CN109456761A - 基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素b12的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素b12的荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于荧光探针技术领域，提供一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素B12的荧光探针及其制备方法和应用。以蔗糖作为碳源，乙二胺作为氮源，浓磷酸作为磷源，通过酸碱中和放热碳化法制备PNCQDs，离心除去不溶物，透析去除未反应的前体物质和小分子，冷冻干燥得到荧光探针PNCQDs固体粉末；利用荧光检测法确定维生素B12浓度与PNCQDs荧光强度之间的线性关系。通过加标回收实验检测实际样品中维生素B12的含量。操作简便，抗干扰性强，不需要昂贵的仪器设备，检测成本低，可快速、高效、定量检测实际样品中维生素B12的含量。

Description

基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素B12的荧光探针及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素B12的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
维生素B12（Vitamin B12，VB12）又称钴胺素或氰钴素，是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素。VB12也是唯一含必需矿物质的维生素，因含钴而呈红色，又称红色维生素，是少数有色的维生素，也是维持人体正常机能以及新陈代谢必不可少的维生素。当成人缺乏VB12时会引起恶性贫血，舌、口腔、消化道的粘膜发炎，脊髓变性，神经和周围神经退化；小孩缺乏VB12的早期表现为精神情绪异常、表情呆滞、少哭少闹、反应迟钝、爱睡觉等症状，最后会引起贫血，另外，缺乏VB12可能引起精神忧郁。然而，当VB12过量时，人体会发生哮喘、荨麻疹、湿疹、面部浮肿、寒颤等过敏反应，也可能引发神经兴奋、心前区痛和心悸，还可导致叶酸缺乏。
目前已报道的检测VB12的方法有：微生物法、原子吸收分光光度法、高效液相色谱法以及液相色谱质谱联用系统。这些方法有自身独特的优势，但都存在以下缺陷：步骤繁琐，耗时费力，仪器装置复杂昂贵，检测周期长，技术含量高，成本高，抗干扰能力弱以及准确度低等，导致这些检测方法无法得到广泛应用。因此，亟需发展一种快速、高效、定量检测VB12的方法。
碳量子点又称为碳纳米点，是碳家族中新型成员，具有光致发光性能，良好的水溶性和稳定性，生物相容性以及低细胞毒性等优点。基于碳量子点已经构筑了多种荧光探针用于各种金属离子、氨基酸、药物和环境污染物等的检测。以其为基础，通过荧光猝灭法，发展一种快速、高效、定量检测VB12的方法具有重要的意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测VB12的荧光探针及其制备方法和应用。
本发明由如下技术方案实现的：一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测VB12的荧光探针，以蔗糖作为碳源，乙二胺作为氮源，浓磷酸作为磷源，通过酸碱中和放热碳化法制备PNCQDs，离心除去不溶物，透析去除未反应的前体物质和小分子，冷冻干燥得到荧光探针PNCQDs固体粉末；所述荧光探针的具体制备方法如下：(1)前体物质的获得：称量0.4 g蔗糖，向其中加6 mL乙二胺和4 mL浓磷酸，通过酸碱中和放热碳化法得到深褐色黏稠物；（2）待反应体系温度冷却至室温后，将深褐色黏稠物溶解于二次水中，溶液8000转/分钟离心15分钟，上清液在500-1000 Da的透析袋中透析处理三天，透析袋中的溶液冷冻干燥，即得PNCQDs固体粉末。
所述浓磷酸为市售的85%的浓磷酸，浓度14.6 mol/L。
利用所述的基于碳量子点荧光猝灭法定量检测VB12的荧光探针检测VB12的方法，具体步骤为：
