CN101248083A - Nogo受体多肽和多肽片段及其用途 - Google Patents

Abstract

Nogo受体(1)(NgR1)是形成信号复合物部分的富亮氨酸重复蛋白质，所述信号复合物调节轴突再生。先前研究已显示Nogo受体(1)的包括LRR的C端帽－LRRCT的完整LRR区域，是配体结合所需的，并且Nogo受体(1)邻近的CT茎促成与其共受体的相互作用。本发明指向某些Nogo受体(1)和Nogo受体(2)多肽和多肽片段用于促进神经突长出、神经元存活和CNS神经元中的轴突再生的用途。本发明的特征在于用于抑制神经突长出抑制、促进神经元存活、和/或促进CNS神经元中的轴突再生的分子和方法。

Description

NOGO受体多肽和多肽片段及其用途

技术领域

本发明涉及神经生物学、神经病学和药理学。更具体而言，本发明涉及神经元以及用于介导轴突生长的组合物和方法。

背景技术

神经元的轴突和树突是来自神经元的长细胞延伸。延伸轴突或神经突的远端包含称为生长锥的特异性区域，所述生长锥感觉局部环境且指导朝向神经元靶细胞的轴突生长。在锥体上生长的指导涉及各种种类的粘附分子、细胞间信号、以及刺激和抑制生长锥的因子。

神经细胞功能受到神经元及其直接环境中的其他细胞之间接触的极大影响。这些细胞包括特化神经胶质细胞、中枢神经系统(CNS)中的少突胶质细胞、和外周神经系统(PNS)中的施万细胞，所述细胞包盖具有髓鞘(多层膜的绝缘结构)的神经元轴突。尽管CNS神经元具有在损伤后再生的能力，但由于髓鞘中存在的抑制蛋白质以及可能经由其局部环境中通常发现的其他类型分子的存在，它们被阻止这样做(Brittis和Flanagan，Neuron 2001，30，第11-14页；Jones等人，J.Neurosci.2002，22，第2792-2803页；Grimpe等人，J.Neurosci.2002，22，第3144-3160页)。

在少突胶质细胞上发现的几种髓鞘抑制蛋白质已被表征，例如NogoA(Chen等人，Nature.2000，403，434-439；Grandpre等人，Nature 2000，403，439-444)，髓鞘相关糖蛋白(MAG，McKerracher等人，Neuron 1994，13，805-811；Mukhopadhyay等人，Neuron 1994，13，757-767)和少突胶质细胞糖蛋白(OM-gp，Mikol和Stefansson，J.Cell.Biol.1988，106，1273-1279)。这些蛋白质各自分别显示为神经元Nogo受体1(“NgR1”)的配体(Wang等人，Nature 2002，417，941-944；Liu等人，Science，2002，297，1190-93；Grandpre等人，Nature 2000，403，439-444；Chen等人，Nature，2000，403，434-439；Domeniconi等人，Neuron，2002，35，283-90)。Nogo-66是来自NogoA的66氨基酸肽，具有抑制神经突长出和引起生长锥萎缩的能力(Fournier等人，Nature 2001，409，341-346)。Nogo受体1(NgR1)是富亮氨酸重复(LRR)蛋白质，所述LRR蛋白质包含侧翼为N端和C端富含半胱氨酸的结构域(分别为LRRNT和LRRCT的8个LRRs，以及LRRCT和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点之间富含Ser-、Thr-、Pro-和Gly-的茎区(CT茎)。NgR1与LINGO-1和p75或Taj(也称为TROY)形成信号复合物。与抑制蛋白质(例如，NogoA，MAG和OM-gp)相互作用后，NgR1复合物转导导致生长锥萎缩和神经突长出抑制的信号。先前研究已显示Nogo受体1的完整LRR区域，包括LRR的C端帽-LRRCT，是配体结合所需的，并且Nogo受体1邻近的CT茎促成与其共受体的相互作用。

轴突损害是许多中枢神经系统(CNS)损伤和多发性硬化症(MS)中的关键病理学，所述CNS损伤例如脊髓损伤、外伤性脑损伤和中风。用于治疗CNS损伤和CNS疾病的近期发展策略是干扰轴突生长抑制，所述轴突生长抑制通过髓鞘蛋白与其轴突受体的相互作用发生，所述轴突受体例如NgR、LINGO-1和p75或Taj。例如，抗NogoA抗体IN-1显示改善大鼠中的功能恢复，所述大鼠已经历脊髓横切。(Lee等人，Nature Reviews 2003，2，1-7。)此外，称为NEP1-40的40残基肽-NogoA拮抗剂，显示减少髓磷脂或Nogo-66对生长锥萎缩和神经突长出的作用，且改善脊髓损伤后的体内结果。(Lee等人，Nature Reviews 2003，2，1-7。)尽管这些反应物已显示治疗CNS损伤的极大希望，但本领域仍需要抑制NgR信号和/或减少髓磷脂介导的生长锥萎缩和/或抑制神经突长出抑制的另外化合物。

发明内容

本发明指向某些Nogo受体、多肽、包括NgR1和NgR2、及其多肽片段用于促进神经突长出、神经元存活和CNS神经元中的轴突再生的用途。本发明的特征在于用于抑制神经突长出抑制、促进神经元存活、和/或促进CNS神经元中的轴突再生的分子和方法。

在某些实施方案中，本发明提供了40个残基或更少的分离多肽片段，所述分离多肽片段包含SEQ ID NO：2的氨基酸309-344，除了高达3个氨基酸置换外。

在某些实施方案中，本发明提供了环状的本发明多肽。在某些实施方案中，环状多肽进一步包含在N端连接的第一分子和在C端连接的第二分子；其中第一分子和第二分子互相连接以形成所述环状分子。在某些实施方案中，第一和第二分子选自：生物素分子、半胱氨酸残基、和乙酰化半胱氨酸残基。在某些实施方案中，第一分子是附着于N端的生物素分子，和第二分子是与本发明多肽的C端附着的半胱氨酸残基。在某些实施方案中，第一分子是附着于N端的乙酰化半胱氨酸残基，以及第二分子是附着于本发明多肽的C端的半胱氨酸残基。在某些实施方案中，第一分子是附着于N端的乙酰化半胱氨酸残基，和第二分子是附着于本发明多肽的C端的半胱氨酸残基。在某些实施方案中，C端半胱氨酸具有附着的NH₂部分。

在某些实施方案中，本发明提供了其中至少一个半胱氨酸残基用不同氨基酸置换的本发明多肽。在某些实施方案中，至少一个半胱氨酸残基是C309。在某些实施方案中，至少一个半胱氨酸残基是C335。在某些实施方案中，至少一个半胱氨酸残基在C336上。在某些实施方案中，至少一个半胱氨酸残基用选自下列的不同氨基酸置换：丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸。在某些实施方案中，不同氨基酸是丙氨酸。

在某些实施方案中，本发明进一步提供了与异源多肽融合的多肽。在某些实施方案中，异源多肽是血清白蛋白。在某些实施方案中，异源多肽是Fc区。在某些实施方案中，异源多肽是信号肽。在某些实施方案中，异源多肽是多肽标记。在某些实施方案中，本发明进一步提供了选自下列的Fc区：IgA Fc区；IgD Fc区；IgG Fc区，IgE Fc区；和IgM Fc区。在某些实施方案中，本发明进一步提供了选自下列的多肽标记：FLAG标记；Strep标记；多组氨酸标记；VSV-G标记；流感病毒血凝素(HA)标记；和c-Myc标记。

在某些实施方案中，本发明提供了附着于一或多种聚二醇部分的本发明多肽。在某些实施方案中，本发明进一步提供了是聚乙二醇(PEG)部分的一或多种聚二醇部分。在某些实施方案中，本发明进一步提供了附着于1-5个PEG部分的本发明多肽。

在某些实施方案中，本发明提供了编码本发明多肽的分离多核苷酸。在某些实施方案中，本发明进一步提供了与表达控制元件(例如诱导型启动子、组成型启动子、或分泌信号)可操作地连接的核苷酸序列。另外的实施方案包括包含本发明分离多核苷酸的载体和包含所述载体的宿主细胞。

本发明的另外实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含本发明的多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞，且在某些实施方案中包含药学可接受的载体。

本发明的实施方案还包括用于促进神经突长出的方法，所述方法包括使神经元与包括本发明多肽、多核苷酸或组合物的制剂接触，其中所述制剂抑制Nogo受体1介导的神经突长出抑制。在某些实施方案中，神经元在哺乳动物中，和在某些实施方案中，哺乳动物是人。

另外的实施方案包括用于抑制通过NgR1信号复合物的信号转导的方法，所述方法包括使神经元与有效量的包括本发明多肽、多核苷酸或组合物的制剂接触，其中所述制剂抑制通过NgR1信号复合物的信号转导。在某些实施方案中，神经元在哺乳动物中，和在某些实施方案中，哺乳动物是人。

其他实施方案包括用于治疗哺乳动物中的中枢神经系统(CNS)疾病、病症或损伤的方法，所述方法包括给需要治疗的哺乳动物施用有效量的包括本发明多肽、多核苷酸或组合物的制剂，其中所述制剂抑制Nogo受体1介导的神经突长出抑制。在某些实施方案中，疾病、病症或损伤选自多发性硬化症、ALS、亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、糖尿病性神经病、中风、外伤性脑损伤、脊髓损伤、视神经炎、青光眼、听力丧失、和肾上腺脑白质营养不良。

附图说明

图1显示不包括GPI结构域(SEQ ID NO：22)的人FL-NgR1序列。LRRNT区域由氨基酸27-73表示。8个LRR区域由氨基酸74-249表示。LRRCT结构域由氨基酸250-310表示。延伸的LRRCT区域由氨基酸311-337表示。茎区由氨基酸338-438表示。在这个研究中确定的二硫键用连接特定Cys残基的黑线指出。游离巯基形式的Cys残基以灰色突出显示。羟脯氨酸(Hyp)残基是双下划线的；糖基化位点是下划线的。信号肽和标记序列未显示。人FL-NgR1的示意图在序列之下显示。

图2A显示各种NgRI蛋白质的SDS PAGE。

图2B显示FL-NgR1的分子排阻层析(SEC)曲线图。

图2C显示ELISA曲线，使用抗NgR1抗体以阻断AP-OMgp和AP-Lingo-1与FL-NgR1的结合。

图3显示吡啶乙基化FL-NgR1的胰蛋白酶肽图。上图，未还原的消化；下图，还原的消化。

图4显示包含NES基团的部分还原肽T1(SEQ ID NO：18)的MS/MS谱。

图5显示来自endo-Asp-N处理的来自FL-NgR1二硫键合的胰蛋白酶肽簇T21/T24/T28/T30的峰2重叠合并质谱。y和b离子是由于源内碎片。该图显示肽T21(SEQ ID NO：19)的部分序列和肽24(SEQ ID NO：20)的全序列。

图6显示来自FL-NgR1的部分还原、NEM-烷化二硫键合的肽簇T21/T24/T28/T30的总离子层析图(TIC)。每个峰中组分的鉴定在表3中列出。

图7显示具有NES基团包含残基335-343的肽T30(SEQ IDNO：21)的MS/MS谱，所述肽由部分还原二硫键合的胰蛋白酶肽335-343和胰蛋白酶肽301-323还原产生。

图8显示肽T21/T24/T28/T30簇中可能的二硫键。该图显示肽T24(SEQ ID NO：20)、T21(SEQ ID NO：27)、T30(SEQ ID NO：28)、T28(SEQ ID NO：29)的全序列。

图9显示肽簇T21/T24/T28/T30中的二硫键。该图显示肽T24(SEQ ID NO：20)、T21(SEQ ID NO：27)、T30(SEQ ID NO：28)、T28(SEQ ID NO：29)的全序列。

图10显示不同NgR形式的蛋白质序列比对。

图11显示吡啶乙基化大鼠NgR1(310)的胰蛋白酶肽图。在图上只标记了形成二硫键的含Cys肽。该图显示了大鼠NgR1的T21(SEQ ID NO：30)、T18(SEQ ID NO：31)和T25(SEQ ID NO：32)。

图12显示来自不同构建体的NgR2和NgR1中的二硫化物结构。该图显示SEQ ID NO：2(人NgR1)的氨基酸27-473、SEQ IDNO：23(大鼠NgR1)的氨基酸27-473和SEQ ID NO：24(人NgR2)的氨基酸31-420。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。在冲突的情况下，将以本申请包括定义为准。除非上下文以别的方式要求，单数术语应当包括复数，和复数术语应当包括单数。本文提及的所有出版物、专利及其他参考文献为了所有目的整体引入作为参考，如每个单个出版物或专利申请特别并个别指出引入作为参考一样。

尽管类似于或等价于本文所述那些的方法和材料可以在本发明的实践或测试中使用，下文还是描述了合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是举例说明性的且不希望是限制性的。本发明的其他特征和优点由于详细描述和权利要求将是显而易见的。

为了进一步限定本发明，提供了下述术语和定义。

应当指出术语“一个”实体指一个或多个那种实体；例如，“免疫球蛋白分子”应当理解表示一个或多个免疫球蛋白分子。像这样，术语“一个”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。

本说明书和权利要求自始至终，单词“包含”指包括任何所述整体或整体群，但不排除任何其他整体或整体群。

如本文使用的，如说明书和权利要求自始至终使用的，术语“由......组成”指包括任何所述整体或整体群，但所述方法、结构或组合物中不能添加另外的整体或整体群。

如本文使用的，如说明书和权利要求自始至终使用的，术语“基本上由......组成”指包括任何所述整体或整体群，和任选包括基本上不改变所述方法、结构或组合物的基本或新型特性的任何所述整体或整体群。

如本文使用的，术语“多肽”意欲包含单数“多肽”以及复数“多肽”，且指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。分子“多肽”指2个或更多氨基酸的任何一条或多条链，且不指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”、或用于指2个或更多氨基酸的一条或多条链的任何其他术语，包括在“多肽”的定义内，和术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个使用，或与这些术语中的任何一个互换使用。术语“多肽”还意欲指多肽的表达后修饰产物，所述修饰包括但不限于，糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基衍生化、蛋白酶剪切、或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以来源于天然生物源或通过重组技术产生，而不必由指定核酸序列翻译。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。

本发明多肽的大小可以为约3个或更多、5个或更多、10个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1,000个或更多、或2000个或更多氨基酸。多肽可以具有限定三维结构，尽管它们不必具有此类结构。具有限定三维结构的多肽称为折叠的，而没有限定三维结构、而是可以采取大量不同构象的多肽称为未折叠的。如本文使用的，术语糖蛋白指与至少一种碳水化合物部分偶联的蛋白质，所述碳水化合物部分经由氨基酸残基的含氧或含氮侧链附着于蛋白质，所述氨基酸残基例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基。

“分离”多肽或其片段、变体或其衍生物意指不在其天然环境中的多肽。并不要求特定水平的纯化。例如，分离多肽可以取自其天然或自然环境。为了本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组生产的多肽和蛋白质被视为分离的，与已通过任何合适技术分离、分馏、或部分或基本上纯化的天然或重组多肽一样。

在本发明中，“多肽片段”指较大多肽的短氨基酸序列。蛋白质片段可以是“独立的”，或包含在其片段形成部分区域的较大多肽内。本发明多肽片段的代表性例子包括例如，长度包含约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约60个氨基酸、约70个氨基酸、约80个氨基酸、约90个氨基酸、和约100个氨基酸或更多的片段。

术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”当指本发明多肽时，包括保留至少某些生物活性的任何多肽。如本文所述多肽可以包括但不限于其中的片段、变体、或衍生物分子，只要多肽仍发挥其功能。本发明的NgR1多肽和多肽片段可以包括蛋白水解片段、缺失片段、和特别是递送给动物时更容易到达作用位点的片段。多肽片段进一步包括多肽的任何部分，所述部分包含天然多肽的抗原或免疫原性表位，包括线性以及三维表位。本发明的NgR1多肽和多肽片段可以包含变体区域，包括如上所述的片段，以及由于氨基酸置换、删除、或插入具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然发生，例如等位基因变体。“等位基因变体”意指占据生物染色体上给定基因座的基因的可替代形式。Genes II，Lewin，B.，ed.，John Wiley&Sons，New York(1985)。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。本发明的NgR1多肽和多肽片段可以包含保守或非保守氨基酸置换、删除或添加。本发明的NgR1多肽和多肽片段还可以包括衍生分子。变体多肽在本文中还可以称为“多肽类似物”。如本文使用的，多肽或多肽片段“衍生物”指具有通过功能侧基反应化学衍生的一个或多个残基的主题多肽。作为“衍生物”还包括的是包含20种标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羟脯氨酸可以置换脯氨酸；5-羟赖氨酸可以置换赖氨酸；3-甲基组氨酸可以置换组氨酸；高丝氨酸可以置换丝氨酸；和鸟氨酸可以置换赖氨酸。

