CN111122524B - 基于荧光猝灭法快速检测桑色素的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

基于荧光猝灭法快速检测桑色素的荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于荧光探针技术领域，提供一种基于荧光猝灭法快速检测桑色素的荧光探针及其制备方法和应用。以邻氯苯甲酸作为碳源和氯源，对苯二胺作为氮源，通过一步水热法快速制备氯氮双掺杂碳量子点ClNCQDs，离心除去不溶物，旋蒸去除乙醇溶剂，透析去除未反应的前体物质和小分子，冷冻干燥得到荧光探针ClNCQDs固体粉末。利用荧光检测法确定桑色素浓度与ClNCQDs荧光强度之间的线性关系，并将此线性方程用于实际样品中桑色素含量和加标回收率检测。本方法操作简便，抗干扰性强，检测成本低，可快速、高效、准确并定量检测实际样品中桑色素的含量。

Description

基于荧光猝灭法快速检测桑色素的荧光探针及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于荧光猝灭法快速检测桑色素的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
桑色素，学名3,5,7,2′,4′-五羟黄酮，属黄体酮类化合物，分子式为C15H10O7·2H2O，结构为含氧的杂环连接两个芳香环。通常为黄色或灰黄色针状结晶，久置空气中易氧化为棕色，熔点285℃～300℃，微溶于水（溶解度为0.025%），易溶于乙醇等有机溶剂，它是从黄桑木、桑橙树等桑科植物的树皮和许多中草药中提取的一种浅黄色色素。桑色素是一种化学分析中常用的显色剂，一般用来检测痕量的铁、锌、钴等。桑色素具有免疫调节作用、抗肿瘤作用和抗氧化作用。它作为黄酮类化合物，其抗氧化性、抗肿瘤活性不是很高，但是通过与金属离子螯合，可显著提高其活性，所以桑色素有可能成为既具有高抗氧化性，又同时具有低毒性和高效性的抗癌药物。桑色素还具有清除自由基的能力，已有很多厂商把其作为增白剂添入到化妆品中，因此，桑色素受到诸多研究者的重视，未来其将会更广泛地被应用于化妆品行业及美容保健食品中。
目前，已报道的检测桑色素的方法有：流动注射双安培法、电位法、分光光度法、荧光光度法等，这些方法有其自身独特的优势，但都存在以下缺陷：步骤繁琐，耗时费力，检测周期长，成本高，抗干扰能力弱以及准确度低等，导致这些检测方法未能得到广泛应用。因此，亟需发展一种快速、高效、准确检测桑色素的方法。
碳量子点又称为碳纳米点，是碳家族中的新型成员，具有光致发光性能，良好的水溶性和稳定性，生物相容性以及低细胞毒性等优点。基于碳量子点已经构筑了多种荧光探针用于各种金属离子、氨基酸、药物和环境污染物等的检测。以其为基础，通过荧光猝灭法，发展一种快速、高效、准确检测桑色素的方法具有重要的意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于荧光猝灭法快速检测桑色素的荧光探针及其制备方法和应用。
本发明由如下技术方案实现的：一种基于荧光猝灭法快速检测桑色素的荧光探针，以邻氯苯甲酸作为碳源和氯源，对苯二胺作为氮源，通过一步水热法制备氯氮双掺杂碳量子点（ClNCQDs），离心除去不溶物，旋蒸去除乙醇溶剂，透析去除未反应的前体物质和小分子，冷冻干燥得到荧光探针ClNCQDs固体粉末。
所述荧光探针的具体制备方法如下：
（1）前体物质的获得：准确称量0.16 g邻氯苯甲酸和0.054 g对苯二胺，向其中依次加入7.5 mL无水乙醇和7.5 mL去离子水，200 W超声1.5 min充分溶解，混合液转移至50mL高压反应釜并置于马弗炉中，于120℃下反应16 h，将前体物质完全碳化，制备得到红褐色溶液；
（2）将红褐色溶液在7000转/分钟下离心10 min，上清液中的乙醇旋蒸去除，再向其中加入10 mL去离子水，200 W超声5 min充分溶解，混合液在7000转/分钟下离心10 min，收集红褐色的上清液；
（3）将红褐色上清液利用100-500 Da透析袋透析处理3 h，每隔1.5 h换一次去离子水，透析完成后，透析袋中的溶液冷冻干燥即获得ClNCQDs固体粉末。
利用所述的荧光探针检测桑色素的方法，具体步骤为：
