CN111110666B - 一种治疗消化道癌症的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗消化道癌症的药物组合物，属于医药技术领域。FTY720或其联合JTE‑013在制备5‑氟尿嘧啶(5‑FU)耐药逆转剂中的应用，本发明提供了一种用于治疗消化道癌症的药物组合物，包括5‑氟尿嘧啶和以下至少一种的5‑氟尿嘧啶耐药逆转剂：FTY720和JTE‑013。本发明还提供了SphK2和S1PR2在筛选逆转消化道癌症氟尿嘧啶类化合物耐药的药物中的用途。SphK2上调DPD表达引发的氟尿嘧啶原发性耐药及S1PR2移位引发的氟尿嘧啶获得性耐药，并且SphK2和S1PR2可以作为新的分子靶点，通过设计靶向药物解决氟尿嘧啶及其衍生物在治疗癌症过程中的耐药问题。

Description

一种治疗消化道癌症的药物组合物

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种治疗消化道癌症的药物组合物。

背景技术

消化道癌症是常见的恶性肿瘤，近年来逐步开展应用的免疫疗法显示预后较差。除手术外，化疗在消化道癌症综合治疗中占有极其重要的地位。自1957年Duschinsky等合成5-氟尿嘧啶(5-FU)以来，5-FU及衍生物一直是消化道肿瘤化疗的基础用药。5-FU属于胸苷酸合成酶抑制剂类药物，在胃癌、结直肠癌、头颈部鳞癌、肝癌等多种消化道癌症中作为一线化疗药物被广泛应用。目前的FOLFOX治疗方案主要包括基础药物5-FU配伍CF(亚叶酸钙)和奥沙利铂等，而在实施过程中又可根据病人临床分期与病理学类型，变换FOLFOX方案为FOLFOX1-6和mFOLFOX6等。但是无论如何变化方案，5-FU是这些方案中不可或缺的基础用药。然而，与其它抗癌药物一样，肿瘤对其产生耐药性是化疗失败主要原因之一，而目前尚无有效的耐药逆转剂问世，这已经成为临床消化道癌症化疗失败的最大痛点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种治疗消化道癌症的药物组合物，能有效解决5-氟尿嘧啶产生的耐药性。

本发明提供了结构式如式I所示的FTY720在制备5-氟尿嘧啶耐药逆转剂中的应用；

优选的，所述FTY720联合结构式如式II所示的JTE-013在制备5-氟尿嘧啶耐药逆转剂中的应用；

本发明提供了一种5-氟尿嘧啶耐药逆转剂组合物，包括结构式如式I所示的FTY720和结构式如式II所示的JTE-013；所述FTY720和JTE-013的摩尔比为1：2～2：1。

本发明提供了抑制SphK2基因或蛋白表达的试剂在制备治疗消化道癌症的药物中的应用；所述抑制SphK2基因或蛋白表达的试剂包括结构式如式I所示的FTY720。

优选的，所述抑制SphK2基因或蛋白表达的试剂联合S1PR2基因或蛋白表达的试剂在制备治疗消化道癌症的药物中的应用；所述S1PR2基因或蛋白表达的试剂包括结构式如式II所示的JTE-013。

优选的，所述消化道癌症包括结直肠癌。

本发明提供了一种用于治疗消化道癌症的药物组合物，包括5-氟尿嘧啶和以下至少一种的5-氟尿嘧啶耐药逆转剂：结构式如式I所示的FTY720和结构式如式II所示的JTE-013；

所述5-氟尿嘧啶和5-氟尿嘧啶的耐药逆转剂的摩尔比为1:0.1～0.4。

优选的，包括两种5-氟尿嘧啶耐药逆转剂时，所述FTY720和JTE-013的摩尔比为1：2～2：1。

本发明提供了SphK2作为治疗靶点在筛选逆转消化道癌症氟尿嘧啶类药物耐药性的药物中的应用。

优选的，所述治疗靶点还包括S1PR2。

本发明提供了结构式如式I所示的FTY720在制备5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药逆转剂中的应用。利用SphK2抑制剂FTY720联合化疗药物5-氟尿嘧啶治疗后进行H&E和DPD的免疫组化切片检测，结果表明FTY720可逆转SphK2过表达引起的5-FU耐药问题。

