CN111053894B - 一种抗NgR和NG2混合多肽疫苗及其在脊髓损伤修复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学和生物工程技术领域，具体是一种抗NgR和NG2混合多肽疫苗，由三条NgR蛋白目标多肽和四条NG2蛋白目标多肽组成，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示。本发明还提供所述的多肽疫苗在制备脊髓损伤修复药物或试剂中的应用。本发明的混合多肽疫苗能够抑制脊髓损伤区炎症因子IL6和IL‑1β表达，减少脊髓损伤区胶质疤痕形成，促进脊髓损伤区轴突生长，促进神经功能恢复。

Description

一种抗NgR和NG2混合多肽疫苗及其在脊髓损伤修复中的应用

技术领域

本发明涉及医学和生物工程技术领域，具体地说，是一种抗NgR+NG2混合多肽疫苗的研制及其在脊髓损伤修复中的应用。

背景技术

成年哺乳动物的中枢神经系统损伤后是可以再生的，但其再生能力有限，主要原因是局部微环境中的抑制性因子及胶质瘢痕阻碍了轴突再生。Nogo受体(Nogo receptor，NgR)是三种髓磷脂相关轴突生长抑制因子(Nogo、MAG和Omgp)的高亲和共受体，NgR失活则能阻断轴突生长抑制因子的信号传递和功能。脊髓损伤区的胶质瘢痕形成主要是由NG2细胞及其分泌的NG2蛋白多糖所调控。本发明研究团队于2004年开始以NgR及NG2基因作为靶点进行脊髓损伤基因治疗方面的研究工作，首先成功筛选出能够高效沉默NgR基因的siNgR199片段，应用慢病毒介导siNgR199干扰大鼠NgR基因表达，动物实验证实促进了大鼠脊髓损伤区轴突生长，神经功能得到一定程度的恢复，同时发现脊髓损伤区的胶质疤痕阻碍神经轴突的进一步生长，进而构建慢病毒介导的NG2基因RNA干扰载体，动物实验证实慢病毒介导的NG2基因RNA干扰载体能有效减少脊髓损伤区胶质疤痕形成，促进轴突生长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗NgR和NG2混合多肽疫苗的研制及其在脊髓损伤修复中的应用。

本发明的第一方面，提供一种抗NgR和NG2混合多肽疫苗，所述的混合多肽疫苗由三条NgR蛋白目标多肽和四条NG2蛋白目标多肽组成，其氨基酸序列分别如下所示：

三条NgR蛋白目标多肽：

1,PGCSRKNRTRSHCR(SEQ ID NO.1)；

2,Cys-GNGSGPRHINDSP(SEQ ID NO.2)；

3,Cys-TGRATDEEPLGLPK(SEQ ID NO.3)；

四条NG2蛋白目标多肽：

1,Cys-GKPESSTPTGEPGPM(SEQ ID NO.4)；

2,Cys-PEGRAPGPAGDSLT(SEQ ID NO.5)；

3,GLPYLRGTSRPLRGC(SEQ ID NO.6)；

4,Cys-PVERRDQPGEPATE(SEQ ID NO.7)。

在前期研究工作的基础上，本发明研究团队采用分子生物学技术研制抗NgR和NG2混合多肽疫苗，自NgR蛋白(SEQ ID NO.8)和NG2蛋白(SEQID NO.9)全长序列中选择多段抗原表位，经组合和综合比较后，最终选定以上三条NgR蛋白目标多肽和四条NG2蛋白目标多肽，组成本发明的混合多肽疫苗。

本发明首先检测混合疫苗的纯度及探索最佳配比关系，然后构建大鼠胸髓横切损伤动物模型，在脊髓损伤后不同时间窗分别于皮下给药，观测混合疫苗的药性反应、脊髓损伤区胶质疤痕生长情况及大鼠神经功能恢复情况，验证混合疫苗的有效性，并寻找合理的给药时间窗。