（1）PNCQDs储备液的制备：0.5 g PNCQDs固体粉末中加入50 mL二次水，搅拌使其充分溶解得到浓度为10 mg/mL的PNCQDs储备液；
（2）VB12储备液的制备：称取0.1402 g VB12粉末，加入到20 mL生理盐水中，搅拌溶解，配制浓度为5.17 mmol/L的VB12储备液；
（3）VB12含量与PNCQDs荧光强度的线性方程的获得：将若干体积的VB12储备液加入到浓度为2 mg/mL的PNCQDs溶液中，在365 nm激发波长下，记录PNCQDs在451 nm下的荧光强度值；通过Origin 软件线性拟合VB12浓度与PNCQDs荧光强度，得到线性方程：F 0 /F = 0.11956[VB12] + 1.35303，R 2 = 0.994。式中F 0 、F分别为VB12加入前后PNCQDs的荧光强度；可检测的线性范围为1.99-31.01 µmol/L，最低检出限为0.785 µmol/L；
（4）待测样品的检测：将待测样品溶于生理盐水中，通过测量加入样品前后PNCQDs荧光强度的变化，代入线性方程即可得到样品中VB12的含量；
（5）实际样品中VB12的加标回收率的测定：向待测样品中加入PNCQDs储备液，使体系中PNCQDs浓度为0.2 mg/mL；VB12储备液用生理盐水稀释至VB12的浓度为2 mmol/L的VB12标准溶液，然后将VB12标准溶液加入体系中，测试实际样品中VB12的加标回收率。
本方法的优点在于：碳源蔗糖廉价易得，乙二胺和浓磷酸均为普通试剂，容易采购。探针制备方法简单，无需昂贵仪器，可快速、高效、定量实现VB12的检测。所制备的荧光探针性能稳定，抗干扰能力强。
总而言之，与其他检测VB12的方法相比，该方法具有快速有效，性能稳定，抗干扰能力强，无需昂贵的仪器设备，操作简便，检测成本低等优点，为VB12检测提供了一种全新的方法。
附图说明
图1为实施例1中所制备的PNCQDs的紫外光谱图以及荧光光谱图。
图2为实施例1中所制备的PNCQDs的激发波长依赖性光谱图。
图3为实施例2中各种金属离子（Fe3+, Pb2+, K+, Fe2+, Mg2+, Cu2+, Al3+, Ni2+,Ag+, Ca2+, Cr3+, Na+, Mn2+, Zn2+）对VB12检测的干扰实验结果图。
图4为实施例2中各种氨基酸（半胱氨酸、色氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、L-亮氨酸、丝氨酸）以及一些B族维生素（VB1、VB3、VB7）对VB12检测的干扰实验结果。
图5为实施例3中利用VB12滴定PNCQDs溶液，PNCQDs荧光强度的变化曲线图。
图6为实施例3中VB12浓度与PNCQDs荧光强度的线性图。
具体实施方式
实施例1：PNCQDs的制备及表征
步骤一，称量0.4 g蔗糖，向其中加入6 mL乙二胺和4 mL浓磷酸，得到深褐色黏稠物。
步骤二，待烧杯冷却至室温后，向其中加入30 mL二次水，搅拌，8000转/分钟离心15分钟，利用500-1000 Da的透析袋透析处理三天，得到澄清的PNCQDs溶液。
步骤三，冷冻干燥制得PNCQDs固体粉末。
步骤四，称量0.5 g PNCQDs固体粉末于烧杯中，向其中加入50 mL二次水，搅拌使其充分溶解，得到浓度为10 mg/mL的PNCQDs储备液。
性质表征见图1和图2。图1在PNCQDs的紫外吸收光谱图中，有两个明显的吸收峰位于276 nm和323 nm，分别由C=O的n→π*跃迁和N/P掺杂产生的表面缺陷引起；图1中PNCQDs的最佳激发和发射峰分别位于365 nm和451 nm。图2是PNCQDs在不同激发波长下的发射光谱图，当激发波长从300 nm变化到500 nm时，发射波长由439 nm红移到561 nm，说明PNCQDs具有激发波长依赖性。
实施例2：维生素B12检测的抗干扰实验
步骤一，称量不同质量金属离子（Fe3+, Pb2+, K+, Fe2+, Mg2+, Cu2+, Al3+, Ni2+, Ag+,Ca2+, Cr3+, Na+, Mn2+, Zn2+）化合物，加入10 mL二次水，配制成浓度为0.1 mol/L的金属离子储备液。