进一步的，本发明还限定了所述FTY720联合结构式如式II所示的JTE-013在制备5-氟尿嘧啶耐药逆转剂中的应用。5-FU会使SphK2过表达小鼠出现自噬现象，而WT小鼠以及SphK2 Tg小鼠的JTE-103治疗组则未在电镜下观察到明确的自噬泡形成，因此得到JTE-013抑制5-FU治疗引发的SphK2 Tg小鼠的自噬。5-FU刺激下结直肠癌细胞的S1PR2会从细胞膜转移到内质网，而JTE-013有效抑制5-FU刺激下结直肠癌细胞的S1PR2从细胞膜转移到内质网的移位。此外，通过在蛋白结合水平和细胞系水平以及动物模型进行广谱筛选，得到逆转5-FU耐药效果好的SphK2或S1PR2靶向抑制剂FTY720和JTE-103。

附图说明

图1-1为野生型小鼠与SphK2基因过表达小鼠(SphK2 Tg)在5-FU治疗后结直肠肿瘤的数量和体积情况，结果显示SphK2基因过表达小鼠的结直肠癌组织对5-FU治疗的敏感性显著降低；图1-2为统计野生型小鼠与SphK2基因敲除小鼠(SphK2^-/-)在5-FU治疗后结直肠肿瘤的数量和体积情况，结果显示SphK2基因敲除小鼠结直肠癌组织对5-FU治疗敏感性较高；

图2-1为野生型小鼠在化疗药物5-氟尿嘧啶治疗后的H&E和DPD的免疫组化结果，病理学结果显示5-FU联用FTY720后可使结直肠癌恶性程度下降；图2-2为SphK2基因过表达小鼠在5-氟尿嘧啶化疗后结直肠癌发展的恶性程度，H&E和DPD的免疫组化结果显示5-FU治疗后SphK2基因过表达小鼠的结直肠癌仍处于恶性增殖状态，而FTY720可一定程度逆转此耐药过程的发展；

图3-1为临床病人结直肠癌SphK2、SphK1和DPD的免疫组化染色情况，SphK2阳性而SphK1阴性的结直肠癌组织表现为DPD阳性表达；图3-2为临床病人结直肠癌癌旁组织的SphK2、SphK1和DPD的免疫组化结果，SphK2阳性而SphK1阴性的结直肠癌癌旁组织表现为DPD阴性表达；

图4为临床病人结直肠癌组织SphK2与DPD蛋白表达量具有明确正相关关系；SphK2阳性的结直肠癌组织和癌旁组织的DPD表达水平分别高于SphK2阴性结直肠癌组织和癌旁组织，同时结直肠癌组织DPD表达量又高于癌旁组织；

图5-1为SphK2基因过表达的HCT116细胞和SphK2基因正常表达的HCT116细胞在同等剂量5-FU作用后结直肠癌细胞内的5-FU含量比较，结果显示两种细胞内的5-FU含量具有39.6倍的浓度差异；图5-2为5-FU在DPD酶解下的降解产物α-氟代β-丙氨酸的标准品的HPLC结果，与图5-1中降解峰的保留时间及峰型一致；

图6-1为常见H3组蛋白修饰位点的差异表达检测，结果显示SphK2 Tg小鼠的H3K56ac水平明显高于WT小鼠，图6-2为通过H3K56ac蛋白的ChIP-seq以及Luciferase验证发现，过表达SphK2对DPD的影响主要集中于一段500bp的外显子片段；