本发明的第二方面，提供一种如上所述的抗NgR和NG2混合多肽疫苗在制备脊髓损伤修复药物或试剂中的应用。

进一步的，所述的脊髓损伤修复药物或试剂中还包括药学上或免疫学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。所述的佐剂为弗氏完全佐剂或不完全弗氏佐剂。

进一步的，所述的脊髓损伤修复药物或试剂中的七条多肽等量混合。

进一步的，所述的脊髓损伤修复药物或试剂在脊髓损伤后立即皮下注射免疫，后续每周免疫一次，共免疫4次。

进一步的，如上所述的抗NgR和NG2混合多肽疫苗抑制脊髓损伤区炎症因子IL6和IL-1β表达，减少脊髓损伤区胶质疤痕形成，促进神经功能恢复。

本发明的第三方面，提供一种脊髓损伤修复药物或试剂，其包含：治疗有效量的如上所述的抗NgR和NG2混合多肽疫苗，以及药学上或免疫学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。

本发明优点在于：

本发明提供一种可修复脊髓损伤的抗NgR和NG2混合多肽疫苗，探索最佳配比关系，以及该混合疫苗合理的给药时间窗，然后通过大鼠胸髓横切损伤动物模型验证其有效性，证明本发明的混合多肽疫苗能够抑制脊髓损伤区炎症因子IL6和IL-1β表达，减少脊髓损伤区胶质疤痕形成，促进神经功能恢复。

附图说明

图1.术后第0、1、3、7、14、28d分别对各组动物进行BBB运动功能评分。

图2.术后3d，7d，14d，28d取大鼠外周血，ELISA法检测IL-1β、IL-6水平。

图3.术后28d，取大鼠脊髓损伤区组织切片，HE染色观察胶质疤痕形成情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：NGR+NG2混合疫苗制备

一、首先设计目标蛋白多肽，设计结果如下：

NGR蛋白目标多肽三条：

1,PGCSRKNRTRSHCR(SEQ ID NO.1)；

2,Cys-GNGSGPRHINDSP(SEQ ID NO.2)；

3,Cys-TGRATDEEPLGLPK(SEQ ID NO.3)；

计氨基酸43个。

NG2蛋白目标多肽四条：

1,Cys-GKPESSTPTGEPGPM(SEQ ID NO.4)；

2,Cys-PEGRAPGPAGDSLT(SEQ ID NO.5)；

3,GLPYLRGTSRPLRGC(SEQ ID NO.6)；

4,Cys-PVERRDQPGEPATE(SEQ ID NO.7)；

计氨基酸61个。

二、NGR+NG2蛋白多肽合成

a.树脂溶胀：称Fmoc-Arg(pbf)-wangResin树脂倒入反应柱中，加入DCM浸泡30分钟，抽干。

b.脱保护：向反应柱中加入适量脱保护溶液，通氮气搅拌鼓动30分钟，抽干。

c.称料：量取树脂3倍摩尔量的保护氨基酸，再称取3倍摩尔量的HBTU。

d.脱保护洗涤：向反应柱中加入适量DMF，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作6次。

e.投料：将已备好的保护氨基酸和HBTU加入反应柱中，再加入树脂6倍摩尔量的NMM，氮气搅拌鼓动30分钟。

f.反应后洗涤：将反应柱中的溶液抽干，加入适量DMF洗涤，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作3次。

g.检测：取适量(10-20颗)树脂于小试管中，加入A，B，C液各两滴。放入干式加热器中加热3分钟(110摄氏度)。

取出后若溶液显蓝色，树脂有杂色不透明，则反应没有完全，需要重新再反应一次；

若溶液颜色微黄，树脂无色透明则为反应完全，可以连接下一个氨基酸，具体步骤重复以上b-f这五个步骤，直到连完最后一个氨基酸。

h.合成完毕后的洗涤和干燥：在连完最后一个氨基酸并已脱保护洗涤之后，抽干，向反应柱中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，再加入适量DCM，氮气鼓动2分钟，抽干重复操作3次。最后反应釜中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作2次，将树脂装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥12小时。

