CN111073914A - 反式-1,2-环己烷二甲醇的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及反式‑1,2‑环己烷二甲醇的制备方法，经酯化、酶水解、水解、酯化、还原步骤得到，其中酶水解步骤用大肠杆菌水解酶或酿酒酵母水解酶，得到的光学纯的式IV化合物ee值、收率远远高于化学拆分方法，且不会产生大量废液，利于环保。

Description

反式-1,2-环己烷二甲醇的制备方法
技术领域
本发明涉及医药中间体领域，特别是涉及(1R,2R)-1,2-环己烷二甲醇的制备方法。
背景技术
盐酸鲁拉西酮是一种非典型抗精神病药，对5-羟色胺受体和多巴胺D2受体均有高度亲和力，对精神病患者的阳性和阴性症状均具有显著疗效，且本品的锥体外系症状(EPS)非常低，对于治疗有认知功能障碍的精神病患者有非常好的疗效。
(1R,2R)-1,2-环己烷二甲醇是用于合成盐酸鲁拉西酮的关键中间体，其结构如下：
Figure BDA0002354980770000011
JP2004224764A公布了其制备方法：以顺式六氢苯酐为原料，经酸化水解得特定羧酸，特定羧酸经手性胺试剂拆分，再经酯化和还原得到(1R,2R)-1,2-环己烷二甲醇，路线如下：
Figure BDA0002354980770000012
该方法中手性胺拆分收率比较低，JP2004224764A专利实施例1、实施例3报道的经拆分、酸化后收率仅35％。参照该法制得的(1R,2R)-1,2-环己烷二甲醇光学纯度也不够高，ee值仅为98.5％，且该法会产生大量废液，不利于环保及实际的生产应用。
发明内容
为解决现有技术中制备(1R,2R)-1,2-环己烷二甲醇过程中存在的拆分收率低，光化学纯度不高，产生大量废液等问题，本发明提供了一种包含生物酶手性催化技术在内的技术路线，与现有技术路线相比，该方法的产物得率高、光学选择性号且环境友好。
本发明提供一种式IV表示的化合物的制备方法：
Figure BDA0002354980770000013
其包含在磷酸盐缓冲溶液中用酶处理由下式III表示的化合物，
Figure BDA0002354980770000021
其中R为C1-6烷基或C3-6环烷基，所述的酶选自米曲霉NCBI ID:5993307表达的大肠杆菌水解酶或酿酒酵母水解酶。
本发明的一些实施方式，所述的磷酸盐缓冲液选自磷酸钾缓冲盐、磷酸钠缓冲盐或Tris-HCl缓冲液。
本发明的一些实施方式，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲盐。
本发明的一些实施方式，所述的R选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
本发明的一些实施方式，所述的R选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、或环丙基。
本发明的一些实施方式，所述的酶选自米曲霉NCBI ID:5993307表达的酿酒酵母水解酶。
本发明的一些实施方式，酶水解反应温度为20～40℃，pH为7～8。
本发明的一些实施方式，酶水解反应温度为25～35℃，pH为7～8。
本发明的一些实施方式，酶反应温度为30～35℃，pH为7～8。
本发明的一些实施方式，酶与式III化合物的质量比为1：1～5，式III化合物的浓度为10～150g/L。
本发明的一些实施方式，酶与式III化合物的质量比为1：1～2，式III化合物的浓度为10～100g/L。
本发明另一方面，提供了式I化合物的制备方法，包括以下步骤：
Figure BDA0002354980770000022
(1)顺式六氢苯酐与ROH在酸性条件下发生酯化反应得化合物III，所述的R为C1-6烷基或C3-6环烷基；
(2)将化合物III、磷酸盐缓冲液和酶混合，经过酶水解反应得到化合物IV；
(3)化合物IV在碱性条件下经水解反应得到化合物V；
(4)化合物V在酸性条件下，与甲醇发生酯化反应得到化合物VI；
