ITRM20120083A1 - Uso di modulatori dei recettori della sfingosina 1 fosfato per migliorare le immunizzazioni vaccinali. - Google Patents

Description

Uso di modulatori dei recettori della sfingosina 1 fosfato per migliorare le immunizzazioni vaccinali

La presente invenzione concerne l’uso di modulatori dei recettori della sfingosina 1 fosfato per migliorare le immunizzazioni vaccinali. In particolare, l’invenzione concerne l’uso di modulatori dei recettori della sfingosina 1 fosfato, come il composto FTY720, mediante somministrazione combinata con vaccini per migliorare le immunizzazioni vaccinali e quindi ridurre le dosi e aumentare l’efficacia dei vaccini stessi.

I vaccini costituiscono uno dei principali strumenti della medicina nella lotta contro le infezioni. Con la vaccinazione si vuole mimare il più possibile l'infezione naturale e proteggere da futuri incontri con agenti patogeni. Nonostante i risultati ottenuti, à ̈ ancora necessario un notevole impegno per arrivare allo sviluppo di vaccini efficaci a prevenire malattie contro le quali ogni strategia vaccinale sin qui perseguita si à ̈ rivelata inefficace, o contro nuove malattie emergenti. La maggioranza dei vaccini, oggi utilizzati o in via di sviluppo, essendo in gran parte costituiti da molecole purificate, non sono in grado di stimolare una risposta immunitaria efficiente come accade nel corso dell’infezione naturale. Pertanto, risulta necessario l’aggiunta di sostanze adiuvanti o immunoagonisti per rendere efficaci i vaccini. La maggior parte dei vaccini attualmente in uso sono derivati da un approccio alla lotta alle infezioni di tipo empirico. Sono distribuiti infatti vaccini preparati impiegando germi attenuati, anatossine, sub unità di microrganismi, prodotti microbici. Lo sviluppo delle tecnologie e il progredire delle conoscenze del sistema immunitario consentono di sviluppare nuovi vaccini o di riformulare vaccini già in uso con lo scopo di ridurre al minimo le dosi e quindi gli effetti collaterali ad essi associati. Tra i vaccini più diffusi possono esser citati il vaccino antivaioloso, antirabbico, antitetanico, antipoliomielitico, antinfluenzale, antiepatite e molti altri impiegati sia nei paesi con ecomomie più avanzate o in aeree in via di sviluppo dove diverse malattie sono endemiche.

Alla luce di quanto sopra esposto risulta pertanto evidente l’esigenza di poter disporre di nuove terapie vaccinali in grado di superare gli svantaggi dei vaccini noti.

L’identificazione di nuovi meccanismi di regolazione delle risposte immuni che ne controllano l’amplificazione e la regolazione in seguito alle immunizzazioni sono importanti e utili per la scoperta di target immunologici specifici da utilizzare per ottenere delle vaccinazioni efficaci.

E’ noto che la generazione delle risposte immunitarie adattative verso potenziali patogeni, allergeni, tumori o anche antigeni “self†avvengono nei linfonodi. La qualità del “priming†dei linfociti T CD4<+>e CD8<+>à ̈ critico al fine di indurre una memoria immunologica che sia efficiente nella protezione verso le infezioni o l’insorgenza di malattie (32). Le cellule dendritiche (DCs) catturano gli antigeni nei tessuti e in seguito a maturazione migrano nei linfonodi drenanti, dove presentano peptidi antigenici sulla loro superficie ai linfociti T tramite le molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC I e II) (3, 23, 31). I linfociti T naive transitano tra il sangue periferico e il sistema linfatico, entrano nei linfonodi e se non incontrano l’antigene tornano in circolazione (4). L’inizio della risposta immune richiede la presenza e il contatto tra cellule presentanti l’antigene, in particolare DCs attivate e linfociti T antigene-specifici nell’area degli organi linfoidi secondari (10). I linfociti T specifici per un antigene sono presenti nel repertorio dei linfociti T di ogni individuo sottoforma di un basso numero di precursori. Quando tali cellule incontrano l’antigene vanno incontro ad espansione clonale e differenziamento verso linfociti T effettori o della memoria e danno origine alle risposte acquisite che sono alla base della memoria immunologica e quindi delle vaccinazioni. Il numero complessivo dei linfociti T naive che ricevono il “priming†correla con l’entità delle risposte immuni generate nei confronti di un determinato antigene (8). Studi recenti indicano che l’espansione dei linfociti T non dipende dalla frequenza dei linfociti T precursori, ma à ̈ linearmente proporzionale al numero complessivo delle cellule T naive progenitrici (15).

In uno studio precedente, gli inventori hanno identificato un nuovo meccanismo di immunoregolazione attraverso il quale una sottopopolazione di linfociti T con funzione regolatoria (Treg) induce l’aumento delle risposte immunitarie in seguito ad un’immunizzazione con il tossoide tetanico usato come antigene e la tossina colerica usata come adiuvante mucosale (22, 29). In questo studio à ̈ stato osservato che tale aumento della risposta immune correla con la capacità delle Treg di sequestrare cellule del sistema immune nei linfonodi drenanti l’immunizzazione. Lo studio del meccanismo di azione di questa nuova e inaspettata funzione delle Treg à ̈ tuttora non noto e in corso di studio. E’ infatti ampiamente descritto che le cellule Treg esercitano una funzione soppressoria del sistema immunitario.

E’ noto che l’uscita dei linfociti dal timo o dagli organi linfoidi secondari à ̈ controllata dalla sfingosina 1 fosfato (S1P), che consiste in un sfingolipide bioattivo coinvolto in molti processi cellulari che includono la proliferazione, la sopravvivenza e la migrazione delle cellule (21). La sfingosina-1 fosfato si lega a 5 diversi recettori che attivano le proteine G, S1P1-S1P5 (25, 26), i quali differiscono per i segnali che traducono e per la loro diversa distribuzione in diversi tessuti.

Gli inventori della presente invenzione hanno ora trovato che i modulatori dei recettori della sfingosina 1 fosfato, che regolano il traffico dei leucociti, sono in grado di migliorare le risposte immuni in seguito a vaccinazione mucosale e sistemica. In particolare, Ã ̈ stato trovato che il trattamento con i modulatori dei recettori della sfingosina 1 fosfato, come ad esempio il composto FTY720, in seguito a vaccinazione con tossoide tetanico o ovoalbumina usati come antigeni e tossina colerica usata come adiuvante, aumenta le risposte tetano-specifiche sia a livello sistemico sia mucosale.