（1）ClNCQDs储备液的制备：准确称量ClNCQDs固体粉末，加入去离子水，搅拌充分溶解，得到浓度为10 mg/mL的ClNCQDs储备液；
（2）桑色素储备液的制备：准确称量桑色素粉末，加入无水乙醇，搅拌充分溶解，得到浓度为0.10 mol/L的桑色素储备液；
（3）桑色素标准液的制备：准确吸取1.0 mL桑色素储备液，用乙醇溶液稀释定容至10 mL，摇匀，即可得浓度为0.01 mol/L的桑色素标准液；
（4）桑色素含量与ClNCQDs荧光强度之间线性方程的获得：将不同体积的0.01mol/L桑色素标准液加入到浓度为0.91 mg/mL的ClNCQDs溶液中，在374 nm激发波长下，记录ClNCQDs在551 nm处的荧光强度值；通过Origin 软件线性拟合桑色素浓度与ClNCQDs荧光强度，得到线性方程：(P 0 -P)/P 0 = 0.0092´c(桑色素) - 0.0050，R 2 = 0.9965；式中P 0 和P分别为桑色素加入前后ClNCQDs在551 nm处的荧光强度；可检测的线性范围为0.87~34.83 µmol/L，最低检出限为0.69 µmol/L。
利用所述方法对实际样品中桑色素的检测，具体方法为：
（1）实际样品的制备：称取5.0 g待测实际样品，加入50 mL去离子水，加热煮沸30min，上清液装入离心管，7000转/分钟下离心10 min，收集上清液，冷冻干燥得到待测实际样品固体粉末；
（2）待测实际样品储备液的制备：准确称量待测实际样品固体粉末，加入去离子水，搅拌完全溶解，溶液于7000转/分钟下离心10 min，收集上清液，即为浓度为1.0 mg/mL的待测实际样品储备液；
（3）去离子水中加入浓度为10 mg/mL的 ClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P0；
（4）在2 mL浓度为1.0 mg/mL的待测实际样品储备液中加入200 µL ClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1；
（5）将(P 0 -P 1 )/P 0 代入线性方程，计算得到实际样品中桑色素的含量。
利用所述方法对实际样品中桑色素的加标回收率的测定，具体步骤为：
（1）在2 mL浓度为1.0 mg/mL的待测实际样品储备液中加入200 µL ClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P0；再向混合溶液中滴加2.2 µL浓度为0.01 mol/L的桑色素标准液，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1；
（2）将(P 0 -P 1 )/P 0 代入线性方程，计算得到加标浓度c1，利用c1/c0×100%计算得到四种实际样品中桑色素的加标回收率，其中c0为加标浓度。
本发明前体物质邻氯苯甲酸和对苯二胺均为普通试剂，廉价易得，容易采购。探针制备方法简单，无需昂贵仪器，可快速、高效、准确实现桑色素的检测。所制备的荧光探针性能稳定，抗干扰能力强。
总而言之，与其他检测桑色素的方法相比，该方法具有快速有效，性能稳定，抗干扰能力强，操作简便，检测成本低等优点，是桑色素检测的新方法。
附图说明
图1为实施例1中制备的ClNCQDs的紫外光谱图以及荧光最佳激发发射光谱图；
图2为实施例1中制备的ClNCQDs在不同激发波长下的发射光谱图；
图3为实施例2中各种氨基酸以及药物对桑色素检测的抗干扰实验结果图；
图4为实施例3中桑色素滴定ClNCQDs荧光强度变化光谱图；
图5为实施例3中桑色素浓度与ClNCQDs荧光强度变化线性图。
具体实施方式
实施例1：ClNCQDs的制备及表征
步骤一，准确称量0.16 g邻氯苯甲酸和0.054 g对苯二胺，向其中依次加入7.5 mL无水乙醇和7.5 mL去离子水，超声（200 W，1.5 min）充分溶解，混合液转移至50 mL高压反应釜并置于马弗炉中，于120oC下反应16 h，将前体物质完全碳化，制备得到红褐色溶液。
步骤二，将红褐色溶液在7000转/分钟下离心10 min，上清液中的乙醇旋蒸去除，再向其中加入10 mL去离子水，超声（200 W，5 min）充分溶解，混合液在7000转/分钟下离心10 min，收集红褐色的上清液。
