JP5032577B2 - 鉛濃度測定用試薬及び鉛濃度測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、水溶性ポルフィリンを利用した鉛濃度測定用試薬、及び該試薬を用いた鉛濃度測定方法に関する。

鉛は、伝導性をはじめ電気化学的に有用な性質を持つ他、加工も行いやすい為、はんだ、電池、ガラス材料等様々な工業製品に使用されている。これらが都市ゴミや産業廃棄物として廃棄され、焼却プラントで焼却されると、焼却灰や飛灰からは高濃度の鉛が検出されることがある。これらの灰は埋め立て処理されるものの、周辺地域の雨水等によって生じる鉛の溶出が懸念される。鉛は、微量でも人体に対して強い毒性があり、神経系の障害や、貧血、頭痛、食欲不振、鉛疝痛等の中毒症状を呈することが知られている。そのため、埋め立て基準等が設けられ、鉛の溶出を防ぐ処理剤や処理方法及び溶出液中の鉛濃度の測定法が開発されてきた。鉛はまた、その他の多くの生物に対しても毒性を示すため、環境基準及び排水基準等が定められている他、広範囲に及ぶ環境分析に適用できる簡易な測定方法が求められている。

鉛の測定方法としては、原子吸光光度計やＩＣＰ発光分光光度計を用いる方法が一般的であるが、アセチレンガスやアルゴンガスの供給、排気ダクトの設置を必要とする他、複雑な操作が要求されるため、オンサイトでの環境分析や焼却現場での日常的な分析には適していない。

一方、比色試薬の発色によって濃度を見積もる吸光光度法は、小型で安価な装置と簡単な操作で測定が可能であるため簡易測定に適する。そして、鉛の測定に用いられる比色試薬には、水溶性ポルフィリンやポルフィリン核導入ポリマー等のポルフィリン誘導体があり、水溶液中の微量な鉛濃度を測定できることが知られている。
しかしながら、環境分析の対象となる試料溶液中には、鉛の他に様々な夾雑物が含まれることが一般的であり、これらは高感度かつ正確に鉛を測定する際に妨害物質となる。例えば、海水、河川水、水道水、工場排水、灰溶出液等環境中に普遍的に見出されるカルシウムは、水溶液中では鉛と同様に主に２価イオンとして共存するため、比色試薬との化学反応に基づく吸光光度法においては鉛測定の妨害物質となることがある。特に灰溶出液中には、カルシウムが数十から数百ミリモル濃度といった高濃度で含まれているため、比色試薬に水溶性ポルフィリンを用いた吸光光度法で、灰溶出液中の鉛濃度を測定することは困難であった。このようなカルシウムを含む試料溶液中の鉛濃度を吸光光度法により測定する場合は、その前処理として、カルシウムと鉛を分離するか、又はカルシウムをマスキングする必要がある。

カルシウムと鉛を分離する方法として、イミノ二酢酸等を主成分とするキレート樹脂を用いる方法がある。イミノ二酢酸は鉛をはじめとする重金属と親和性が強いため、キレート樹脂から成るカラム又はフィルターに試料溶液を通液することで鉛のみを補足した後、酸性の溶離液を通液することで再び鉛を溶出させて、その溶液中の鉛濃度を測定する方法である。この方法は、ポンプ又はシリンジ等を用いて正確な容量の通液を複数回必要とする等、操作が煩雑となり簡易測定として十分とは言えない。

カルシウムのマスキング剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）が知られている。しかしながら、これらは同時に鉛とも結合する。高濃度のカルシウムをマスクするためには高濃度のマスキング剤を添加する必要があるが、その場合、カルシウムに比べてはるかに微量な鉛は、残らずマスキングされてしまう。そのため、水溶性ポルフィリンを用いた吸光光度法による鉛測定において、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡをカルシウムのマスキング剤として使用することはできない。