(5)将化合物VI在还原剂作用下发生反应得到化合物I。
本发明一些实施方式中，步骤(1)和步骤(4)中所述的酸选自硫酸、磷酸、苯磺酸或甲苯磺酸。
本发明的一些实施方式中，步骤(1)和步骤(4)所述的酸选自硫酸或磷酸。
本发明的一些实施方式中，步骤(2)所述的酶选自米曲霉NCBI ID:5993307表达的大肠杆菌水解酶或酿酒酵母水解酶，所述的磷酸盐缓冲液选自磷酸钾缓冲盐、磷酸钠缓冲盐或Tris-HCl缓冲液。
本发明的一些实施方式中，步骤(2)所述的酶选自米曲霉NCBI ID:5993307表达的酿酒酵母水解酶，所述的磷酸盐缓冲液选自磷酸钾缓冲盐。
本发明的一些实施方式，所述的R选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
本发明的一些实施方式，所述的R选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、或环丙基。
本发明的一些实施方式，酶水解反应温度为20～40℃，pH为7～8。
本发明的一些实施方式，酶水解反应温度为25～35℃，pH为7～8。
本发明的一些实施方式，酶水解反应温度为30～35℃，pH为7～8。
本发明的一些实施方式，酶与式III化合物的质量比为1：1～5，式III化合物的浓度为10～150g/L。
本发明的一些实施方式，酶与式III化合物的质量比为1：1～2，，式III化合物的浓度为10～100g/L。
本发明的一些实施方式中，步骤(3)所述的碱选自甲醇钠、乙醇钠、氢氧化钠或氢氧化钾。
本发明的一些实施方式中，步骤(5)所述的还原剂选自硼氢化钠或氢化铝锂。
本发明的有益效果：
现有技术在合成(1R,2R)-1,2-环己烷二甲醇的过程中使用手性胺拆分剂进行手性拆分，收率及光化学纯度均不理想，本发明使用生物酶法可以显著提高收率及光化学纯度，有利于工业化生产，本发明方法得到的(1R,2R)-1,2-环己烷二甲醇ee值可达到99.9％。
附图说明
图1实施例8得到产物的手性HPLC图谱
图2实施例13得到产物的手性HPLC图谱
具体实施方式
本发明中的蛋白水解酶取自米曲霉(Aspergillus oryzae)，其基因信息源于NCBI(Gene ID:5993307)。第二种脂肪酶(lipase)来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)，其基因信息来源于NCBI(Gene ID:26306619)。第三种猪肝酯酶(ple)最初来源于猪肝组织，其基因信息来源于NCBI(Gene ID:100736962)，委托全基因公司进行合成基因序列。
本发明中选用二种表达系统对其比较，具体分为大肠杆菌表达系统和酿酒酵母表达系统。
顺式六氢苯酐来源购自濮阳惠成电子材料股份有限公司；
HPLC仪器岛津LC-20AT
手性色谱柱：
大赛璐IC柱(250*4.6mm，5μm)
大赛璐AD柱(250*4.6mm，5μm)
本发明中酶反应体系的体积是指底物、缓冲液、酶和碳酸氢钾等的体积之和，即为反应液总体积。
实施例1
Figure BDA0002354980770000041
将顺式六氢苯酐(220Kg，1.427Kmol)预热熔化，再用甲醇(522Kg)溶解稀释加入到反应釜中，缓慢滴加浓硫酸(28Kg，0.285Kmol)，滴毕加热至65-70℃回流反应12小时，加碳酸氢钠调节pH至7-8，过滤收集滤液，加入水(220Kg)，再用二氯甲烷(874Kg)萃取，减压浓缩至干得油状物环己烷-1,2-二甲酸二甲酯III-a 280Kg，收率98％。
实施例2
Figure BDA0002354980770000042
将顺式六氢苯酐(500g，3.244mol)加入到反应瓶中，加乙醇(1.5L)溶解分散，缓慢滴加浓硫酸(64g，0.65mol)，滴毕加热至75-80℃回流反应16小时，加碳酸氢钠调节pH至7-8，过滤收集滤液，加入水(500mL)，再用二氯甲烷(1.5L)萃取，减压浓缩至干得油状物环己烷-1,2-二甲酸二乙酯III-b 688g，收率93％。