图7为ChIP-seq的Motif分析显示，H3K56ac蛋白与DPD基因的结合位点主要为一段连续的腺嘌呤序列，与Luciferase验证结果序列；

图8-1为对照HCT116细胞的S1PR2(绿色荧光)的细胞膜分布情况，图8-2为5-FU刺激下S1PR2与内质网标记蛋白Calnexin(红色荧光)的共定位情况(黄色荧光)，图8-3为JTE-013与5-FU同时刺激下的S1PR2分布情况，结果显示JTE-013有效抑制了S1PR2的内质网移位；

图9-1为5-FU可刺激SphK2 Tg小鼠的自噬泡形成，图9-2为WT小鼠及SphK2 Tg小鼠的JTE-013治疗组均未在透射电镜视野下观察到自噬泡的形成；

图10为RNASET2及其它自噬标记蛋白Beclin1，p62，LC-3B表达量的结果；

图11为敲低SphK2的结直肠癌细胞中3'UMP、Uridine、3'CMP和Cytidine含量变化趋势；

图12为SphK2/S1PR2抑制剂的筛选模型与优化方案示意图；

图13为在裸鼠和C57BL/6J小鼠进行体内成瘤造模进行体外筛选活性较高的先导化合物。

具体实施方式

本发明提供了结构式如式I所示的FTY720在制备5-氟尿嘧啶耐药逆转剂中的应用；

在本发明中，FTY720是鞘氨醇激酶2(SphK2)的抑制剂，可以抑制SphK2的功能以减少鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的产生。S1P是真核生物体的第二信使，可以发挥多种重要生理功能，可促进癌组织生长和病理性炎症的发生。现在研究发现FTY720对多种实体瘤包括胰腺癌、肝癌、胆管癌和多发性骨肉瘤，有抑制肿瘤生长、减少免疫炎症反应的治疗作用，相关实验已经在美国开展临床II期实验。瑞士Novartis已经开始III期临床研究以深入评价盐酸芬戈莫德Fingolimod hydrochloride(FTY720)在复发性多发性硬化症方面的疗效，证实该药物具有良好的安全性和耐受性，主要副作用是1-2级的疲惫感和恶心感。本发明实验表明FTY720具有结直肠癌代表的消化道癌症的5-FU耐药的作用。本发明对所述FTY720的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的FTY720来源即可。在本发明实施例中，所述FTY720购自Selleck公司。

在本发明中，所述FTY720优选联合结构式如式II所示的JTE-013在制备5-氟尿嘧啶耐药逆转剂中的应用；JTE-013是鞘氨醇-1-磷酸二型受体(S1PR2)的抑制剂，可以竞争抑制S1PR2与S1P的结合。S1PR2(EDG-5)作为G蛋白偶联受体家族成员之一，是rhodopsin(视紫红质样受体，A类)家族的典型成员。其结构特征包括一个小的胞外N端(30～50个残基)、7个螺旋跨膜结构域以及细胞内的C端，可偶联至多个Gα蛋白受体，如Gi、G12/13及Gq等，影响多种下游第二信使分子。目前研究报道的主要功能为抑制内皮细胞迁移、促进胰岛素分、抑制肿瘤细胞迁移等。前述的磷酸化FTY720可与S1PR亚型1，3，4和5均具有良好的结合能力，唯独与S1PR2的结合较差。而JTE-013目前作为唯一的S1PR2抑制剂，可以弥补FTY720与S1PR2结合性差的缺陷，实现其对消化道癌症5-FU耐药的作用。本发明对所述JTE-013的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的JTE-013来源即可。在本发明实施例中，所述JTE-013购自Selleck公司。