FTY720 à ̈ un analogo della sfingosina, 2-amino-2-(2-(4-ottilfenil)etil)propano-1,3-diolcloridrato) ed à ̈ un derivato sintetico della miriocina, un metabolita del fungo Isaria sinclairii e agisce come un forte agonista per 4 dei 5 recettori della S1P (S1P1, S1P3, S1P4 e S1P5) (2, 16). Grazie alla sua capacità di inibire l’uscita dei linfociti dai linfonodi, FTY720 à ̈ stato autorizzato dalla FDA americana come farmaco (Gilenya<TM>) per il trattamento della sclerosi multipla (1). Attraverso il legame ai suoi recettori, FTY720 induce l’accumulazione dei linfociti T negli organi linfoidi secondari prevenendo in questo modo alle cellule attivate di raggiungere il sistema nervoso centrale e provocare danni (1). FTY720 à ̈ stato classificato come una nuova classe di farmaci immunosoppressori, tuttavia, non inibisce le funzioni effettrici delle cellule. Infatti à ̈ stato dimostrato che questo composto non interferisce con l’induzione, espansione e generazione delle risposte immunitarie cellulari e umorali (19, 20). Il sequestro dei linfociti da parte di FTY720 negli organi linfoidi à ̈ reversibile, e questo permette ai linfociti di tornare in circolo ed esercitare le loro funzioni una volta che il trattamento à ̈ terminato (18). Inoltre, sono stati identificati diversi agonisti specifici per i diversi recettori della S1P, i quali selettivamente targhettano diversi tessuti, essi sono attualmente studiati per il trattamento di diverse malattie (9, 21, 28).

Secondo la presente invenzione, il trattamento con FTY720 dopo la vaccinazione aumenta le risposte immuni vaccino-specifiche e, pertanto, può essere usato come co-adiuvante per ridurre le dosi e aumentare l’efficacia di vaccini nuovi o già formulati con un buon profilo di sicurezza.

Eventi cruciali nel priming dei linfociti T in seguito a vaccinazione sia mucosale sia sistemica sono il reclutamento e la mobilizzazione delle APC. Le cellule dendritiche giocano un ruolo principale nella sorveglianza e nell’inizio delle risposte immuni. Poiché FTY720 influenza anche la migrazione delle DCs (13, 14, 24), può essere vantaggioso iniziare la somministrazione del farmaco circa 24 h dopo l’immunizzazione intranasale o sistemica, in modo da permettere alle DCs di migrare nei linfonodi drenanti e iniziare la presentazione degli antigeni alle cellule T.

In generale, dati provenienti da trials clinici in fase III, nei quali sono state valutate 2 dosi di FTY720 (fingolimod) per via orale (0.5 e 1.25 mg al giorno) per il trattamento di pazienti con sclerosi multipla hanno mostrato che il farmaco era efficace e ben tollerato dai pazienti (6, 7, 11, 12, 17, 27). Sono state osservate alcune complicazioni di tipo infettivo principalmente nei pazienti che hanno ricevuto la dose più alta (7). Tuttavia, grazie alla sua elevata efficacia con un buon profilo di sicurezza, fingolimod à ̈ stato rilasciato dalla FDA ed à ̈ correntemente usato per il trattamento della sclerosi multipla. E’ degno di nota il fatto che il trattamento dei pazienti di sclerosi multipla richiede la somministrazione di fingolimod per un periodo prolungato, mentre lo studio ora condotto dagli inventori indica che una doppia somministrazione del farmaco nel momento della vaccinazione aumenta le risposte immuni con effetti a lunga durata. La condizione di somministrazione del farmaco sopra menzionato viene effettuata generalmente per via orale, come attualmente viene fatta nei pazienti con sclerosi multipla, e la dose può essere quella clinicamente approvata (0.5 mg/dose) o quella già utilizzata nei trials clinici (1.25 mg/dose). Preferibilmente, la somministrazione del farmaco potrebbe essere effettuata, per due volte, dopo la somministrazione del vaccino, ossia dopo circa 24 e 48 ore, e dopo la somministrazione di ogni richiamo del vaccino stesso con la stessa tempistica (per due volte ossia dopo circa 24 e 48). Appropriati test clinici per monitorare l’efficacia del trattamento nel contesto di vaccinazioni dovrebbero essere comunque fatti. Infatti, l’uso di fingolimod nella strategia delle vaccinazioni richiede che il trattamento venga interrotto per permettere alle cellule memory generate al momento del priming di ricircolare e raggiungere i tessuti periferici.

Formano pertanto oggetto specifico della presente invenzione modulatori dei recettori per sfingosina 1 fosfato per l’uso come co-adiuvanti immunologici nelle immunizzazioni vaccinali.

Per co-adiuvanti immunologici si intendono sostanze che differiscono dagli adiuvanti vaccinali in senso stretto in quanto hanno target immunolologici distinti e non sostituiscono gli adiuvanti classici, ma ne potenziano l’efficacia.

I modulatori secondo l’invenzione possono essere scelti nel gruppo che consiste negli agonisti recettoriali in FTY720, AUY954 (selettivo per S1P1), CYM-5442 (selettivo per S1P1), KRP-203 (selettivo per S1P1), SEW2871 (selettivo per S1P1), e negli antagonisti recettoriali JTE 013 (specifico per S1P2), VPC 23019 (specifico per S1P1 and S1P3). Tra i modulatori dei recettori per S1P sono infatti compresi: agonisti che si legano ai recettori S1PR, li fanno internalizzare ed impediscono alla sfingosina 1 fosfato di legarsi (come FTY720, KRP203, AUY954, CYM-5442 SEW2871); antagonisti che si legano ai recettori ed impediscono alla sfingosina 1 fosfato di legarsi; inibitori della sfingosina chinasi, l’enzima che regola la sintesi della sfingosina 1 fosfato (utilizzati molto nel campo dei tumori) ed anche un anticorpo monoclonale umanizzato per la S1P (LT1009, in fase I per il trattamento del cancro), il quale impedisce il legame della S1P con i recettori.

FTY720 può essere somministrato in dose da 0.5 a 1.25 mg/dose, mentre la dose per KRP203 à ̈ di 1.2 mg. La via di somministrazione dei modulatori secondo la presente invenzione à ̈ preferibilmente la via orale.

Secondo la presente invenzione, i modulatori possono essere somministrati preferibilmente in un periodo di tempo da 24 a 48 ore dopo la somministrazione del vaccino e di ciascun richiamo. Ancora più preferibilmente, i modulatori possono somministrati per due volte dopo la somministrazione del vaccino e di ciascun richiamo, ciascuna volta in una unica dose giornaliera per una sola volta nella giornata. Secondo una forma preferita di realizzazione i modulatori sono somministrati dopo 24 ore e dopo 48 ore dalla somministrazione del vaccino e di ciascun richiamo, ciascuna volta in una unica dose giornaliera per una sola volta nella giornata. Il vaccino può essere sia un vaccino ad uso umano sia veterinario. Il vaccino può essere scelto nel gruppo che consiste in vaccino contro la difterite, epatite virale, rosolia, meningiti, papilloma virus umano HPV, tetano, poliomielite, morbillo, pertosse, parotite, varicella, tubercolosi, influenza stagionale e pandemica, malattie dei viaggiatori internazionali tra cui febbre tifoide, colera, amebiasi, malaria, febbre gialla, Dengue, encefalite giapponese, infezioni da Hantavirus, Febbre della Rift valley, Sars, sindrome respiratoria acuta grave, infezione da virus West Nile, Chikungunya, febbre emorragica di Marburg.

