CN109456761B

CN109456761B - 基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素b12的荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109456761B
Application number: CN201811360675.1A
Authority: CN
Inventors: 弓晓娟; 张俐; 董文娟; 宋胜梅; 董川
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2018-11-15
Filing date: 2018-11-15
Publication date: 2022-01-28
Anticipated expiration: 2038-11-15
Also published as: CN109456761A

Abstract

本发明属于荧光探针技术领域，提供一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素B₁₂的荧光探针及其制备方法和应用。以蔗糖作为碳源，乙二胺作为氮源，浓磷酸作为磷源，通过酸碱中和放热碳化法制备PNCQDs，离心除去不溶物，透析去除未反应的前体物质和小分子，冷冻干燥得到荧光探针PNCQDs固体粉末；利用荧光检测法确定维生素B₁₂浓度与PNCQDs荧光强度之间的线性关系。通过加标回收实验检测实际样品中维生素B₁₂的含量。操作简便，抗干扰性强，不需要昂贵的仪器设备，检测成本低，可快速、高效、定量检测实际样品中维生素B₁₂的含量。

Description

基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素B12的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素B₁₂的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

维生素B₁₂（Vitamin B₁₂，VB₁₂）又称钴胺素或氰钴素，是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素。VB₁₂也是唯一含必需矿物质的维生素，因含钴而呈红色，又称红色维生素，是少数有色的维生素，也是维持人体正常机能以及新陈代谢必不可少的维生素。当成人缺乏VB₁₂时会引起恶性贫血，舌、口腔、消化道的粘膜发炎，脊髓变性，神经和周围神经退化；小孩缺乏VB₁₂的早期表现为精神情绪异常、表情呆滞、少哭少闹、反应迟钝、爱睡觉等症状，最后会引起贫血，另外，缺乏VB₁₂可能引起精神忧郁。然而，当VB₁₂过量时，人体会发生哮喘、荨麻疹、湿疹、面部浮肿、寒颤等过敏反应，也可能引发神经兴奋、心前区痛和心悸，还可导致叶酸缺乏。

目前已报道的检测VB₁₂的方法有：微生物法、原子吸收分光光度法、高效液相色谱法以及液相色谱质谱联用系统。这些方法有自身独特的优势，但都存在以下缺陷：步骤繁琐，耗时费力，仪器装置复杂昂贵，检测周期长，技术含量高，成本高，抗干扰能力弱以及准确度低等，导致这些检测方法无法得到广泛应用。因此，亟需发展一种快速、高效、定量检测VB₁₂的方法。

碳量子点又称为碳纳米点，是碳家族中新型成员，具有光致发光性能，良好的水溶性和稳定性，生物相容性以及低细胞毒性等优点。基于碳量子点已经构筑了多种荧光探针用于各种金属离子、氨基酸、药物和环境污染物等的检测。以其为基础，通过荧光猝灭法，发展一种快速、高效、定量检测VB₁₂的方法具有重要的意义和广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测VB₁₂的荧光探针及其制备方法和应用。

本发明由如下技术方案实现的：一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测VB₁₂的荧光探针，以蔗糖作为碳源，乙二胺作为氮源，浓磷酸作为磷源，通过酸碱中和放热碳化法制备PNCQDs，离心除去不溶物，透析去除未反应的前体物质和小分子，冷冻干燥得到荧光探针PNCQDs固体粉末；所述荧光探针的具体制备方法如下：(1)前体物质的获得：称量0.4 g蔗糖，向其中加6 mL乙二胺和4 mL浓磷酸，通过酸碱中和放热碳化法得到深褐色黏稠物；（2）待反应体系温度冷却至室温后，将深褐色黏稠物溶解于二次水中，溶液8000转/分钟离心15分钟，上清液在500-1000 Da的透析袋中透析处理三天，透析袋中的溶液冷冻干燥，即得PNCQDs固体粉末。