本发明提供了一种5-氟尿嘧啶耐药逆转剂组合物，包括结构式如式I所示的FTY720和结构式如式II所示的JTE-013；所述FTY720和JTE-013的摩尔比为1～10:1～10。在本发明中，所述FTY720和JTE-013的摩尔比优选为2～8:2～8，更优选的6:5。所述组合物中还优选包括药学上可接受的赋形剂。所述FTY720和JTE-013在所述组合物中的质量百分比为0.1～99％，更优选为10～80％。所述5-氟尿嘧啶耐药逆转剂组合物的制备方法，将FTY720和JTE-013按比例混合得到。

本发明提供了抑制SphK2基因或蛋白表达的试剂在制备治疗消化道癌症的药物中的应用；所述抑制SphK2基因或蛋白表达的试剂包括结构式如式I所示的FTY720。

在本发明中，所述SphK2基因过表达会使结直肠癌细胞对5-FU治疗敏感性下降，表现为SphK2基因过表达小鼠相比于野生型小鼠在结直肠癌造模后对同等剂量的5-FU治疗无明显缓解效果。本发明还发现了SphK2基因过表达小鼠的DPD表达量明显升高，并且找到此调控机制主要为细胞核内S1P作为生物内源性HDAC1/2抑制剂，在SphK2过表达时可提高H3K56ac水平，进而上调DPD外显子区转录，并发现H3K56ac与DPD外显子区的一段连续腺嘌呤序列结合。以上内容说明SphK2是解决5-FU耐药问题的有效治疗靶点。本发明所述SphK2包括SphK2基因和SphK2蛋白。本发明将现有的SphK2抑制剂发掘出新的药用价值，将其应用在结直肠癌细胞过表达DPD所导致的5-FU降解具有重要治疗意义。

在本发明中，所述抑制SphK2基因或蛋白表达的试剂优选联合S1PR2基因或蛋白表达的试剂在制备治疗消化道癌症的药物中的应用；所述S1PR2基因或蛋白表达的试剂包括结构式如式II所示的JTE-013。本发明将S1PR2抑制剂对上述5-FU耐药小鼠也进行了同等剂量的治疗，结果显示S1PR2抑制剂也具有良好的逆转耐药的作用，其分子机制为S1PR2在5-FU治疗时出现细胞膜向内质网移位的现象，从而引发内质网应激诱导的以RNASET2为主导的核糖体自噬，使肿瘤细胞内源性尿嘧啶升高从而抵制外源性5-FU的吸收，导致获得性耐药。本发明所述S1PR2包括S1PR2基因和S1PR2蛋白。

在本发明中，所述消化道癌症优选包括结直肠癌。本发明对所述药物的剂型没有特殊限制，采用本领域所孰知的药物剂型即可。

本发明提供了一种用于治疗消化道癌症的药物组合物，包括5-氟尿嘧啶和以下至少一种的5-氟尿嘧啶耐药逆转剂：结构式如式I所示的FTY720和结构式如式II所示的JTE-013；所述5-氟尿嘧啶和5-氟尿嘧啶的耐药逆转剂的摩尔比优选为1:0.1～0.4，更优选为1:0.4。

在本发明中，所述药物组合物包括两种5-氟尿嘧啶耐药逆转剂时，所述FTY720和JTE-013的摩尔比优选为1：2～2：1，更优选为1:1。

本发明提供了SphK2作为治疗靶点在筛选逆转消化道癌症氟尿嘧啶类药物耐药性的药物中的应用。所述治疗靶点优选还包括S1PR2。

在本发明中，SphK2基因或蛋白作为先导化合物筛选靶点，SphK2抑制剂是通过下调DPD表达来抑制结直肠癌细胞内5-FU的降解。S1PR2基因或蛋白作为先导化合物筛选靶点的应用，S1PR2抑制剂是通过抑制S1PR2移位而降低5-FU诱导出现的核糖体自噬，从而提高结直肠癌细胞对5-FU治疗的敏感性。所述先导化合物抑制SphK2和S1PR2基因的表达或者SphK2和S1PR2蛋白的功能。SphK2抑制剂通过抑制SphK2基因的表达或者抑制SphK2蛋白的功能来下调DPD的转录水平，从而解决5-FU耐药问题。而S1PR2抑制剂则是通过对S1PR2的受体占据，使其不能从细胞膜移位进入内质网，进而通过抑制内质网应激引发的核糖体自噬来提高结直肠癌细胞对5-FU治疗的敏感性。