步骤二，分别称量一定质量半胱氨酸、色氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、L-亮氨酸、丝氨酸，加入5 mL二次水，配制成浓度为0.01 mol/L的氨基酸储备液。
步骤三，分别称量0.015 g VB1，0.0062 g VB3，0.0122 g VB7，加入5 mL生理盐水，搅拌使其溶解，配制0.01 mol/L的B族维生素储备液。
步骤四，向浓度为2 mg/mL碳点溶液（2 mL）中加入金属离子储备液9 µL，此时金属离子浓度为0.3 mmol/L，测量此时的荧光强度，记为F0；再向其中加入20 µL VB12储备液，此时VB12浓度为34 µmol/L，测量此时的荧光强度，记为F。实验结果见图3。
步骤五，向浓度为2 mg/mL碳点溶液（2 mL）中加入氨基酸储备液90 µL，此时氨基酸浓度为0.3 mmol/L，测量此时的荧光强度，记为F0；再向其中加入20 µL VB12储备液，此时VB12浓度为34 µmol/L，测量此时的荧光强度，记为F。实验结果见图4。
步骤六，向浓度为2 mg/mL碳点溶液（2 mL）中加入B族维生素储备液90 µL，此时B族维生素浓度为0.3 mmol/L，测量此时的荧光强度，记为F0；再向其中加入20 µL VB12储备液，此时VB12浓度为34 µmol/L，测量此时的荧光强度，记为F。实验结果见图4。
图3是不同金属离子对VB12检测的干扰性研究，说明VB12检测不受金属离子的干扰；图4是不同氨基酸和其他B族维生素对VB12检测的干扰性研究，说明VB12检测不受氨基酸和其他B族维生素的干扰。结果说明PNCQDs对VB12检测时具有很好的抗干扰性。
实施例3：维生素B12滴定PNCQDs的线性方程
步骤一，测量2 mg/mL碳点溶液的荧光强度，记为F0。
步骤二，向其中逐滴滴加VB12储备液，分别记录荧光强度，记为F。荧光强度变化见图5。
步骤三，利用Origin 软件，拟合荧光强度变化（F 0 /F）和VB12浓度之间的线性方程，结果见图6。
图5表明随着VB12储备液的加入，PNCQDs的荧光逐渐被猝灭，说明VB12对PNCQDs的荧光有特异的猝灭效果。图6是PNCQDs荧光强度的变化值与VB12浓度之间的线性关系图，线性方程为F 0 /F = 0.11956[VB12] + 1.35303，线性范围为1.99-31.01 µmol/L，最低检出限为0.785 µmol/L，相关性系数R 2 = 0.994。
实施例4：实际样品中VB12含量检测
步骤一，取四片利丰VB12片剂（山西利丰华瑞制药有限公司，国药准字H14023061），将其全部捣碎，加入10 mL生理盐水，搅拌使其充分溶解，溶液在6000转/分钟的台式离心机下离心15分钟，取上清液，取该溶液5 mL，稀释至10 mL，备用。
步骤二，取四片国润VB12片剂（山西国润制药有限公司，国药准字H14022782），将其全部捣碎，加入20 mL生理盐水，搅拌使其完全溶解，溶液在6000转/分钟的台式离心机下离心15分钟，取上清液，备用。
步骤三，取0.4 mL 方明VB12注射剂（山东方明药业集团股份有限公司H37021054），用生理盐水稀释至10 mL，备用。
步骤四，向1600 µL二次水中加400 µL PNCQDs储备液，此时碳点浓度为0.2 mg/mL，测量荧光强度，记为F0。
步骤五，将步骤四中的二次水分别替换为样品溶液，测量此时的荧光强度，记为F。
步骤六，将F0/F代入线性方程，计算得到所对应样品中VB12的含量。
结果见表1，表明利用PNCQDs检测VB12 的方法可用于实际样品中VB12含量的检测，且相对标准偏差均小于6.8%，具有良好的重现性。
表1：三种实际样品中VB12的含量
样品 VB<sub>12</sub>含量(µM) 相对标准偏差(%)
利丰VB<sub>12</sub>片剂 10.587 1.8
国润VB<sub>12</sub>片剂 4.612 3.1
方明VB<sub>12</sub> 注射剂 7.779 6.8
实施例5：实际样品中维生素B12 的加标回收实验
步骤一，取3.868 mL VB12储备液稀释至10 mL，此时VB12浓度为2 mmol/L。