三、多肽的切割

洗涤：将离心管密封后放入离心机中以4000转每分钟的转速离心3分钟，取出，将上层清液倒掉，再加入乙醚，用玻璃棒搅拌均匀，再次离心；如此重复操作洗涤5次。

干燥：将以洗涤5次后的多肽放入真空干燥器中真空干燥24小时。最后的所得白色粉末即为所需多肽的粗品，称量。

7条多肽合成完毕，每条多肽各5mg量，混合使用。

实施例2：动物造模及给药

一、造模方法：SD大鼠，雄性别，质量200-300g，8周龄，18只大鼠适应性饲养一周后，采用10％水合氯醛(1mL/100g)腹腔注射麻醉，麻醉成功后将大鼠俯卧位固定于动物手术台上，胸背部剪毛备皮，消毒。按肋骨确定椎体序列，以T10棘突为中心行背部正中纵行切开T10处，沿脊柱方向取一长约2.0cm的切口，切开皮肤、肌肉，分离并显露棘突，小心敲除T10椎板。打开硬脊膜暴露脊髓，眼科手术尖刀刀刃朝左沿中线切断左侧脊髓，清除残留纤维组织。切割后，见鼠尾痉挛性摆动、左下肢回缩扑动后瘫痪，标志切割成功，术后缝合肌层与皮肤。

二、实验分组：

将造模成功的18只大鼠，随机分为6组，每组3只，具体分组和处理方法如下：

A.对照组：损伤模型完成后不给药；

B.给药1组：损伤模型完成后立即皮下注射给药，后续每周免疫一次；

C.给药2组：损伤模型完成后3h皮下注射给药，后续每周免疫一次；

D.给药3组：损伤模型完成后8h皮下注射给药，后续每周免疫一次；

E.给药4组：损伤模型完成后24h皮下注射给药，后续每周免疫一次；

F.给药5组：损伤模型完成后72h皮下注射给药，后续每周免疫一次。

三、动物给药：

7种多肽混合后用PBS配制成0.2mg/mL溶液，将混合疫苗与等量佐剂混匀(初次免疫均与弗氏完全佐剂等量混匀、每只大鼠0.5mL；之后均与不完全弗氏佐剂等量混匀、每只大鼠0.5mL)按照50ug/次/只进行皮下注射免疫。除第一次免疫根据分组在时间点上不同外，后续所有大鼠均每周免疫一次，共免疫4次。

实施例3：实验检测与统计分析

一、行为学评分

术后第0、1、3、7、14、28d分别对各组动物进行BBB运动功能评分。将大鼠后肢运动分为22个等级。0分为后肢全瘫，21分完全正常，其基本内容为：关节活动的数目和范围，负重程度及前后肢协调性。原始数据处理，统计分析，绘制图表。详见BBB运动评分数据表。

结论：如图1所示，随着时间点渐进，B组(皮下给药1组)恢复最好，A组(对照组)恢复最差。

二、ELISA检测

检测指标：IL-1β、IL-6

术后3d，7d，14d，28d取大鼠外周血，ELISA法检测IL-1β、IL-6水平

结论：如图2所示，炎症因子IL6和IL-1β表达量在对照组中最高，皮下给药1组中最低，且随着造模时间点逐渐增高。故对照组恢复相对最差，皮下给药1组恢复相对最好。

三、HE染色

最后一次行为学评分后，动物处死，截取脊髓损伤区脊髓组织，石蜡包埋切片。切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

结果如图3所示：对照组脊髓损伤区胶质疤痕增生明显，各给药组脊髓损伤区胶质疤痕明显减少。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 上海长征医院

<120> 一种抗NgR和NG2混合多肽疫苗及其在脊髓损伤修复中的应用

<130> /

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg Ser His Cys Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