步骤三，将红褐色上清液利用100-500 Da透析袋透析处理3 h，每隔1.5 h换一次去离子水，透析完成后，透析袋中的溶液冷冻干燥即获得ClNCQDs固体粉末。
步骤四，准确称取0.1 g ClNCQDs固体粉末，加入10 mL去离子水，搅拌充分溶解，得到浓度为10 mg/mL的ClNCQDs储备液。
性质表征见图1和图2。
图1为ClNCQDs的紫外吸收光谱图，其中有两个明显的吸收峰位于233 nm和279nm，分别由芳香环sp2键发生π→π*跃迁和C=O键发生n→π*跃迁引起；图1中ClNCQDs的最佳激发和发射峰分别位于374 nm和551 nm。
图2是ClNCQDs在不同激发波长下的发射光谱图，当激发波长从360 nm变化到450nm时，发射波长由546 nm红移到599 nm，说明ClNCQDs具有激发波长依赖性。
实施例2：桑色素检测的抗干扰实验
步骤一，准确称量一定质量的氨基酸（0.0038 g甘氨酸、0.0083 g苯丙氨酸、0.0075 g甲硫氨酸、0.0073 g赖氨酸、0.0078 g组氨酸、0.0061 g半胱氨酸、0.0066 g天冬氨酸、0.0059 g缬氨酸、0.0074 g谷氨酸、0.0053 g丝氨酸、0.0066 g天冬酰胺、0.0060 g苏氨酸、0.0045 g丙氨酸、0.0073 g谷氨酰胺、0.0066 g异亮氨酸、0.0058 g脯氨酸、0.0087 g精氨酸、0.0102 g色氨酸、0.0066 g亮氨酸、0.0091 g酪氨酸），加入5 mL去离子水，搅拌充分溶解，配制浓度为0.01 mol/L的氨基酸储备液。
步骤二，准确称量一定质量的腺苷（0.0134 g）、维生素C（0.0088 g）、乙酰水杨酸（0.0090 g）、多巴胺（0.0095 g），加入5 mL去离子水，搅拌充分溶解，配制浓度为0.01 mol/L的药物储备液。
步骤三，准确称量一定质量的阿霉素（0.0272 g）、姜黄素（0.0184 g），加入5 mL无水乙醇，搅拌充分溶解，配制浓度为0.01 mol/L的药物储备液。
步骤四，测量2 mL ClNCQDs溶液（0.89 mg/mL）在551 nm处的荧光强度，记为P0；在1782 µL ClNCQDs溶液（1 mg/mL）中分别加入198 µL氨基酸储备液（0.01 mol/L）和药物储备液（0.01 mol/L），此时氨基酸浓度和药物浓度均为1.0 mmol/L，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1；再向其中加入20 µL 桑色素标准液（0.01 mol/L），此时桑色素浓度为0.1 mmol/L，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P2。P1/P0得到黑色柱状图，P2/P1得到灰色柱状图，实验结果见图3。
图3是不同氨基酸和药物对桑色素检测的抗干扰性研究，说明利用ClNCQDs对桑色素检测不受氨基酸和其它药物的干扰，检测结果具有良好的抗干扰性。
实施例3：桑色素滴定ClNCQDs的线性方程
步骤一，在2 mL去离子水中加入200 µL ClNCQDs溶液（10 mg/mL），ClNCQDs的终浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P0。
步骤二，向步骤一中的溶液逐滴滴加桑色素标准液（0.01 mol/L），测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P。整个滴加过程中，ClNCQDs荧光光谱变化见图4。
步骤三，利用Origin 软件，拟合荧光强度变化(P 0 -P)/P 0和桑色素浓度之间的线性关系，结果见图5。
图4表明随着桑色素标准液的加入，ClNCQDs的荧光逐渐被猝灭，说明桑色素对ClNCQDs的荧光有特异的猝灭效果。图5是ClNCQDs荧光强度的猝灭值与桑色素浓度之间的线性关系图，线性方程为(P 0 -P)/P 0 = 0.0092´c(桑色素) - 0.0050，相关系数R 2 = 0.9965，线性范围为0.87~34.83 µmol/L，最低检出限为0.69 µmol/L。
实施例4：实际样品中桑色素含量检测