实施例3
Figure BDA0002354980770000051
将顺式六氢苯酐(100g，0.648mol)加入到反应瓶中，加异丙醇(300mL)溶解分散，缓慢滴加浓硫酸(12.7g，0.13mol)，滴毕加热至70-85℃回流反应24小时，加碳酸氢钠调节pH至7-8，过滤收集滤液，加入水(200mL)，再用二氯甲烷(600mL)萃取，减压浓缩至干得油状物环己烷-1,2-二甲酸二异丙酯III-c 134g，收率81％。
实施例4蛋白水解酶的制备
1)酶的工程菌的构建
将目的基因(委托商业化公司进行全基因合成)经过酶切、转化、平板筛选后，构建大肠杆菌表达菌株。或者提取质粒重新构建酿酒酵母表达菌株。
2)大肠杆菌表达水解酶
种子培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，3％氯化钠；
发酵培养基：12％胰蛋白胨，24％酵母粉，4％甘油。
表达菌株菌用种子培养基活化好后，转入罐体，37℃培养，待OD600值为2.0，加入乳糖终浓度为1.0％，25℃继续培养，再加入0.5％的乳糖，过夜放罐，离心收集菌体，用磷酸钠缓冲盐(0.1M，pH7.0)重悬菌体，均质机破碎细胞，离心得到上清液，经过蛋白膜过滤后得到蛋白水解酶1。
3)酿酒酵母表达水解酶
过夜培养酿酒酵母细胞表达菌株，离心收集细胞，磷酸钠盐重悬后，加入重组质粒提取液，45℃，30分钟，平板筛选，挑取单菌落，过夜培养，离心破碎得到上清，简单膜过滤到蛋白水解酶2。
4)蛋白水解酶酶活的比较
使用nanodrop检测蛋白浓度，检测相同蛋白浓度下的酶活力。
1mL体系：以0.1g环己烷-1,2-二甲酸二甲酯(III-a)为底物，加入0.1g酶液(等蛋白浓度)，0.3M磷酸钾盐，控制pH7-8，35℃震荡搅拌2h，转化率计算公式：X(转化率)＝转化的底物量/起始的底物量×100％，酶1转化率29％，酶2转化率45％。
结论：相同蛋白浓度下，酿酒酵母酶酶活高于大肠杆菌酶，优选酿酒酵母产酶。
实施例5水解酶基因型筛选实验
Figure BDA0002354980770000061
利用酿酒酵母发酵产生的三种蛋白水解酶来进行相关实验：
500mL体系：以环己烷-1,2-二甲酸二甲酯(50g)为底物，加入适量磷酸钾缓冲液(0.3M，pH 7.5)，酶(25g)，用20％的碳酸氢钾溶液调节pH至7-8，室温下搅拌20小时，过滤，二氯甲烷萃取，减压浓缩得到(1R，2S)-2-(甲氧基羰基)环己烷-1-甲酸。
表1酿酒酵母发酵不同基因型的水解酶的催化活性比较
基因型 ee值(％) 收率(％)
Gene ID:5993307 98.1 94.7
Gene ID:26306619 62.3 86.7
Gene ID:100736962 76.9 90.3
结论：来自米曲霉的基因，NCBI(Gene ID:5993307)所表达的蛋白酶活具有高度的选择性和转化率，得到的(1R，2S)-2-(甲氧基羰基)环己烷-1-甲酸具有更高的收率。
实施例6水解酶筛选实验
Figure BDA0002354980770000062
500mL体系：以环己烷-1,2-二甲酸二甲酯(50g)为底物，加入适量磷酸钾缓冲液(0.3M，pH 7.5)，酶(25g)，用20％的碳酸氢钾溶液调节pH至7-8，室温下搅拌20小时，过滤，二氯甲烷萃取，减压浓缩得到(1R，2S)-2-(甲氧基羰基)环己烷-1-甲酸。
表2水解酶(Gene ID:5993307)在不同表达系统的催化活性比较
水解酶 ee值(％) 收率(％)
大肠杆菌水解酶 93.3 91.2
酿酒酵母水解酶 98.1 94.7
结论：与大肠杆菌水解酶相比，酿酒酵母水解酶对底物的选择性更好，产物的手性纯度和收率更高。
实施例7酶条件筛选
Figure BDA0002354980770000071
a底物浓度筛选