Cys Gly Asn Gly Ser Gly Pro Arg His Ile Asn Asp Ser Pro

1 5 10

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

Cys Thr Gly Arg Ala Thr Asp Glu Glu Pro Leu Gly Leu Pro Lys

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

Cys Gly Lys Pro Glu Ser Ser Thr Pro Thr Gly Glu Pro Gly Pro Met

1 5 10 15

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

Cys Pro Glu Gly Arg Ala Pro Gly Pro Ala Gly Asp Ser Leu Thr

1 5 10 15

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

Gly Leu Pro Tyr Leu Arg Gly Thr Ser Arg Pro Leu Arg Gly Cys

1 5 10 15

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

Cys Pro Val Glu Arg Arg Asp Gln Pro Gly Glu Pro Ala Thr Glu

1 5 10 15

<210> 8

<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

Met Lys Arg Ala Ser Ala Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu

1 5 10 15

Trp Leu Gln Ala Trp Gln Val Ala Ala Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val

20 25 30

Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln Gly Leu

35 40 45

Gln Ala Val Pro Val Gly Ile Pro Ala Ala Ser Gln Arg Ile Phe Leu

50 55 60

His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Arg Ala Cys

65 70 75 80

Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser Asn Val Leu Ala Arg Ile

85 90 95

Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Ala Leu Leu Glu Gln Leu Asp Leu

100 105 110

Ser Asp Asn Ala Gln Leu Arg Ser Val Asp Pro Ala Thr Phe His Gly

115 120 125

Leu Gly Arg Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Gln Glu

130 135 140

Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr

145 150 155 160

Leu Gln Asp Asn Ala Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asp Thr Phe Arg Asp

165 170 175

Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Ser Ser

180 185 190

Val Pro Glu Arg Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu

195 200 205

Leu His Gln Asn Arg Val Ala His Val His Pro His Ala Phe Arg Asp

210 215 220

Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Ala

225 230 235 240

Leu Pro Thr Glu Ala Leu Ala Pro Leu Arg Ala Leu Gln Tyr Leu Arg

245 250 255

Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp

260 265 270

Ala Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Ser

275 280 285

Leu Pro Gln Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Asn

290 295 300

Asp Leu Gln Gly Cys Ala Val Ala Thr Gly Pro Tyr His Pro Ile Trp

305 310 315 320

Thr Gly Arg Ala Thr Asp Glu Glu Pro Leu Gly Leu Pro Lys Cys Cys

325 330 335

Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala Ser Val Leu Glu Pro Gly Arg Pro