如本文使用的，术语“二硫键”包括2个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与第二个巯基形成二硫键或桥的巯基。

如本文使用的，“融合蛋白”指包含经由肽键与第二多肽线性连接的第一多肽的蛋白质。第一多肽和第二多肽可以是相同或不同的，和它们可以直接连接，或经由肽连接体进行连接(参见下文)。

术语“多核苷酸”意欲包含单数核酸以及复数核酸，且指分离核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含全长cDNA序列的核苷酸序列，包括非翻译5’和3’序列，编码序列。多核苷酸可以包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如，酰胺键，例如在肽核酸(PNA)中发现的)。多核苷酸可以由可以是未修饰RNA或DNA或修饰RNA或DNA的任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸构成。例如，多核苷酸可以由下述构成：单和双链DNA、单和双链区域混合物DNA、单和双链RNA、以及单和双链区域混合物RNA、包含DNA和RNA的杂交分子，所述DNA和RNA可以是单链，或更一般地，双链或单和双链区域混合物。如本文使用的，此外，多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA的三链区域构成。多核苷酸还可以包含一个或多个修饰碱基或出于稳定性或其他原因修饰的DNA或RNA主链。“修饰”碱基包括例如三苯甲基化碱基和稀有碱基例如肌苷。可以对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包含化学、酶促或代谢修饰形式。

术语“核酸”指多核苷酸中存在的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。“分离”核酸或多核苷酸意指已从其天然环境中取出的核酸分子，DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，载体中包含的、编码本发明的NgR多肽或多肽片段的重组多核苷酸被视为分离的。分离多核苷酸的进一步例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸、或在溶液中(部分或基本上)的多核苷酸。分离RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，例如启动子、核糖体结合位点、或转录终止子。

如本文使用的，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但它可以被视为编码区的部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码区的部分。本发明的2个或更多编码区可以呈现于单个多核苷酸构建体中，例如在单个载体上，或在分开的多核苷酸构建体中，例如在分开(不同)的载体上。此外，任何载体可以包含单个编码区，或可以包含2个或更多编码区，例如，单个载体可以分开编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸、或核酸可以编码与编码本发明NgR多肽或多肽片段的核酸融合或未融合的异源编码区。异源编码区包括但不限于特异性元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能结构域。

在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包括与一个或多个编码区可操作地结合的启动子和/或其他转录或翻译控制元件。可操作的结合是当基因产物例如多肽的编码区以这样的方式与一个或多个调节序列结合，使得基因产物的表达置于一种或多种调节序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA转录，和如果2个DNA片段之间连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力，或不干扰DNA模板被转录的能力，那么2个DNA片段(例如，多肽编码区和与之结合的启动子)是“可操作地结合的”。因此，如果启动子能够影响那种核酸的转录，那么启动子区与编码多肽的核酸将是可操作地结合的。启动子可以是指导DNA只在预定细胞中大量转录的细胞特异性启动子。其他转录控制元件，除了启动子外，例如增强子、操纵子、阻遏子、和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地结合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。

各种转录扩增区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于，在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于，来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子A结合)、猴病毒40(早期启动子)、和逆转录病毒(例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因例如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β珠蛋白的那些，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其他序列。另外合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如，可通过干扰素或白介素诱导的启动子)。

类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于，核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子、和来源于微小核糖核酸病毒的元件(特别是内核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。

在其他实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式。

本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外编码区结合，所述分泌或信号肽指导由本发明多核苷酸编码的多肽分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌引导序列，在成长的蛋白质链经过糙面内质网的输出已开始后，所述信号肽或分泌引导序列从成熟蛋白质中切除。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽N端融合的信号肽，所述信号肽从完整或“全长”多肽中切除以产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或保留指导与之可操作地结合的多肽分泌能力的那种多肽的功能衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽，或其功能衍生物。例如，野生型引导序列可以用人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的引导序列代替。

如本文使用的，术语“改造的”包括通过合成方法(例如通过重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶联或这些技术的某些组合)处理核酸或多肽分子。

如本文使用的，术语“连接”或“融合”可互换使用。这些术语指通过无论何种方法包括化学缀合或重组方法，将2个或更多元件或组分连接在一起。“框内融合”指以维持原始ORFs的正确翻译读码框的方式，连接2个或更多个多核苷酸开放读码框(ORFs)以形成连续的较长ORF。因此，重组融合蛋白是包含2个或更多区段的单个蛋白质，所述区段对应由原始ORFs编码的多肽(所述区段在自然界中通常不这样连接)。尽管读码框因此在融合区段各处变成连续的，但区段可以经由例如框内连接体序列在物理或空间上分开。

“连接体”序列是使融合蛋白中的2个多肽编码区隔开的一连串一种或多种氨基酸。一般的连接体包含至少5个氨基酸。另外的连接体包含至少10个或至少15个氨基酸。在某些实施方案中，肽连接体的氨基酸如此选择，使得连接体是亲水的。连接体(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃(SEQ ID NO：3)是可广泛应用于许多抗体的优选连接体，因为它提供足够的弹性。其他连接体包括Glu SerGly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO：4)、Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr(SEQ IDNO：5)、Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln(SEQ ID NO：6)、Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser LysVal Asp(SEQ ID NO：7)、Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser GluGly Lys Gly(SEQ ID NO：8)、Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu GlnLeu Ala Gln Phe Arg Ser Leu Asp(SEQ ID NO：9)、和Glu Ser Gly SerVal Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp(SEQ ID NO：10)。较短连接体的例子包括上述连接体的片段，和较长连接体的例子包括上述连接体的组合、上述连接体片段的组合、和上述连接体与上述连接体片段的组合。

在多肽背景中，“线性序列”或“序列”是多肽中从氨基至羧基末端方向的氨基酸顺序，其中在序列中互相邻近的残基在多肽一级结构中是邻接的。

如本文使用的，术语“表达”指基因通过其产生生化制剂，例如RNA或多肽的过程。该过程包括细胞内基因的功能存在表现，所述表现包括但不限于，基因敲落(gene knockdown)以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物，以及将此类mRNA翻译成一种或多种多肽，以及调节转录或翻译的任何过程。如果最终所需产物是生化制剂，那么表达包括那种生化制剂和任何前体的产生。基因表达产生“基因产物”。如本文使用的，基因产物可以是核酸，例如通过基因转录产生的信使RNA，或由转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物进一步包括具有转录后修饰例如多腺苷酸化的核酸，或具有翻译后修饰的多肽，所述翻译后修饰例如甲基化、糖基化、脂质添加、与其他蛋白质亚单位结合、蛋白酶剪切等。

如本文使用的，术语“治疗”指治疗性处理和预防性措施，其中目的是阻止或减慢(减少)不希望有的生理学变化或病症，例如多发性硬化症的进展。有利或所需临床结果包括但不限于，症状减轻、病变范围减少、疾病状态稳定(即不恶化)、疾病进展延迟或减慢、疾病状态改善或减轻、和好转(无论是部分还是全部)、无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以指与未接受治疗时的预期存活比较延长存活。需要治疗的那些包括已具有病状或病症的那些，以及易于具有病状或病症的那些，或其中待预防病状或病症的那些。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指诊断、预后或治疗对于其是需要的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于，人、家畜、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛；灵长类例如猿、猴、猩猩、和黑猩猩；犬科动物例如狗和狼；猫科动物例如猫、狮子、和老虎；马科动物例如马、驴、和斑马；食物动物例如奶牛、猪、和绵羊；有蹄类动物例如鹿和长颈鹿；啮齿类例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。在某些实施方案中，哺乳动物是人受试者。

如本文使用的，短语例如“将从本发明的NgR多肽或多肽片段施用获益的受试者”和“需要治疗的动物”包括，将从本发明的NgR多肽或多肽片段施用获益的受试者，例如哺乳动物受试者，所述NgR多肽或多肽片段用于例如检测(例如用于诊断程序)和/或治疗，即用本发明的NgR多肽或多肽片段减轻或预防疾病例如MS。如本文更详细地描述的，多肽或多肽片段可以以未缀合形式使用，或可以例如与药物、药物前体或同位素缀合。

如本文使用的，“治疗有效量”指在剂量上和对于所需时间段有效的量，以达到所需治疗结果。治疗结果可以是例如减轻症状、延长存活、改善移动能力等。治疗结果不必是“治愈”。

如本文使用的，“预防有效量”指在剂量上和对于所需时间段有效的量，以达到所需预防结果。一般地，因为预防剂量在疾病早期之前或之时在受试者中使用，所以预防有效量将少于治疗有效量。

本发明指向促进神经元存活、神经突长出和神经元例如CNS神经元轴突再生的某些NgR1多肽和多肽片段。例如，本发明提供了在其中轴突生长通常被抑制的条件下刺激轴突生长的NgR1多肽和多肽片段。因此，本发明的NgR1多肽和多肽片段在治疗损伤、疾病或病症中有用，所述损伤、疾病或病症可以通过促进神经元存活、或通过刺激轴突生长或CNS中的再生减轻。

示例性CNS疾病、病症或损伤包括但不限于，多发性硬化症(MS)、进行性多灶性白质脑病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、脑桥中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大氏病、佩-梅二氏病(PMZ)、球形细胞脑白质营养不良(克腊伯氏病)和华勒变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、脊髓损伤、外伤性脑损伤、放射后损伤、化学疗法神经系统并发症、中风、缺血性视神经病、维生素E缺乏病、单独的维生素E缺乏病、AR、巴-科二氏综合征、马-比二氏综合征、异染性脑白质营养不良、三叉神经痛、和贝耳氏麻痹。在这些疾病中，MS是最普遍的，影响全世界约2.5百万人。

NgR多肽和多肽片段

本发明指向对例如促进神经突长出、促进神经元存活、促进轴突存活、或抑制通过NgR信号复合物的信号转导有用的某些Nogo受体多肽，包括NgR1和NgR2，和多肽片段。一般地，本发明的多肽和多肽片段用于阻断NgR介导的神经元存活、神经突长出或中枢神经系统(CNS)神经元的轴突再生抑制。

人NgR1多肽在下文显示为SEQ ID NO：2且是Genbank中的登记号NP 075380。

全长人NgR1(SEQ ID NO：2)：

MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPVGIPAASQRIFLHGNRISHVPAASFRACRNLTILWLHSNVLARIDAAAFTGLALLEQLDLSDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNALQALPDDTFRDLGNLTHLFLHGNRISSVPERAFRGLHSLDRLLLHQNRVAHVHPHLAFRDLGRLMTLYLFANNLSALPTEALAPLRALQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRLAGRDLKRLAANDLQGCAVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDSPPGNGSGPRHINDSPFGTLPGSAEPPLTAVRPEGSEPPGFPTSGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGGGGTGDSEGSGALPSLTCSLTPLGLALVLWTVLGPC

大鼠NgR1多肽在下文显示为SEQ ID NO：23且是Genbank中的登记号NP_446065。

全长大鼠NgR1(SEQ ID NO：23)：

MKRASSGGSRLLAWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPTGIPASSQRIFLHGNRISHVPAASFQSCRNLTILWLHSNALARIDAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLHVVDPTTFHGLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLTHLFLHGNRIPSVPEHAFRGLHSLDRLLLHQNHVARVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSMLPAEVLMPLRSLQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCNLPQRLADRDLKRLAASDLEGCAVASGPFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDTPPGNGSGPRHINDSPFGTLPSSAEPPLTALRPGGSEPPGLPTTGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGASGTGDAEGSGALPALACSLAPLGLALVLWTVLGPC

人NgR2多肽在下文显示为SEQ ID NO：24且是Genbank中的登记号NP_848665。

全长人NgR2(SEQ ID NO：24)：

MLPGLRRLLQAPASACLLLMLLALPLAAPSCPMLCTCYSSPPTVSCQANNFSSVPLSLPPSTQRLFLQNNLIRTLRPGTFGSNLLTLWLFSNNLSTIYPGTFRHLQALEELDLGDNRHLRSLEPDTFQGLERLQSLHLYRCQLSSLPGNIFRGLVSLQYLYLQENSLLHLQDDLFADLANLSHLFLHGNRLRLLTEHVFRGLGSLDRLLLHGNRLQGVHRAAFRGLSRLTILYLFNNSLASLPGEALADLPSLEFLRLNANPWACDCRARPLWAWFQRARVSSSDVTCATPPERQGRDLRALREADFQACPPAAPTRPGSRARGNSSSNHLYGVAEAGAPPADPSTLYRDLPAEDSRGRQGGDAPTEDDYWGGYGGEDQRGEQMCPGAACQAPPDSRGPALSAGLPSPLLCLLLLVPHHL

在一个实施方案中，本发明提供了40个残基或更少的分离多肽片段，其中所述多肽片段包含等同于SEQ ID NO：2氨基酸309-344的氨基酸序列，除了高达1、2、3、4、10或20个单个氨基酸置换外。

“NgR1参考氨基酸序列”、“NgR2参考氨基酸序列”、或“参考氨基酸序列”意指没有引入任何氨基酸置换的指定序列。如本领域普通技术人员应当理解的，如果不存在置换，那么本发明的“分离多肽”包含等同于参考氨基酸序列的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供了40个残基或更少的分离多肽片段，其中所述多肽片段包含等同于SEQ ID NO：2氨基酸309-344的氨基酸序列，除了高达3个单个氨基酸置换外。

在另一个实施方案中，本发明提供了40个残基或更少的分离多肽片段，其中所述多肽片段包含下述序列、由下述序列组成、或基本上由下述序列组成：等同于SEQ ID NO：2氨基酸309-344的氨基酸序列，除了高达1、2或3个氨基酸置换外。

根据这个实施方案关于多肽片段的示例性氨基酸置换包括用不同氨基酸置换在本发明多肽中的单个半胱氨酸残基。本发明多肽中的半胱氨酸残基可以用任何异源氨基酸置换。使用何种不同氨基酸取决于众多标准，例如，置换对多肽片段构象的影响、多肽片段的电荷、或多肽片段的亲水性。关于本发明多肽和参考氨基酸序列的氨基酸的氨基酸置换可以包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。置换参考氨基酸中的半胱氨酸的一般氨基酸包括丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸，特别是丙氨酸。通过改造编码多肽片段的多核苷酸进行此类置换完全在本领域普通技术人员的常规专业知识内。在某些实施方案中，半胱氨酸用最不可能改变多肽三维构象的小的不带电氨基酸置换，所述氨基酸例如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸。在某些实施方案中，置换氨基酸是丙氨酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了其中至少一个半胱氨酸残基用不同氨基酸置换的本发明的分离多肽。可以被置换的半胱氨酸残基包括但不限于C27、C31、C33、C43、C80、C140、C264、C266、C287、C309、C335、C336、C419、C429、C455和C473。本发明进一步提供了40个残基或更少的分离多肽片段，其中所述多肽片段包含等同于SEQ ID NO：2氨基酸309-344的氨基酸序列，除了：C309被置换、C335被置换、C336被置换、C309和C335被置换、C309和C336被置换、C335和C336被置换、或C309、C335和C336被置换。

在一个方面，本发明包括在融合蛋白中包含2个或更多如上所述的多肽片段的多肽，以及包含与异源氨基酸序列融合的如上所述的多肽片段的融合蛋白。本发明进一步包含如上所述的多肽片段的变体、类似物或衍生物。

在本发明中，多肽可以由通过肽键或修饰的肽键互相连接的氨基酸构成，即肽同电子排列体，且可以包含除20种基因编码氨基酸以外的氨基酸(例如非天然存在的氨基酸)。本发明的多肽可以通过天然过程例如翻译后加工，或通过本领域众所周知的化学修饰技术进行修饰。此类修饰在基础教科书中和更详细的专题论文中，以及庞大的研究文献中充分描述。修饰可以在多肽中的任何地方发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基端。应当理解相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽的几个位点上。同样，给定多肽可以包含许多类型的修饰。多肽可以是分支的，例如作为遍在蛋白化的结果，且它们可以是环状的，含或不含分支。环状、分支、和分支环状多肽可以由翻译后的自然过程产生，或可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、亚铁血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、共价交联形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸盐形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋作用、selenoylation、硫酸盐化作用、转移RNA介导的向蛋白质中添加氨基酸例如精氨酰化、和遍在蛋白化。(参见，例如，Proteins-Structure AndMolecular Properties，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman andCompany，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modificationof Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，第1-12页(1983)；Seifter等人，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Rattan等人，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992).)。

本文所述多肽可以是环状的。多肽环化减少了线性肽的构象自由度且导致结构上更受限制的分子。许多肽环化方法是本领域已知的。例如，“主链至主链”环化通过在肽的N端和C端氨基酸残基之间形成酰胺键。“主链至主链”环化方法包括在2个ω硫代氨基酸残基(例如半胱氨酸、高半胱氨酸)之间形成二硫桥。本发明的某些肽包括在肽的N和C端上的修饰以形成环状多肽。此类修饰包括但不限于，半胱氨酸残基、乙酰化半胱氨酸残基、具有NH₂部分和生物素的半胱氨酸残基。其他肽环化方法在Li和Roller.Curr.Top.Med.Chem.3：325-341(2002)中描述，所述参考文献整体引入本文作为参考。