所述浓磷酸为市售的85%的浓磷酸，浓度14.6 mol/L。

利用所述的基于碳量子点荧光猝灭法定量检测VB₁₂的荧光探针检测VB₁₂的方法，具体步骤为：

（1）PNCQDs储备液的制备：0.5 g PNCQDs固体粉末中加入50 mL二次水，搅拌使其充分溶解得到浓度为10 mg/mL的PNCQDs储备液；

（2）VB₁₂储备液的制备：称取0.1402 g VB₁₂粉末，加入到20 mL生理盐水中，搅拌溶解，配制浓度为5.17 mmol/L的VB₁₂储备液；

（3）VB₁₂含量与PNCQDs荧光强度的线性方程的获得：将若干体积的VB₁₂储备液加入到浓度为2 mg/mL的PNCQDs溶液中，在365 nm激发波长下，记录PNCQDs在451 nm下的荧光强度值；通过Origin 软件线性拟合VB₁₂浓度与PNCQDs荧光强度，得到线性方程：F ₀ /F =0.11956[VB₁₂] + 1.35303，R ²= 0.994。式中F ₀、F分别为VB₁₂加入前后PNCQDs的荧光强度；可检测的线性范围为1.99-31.01 µmol/L，最低检出限为0.785 µmol/L；

（4）待测样品的检测：将待测样品溶于生理盐水中，通过测量加入样品前后PNCQDs荧光强度的变化，代入线性方程即可得到样品中VB₁₂的含量；

（5）实际样品中VB₁₂的加标回收率的测定：向待测样品中加入PNCQDs储备液，使体系中PNCQDs浓度为0.2 mg/mL；VB₁₂储备液用生理盐水稀释至VB₁₂的浓度为2 mmol/L的VB₁₂标准溶液，然后将VB₁₂标准溶液加入体系中，测试实际样品中VB₁₂的加标回收率。

本方法的优点在于：碳源蔗糖廉价易得，乙二胺和浓磷酸均为普通试剂，容易采购。探针制备方法简单，无需昂贵仪器，可快速、高效、定量实现VB₁₂的检测。所制备的荧光探针性能稳定，抗干扰能力强。

总而言之，与其他检测VB₁₂的方法相比，该方法具有快速有效，性能稳定，抗干扰能力强，无需昂贵的仪器设备，操作简便，检测成本低等优点，为VB₁₂检测提供了一种全新的方法。

附图说明

图1为实施例2中各种金属离子（Fe³⁺, Pb²⁺, K⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, Cu²⁺, Al³⁺, Ni²⁺,Ag⁺, Ca²⁺, Cr³⁺, Na⁺, Mn²⁺, Zn²⁺）对VB₁₂检测的干扰实验结果图。

图2为实施例2中各种氨基酸（半胱氨酸、色氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、L-亮氨酸、丝氨酸）以及一些B族维生素（VB₁、VB₃、VB₇）对VB₁₂检测的干扰实验结果。

图3为实施例3中利用VB₁₂滴定PNCQDs溶液，PNCQDs荧光强度的变化曲线图。

图4为实施例3中VB₁₂浓度与PNCQDs荧光强度的线性图。

具体实施方式

实施例1：PNCQDs的制备及表征

步骤一，称量0.4 g蔗糖，向其中加入6 mL乙二胺和4 mL浓磷酸，得到深褐色黏稠物。

步骤二，待烧杯冷却至室温后，向其中加入30 mL二次水，搅拌，8000转/分钟离心15分钟，利用500-1000 Da的透析袋透析处理三天，得到澄清的PNCQDs溶液。

步骤三，冷冻干燥制得PNCQDs固体粉末。

步骤四，称量0.5 g PNCQDs固体粉末于烧杯中，向其中加入50 mL二次水，搅拌使其充分溶解，得到浓度为10 mg/mL的PNCQDs储备液。

在PNCQDs的紫外吸收光谱图中，有两个明显的吸收峰位于276 nm和323 nm，分别由C=O的n→π^*跃迁和N/P掺杂产生的表面缺陷引起；PNCQDs的最佳激发和发射峰分别位于365 nm和451 nm。PNCQDs在不同激发波长下的发射光谱图，当激发波长从300 nm变化到500nm时，发射波长由439 nm红移到561 nm，说明PNCQDs具有激发波长依赖性。