340 345 350

Ala Ser Ala Gly Asn Ala Leu Lys Gly Arg Val Pro Pro Gly Asp Ser

355 360 365

Pro Pro Gly Asn Gly Ser Gly Pro Arg His Ile Asn Asp Ser Pro Phe

370 375 380

Gly Thr Leu Pro Gly Ser Ala Glu Pro Pro Leu Thr Ala Val Arg Pro

385 390 395 400

Glu Gly Ser Glu Pro Pro Gly Phe Pro Thr Ser Gly Pro Arg Arg Arg

405 410 415

Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg Ser His Cys Arg Leu Gly

420 425 430

Gln Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Glu Gly Ser Gly

435 440 445

Ala Leu Pro Ser Leu Thr Cys Ser Leu Thr Pro Leu Gly Leu Ala Leu

450 455 460

Val Leu Trp Thr Val Leu Gly Pro Cys

465 470

<210> 9

<211> 2322

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

Met Gln Ser Gly Pro Arg Pro Pro Leu Pro Ala Pro Gly Leu Ala Leu

1 5 10 15

Ala Leu Thr Leu Thr Met Leu Ala Arg Leu Ala Ser Ala Ala Ser Phe

20 25 30

Phe Gly Glu Asn His Leu Glu Val Pro Val Ala Thr Ala Leu Thr Asp

35 40 45

Ile Asp Leu Gln Leu Gln Phe Ser Thr Ser Gln Pro Glu Ala Leu Leu

50 55 60

Leu Leu Ala Ala Gly Pro Ala Asp His Leu Leu Leu Gln Leu Tyr Ser

65 70 75 80

Gly Arg Leu Gln Val Arg Leu Val Leu Gly Gln Glu Glu Leu Arg Leu

85 90 95

Gln Thr Pro Ala Glu Thr Leu Leu Ser Asp Ser Ile Pro His Thr Val

100 105 110

Val Leu Thr Val Val Glu Gly Trp Ala Thr Leu Ser Val Asp Gly Phe

115 120 125

Leu Asn Ala Ser Ser Ala Val Pro Gly Ala Pro Leu Glu Val Pro Tyr

130 135 140

Gly Leu Phe Val Gly Gly Thr Gly Thr Leu Gly Leu Pro Tyr Leu Arg

145 150 155 160

Gly Thr Ser Arg Pro Leu Arg Gly Cys Leu His Ala Ala Thr Leu Asn

165 170 175

Gly Arg Ser Leu Leu Arg Pro Leu Thr Pro Asp Val His Glu Gly Cys

180 185 190

Ala Glu Glu Phe Ser Ala Ser Asp Asp Val Ala Leu Gly Phe Ser Gly

195 200 205

Pro His Ser Leu Ala Ala Phe Pro Ala Trp Gly Thr Gln Asp Glu Gly

210 215 220

Thr Leu Glu Phe Thr Leu Thr Thr Gln Ser Arg Gln Ala Pro Leu Ala

225 230 235 240

Phe Gln Ala Gly Gly Arg Arg Gly Asp Phe Ile Tyr Val Asp Ile Phe

245 250 255

Glu Gly His Leu Arg Ala Val Val Glu Lys Gly Gln Gly Thr Val Leu

260 265 270

Leu His Asn Ser Val Pro Val Ala Asp Gly Gln Pro His Glu Val Ser

275 280 285

Val His Ile Asn Ala His Arg Leu Glu Ile Ser Val Asp Gln Tyr Pro

290 295 300

Thr His Thr Ser Asn Arg Gly Val Leu Ser Tyr Leu Glu Pro Arg Gly

305 310 315 320

Ser Leu Leu Leu Gly Gly Leu Asp Ala Glu Ala Ser Arg His Leu Gln

325 330 335

Glu His Arg Leu Gly Leu Thr Pro Glu Ala Thr Asn Ala Ser Leu Leu

340 345 350

Gly Cys Met Glu Asp Leu Ser Val Asn Gly Gln Arg Arg Gly Leu Arg

355 360 365

Glu Ala Leu Leu Thr Arg Asn Met Ala Ala Gly Cys Arg Leu Glu Glu

370 375 380

Glu Glu Tyr Glu Asp Asp Ala Tyr Gly His Tyr Glu Ala Phe Ser Thr

385 390 395 400

Leu Ala Pro Glu Ala Trp Pro Ala Met Glu Leu Pro Glu Pro Cys Val

405 410 415

Pro Glu Pro Gly Leu Pro Pro Val Phe Ala Asn Phe Thr Gln Leu Leu

420 425 430

Thr Ile Ser Pro Leu Val Val Ala Glu Gly Gly Thr Ala Trp Leu Glu

435 440 445

Trp Arg His Val Gln Pro Thr Leu Asp Leu Met Glu Ala Glu Leu Arg

450 455 460

Lys Ser Gln Val Leu Phe Ser Val Thr Arg Gly Ala Arg His Gly Glu

465 470 475 480

Leu Glu Leu Asp Ile Pro Gly Ala Gln Ala Arg Lys Met Phe Thr Leu

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Leu Asp Val Val Asn Arg Lys Ala Arg Phe Ile His Asp Gly Ser Glu