在本发明的方法中，本发明的NgR1多肽或多肽片段可以作为预先形成的多肽直接使用，或通过核酸载体间接施用。在本发明的某些实施方案中，本发明的NgR1多肽或多肽片段在治疗方法中施用，所述治疗方法包括：(1)用核酸例如载体转化或转染可植入的宿主细胞，所述核酸表达本发明的NgR1多肽或多肽片段；和(2)在疾病、病症或损伤位点处将转化的宿主细胞植入哺乳动物内。例如，转化的宿主细胞可以在MS的慢性损害位点处植入。在本发明的某些实施方案中，可植入的宿主细胞从哺乳动物中取出、暂时培养、用编码本发明的NgR1多肽或多肽片段的分离核酸转化或转染、且植回到它从中取出的相同哺乳动物内。细胞可以但无需从它植入的相同位点处取出。此类实施方案有时称为离体基因疗法，可以提供集中在作用位点、用于有限时间段的本发明的NgR1多肽或多肽片段的连续供应。

本发明的另外示例性NgR多肽、以及为了实践本发明用于获得这些方法的方法和材料在下文描述。

融合蛋白和缀合多肽

本发明的某些实施方案包括与异源多肽部分融合以形成融合蛋白的NgR多肽的使用，所述NgR多肽是非全长NgR蛋白质例如NgR的多肽片段。此类融合蛋白可以用于实现各种目的，例如增加血清半衰期、改善生物利用度、体内靶向特定器官或组织类型、改善重组表达效率、改善宿主细胞分泌、易于纯化、和更高的亲合力。取决于待实现的目的，异源部分可以是惰性或生物学活性的。同样，它可以选择与本发明的NgR多肽部分稳定融合，或在体外或体内是可切割的。实现这些其他目的的异源部分是本领域已知的。

作为融合蛋白表达的可替代方案，所选异源部分可以预先形成且与本发明的NgR多肽部分化学缀合。在大多数情况下，无论与NgR多肽部分融合还是缀合，所选异源部分都将类似地发挥作用。因此，在异源氨基酸序列的下述讨论中，除非另有说明，应当理解异源序列可以以融合蛋白的形式或作为化学缀合物与NgR多肽部分连接。

药理学活性多肽例如NgR多肽可以显示快速的体内清除率、使大剂量成为必要以在体内达到治疗有效浓度。此外，小于约60kDa的多肽可能经历肾小球过滤，这有时导致肾毒性。相对较小的多肽例如NgR信号结构域的多肽片段的融合或缀合，可以用于减少或避免此类肾毒性的危险。用于增加治疗多肽的体内稳定性，即血清半衰期的各种异源氨基酸序列，即多肽部分或“载体”是已知的。例子包括血清白蛋白例如，牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)。

由于其长半衰期、在体内广泛分布、和缺乏酶促或免疫功能，基本上全长的人血清白蛋白(HSA)或HSA片段通常用作异源部分。通过应用方法和材料例如Yeh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：1904-08(1992)和Syed等人，Blood 89：3243-52(1997)中教导的那些，HSA可以用于形成融合蛋白或多肽缀合物，所述融合蛋白或多肽缀合物显示由于NgR多肽部分的药理学活性，同时显示显著增加的体内稳定性，例如高10倍至100倍。HSA的C端可以与NgR多肽部分的N端融合。因为HSA是天然分泌的蛋白质，所以当融合蛋白在真核例如哺乳动物表达系统中生产时，HSA信号序列可以用于将融合蛋白分泌到细胞培养基内。

在某些实施方案中，用于在本发明方法中使用的NgR多肽进一步包含靶向部分。靶向部分包括指导定位至身体某一部分例如脑或其中的区室的蛋白质或肽。在某些实施方案中，用于在本发明方法中使用的NgR多肽与脑靶向部分附着或融合。脑靶向部分共价附着(例如，直接、翻译融合、或直接通过化学键或通过间隔分子，所述间隔分子可以任选是可切割的)或非共价附着(例如，通过可逆相互作用例如抗生物素蛋白：生物素，蛋白A：IgG等)。在其他实施方案中，用于在本发明方法中使用的NgR多肽附着于一种或多种脑靶向部分。在另外的实施方案中，脑靶向部分附着于用于在本发明方法中使用的多个NgR多肽。

与NgR多肽结合的脑靶向部分增强此类NgR多肽的脑递送。当与蛋白质或治疗剂融合时，穿过血脑屏障(BBB)递送蛋白质或治疗剂的许多多肽已得到描述。非限制性例子包括单结构域抗体FC5(Abulrob等人(2005)J.Neurochem.95，1201-1214)；mAB 83-14，针对人胰岛素受体的单克隆抗体(Pardridge等人(1995)Pharmacol.Res.12，807-816)；与人转铁蛋白受体(hTfR)结合的B2、B6和B8肽(Xia等人(2000)J Virol.74，11359-11366)；针对转铁蛋白受体的OX26单克隆抗体(Pardridge等人(1991)J.Pharmacol.Exp.Ther.259，66-70)；白喉毒素缀合物(参见，例如，Gaillard等人，International Congress Series 1277：185-198(2005)；和美国专利号6,306,365的SEQ ID NOs：1-18。上述参考文献的内容整体引入本文作为参考。

NgR组合物的增强脑递送通过本领域良好建立的许多方法来确定。例如，给动物施用与脑靶向部分连接的放射性标记的NgR多肽；测定脑定位；和与未结合脑靶向部分的等价放射性标记NgR多肽的定位比较。测定增强靶向的其他方法在上述参考文献中得到描述。

本发明的某些实施方案使用与铰链和Fc区，即Ig重链恒定区的C端部分融合的NgR多肽部分。在某些实施方案中，铰链区中的氨基酸可以用不同氨基酸置换。根据这些实施方案关于铰链区的示例性氨基酸置换包括用不同氨基酸置换铰链区中的单个半胱氨酸残基。任何不同氨基酸都可以置换铰链区中的半胱氨酸。关于本发明多肽和参考氨基酸序列的氨基酸的氨基酸置换可以包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。置换参考氨基酸中的半胱氨酸的一般氨基酸包括丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸，特别是丝氨酸和丙氨酸。通过改造编码多肽片段的多核苷酸进行此类置换完全在本领域普通技术人员的常规专业知识内。

NgR-多肽-Fc融合的潜在优点包括溶解性、体内稳定性、和多价例如二聚作用。使用的Fc区可以是IgA、IgD或IgG Fc区(铰链-CH2-CH3)。可替代地，它可以是IgE或IgM Fc区(铰链-CH2-CH3-CH4)。一般使用IgG Fc区，例如IgG1Fc区或IgG4Fc区。用于构建和表达编码Fc区的DNA的材料和方法是本领域已知的，且无需过度实验即可应用以获得融合。本发明的某些实施方案使用融合蛋白，例如Capon等人，美国专利号5,428,130和5,565,335中所述的那些。

信号序列是编码氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列起始蛋白质运输穿过内质网膜。对于构建免疫融合(immunofusin)有用的信号序列包括抗体轻链信号序列，例如抗体14.18(Gillies等人，J.Immunol.Meth..125：191-202(1989))，抗体重链信号序列，例如MOPC141抗体重链信号序列(Sakano等人，Nature 286：5774(1980))。可替代地，可以使用其他信号序列。参见，例如，Watson，Nucl.Acids Res.12：5145(1984)。信号肽通常在内质网腔内通过信号肽酶进行切割。这导致包含FC区和NgR多肽部分的免疫融合蛋白分泌。

在某些实施方案中，DNA序列可以编码分泌盒和NgR多肽部分之间的蛋白酶剪切位点。此类切割位点可以例如提供编码融合蛋白的蛋白酶剪切，从而分离Fc结构域与靶蛋白。有用的蛋白酶剪切位点包括由蛋白水解酶识别的氨基酸序列，所述蛋白水解酶例如胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子Xa、或肠激酶K。

分泌盒可以整合入可复制的表达载体内。有用的载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒等。示例性表达载体是pdC，其中免疫融合DNA的转录置于人巨细胞病毒的增强子和启动子的控制下。参见例如，Lo等人，Biochim.Biophvs.Acta 1088：712(1991)；和Lo等人，Protein Engineering 11：495-500(1998)。合适的宿主细胞可以用编码本发明的NgR1多肽或多肽片段的DNA转化或转染，且用于表达和分泌多肽。一般使用的宿主细胞包括永生化杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、和COS细胞。

非常完整的野生型Fc区显示在本发明方法中使用的Fc融合蛋白中通常不必要和不希望有的效应子作用。因此，某些结合位点一般在分泌盒构建期间从Fc区中删除。例如，因为与轻链的共表达是不必要的，所以关于重链结合蛋白的结合位点Bip(Hendershot等人，Immunol.Today 8：111-14(1987))，从IgE Fc区的CH2结构域中删除，从而使得这个位点不干扰免疫融合物的有效分泌。跨膜结构域序列例如IgM中存在的那些一般也被删除。

IgG1Fc区是最常使用的。可替代地，免疫球蛋白γ其他亚类(γ2、γ3和γ4)的Fc区可以在分泌盒中使用。免疫球蛋白γ1的IgG1Fc区一般在分泌盒中使用，且包括至少部分铰链区、CH2区、和CH3区。在某些实施方案中，免疫球蛋白γ1的Fc区是CH2-缺失-Fc，这包括部分铰链区和CH3区，而不包括CH2区。CH2-缺失-Fc已由Gillies等人，Hum.Antibod.Hybridomas 1：47(1990)描述。在某些实施方案中，使用IgA、IgD、IgE或IgM之一的Fc区。

NgR-多肽-部分-Fc融合蛋白可以以几种不同构型进行构建。在一种构型中，NgR多肽部分的C端与Fc铰链部分的N端直接融合。在略微不同的构型中，短多肽例如2-10个氨基酸，在NgR多肽部分的N端与Fc部分的C端之间整合入融合物内。在可替代的构型中，短多肽在NgR多肽部分的C端与Fc部分的N端之间整合入融合物内。此类连接体提供了构象弹性，这在某些情况下可以改善生物活性。如果足够部分的铰链区保留在Fc部分中，那么NgR-多肽-部分-Fc融合物将二聚化，从而形成二价分子。单体Fc融合物的同质群体将产生单特异性、二价二聚体。各自具有不同特异性的2种单体Fc融合物的混合物将产生双特异性、二价二聚体。

包含相应氨基反应基团和巯基反应基团的许多交联剂中的任何一种可以用于使本发明的NgR1多肽或多肽片段与血清白蛋白连接。合适连接体的例子包括插入巯基反应马来酰亚胺的胺反应交联剂，例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS和GMBS。其他合适的连接体插入巯基反应卤素乙酸盐(haloacetate)基团，例如SBAP、SIA、SIAB。提供保护或未保护巯基的连接体包括SPDP、SMPT、SATA和SATP，所述巯基用于与氢硫基反应以产生可还原键。此类制剂是商购可得的(例如，Pierce Chemical Company，Rockford，IL)

缀合不必涉及本发明的NgR1多肽或多肽片段的N端或血清白蛋白上的巯基部分。例如，NgR-多肽-白蛋白融合物可以使用遗传工程技术获得，其中NgR多肽部分在其N端、C端或两者上与血清白蛋白基因融合。

本发明的NgR多肽可以与多肽标记融合。如本文使用的，术语“多肽标记”意指可以与NgR多肽附着、连接或结合，且可以用于鉴定、纯化、浓缩或分离NgR多肽的任何氨基酸序列。多肽标记附着于NgR多肽可以例如通过构建核酸分子来发生，所述核酸分子包含：(a)编码多肽标记的核酸序列，和(b)编码NgR多肽的核酸序列。示例性多肽标记包括例如，能够进行翻译后修饰的氨基酸序列，例如被生物素化的氨基酸序列。其他示例性多肽标记包括例如，能够由抗体(或其片段)或其他特异性结合剂识别和/或结合的氨基酸序列。能够由抗体(或其片段)或其他特异性结合剂识别的多肽标记包括，例如本领域称为“表位标记”的那些。表位标记可以是天然或人工附加表位。天然和人工表位标记是本领域已知的，包括例如人工表位例如FLAG、Strep、或多组氨酸肽。FLAG肽包括序列Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO：11)或Asp-Tyr-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO：12)(Einhauer，A和Jungbauer，A.，J Biochem.Biophys.Methods 49：1-3：455-465(2001))。Strep表位具有序列Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO：13)。VSV-G表位也可以使用且具有序列Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys(SEQ ID NO：14)。另一种人工表位是具有6个组氨酸残基的多His序列(His-His-His-His-His-His(SEQ ID NO：15)。天然存在的表位包括由单克隆抗体12CA5(Murray等人，Anal.Biochem.229：170-179(1995))识别的流感病毒血凝素(HA)序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg(SEQ ID NO：16)，和由单克隆抗体9E10识别、来自人c-myc(Myc)的11个氨基酸序列(Glu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn(SEQ IDNO：17)(Manstein等人，Gene 162：129-134(1995))。另一种有用的表位是由单克隆抗体YL 1/2识别的三肽Glu-Glu-Phe。(Stammers等人FEBS Lett.253：298-302(1991))。

在某些实施方案中，NgR多肽和多肽标记可以经由连接氨基酸序列进行连接。如本文使用的，“连接氨基酸序列”可以是能够由一种或多种蛋白酶识别和/或切割的氨基酸序列。可以由一种或多种蛋白酶识别和/或切割的氨基酸序列是本领域已知的。示例性氨基酸序列是由下述蛋白酶识别的那些：因子VIIa，因子IXa，因子Xa，APC，t-PA，u-PA，胰蛋白酶，糜蛋白酶，肠激酶，胃蛋白酶，组织蛋白酶B、H、L、S、D，组织蛋白酶G，高血压蛋白原酶，血管紧张素转化酶，基质金属蛋白酶(胶原酶、间质溶解素、明胶酶)，巨噬细胞弹性酶、Cir和Cis。可以由前述蛋白酶识别的氨基酸序列是本领域已知的。由某些蛋白酶识别的示例性序列可以例如在美国专利号5,811,252中找到。

多肽标记可以促进使用商购可得层析介质的纯化。

在本发明的某些实施方案中，NgR多肽融合构建体用于增强NgR多肽部分在细菌中的生产。在此类构建体中，通常以高水平表达和/或分泌的细菌蛋白用作本发明的NgR1多肽或多肽片段的N端融合配偶体。参见，例如Smith等人，Gene 67：31(1988)；Hopp等人，Biotechnology 6：1204(1988)；La Vallie等人，Biotechnology11：187(1993)。

通过在合适的融合配偶体的氨基和羧基端上融合NgR多肽部分，可以获得二价或四价形式的本发明的NgR1多肽或多肽片段。例如，NgR多肽部分可以与Ig部分的氨基和羧基端融合，以产生包含2个NgR多肽部分的二价单体多肽。这些单体中的2个由于Ig部分二聚化后，获得四价形式的NgR多肽。此类多价形式可以用于达到对于靶的结合亲和力增加。本发明的多价形式的NgR1多肽或多肽片段可以通过使NgR多肽部分串联放置形成多联体来获得，所述多联体可以单独使用或与融合配偶体例如Ig或HSA融合。

缀合聚合物(而非多肽)

本发明的某些实施方案涉及其中一种或多种聚合物与NgR多肽缀合(共价连接)的本发明的NgR1多肽或多肽片段。适合于此类缀合的聚合物例子包括多肽(上文讨论的)、糖聚合物和聚二醇链。一般地，但不一定地，为了改善下述一种或多种的目的使聚合物与本发明的NgR1多肽或多肽片段缀合：溶解性、稳定性、或生物利用度。

一般用于与本发明的NgR1多肽或多肽片段缀合的聚合物种类是聚二醇。聚乙二醇(PEG)是最常使用的。与单独的NgR多肽比较，PEG部分例如1、2、3、4或5个PEG聚合物，可以与每种NgR多肽缀合以增加血清半衰期。PEG部分是非抗原性并且基本上是生物学惰性的。本发明实践中使用的PEG部分可以是分支的或未分支的。

附着于NgR多肽的PEG部分的数目以及个别PEG链的分子量可以不同。一般而言，聚合物的分子量越高，与多肽附着的聚合物链就越少。通常地，与NgR多肽或多肽片段附着的总聚合物质量为20kDa-40kDa。因此，如果附着1条聚合物链，那么链的分子量一般为20kDa-40kDa。如果附着2条链，那么每条链的分子量一般为10-20kDa。如果附着3条链，那么分子量一般为7-14kD。