500mL体系：分别以不同浓度的环己烷-1,2-二甲酸二甲酯为底物，加入适量磷酸钾缓冲液(0.3M，pH 7.5)，酿酒酵母水解酶(酶用量按底物质量的50％投料，即酶/底物＝1:2)，用20％的碳酸氢钾溶液调节pH至7-8，室温下搅拌20小时，过滤，二氯甲烷萃取，减压浓缩得到(1R，2S)-2-(甲氧基羰基)环己烷-1-甲酸。
表3底物浓度对酶促反应的影响
Figure BDA0002354980770000072
结论：由表3可以看出，底物浓度在10-150g/L范围内，产物的手性纯度和收率都较高。
b温度筛选
500mL体系：以环己烷-1,2-二甲酸二甲酯(50g)为底物，加入适量磷酸钾缓冲液(0.3M，pH 7.5)，酿酒酵母水解酶(25g)，用20％的碳酸氢钾调节pH值，控制pH在7-8，分别在不同温度下搅拌20小时，过滤，二氯甲烷萃取，减压浓缩得到(1R，2S)-2-(甲氧基羰基)环己烷-1-甲酸。
表4温度对酶促反应的影响
温度(℃) ee值(％) 收率(％)
25-30 98.1 94.7
30-35 99.5 94.9
35-40 92.2 91.2
40-45 90.7 89.5
结论：从表4可以看出，温度在25-35℃时，得到产物的手性纯度和收率都比较高。
c pH值筛选
500ml体系：以环己烷-1,2-二甲酸二甲酯(50g)为底物，加入适量磷酸钾缓冲液(0.3M，pH 7.5)，酿酒酵母水解酶(25g)，用20％的碳酸氢钾调节pH值，调节pH至不同的值，30-35℃下搅拌20小时，过滤，二氯甲烷萃取，减压浓缩得到(1R，2S)-2-(甲氧基羰基)环己烷-1-甲酸。
表5pH对酶促反应的影响
pH ee值(％) 收率(％)
6-7 89.9 80.8
7-8 99.5 94.9
结论：从表5可以看出，pH在7-8范围内，得到产物的手性纯度和收率较高。
实施例8
Figure BDA0002354980770000081
向反应瓶中依次加入环己烷-1,2-二甲酸二甲酯(50Kg)，适量磷酸钾缓冲液(0.3M，pH7.5)，酿酒酵母水解酶(25kg)，用20％碳酸氢钾调节pH，控制pH在7-8，反应体系约为1000L，加热至30-35℃反应24小时。反应结束后，过滤收集滤液，二氯甲烷(250L)萃取，合并有机相，减压浓缩得黄色油状物，加石油醚(250L)打浆分散，过滤并干燥得白色固体(1R，2S)-2-(甲氧基羰基)环己烷-1-甲酸44.2kg，ee值99.5％，收率95％。
实施例9
Figure BDA0002354980770000082
将环己烷-1,2-二甲酸二乙酯(50g)和适量磷酸钾缓冲液(0.3M，pH 7.5)混合均匀，加入酿酒酵母水解酶(25g)，用20％碳酸氢钾调节pH，控制pH在7-8，总反应体系约为500mL，加热至30-35℃反应24小时。反应结束后，过滤收集滤液，二氯甲烷(250mL)萃取三次，合并有机相，减压浓缩得黄色油状物，加石油醚(150mL)打浆分散，过滤并干燥得白色固体化合物(1R，2S)-2-(乙氧基羰基)环己烷-1-甲酸38.6g，ee值94.2％，收率88％。
实施例10
Figure BDA0002354980770000083
将环己烷-1,2-二甲酸二异丙酯(50g)和适量磷酸钾缓冲液(0.3M，pH 7.5)混合均匀，加入酿酒酵母水解酶(25g)，用20％碳酸氢钾调节pH，控制pH在7-8，总反应体系约为500mL,加热至30-35℃反应24小时。反应结束后，过滤收集滤液，二氯甲烷(250mL)萃取三次，合并有机相，减压浓缩干燥得白色固体(1R，2S)-2-(异丙氧基羰基)环己烷-1-甲酸38.9g，ee值91.5％，收率93％。
实施例11
Figure BDA0002354980770000091
将甲醇(32Kg)加入到反应釜中，再加入(1R，2S)-2-(甲氧基羰基)环己烷-1-甲酸(10Kg，53.7mol)，搅拌溶清，加入30％甲醇钠的甲醇溶液(29Kg，161.1mol)，升温至60-65℃，回流反应36小时，向反应釜内快速滴加水(40Kg)，升温至75-80℃反应3小时，反应结束后加浓盐酸调节pH至1-2，过滤收集滤液，乙酸乙酯(30Kg)萃取，将溶剂浓缩至10L左右，加入甲醇(14Kg)，冷却至0℃析晶，过滤并烘干得白色固体(1R，2R)-环己烷-1，2-二羧酸7.5Kg，收率81％。