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una combinazione di almeno un modulatore dei recettori per sfingosina 1 fosfato con almeno un vaccino per l’uso sequenziale come co-adiuvante immunologico nelle immunizzazioni vaccinali, in cui detto modulatore à ̈ somministrato dopo il vaccino e dopo ogni richiamo.

I modulatori possono essere scelti nel gruppo che consiste in FTY720, AUY954 (selettivo per S1P1); CYM-5442 (selettivo per S1P1), KRP-203 (selettivo per S1P1), SEW2871 (selettivo per S1P1), JTE 013 (specifico per S1P2), VPC 23019 (specifico per S1P1 and S1P3). Il vaccino può essere sia ad uso umano sia veterinario. Tra i vaccini possono essere menzionati i seguenti: vaccino contro la difterite, epatite virale, rosolia, meningiti, papilloma virus umano HPV, tetano, poliomielite, morbillo, pertosse, parotite, varicella, tubercolosi, influenza stagionale e pandemica, malattie dei viaggiatori internazionali tra cui febbre tifoide, colera, amebiasi, malaria, febbre gialla, Dengue, encefalite giapponese, infezioni da Hantavirus, Febbre della Rift valley, Sars, sindrome respiratoria acuta grave, infezione da virus West Nile, Chikungunya, febbre emorragica di Marburg. Preferibilmente, detto almeno un modulatore à ̈ somministrato in un periodo di tempo da 24 a 48 ore dopo la somministrazione del vaccino e di ciascun richiamo. Ancora più preferibilmente, detto almeno un modulatore à ̈ somministrato per due volte dopo la somministrazione del vaccino e di ciascun richiamo, ciascuna volta in una unica dose giornaliera per una sola volta nella giornata. Secondo una forma di realizzazione preferita, detto almeno un agonista à ̈ somministrato dopo 24 ore e dopo 48 ore dalla somministrazione del vaccino e di ciascun richiamo, ciascuna volta in una unica dose giornaliera per una sola volta nella giornata.

FTY720 può essere somministrato in dose da 0.5 a 1.25 mg/dose, mentre la dose per KRP203 à ̈ 1.2 mg. La via di somministrazione preferibile à ̈ la via orale.

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati.

Figura 1. Risposta anticorpale a livello sistemico dopo immunizzazione intranasale con TT e CT seguita dal trattamento con FTY720. Livelli di IgG, IgG1 e IgG2a specifici per il TT nel siero di topi BALB/c immunizzati per via intranasale con TT, TT seguito dal trattamento con FTY720, TT+CT o TT+CT seguito dal trattamento con FTY720. L’analisi à ̈ stata fatta una settimana dopo la seconda, la terza e la quarta immunizzazione. I risultati sono espressi come la media geometrica dei titoli di IgG specifiche (GMT) di 6-8 topi per gruppo e le barre indicano gli errori standard tra topi dello stesso gruppo.

Figura 2. Risposta anticorpale a livello sistemico e mucosale dopo immunizzazione intranasale con TT e CT seguita dal trattamento con FTY720. Livelli di IgG nel siero e di IgA nelle mucose specifici per TT di topi BALB/c immunizzati per via intranasale con TT+CT o TT+CT seguito dal trattamento con FTY720. L’analisi à ̈ stata condotta quattro mesi dopo la quarta immunizzazione (pre-boost) e una settimana dopo la dose di richiamo (post-boost) per le IgG nel siero (A) e una settimana dopo la dose di richiamo per le IgA mucosali (B e C). I risultati sono espressi come la media geometrica dei titoli di IgG e IgA specifiche (GMT) di 6-8 topi per gruppo e le barre indicano gli errori standard tra topi dello stesso gruppo.

Figura 3. Analisi di cellule secernenti anticorpi (ASC) specifiche per il TT nel midollo osseo. La presenza di ASC IgG (pannelli in alto) e di ASC IgA (pannelli in basso) specifiche per il TT à ̈ stata valutata attraverso ELISPOT in cellule del midollo osseo (pool di cellule di 4 topi dello stesso gruppo) 2 settimane dopo la quarta immunizzazione (pannelli a sinistra), e 2 settimane dopo la dose di richiamo somministrata 4 mesi dopo la quarta immunizzazione (pannelli a destra) con TT, TT seguito dal trattamento con FTY720, TT+CT o TT+CT seguito dal trattamento con FTY720. I risultati di un esperimento rappresentativo sono espressi come numero di ASC specifiche per TT per 1×10<6>di cellule derivate dal midollo osseo. Le barre indicano le deviazioni standard tra duplicati dello stesso esperimento.

Figura 4. Analisi della proliferazione di linfociti T CD4<+>e CD8<+>antigene-specifici in diversi distretti. Topi BALB/c sono stati immunizzati per via intranasale con TT+CT o TT+CT seguito dal trattamento con FTY720. Le cellule provenienti dai linfonodi mediastinici e dalle milze sono state prelevate 2 settimane dopo la quarta immunizzazione, sono state marcate con CFSE, coltivate in vitro per 5 giorni in presenza ed in assenza di TT (2 µg/ml), marcate con anticorpi monoclonali anti-CD4-PE o anti-CD8-PercP e analizzate al citofluorimetro. (A) E’ mostrata un’analisi al FACS di un esperimento rappresentativo. La percentuale delle cellule TT-specifiche proliferanti à ̈ stata calcolata mediante la diluizione del CFSE nella popolazione CD4<+>(pannelli a sinistra) e CD8<+>(pannelli a destra). (B) E’ riportata la media delle percentuali di cellule proliferanti calcolata all’interno della popolazione CD4<+>(pannelli a sinistra) e CD8<+>(pannelli a destra). Le barre indicano gli errori standard tra topi dello stesso gruppo.