試料溶液中に妨害成分としてカルシウムが含まれている場合の吸光光度法による鉛の測定方法としては、これらの他に、予めカルシウムを添加したポルフィリン核導入ポリマーを用いた鉛濃度測定方法が報告されている（特許文献１）。この方法は、カルシウムの影響を除くことはできるものの、試薬の製造に重合過程を含むため、試薬の調製には時間とコストを要する。また、ポリマー内へ導入されたポルフィリンは、吸収ピーク幅がブロードとなり感度が低下するため、環境基準や排水基準レベルといった、より微量の鉛分析にはさらなる感度の向上が望まれている。
国際公開第２００６／０１１５４９号パンフレット

従って、本発明の目的は、カルシウムイオンが共存する試料溶液中の鉛イオン濃度（単に鉛濃度ともいう）を正確、高感度かつ簡易に測定できる鉛濃度測定用試薬及び該試薬を用いた鉛濃度測定方法を提供することにある。

本発明者らは、斯かる実状に鑑み鋭意検討した結果、全く意外にも、水溶性ポルフィリンを用いた吸光光度法による鉛濃度測定において、カルシウム供給化合物と、更にポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール又はポリエチレングリコールの高分子を用いたときに初めてカルシウムイオンによる妨害を良好に排除でき、カルシウムイオンが共存する試料溶液中の鉛イオン濃度が正確、高感度かつ簡易に測定できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、（Ａ）水溶性ポルフィリン誘導体又はその塩、
（Ｂ）ポリアクリルアミド（以下、ＰＡＡｍと略する場合がある）、ポリビニルアルコール（以下、ＰＶＡと略する場合がある）、及びポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略する場合がある）から選ばれる少なくとも一種、並びに（Ｃ）カルシウムイオン供給化合物を含有する鉛濃度測定用試薬を提供するものである。

また、本発明は、上記の鉛濃度測定用試薬と試料溶液を混合し、その吸光度を測定することを特徴とする鉛濃度測定方法を提供するものである。

本発明の鉛濃度測定用試薬は、試料溶液中に存在するカルシウムイオンの影響を受けることなく、正確な鉛濃度を簡易に測定することが可能であり、排水、廃液、灰溶出液等の鉛濃度測定用試薬として有用である。

試料溶液（鉛・０〜５０ｍＭカルシウム混合液）と、ＴＰＰＳを反応させた吸収スペクトルの図である。 試料溶液（鉛・０〜１５０ｍＭカルシウム混合液）とＴＰＰＳ（ｎｏｎ）、前記試料溶液とＴＰＰＳ及びＰＡＡｍ（ＰＡＡｍ）、前記試料溶液とＴＰＰＳ及びカルシウム供給化合物（Ｃａ）、前記試料溶液とＴＰＰＳ、ＰＡＡｍ及びカルシウム供給化合物（ＰＡＡｍ＋Ｃａ）をそれぞれ反応させた吸収スペクトルの図である。 試料溶液（鉛・０〜１５０ｍＭカルシウム混合液）とＴＰＰＳ、ＰＶＡ及びカルシウム供給化合物（ＰＶＡ＋Ｃａ）、前記試料溶液とＴＰＰＳ、ＰＥＧ及びカルシウム供給化合物（ＰＥＧ＋Ｃａ）をそれぞれ反応させた吸収スペクトルの図である。 （ａ）試料溶液（鉛・０〜５０ｍＭカルシウム混合液）とＴＰＰＳ、ＥＤＴＡ及びカルシウム供給化合物を反応させた吸収スペクトルの図である。（ｂ）試料溶液（鉛・０〜５０ｍＭカルシウム混合液）とＴＰＰＳ、ＥＧＴＡ及びカルシウム供給化合物を反応させた吸収スペクトルの図である。 試料溶液（鉛・０〜１５０ｍＭカルシウム混合液）とＴＭＰｙＰ（ｎｏｎ）、前記試料溶液とＴＭＰｙＰ及びＰＡＡｍ（ＰＡＡｍ）、前記試料溶液とＴＭＰｙＰ及びカルシウム供給化合物（Ｃａ）、前記試料溶液とＴＭＰｙＰ、ＰＡＡｍ及びカルシウム供給化合物（ＰＡＡｍ＋Ｃａ）をそれぞれ反応させた吸収スペクトルの図である。 簡易型鉛計測装置における、試料溶液（鉛・０〜１５０ｍＭカルシウム混合液）と、（ａ）本発明鉛濃度測定用試薬（ＴＰＰＳ＋ＰＡＡｍ＋Ｃａ）、（ｂ）参考鉛濃度測定用試薬（ポルフィリンポリマー）をそれぞれ反応させた吸収スペクトルの図である。 簡易型鉛計測装置における、試料溶液（０〜０．１ｍｇ／Ｌ 鉛水溶液）と、（ａ）本発明鉛濃度測定用試薬（ＴＰＰＳ＋ＰＡＡｍ＋Ｃａ）、（ｂ）参考鉛濃度測定用試薬（ポルフィリンポリマー）をそれぞれ反応させたときの検量線である。