步骤一，在2 mL去离子水中加入200 µL ClNCQDs储备液（10 mg/mL），此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P0。
步骤二，在2 mL甘草储备液（1.0 mg/mL）中加入200 µL ClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1。
步骤三，在2 mL桑白皮储备液（1.0 mg/mL）中加入200 µL ClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1。
步骤四，在2 mL桑叶储备液（0.10 mg/mL）中加入200 µL ClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1。
步骤五，在2 mL桑椹储备液（0.10 mg/mL）中加入200 µL ClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1。
步骤六，将(P 0 -P 1 )/P 0代入线性方程，计算得到四种实际样品中桑色素的含量。所有实验重复三次，结果见表1。
表1表明利用ClNCQDs检测桑色素的方法可用于实际样品中桑色素的定量检测，且相对标准偏差均小于10.4%，具有良好的重现性。
表1：实施例4中四种实际样品中桑色素的含量
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例5：实际样品中桑色素的加标回收实验
步骤一，在2 mL甘草储备液（1.0 mg/mL）中加入200 µL ClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P0；再向混合溶液中滴加2.2 µL桑色素标准液（0.01 mol/L），测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1。
步骤二，在2 mL桑白皮储备液（1.0 mg/mL）中加入200 µL ClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P0；再向混合溶液中滴加2.2 µL桑色素标准液（0.01 mol/L），测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1。
步骤三，在2 mL桑叶储备液（0.10 mg/mL）中加入200 µL ClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P0；再向混合溶液中滴加2.2 µL桑色素标准液（0.01 mol/L），测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1。
步骤四，在2 mL桑椹储备液（0.10 mg/mL）中加入200 µL ClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P0；再向混合溶液中滴加2.2 µL桑色素标准液（0.01 mol/L），测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1。
步骤五，将(P 0 -P 1 )/P 0代入线性方程，计算得到加标浓度c1，利用c1/c0 × 100%计算得到四种实际样品中桑色素的加标回收率，其中c0为加标浓度。所有实验重复三次，结果见表2。
表2说明四种实际样品中的桑色素的加标回收率介于98.8%与103.6%之间，相对标准偏差均小于6.3%，表明ClNCQDs可用于实际样品中桑色素的加标检测，该方法具有良好的重现性。
表2：实施例5中四种实际样品中桑色素的加标回收实验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE004

Claims (5)

1.一种基于荧光猝灭法快速检测桑色素的荧光探针，其特征在于：以邻氯苯甲酸作为碳源和氯源，对苯二胺作为氮源，通过一步水热法快速制备氯氮双掺杂碳量子点ClNCQDs，离心除去不溶物，旋蒸去除乙醇溶剂，透析去除未反应的前体物质和小分子，冷冻干燥得到荧光探针ClNCQDs固体粉末。