聚合物例如PEG可以通过多肽上任何合适的、暴露的反应基团与NgR多肽连接。暴露的一种或多种反应基团可以是例如，内部赖氨酸残基的N端氨基或ε氨基，或两者。活化聚合物可以在NgR多肽上任何游离氨基处反应和共价连接。NgR多肽(如果可用)的游离羧基、适当活化的羰基、羟基、胍基、咪唑、氧化碳水化合物部分和氢硫基也可以用作反应基团用于聚合物附着。

在缀合反应中，取决于多肽浓度，一般使用约1.0-约10摩尔活化聚合物/摩尔多肽。通常，所选比率表示使反应最大化同时使副反应(通常是非特异性的)最小化之间的平衡，所述副反应可以损害NgR多肽部分的所需药理学活性。优选地，保留NgR多肽的至少50％生物活性(如证实的，例如在本文所述或本领域已知的任何测定法中)，且最优选保留几乎100％。

聚合物可以使用常规化学与NgR多肽缀合。例如，聚二醇部分可以与NgR多肽的赖氨酸ε氨基偶联。与赖氨酸侧链的连接可以用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯例如PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA-PEG)来进行。合适的聚二醇部分包括例如羧甲基-NHS和正亮氨酸-NHS，SC。这些制剂是商购可得的。另外的胺反应PEG连接体可以置换琥珀酰亚胺部分。这些包括例如异硫氰酸酯、羟基苯碳酸酯(PNP)、环氧化物、苯并三唑碳酸酯、SC-PEG、三氟乙基磺酸酯、醛、环氧化物、碳酰基咪唑和PNP碳酸酯。条件通常进行优化以使反应的选择性和程度最大化。此类反应条件的优化在本领域普通技术人员范围内。

PEG化可以通过本领域已知的任何PEG化反应来进行。参见，例如，Focus on Growth Factors，3：4-10，1992以及欧洲专利申请EP 0 154 316和EP 0 401 384。PEG化可以使用与反应聚乙二醇分子(或类似的反应水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应来进行。

通过酰化作用的PEG化一般涉及聚乙二醇活性酯衍生物的反应。任何反应性PEG分子都可以在PEG化中使用。酯化成N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)的PEG是经常使用的活化PEG酯。如本文使用的，“酰化”包括但不限于治疗蛋白质和水溶性聚合物例如PEG之间下述类型的连接：酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯等。参见，例如，Bioconjugate Chem.5：133-140，1994。一般选择反应参数，以避免会损害或灭活NgR多肽的温度、溶剂和pH条件。

一般地，连接键是酰胺且一般至少95％的所得产物是单、二或三PEG化的。然而，可以形成具有更高PEG化程度的某些种类，其量取决于使用的特异性反应条件。任选地，纯化的PEG化种类通过常规纯化方法与混合物特别是未反应的种类分开，所述纯化方法包括例如透析、盐析、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水交换层析、和电泳。

通过烷化的PEG化一般涉及在还原剂的存在下，使PEG的末端醛衍生物与本发明的NgR1多肽或多肽片段反应。此外，可以操纵反应条件以促成基本上只在NgR多肽的N端氨基上的PEG化，即单PEG化蛋白质。在单PEG化或多PEG化的任一情况下，PEG基团一般经由-CH2-NH-基团附着于蛋白质。其中具体提及-CH2-基团，这种类型的连接称为“烷基”连接。

经由还原烷化以产生N端靶向单PEG化产物的衍生化使用可用于衍生化的不同类型伯氨基团(赖氨酸对N端)的差异反应性。该反应在允许利用赖氨酸残基的ε氨基和蛋白质N端氨基之间的pKa差异的pH下进行。通过此类选择性衍生化，控制包含反应基团例如醛的水溶性聚合物与蛋白质的附着：与聚合物的缀合主要在蛋白质的N端发生，且不发生其他反应基团例如赖氨酸侧链氨基的显著修饰。

在酰化和烷化方法中使用的聚合物分子选自水溶性聚合物中。所选聚合物一般是修饰的以具有单个反应基团，例如活性酯用于酰化或醛用于烷化，从而使得聚合程度可以如本方法中提供的进行控制。示例性反应PEG醛是水溶性的聚乙二醇丙醛，或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参见，例如Harris等人，美国专利号5,252,714)。聚合物可以是分支的或未分支的。对于酰化反应，所选的一种或多种聚合物一般具有单个反应酯基团。对于还原烷化，所选的一种或多种聚合物一般具有单个反应醛基团。一般地，水溶性聚合物将不选自天然存在的糖基，因为这些通常通过哺乳动物重组表达系统更方便地进行制备。

用于制备本发明的PEG化NgR多肽的方法一般包括下述步骤：(a)在可以使分子变得与一个或多个PEG基团附着的条件下，使本发明的NgR1多肽或多肽片段与聚乙二醇(例如PEG的反应酯或醛衍生物)反应，和(b)获得一种或多种反应产物。一般而言，关于酰化反应的最佳反应条件将基于已知参数和所需结果根据具体情况进行确定。例如，PEG与蛋白质的比率越大，一般所产生的多PEG化产物的百分比越大。

产生单聚合物/NgR多肽的基本上同质群体的还原烷化一般包括下述步骤：(a)在还原烷化条件下，在适合于允许NgR的N端氨基选择性修饰的pH下，使本发明的NgR1多肽或多肽片段与反应性PEG分子反应；和(b)获得一种或多种反应产物。

对于单聚合物/NgR多肽的基本上同质群体，还原烷化反应条件是允许水溶性聚合物部分与本发明的NgR1多肽或多肽片段的N端选择性附着的那些条件。此类反应条件一般提供赖氨酸侧链氨基和N端氨基之间的pKa差异。为了本发明的目的，pH一般为3-9，一般为3-6。

本发明的NgR多肽可以包括标记，例如，可以通过蛋白质水解随后释放的部分。因此，赖氨酸部分可以通过下述方法选择性修饰：首先使修饰的His标记与低分子量连接体例如Traut′s制剂(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)反应，所述Traut′s制剂将与赖氨酸和N端反应，和随后释放His标记。多肽随后将包含游离SH基团，所述游离SH基团可以用包含巯基反应性首基的PEG选择性修饰，所述巯基反应性首基例如马来酰亚胺基团、乙烯砜基团、卤素乙酸酯基团、或游离或保护的SH。

Traut′s制剂可以用将建立用于PEG附着的特异性位点的任何连接体替换。例如，Traut′s制剂可以用SPDP、SMPT、SATA或SATP(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)替换。类似地，可以使蛋白质与胺反应连接体反应，所述胺反应连接体插入马来酰亚胺(例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS或GMBS)、卤素乙酸酯基团(SBAP、SIA、SIAB)、或乙烯砜基团，和使所得到的产物与包含游离SH的PEG反应。

在某些实施方案中，聚二醇部分与NgR多肽的半胱氨酸基团偶联。偶联可以使用例如马来酰亚胺基团、乙烯砜基团、卤素乙酸酯基团、或巯基来完成。

任选地，NgR多肽经由不稳定键与聚乙二醇部分缀合。不稳定键可以在例如生物化学水解、蛋白质水解或硫氢基切割中进行切割。例如，键可以在体内(生理学)条件下进行切割。

反应可以通过任何合适的方法来发生，所述方法用于使生物学活性材料与惰性聚合物反应，如果反应基团在N端的α氨基上，那么一般在pH 5-8下，例如pH 5、6、7或8。一般地该过程涉及制备活化聚合物，此后使蛋白质与活化聚合物反应，以产生适合于配制的可溶蛋白。

在某些实施方案中，本发明的NgR多肽是可溶多肽。用于使得多肽可溶或改善多肽溶解性的方法是本领域众所周知的。

多核苷酸

本发明还包括编码本发明的任何一种NgR多肽的分离多核苷酸。本发明还包括在中等严格或高度严格条件下，与编码本发明任何一种多肽的多核苷酸的非编码链或互补链杂交的多核苷酸。严格条件是本领域技术人员已知的，且可以在CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley和Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。

人Nogo受体1多核苷酸在下文显示为SEQ ID NO：1。

全长人Nogo受体1由SEQ ID NO：1的核苷酸166-核苷酸1587编码：

大鼠Nogo受体1多核苷酸在下文显示为SEQ ID NO：25，且是Genbank中的登记号NM_053613。

人Nogo受体2多核苷酸在下文显示为SEQ ID NO：26，且是Genbank中的登记号BK001302。

载体

包含编码本发明NgR多肽的核酸的载体也可以用于生产在本发明方法中使用的多肽。此类核酸与之可操作地连接的载体和表达控制序列的选择取决于所需功能特性，例如蛋白质表达、和待转化的宿主细胞。

用于调节可操作地连接的编码序列表达的表达控制元件是本领域已知的。例子包括但不限于，诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号、和其他调节元件。当使用诱导型启动子时，它可以例如通过宿主细胞培养基中的营养状态变化或温度变化来控制。

载体可以包括原核复制子，即具有在细菌宿主细胞中指导染色体外重组DNA分子自主复制和维持能力的DNA序列。此类复制子是本领域众所周知的。此外，包括原核复制子的载体还可以包括其表达给予可检测标记例如药物抗性的基因。细菌耐药性基因的例子是给予针对氨苄青霉素或四环素抗性的那些。

包括原核复制子的载体还可以包括原核或噬菌体启动子，用于指导编码基因序列在细菌宿主细胞中表达。与细菌宿主相容的启动子序列一般在质粒载体中提供，所述质粒载体包含用于插入待表达的DNA区段的方便的限制位点。此类质粒载体的例子是pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(BioRad Laboratories，Hercules，CA)、pPL和pKK223。任何合适的原核宿主可以用于表达在本发明方法中使用的编码蛋白质的重组DNA分子。

为了本发明的目的，可以使用众多表达载体系统。例如，一类载体使用来源于动物病毒的DNA元件，所述动物病毒例如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其他涉及含内核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。此外，DNA已整合到其染色体内的细胞可以通过引入一种或多种标记来选择，所述标记允许选择转染的宿主细胞。标记可以对营养缺陷型宿主提供原养，杀生物剂抗性(例如抗生素)或针对重金属例如铜的抗性。可选标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接，或通过共转化引入相同细胞内。新霉素磷酸转移酶(neo)基因是可选标记基因的例子(Southern等人，J.Mol.Anal.Genet.1：327-341(1982))。另外的元件也可能是mRNA最佳合成所需的。这些元件可以包括信号序列、剪接信号、以及转录启动子、增强子和终止信号。

在一个实施方案中，可以使用称为NEOSPLA(美国专利6,159,730)的Biogen IDEC，Inc.有专利权的表达载体。这种载体包含巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β珠蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和引导序列。这种载体已发现在CHO细胞中转染后导致非常高水平的表达，随后在含G418的培养基中选择和氨甲蝶呤扩增。当然，能够在真核细胞中引起表达的任何表达载体可以在本发明中使用。合适载体的例子包括但不限于，质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen，San Diego，CA获得)和质粒pCI(可从Promega，Madison，WI获得)。另外的真核细胞表达载体是本领域已知的且是商购可得的。一般地，此类载体包含用于插入所需DNA区段的方便的限制位点。示例性载体包括pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1、pm12d  (InternationalBiotechnologies)、pTDT1(ATCC 31255)、逆转录病毒表达载体pMIG和pLL3.7、腺病毒穿梭载体pDC315、和AAV载体。其他示例性载体系统公开于例如美国专利6,413,777中。

一般而言，在大量转化细胞中筛选表达适当高水平的拮抗剂的那些是常规实验法，所述常规实验法可以例如通过机器人系统来进行。

对于哺乳动物宿主细胞表达常用的调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白质表达的病毒元件，例如来源于逆转录病毒LTRs、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdmlP))、多瘤病毒的启动子和增强子，以及强哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如，Stinski，美国专利号5,168,062；Bell，美国专利号4,510,245；和Schaffher，美国专利号4,968,615。

重组表达载体可以携带调节载体在宿主细胞中的复制(例如，复制起点)和可选标记基因的序列。可选标记基因促进载体已引入其中的宿主细胞的选择(参见，例如，Axel，美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，一般地可选标记基因在载体已引入其中的宿主细胞上给予针对药物的抗性，所述药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤。常用的可选标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在用氨甲喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中使用)和neo基因(对于G418选择)。

编码多肽或多肽片段的载体可以用于转化合适的宿主细胞。转化可以通过任何合适的方法。用于将外源DNA引入哺乳动物细胞内的方法是本领域众所周知的，且包括葡聚糖介导的转化、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导的转化、原生质融合、电穿孔、在脂质体中封装多核苷酸、和将DNA直接显微注射到核内。此外，核酸分子可以通过病毒载体引入哺乳动物细胞内。

宿主细胞转化可以通过适合于所用载体和宿主细胞的常规方法来完成。对于原核宿主细胞转化，可以使用电穿孔和盐处理方法(Cohen等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 69：2110-14(1972))。对于脊椎动物细胞转化，可以使用电穿孔、阳离子脂质体或盐处理方法。参见，例如，Graham等人，Virology 52：456-467(1973)；Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1373-76(1979)。

用于蛋白质表达的宿主细胞系最优选是哺乳动物来源；本领域技术人员具有优先确定具体宿主细胞系的能力，所述宿主细胞系最适合于其中待表达的所需基因产物。示例性宿主细胞系包括但不限于，NSO、SP2细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛上皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。宿主细胞系一般可从商业来源、美国典型培养物保藏中心或公开文献获得。

来自生产细胞系的多肽表达可以使用已知技术得到增强。例如，谷氨酰胺合成酶(GS)系统通常用于增强某些条件下的表达。参见，例如，欧洲专利号0 216 846、0 256 055和0 323 997以及欧洲专利申请号No.89303964.4。

真核细胞表达载体是本领域已知的且是商购可得的。一般地，此类载体包含用于插入所需DNA区段的方便的限制位点。示例性载体包括pSVL和pKSV-10、pBPV-1、pm12d、pTDT1(ATCC 31255)、逆转录病毒表达载体pMIG、腺病毒穿梭载体pDC315、和AAV载体。

真核细胞表达载体可以包括可选标记，例如耐药性基因。新霉素磷酸转移酶(neo)基因是此类基因的例子(Southern等人，J.Mol.Anal.Genet.1：327-341(1982))。

对于哺乳动物宿主细胞表达常用的调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白质表达的病毒元件，例如来源于逆转录病毒LTRs、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdmlP))、多瘤病毒的启动子和增强子，以及强哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如，Stinski，美国专利号5,168,062；Bell，美国专利号4,510,245；和Schaffher，美国专利号4,968,615。

重组表达载体可以携带调节载体在宿主细胞中的复制(例如，复制起点)和可选标记基因的序列。可选标记基因促进载体已引入其中的宿主细胞的选择(参见，例如，Axel，美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，一般地可选标记基因在载体已引入其中的宿主细胞上给予针对药物的抗性，所述药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤。常用的可选标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在用氨甲喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中使用)和neo基因(对于G418选择)。

编码本发明的NgR多肽的核酸分子、和包含这些核酸分子的载体可以用于转化合适的宿主细胞。转化可以通过合适的方法。用于将外源DNA引入哺乳动物细胞内的方法是本领域众所周知的，包括葡聚糖介导的转化、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转化、原生质融合、电穿孔、在脂质体中封装多核苷酸、和将DNA直接显微注射到核内。此外，核酸分子可以通过病毒载体引入哺乳动物细胞内。

宿主细胞转化可以通过适合于所用载体和宿主细胞的常规方法来完成。对于原核宿主细胞转化，可以使用电穿孔和盐处理方法(Cohen等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 69：2110-14(1972))。对于脊椎动物细胞转化，可以使用电穿孔、阳离子或盐处理方法。参见，例如，Graham等人，Virology 52：456-467(1973)；Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1373-76(1979)。

宿主细胞

用于在本发明方法中使用、用于表达本发明的NgR1多肽或多肽片段的宿主细胞可以是原核的或真核的。示例性真核宿主细胞包括但不限于，酵母和哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCC登记号CCL61)、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH-3T3(ATCC登记号CRL1658)、和幼仓鼠肾细胞(BHK)。其他有用的真核宿主细胞包括昆虫细胞和植物细胞。示例性原核宿主细胞是大肠杆菌和链霉菌(Streptomyces)。

可用作宿主用于表达的哺乳动物细胞系是本领域已知的，且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、和许多其他细胞系。

来自生产细胞系的多肽表达可以使用已知技术得到增强。例如，谷氨酰胺合成酶(GS)系统通常用于增强某些条件下的表达。参见，例如，欧洲专利号0 216 846、0 256 055和0 323 997以及欧洲专利申请号No.89303964.4。

基因疗法

本发明的NgR1多肽或多肽片段可以使用基因疗法方法在哺乳动物例如人患者体内产生，以治疗其中拮抗NgR介导的信号传导将是治疗上有利的神经系统疾病、病症或损伤。这包括施用合适的NgR多肽编码核酸，所述编码核酸与合适的表达控制序列可操作地连接。一般地，将这些序列整合入病毒载体内。对于此类基因疗法合适的病毒载体包括腺病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、EB病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、和腺相关病毒(AVV)载体。病毒载体可以是复制缺陷型病毒载体。一般使用在其E1基因或E3基因中有缺失的腺病毒载体。当使用腺病毒载体时，载体通常没有可选标记基因。