实施例12
Figure BDA0002354980770000092
向反应釜中加入甲醇(10Kg)，二氯甲烷(50Kg)和(1R，2R)-环己烷-1，2-二羧酸(7.5Kg，43.6mol)，搅拌分散均匀，滴加浓硫酸(0.85kg，8.72mol)，滴毕加热至40-45℃反应12小时，反应结束后加碳酸氢钠调节pH至7-8，过滤收集滤液，加入25kg水，静置分层，收集有机相，减压浓缩至干得黄色液体(1R，2R)-环己烷-1,2-二羧酸二甲酯8.34kg，收率95％。
实施例13
Figure BDA0002354980770000093
向反应釜中加入四氢呋喃(23Kg)和硼氢化钠(3.86Kg,102mol)，充分搅拌，滴加(1R，2R)-环己烷-1,2-二羧酸二甲酯(8.17Kg，40.8mol)，滴毕再滴加甲醇(5.75Kg)和四氢呋喃(15.32Kg)的混合物。滴毕加热升温至60-65℃反应2小时，缓慢加入稀盐酸(40Kg)，充分搅拌1小时，加入乙酸乙酯(36Kg)，静置分液，用乙酸乙酯(18Kg)萃取2次，合并有机相，浓缩得无色油状物，加入异丙醚(20Kg)，加热升温至回流溶清，冷却至0℃析晶，过滤并烘干得白色针状固体(1R,2R)-1,2-环己烷二甲醇4.4Kg，e.e值99.9％，收率75％。

Claims (11)

1.式IV表示的化合物的制备方法：
Figure FDA0002354980760000011
其包含在磷酸盐缓冲溶液中用酶处理由下式III表示的化合物，
Figure FDA0002354980760000012
其中R选自C1-6烷基或C3-6环烷基，所述的酶选自米曲霉NCBI ID:5993307表达的大肠杆菌水解酶或酿酒酵母水解酶。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的磷酸盐缓冲液选自磷酸钾缓冲盐、磷酸钠缓冲盐或Tris-HCl缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的R选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
4.根据权利要求1所述的方法，所述的酶选自米曲霉NCBI ID:5993307表达的酿酒酵母水解酶。
5.根据权利要求1所述的方法，酶反应温度为20～40℃，pH为7～8。
6.根据权利要求1所述的方法，酶与式III化合物的质量比为1：1～5，式III化合物的浓度为10～150g/L。
7.式I化合物的制备方法，包括以下步骤：
Figure FDA0002354980760000013
(1)顺式六氢苯酐与ROH在酸性条件下发生酯化反应得化合物III，所述的R选自C1-6烷基或C3-6环烷基；
(2)将化合物III、磷酸盐缓冲液和酶混合，经过酶水解反应得到化合物IV；
(3)化合物IV在碱性条件下经水解反应得到化合物V；
(4)化合物V在酸性条件下，与甲醇发生酯化反应得到化合物VI；
(5)将化合物VI在还原剂作用下发生反应得到化合物I。
8.根据权利要求7所述的方法，步骤(1)和步骤(4)中所述的酸选自硫酸、磷酸、苯磺酸或对甲苯磺酸。
9.根据权利要求7所述的方法，步骤(2)所述的酶选自米曲霉NCBI ID:5993307表达的大肠杆菌水解酶或酿酒酵母水解酶，所述的磷酸盐缓冲液选自磷酸钾缓冲盐、磷酸钠缓冲盐或Tris-HCl缓冲液。
10.根据权利要求7所述的方法，步骤(3)所述的碱选自甲醇钠、乙醇钠、氢氧化钠或氢氧化钾。
11.根据权利要求7所述的方法，步骤(5)所述的还原剂选自硼氢化钠或氢化铝锂。
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