2.制备权利要求1所述的一种基于荧光猝灭法快速检测桑色素的荧光探针的方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）前体物质的获得：准确称量0.16 g邻氯苯甲酸和0.054 g对苯二胺，向其中依次加入7.5 mL无水乙醇和7.5 mL去离子水，200 W超声1.5 min充分溶解，混合液转移至50 mL高压反应釜并置于马弗炉中，于120℃下反应16 h，将前体物质完全碳化，制备得到红褐色溶液；
（2）将红褐色溶液在7000转/分钟下离心10 min，上清液中的乙醇旋蒸去除，再向其中加入10 mL去离子水，200 W超声5 min充分溶解，混合液在7000转/分钟下离心10 min，收集红褐色的上清液；
（3）将红褐色上清液利用100-500 Da透析袋透析处理3 h，每隔1.5 h换一次去离子水，透析完成后，透析袋中的溶液冷冻干燥即获得ClNCQDs固体粉末。
3.利用权利要求1所述的荧光探针检测桑色素的方法，其特征在于：具体步骤为：
（1）ClNCQDs储备液的制备：准确称量ClNCQDs固体粉末，加入去离子水，搅拌充分溶解，得到浓度为10 mg/mL的ClNCQDs储备液；
（2）桑色素储备液的制备：准确称量桑色素粉末，加入无水乙醇，搅拌充分溶解，得到浓度为0.10 mol/L的桑色素储备液；
（3）桑色素标准液的制备：准确吸取1.0 mL桑色素储备液，用乙醇溶液稀释定容至10mL，摇匀，即可得浓度为0.01 mol/L的桑色素标准液；
（4）桑色素含量与ClNCQDs荧光强度之间线性方程的获得：将不同体积的0.01 mol/L桑色素标准液加入到浓度为0.91 mg/mL的ClNCQDs溶液中，在374 nm激发波长下，记录ClNCQDs在551 nm处的荧光强度值；通过Origin 软件线性拟合桑色素浓度与ClNCQDs荧光强度，得到线性方程：(P 0 -P)/P 0 = 0.0092×c桑色素 - 0.0050，R 2 = 0.9965；式中P 0 和P分别为桑色素加入前后ClNCQDs在551 nm处的荧光强度；可检测的线性范围为0.87~34.83 µmol/L，最低检出限为0.69 µmol/L。
4.利用权利要求3所述方法检测实际样品中桑色素的方法，其特征在于：具体步骤为：
（1）实际样品的制备：称取5.0 g待测实际样品，加入50 mL去离子水，加热煮沸30 min，上清液装入离心管，7000转/分钟下离心10 min，收集上清液，冷冻干燥得到待测实际样品固体粉末；
（2）待测实际样品储备液的制备：准确称量待测实际样品固体粉末，加入去离子水，搅拌完全溶解，溶液于7000转/分钟下离心10 min，收集上清液，即为浓度为1.0 mg/mL或0.10mg/mL的待测实际样品储备液；
（3）去离子水中加入浓度为10 mg/mL的 ClNCQDs储备液，配制成ClNCQDs的浓度为0.91mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P0；
（4）在2 mL浓度为1.0 mg/mL或0.10 mg/mL的待测实际样品储备液中加入200 µLClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1；
（5）将(P 0 -P 1 )/P 0 代入线性方程，计算得到实际样品中桑色素的含量。
5.利用权利要求3所述方法测定实际样品中桑色素的加标回收率的方法，其特征在于：具体步骤为：
（1）在2 mL浓度为1.0 mg/mL或0.10 mg/mL的待测实际样品储备液中加入200 µLClNCQDs储备液，此时ClNCQDs的浓度为0.91 mg/mL，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P0；再向混合溶液中滴加2.2 µL浓度为0.01 mol/L的桑色素标准液，测量ClNCQDs在551 nm处的荧光强度，记为P1；
（2）将(P 0 -P 1 )/P 0 代入线性方程，计算得到加标浓度c1，利用c1/c0×100%计算得到四种实际样品中桑色素的加标回收率，其中c0为加标浓度。
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