药物组合物

本发明的NgR多肽、多肽片段、多核苷酸、载体和宿主细胞可以配制到药物组合物内，用于给哺乳动物包括人施用。本发明方法中使用的药物组合物包含药学可接受的载体，包括，例如，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质、例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

本发明方法中使用的组合物可以通过任何合适的方法施用，例如，肠胃外、心室内、经口、通过吸入喷雾、局部地、经直肠、经鼻、经颊、经阴道、或经由植入型药盒。如本文使用的，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、损伤内和颅内注射或灌注技术。如先前所述，本发明的NgR多肽在神经系统中发挥作用以抑制NgR介导的信号传导。相应地，在本发明的方法中，NgR多肽以这样的方式施用，使得它们穿过血脑屏障。这种穿过可以起因于NgR多肽分子自身固有的理化性质，药物制剂中的其他组分、或机械装置例如针、插管或手术器械的使用以突破血脑屏障。当NgR多肽是本身不能穿过血脑屏障的分子时，例如，是与促进穿过部分的融合物时，合适的施用途径是例如鞘内或颅内，例如直接进入MS的慢性损伤内。当NgR多肽是本身能穿过血脑屏障的分子时，施用途径可以通过下述各种途径中的一种或多种。

在本发明方法中使用的无菌可注射形式的组合物可以是水或油质悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知技术、使用合适的分散或湿润剂和悬浮剂进行配制。无菌可注射的制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1，3-丁二醇中的悬浮液。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物在注射剂制备中有用，与天然药学可接受的油一样，所述油例如橄榄油或蓖麻油，特别是其聚氧乙烯形式。这些油溶液或悬浮液也可以包含在药学可接受的剂型配制中常用的长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或类似分散剂，所述剂型包括乳剂和悬浮液。为了配制的目的，也可以使用其他常用的表面活性剂例如Tweens、Spans，以及在药学可接受的固体、液体或其他剂型制备中常用的其他乳化剂或生物利用度增强剂。

肠胃外制剂可以是单次快速灌注剂量、输注或先装载大丸剂量随后为维持剂量。这些组合物可以以特异性固定或不定间隔施用，例如每天1次，或基于“需要”。

在本发明方法中使用的某些药物组合物可以以可接受的剂型经口施用，所述剂型包括例如，胶囊、片剂、水悬浮液或溶液。某些药物组合物也可以通过鼻气溶胶或吸入剂施用。此类组合物可以配制为在盐水中的溶液，使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、吸收促进剂以增强生物利用度、和/或其他常规溶解或分散剂。

可以与载体材料组合以生产单一剂型的本发明NgR1多肽或多肽片段的量将依治疗宿主和具体施用方式而变。组合物可以作为单次剂量、多次剂量或在输注中经过确定时间段来施用。给药方案也可以进行调整以提供最佳所需应答(例如，治疗或预防应答)。

本发明方法使用“治疗有效量”或“预防有效量”的NgR多肽。此类治疗或预防有效量可以依因素例如疾病状态、个体的年龄、性别和重量而变。治疗或预防有效量也是其中治疗有利效应胜于任何有毒或有害效应的量。

对于任何具体患者的特定剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括使用的具体NgR多肽，患者年龄、体重、一般健康、性别和饮食，以及施用时间、排泄率、药物并用、以及待治疗的具体疾病的严重度。通过医学护理师判断此类因素在本领域普通技术人员的范围内。量也将取决于待治疗的个别患者、施用途径、制剂类型、所用化合物的特征、疾病严重度、和预期效应。使用的量可以通过本领域众所周知的药理学和药物代谢动力学原理来确定。

在本发明的方法中，NgR多肽一般在脑室内或鞘内直接施用于神经系统，例如进入MS慢性损伤内。根据本发明的方法用于施用的组合物可以这样配制，使得施用剂量为0.001-10mg/kg体重/天NgR多肽。在本发明的某些实施方案中，剂量是0.01-1.0mg/kg体重/天。在某些实施方案中，剂量是0.001-0.5mg/kg体重/天。

补充性活性化合物也可以整合入本发明方法中使用的组合物内。例如，本发明的NgR1多肽或多肽片段，或其融合蛋白，可以与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用。

对于使用本发明的NgR1多肽或多肽片段的治疗，剂量可以为约0.0001-100mg/kg，且更通常为0.01-5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。上述范围内的中间剂量也预期在本发明的范围内。受试者可以以此类剂量每天、隔天、每周施用一次，或根据通过经验分析确定的任何其他时间表施用。示例性治疗要求在多次剂量中经过延长的时间段例如至少6个月施用。另外的示例性治疗方案要求每2周1次或每月1次或每3-6个月1次的施用。示例性给药时间表包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg，在隔天时30mg/kg或每周1次60mg/kg。

在某些方法中，2种或多种NgR1多肽或多肽片段同时施用，在每种情况下施用的每种多肽的剂量在指示范围内。补充性活性化合物也可以整合入在本发明方法使用的组合物内。例如，抗NgR1抗体或其他NgR1拮抗剂可以与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用。

本发明包含关于NgR1多肽或多肽片段针对所选靶组织的任何合适的递送方法，包括水溶液的快速注射或控释系统的植入。控制释放埋植物的使用减少了反复注射的需要。

本发明方法中使用的NgR1多肽和多肽片段可以直接输注到脑内。关于化合物的直接脑输注的各种埋植物是已知的，且在给患有神经障碍的人类患者递送治疗化合物中有效。这些包括使用下述持续输注到脑内：泵、通过立体定位仪植入、临时间隙导管、永久颅内导管埋植物、和外科手术植入的生物可降解埋植物。参见，例如，Gill等人，同上；Scharfen等人，″High Activity Iodine-125 InterstitialImplant For Gliomas，″Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.24(4)：583-91(1992)；Gaspar等人，″Permanent 125I Implants for RecurrentMalignant Gliomas，″Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.43(5)：977-82(1999)；第66章，第577-580页，Bellezza等人，″StereotacticInterstitial Brachytherapy，″in Gildenberg等人，Textbook ofStereotactic and Functional Neurosurgery，McGraw-Hill(1998)；和Brem等人，″The Safety of Interstitial Chemotherapy withBCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in theTreatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas：Phase I Trial″J.Neuro-Oncology 26：111-23(1995)。

组合物还可以包含分散在生物相容性载体材料中的本发明的NgR1多肽或多肽片段，所述载体材料充当关于化合物的合适的递送或支持系统。持续释放载体的合适例子包括成形物品形式的半透性聚合物基质，例如栓剂或胶囊。植入的或微胶囊持续释放的基质包括多乳酸(美国专利号3,773,319；EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯共聚物(Sidman等人，Biopolymers 22：547-56(1985))；聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))或聚-D-(-)-3羟基丁酸(EP 133,988)。

在某些实施方案中，本发明的NgR1多肽或多肽片段通过直接输注到合适的脑区内施用于患者。参见，例如，Gill等人，″Direct braininfusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinsondisease，″Nature Med.9：589-95(2003)。还有可替代的技术且可以应用于施用根据本发明的NgR多肽。例如，导管或埋植物的立体定位放置可以使用Riechert-Mundinger装置和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定位装置来完成。对照增强的计算机断层(CT)扫描，注入120ml欧乃派克、350mg碘/ml，使用2mm层面厚度可以允许三维多平面治疗计划(STP，Fischer，Freiburg，Germany)。这种设备允许基于磁共振成像研究计划，合并CT和MRI靶信息用于明确的靶证实。

改造用于与GE CT扫描仪(General Electric Company，Milwaukee，WI)以及Brown-Roberts-Wells(BRW)立体定位系统(Radionics，Burlington，MA)一起使用的Leksell立体定位系统(Downs Surgical，Inc.，Decatur，GA)可以用于这个目的。因此，在植入当天的早晨，BRW立体定位框的环状基底环可以附着于患者的颅骨。系列CT层面可以以3mm间隔、通过具有夹住基底板的石墨杆定位器框的(靶组织)区域获得。计算机化的治疗计划程序可以在VAX 11/780计算机(Digital Equipment Corporation，Maynard，Mass.)上运行，使用石墨杆图像的CT坐标以在CT间隔和BRW间隔之间作图。

体外方法

本发明还包括体外抑制神经元细胞生长抑制的方法。例如，本发明包括在因素的存在下用于刺激神经元细胞生长的体外方法，所述因素在正常环境下引起神经元细胞生长抑制或生长锥萎缩。

根据本发明的这个方面的方法包括在本发明的分离NgR1多肽或多肽片段的存在和不存在下，使表达Nogo受体的神经元细胞与引起NgR介导的生长抑制的制剂接触。如本文使用的，表述“引起NgR介导的生长抑制的制剂”意指，与Nogo受体信号转导途径的组分(例如NgR或NgR相互作用蛋白质)相互作用从而刺激神经元细胞生长抑制或生长锥萎缩的任何化合物。引起NgR介导的生长抑制的示例性制剂包括，例如Nogo(例如，NogoA，Nogo-66)、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)、少突胶质细胞糖蛋白(OMgp)，及其抑制表达Nogo受体的细胞生长的片段和衍生物。髓磷脂自身是引起NgR介导的生长抑制的另一种示例性制剂。

在某些实施方案中，本发明体外方法实践中使用的神经元细胞可以表达内源性Nogo受体。在其他实施方案中，神经元细胞表达来自载体的外源性Nogo受体。神经元细胞可以表达内源性Nogo受体和外源性Nogo受体。

根据本发明的这个方面的方法可以包括在本发明的分离NgR1多肽或多肽片段的存在和/或不存在下，监控神经元生长抑制或生长锥萎缩程度。本发明的体外方法可以用于表征候选NgR多肽能够抑制神经元细胞生长抑制或生长锥萎缩的程度，所述神经元细胞生长抑制或生长锥萎缩通常在引起NgR介导的生长抑制的制剂的存在下发生。因此，本发明的方法对于鉴定和表征全范围NgR多肽有用，所述NgR多肽具有抑制神经元细胞生长抑制的能力。根据本发明的这个方面的方法可以以高通量形式来进行。

用于测试NgR1多肽和多肽片段抑制神经突长出能力的其他体外和体内方法在PCT公开WO2005/016955(引入本文作为参考)中描述。

对于相关领域的普通技术人员将显而易见的是，本文所述方法和应用的其他合适修饰和适应是明显的，且无需背离本发明或其任何实施方案的范围即可进行。现在详细描述本发明，同样通过参考下述实施例将更容易理解，所述实施例仅为了举例说明的目的由此包括且不希望限制本发明。

实施例

实施例1

NgR1蛋白质的纯度和生物活性

先前的缺失分析暗示Nogo受体1的包括LRR的C端帽-LRRCT的完整LRR区是配体结合所需的，和Nogo受体1邻近的CT茎促成与其共受体(例如，p75、TAJ和LINGO-1)的相互作用。为了进一步阐明NgR1的哪个区域涉及与其共受体的相互作用，分析各种NgR1构建体与共受体结合的能力。不包括GPI结构域在其N端具有flag标记的人NgR1(FL-NgR1，残基27-438，图1(SEQID NO：22))在CHO细胞中进行表达，且通过顺序层析步骤在TMAE-Fractogel(EM Merck)和Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)上，作为可溶蛋白从条件培养基中进行纯化。人NgR1(310)(残基27-310)和人NgR1(344)(残基27-344)在昆虫细胞中作为组氨酸标记的蛋白质(C端标记)进行表达，且通过顺次步骤在SP-Sepharose(Amersham BioSciences)和Ni-NTA琼脂糖上进行纯化。大鼠NgR1(344)(残基27-344)-大鼠-Fc(IgG1)和大鼠NgR1(310)(残基27-310)在CHO细胞中进行表达。大鼠NgR1(344)-大鼠-Fc在Protein A Sepharose(Amersham BioSciences)上进行纯化，以及大鼠NgR1(310)在SP-Sepharose上进行纯化。样品通过SDS-PAGE在4-20％梯度凝胶(NOVEX)上分析纯度，且通过尺寸排阻层析(SEC)在Superdex ^TM200柱(Amersham Biosciences)上分析聚集。柱在PBS中以20mL/小时的流速运行，且监控柱流出物在280nm处的吸光度。

SDS-PAGE指出FL-NgR1的纯度大于90％，而平均分子量为约65kDa(图2A)。在尺寸排阻层析(SEC)上，蛋白质作为质量约80kDa的单个峰洗脱(图2B)。使用本领域已知方法测试FL-NgR1在ELISA测定法中的结合，且发现结合LINGO-1、OMgp、Nogo-66、p75和TAJ与包含单独LRR区域的截短形式一样好，或比截短形式更好。参见，例如Shao等人，(2005)，Neuron 45，353-359。与如同前所述的只包含LRR区域的截短形式NgR1(310)比较，使用FL-NgR1可见对Taj的亲和力高10倍。使用阻断AP-OMgp和AP-Lingo-1与NgR1结合的抗NgR1抗体，在竞争ELISA中的结合的进一步分析证实了FL-NgR1的活性(图2C)。

实施例2

全长人NgR1蛋白质的氨基酸序列分析

FL-NgR1的氨基酸序列通过在LC-MS系统上的胰蛋白酶肽作图来证实。对含或不含PNGase F处理的蛋白质样品进行肽图分析。首先，用PNGase F从天然蛋白中去除N联聚糖。向包含约20μg蛋白质的25μL溶液中加入约1μL PNGase F(2.5mU/μL，Prozyme)；溶液于37℃温育24小时。随后再加入1μL PNGase F，且使溶液于室温再放置24小时。烷化在变性但非还原条件下进行。向50μL蛋白质溶液内加入约0.3μL 4-乙烯吡啶，且之后立即向溶液中加入50mg盐酸胍(GuHCl)。溶液于室温在黑暗中温育60分钟。如Pepinsky，R.B.(1991)Anal.Biochem.195，177-181中所述，烷化蛋白质通过用40体积冷乙醇沉淀来回收。溶液于-20℃贮藏1小时，且随后在14000 X g下于4℃离心8分钟。弃去上清液且用冷乙醇洗涤1次沉淀物(-20μg/管形瓶)。

选择胰蛋白酶作为关于二硫键连接研究的切割酶，因为它预期产生最简单的含半胱氨酸肽组。消化在pH 6.5进行以使二硫化物交换最小化。为了克服胰蛋白酶在pH6.5较低的水解率，蛋白质在胰蛋白酶切割之前用endo-Lys-C蛋白酶处理。约20μg每种烷化蛋白质，去糖基化或完全糖基化的，在1M尿素、0.2M Tris-HCl、pH6.5、10mM甲胺、1mM CaCl₂中用5％(w/w)内切蛋白酶Lys-C(endo-Lys-C，Wako)于室温消化5小时；随后加入5％(w/w)胰蛋白酶(Promega)，且使溶液于室温再温育10-12小时。最终体积为55μL。在液体层析/质谱测定法(LC-MS)系统上分析消化液之前，加入55μL新鲜配制的8M尿素，且将溶液分成2份：一份在用40mM DTT于37℃还原1小时后进行分析，和另一份无需还原直接进行分析。还原和未还原消化液在LC-MS系统上进行分析，所述LC-MS系统由HPLC(2690Alliance Separations Module)、2487双波长UV检测器和LCT质谱仪(Waters Corp.，Milford，MA)构成。HPLC配备1.0-mm×25-cm YMC C18柱(AA12S052501WT)或1.0-mm×25-cm Vydac C18柱(218TP51)，且于30℃用在0.03％三氟乙酸中的200-min梯度(0-70％乙腈)洗脱，流速为0.07mL/分钟。

肽在C18反相柱上用联机操作的ESI-TOF质谱仪进行分离。所有显著峰被鉴定且占97％的预测NgR1序列(表1)。在肽图中未检出的是推测与溶剂峰共洗脱的小的亲水肽。在鉴定的肽中，包括8个未预测到的翻译后修饰位点：在脯氨酸352上的羟基化(约75％；峰在图2中在51.5分钟时洗脱且在表1中指定为T31<Hyp-352>)和在肽T34中7个位点上的O联糖基化(残基378-414，表1)。羟基化位点通过串联质谱法(MS/MS)对1652.9-Da肽测序来鉴定(数据未显示)。收集包含胰蛋白酶糖肽T34(残基378-414)的峰，且约0.1μg肽在真空下干燥，且重悬浮于10μlPBS中。为了去除唾液酸，加入等分试样的0.5μl唾液酸酶(10mU/μL，Boehringer Mannheim)，这之后使溶液于室温温育20小时。内切蛋白酶Glu-C(endo-Glu-C，Sequencing Grade，Roche)消化通过用0.05μg酶于室温处理糖肽24小时来进行。唾液酸酶处理的胰蛋白酶肽T34在Voyager STR质谱仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上使用DHB作为基质进行分析。如上所述去唾液酸化T34的endo-Glu-C消化液在纳米流LC-MS系统上进行分析。该分析显示T34中的N联糖基化位点天冬酰胺380未被占据，但肽中的所有4个丝氨酸和3个苏氨酸残基糖基化至一定程度，尽管肽主要包含总共4-6个O联聚糖(数据未显示)。分析结果与使用程序NetOGlyc 3.1进行的预测一致。