本発明に用いられる（Ａ）水溶性ポルフィリン誘導体又はその塩としては、ポルフィリン骨格を有し、鉛イオンと反応して特定の波長の吸光度が変化するものが挙げられる。

具体的なポルフィリン誘導体としては、次式（１）

（式中、Ｘ^１〜Ｘ^４のうち少なくとも１個は

を示し、残余は水素原子を示し、

Ｒ^１はアルキル基、スルホアルキル基、カルボキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基又は水素原子を示し、Ｒ^２及びＲ^３は水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン酸残基、リン酸残基又はトリアルキルアンモニウム基を示す）で表される水溶性ポルフィリンが挙げられる。

前記式（１）中、Ｒ^１で示されるアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等の炭素数１〜６のアルキル基が挙げられるが、メチル基が特に好ましい。また、スルホアルキル基としては、スルホメチル基、スルホエチル基、スルホプロピル基、スルホブチル基、スルホペンチル基、スルホヘキシル基等のスルホＣ_１−６アルキル基が挙げられる。カルボキシアルキル基としては、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルボキシブチル基、カルボキシペンチル基、カルボキシヘキシル基等のカルボキシＣ_１−６アルキル基が挙げられる。ヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、ヒドロキシペンチル基、ヒドロキシヘキシル基等のヒドロキシＣ_１−６アルキル基が挙げられる。

Ｒ^２及びＲ^３の具体例としては、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン酸残基（−ＳＯ_３Ｈ）、リン酸残基、トリメチルアンモニウム基が挙げられるが、スルホン酸残基（−ＳＯ_３Ｈ）、トリメチルアンモニウム基が特に好ましい。

Ｘ^１〜Ｘ^４の好ましい例としては、スルホフェニル基、スルホチエニル基、トリメチルアンモニウムフェニル基、ヒドロキシフェニル基、カルボキシフェニル基、アミノフェニル基、ホスホリルフェニル基、ピリジニウム基、メチルピリジニウム基、スルホエチルピリジニウム基、カルボキシメチルピリジニウム基、ヒドロキシエチルピリジニウム基等が挙げられる。より好ましくは、４−スルホフェニル基、４−スルホチエニル−２−イル基、４−トリメチルアンモニウムフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、４−カルボキシルフェニル基、４−アミノフェニル基、４−ホスホリルフェニル基、Ｎ−メチルピリジニウム−４−イル基、Ｎ−メチルピリジニウム−３−イル基、Ｎ−スルホエチルピリジニウム−４−イル基等が挙げられる。さらに好ましくは、４−スルホフェニル基、４−トリメチルアンモニウムフェニル基、Ｎ−メチルピリジニウム−４−イル基、Ｎ−メチルピリジニウム−３−イル基等が挙げられる。

特に好ましい式（１）の化合物としては、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−スルホフェニル）ポルフィリン（以下、ＴＰＰＳと略する場合がある）、５，１０，１５，２０−テトラキス（Ｎ−メチルピリジニウム−４−イル）ポルフィリン（以下、ＴＭＰｙＰと略する場合がある）、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−トリメチルアンモニウムフェニル）ポルフィリンが挙げられ、これらのうち、測定感度の点から、好ましくはＴＰＰＳ又はＴＭＰｙＰである。

本発明の式（１）で表される水溶性ポルフィリン誘導体は、置換基Ｘ^１〜Ｘ^４の種類に応じて、塩の形態であってもよい。具体的には、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等の酸付加塩等が挙げられる。

