水,超声溶解配制成浓度为0.1 mol/L的金属离子储备液。
步骤二,分别准确称量一定质量氨基酸(缬氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽),加入5 mL超纯水,超声溶解,配制成浓度为0.01 mol/L的氨基酸储备液。
步骤三,分别准确称量一定质量的阴离子(Br-,I-,F-,CO3 2-,S2O3 2-,HCO3 2-,SO3 2-,NO3 -,HPO4 2-,NO2 -,H2PO4 -,Cl-)化合物,加入5 mL超纯水,超声溶解,配制0.01 mol/L的阴离子储备液。
步骤四,分别准确称量一定质量的VB1,VB3,VB7,VB9,VB12,加入5 mL超纯水,超声溶解,配制0.01 mol/L的B族维生素储备液。
步骤五,测量浓度为0.57 mg/mL NPCl-CQDs溶液(530 μL)的荧光强度,记为F0;向溶液中加入10 µL金属离子储备液,此时金属离子浓度为1.85 mmol/L,测量此时混合溶液的荧光强度,记为F;再加入核黄素储备液70 µL,此时核黄素浓度为15.24 μmol/L,测量并计算此时混合溶液在530 nm和453 nm处荧光强度的比值,记为I 530 nm /I 453 nm 。实验结果见图3。
步骤六,测量浓度为0.57 mg/mL NPCl-CQDs溶液(530 μL)的荧光强度,记为F0;向溶液中加入10 µL氨基酸储备液,此时氨基酸浓度为1.85 mmol/L,测量此时混合溶液的荧光强度,记为F;再加入核黄素储备液70 µL,此时核黄素浓度为15.24 μmol/L,测量并计算此时混合溶液在530 nm和453 nm处荧光强度的比值,记为I 530 nm /I 453 nm 。实验结果见图4。
步骤七,测量浓度为0.57 mg/mL NPCl-CQDs溶液(530 μL)的荧光强度,记为F0;向溶液中加入10 µL阴离子储备液,此时阴离子浓度为1.85 mmol/L,测量此时混合溶液的荧光强度,记为F;再加入核黄素储备液70 µL,此时核黄素浓度为15.24 μmol/L,测量并计算此时混合溶液在530 nm和453 nm处荧光强度的比值,记为I 530 nm /I 453 nm 。实验结果见图5。
步骤八,测量浓度为0.57 mg/mL NPCl-CQDs溶液(530 μL)的荧光强度,记为F0;向溶液中加入10 µL其他B族维生素储备液,此时其他B族维生素的浓度为1.85 mmol/L,测量此时混合溶液的荧光强度,记为F;再加入核黄素储备液70 µL,此时核黄素浓度为15.24 μmol/L,测量并计算此时混合溶液在530 nm和453 nm处荧光强度的比值,记为I 530 nm /I 453 nm 。实验结果见图6。
图3-图6是金属离子、氨基酸、阴离子和其他B族维生素对核黄素检测的干扰性研究,说明核黄素检测不受金属离子、氨基酸、阴离子和其他B族维生素的干扰。结果说明NPCl-CQDs用于核黄素检测时具有良好的抗干扰性。
实施例3:核黄素滴定NPCl-CQDs的线性方程
步骤一,测量NPCl-CQDs(0.57 mg/mL)的荧光强度,分别记录NPCl-CQDs在530 nm和453 nm处的荧光强度,分别记为I 530 nm 和I 453 nm ,并计算比值I 530 nm /I 453 nm 。
步骤二,向其中逐滴滴加核黄素储备液,分别记录NPCl-CQDs与核黄素混合溶液在530 nm和453 nm处的荧光强度,分别记为I 530 nm 和I 453 nm ,并计算其比值I 530 nm /I 453 nm 。荧光强度变化见图7。
步骤三,利用Origin 软件,拟合NPCl-CQDs与核黄素混合溶液在530 nm和453 nm处的荧光强度比值(I 530 nm /I 453 nm )和核黄素浓度,得到线性方程,结果见图8和图9。
图7表明随着核黄素储备液的加入,NPCl-CQDs与核黄素混合溶液在453 nm处荧光强度逐渐降低,530 nm处的荧光强度逐渐升高,说明NPCl-CQD和核黄素之间发生荧光共振能量转移。图8和图9是NPCl-CQDs与核黄素混合溶液在530 nm和453 nm处荧光强度比值(I 530 nm /I 453 nm )与核黄素浓度(c (核黄素) )之间的线性关系图,当线性范围为0.50-10.18 μmol/L时,线性方程为:I 530 nm /I 453 nm = 0.1522c(核黄素) + 0.3674, R 2 = 0.9938;当线性范围为10.18-36.40 μmol/L时,线性方程为:I 530 nm /I 453 nm = 0.3809c(核黄素) - 2.2192,R 2 =0.9910,最低检出限为7.50 nmol/L。其中,I 453 nm 为核黄素加入前后溶液在453 nm处的荧光强度,I 530 nm 为核黄素加入前后溶液在530 nm处的荧光强度。
实施例4:实际样品中核黄素含量检测
步骤一,取两片海王核黄素药片(福州海王福药制药有限公司,国药准字H35021105),将其研磨成粉末,加入10 mL超纯水,超声使其充分溶解,溶液在8000转/分钟的台式离心机下离心10分钟,取上清液储存备用。
步骤二,取两片玉川核黄素药片(山西太原药业有限公司,国药准字H14021767),将其研磨成粉末,加入10 mL超纯水,超声使其完全溶解,溶液在8000转/分钟的台式离心机下离心10分钟,取上清液储存备用。