表1.来自还原和吡啶乙基化FL-NgF的胰蛋白酶消化液的肽的C-MS分析

￥胰蛋白酶肽	残基编号	保留时间(分钟)	观察到的分子量	计算的分子量
					T1	*Leu+27-38	57.7	1395.68	1395.60
T2	39-61	67.9	2307.22	2307.20
					T3	62-68	43.6	855.49	855.47
T4	69-78	50.6	1083.59	1083.58
					PE-T5	79-81		N/D	245.15
T6+§4Hex5HexNAc4Fuc	82-95	96.7	3417.67	3417.58
					T6	82-95	108.4	1648.94	1648.94
T6(去糖基化)	82-95	111.6	1649.92	1649.95
					T7	96-119	147.9	2557.38	2557.34
T8	120-131	57.9	1255.64	1255.63
					T9	132-139	50.6	1003.54	1003.56
PE-T10	140-151	79.2	1393.81	1393.72
					T11	152-175	133.1	2708.52	2708.38
T12+§Hex5HexNAc4Sia1-2Fuc	176-189	85.4	3374.473665.68	3374.483665.58

￥胰蛋白酶肽	残基编号	保留时间(分钟)	观察到的分子量	计算的分子量
					T12(去糖基化)	176-189	99.2	1606.82	1606.85
T13	190-196	31.4	786.44	786.42
					T14	197-199		N/D	393.23
T15	200-206	34.9	796.45	796.42
					T16	207-213	41.8	892.55	892.52
T17	214-217	42.0	1169.64	1169.62
					T18	224-227	14.9	460.26	460.25
T19′(去糖基化)	233-250	116.8	1911.12	1911.07
					T19(去糖基化)	228-250	168.3	2532.42	2532.39
T19+§Hex5HexNAc4SiaFuc0-1	228-250	146.2	4447.04594.0	4447.84593.9
					T20	251-256	50.6	762.45	762.44
T21	257-267	65.1	1333.55	1333.55
					T22	268-277	92.9	1267.72	1267.72
T22′	270-277	95.4	1040.59	1040.58
					T23-T24	278-292	56.1	1648.80	1648.80
T24	280-292	52.0	1345.63	1345.63
					T25	293-296	17.9	416.23	416.26
T26-27	297-300	34.8	531.34	531.33
					T28	301-323	80.6	2410.18	2410.19
T29	324-334	57.1	1168.61	1168.60
					T30	335-343	22.5	949.41	949.36
T31<Hyp-352>	344-360	51.5	1652.89	1652.89
					T31	344-360	54.4	1636.90	1636.89
T32-T33(去糖基化)	361-377	36.2	1603.78	1603.80
					T33(去糖基化)	363-377	34.9	1390.64	1390.67
T34+4-60-联§聚糖(HexNAcHex)	378-414+4378-414+5378-414+6378-414+7	65.8	5228.285593.415958.576323.63	5228.385593.525958.646323.76
					T35-36	415-421	17.9	830.45	830.43
T37	422-422		N/D	146.11
					T38	423-424		N/D	288.15
T39	425-426		N/D	275.16
					T40	427-430		N/D	501.21
T41	431-438	16.5	645.32	645.31
					§E1(T34)+O-联聚糖[来自Gluc-C处理的T34]HexNAcHex	378-401+2378-401+3378-401+4	N/A	3231.493596.593961.60	3231.503596.623961.74
§E1(T34)+O-联聚糖[来自Gluc-C处理的T34]HexNAcHex	402-414+2402-414+3	N/A	2014.842379.96	2014.852379.07

￥标记表示来自FL-NgR1序列的预测胰蛋白酶肽，其中T1是N端肽和T41是C端肽。^*Leu来自FL-NgR1N端的Flag标记。§是在质谱分析前用唾液酸酶处理的部分。

实施例3

人NgR1蛋白质中的游离半胱氨酸和二硫键合的半胱氨酸残基分析

为了直接评估成熟结构中的哪个半胱氨酸残基是游离的，在消化液已用DTT还原后，吡啶乙基化、未还原的FL-NgR1的胰蛋白酶消化液在LC-MS系统上进行分析。因为天然蛋白在酶促切割前用4-乙烯吡啶进行烷化，所以游离巯基状态的任何半胱氨酸残基应当已被吡啶乙基化，导致对于每个烷基质量增加105-Da。另一方面，涉及二硫键的半胱氨酸残基应当被检测为游离半胱氨酸，即在还原后具有游离巯基。FL-NgR1包含14个半胱氨酸残基-4个在LRRNT中，2个在LRRs中，4个在LRRCT中，和4个在CT茎中。在还原消化液的胰蛋白酶肽图中所有预测的含半胱氨酸肽被鉴定，除了含半胱氨酸80和半胱氨酸429的那些，它们很小，推测与溶剂峰一起被洗脱，所以未被分析。图3的下图显示还原后吡啶乙基化FL-NgR1的胰蛋白酶肽图。所有鉴定的肽在表1中列出，其中含半胱氨酸肽是粗体的。这些数据分析显示12个鉴定的半胱氨酸残基中的11个在还原后是游离巯基形式，和肽T10中的半胱氨酸140(残基140-151)是吡啶乙基化的。因此，可以推断天然FL-NgR1中的12个半胱氨酸残基涉及6个二硫键以及2个是不成对的。此外，利用来自NgR1(310)晶体结构的信息，可以预测半胱氨酸80作为游离巯基存在，因为在晶体结构中它包埋在LRR区域中。通过推论，晶体结构中不存在的CT茎区中的半胱氨酸429一定涉及二硫键形成。

实施例4

FL-NgR1蛋白质中的二硫键分析

NgR1内的二硫化物结构通过分析未还原消化液的肽图来确定。如He等人，(2003)Neuron，38，177-185和Barton等人，(2003)EMBO J.22，3291-3302中所述，基于在NgR1(310)晶体结构中可见的二硫化物结构，未还原消化液应当包含2组二硫键合的肽，一组来自LRRNT区域和另一组来自LRRCT区域。事实上，未还原消化液的肽图分析的确显示来自在74.3分钟时洗脱的LRRNT区域的二硫键合的肽(T1/T2)组(图3，上图)。该峰的质谱分析显示它包含通过2个二硫键连接的2种肽，T1(残基27-38)和T2(残基39-61)(观察到的质量，3698.77Da；计算的质量，3698.77Da；表2)。当消化液用DTT还原时，包含T1和T2肽的峰消失，且同时在还原图上，观察到对应肽T1和T2的2个新峰(图3，下图)。肽T1包含3个半胱氨酸。由于缺乏可以在半胱氨酸27和半胱氨酸29，以及半胱氨酸29和半胱氨酸33之间切割的蛋白酶，所以T1/T2中的确切二硫键必须通过下述确定：用三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP，Pierce)部分还原，且用N-乙基马来酰亚胺(NEM，Pierce)烷化，随后进行LC-MS/MS分析。为了实现这点，如Burns等人，J.Org.Chem.1991，56，2648-2650中所述，二硫键合的胰蛋白酶肽使用TCEP，Pierce在包含6M盐酸胍的0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 3中进行部分还原。将各种量的TCEP加入溶液中以找到最佳条件。发现TCEP的最适量对于20pmol LRRNT区域中二硫键合的肽是5nmol，以及对于10pmol LRRCT和茎区中二硫键合的肽是5nmol。溶液总体积为2.5μl。还原于37℃进行15分钟，且通过用过量NEM使部分还原的肽烷化来终止，所述NEM在包含6M盐酸胍的0.4M柠檬酸盐缓冲液，pH4.5中。溶液(5pl)中的NEM终浓度是10mM；溶液于37℃放置1小时。如上所述，部分还原和NEM烷化的肽在纳米流LC-MS/MS系统上进行分析，直接地或在2690 Alliance Separations Module上用1.0-mm×15-cm AtlanticdC18柱(186001283，Waters Corp.)进一步分馏后。对于分馏，于30℃使用在0.1％三氟乙酸中的70-min梯度(5-70％乙腈)，流速为0.07mL/分钟。在肽图上的峰组分使用MassLynx 4.0软件(WatersCorp.)进行鉴定。如上所述，MS/MS谱在纳米流LC-MS/MS系统上使用数据依赖采集功能(DDA)来获得。对于MS/MS实验使用倾斜碰撞能量21-40ev，和在m/z范围50-1800中收集MS/MS谱，其中每0.5秒取样，在连续谱之间分开0.05秒。从Q-TOF Premier获得MS或MS/MS谱，通过MaxEnt 3程序进行重叠合并。通过二硫键连接的肽通过比较未还原消化液的图与相应还原样品的图进一步鉴定。

如He等人，(2003)Neuron，38，177-185和Barton等人，(2003)EMBO J.22，3291-3302中所述，根据NgR1(310)晶体结构，可以推断T1将具有肽内二硫键且经由肽间二硫键与T2连接。在C18柱上分离后，部分还原和烷化产物的质谱分析检测到下述预测的部分还原、NEM烷化肽：T1包含1个二硫键和1个N-乙基琥珀酰亚胺基(NES)基团(观察到的MH+＝1519.64，计算的MH+＝1519.64)，T2具有1个NES基团(观察到的MH+＝2433.26，计算的MH+＝2433.25)，和T1/T2包含1个肽间二硫键和2个NES基团(观察到的MH+＝3951.90，计算的MH+＝3951.89Da)。图4中所示关于包含1个二硫键和1个NES基团的T1的MS/MS谱，指出NES基团在半胱氨酸29上(内部碎片离子，PGAC(NES)和PGAC(NES)V，y11相关离子，图4)，这意味着半胱氨酸33经由肽内二硫键与半胱氨酸27连接，和半胱氨酸29经由肽间二硫键与T2中的半胱氨酸43连接。关于包含1个肽间二硫键和2个NES基团的T1/T2的MS/MS测序结果与这个结论一致，因为分析显示2个NES基团在半胱氨酸27和半胱氨酸33上(数据未显示)。

如He等人，(2003)Neuron，38，177-185和Barton等人，(2003)EMBO J 22，3291-3302)中所述，NgR1(310)LRRCT区域的晶体结构显示半胱氨酸264与半胱氨酸287和半胱氨酸266与半胱氨酸309的二硫键。因此，LRRCT区域中的4个半胱氨酸残基应当包含在通过2个肽间二硫键连接在一起的3种胰蛋白酶肽中一T21(残基257-267)、T24(残基280-292)和T28(残基301-323)(关于这个簇的计算的分子量应当为5088.68 Da)。3种个别的肽，T21、T24和T28(图3的下图和表1)，在还原消化液的图中容易地鉴定，但在未还原消化液的图中没有发现对应这个肽簇T21/T24/T28的显著峰。而是出现质量为6032.62Da的主峰，这对应包含通过3个二硫键连接的T21、T24、T28和T30(残基335-343)的4个肽簇(计算的质量＝6032.68 Da；图3的上图，和表2)。因为肽T21和T30各自包含2个半胱氨酸残基，在肽T21中的1个半胱氨酸一定与肽T30中的1个形成二硫键，尽管确切连接不能确定。胰蛋白酶肽作图分析也显示在19.0分钟时的峰包含在CT茎区中的其他2种含半胱氨酸肽，并且它们通过半胱氨酸419和半胱氨酸429之间的二硫键进行连接(表2和图3，上图)。

为了确定肽T21/T24/T28/T30复合物中的二硫键，收集在胰蛋白酶肽图上包含在LRRCT和茎区中的二硫键合的肽的峰，在真空下干燥，且重悬浮于10μl 0.1 M Tris-HCl，pH 6.5，1mM MgC12中。向0.6μg肽中加入约0.02μg内切蛋白酶Asp-N(endo-Asp-N，Sequencing Grade，Roche)，这之后使溶液于室温温育6小时。消化液在纳米流LC-MS系统上进行分析，所述纳米流LC-MS系统由纳米流HPLC(NanoAcquity，Waters Corp.，Milford，MA)和Q-TOFPremier质谱仪(Waters Corp.，Milford，MA)构成。对于分离使用0.10-mm×10-cm Atlantic dC18柱(186002831，Waters Corp.)，用在0.1％甲酸中的50-min梯度(0-70％乙腈)，流速为400nL/分钟。温度为35℃。

因为肽T21和T30各自包含2个Cys残基，所以在肽T21中的1个Cys一定与肽T30中的1个形成二硫键(图8)。对于肽T21/T24/T28/T30簇存在8个可能的二硫化物结构(图8)。

在未还原消化液中通过质谱分析检测到2个显著的峰(数据未显示)。如NgR1(310)晶体结构中可见，在第2个峰中检测到的MH+2076.89(图5)匹配对于肽T21和肽T24的计算的MH+2076.91，所述肽T21和肽T24通过半胱氨酸264和半胱氨酸287之间的二硫键连接。这个片段的鉴定通过源内碎片离子的观察得到证实(图5)。在另一个峰中观察到的MH+2879.50Da匹配对于下述3种肽组计算的MH+2879.25Da：残基265-267(来源于T21)、残基305-323(来源于T28)和残基335-338(来源于T30)，所述3种肽通过2个肽间二硫键连接，这表明LRRCT区域中的半胱氨酸266和半胱氨酸309与CT茎区中的半胱氨酸335和半胱氨酸336形成二硫键(数据未显示)。在这种情况下，半胱氨酸266和半胱氨酸309与半胱氨酸335和半胱氨酸336的确切二硫化物配对的确定由于下述事实变复杂：不存在可以切割半胱氨酸335和半胱氨酸336之间的主链的制剂。

T21/T24/T28/T30复合物中的二硫化物配对排列通过下述进一步阐明，用TCEP对其实施部分还原，随后用NEM烷化，和通过纳米-LC-MS分析。图6显示纳米流LC-MS结果(TIC)，和表3列出峰中组分的鉴定。对于某些肽可见的双重峰是由于通过NEM烷化产生的立体异构体。MS/MS谱对于每个双重峰中的个别峰是一样的(数据未显示)。包含T28/T30的双重峰从在1-mm×150mm柱上运行的部分中收集，所述T28/T30具有二硫键和NES基团，且在它已用DTT充分还原后在纳米-LCMS/MS系统上进一步分析。图7显示包含NES基团的肽T30的MS/MS谱。通过MS/MS测序检测的b1和y8离子，显示NES基团在半胱氨酸356而不是半胱氨酸366上，因为观察到的m/z对于b为229.08，和对于y8为847.38(如果半胱氨酸335用NEM烷化，那么计算的m/z值对于b1为229.06，和对于y8为847.36；如果半胱氨酸336用NEM烷化，那么计算的m/z值对于b1为104.10，和对于y8为972.46)，这表明半胱氨酸336与半胱氨酸309形成二硫键。因此，随后，半胱氨酸335一定与半胱氨酸266连接。在T21/T24/T28/T30复合物中以实验测定的二硫键显示于图9中。FL-NgR1的LRRCT结构域中的二硫化物结构分析不仅证明对于NgR1的LRRCT预测的二硫化物结构是不正确的，而且还鉴定了可替代的半胱氨酸配对结构。尽管不希望被理论束缚，但认为NgR1(310)中可见的Cys-266与Cys-309连接是由截断产生的假象。

表2.在吡啶乙基化FL-NgR1的未还原消化液的胰蛋白酶肽图中检测到的二硫键合的肽

￥胰蛋白酶肽	残基编号	保留时间(分钟)	观察到的分子量	计算的分子量
					具有2个二硫键的T1/T2	*Leu+27-3839-61	74.3	3698.77	3698.77
具有3个二硫键的T21/T24/T28/T30	257-267(C1，C2)280-292(C3)301-323(C4)335-343(C5，C6)	77.3	6032.62	6032.68
					具有1个二硫键的T35-T36/T40	415-421(C7)427-430(C8)	19.0	1329.62	1329.62

表3.来自部分还原、NEM烷化肽簇T21/T24/T28/T30的组分的LC-MS分析

￥胰蛋白酶肽	保留时间(分钟)	观察到的分子量	计算的分子量
				T30+2NES	30.4	1199.58	1199.46
T24+1NES	32.4-32.8	1470.70	1470.68
				T21/T24/T30+1NES	35.8	3749.56	3749.56
T21/T24+1NES	40.25	2802.21	2802.22
				T28/T30+1NES	41.1-41.5	3482.57	3482.58
T21/T24/T28/T30	43.0	6032.62	6032.68
				T21+2NES	47.4	1583.66	1583.65
T28+1NES	49.2-49.5	2535.26	2535.23