本発明で用いる式（１）で表される水溶性ポルフィリンは、微量金属の比色試薬として公知の化合物である。該ポルフィリン誘導体は、例えばピロールとベンズアルデヒドの脱水縮合と、ｐ−クロラニルによる酸化によって得られるテトラフェニルポルフィリンのフェニル基を、濃硫酸中でスルホン酸化することによって製造することができる（J. S. Lindsey, I. C. Schreiman, H. C. Hsu, P. C. Kearney, and A. M. Marguerettaz, ‘‘Rothemund and Adler-Longo Reactions Revisited : Synthesis of Tetraphenylporphyrinsunder Equilibrium Conditions’’, J. Org. Chem., 1987, 52, 827）。また、市販品として入手することも可能である。

鉛濃度測定用試薬中の式（１）で表される水溶性ポルフィリンの濃度は、使用時の濃度として、０．０１〜１０００μｍｏｌ／Ｌ、更に、０．１〜５００μｍｏｌ／Ｌ、特に、１〜１００μｍｏｌ／Ｌであるのが、試料溶液中に微量含まれる鉛濃度測定の精度の点で好ましい。

本発明に用いられる（Ｂ）成分としては、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、これらのうち、測定感度や安定性の点からポリアクリルアミドが好ましい。これらは、いずれも水溶性の高分子で、それぞれ様々な用途で使用される公知の化合物であり、市販品として入手できる。

本発明の鉛濃度測定用試薬中のＰＡＡｍ濃度は、使用時の濃度として、１〜４０質量％、特に１０〜２５質量％が好ましい。また、ＰＡＡｍの平均分子量は１０００〜１０００００、特に５０００〜２００００が好ましい。
本発明の鉛濃度測定用試薬中のＰＶＡ濃度は、使用時の濃度として、０．１〜２０質量％、特に１〜１０質量％が好ましい。また、ＰＶＡの重合度は１００〜１００００、特に２００〜２０００が好ましい。
本発明の鉛濃度測定用試薬中のＰＥＧ濃度は、使用時の濃度として、０．１〜２０質量％、特に１〜１０質量％が好ましい。また、ＰＥＧの分子量は１００〜５００００、特に１００００〜４００００が好ましい。

一般的に、ＰＡＡｍは、紙力増強剤、接着剤、凝集剤の他、化粧品の適度な粘性と安定化に寄与する基剤としても使用され、また、ゲル化したものは電気泳動に用いられる。ＰＶＡは、接着剤、界面活性剤、フィルム材料等に利用され、ＰＥＧは、薬剤等の安定化剤や基剤として利用されている。しかしながら、ＰＡＡｍ、ＰＶＡ、ＰＥＧをカルシウムイオンのマスキング剤として利用したり、水溶性ポルフィリンと鉛イオンとの安定な反応に寄与する添加剤として使用された例はない。

本発明の鉛濃度測定用試薬に用いられる（Ｃ）成分のカルシウムイオンを発生させるカルシウムイオン供給化合物は、本発明の効果を損なわないでカルシウムイオンを遊離する化合物であれば特に制限されるものではない。例えば、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸カルシウム等の無機カルシウム塩；酢酸カルシウム、ギ酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、安息香酸カルシウム、イソ酪酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、サリチル酸カルシウム等の有幾カルシウム塩が挙げられる。カルシウムイオン供給化合物としては、無機カルシウム塩、例えば、塩化カルシウム、硫酸カルシウム及び硝酸カルシウムが好ましく、特に塩化カルシウムが好ましい。

本発明の鉛濃度測定用試薬中のカルシウムイオン供給化合物は、使用時に、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、特に５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌを供給できる量が好ましい。

本発明の鉛濃度測定用試薬には上記成分及び水の他、本発明の効果を損なわない範囲で、通常溶液中の重金属イオンの測定に使用される任意成分を加えることができる。このような任意成分としては、ｐＨ調整剤、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤、その他の金属に対するマスキング剤等が挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（以下、ＣＡＰＳと略する場合がある）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等から選ばれる少なくとも１種のものが挙げられる。鉛濃度測定用試薬と試料溶液との混合液のｐＨを、８〜１３、更に９〜１１（２５℃）に調整するためのｐＨ調整剤が好ましい。