实施例2：维生素B₁₂检测的抗干扰实验

步骤一，称量不同质量金属离子（Fe³⁺, Pb²⁺, K⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, Cu²⁺, Al³⁺, Ni²⁺,Ag⁺, Ca²⁺, Cr³⁺, Na⁺, Mn²⁺, Zn²⁺）化合物，加入10 mL二次水，配制成浓度为0.1 mol/L的金属离子储备液。

步骤二，分别称量一定质量半胱氨酸、色氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、L-亮氨酸、丝氨酸，加入5 mL二次水，配制成浓度为0.01 mol/L的氨基酸储备液。

步骤三，分别称量0.015 g VB₁，0.0062 g VB₃，0.0122 g VB₇，加入5 mL生理盐水，搅拌使其溶解，配制0.01 mol/L的B族维生素储备液。

步骤四，向浓度为2 mg/mL碳点溶液（2 mL）中加入金属离子储备液9 µL，此时金属离子浓度为0.3 mmol/L，测量此时的荧光强度，记为F₀；再向其中加入20 µL VB₁₂储备液，此时VB₁₂浓度为34 µmol/L，测量此时的荧光强度，记为F。实验结果见图1。

步骤五，向浓度为2 mg/mL碳点溶液（2 mL）中加入氨基酸储备液90 µL，此时氨基酸浓度为0.3 mmol/L，测量此时的荧光强度，记为F₀；再向其中加入20 µL VB₁₂储备液，此时VB₁₂浓度为34 µmol/L，测量此时的荧光强度，记为F。实验结果见图2。

步骤六，向浓度为2 mg/mL碳点溶液（2 mL）中加入B族维生素储备液90 µL，此时B族维生素浓度为0.3 mmol/L，测量此时的荧光强度，记为F₀；再向其中加入20 µL VB₁₂储备液，此时VB₁₂浓度为34 µmol/L，测量此时的荧光强度，记为F。实验结果见图2。

图1是不同金属离子对VB₁₂检测的干扰性研究，说明VB₁₂检测不受金属离子的干扰；图2是不同氨基酸和其他B族维生素对VB₁₂检测的干扰性研究，说明VB₁₂检测不受氨基酸和其他B族维生素的干扰。结果说明PNCQDs对VB₁₂检测时具有很好的抗干扰性。

实施例3：维生素B₁₂滴定PNCQDs的线性方程

步骤一，测量2 mg/mL碳点溶液的荧光强度，记为F₀。

步骤二，向其中逐滴滴加VB₁₂储备液，分别记录荧光强度，记为F。荧光强度变化见图3。

步骤三，利用Origin 软件，拟合荧光强度变化（F ₀ /F）和VB₁₂浓度之间的线性方程，结果见图4。

图3表明随着VB₁₂储备液的加入，PNCQDs的荧光逐渐被猝灭，说明VB₁₂对PNCQDs的荧光有特异的猝灭效果。图4是PNCQDs荧光强度的变化值与VB₁₂浓度之间的线性关系图，线性方程为F ₀ /F = 0.11956[VB₁₂] + 1.35303，线性范围为1.99-31.01 µmol/L，最低检出限为0.785 µmol/L，相关性系数R ²= 0.994。

实施例4：实际样品中VB₁₂含量检测

步骤一，取四片利丰VB₁₂片剂（山西利丰华瑞制药有限公司，国药准字H14023061），将其全部捣碎，加入10 mL生理盐水，搅拌使其充分溶解，溶液在6000转/分钟的台式离心机下离心15分钟，取上清液，取该溶液5 mL，稀释至10 mL，备用。

步骤二，取四片国润VB₁₂片剂（山西国润制药有限公司，国药准字H14022782），将其全部捣碎，加入20 mL生理盐水，搅拌使其完全溶解，溶液在6000转/分钟的台式离心机下离心15分钟，取上清液，备用。