Figura 5. Analisi della proliferazione di linfociti T CD4<+>e CD8<+>antigene-specifici in diversi distretti. Topi BALB/c sono stati immunizzati per via intranasale con TT (A, C) o Ova (B, D) come antigeni e CT come adiuvante in presenza e in assenza di FTY720. Le cellule provenienti dai linfonodi mediastinici e dalle milze sono state prelevate 8 mesi dopo la quarta immunizzazione dopo una dose di richiamo, sono state marcate con CFSE, coltivate in vitro per 5 giorni in presenza ed in assenza di TT (2 µg/ml) o Ova (2 µg/ml), marcate con anticorpi monoclonali anti-CD4-PE o anti-CD8-PercP e analizzate al citofluorimetro. E’ mostrata un’analisi al FACS di un esperimento rappresentativo. La percentuale delle cellule TT-specifiche (A) e Ovaspecifiche (B) proliferanti à ̈ stata calcolata mediante la diluizione del CFSE nella popolazione CD4<+>. E’ riportata la media delle percentuali di cellule proliferanti TT-specifiche (C) e Ova-specifiche (D) calcolata all’interno della popolazione CD4<+>(pannelli in alto) e CD8<+>(pannelli in basso). Le barre indicano gli errori standard tra topi dello stesso gruppo.

Figura 6. Risposta anticorpale a livello sistemico dopo immunizzazione sistemica con TT e CT seguita dal trattamento con FTY720. Livelli di IgG specifici per il TT nel siero di topi BALB/c immunizzati per via intraperitoneale con TT, TT+CT o TT+CT seguito dal trattamento con FTY720. L’analisi à ̈ stata fatta una settimana dopo la prima dose (A), una settimana (B) e un mese (C) dopo la seconda dose. I risultati sono espressi come la media geometrica dei titoli di IgG specifiche (GMT) di 4-6 topi per gruppo e le barre indicano gli errori standard tra topi dello stesso gruppo.

Figura 7. Analisi della proliferazione di linfociti T CD4<+>e CD8<+>antigene-specifici in diversi distretti. Topi BALB/c sono stati immunizzati per via intraperitoneale con TT come antigene e CT come adiuvante in presenza e in assenza di FTY720. Le cellule provenienti dai linfonodi mediastinici e dalle milze sono state prelevate 4 mesi dopo la seconda immunizzazione sono state marcate con CFSE, coltivate in vitro per 5 giorni in presenza ed in assenza di TT (2 µg/ml) marcate con anticorpi monoclonali anti-CD4-PE o anti-CD8-PercP e analizzate al citofluorimetro. E’ mostrata un’analisi al FACS di un esperimento rappresentativo (A). La percentuale delle cellule TT-specifiche proliferanti à ̈ stata calcolata mediante la diluizione del CFSE nella popolazione CD4<+>e CD8<+>. E’ riportata la media delle percentuali di cellule proliferanti TT-specifiche (B) calcolata all’interno della popolazione CD4<+>e CD8<+>. Le barre indicano gli errori standard tra topi dello stesso gruppo.

ESEMPIO 1: Studio in vivo sugli effetti di FTY720 nelle immunizzazioni vaccinali

Materiali and metodi

Terreni e reagenti. RPMI 1640 supplementato con 2 mM L-glutamine, 1% (v/v) aminoacidi non essenziali, 1% (v/v) piruvato, 55 µM β2-mercaptoetanolo 100 U/ml penicillina, 100 µg/ml streptomicina (Gibco, USA), e 10% FCS (Hyclone Laboratories, USA), à ̈ stato usato come terreno completo in tutte le colture. L’anticorpo monoclonale anti-CD3 (clone 145-2C11) (mAb) à ̈ stato acquistato dalla BD Biosciences, (USA). Il tossoide tetanico (TT) à ̈ stato un dono dalla Novartis (Italia), la CT e FTY720 sono stati acquistati dalla Calbiochem-Novabiochem (USA), l’ovoalbumina (Ova) à ̈ stata acquistata dalla Sigma Aldrich, USA.

Immunizzazioni intranasali e sistemiche. Topi BALB/c femmine di età tra 6-8 settimane sono state ottenute dall’harlan Nossan, Italia e mantenuti nei nostri stabulari per tutta la durata degli esperimenti. Tutte le procedure riguardanti il trattamento degli animali son in accordo con le linee guida istituzionali. Gruppi di 4 topi sono stati immunizzati per via intranasale per quattro volte ad intervalli settimanali (giorno 0, 7, 14 e 21), con 1 µg di tossoide tetanico (TT) or ovoalbumina (Ova) in presenza o in assenza di CT (0.5 µg/dose). Per quanto riguarda l’immunizzazione per via sistemica, TT (1 µg/dose) à ̈ stato somministrato per via intraperitoneale in presenza o in assenza di CT (0.5 µg/dose) due volte ad intervalli settimanali (giorni 0 e 7). Il giorno dopo la prima e la seconda immunizzazione sia mucosale che sistemica, alcuni gruppi di topi sono stati trattati con FTY720 (0.5 mg/Kg) o il suo veicolo attraverso una somministrazione intra-gastrica. In alcuni esperimenti, i topi hanno ricevuto una dose di antigene e adiuvante di richiamo 4 o 8 mesi dopo la quarta immunizzazione. Per l’immunizzazione intranasale, i topi sono stati leggermente anestetizzati attraverso un’iniezione per via intraperitoneale di Ketamina (Ketavet, Gellini Pharmaceutics, 50 mg/Kg di peso) e xylazina (Rompun, Bayer, 3 mg/Kg di peso). E’ stato somministrato un volume di 15-20 µl (i.e., 7.5-10 µl per narice) di una soluzione di PBS contenente l’antigene con o senza adiuvante.

Raccolta di campioni. I campioni di siero sono stati ottenuti dal sangue periferico raccolto dal plesso retro-orbitale di topi anestetizzati e poi congelati e tenuti a –20°C. Le salive sono state raccolte dopo un’iniezione nel peritoneo di pilocarpina (100 µg/animale). I lavaggi vaginali sono stati ottenuti introducendo 50 µl di PBS per tre volte nel tratto vaginale usando una pipetta Gilson. Il siero à ̈ stato raccolto una settimana dopo la seconda, terza e quarta immunizzazione, 4 mesi dopo la quarta immunizzazione prima e una settimana dopo la dose di richiamo. Le salive e i lavaggi vaginali sono stati raccolti 4 mesi dopo la quarta immunizzazione una settimana dopo la dose di richiamo. I sieri dopo l’immunizzazione sistemica, sono stati raccolti una settimana dopo la prima immunizzazione e una settimana e un mese dopo la seconda immunizzazione.