下面结合实施例对本发明提供的一种治疗消化道癌症的药物组合物进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

SphK2过表达引发5-FU耐药性

利用SphK2过表达和敲除小鼠模型进行AOM/DSS结直肠癌造模后的5-FU给药，具体方法如下：SphK2基因过表达和敲除小鼠均交付北京赛业公司进行Crisper/Cas9基因编辑，其系背景为C57BL/6J，在无特定病原体的洁净(SPF)环境中饲养。首先选用基因型为野生型小鼠与SphK2基因过表达小鼠，6～8周大，数目各6只，每组小鼠在第一天腹腔注射10mg/kgAOM，一周后小鼠接受7天的含有1.0％DSS的饮用水。然后给予小鼠14天的定期正常饮用水，上述21天作为一个周期再重复进行两个周期。每周称量一次小鼠体重并每天观察是否有便血情况及其它疾病迹象。70天造模结束后，开始60天的每周两次5-氟尿嘧啶腹腔注射，注射剂量为30mg/kg。而后将小鼠处死，取出结直肠样本并进行肿瘤数目和大小的相关检测。

结果显示，图1-1是野生型小鼠与SphK2基因过表达小鼠(SphK2 Tg)在5-FU治疗后结直肠肿瘤的数量和体积情况，结果显示SphK2基因过表达小鼠的结直肠癌组织对5-FU治疗的敏感性显著降低；图1-2是统计野生型小鼠与SphK2基因敲除小鼠(SphK2^-/-)在5-FU治疗后结直肠肿瘤的数量和体积情况，结果显示SphK2基因敲除小鼠结直肠癌组织对5-FU治疗敏感性较高。说明在正常的生理状态下，SphK2基因过表达小鼠的结直肠癌对5-FU治疗出现耐药现象，而SphK2基因敲除小鼠的结直肠癌对5-FU的治疗敏感性较高。

实施例2

过表达SphK2增加结直肠癌细胞内的5-FU降解而导致5-FU耐药性

对过表达SphK2和vector对照组的结直肠癌细胞HCT116进行30μM的5-FU刺激，24h后取出细胞用PBS洗涤5次，用细胞刮刀使细胞从瓶壁上完全脱落下来。4℃1000r/min离心5min，弃去上清，加入0.5mL的PBS吹打均匀后，吸取到EP管中，分别放在细胞超生粉碎机中超声10min，然后在4℃12000r/min离心机中离心30min，吸取上清液于另一干净的EP管中，固相萃取分离后进行HPLC-UV检测。其中固相萃取过程如下：将固相萃取柱Styre ScreenHP依次用1mL乙醇、1mL含0.1％三氟乙酸的去离子水活化。吸取0.5mL细胞裂解液，以1mL/min的速度加入活化后的固相萃取柱，待样品富集后用1mL去离子水淋洗，抽干；用体积比为75:25的乙醇-含0.1％三氟乙酸的去离子水溶液洗脱，抽干；使用真空离心蒸发浓缩器干燥20min，去掉有机溶剂；经冷冻干燥器干燥浓缩，测定时加入流动相定容至0.5mL，4℃避光保存，供HPLC分析。HPLC的色谱条件为：色谱柱Diamonsil C18柱，流动相:甲醇：水＝10：90，检测波长:265nm，柱温:25℃，进样量:20μL，时间:10min。