步骤三，取0.4 mL 方明VB₁₂注射剂（山东方明药业集团股份有限公司H37021054），用生理盐水稀释至10 mL，备用。

步骤四，向1600 µL二次水中加400 µL PNCQDs储备液，此时碳点浓度为0.2 mg/mL，测量荧光强度，记为F₀。

步骤五，将步骤四中的二次水分别替换为样品溶液，测量此时的荧光强度，记为F。

步骤六，将F₀/F代入线性方程，计算得到所对应样品中VB₁₂的含量。

结果见表1，表明利用PNCQDs检测VB₁₂的方法可用于实际样品中VB₁₂含量的检测，且相对标准偏差均小于6.8%，具有良好的重现性。

表1：三种实际样品中VB₁₂的含量

实施例5：实际样品中维生素B₁₂的加标回收实验

步骤一，取3.868 mL VB₁₂储备液稀释至10 mL，此时VB₁₂浓度为2 mmol/L。

步骤二，向1600 µL样品溶液中加400 µL PNCQDs储备液，测量荧光强度，记为F₀。

步骤三，向利丰VB₁₂溶液中滴加12.62 µL浓度为2 mmol/L的VB₁₂溶液，测量荧光强度，记为F。

步骤四，向国润VB₁₂溶液中滴加2.62 µL浓度为2 mmol/L的VB₁₂溶液，测量荧光强度，记为F。

步骤五，向2 mL 方明VB₁₂注射剂溶液中滴加2.62 µL浓度为2 mmol/L的VB₁₂溶液，测量荧光强度，记为F。

步骤六，将F₀/F代入线性方程，计算得到三种实际样品中VB₁₂的加标回收率。

结果见表2。表2说明三种实际样品中的VB₁₂的加标回收率介于94.5%与103.9%之间，相对标准偏差小于7.8%，表明PNCQDs可用于实际样品中VB₁₂的检测，该方法具有很好的重现性。

表2：实施例5中三种实际样品中VB₁₂的加标回收实验结果

Claims

1.利用基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素B₁₂的荧光探针检测维生素B₁₂的方法，其特征在于：具体步骤为：

（2）维生素B₁₂储备液的制备：称取0.1402 g维生素B₁₂粉末，加入到20 mL生理盐水中，搅拌溶解，配制浓度为5.17 mmol/L的维生素B₁₂储备液；

（3）维生素B₁₂含量与PNCQDs荧光强度的线性方程的获得：将若干体积的维生素B₁₂储备液加入到浓度为2 mg/mL的PNCQDs溶液中，在365 nm激发波长下，记录PNCQDs在451 nm下的荧光强度值；通过Origin 软件线性拟合维生素B₁₂浓度与PNCQDs荧光强度，得到线性方程：F ₀ /F = 0.11956[VB₁₂] + 1.35303，R ²= 0.994；式中F ₀、F分别为维生素B₁₂加入前后PNCQDs的荧光强度；可检测的线性范围为1.99-31.01 µmol/L，最低检出限为0.785 µmol/L；

（4）待测样品的检测：将待测样品溶于生理盐水中，通过测量加入样品前后PNCQDs荧光强度的变化，代入线性方程即可得到样品中维生素B₁₂的含量；

（5）实际样品中维生素B₁₂的加标回收率的测定：向待测样品中加入PNCQDs储备液，使体系中PNCQDs浓度为0.2 mg/mL；VB₁₂储备液用生理盐水稀释至维生素B₁₂的浓度为2 mmol/L的VB₁₂标准溶液，然后将VB₁₂标准溶液加入体系中，测试实际样品中维生素B₁₂的加标回收率；

其中：基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素B₁₂的荧光探针，以蔗糖作为碳源，乙二胺作为氮源，浓度为14.6 mol/L的浓磷酸作为磷源，通过酸碱中和放热碳化法制备PNCQDs，离心除去不溶物，透析去除未反应的前体物质和小分子，冷冻干燥得到荧光探针PNCQDs固体粉末；

所述荧光探针的具体制备方法如下：(1)前体物质的获得：称量0.4g蔗糖，向其中加6mL乙二胺和4 mL浓磷酸，通过酸碱中和放热碳化法得到深褐色黏稠物；（2）待反应体系温度冷却至室温后，将深褐色黏稠物溶解于二次水中，溶液8000转/分钟离心15分钟，上清液在500-1000 Da的透析袋中透析处理三天，透析袋中的溶液冷冻干燥，即得PNCQDs固体粉末。