实施例5

由不同构建体制备的NgR1和NgR2蛋白质的二硫化物结构分析

在人NgR2(FL)-Fc、人NgR1(310)蛋白质、人NgR1(344)蛋白质、大鼠NgR1(310)蛋白质、和大鼠NgR1(344)-大鼠Fc(IgG1)融合蛋白[大鼠NgR1(344)-Fc]中的二硫化物结构同样通过胰蛋白酶肽图进行分析。序列比对显示于图10中。图11显示关于大鼠NgR1(310)的胰蛋白酶肽图作为例子。结果概括于表4和图12中。这些分析显示人NgR2(FL)-Fc、大鼠NgR1(310)、和在CT茎区中缺乏2个半胱氨酸残基--半胱氨酸335和半胱氨酸336的人NgR1(310)蛋白质中的二硫化物结构，与在人NgR1(310)晶体结构中可见的一样，和大鼠NgR1(344)-Fc以及在CT茎区中的确具有2个半胱氨酸残基的人NgR1(344)蛋白质的二硫化物结构与FL-NgR1中可见的一样。质谱分析显示如NgR1中可见的，NgR2(FL)-Fc的CT茎中的2个Cys残基通过二硫键连接。分析还鉴定了NgR2(FL)-Fc的LRRCT中的O-联糖基化位点Thr-313。糖基化位点占据率为约35％。

表4.由不同构建体制备的NgR1蛋白质中的二硫化物结构的质谱分析概括

实施例6

神经突长出测定法

本发明的可溶性Nogo受体多肽和多肽片段对神经突长出的影响通过在层粘连蛋白的存在和不存在下进行细胞生长实验来测试。在不含层粘连蛋白的培养基中，神经元细胞是很差的且模拟神经元应激条件。

从出生后第6-7天的小鼠幼崽中切开背根神经节(DRG′s)，分离成单细胞，且在用0.1mg/ml多D-赖氨酸

预包被的96孔板上进行铺板。在某些孔中，加入2μg/ml层粘连蛋白2-3小时，且在细胞进行铺板之前漂洗。温育18-20小时后，板用4％多聚甲醛固定、用1∶500稀释的兔抗β-III-微管蛋白抗体(Covance

)和1∶100稀释的抗HuC/D(Molecular Probes)染色，且加入稀释度为1∶200的荧光次级抗体(Molecular Probes)。

通过使用神经突长出应用，ArrayScanII(Cellomics

)可以用于捕获5x数字图像、且将神经突长出定量为平均神经突长出/神经元/孔。分析足够的图像以允许结果的统计分析。

在某些实施方案中，使用PC12细胞的亚克隆(Neuroscreen)(Cellomics)。Neuroscreen细胞用200ng/ml NGF预分化7天，分离且在用多D-赖氨酸预包被的96孔板上重新铺板。在某些孔中，加入5μg/ml层粘连蛋白2-3小时，且在细胞进行铺板之前漂洗。温育2天后，板用4％低聚甲醛固定、用1∶500稀释的兔抗β-III-微管蛋白抗体(Covance)和Hoechst(核染剂)染色。如上所述如在DRG细胞中，使用ArrayScan

II定量神经突长出。

在铺板时将在溶液中的本发明的NgR1多肽和多肽片段，例如NgR1(309-344)多肽片段，加入P6-7DRG神经元和分化的Neuroscreen^TM细胞中。

评估了NgR1多肽或多肽片段对神经突长出的影响。

实施例7

神经突长出测定法

Lab-Tek

培养玻片(4孔)用0.1mg/ml多D-赖氨酸(Sigma)包被。单独或与本发明的NgR1多肽和多肽片段，例如NgR1(309-344)多肽片段混合的CNS髓磷脂作为3μl滴分别点上。将荧光微球体(Polysciences)加入髓磷脂/PBS中，以允许随后鉴定滴(Grandpre等人，Nature 403，(2000))。Lab-Tek

玻片随后进行漂洗且用10μg/ml层粘连蛋白(GibcoTM)包被。

来自P3-4Sprague Dawley大鼠幼崽的背根神经节(DRG′s)用1mg/ml I型胶原酶(Worthington)分离、用火琢巴氏吸管捣碎、预先铺板以富含神经元细胞、且最后以23,000细胞/孔在预包被的Labtek培养玻片上铺板。培养基是例如包含5％热灭活的供体马血清、5％热灭活的胎牛血清和50ng/ml mNGF的F12，且于37℃和5％CO2温育6小时。

玻片用包含20％蔗糖的4％低聚甲醛固定20分钟，且用1∶500稀释的神经元标记抗β-III-微管蛋白(Covance TUJl)染色。作为次级抗体，抗小鼠Alexa Fluor

594(Molecular Probes)1∶300稀释，和玻片用Gel/MountTM(BimedaTM)盖玻片盖上。使用OpenLab软件获得足够的5x数字图像，且通过使用MetaMorph软件分析，用于定量神经突长出。

评估NgR1多肽或多肽片段保护DRG神经元不受髓磷脂介导的神经突长出抑制的能力。

序列表

<110>比奥根艾迪克MA公司(Biogen Idec MA Inc.)

<120>NOGO受体多肽和多肽片段及其用途

<130>P18108SYNC

<140>待指定

<141>2006-08-25

<150>60/710，864

<151>2005-08-25

<160>32

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1719

<212>DNA

<213>人Nogo受体-I

<400>1

agcccagcca gagccgggcg gagcggagcg cgccgagcct cgtcccgcgg ccgggccggg   60

gccgggccgt agcggcggcg cctggatgcg gacccggccg cggggagacg ggcgcccgcc  120

ccgaaacgac tttcagtccc cgacgcgccc cgcccaaccc ctacgatgaa gagggcgtcc  180

gctggaggga gccggctgct ggcatgggtg ctgtggctgc aggcctggca ggtggcagcc  240

ccatgcccag gtgcctgcgt atgctacaat gagcccaagg tgacgacaag ctgcccccag  300

cagggcctgc aggctgtgcc cgtgggcatc cctgctgcca gccagcgcat cttcctgcac  360

ggcaaccgca tctcgcatgt gccagctgcc agcttccgtg cctgccgcaa cctcaccatc  420

ctgtggctgc actcgaatgt gctggcccga attgatgcgg ctgccttcac tggcctggcc  480

ctcctggagc agctggacct cagcgataat gcacagctcc ggtctgtgga ccctgccaca  540

ttccacggcc tgggccgcct acacacgctg cacctggacc gctgcggcct gcaggagctg  600

ggcccggggc tgttccgcgg cctggctgcc ctgcagtacc tctacctgca ggacaacgcg  660

ctgcaggcac tgcctgatga caccttccgc gacctgggca acctcacaca cctcttcctg  720

cacggcaacc gcatctccag cgtgcccgag cgcgccttcc gtgggctgca cagcctcgac  780

cgtctcctac tgcaccagaa ccgcgtggcc catgtgcacc cgcatgcctt ccgtgacctt  840

ggccgcctca tgacactcta tctgtttgcc aacaatctat cagcgctgcc cactgaggcc  900

ctggcccccc tgcgtgccct gcagtacctg aggctcaacg acaacccctg ggtgtgtgac  960

tgccgggcac gcccactctg ggcctggctg cagaagttcc gcggctcctc ctccgaggtg 1020

ccctgcagcc tcccgcaacg cctggctggc cgtgacctca aacgcctagc tgccaatgac 1080

ctgcagggct gcgctgtggc caccggccct taccatccca tctggaccgg cagggccacc 1140

gatgaggagc cgctggggct tcccaagtgc tgccagccag atgccgctga caaggcctca 1200

gtactggagc ctggaagacc agcttcggca ggcaatgcgc tgaagggacg cgtgccgccc 1260

ggtgacagcc cgccgggcaa cggctctggc ccacggcaca tcaatgactc accctttggg 1320

actctgcctg gctctgctga gcccccgctc actgcagtgc ggcccgaggg ctccgagcca 1380

ccagggttcc ccacctcggg ccctcgccgg aggccaggct gttcacgcaa gaaccgcacc 1440

cgcagccact gccgtctggg ccaggcaggc agcgggggtg gcgggactgg tgactcagaa 1500

ggctcaggtg ccctacccag cctcacctgc agcctcaccc ccctgggcct ggcgctggtg 1560

ctgtggacag tgcttgggcc ctgctgaccc ccagcggaca caagagcgtg ctcagcagcc    1620

aggtgtgtgt acatacgggg tctctctcca cgccgccaag ccagccgggc ggccgacccg    1680

tggggcaggc caggccaggt cctccctgat ggacgcctg                           1719

<210>2

<211>473

<212>PRT

<213>人NgR-1

<400>2

Met Lys Arg Ala Ser Ala Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu

1               5                   10                  15

Trp Leu Gln Ala Trp Gln Val Ala Ala Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val

            20                  25                  30

Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln Gly Leu

        35                  40                  45

Gln Ala Val Pro Val Gly Ile Pro Ala Ala Ser Gln Arg Ile Phe Leu

    50                  55                  60

His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Arg Ala Cys

65                  70                  75                  80

Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser Asn Val Leu Ala Arg Ile

                85                  90                  95

Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Ala Leu Leu Glu Gln Leu Asp Leu

        100                 105                 110

Ser Asp Asn Ala Gln Leu Arg Ser Val Asp Pro Ala Thr Phe His Gly

        115                 120                 125

Leu Gly Arg Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Gln Glu

    130                 135                 140

Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr

145                 150                 155                 160

Leu Gln Asp Asn Ala Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asp Thr Phe Arg Asp

                165                 170                 175

Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Ser Ser

            180                 185                 190

Val Pro Glu Arg Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu

        195                 200                 205

Leu His Gln Asn Arg Val Ala His Val His Pro His Ala Phe Arg Asp

    210                 215                 220

Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Ala

225                 230                 235                 240

Leu Pro Thr Glu Ala Leu Ala Pro Leu Arg Ala Leu Gln Tyr Leu Arg

                245                 250                 255

Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp

            260                 265                 270

Ala Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Ser

        275                 280                 285

Leu Pro Gln Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Asn

    290                 295                 300

Asp Leu Gln Gly Cys Ala Val Ala Thr Gly Pro Tyr His Pro Ile Trp

305                 310                 315                 320

Thr Gly Arg Ala Thr Asp Glu Glu Pro Leu Gly Leu Pro Lys Cys Cys

                325                 330                 335

Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala Ser Val Leu Glu Pro Gly Arg Pro

            340                 345                 350

Ala Ser Ala Gly Asn Ala Leu Lys Gly Arg Val Pro Pro Gly Asp Ser

        355                 360                 365

Pro Pro Gly ASn Gly Ser Gly Pro Arg His Ile Asn Asp Ser Pro Phe

    370                 375                 380

Gly Thr Leu Pro Gly Ser Ala Glu Pro Pro Leu Thr Ala Val Arg Pro

385                 390                 395                 400

Glu Gly Ser Glu Pro Pro Gly Phe Pro Thr Ser Gly Pro Arg Arg Arg

                405                 410                 415

Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg Ser His Cys Arg Leu Gly

            420                 425                 430

Gln Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Glu Gly Ser Gly

        435                 440                 445

Ala Leu Pro Ser Leu Thr Cys Ser Leu Thr Pro Leu Gly Leu Ala Leu

    450                 455                 460

Val Leu Trp Thr Val Leu Gly Pro Cys

465                 470

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的“连接体”

<400>3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1               5                   10                  15

<210>4

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的“连接体”

<400>4

Glu Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1               5                   10                  15

<210>5

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的“连接体”

<400>5

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr

1               5                   10

<210>6

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的“连接体”

<400>6

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln

1               5                   10                  15

<210>7

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的“连接体”

<400>7

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp

1               5                   10

<210>8

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的“连接体”

<400>8

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly

1               5                   10

<210>9

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的“连接体”

<400>9

Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser

1               5                   10                  15

Leu Asp

<210>10

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的“连接体”

<400>10

Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp

1               5                   10                  15

<210>11

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>用于鉴定、纯化、浓缩或分离NgR多肽的合成表位标记

<400>11

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1               5

<210>12

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的表位标记

<400>12

Asp Tyr Lys Asp Glu Asp Asp Lys

1               5

<210>13

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的表位标记

<400>13

Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly

1               5

<210>14

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的表位标记

<400>14

Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

1               5                   10

<210>15

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的表位标记

<400>15

His His His His His His

1               5

<210>16

<211>13

<212>PRT

<213>流感病毒血凝素(HA)

<400>16

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ile Glu Gly Arg

1               5                   10

<210>17

<211>11

<212>PRT

<213>人c-myc(Myc)

<400>17

Glu Gln Lys Leu Leu Ser Glu Glu Asp Leu Asn

1               5                   10

<210>18

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>NgR-1的胰蛋白酶消化

<400>18

Leu Cys Pro Gly Ala Cys Val Cys Tyr Asn Glu Pro Lys

1               5                   10

<210>19

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>NgR-1的胰蛋白酶消化

<400>19

Asp Asn Pro Trp Val Cys

1               5

<210>20

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>NgR-l的胰蛋白酶消化

<400>20

Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Ser Leu Pro Gln Arg

1               5                   10

<210>21

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>NgR-1的胰蛋白酶消化

<400>21

Cys Cys Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys

1               5

<210>22

<211>412

<212>PRT

<213>人NgR-1

<400>22

Cys Pro Gly Ala Cys Val Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser

1               5                   10                  15

Cys Pro Gln Gln Gly Leu Gln Ala Val Pro Val Gly Ile Pro Ala Ala

            20                  25                  30

Ser Gln Arg Ile Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala

        35                  40                  45

Ala Ser Phe Arg Ala Cys Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser

    50                  55                  60

Asn Val Leu Ala Arg Ile Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Ala Leu

65                  70                  75                  80

Leu Glu Gln Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Gln Leu Arg Ser Val Asp

                85                  90                  95

Pro Ala Thr Phe His Gly Leu Gly Arg Leu His Thr Leu His Leu Asp

            100                 105                 110

Arg Cys Gly Leu Gln Glu Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala

        115                 120                 125

Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr Leu Gln Asp Asn Ala Leu Gln Ala Leu Pro

    130                 135                 140

Asp Asp Thr Phe Arg Asp Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His

145                 150                 155                 160

Gly Asn Arg Ile Ser Ser Val Pro Glu Arg Ala Phe Arg Gly Leu His

                165                 170                 175

Ser Leu Asp Arg Leu Leu Leu His Gln Asn Arg Val Ala His Val His

            180                 185                 190

Pro His Ala Phe Arg Asp Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe

        195                 200                 205

Ala Asn Asn Leu Ser Ala Leu Pro Thr Glu Ala Leu Ala Pro Leu Arg

    210                 215                 220

Ala Leu Gln Tyr Leu Arg Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys

225                 230                 235                 240

Arg Ala Arg Pro Leu TrpAla Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser

                245                250                 255

Ser Glu Val Pro Cys Ser Leu Pro Gln Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu

            260                 265                 270

Lys Arg Leu Ala Ala Asn Asp Leu Gln Gly Cys Ala Val Ala Thr Gly

        275                 280                 285

Pro Tyr His Pro Ile Trp Thr Gly Arg Ala Thr Asp Glu Glu Pro Leu

    290                 295                 300

Gly Leu Pro Lys Cys Cys Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala Ser Val

305                 310                 315                 320

Leu Glu Pro Gly Arg Pro Ala Ser Ala Gly Asn Ala Leu Lys Gly Arg

                325                 330                 335

Val Pro Pro Gly Asp Ser Pro Pro Gly Asn Gly Ser Gly Pro Arg His

            340                 345                 350

Ile Asn Asp Ser Pro Phe Gly Thr Leu Pro Gly Ser Ala Glu Pro Pro

        355                 360                 365

Leu Thr Ala Val Arg Pro Glu Gly Ser Glu Pro Pro Gly Phe Pro Thr

    370                 375                 380

Ser Gly Pro Arg Arg Arg Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg

385                 390                 395                 400

Ser His Cys Arg Leu Gly Gln Ala Gly Ser Gly Gly

                405                 410

<210>23

<211>473

<212>PRT

<213>大鼠NgR1

<400>23

Met Lys Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu

1               5                  10                   15

Trp Leu Gln Ala Trp Arg Val Ala Thr Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val

            20                  25                  30

Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln Gly Leu

        35                  40                  45

Gln Ala Val Pro Thr Gly Ile Pro Ala Ser Ser Gln Arg Ile Phe Leu

    50                  55                  60

His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Gln Ser Cys

65                  70                  75                  80

Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser Asn Ala Leu Ala Arg Ile

                85                  90                  95

Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Thr Leu Leu Glu Gln Leu Asp Leu

            100                 105                 110

Ser Asp Asn Ala Gln Leu His Val Val Asp Pro Thr Thr Phe His Gly

        115                 120                 125

Leu Gly His Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Arg Glu

    130                 135                 140

Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr

145                 150                 155                 160

Leu Gln Asp Asn Asn Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asn Thr Phe Arg Asp