Analisi degli isotipi anticorpali. Tutti i campioni sono stati testati mediante test ELISA. Piastre da 96 pozzetti (Greiner bio-one, Germany) sono state incubate con 0.5 µg/pozzetto di TT per una notte a 4° C. Dopo un lavaggio con PBS 0.05% (v/v) Tween 20 (UCS Diagnostics, Italia) e blocco per 2 h con 200 µl of PBS contenente 1% (v/v) di sieroalbumina bovina (Sigma Aldrich, USA), diluizioni seriali di sieri o fluidi mucosali di singoli topi sono stati aggiunti in duplicato e incubati per 2 h a temperatura ambiente. Le piastre sono state lavate e un anticorpo anti-IgG o anti-IgA di topo biotinilato (Sigma Aldrich, USA) diluiti in PBS -Tween 20 sono stati aggiunti ai pozzetti e incubati per 2 h a temperatura ambiente. Le piastre sono state lavate ed à ̈ stata aggiunta la streptavidina coniugata con HRP (Dako, Italia) diluita 1:2000 in PBS-Tween per 30 minuti a temperatura ambiente. Alla fine, dopo i lavaggi con PBS-Tween, la reazione antigene anticorpo à ̈ stata misurata usando come substrato 3.3, 5.5 -tetramethylbenzidine (Kirkegaard & Perry Laboratories, USA). La colorazione della reazione à ̈ stata bloccata dopo 5-10 minuti con 50 µl of 0.2 M H2SO4. I titoli finali sono stati determinati come il reciproco della diluizione più alta che corrisponde ad un’assorbenza di più di 0.3 unità (per le IgG) e 0.2 unita (per le IgA) rispetto ai controlli negativi.

ELISPOT per cellule secernenti anticorpo (ASC). Le cellule sono state isolate dal midollo osseo attraverso il flusso di RPMI da una delle estremità del femore o della tibia. Le cellule derivate dal midollo osseo da topi dello stesso gruppo sono state unite e saggiate per la frequenza di ASC specifiche per il TT attraverso un saggio ELISPOT. Sono state incubate 2×10<5>cellule/pozzetto per una notte a 37 â—¦C in piastre da 96 pozzetti (PVDF) (Millipore) incubate con il TT (20µg/ml) dal giorno prima. Le piastre sono state poi lavate abbondantemente e sviluppate con anticorpi di capra anti-topo IgG e IgA coniugati con HRP (Sigma Chemicals, Co., St. Louis, MO, USA) seguito da un’incubazione con un substrato cromogeno (amino ethylcarbazolo) (Sigma Chemicals, Co., St. Louis, MO, USA). Gli spots sono stati contati con un lettore automatico (A.EL.VIS, Hannover, Germany).

Saggio di proliferazione. Splenociti e cellule derivate dai linfonodi sono state ottenute attraverso una rottura meccanica degli organi e filtrate con membrane con pori 70-100 µm di diametro. (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA). Le cellule sono state lavate con PBS 1% FBS e incubate con 2.5µM di carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE, Molecular probes, Eugene, USA) per 10 min a 37 °C. La reazione à ̈ stata bloccata attraverso l’aggiunta di terreno completo freddo e incubate per 5 min a 4 â—¦C. Le cellule sono state lavate 2 volte con terreno completo e piastrate con TT o Ova (2µg/ml), anticorpi monoclonali anti-CD3 (mAb) (0.1µg/ml), (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) o senza stimoli ad una concentrazione di 2×10<5>cells/pozzetto in piastre da 96-pozzetti (Costar, USA). Dopo 5–6 giorni, le cellule sono state marcate con anticorpi monoclonali anti-CD4-PE o anti-CD8-PercP (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) e acquisite al citofluorimetro FACSCaliburTM e analizzate mediante software dedicati (CellQuest or flowjo).

Analisi statistica. I dati sono espressi come media geometrica o media ± errore standard e la significatività à ̈ stata calcolata attraverso il test t di Student. Quando la p calcolata paragonando due gruppi di valori era < 0.05 le differenze sono state considerate significative.

Risultati

Il trattamento con FTY720 seguito alla vaccinazione con tossoide tetanico e tossina colerica aumenta le risposte anticorpali tetano-specifiche Nel tentativo di identificare un nuovo approccio per migliorare le immunizzazioni vaccinali, abbiamo esplorato una nuova classe di immunoagonisti che hanno la capacità di trattenere le cellule del sistema immune nei linfonodi. Lo scopo del nostro lavoro à ̈ di migliorare le immunizzazioni indirizzando le cellule del sistema immune nei linfonodi drenanti, dove avviene il “priming†e quindi la generazione delle risposte immuni verso antigeni specifici. Topi Balb/c sono stati immunizzati per via intranasale con il tossoide tetanico (TT) (1 µg/dose) e con o senza la tossina colerica utilizzata come adiuvante mucosale (CT) (0.5 µg/dose) per quattro volte, una volta a settimana. Il giorno seguente la prima e la seconda immunizzazione, alcuni gruppi hanno ricevuto FTY720 (0.5 mg/Kg) o il veicolo attraverso una somministrazione intra-gastrica. Le risposte anticorpali TT-specifiche sono state analizzate una settimana dopo la seconda, terza e quarta immunizzazione. Dopo la seconda immunizzazione il titolo degli anticorpi IgG anti-tetano nei topi immunizzati con TT e CT e trattati con FTY720 era più alto (305 volte rispetto al titolo dei topi che hanno ricevuto solo TT) se comparato al titolo dei topi immunizzati con TT e CT in assenza di trattamento (54 volte rispetto al titolo dei topi che hanno ricevuto solo TT) (Fig. 1A). Tale aumento osservato nei topi che hanno ricevuto il farmaco à ̈ stato osservato anche dopo la terza (Fig 1D) e dopo la quarta (761 vs 304) (Fig 1G) imminizzazione.

Inoltre, sono state analizzate le sottoclassi delle immunoglobuline (IgG1 e IgG2a) dopo le immunizzazioni con TT e CT in presenza ed in assenza del trattamento con FTY720. Un aumento del titolo di entrambe le sottoclassi IgG1 e IgG2a à ̈ stato osservato in topi immunizzati con TT e CT e trattati con FTY720 ai diversi punti di cinetica analizzati (Fig 1).

Persistenza delle risposte immuni antigenespecifiche dopo il trattamento con FTY720 seguito a vaccinazione

Nel tentativo di valutare la persistenza delle risposte anticorpali antigene-specifiche nei topi immunizzati con TT e CT in assenza ed in presenza del trattamento con FTY720, quattro mesi dopo la quarta immunizzazione, à ̈ stato valutato il titolo degli anticorpi IgG anti-tetano. Il titolo degli anticorpi IgG anti-TT era diminuito se comparato a quello osservato dopo la quarta immunizzazione, tuttavia anticorpi specifici erano ancora rilevabili e mantenuti a livelli più alti nei topi immunizzati e trattati con FTY720 (Fig. 2A, pre-boost). Successivamente, à ̈ stata valutata la memoria e i diversi gruppi hanno ricevuto un boost dopo 4 mesi dopo la quarta immunizzazione e sono state analizzate entrambe le risposte anticorpali sistemiche e mucosali. Ancora una volta i topi che hanno ricevuto il trattamento con FTY720 dopo l’immunizzazione hanno mostrato nel siero livelli più alti di anticorpi IgG specifici per il TT se paragonati ai topi immunizzati che non hanno ricevuto il trattamento (Fig 2A).