界面活性剤としては、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
その他の金属に対するマスキング剤としては、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジプロピオン酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジ酢酸及び１，６−ジアミノヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸等が挙げられる。

本発明の鉛濃度測定用試薬は、原液、濃縮液、粉体、ペースト状等いずれの形態でもよい。また、鉛濃度測定用試薬の各成分を適宜、別々又は混合した状態で保存してもよい。

本発明の鉛濃度測定方法は、上記鉛濃度測定用試薬と試料溶液とを混合し、その吸光度を測定することにより行われる。
測定にあたっては、鉛濃度測定用試薬と試料溶液との混合液のｐＨが、８〜１３、更に９〜１１（２５℃）となるように調整することが好ましい。なお、該混合液のｐＨがこの範囲外である場合は、この範囲になるように予め鉛濃度測定用試薬のｐＨをｐＨ調整剤で調整するのが好ましい。
吸光度測定に先立ち、鉛濃度測定用試薬と試料溶液との混合液を加熱する等して反応を十分に進行させておくことが好ましい。加熱温度は３０〜９０℃が好ましく、加熱時間は１〜６０分が好ましい。このうち、精度と感度及びスループットの点から、加熱時間は６０〜８０℃、加熱時間は３〜１５分が特に好ましい。

本発明の鉛濃度測定用試薬を用いた試料溶液中に含有する鉛濃度測定方法は、例えば、吸光度法により標準試料を用いた検量線を用いて行われる。
吸光度計による測定における吸光波長は、３５０〜７００ｎｍ、更に４００〜５００ｎｍ、特に４６０〜４９０ｎｍであるのが好ましい。

本発明において鉛濃度を測定する試料は、特に限定されないが、海水、河川水、水道水、工場排水、焼却灰や飛灰等の灰溶出液等の環境試料；食品、飲料、農林水産物、植物、薬剤、ヒト又は動物の血液、唾液、精液等の体液、腎臓、心臓、脳等の臓器、筋肉、皮膚、神経組織、毛髪、糞便等の生体試料等が挙げられる。
本発明の鉛濃度測定用試薬を用いた鉛濃度測定方法において、試料溶液は、これら試料の原液の他、測定のために試料を公知の手法で適宜抽出や濃縮・希釈等した抽出液、濃縮・希釈液等も含まれる。該試料溶液中のカルシウムイオン濃度は、特に限定されないが、１５０ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下が特に好ましい。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

参考例１ ＴＰＰＳのみ含む鉛濃度測定用試薬Ａ
鉛濃度測定用試薬の調製：水溶性ポルフィリンとしてＴＰＰＳを５０μＭ、ｐＨ調整剤としてＣＡＰＳを１８０ｍＭ含む水溶液（ｐＨ１０）となるように調製し、鉛濃度測定用試薬Ａとした。
試料溶液及び標準試料の調製：試料溶液として、０．１５ｍｇ／Ｌの鉛と０．５，５，１５，５０及び１５０ｍＭの塩化カルシウムを含み、ｐＨを９〜１２．５に調整した鉛−カルシウム混合水溶液を用意した。また、検量線作成のため、標準試料として、０及び０．１５ｍｇ／Ｌの鉛を含む標準溶液を用意した。

鉛濃度測定：鉛濃度測定用試薬Ａ２５０μＬと試料溶液２５０μＬを混合し、７５℃で５分間加熱した後、分光光度計を用いて吸収スペクトルを測定した。
得られた吸収スペクトルは規格化し、ベースラインの変動を除外した。同様に、試料溶液に代えて標準試料を用い、吸収スペクトルを測定した。
標準試料との混合で得た吸収スペクトルから、鉛との反応に由来する吸光度変化の大きい波長を４７０ｎｍ付近から選択し検量線を作成した。この検量線を用いて、試料溶液との混合で得た吸光度から試料溶液中の鉛濃度を見積もった。
図１に、ＴＰＰＳのみを含む鉛濃度測定用試薬Ａを用いた場合の吸収スペクトルを示す。４６６ｎｍ付近に、鉛に由来するピークが観察された。しかしながら、鉛濃度は同一であっても共存するカルシウム濃度が増加するとピーク高は減少し、ついにはピークが消滅した。図１より算出された鉛濃度を、共存するカルシウム濃度に対してプロットしたグラフを図２（ｎｏｎ：参照）に示す。わずかなカルシウムの共存でも本来の鉛濃度（０．１５ｍｇ／Ｌ）より低い値が算出されてしまい、正しい測定をおこなうことはできなかった。