结果如图5-1和图5-2所示。图5-1是SphK2基因过表达的HCT116细胞和SphK2基因正常表达的HCT116细胞在同等剂量5-FU作用后结直肠癌细胞内的5-FU含量比较，结果显示两种细胞内的5-FU含量具有39.6倍的浓度差异。图5-2是5-FU在DPD酶解下的降解产物α-氟代β-丙氨酸的标准品的HPLC结果，与图5-1降解峰的保留时间及峰型一致。结果显示，SphK2基因过表达结直肠癌细胞的5-FU胞内降解程度显著高于对照组细胞，过表达SphK2会增加结直肠癌细胞内的5-FU降解而导致5-FU耐药。

实施例3

FTY720联合化疗药物5-氟尿嘧啶治疗的免疫组化切片检测

利用SphK2抑制剂FTY720联合化疗药物5-氟尿嘧啶治疗后进行H&E和DPD的免疫组化切片检测。

分别选择实施例1中饲养环境的野生型小鼠与SphK2基因过表达小鼠，6-8周大，数目各6只，在如前述的AOM/DSS造模后进行每天的5-氟尿嘧啶腹腔注射，注射剂量为30mg/kg，同时进行每天的FTY720腹腔注射，注射剂量为1mg/kg，2个月后进行取材固定，其它取材分析过程同实施例1。进行4％多聚甲醛固定后进行石蜡切片，对各切片进行H&E和DPD免疫组化染色。

结果如图2-1和图2-2所示。图2-1是野生型小鼠在化疗药物5-氟尿嘧啶治疗后的H&E和DPD的免疫组化结果，病理学结果显示5-FU联用FTY720后可使结直肠癌恶性程度下降；图2-2是SphK2基因过表达小鼠在5-氟尿嘧啶化疗后结直肠癌发展的恶性程度，H&E和DPD的免疫组化结果显示5-FU治疗后SphK2基因过表达小鼠的结直肠癌仍处于恶性增殖状态，而FTY720可一定程度逆转此耐药过程的发展。结果表明FTY720可逆转SphK2过表达引起的5-FU耐药问题。

实施例4

SphK2水平在临床上与DPD表达的相关性

人体结直肠癌组织临床标本来源于山东省滨州医学院附属医院2010年1月-2014年9月胃肠外科的患者术后结直肠癌和相配对的癌旁组织标本104例。手术组织标本经过取材后，福尔马林固定、脱水、石蜡包埋和连续切片，切片厚度为5μm，用于免疫组化染色。距离肿瘤组织较远的残端癌旁粘膜也被取材用于对照实验(癌旁组织经病理证实不存在癌细胞)，本部分的人体临床标本的使用经滨州医学院附属医院伦理委员会批准。

DPD蛋白表达量检测采用蛋白质印记(Western Blotting)检测：配制分离胶与浓缩胶后，浸泡于电泳液中。等量20μg蛋白样品加入上样孔中，加入上样标志物或1x上样缓冲液封边。80V恒压电泳至蛋白下降于分离胶后，改为120V，继续恒压电泳。使用PVDF膜进行100V，90min转膜。1 x TBST于摇床清洗PVDF膜，5min一次，共2次。封闭液封闭PVDF膜1h，4℃孵育DPD一抗过夜。1 x TBST于摇床清洗PVDF膜，10min一次，共3次。二抗孵育40min。1 xTBST于摇床清洗PVDF膜，10min一次，共3次。ECL发光液配制，均匀淋于PVDF膜上，ChemiDocXRS和分子成像仪(molecularimager)曝光。计算Bio-Rad Quantity One分析印记灰度比值，计算公式：目的蛋白相对表达水平＝(目的蛋白灰度值-背景灰度值)/(内参蛋白灰度值-背景灰度值)。

临床病人结直肠癌组织中SphK2与免疫组化染色结果图如图3-1和图3-2所示。图3-1是临床病人结直肠癌SphK2、SphK1和DPD的免疫组化染色情况，SphK2阳性而SphK1阴性的结直肠癌组织表现为DPD阳性表达；图3-2是临床病人结直肠癌癌旁组织的SphK2、SphK1和DPD的免疫组化结果，SphK2阳性而SphK1阴性的结直肠癌癌旁组织表现为DPD阴性表达。结果表明，临床病人结直肠癌组织中SphK2与DPD表达具有显著正相关。