Nel tentativo di valutare la risposta a livello mucosale, il titolo di anticorpi IgA TT-specifici sono stati misurati nei fluidi di due distretti mucosali, la saliva e i lavaggi vaginali (VW). Come mostrato nella Fig. 2BC, nella saliva e nei VW, sono stati trovati anticorpi IgA antigene-specifici e titoli più elevati sono stati misurati in topi immunizzati con TT e CT e trattati con FTY720 dopo l’immunizzazione.

Analisi di cellule B secernenti anticorpi antigene-specifiche in seguito ad immunizzazione e trattamento con FTY720

Per analizzare l’effetto del trattamento con FTY720 sulle risposte immuni cellulari in topi immunizzati con TT e CT, à ̈ stata valutata la presenza di cellule secernenti anticorpi TT–specifici (ASC) nelle sospensioni cellulari derivate dal midollo osseo (BM), due settimane dopo la quarta immunizazione e due settimane dopo la dose di richiamo avvenuta 4 mesi dopo la quarta immunizzazione (boost), mediante ELISPOT. Come mostrato in Fig. 3A, due settimane dopo la quarta immunizzazione, un numero più alto di ASC anti-TT IgG à ̈ stato osservato nel midollo di topi immunizzati e trattati con FTY720 rispetto al midollo di topi immunizzati e non trattati (115 e 60 ASC/1×10<6>di cellule, rispettivamente). Il numero delle ASC specifiche à ̈ stato trovato aumentato dopo la dose di richiamo in entrambi i gruppi e ancora differenze significative sono state osservate tra i gruppi trattati con FTY720 e i gruppi non trattati (Fig. 3C) (240 e 123 ASC/1×10<6>di cellule, rispettivamente). Cellule secernenti IgA anti-TT sono state rilevate nel midollo osseo di topi immunizzati in entrambi i tempi analizzati (Fig. 3B and D). In particolare, i topi trattati con FTY720 mostrano un numero più elevato di IgA ASC rispetto agli animali immunizzati e non trattati 80 e 40 ASC/1×10<6>di cellule, rispettivamente, due settimane dopo la quarta immunizzazione (Fig. 3B) e 136 e 58 ASC/1×10<6>di cellule, rispettivamente, due settimane dopo la dose di richiamo (Fig. 3D). Entrambe IgG e IgA ASC di gruppi trattati e non trattati sono statisticamente diversi dai gruppi che hanno ricevuto TT o TT più FTY720 in assenza di CT.

Analisi delle risposte dei linfociti T tetano – specifici

Per valutare la presenza di linfociti T antigenespecifici, i linfonodi mediastinici, che sono stati descritti essere i linfonodi drenanti le immunizzazioni intranasali (30), e le milze sono stati processati. Le cellule sono state raccolte 2 settimane e 8 mesi dopo la quarta immunizzazione e sono state utilizzate in un test di proliferazione. Entrambe le popolazioni CD4<+>e CD8<+>specifiche per il TT sono state analizzate. Cellule isolate dalla milza e dai linfonodi sono state marcate con CFSE e coltivate in presenza di TT per 5 giorni. La percentuale delle cellule proliferanti à ̈ stata calcolata all’interno delle popolazioni CD4<+>o CD8<+>. Le cellule stimolate con anticorpi monoclonali anti-CD3 sono state incluse come controllo positivo e hanno proliferato come ci si aspettava (tra 60% e 90%, dati non mostrati). I topi immunizzati per via intranasale con TT e CT e trattati con FTY720 mostrano 2 settimane dopo la quarta immunizzazione nei linfonodi drenanti una proliferazione di linfociti T antigenispecifici CD4<+>and CD8<+>significativamente più alta rispetto ai topi immunizzati e non trattati (p < 0.05) (Fig. 4). La proliferazione dei linfociti T antigenispecifici CD4<+>e CD8<+>nella milza 2 settimane dopo la quarta immunizzazione era comparabile tra le cellule isolate da topi immunizzati con TT e CT trattati e non trattati con FTY720 (Fig. 4).

Per testare la permanenza nel tempo delle risposte immuni cellulari indotte dalla vaccinazione, la proliferazione dei linfociti T à ̈ stata valutata 8 mesi dopo la quarta immunizzazione una settimana dopo una dose di richiamo (Fig. 5). Come osservato prima, la proliferazione dei linfociti T antigeni-specifici CD4<+>e CD8<+>nei linfonodi drenanti di topi immunizzati con TT e CT e trattati con FTY720 era più elevata rispetto ai topi immunizzati e non trattati (p < 0.05) (Fig. 5). Al contrario di quanto osservato prima, a questo punto di cinetica, una percentuale più elevata di linfociti T CD4<+>e CD8<+>antigene-specifici à ̈ stata osservata anche in cellule derivanti dalla milza di topi immunizzati e trattati con FTY720 rispetto a topi non trattati.

Per valutare la capacità di FTY720 di modulare le risposte immuni verso un antigene diverso, topi sono stati immunizzati con ovoalbumin (Ova) seguendo la stessa strategia di immunizzazione descritta sopra e la presenza di linfociti T CD4<+>CD8<+>Ova-specifici à ̈ stata analizzata dopo 8 mesi dopo la quarta immunizzazione. In maniera comparabile alle risposte T TT-specifiche, una percentuale più elevata di linfociti T CD4<+>e CD8<+>Ova-specifici à ̈ stata osservata in cellule derivanti sia dai linfonodi drenanti sia dalla milza di topi immunizzati e trattati con FTY720 rispetto a topi non trattati, suggerendo che la modulazione delle risposte immuni da parte di FTY720 non à ̈ TT-ristretta.

Il trattamento con FTY720 seguito ad una vaccinazione sistemica con il tossoide tetanico e la tossina colerica aumenta le risposte anticorpali e cellulari specifiche

Per valutare se gli effetti del trattamento con FTY720 nell’aumentare le risposte indotte dalle vaccinazioni fossero legate alla via di immunizzazione mucosale o se potesse essere applicata ad una immunizzazione sistemica, abbiamo fatto degli esperimenti usando il TT come antigene e la CT come adjuvante sistemico. Topi Balb/c sono stati immunizzati per via intra-peritoneale con TT (1 µg/dose) e con o senza CT (0.5 µg/dose), che à ̈ nota essere anche un ottimo adiuvante sistemico, due volte a distanza di una settimana. Il giorno dopo la prima e la seconda immunizzazione, alcuni gruppi di topi hanno ricevuto FTY720 (0.5 mg/Kg) o il suo veicolo per via intragastrica. Le risposte anticorpali nei sieri sono state esaminate una settimana dopo la prima immunizzazione e una settimana e un mese dopo la seconda immunizzazione. Dopo la prima immunizzazione, il titolo degli anticorpi IgG anti-tetano nei sieri dei topi immunizzati con TT più CT e trattati con FTY720 era più alto (203 volte rispetto al titolo di topi immunizzati solo con TT) rispetto al tiolo di topi immunizzati con TT e CT in assenza di trattamento (63 volte più alti) (Fig. 6A). Un incremento più alto nei topi che hanno ricevuto il farmaco si à ̈ mantenuto una settimana dopo la seconda immunizzazione (575 vs 152) (Fig 6B). Un mese dopo la seconda immunizzazione le differenze tra i due gruppi sono diminuite ma ancora rilevabili (Fig.6C).