試験例１ （Ａ）成分：ＴＰＰＳ、（Ｂ）成分：ＰＡＡｍ及び／又は（Ｃ）成分：塩化カルシウムの添加剤を含む鉛濃度測定用試薬Ｂ１〜３
鉛濃度測定用試薬調製：添加剤としてポリアクリルアミド（平均分子量１００００）を２０質量％及び／又は塩化カルシウムを１０ｍＭ、水溶性ポルフィリンとしてＴＰＰＳを５０μＭ、ｐＨ調整剤としてＣＡＰＳを１８０ｍＭ含む水溶液（ｐＨ１０）となるように調製し、鉛濃度測定用試薬Ｂ１〜３とした。添加剤として、ポリアクリルアミドのみ（試薬Ｂ１）、塩化カルシウムのみ（試薬Ｂ２）、ポリアクリルアミド及び塩化カルシウム併用（試薬Ｂ３）。
試料溶液及び標準試料の調製：参考例１と同様のものを用いた。
鉛濃度測定：鉛濃度測定試薬Ａの代わりに試薬Ｂ１〜３を用いて、参考例１と同様に行った。

図２には、鉛濃度測定試薬Ｂ１〜３を用いた場合の鉛濃度測定結果も示した。ポリアクリルアミドのみを添加した試薬Ｂ１の場合、高濃度のカルシウム共存による妨害は多少改善されたが、低濃度（約１５ｍＭ以下）のカルシウムが共存したときは鉛濃度が低く見積もられる傾向があった。カルシウムのみを添加した試薬Ｂ２の場合は、添加剤を含まない場合と同様に、共存カルシウム濃度に応じて測定値が単調に低下する傾向を示した。一方、ポリアクリルアミドと塩化カルシウムの両方を添加した試薬Ｂ３の場合、カルシウムが低濃度から高濃度にかけて共存しても本来の鉛濃度に近い値が算出された。

試験例２ （Ａ）成分：ＴＰＰＳ、（Ｂ）：ＰＶＡ及び（Ｃ）成分：塩化カルシウムの添加剤を含む鉛濃度測定用試薬Ｃ並びに（Ａ）成分：ＴＰＰＳ、（Ｂ）成分：ＰＥＧ及び（Ｃ）成分：塩化カルシウムの添加剤を含む鉛濃度測定用試薬Ｄ
濃度測定用試薬調製：添加剤としてＰＶＡ（重合度５００）を２．５質量％及び塩化カルシウムを１０ｍＭ、水溶性ポルフィリンとしてＴＰＰＳを５０μＭ、ｐＨ調整剤としてＣＡＰＳを１８０ｍＭ含む水溶液（ｐＨ１０）となるように調製し、鉛濃度測定用試薬Ｃとした。
また、添加剤としてＰＥＧ（平均分子量２００００）を５質量％及び塩化カルシウムを１０ｍＭ、水溶性ポルフィリンとしてＴＰＰＳを５０μＭ、ｐＨ調整剤としてＣＡＰＳを１８０ｍＭ含む水溶液（ｐＨ１０）となるように調製し、鉛濃度測定用試薬Ｄとした。
上記鉛濃度測定用試薬Ｂ３を試薬Ｃ又は試薬Ｄに代えた以外は、上記試験例１と同様に行った。
図３に、ＰＶＡと塩化カルシウム併用添加剤の鉛濃度測定用試薬Ｃ、ＰＥＧと塩化カルシウム併用添加剤の鉛濃度測定用試薬Ｄを用いた場合の結果を示した。鉛濃度測定用試薬Ｃ及びＤのいずれを用いた場合も、共存カルシウムが増加しても測定値が低下することなく、本来の鉛濃度に近い値が算出された。