临床病人结直肠癌组织SphK2与DPD蛋白表达量结果如图4所示。如图4可知，SphK2阳性的结直肠癌组织和癌旁组织的DPD表达水平分别高于SphK2阴性结直肠癌组织和癌旁组织，同时结直肠癌组织DPD表达量又高于癌旁组织。说明临床病人结直肠癌组织SphK2与DPD蛋白表达量具有明确正相关关系。

实施例5

在EpiQuik的H3组蛋白修饰试剂盒中筛选得到SphK2过表达转基因小鼠的组蛋白中H3K56ac出现显著升高，**P＜0.01。而后通过ChIP-seq得到H3K56ac与DPD结合序列为一段2200bp的序列，再利用Luciferase截短实验逐步发现二者主要结合在chr3:118,593,600-118,595,799片段。

图6-1是常见H3组蛋白修饰位点的差异表达检测，结果显示SphK2 Tg小鼠的H3K56ac水平明显高于WT小鼠，而图6-2表明通过H3K56ac蛋白的ChIP-seq以及Luciferase验证发现，过表达SphK2对DPD的影响主要集中于一段500bp的外显子片段。

实施例6

采用MEME算法计算ChIP-seq的motif结果可知，H3K56ac与DPD主要结合序列为一段连续腺嘌呤，而根据实施例5中Luciferase截短实验序列进行UCSC数据库查阅比较，证实此结果与测序得到的motif分析结果一致(图7)。

实施例7

JTE-013有效抑制5-FU刺激下结直肠癌细胞的S1PR2从细胞膜转移到内质网的移位

对生长在Confocal皿的结直肠癌细胞HCT116进行10μM的5-FU刺激，固定染色封片后进行TCS SP5激光共聚焦显微镜(FCS&FLIM)检测观察S1PR2免疫荧光(绿色，检测波长AlexaFluor488nm)分布，同时利用内质网marker蛋白Calnexin进行内质网定位(红色，检测波长Alexa Fluor 647nm)。

结果显示，HCT116细胞中的S1PR2会在5-FU的刺激下从细胞膜转移到内质网，而作用24h的10μM JTE-013可以抑制5-FU引发的S1PR2移位(图8)。结论：5-FU刺激下结直肠癌细胞的S1PR2会从细胞膜转移到内质网，而JTE-013可有效抑制此移位过程。

实施例8

JTE-013抑制5-FU治疗引发的SphK2 Tg小鼠的自噬

取出SphK2过表达和WT小鼠以及各自的JTE-013给药组的结直肠癌组织，用锐利的刀片将其切成约2mm×2mm×1mm大小的组织块，用0.1％戊二醛固定后进行包埋切片上机，在日立HT7700透射电子显微镜观察寻找自噬泡形成，可发现5-FU治疗引发的SphK2 Tg小鼠的自噬可以被JTE-013治疗而得到抑制(图9-1和图9-2)。结论：5-FU会使SphK2过表达小鼠出现自噬现象，而WT小鼠以及SphK2 Tg小鼠的JTE-103治疗组则未在电镜下观察到明确的自噬泡形成。