Successivamente, per analizzare la presenza di linfociti T antigene-specifici, i linfonodi drenanti l’immunizzazione e la milza sono stati prelevati 4 mesi dopo la seconda immunizzazione . Entrambe le popolazioni T CD4<+>e CD8<+>sono state analizzate. Le cellule sono state marcate con CFSE e coltivate con TT (2 µg/ml) per 5 giorni. La percentuale delle cellule proliferanti sono state calcolate all’interno delle popolazioni CD4<+>e CD8<+>. Topi immunizzati con TT e CT e trattati con FTY720 hanno mostrato una percentuale di cellule proliferanti CD4<+>and CD8<+>antigene-specificche più elevata nei linfonodi e nella milza, rispetto a topi immunizzati e non trattati (p < 0.05) (Fig. 7).

References

1. Brinkmann, V., A. Billich, T. Baumruker, P.

Heining, R. Schmouder, G. Francis, S. Aradhye, and P. Burtin. Fingolimod (FTY720): discovery and development of an oral drug to treat multiple sclerosis. Nat Rev Drug Discov 9:883-897.

2. Brinkmann, V., M. D. Davis, C. E. Heise, R.

Albert, S. Cottens, R. Hof, C. Bruns, E. Prieschl, T. Baumruker, P. Hiestand, C. A. Foster, M. Zollinger, and K. R. Lynch. 2002. The immune modulator FTY720 targets sphingosine 1-phosphate receptors. J Biol Chem 277:21453-21457.

3. Cahalan, M. D., and I. Parker. 2006. Imaging the choreography of lymphocyte trafficking and the immune response. Curr Opin Immunol 18:476-482.

4. Catron, D. M., A. A. Itano, K. A. Pape, D. L.

Mueller, and M. K. Jenkins. 2004. Visualizing the first 50 hr of the primary immune response to a soluble antigen. Immunity 21:341-347.

5. Chi, H. Sphingosine-1-phosphate and immune regulation: trafficking and beyond. Trends in pharmacological sciences 32:16-24.

Cohen, J. A., F. Barkhof, G. Comi, H. P. Hartung, B. O. Khatri, X. Montalban, J. Pelletier, R. Capra, P. Gallo, G. Izquierdo, K. Tiel-Wilck, A. de Vera, J. Jin, T. Stites, S. Wu, S. Aradhye, and L. Kappos. Oral fingolimod or intramuscular interferon for relapsing multiple sclerosis. The New England journal of medicine 362:402-415.

Cohen, J. A., and J. Chun. Mechanisms of fingolimod's efficacy and adverse effects in multiple sclerosis. Annals of neurology 69:759-777.

Galli, G., D. Medini, E. Borgogni, L. Zedda, M. Bardelli, C. Malzone, S. Nuti, S. Tavarini, C. Sammicheli, A. K. Hilbert, V. Brauer, A. Banzhoff, R. Rappuoli, G. Del Giudice, and F. Castellino.

2009. Adjuvanted H5N1 vaccine induces early CD4+ T cell response that predicts long-term persistence of protective antibody levels. Proc Natl Acad Sci U S A 106:3877-3882.

Hamada, M., M. Nakamura, M. Kiuchi, K. Marukawa, A. Tomatsu, K. Shimano, N. Sato, K. Sugahara, M. Asayama, K. Takagi, and K. Adachi. Removal of sphingosine 1-phosphate receptor-3 (S1P(3)) agonism is essential, but inadequate to obtain immunomodulating 2-aminopropane-1,3-diol S1P(1) agonists with reduced effect on heart rate.

Journal of medicinal chemistry 53:3154-3168.

Henrickson, S. E., T. R. Mempel, I. B. Mazo, B. Liu, M. N. Artyomov, H. Zheng, A. Peixoto, M. Flynn, B. Senman, T. Junt, H. C. Wong, A. K. Chakraborty, and U. H. von Andrian. 2008. In vivo imaging of T cell priming. Sci Signal 1:pt2.

Kappos, L., E. W. Radue, P. O'Connor, C. Polman, R. Hohlfeld, P. Calabresi, K. Selmaj, C. Agoropoulou, M. Leyk, L. Zhang-Auberson, and P. Burtin. A placebo-controlled trial of oral fingolimod in relapsing multiple sclerosis. The New England journal of medicine 362:387-401.

Khatri, B., F. Barkhof, G. Comi, H. P. Hartung, L. Kappos, X. Montalban, J. Pelletier, T. Stites, S. Wu, F. Holdbrook, L. Zhang-Auberson, G. Francis, and J. A. Cohen. Comparison of fingolimod with interferon beta-1a in relapsing-remitting multiple sclerosis: a randomised extension of the TRANSFORMS study. Lancet neurology 10:520-529.

Lamana, A., P. Martin, H. de la Fuente, L. Martinez-Munoz, A. Cruz-Adalia, M. Ramirez-Huesca, C. Escribano, K. Gollmer, M. Mellado, J. V. Stein, J. L. Rodriguez-Fernandez, F. Sanchez-Madrid, and G. M. Del Hoyo. CD69 Modulates Sphingosine-1-Phosphate-Induced Migration of Skin Dendritic Cells. The Journal of investigative dermatology 131:1503-1512.

Lan, Y. Y., A. De Creus, B. L. Colvin, M. Abe, V.

Brinkmann, P. T. Coates, and A. W. Thomson. 2005. The sphingosine-1-phosphate receptor agonist FTY720 modulates dendritic cell trafficking in vivo. Am J Transplant 5:2649-2659.

Linderman, J. J., T. Riggs, M. Pande, M. Miller, S. Marino, and D. E. Kirschner. Characterizing the dynamics of CD4+ T cell priming within a lymph node. J Immunol 184:2873-2885.

Mandala, S., R. Hajdu, J. Bergstrom, E. Quackenbush, J. Xie, J. Milligan, R. Thornton, G. J. Shei, D. Card, C. Keohane, M. Rosenbach, J. Hale, C. L. Lynch, K. Rupprecht, W. Parsons, and H. Rosen. 2002. Alteration of lymphocyte trafficking by sphingosine-1-phosphate receptor agonists. Science 296:346-349.

Mehling, M., T. A. Johnson, J. Antel, L. Kappos, and A. Bar-Or. Clinical immunology of the sphingosine 1-phosphate receptor modulator fingolimod (FTY720) in multiple sclerosis. Neurology 76:S20-27.