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Arg Val Ser Asp Gly Leu Gln Ala Ser Pro Pro Ala Thr Leu Lys Val

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Leu Ala Gln Gly Ser Ala Met Pro Ile Leu Pro Ala Asn Leu Ser Val

675 680 685

Glu Thr Asn Ala Val Gly Gln Asp Val Ser Val Leu Phe Arg Val Thr

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Gly Ala Leu Gln Phe Gly Glu Leu Gln Lys Gln Gly Ala Gly Gly Val

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Glu Gly Ala Glu Trp Trp Ala Thr Gln Ala Phe His Gln Arg Asp Val

725 730 735

Glu Gln Gly Arg Val Arg Tyr Leu Ser Thr Asp Pro Gln His His Ala

740 745 750

Tyr Asp Thr Val Glu Asn Leu Ala Leu Glu Val Gln Val Gly Gln Glu

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Ile Leu Ser Asn Leu Ser Phe Pro Val Thr Ile Gln Arg Ala Thr Val

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Trp Met Leu Arg Leu Glu Pro Leu His Thr Gln Asn Thr Gln Gln Glu

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Thr Leu Thr Thr Ala His Leu Glu Ala Thr Leu Glu Glu Ala Gly Pro

805 810 815

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820 825 830

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Gln Asp Asp Ile Gln Ala Gly Arg Val Thr Tyr Gly Ala Thr Ala Arg

850 855 860

Ala Ser Glu Ala Val Glu Asp Thr Phe Arg Phe Arg Val Thr Ala Pro

865 870 875 880

Pro Tyr Phe Ser Pro Leu Tyr Thr Phe Pro Ile His Ile Gly Gly Asp

885 890 895

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Gly Glu Gly Val Leu Ser Ala Asp His Leu Phe Val Lys Ser Leu Asn

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Leu Gln Val Ser Asp Gly Gln His Gln Ala Thr Ala Leu Leu Glu Val

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Gln Ala Ser Glu Pro Tyr Leu Arg Val Ala Asn Gly Ser Ser Leu Val