实施例9

自噬通过自噬泡内RNASET2回收利用RNA将其酶解为3’UMP，而后增加自身的尿苷Uridine合成，从而降低外源性5-FU的吸收而导致获得性耐药。

相比于转染vector的HCT116细胞，western blotting结果表明SphK2过表达的HCT116细胞的RNASET2表达量较高，而后检测敲低SphK2和vector的HCT116的尿嘧啶自身合成途径的中间代谢产物3'CMP，3'UMP，Cytidine，Uridine的含量(图10)。LC-MS/MS三重串联液质联用仪6500检测结果发现，结直肠癌细胞的SphK2被敲低后，因RNASET2表达下降而引发的3’UMP和Uridine出现显著降低，但3'CMP和Cytidine含量无明显变化(图11)，**P＜0.01。其中LC-MS/MS检测条件为：色谱柱ACQUITY UPLC HSST3，2.1×50mm，1.8μm；柱温:45℃；0.1％(v/v)乙酸1mmol/L乙酸铵溶液：乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速：0.80mL/min；总运行时间:7.0min。经超高效液相色谱(UPLC)分离，采用电喷雾串联四级杆质谱进行多反应监测模式(MRM)进行检测。

实施例10

逆转结直肠癌5-FU耐药性的药物的筛选

分别在蛋白结合水平和细胞系水平进行广谱筛选，得到逆转5-FU耐药效果较好的SphK2或S1PR2靶向抑制剂。

购置商业SphK2重组蛋白(Catalog:ab61643)和S1PR2重组蛋白(Catalog:TP310163)，分别固定于Biacore CM5芯片，采用分子间相互作用系统Biacore T200进行先导化合物广谱筛选，选择结合信号较强的化合物进行进一步细胞系筛选。分别在HCT116和HT-29细胞系进行慢病毒过表达SphK2或S1PR2转染，加入先导化合物与5-FU联合培养48小时，用CCK8试剂盒筛选得到有效逆转5-FU耐药的候选化合物(图12)。

实施例11

逆转结直肠癌5-FU耐药性的药物的筛选

先后在BALB/c裸鼠和C57 BL/6J转基因小鼠构建结肠癌模型，分别采用尾静脉注射和腹腔注射的给药方式，得到逆转5-FU耐药较高活性的SphK2或S1PR2靶向抑制剂。

分别在BALB/c裸鼠皮下接种和原位接种过表达SphK2或S1PR2的HCT116和HT-29细胞系，与20mg/kg 5-FU联用，连续4周每天给药1mg/kg先导化合物，与载体组对照，筛选得到可有效抑制高表达SphK2或S1PR2引起5-FU耐药的先导化合物，再分别在SphK2或S1PR2过表达的C57 BL/6J转基因小鼠采用AOM/DSS进行结肠癌造模、联用20mg/kg 5-FU腹腔注射给药(连续4周每天给药1mg/kg)，取材肿瘤组织进行westernblotting和免疫组化检测DPD表达，从而对以上筛选得到的SphK2或S1PR2抑制剂进行进一步活性验证(图13)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.结构式如式II所示的JTE-013在制备5-氟尿嘧啶耐药逆转剂中的应用；

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述JTE-013联合结构式如式I所示的FTY720在制备5-氟尿嘧啶耐药逆转剂中的应用；

3.一种组合物在制备5-氟尿嘧啶耐药逆转剂的应用，其特征在于，所述组合物包括结构式如式I所示的FTY720和结构式如式II所示的JTE-013；所述FTY720和JTE-013的摩尔比为1:2～2:1；

4.抑制S1PR2基因或蛋白表达的试剂和5-氟尿嘧啶在制备治疗消化道癌症的药物中的应用；所述抑制S1PR2基因或蛋白表达的试剂包括结构式如式II所示的JTE-013；

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，抑制SphK2基因或蛋白表达的试剂联合抑制S1PR2基因或蛋白表达的试剂和5-氟尿嘧啶在制备治疗消化道癌症的药物中的应用；所述抑制SphK2基因或蛋白表达的试剂包括结构式如式I所示的FTY720；

6.根据权利要求4或5所述应用，其特征在于，所述消化道癌症包括结直肠癌。

7.一种用于治疗消化道癌症的药物组合物，其特征在于，包括5-氟尿嘧啶和结构式如式II所示的JTE-013；

所述5-氟尿嘧啶和结构式如式II所示的JTE-013的摩尔比为1:0.1～0.4；

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