Morris, M. A., D. R. Gibb, F. Picard, V. Brinkmann, M. Straume, and K. Ley. 2005. Transient T cell accumulation in lymph nodes and sustained lymphopenia in mice treated with FTY720. European journal of immunology 35:3570-3580.

Pinschewer, D. D., V. Brinkmann, and D. Merkler.

Impact of sphingosine 1-phosphate modulation on immune outcomes. Neurology 76:S15-19.

Pinschewer, D. D., A. F. Ochsenbein, B. Odermatt, V. Brinkmann, H. Hengartner, and R. M. Zinkernagel. 2000. FTY720 immunosuppression impairs effector T cell peripheral homing without affecting induction, expansion, and memory. J Immunol 164:5761-5770.

Pyne, S., and N. J. Pyne. Translational aspects of sphingosine 1-phosphate biology. Trends in molecular medicine.

Raghavan, S., and A. M. Harandi. 'Help' from an unexpected source: polyclonal Tregs enhance antibody response to mucosal immunization. Immunol Cell Biol 88:696-697.

Randolph, G. J., V. Angeli, and M. A. Swartz.

2005. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol 5:617-628.

Reines, I., M. Kietzmann, R. Mischke, T. Tschernig, A. Luth, B. Kleuser, and W. Baumer.

2009. Topical application of sphingosine-1-phosphate and FTY720 attenuate allergic contact dermatitis reaction through inhibition of dendritic cell migration. The Journal of investigative dermatology 129:1954-1962.

Rivera, J., R. L. Proia, and A. Olivera. 2008. The alliance of sphingosine-1-phosphate and its receptors in immunity. Nat Rev Immunol 8:753-763.

Rosen, H., P. Gonzalez-Cabrera, D. Marsolais, S.

Cahalan, A. S. Don, and M. G. Sanna. 2008. Modulating tone: the overture of S1P receptor immunotherapeutics. Immunol Rev 223:221-235.

Singer, B., A. P. Ross, and K. Tobias. Oral fingolimod for the treatment of patients with relapsing forms of multiple sclerosis. International journal of clinical practice 65:887-895.

Skoura, A., and T. Hla. 2009. Lysophospholipid receptors in vertebrate development, physiology, and pathology. Journal of lipid research 50 Suppl:S293-298.

Vendetti, S., T. S. Davidson, F. Veglia, A. Riccomi, D. R. Negri, R. Lindstedt, P. Pasquali, E. M. Shevach, and M. T. De Magistris. Polyclonal Treg cells enhance the activity of a mucosal adjuvant. Immunol Cell Biol 88:698-706.

Vendetti, S., A. Riccomi, D. R. Negri, F. Veglia, E. Sciaraffia, and M. T. De Magistris. 2009. Development of antigen-specific T cells in mediastinal lymph nodes after intranasal immunization. Methods 49:334-339.

von Andrian, U. H., and T. R. Mempel. 2003. Homing and cellular traffic in lymph nodes. Nat Rev Immunol 3:867-878.

Zielinski, C. E., D. Corti, F. Mele, D. Pinto, A. Lanzavecchia, and F. Sallusto. Dissecting the human immunologic memory for pathogens. Immunol

Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1) Modulatori dei recettori per sfingosina 1 fosfato per l’uso come co-adiuvanti immunologici nelle immunizzazioni vaccinali.
2. 2) Modulatori dei recettori per sfingosina 1 fosfato per l’uso secondo la rivendicazione 1, in cui detti modulatori sono scelti nel gruppo che consiste in FTY720, AUY954, CYM-5442, KRP-203, SEW2871, JTE 013, VPC 23019.
3. 3) Modulatori dei recettori per sfingosina 1 fosfato per l’uso secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, in cui detti modulatori sono somministrati in un periodo di tempo da 24 a 48 ore dopo la somministrazione del vaccino e di ciascun richiamo.
4. 4) Modulatori dei recettori per sfingosina 1 fosfato per l’uso secondo la rivendicazione 3, in cui detti modulatori sono somministrati per due volte dopo la somministrazione del vaccino e di ciascun richiamo, ciascuna volta in una unica dose giornaliera per una sola volta nella giornata.
5. 5) Modulatori dei recettori per sfingosina 1 fosfato per l’uso secondo la rivendicazione 4, in cui detti modulatori sono somministrati dopo 24 ore e dopo 48 ore dalla somministrazione del vaccino e di ciascun richiamo, ciascuna volta in una unica dose giornaliera per una sola volta nella giornata.
6. 6) Combinazione di almeno un modulatore dei recettori per sfingosina 1 fosfato con almeno un vaccino per l’uso sequenziale come co-adiuvante immunologico nelle immunizzazioni vaccinali, in cui detto modulatore à ̈ somministrato dopo il vaccino e dopo ogni richiamo.
7. 7) Combinazione per l’uso secondo la rivendicazione 6, in cui detto almeno un modulatore dei recettori per sfingosina 1 fosfato à ̈ scelto nel gruppo che consiste in FTY720, AUY954; CYM-5442, KRP-203, SEW2871, JTE 013, VPC 23019.
8. 8) Combinazione per l’uso secondo la rivendicazione 6, in cui detto almeno un vaccino à ̈ un vaccino ad uso umano o veterinario.
9. 9) Combinazione per l’uso secondo ognuna delle rivendicazioni 6-8, in cui detto almeno un vaccino à ̈ scelto nel gruppo che consiste in vaccino contro la difterite, epatite virale, rosolia, meningiti, papilloma virus umano HPV, tetano, poliomielite, morbillo, pertosse, parotite, varicella, tubercolosi, influenza stagionale e pandemica, febbre tifoide, colera, amebiasi, malaria, febbre gialla, Dengue, encefalite giapponese, infezioni da Hantavirus, Febbre della Rift valley, Sars, sindrome respiratoria acuta grave, infezione da virus West Nile, Chikungunya, febbre emorragica di Marburg.
10. 10) Combinazione per l’uso secondo ognuna delle rivendicazioni 6-9, in cui detto almeno un modulatore à ̈ somministrato in un periodo di tempo da 24 a 48 ore dopo la somministrazione del vaccino e di ciascun richiamo.
11. 11) Combinazione per l’uso secondo ognuna delle rivendicazioni 6-9, in cui detto almeno un modulatore à ̈ somministrato per due volte dopo la somministrazione del vaccino e di ciascun richiamo, ciascuna volta in una unica dose giornaliera per una sola volta nella giornata.
12. 12) Combinazione per l’uso secondo la rivendicazione 11, in cui detto almeno un agonista à ̈ somministrato dopo 24 ore e dopo 48 ore dalla somministrazione del vaccino e di ciascun richiamo, ciascuna volta in una unica dose giornaliera per una sola volta nella giornata.