1125 1130 1135

Val Pro Gln Gly Gly Gln Gly Thr Ile Asp Thr Ala Val Leu His Leu

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1395 1400 1405

Glu Asp Gly Pro Gln Ala Arg Thr Leu Ser Ala Phe Ser Trp Arg Met

1410 1415 1420

Val Glu Glu Gln Leu Ile Arg Tyr Val His Asp Gly Ser Glu Thr Leu

1425 1430 1435 1440

Thr Asp Ser Phe Val Leu Met Ala Asn Ala Ser Glu Met Asp Arg Gln

1445 1450 1455

Ser His Pro Val Ala Phe Thr Val Thr Val Leu Pro Val Asn Asp Gln

1460 1465 1470

Pro Pro Ile Leu Thr Thr Asn Thr Gly Leu Gln Met Trp Glu Gly Ala

1475 1480 1485

Thr Ala Pro Ile Pro Ala Glu Ala Leu Arg Ser Thr Asp Gly Asp Ser

1490 1495 1500

Gly Ser Glu Asp Leu Val Tyr Thr Ile Glu Gln Pro Ser Asn Gly Arg

1505 1510 1515 1520

Val Val Leu Arg Gly Ala Pro Gly Thr Glu Val Arg Ser Phe Thr Gln

1525 1530 1535

Ala Gln Leu Asp Gly Gly Leu Val Leu Phe Ser His Arg Gly Thr Leu

1540 1545 1550

Asp Gly Gly Phe Arg Phe Arg Leu Ser Asp Gly Glu His Thr Ser Pro

1555 1560 1565

Gly His Phe Phe Arg Val Thr Ala Gln Lys Gln Val Leu Leu Ser Leu

1570 1575 1580

Lys Gly Ser Gln Thr Leu Thr Val Cys Pro Gly Ser Val Gln Pro Leu

1585 1590 1595 1600

Ser Ser Gln Thr Leu Arg Ala Ser Ser Ser Ala Gly Thr Asp Pro Gln

1605 1610 1615

Leu Leu Leu Tyr Arg Val Val Arg Gly Pro Gln Leu Gly Arg Leu Phe

1620 1625 1630

His Ala Gln Gln Asp Ser Thr Gly Glu Ala Leu Val Asn Phe Thr Gln

1635 1640 1645

Ala Glu Val Tyr Ala Gly Asn Ile Leu Tyr Glu His Glu Met Pro Pro

1650 1655 1660

Glu Pro Phe Trp Glu Ala His Asp Thr Leu Glu Leu Gln Leu Ser Ser

1665 1670 1675 1680

Pro Pro Ala Arg Asp Val Ala Ala Thr Leu Ala Val Ala Val Ser Phe

1685 1690 1695

Glu Ala Ala Cys Pro Gln Arg Pro Ser His Leu Trp Lys Asn Lys Gly

1700 1705 1710

Leu Trp Val Pro Glu Gly Gln Arg Ala Arg Ile Thr Val Ala Ala Leu

1715 1720 1725

Asp Ala Ser Asn Leu Leu Ala Ser Val Pro Ser Pro Gln Arg Ser Glu

1730 1735 1740

His Asp Val Leu Phe Gln Val Thr Gln Phe Pro Ser Arg Gly Gln Leu

1745 1750 1755 1760

Leu Val Ser Glu Glu Pro Leu His Ala Gly Gln Pro His Phe Leu Gln

1765 1770 1775

Ser Gln Leu Ala Ala Gly Gln Leu Val Tyr Ala His Gly Gly Gly Gly

1780 1785 1790

Thr Gln Gln Asp Gly Phe His Phe Arg Ala His Leu Gln Gly Pro Ala

1795 1800 1805

Gly Ala Ser Val Ala Gly Pro Gln Thr Ser Glu Ala Phe Ala Ile Thr

1810 1815 1820

Val Arg Asp Val Asn Glu Arg Pro Pro Gln Pro Gln Ala Ser Val Pro

1825 1830 1835 1840

Leu Arg Leu Thr Arg Gly Ser Arg Ala Pro Ile Ser Arg Ala Gln Leu

1845 1850 1855

Ser Val Val Asp Pro Asp Ser Ala Pro Gly Glu Ile Glu Tyr Glu Val

1860 1865 1870

Gln Arg Ala Pro His Asn Gly Phe Leu Ser Leu Val Gly Gly Gly Leu

1875 1880 1885

Gly Pro Val Thr Arg Phe Thr Gln Ala Asp Val Asp Ser Gly Arg Leu

1890 1895 1900

Ala Phe Val Ala Asn Gly Ser Ser Val Ala Gly Ile Phe Gln Leu Ser

1905 1910 1915 1920

Met Ser Asp Gly Ala Ser Pro Pro Leu Pro Met Ser Leu Ala Val Asp

1925 1930 1935

Ile Leu Pro Ser Ala Ile Glu Val Gln Leu Arg Ala Pro Leu Glu Val

1940 1945 1950

Pro Gln Ala Leu Gly Arg Ser Ser Leu Ser Gln Gln Gln Leu Arg Val

1955 1960 1965

Val Ser Asp Arg Glu Glu Pro Glu Ala Ala Tyr Arg Leu Ile Gln Gly

1970 1975 1980

Pro Gln Tyr Gly His Leu Leu Val Gly Gly Arg Pro Thr Ser Ala Phe

1985 1990 1995 2000

Ser Gln Phe Gln Ile Asp Gln Gly Glu Val Val Phe Ala Phe Thr Asn

2005 2010 2015

Phe Ser Ser Ser His Asp His Phe Arg Val Leu Ala Leu Ala Arg Gly

2020 2025 2030

Val Asn Ala Ser Ala Val Val Asn Val Thr Val Arg Ala Leu Leu His

2035 2040 2045

Val Trp Ala Gly Gly Pro Trp Pro Gln Gly Ala Thr Leu Arg Leu Asp

2050 2055 2060

Pro Thr Val Leu Asp Ala Gly Glu Leu Ala Asn Arg Thr Gly Ser Val

2065 2070 2075 2080

Pro Arg Phe Arg Leu Leu Glu Gly Pro Arg His Gly Arg Val Val Arg

2085 2090 2095

Val Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly Gly Ser Gln Leu Val Glu Gln