参考例２ （Ａ）成分：ＴＰＰＳ、マスキング剤：ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡを含む鉛濃度測定用試薬Ｅ及びＦ
水溶性ポルフィリンとしてＴＰＰＳを５０μＭ、ｐＨ調整剤としてＣＡＰＳを１８０ｍＭ、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡを５０ｍＭ含む水溶液（ｐＨ１０）に調製し、鉛濃度測定用試薬Ｅ及びＦとした。ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡは、一般的なカルシウムキレート剤（マスキング剤）として知られており、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡの濃度は、数十ミリモル以上のカルシウムでもマスキングできるよう５０ｍＭとした。
参考例１の試薬Ａを試薬Ｅ又はＦに代えて用いた以外は、参考例１と同様に行った。

図４（ａ）（ｂ）に、鉛濃度測定用試薬Ｅ及び試薬Ｆを用いた場合の結果の吸収スペクトルを示す。ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡのいずれを用いた場合も、カルシウム濃度にかかわらず、鉛に由来するピークは観察されなかった。これは、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡはカルシウムイオンだけでなく鉛イオンに対しても親和性があると同時に、鉛濃度と比べてはるかに大過剰（モル比で７万倍弱）含まれているため、ほぼすべての鉛イオンがＥＤＴＡあるいはＥＧＴＡと結合してしまい、ポルフィリンと錯体を形成できなかったためと考えられる。そのため、高濃度のカルシウムが含まれている試料溶液中の鉛濃度を、水溶性ポルフィリンを用いた吸光光度法により測定する際、カルシウムのマスキング剤としてＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを使用することはできなかった。

試験例３ （Ａ）成分：ＴＭＰｙＰ、（Ｂ）成分：ＰＡＡｍ及び（Ｃ）成分：塩化カルシウムの添加剤を含む鉛濃度測定用試薬Ｇ１〜４
鉛濃度測定用試薬調製：水溶性ポルフィリンとしてＴＭＰｙＰを５０μＭ、添加剤としてポリアクリルアミド（平均分子量１００００）を２０質量％及び／又は塩化カルシウムを３０ｍＭ、ｐＨ調整剤としてＣＡＰＳを１８０ｍＭ含む水溶液（ｐＨ１０）となるように調製し、鉛濃度測定用試薬Ｇ１〜４とした。添加剤として、ポリアクリルアミド及び塩化カルシウム共に無添加（試薬Ｇ１）、ポリアクリルアミドのみ（試薬Ｇ２）、塩化カルシウムのみ（試薬Ｇ３）、ポリアクリルアミド及び塩化カルシウム併用（試薬Ｇ４）。
試料溶液及び標準試料の調製：参考例１と同様のものを用いた。
鉛濃度測定：鉛濃度測定試薬Ａの代わりにＧ１〜４を用いた以外は、参考例１と同様に行った。
なお、標準試料との混合で得た吸収スペクトルから、鉛との反応に由来する吸光度変化の大きい波長を４８０ｎｍ付近から選択した。

図５に測定結果を示す。添加剤を含まない試薬Ｇ１の場合、試料溶液中カルシウムの共存により、測定値は正の誤差を伴った。塩化カルシウムのみを添加した試薬Ｇ３の場合も同様であった。ポリアクリルアミドのみの試薬Ｇ２を添加すると、試料溶液中低濃度のカルシウムの共存により、測定値に正の誤差が生じたが、試料中の共存カルシウム濃度が約１５ｍＭ以上では一定の値を示した。一方、ポリアクリルアミドとカルシウムの両方を添加した試薬Ｇ４の場合は、試料中低濃度から高濃度にかけてカルシウムが共存しても、本来の鉛濃度に近い値が測定された。