                165                 170                 175

Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Pro Ser

            180                 185                 190

Val Pro Glu His Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu

        195                 200                 205

Leu His Gln Asn His Val Ala Arg Val Hi s Pro His Ala Phe Arg Asp

    210                 215                 220

Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Met

225                 230                 235                 240

Leu Pro Ala Glu Val Leu Met Pro Leu Arg Ser Leu Gln Tyr Leu Arg

                245                 250                 255

Leu Asn Asp Asn Pro Trp yal Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp

            260                 265                 270

Ala Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Asn

        275                 280                 285

Leu Pro Gln Arg Leu Ala Asp Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Ser

    290                 295                 300

Asp Leu Glu Gly Cys Ala Val Ala Ser Gly Pro Phe Arg Pro Ile Gln

305                 310                 315                 320

Thr Ser Gln Leu Thr Asp Glu Glu Leu Leu Ser Leu Pro Lys Cys Cys

                325                 330                 335

Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala Ser Val Leu Glu Pro Gly Arg Pro

            340                 345                 350

Ala Ser Ala Gly Asn Ala Leu Lys Gly Arg Val Pro Pro Gly Asp Thr

        355                 360                 365

Pro Pro Gly Asn Gly Ser Gly Pro Arg His Ile Asn Asp Ser Pro Phe

    370                 375                 380

Gly Thr Leu Pro Ser Ser Ala Glu Pro Pro Leu Thr Ala Leu Arg Pro

385                 390                 395                 400

Gly Gly Ser Glu Pro Pro Gly Leu Pro Thr Thr Gly Pro Arg Arg Arg

                405                 410                 415

Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg Ser His Cys Arg Leu Gly

            420                 425                 430

Gln Ala Gly Ser Gly Ala Ser Gly Thr Gly Asp Ala Glu Gly Ser Gly

        435                 440                 445

Ala Leu Pro Ala Leu Ala Cys Ser Leu Ala Pro Leu Gly Leu Ala Leu

    450                 455                 460

Val Leu Trp Thr Val Leu Gly Pro Cys

465                 470

<210>24

<211>420

<212>PRT

<213>人NgR2

<400>24

Met Leu Pro Gly Leu Arg Arg Leu Leu Gln Ala Pro Ala Ser Ala Cys

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Met Leu Leu Ala Leu Pro Leu Ala Ala Pro Ser Cys Pro

            20                  25                  30

Met Leu Cys Thr Cys Tyr Ser Ser Pro Pro Thr Val Ser Cys Gln Ala

        35                  40                  45

Asn Asn Phe Ser Ser Val Pro Leu Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Arg

    50                 55                 60

Leu Phe Leu Gln Asn Asn Leu Ile Arg Thr Leu Arg Pro Gly Thr Phe

65                  70                  75                  80

Gly Ser Asn Leu Leu Thr Leu Trp Leu Phe Ser Asn Asn Leu Ser Thr

                85                  90                  95

Ile Tyr Pro Gly Thr Phe Arg His Leu Gln Ala Leu Glu Glu Leu Asp

            100                 105                 110

Leu Gly Asp Asn Arg His Leu Arg Ser Leu Glu Pro Asp Thr Phe Gln

        115                 120                 125

Gly Leu Glu Arg Leu Gln Ser Leu His Leu Tyr Arg Cys Gln Leu Ser

    130                 135                 140

Ser Leu Pro Gly AsnIle Phe Arg Gly Leu Val Ser Leu Gln Tyr Leu

145                 150                 155                 160

Tyr Leu Gln Glu Asn Ser Leu Leu His Leu Gln Asp Asp Leu Phe Ala

                165                 170                 175

Asp Leu Ala Asn Leu Ser His Leu Phe Leu Hi s Gly Asn Arg Leu Arg

            180                 185                 190

Leu Leu Thr Glu His Val Phe Arg Gly Leu Gly Ser Leu Asp Arg Leu

        195                 200                 205

Leu Leu His Gly Asn Arg Leu Gln Gly Val His Arg Ala Ala Phe Arg

    210                 215                 220

Gly Leu Ser Arg Leu Thr Ile Leu Tyr Leu Phe Asn Asn Ser Leu Ala

225                 230                 235                 240

Ser Leu Pro Gly Glu Ala Leu Ala Asp Leu Pro Ser Leu Glu Phe Leu

                245                 250                 255

Arg Leu Asn Ala Asn Pro Trp Ala Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu

            260                 265                 270

Trp Ala Trp Phe Gln Arg Ala Arg Val Ser Ser Ser Asp Val Thr Cys

        275                 280                 285

Ala Thr Pro Pro Glu Arg Gln Gly Arg Asp Leu Arg Ala Leu Arg Glu

    290                 295                 300

Ala Asp Phe Gln Ala Cys Pro Pro Ala Ala Pro Thr Arg Pro Gly Ser

305                 310                 315                 320

Arg Ala Arg Gly Asn Ser Ser Ser Asn His Leu Tyr Gly Val Ala Glu

                325                 330                 335

Ala Gly Ala Pro Pro Ala Asp Pro Ser Thr Leu Tyr Arg Asp Leu Pro

            340                 345                 350

Ala Glu Asp Ser Arg Gly Arg Gln Gly Gly Asp Ala Pro Thr Glu Asp

        355                 360                 365

Asp Tyr Trp Gly Gly Tyr Gly Gly Glu Asp Gln Arg Gly Glu Gln Met

    370                 375                 380

Cys Pro Gly Ala Ala Cys Gln Ala Pro Pro Asp Ser Arg Gly Pro Ala

385                 390                 395                 400

Leu Ser Ala Gly Leu Pro Ser Pro Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Val

                405                 410                 415

Pro His His Leu

            420

<210>25

<211>1422

<212>DNA

<213>大鼠Nogo受体-1

<400>25

atgaagaggg cgtcctccgg aggaagccgg ctgccgacat gggtgttatg gctacaggcc     60

tggagggtag caacgccctg ccctggtgcc tgtgtgtgct acaatgagcc caaggtcaca    120

acaagccgcc cccagcaggg cctgcaggct gtacccgctg gcatcccagc ctccagccag    180

agaatcttcc tgcacggcaa ccgaatctct tacgtgccag ccgccagctt ccagtcatgc    240

cggaatctca ccatcctgtg gctgcactca aatgcgctgg ccgggattga tgccgcggcc    300

ttcactggtc tgaccctcct ggagcaacta gatcttagtg acaatgcaca gctccgtgtc    360

gtggacccca ccacgttccg tggcctgggc cacctgcaca cgctgcacct agaccgatgc    420

ggcctgcagg agctggggcc tggcctattc cgtgggctgg cagctctgca gtacctctac    480

ctacaagaca acaacctgca ggcacttccc gacaacacct tccgagacct gggcaacctc    540

acgcatctct ttctgcatgg caaccgtatc cccagtgttc ctgagcacgc tttccgtggc    600

ttgcacagtc ttgaccgtct cctcttgcac cagaaccatg tggctcgtgt gcacccacat    660

gccttccggg accttggccg actcatgacc ctctacctgt ttgccaacaa cctctccatg    720

ctccccgcag aggtcctagt gcccctgagg tctctgcagt acctgcgact caatgacaac    780

ccctgggtgt gtgactgcag ggcacgtccg ctctgggcct ggctgcagaa gttccgaggt    840

tcctcatccg gggtgcccag caacctaccc caacgcctgg caggccgtga tctgaagcgc    900

ctggctacca gtgacttaga gggttgtgct gtggcttcgg ggcccttccg tcccttccag    960

accaatcagc tcactgatga ggagctgctg ggcctcccca agtgctgcca gccggatgct   1020

gcagacaagg cctcagtact ggaacccggg aggccggcgt ctgttggaaa tgcactcaag   1080

ggacgtgtgc ctcccggtga cactccacca ggcaatggct caggcccacg gcacatcaat   1140

gactctccat ttgggacttt gcccggctct gcagagcccc cactgactgc cctgcggcct   1200

gggggttccg agcccccggg actgcccacc acgggccccc gcaggaggcc aggttgttcc   1260

agaaagaacc gcacccgtag ccactgccgt ctgggccagg caggaagtgg gagcagtgga   1320

actggggatg cagaaggttc gggggccctg cctgccctgg cctgcagcct tgctcctctg   1380

ggccttgcac tggtactttg gacagtgctt gggccctgct ga                      1422

<210>26

<211>1263

<212>DNA

<213>人Nogo受体-2

<400>26

atgctgcccg ggctcaggcg cctgctgcaa gctcccgcct cggcctgcct cctgctgatg     60

ctcctggccc tgcccctggc ggcccccagc tgccccatgc tctgcacctg ctactcatcc    120

ccgcccaccg tgagctgcca ggccaacaac ttctcctctg tgccgctgtc cctgccaccc    180

agcactcagc gactcttcct gcagaacaac ctcatccgca cgctgcggcc aggcaccttt    240

gggtccaacc tgctcaccct gtggctcttc tccaacaacc tctccaccat ctacccgggc    300

actttccgcc acttgcaagc cctggaggag ctggacctcg gtgacaaccg gcacctgcgc    360

tcgctggagc ccgacacctt ccagggcctg gagcggctgc agtcgctgca tttgtaccgc    420

tgccagctca gcagcctgcc cggcaacatc ttccgaggcc tggtcagcct gcagtacctc    480

tacctccagg agaacagcct gctccaccta caggatgact tgttcgcgga cctggccaac    540

ctgagccacc tcttcctcca cgggaaccgc ctgcggctgc tcacagagca cgtgtttcgc    600

ggcctgggca gcctggaccg gctgctgctg cacgggaacc ggctgcaggg cgtgcaccgc    660

gcggccttcc gcggcctcag ccgcctcacc atcctctacc tgttcaacaa cagcctggcc    720

tcgctgcccg gcgaggcgct cgccgacctg ccctcgctcg agttcctgcg gctcaacgct    780

aacccctggg cgtgcgactg ccgcgcgcgg ccgctctggg cctggttcca gcgcgcgcgc    840

gtgtccagct ccgacgtgac ctgcgccacc cccccggagc gccagggccg agacctgcgc    900

gcgctccgcg aggccgactt ccaggcgtgt ccgcccgcgg cacccacgcg gccgggcagc    960

cgcgcccgcg gcaacagctc ctccaaccac ctgtacgggg tggccgaggc cggggcgccc   1020

ccagccgatc cctccaccct ctaccgagat ctgcctgccg aagactcgcg ggggcgccag   1080

ggcggggacg cgcctactga ggacgactac tgggggggct acgggggtga ggaccagcga   1140

ggggagcaga tgtgccccgg cgctgcctgc caggcgcccc cggactcccg aggccctgcg   1200

ctctcggccg ggctccccag ccctctgctt tgcctcctgc tcctggtgcc ccaccacctc   1260

tga                                                                 1263

<210>27

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>NgR-1的胰蛋白酶消化

<400>27

Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg

1               5                   10

<210>28

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>NgR-1的胰蛋白酶消化

<400>28

Cys Cys Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys

1               5

<210>29

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>NgR-1的胰蛋白酶消化

<400>29

Leu Ala Ala Asn Asp Leu Gln Gly Cys Ala Val Ala Thr Gly Pro Tyr

1               5                   10                  15

His Pro Ile Trp Thr Gly Arg

        20

<210>30

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>大鼠NgR-1的胰蛋白酶消化

<400>30

Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Asn Leu Pro Gln Arg

1               5                   10

<210>31

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>大鼠NgR-1的胰蛋白酶消化

<400>31

Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Gly Cys Arg

1               5               10

<210>32

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>大鼠NgR-1的胰蛋白酶消化

<400>32

Leu Ala Ala Ser Asp Leu Gln Gly Cys Ala

1               5                   10

2

17

Claims (39)

1. 一种40个残基或更少残基的分离多肽片段，其包含等同于SEQ ID NO：2氨基酸309-344的氨基酸序列，除了多达3个氨基酸置换外。

2. 权利要求1的多肽片段，其中至少一个所述氨基酸置换在选自C309、C335和C336的半胱氨酸残基上进行。

3. 权利要求2的多肽片段，其中所述半胱氨酸残基是C309。

4. 权利要求2的多肽片段，其中所述半胱氨酸残基是C335。

5. 权利要求2的多肽片段，其中所述半胱氨酸残基在C336上。

6. 权利要求2-5中任何一项的多肽片段，其中所述半胱氨酸残基用选自下列的不同氨基酸置换：丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

7. 权利要求6的多肽片段，其中所述不同氨基酸是丙氨酸。

8. 权利要求1-7中任何一项的多肽片段，其是环状的。

9. 权利要求8的多肽片段，其进一步包含在N端连接的第一分子和在C端连接的第二分子；其中所述第一分子和所述第二分子互相连接以形成所述环状分子。

10. 权利要求9的多肽片段，其中所述第一和第二分子选自：生物素分子、半胱氨酸残基、和乙酰化半胱氨酸残基。

11. 权利要求10的多肽片段，其中所述第一分子是附着于所述多肽的N端的生物素分子，以及所述第二分子是附着于所述多肽的C端的半胱氨酸残基。

12. 权利要求10的多肽片段，其中所述第一分子是附着于所述多肽的N端的乙酰化半胱氨酸残基，以及所述第二分子是附着于所述多肽的C端的半胱氨酸残基。

13. 权利要求10-12中任何一项的多肽片段，其中所述C端半胱氨酸具有附着的NH₂部分。

14. 权利要求1-13中任何一项的多肽片段，其与异源多肽融合。

15. 权利要求14的多肽片段，其中所述异源多肽是血清白蛋白。

16. 权利要求14的多肽片段，其中所述异源多肽是Fc区。

17. 权利要求14的多肽片段，其中所述异源多肽是信号肽。

18. 权利要求14的多肽片段，其中所述异源多肽是多肽标记。

19. 权利要求16的多肽片段，其中所述Fc区选自：IgA Fc区、IgDFc区、IgG Fc区、IgE Fc区和IgM Fc区。

20. 权利要求18的多肽片段，其中所述多肽标记选自：FLAG标记、Strep标记、多组氨酸标记、VSV-G标记、流感病毒血凝素(HA)标记和c-Myc标记。

21. 权利要求1-20中任何一项的多肽片段，其中所述多肽附着于一种或多种聚二醇部分。

22. 权利要求21的多肽片段，其中所述一种或多种聚二醇部分是聚乙二醇(PEG)部分。

23. 权利要求22的多肽片段，其中所述多肽附着于1-5个PEG部分。

24. 一种分离多核苷酸，其包含编码权利要求1-23中任何一项的多肽片段的核苷酸序列。

25. 权利要求24的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与表达控制元件可操作地连接。

26. 权利要求25的多核苷酸，其中所述表达控制元件选自：诱导型启动子；组成型启动子；和分泌信号。

27. 一种载体，其包含权利要求24-26中任何一项的多核苷酸。

28. 一种宿主细胞，其包含权利要求27的载体。

29. 一种药物组合物，其包含权利要求1-23中任何一项的多肽片段和药学可接受的载体。

30. 一种药物组合物，其包含权利要求24-26中任何一项的多核苷酸和药学可接受的载体。

31. 一种药物组合物，其包含权利要求27的载体或权利要求28的宿主细胞和药学可接受的载体。

32. 一种促进神经突长出的方法，其包括使神经元与选自下列的制剂接触：

(a)权利要求1-23中任何一项的多肽片段；

(b)权利要求24-26中任何一项的多核苷酸；和

(c)权利要求29-31中任何一项的组合物，

其中所述制剂抑制Nogo受体1介导的神经突长出抑制。

33. 权利要求32的方法，其中所述神经元在哺乳动物中。

34. 权利要求33的方法，其中所述哺乳动物是人。

35. 一种抑制通过NgR1信号传导复合物的信号转导的方法，其包括使神经元与有效量的选自下列的制剂接触：

(a)权利要求1-23中任何一项的多肽片段；

(b)权利要求24-26中任何一项的多核苷酸；和

(c)权利要求29-31中任何一项的组合物，

其中所述制剂抑制通过NgR1信号传导复合物的信号转导。

36. 权利要求35的方法，其中所述神经元在哺乳动物中。

37. 权利要求36的方法，其中所述哺乳动物是人。

38. 一种治疗哺乳动物中的中枢神经系统(CNS)疾病、病症或损伤的方法，其包括给需要治疗的哺乳动物施用有效量的选自下列的制剂：

(a)权利要求1-23中任何一项的多肽片段；

(b)权利要求24-26中任何一项的多核苷酸；和

(c)权利要求29-31中任何一项的组合物，

其中所述制剂抑制Nogo受体(1)介导的神经突长出抑制。

39. 权利要求38的方法，其中所述疾病、病症或损伤选自多发性硬化症、ALS、亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、糖尿病性神经病、中风、外伤性脑损伤、脊髓损伤、视神经炎、青光眼、听力丧失、和肾上腺脑白质营养不良。

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