2100 2105 2110

Phe Thr Gln Gln Asp Leu Glu Asp Gly Arg Leu Gly Leu Glu Val Gly

2115 2120 2125

Arg Pro Glu Gly Arg Ala Pro Gly Pro Ala Gly Asp Ser Leu Thr Leu

2130 2135 2140

Glu Leu Trp Ala Gln Gly Val Pro Pro Ala Val Ala Ser Leu Asp Phe

2145 2150 2155 2160

Ala Thr Glu Pro Tyr Asn Ala Ala Arg Pro Tyr Ser Val Ala Leu Leu

2165 2170 2175

Ser Val Pro Glu Ala Ala Arg Thr Glu Ala Gly Lys Pro Glu Ser Ser

2180 2185 2190

Thr Pro Thr Gly Glu Pro Gly Pro Met Ala Ser Ser Pro Glu Pro Ala

2195 2200 2205

Val Ala Lys Gly Gly Phe Leu Ser Phe Leu Glu Ala Asn Met Phe Ser

2210 2215 2220

Val Ile Ile Pro Met Cys Leu Val Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Leu

2225 2230 2235 2240

Pro Leu Leu Phe Tyr Leu Arg Lys Arg Asn Lys Thr Gly Lys His Asp

2245 2250 2255

Val Gln Val Leu Thr Ala Lys Pro Arg Asn Gly Leu Ala Gly Asp Thr

2260 2265 2270

Glu Thr Phe Arg Lys Val Glu Pro Gly Gln Ala Ile Pro Leu Thr Ala

2275 2280 2285

Val Pro Gly Gln Gly Pro Pro Pro Gly Gly Gln Pro Asp Pro Glu Leu

2290 2295 2300

Leu Gln Phe Cys Arg Thr Pro Asn Pro Ala Leu Lys Asn Gly Gln Tyr

2305 2310 2315 2320

Trp Val

Claims (6)

1.一种抗NgR和NG2混合多肽疫苗，其特征在于，所述的混合多肽疫苗由三条NgR蛋白目标多肽和四条NG2蛋白目标多肽组成，七条多肽等量混合，三条NgR蛋白目标多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；四条NG2蛋白目标多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。

2.一种如权利要求1所述的抗NgR和NG2混合多肽疫苗在制备脊髓损伤修复药物或试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的抗NgR和NG2混合多肽疫苗在制备脊髓损伤修复药物或试剂中的应用，其特征在于，所述的脊髓损伤修复药物或试剂中还包括药学上或免疫学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。

4.根据权利要求2所述的抗NgR和NG2混合多肽疫苗在制备脊髓损伤修复药物或试剂中的应用，其特征在于，所述的脊髓损伤修复药物或试剂在脊髓损伤后立即皮下注射免疫，后续每周免疫一次，共免疫4次。

5.根据权利要求2所述的抗NgR和NG2混合多肽疫苗在制备脊髓损伤修复药物或试剂中的应用，其特征在于，所述的抗NgR和NG2混合多肽疫苗抑制脊髓损伤区炎症因子IL6和IL-1β表达，减少脊髓损伤区胶质疤痕形成，促进脊髓损伤区轴突生长，促进神经功能恢复。

6.一种脊髓损伤修复药物或试剂，其特征在于，其包含：治疗有效量的如权利要求1所述的抗NgR和NG2混合多肽疫苗，以及药学上或免疫学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。