試験例４ ポルフィリン核導入ポリマーとの比較
高濃度のカルシウムを含む試料溶液中の鉛濃度を測定する方法として、ポルフィリン核導入ポリマーを比色試薬とするポルフィリンポリマー含有鉛濃度測定用試薬を用いた測定方法が報告されている（ＷＯ２００６／０１１５４９）。簡易型鉛計測装置を用いた鉛濃度測定に、比色試薬としてポルフィリンポリマー含有鉛濃度測定用試薬を用いた場合と本発明鉛濃度測定用試薬を用いた場合を比較した。
簡易型鉛計測装置は、小型分光光度計とセルを加熱するヒーターを内蔵した本体及びパーソナルコンピュータで構成され、吸光光度法に基づき鉛濃度を計測する。鉛濃度測定用試薬と試料溶液の混合液を入れたキュベットを測定器にセットして測定を開始すると、その時点での吸収スペクトルを取得し、５分間、７５℃で加熱後、再び吸収スペクトルを取得する。両者のスペクトルを規格化した後に差分して得た差スペクトルの４６６ｎｍのピーク高が鉛濃度に依存するため、これをシグナルとして、予め鉛濃度既知の標準試料で作成した検量線に当てはめて鉛濃度を算出、表示する。
本発明鉛濃度測定用試薬として上記鉛濃度測定用試薬Ｂ３を用意した。
比較対照として、ポルフィリンポリマー含有鉛濃度測定用試薬も用意した。ポルフィリン核導入ポリマーの合成方法及び試薬調整方法は、ＷＯ２００６／０１１５４９に従い、試薬中の塩化カルシウム濃度は１４ｍＭ、ポリマー濃度は、２倍希釈した際の４６６ｎｍにおける吸光度が０．６〜０．７となるようにした。
試料溶液及び標準試料の調製：参考例１と同様のものを用いた。また、検量線の作成及び検出下限値算出のために０〜０．１ｍｇ／Ｌの鉛水溶液を用いた。
本発明鉛濃度測定用試薬又はポルフィリンポリマー含有鉛濃度測定用試薬５００μＬと試料溶液５００μＬを混和し、簡易型鉛計測装置を用いて鉛濃度を測定した。

図６に、測定結果を示す。いずれも高濃度のカルシウムが共存しても、鉛濃度の測定値が極端に変動することなく本来の鉛濃度に近い値が算出された。

図７に、鉛濃度を変えて測定した際の、鉛濃度とシグナルの関係（検量線）を示す。本発明の試薬では、相関係数Ｒ＝１．００という優れた結果が得られ、さらに検量線の傾きが大きいので、鉛検出の感度が良いことがわかった。鉛濃度が０のときの変動（標準偏差）の３倍のシグナルを与える鉛濃度を検出下限とすると、本発明鉛濃度測定用試薬の検出下限は、０．００６ｍｇ／Ｌ、ポルフィリンポリマー含有鉛濃度測定用試薬の検出下限は、０．０５ｍｇ／Ｌであった。鉛に関する埋め立て基準（溶出液中の濃度として）、排水基準、環境基準値は、それぞれ０．３、０．１、０．０１ｍｇ／Ｌと定められている。本発明鉛濃度測定用試薬は、埋め立て基準及び排水基準だけでなく環境基準の判定にも利用できる。

Claims (5)

1. （Ａ）水溶性ポルフィリン誘導体又はその塩、（Ｂ）ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、及びポリエチレングリコールから選ばれる少なくとも一種、並びに（Ｃ）カルシウムイオン供給化合物、を含有する鉛濃度測定用試薬。
2. （Ａ）水溶性ポルフィリン誘導体が、次式（１）
   

   

   （式中、Ｘ¹〜Ｘ⁴のうち少なくとも１個は、
   

   

   を示し、残余は水素原子を示し、
   そこでＲ¹はアルキル基、スルホアルキル基、カルボキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基又は水素原子を示し、Ｒ²及びＲ³は水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン酸残基、リン酸残基又はトリアルキルアンモニウム基を示す。）で表される水溶性ポルフィリン誘導体である、請求項１記載の鉛濃度測定用試薬。
3. （Ｂ）成分が、ポリアクリルアミドである請求項１又は２記載の鉛濃度測定用試薬。
4. （Ｃ）成分が、塩化カルシウムである請求項１〜３のいずれか１項記載の鉛濃度測定用試薬。
5. 請求項１〜４のいずれか１項記載の鉛濃度測定用試薬と試料溶液を混合し、その吸光度を測定することを特徴とする鉛濃度測定方法。

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