步骤三,取两片鸡老泉核黄素药片(天津飞鹰玉川药业有限公司,国药准字H12020593),将其研磨成粉末,加入10 mL超纯水,超声使其完全溶解,溶液在8000转/分钟的台式离心机下离心10分钟,取上清液储存备用。
步骤四,向490 µL二次水中分别加入10 µL上述药片储备液,然后加入30 µLNPCl-CQDs储备液,此时NPCl-CQDs浓度为0.57 mg/mL,测量453 nm和530 nm处的荧光强度,计算I 530 nm /I 453 nm ,代入线性方程:I 530 nm /I 453 nm = 0.1522c(核黄素) + 0.3674,计算得到药片储备液中核黄素浓度。
结果见表1。表1表明利用荧光共振能量转移比率定量检测核黄素的荧光探针可用于定量检测实际样品中核黄素的含量,且相对标准偏差均小于7.3%,具有良好的重现性。
表1:实施例4中三种实际样品中核黄素的含量
实施例5:实际样品中核黄素的加标回收实验
步骤一,取10 μL核黄素实际样品储备液稀释至500 μL。
步骤二,向500 µL样品溶液中加30 µL NPCl-CQDs储备液(10 mg/mL),测量453 nm和530 nm处的荧光强度,计算I 530 nm /I 453 nm 。
步骤三,向海王核黄素溶液中滴加5 µL核黄素储备液(0.05 mg/mL),测量453 nm和530 nm处的荧光强度,计算I 530 nm /I 453 nm 。
步骤四,向玉川核黄素溶液中滴加5 µL核黄素储备液(0.05 mg/mL),测量453 nm和530 nm处的荧光强度,计算I 530 nm /I 453 nm 。
步骤五,向鸡老泉核黄素溶液中滴加5 µL核黄素储备液(0.05 mg/mL),测量453nm和530 nm处的荧光强度,计算I 530 nm /I 453 nm 。
步骤六,将I 530 nm /I 453 nm 代入线性方程,计算得到三种实际样品中核黄素的加标回收率。
结果见表2。表2说明三种实际样品中核黄素的加标回收率介于95.2%与104.0%之间,相对标准偏差小于4.7%,表明NPCl-CQDs荧光探针可用于实际样品中核黄素的加标检测,不受实际样品中其他物质的干扰,具有良好的回收结果及重现性。
表2:实施例5中三种实际样品中核黄素的加标回收实验结果
Claims (4)
1.一种基于荧光共振能量转移比率定量检测核黄素的荧光探针,其特征在于:以葡萄糖作为碳源,乙二胺作为氮源,浓磷酸作为磷源,浓盐酸作为氯源,通过酸碱中和反应放热碳化法制备氮磷氯共掺杂碳量子点NPCl-CQDs,将NPCl-CQDs粉末溶于超纯水,离心除去不溶物,过滤除去杂质,冷冻干燥得到荧光探针NPCl-CQDs固体粉末;
制备方法具体步骤如下:
(1)称量0.4 g葡萄糖,向其中加6 mL乙二胺,2 mL浓磷酸和2 mL浓盐酸,强酸浓磷酸和浓盐酸与强碱乙二胺中和放热,最高温度为90℃,将葡萄糖碳化得到棕色黏稠物;
(2)待反应体系温度冷却至室温后,将棕色黏稠物溶解于超纯水中,溶液在4000转/分钟下离心10分钟,上清液用0.45 µm微孔滤膜过滤,冷冻干燥,即得NPCl-CQDs固体粉末。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光共振能量转移比率定量检测核黄素的荧光探针,其特征在于:所用浓磷酸为85%的浓磷酸,浓度为14.63 mol/L;浓盐酸为36-38%的浓盐酸,浓度为12.0 mol/L。
3.利用权利要求1所述的荧光探针定量检测核黄素的方法,其特征在于:具体步骤为:
(1)NPCl-CQDs储备液的制备: NPCl-CQDs固体粉末中加入超纯水,超声使其充分溶解得到浓度为10 mg/mL的NPCl-CQDs储备液;
(2)核黄素储备液的制备:称取核黄素粉末,加入到超纯水中,超声使其充分溶解得到浓度为0.1328 mmol/L的核黄素储备液;
(3)核黄素含量与NPCl-CQDs荧光强度的线性方程的获得:将若干体积的核黄素储备液加入到浓度为0.57 mg/mL的NPCl-CQDs溶液中,在368 nm激发波长下,记录NPCl-CQDs与核黄素混合溶液在453 nm和530 nm下的荧光强度比值I 530 nm /I 453 nm ;通过Origin 软件线性拟合核黄素浓度与I 530 nm /I 453 nm ,得到线性方程,当线性范围为0.50-10.18 μmol/L时,线性方程为:I 530 nm /I 453 nm = 0.1522c核黄素 + 0.3674,R 2 = 0.9938;当线性范围为10.18-36.40 μmol/L时,线性方程为:I 530 nm /I 453 nm = 0.3809c核黄素- 2.2192,R 2 = 0.9910,最低检出限为7.50 nmol/L;
其中,I 453 nm 为核黄素加入前后溶液在453 nm处的荧光强度,I 530 nm 为核黄素加入前后溶液在530 nm处的荧光强度。
4.利用权利要求3所述的荧光探针定量检测核黄素的方法对待测样品检测,其特征在于:具体步骤如下:
(1)待测样品的检测:将待测样品溶于超纯水中,通过测量和计算加入样品前后NPCl-CQDs在530 nm和453 nm处比值的变化,代入线性方程即可得到样品中核黄素的含量;
(2)实际样品中核黄素的加标回收率的测定:向待测样品中加入NPCl-CQDs储备液,测得实际样品中核黄素的浓度,向体系中加入0.05 mg/mL核黄素储备液,测得加标浓度,计算得到实际样品中核黄素的加标回收率。
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