步骤二，向1600 µL样品溶液中加400 µL PNCQDs储备液，测量荧光强度，记为F0。
步骤三，向利丰VB12溶液中滴加12.62 µL浓度为2 mmol/L的VB12溶液，测量荧光强度，记为F。
步骤四，向国润VB12溶液中滴加2.62 µL浓度为2 mmol/L的VB12溶液，测量荧光强度，记为F。
步骤五，向2 mL 方明VB12注射剂溶液中滴加2.62 µL浓度为2 mmol/L的VB12溶液，测量荧光强度，记为F。
步骤六，将F0/F代入线性方程，计算得到三种实际样品中VB12的加标回收率。
结果见表2。表2说明三种实际样品中的VB12的加标回收率介于94.5%与103.9%之间，相对标准偏差小于7.8%，表明PNCQDs可用于实际样品中VB12的检测，该方法具有很好的重现性。
表2：实施例5中三种实际样品中VB12的加标回收实验结果
实际样品 VB<sub>12</sub>加入量(µM) VB<sub>12</sub>检出量(µM) 相对标准偏差(%) 回收率（%）
利丰VB<sub>12</sub>片 2.62 13.655 2.7 103.9
国润VB<sub>12</sub>片 2.62 6.832 4.3 94.5
方明VB<sub>12</sub> 注射剂 2.62 10.157 7.8 97.7

Claims (3)

1.一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素B12的荧光探针，以蔗糖作为碳源，乙二胺作为氮源，浓磷酸作为磷源，通过酸碱中和放热碳化法制备PNCQDs，离心除去不溶物，透析去除未反应的前体物质和小分子，冷冻干燥得到荧光探针PNCQDs固体粉末；其特征在于：所述荧光探针的具体制备方法如下：(1)前体物质的获得：称量0.4g蔗糖，向其中加6 mL乙二胺和4 mL浓磷酸，通过酸碱中和放热碳化法得到深褐色黏稠物；（2）待反应体系温度冷却至室温后，将深褐色黏稠物溶解于二次水中，溶液8000转/分钟离心15分钟，上清液在500-1000 Da的透析袋中透析处理三天，透析袋中的溶液冷冻干燥，即得PNCQDs固体粉末。
2.根据权利要求1所述的一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素B12的荧光探针，其特征在于：所述浓磷酸的浓度为14.6 mol/L。
3.利用权利要求1所述的基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素B12的荧光探针检测维生素B12的方法，其特征在于：具体步骤为：
（1）PNCQDs储备液的制备：0.5 g PNCQDs固体粉末中加入50 mL二次水，搅拌使其充分溶解得到浓度为10 mg/mL的PNCQDs储备液；
（2）维生素B12储备液的制备：称取0.1402 g维生素B12粉末，加入到20 mL生理盐水中，搅拌溶解，配制浓度为5.17 mmol/L的维生素B12储备液；
（3）维生素B12含量与PNCQDs荧光强度的线性方程的获得：将若干体积的维生素B12储备液加入到浓度为2 mg/mL的PNCQDs溶液中，在365 nm激发波长下，记录PNCQDs在451 nm下的荧光强度值；通过Origin 软件线性拟合维生素B12浓度与PNCQDs荧光强度，得到线性方程：F 0 /F = 0.11956[VB12] + 1.35303，R 2 = 0.994；式中F 0 、F分别为维生素B12加入前后PNCQDs的荧光强度；可检测的线性范围为1.99-31.01 µmol/L，最低检出限为0.785 µmol/L；
（4）待测样品的检测：将待测样品溶于生理盐水中，通过测量加入样品前后PNCQDs荧光强度的变化，代入线性方程即可得到样品中维生素B12的含量；
（5）实际样品中维生素B12的加标回收率的测定：向待测样品中加入PNCQDs储备液，使体系中PNCQDs浓度为0.2 mg/mL；VB12储备液用生理盐水稀释至维生素B12的浓度为2 mmol/L的VB12标准溶液，然后将VB12标准溶液加入体系中，测试实际样品中维生素B12的加标回收率。
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