MX2008002394A - Polipeptidos y fragmentos de polipeptidos del receptor de nogo y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

El receptor de Nogo 1 (Ngr1) es una proteina de repeticion rica en leucina que forma parte de un complejo de senalizacion que modula la regeneracion de axones. Los estudios previos han mostrado que la region completa de LRR del receptor de Nogo-1, inclusive la tapa C-terminal de LRR, LLRCT, es necesaria para el enlace de ligandos y que el tallo de CT adyacente del receptor de Nogo-1 contribuye a la interaccion con sus co-receptores. La presente invencion se dirige al uso de ciertos polipeptidos y fragmentos de polipeptidos del receptor de Nogo-1 y el receptor de Nogo-2 para promover la extension de neuritas, supervivencia neuronal y regeneracion axonal en neuronas del CNS. La invencion presenta moleculas y metodos utiles para evitar la inhibicion de la extension de neuritas, para promover la supervivencia neuronal y/o para promover la regeneracion axonal en neuronas del CNS.

Description

POLIPEPTIDOS Y FRAGMENTOS DE POLIPEPTIDOS DEL RECEPTOR DE NOGO Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la neurobiologia, neurología y farmacología. Más particularmente, la invención se refiere a neuronas y composiciones y métodos para mediar el crecimiento axonal.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los axones y las dendritas de las neuronas son extensiones celulares largas de las neuronas. La punta distal de un axón o neurita extensible comprende una región especializada conocida como el cono de crecimiento, el cual percibe el ambiente local y guia el crecimiento axonal hacia la célula objetivo de la neurona. La guia de crecimiento en el cono implica varias clases de moléculas de adhesión, señales intercelulares, asi como también factores que estimulan e inhiben los conos de crecimiento. La función de las células nerviosas es influenciada en gran medida por el contacto entre la neurona y otras células en su ambiente inmediato. Estas células incluyen células gliales especializadas, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés) y células Schwann en el sistema nervioso periférico (PNS, por REF: 190382 sus siglas en inglés) , las cuales envainan el axón neuronal con mielina (una estructura aislante de membranas de múltiples capas) . Mientras que las neuronas del CNS tienen la capacidad de regenerarse después de una lesión, éstas son inhibidas de hacerlo debido a la presencia de proteínas inhibitorias que están presentes en la mielina y posiblemente también por otros tipos de moléculas encontradas normalmente en su ambiente local (Brittis y Flanagan, Neuron 2001, 30, páginas 11-14; Jones y colaboradores, J . Neurosci . 2002, 22, páginas 2792-2803; Grimpe y colaboradores , J . Neurosci . 2002, 22, páginas 3144-3160) . Varias proteínas inhibidoras de mielina que se han encontrado en los oligodendrocitos han sido caracterizadas, por ejemplo, NogoA (Chen y colaboradores, Nature. 2000, 403, 434-439; Grandpre y colaboradores, Nature 2000, 403, 439-444), glicoproteina asociada con mielina (MAG, McKerracher y colaboradores, Neuron 1994, 13, 805-811; Mukhopadhyay y colaboradores, Neuron 1994, 13, 757-767) y glicoproteina de oligodendrocitos (OM-gp, Mikol y Stefansson, J. Cell. Biol. 1988, 106, 1273-1279) . Se ha mostrado por separado que cada una de estas proteínas es un ligando para el receptor de Nogo neuronal-1 ("NgRl") (Wang y colaboradores, Nature 2002, 417, 941-944; Liu y colaboradores, Science, 2002, 297, 1190-93; Grandpre y colaboradores, Nature 2000, 403, 439-444; Chen y colaboradores, Nature, 2000, 403, 434-439; Domeniconi y colaboradores, Neuron, 2002, 35, 283-90). Nogo-66 es un péptido de 66 aminoácidos de NogoA que tiene la capacidad de inhibir la extensión de neuritas y de causar el colapso de conos de crecimiento. (Fournier y colaboradores, Nature 2001, 409, 341-346) . El receptor de Nogo-1 (NgRl) es una proteina de repetición rica en leucina (LRR) que contiene ocho LRRs flanqueados por dominio ricos en cisteina N-terminales y C-terminales (regiones LRRNT y LRRCT, respectivamente y una región de tallo rica en Ser, Thr, Pro y Gly (tallo CT) entre el LRRCT y un sitio de anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI). El NgRl forma un complejo de señalización con LINGO-1 y p75 o Taj (también conocido como TROY) . Con la interacción con una proteina inhibitoria (por ej emplo, NogoA, MAG y OM-gp) , el complejo de NgRl transduce señales que conducen al colapso de conos de crecimiento y la inhibición de la extensión de neuritas. Los estudios previos han mostrado que la región de LRR completa del receptor de Nogo-1, inclusive la tapa C-terminal de LRR, LRRCT, es necesaria para el enlace de ligandos y que el tallo CT adyacente del receptor de Nogo-1 contribuye a la interacción con sus co-receptores . El daño axonal es una patología clave en muchas lesiones del sistema nervioso central (CNS) , tal como la lesión de la médula espinal, lesión traumática del cerebro y apoplejía, asi como también en la esclerosis múltiple (MS, por sus siglas en inglés). Una estrategia desarrollada recientemente para tratar lesiones del CNS y enfermedades del CNS es interferir con la inhibición del crecimiento axonal que ocurre a través de la interacción de proteínas mielinicas con sus receptores axonales, tales como NgR, LINGO-1 y p75 o Taj . Por ejemplo, se mostró que el anticuerpo anti-NogoA IN-1 mejora la recuperación funcional en ratas que se hablan sometido al corte transversal de la médula espinal (Lee y colaboradores, Nature Reviews 2003, 2, 1-7). Además, se mostró que un péptido de 40 residuos conocido como NEP1-40, un antagonista de NogoA, atenúa los efectos de la mielina o Nogo-66 sobre el colapso de conos de crecimiento y la extensión de neuritas y mejoró el resultado in vivo después de la lesión de la médula espinal (Lee y colaboradores . , Nature Reviews 2003, 2, 1-7) . Aunque estos reactivos han mostrado una gran promesa en el tratamiento de lesiones al CNS, permanece la necesidad en la técnica de compuestos adicionales que inhiban la señalización de NgR y/o atenúen el colapso de conos de crecimiento mediado por mielina y/o impidan la inhibición de la extensión de neuritas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige al uso de ciertos polipéptidos del receptor de Nogo, inclusive NgRl y NgR2 y fragmentos de polipéptidos de los mismos para promover la extensión de neuritas, la supervivencia neuronal y la regeneración axonal en neuronas del CNS. La invención presenta moléculas y métodos que son útiles para impedir la inhibición de la extensión de neuritas, para promover la supervivencia neuronal y/o para promover la regeneración axonal en neuronas del CNS. En algunas modalidades, la invención proporciona un fragmento de polipéptido aislado de 40 residuos o menos, que comprende los aminoácidos 309 a 344 de la SEC ID NO: 2, excepto por sustituciones de hasta tres aminoácidos. En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido de la invención que es cíclico. En algunas modalidades, el polipéptido cíclico comprende además una primera molécula unida a la terminación N y una segunda molécula unida a la terminación C; en donde la primera molécula y la segunda molécula se unen entre si para formar la molécula cíclica. En algunas modalidades, la primera molécula y la segunda molécula se seleccionan del grupo que consiste de: una molécula de biotina, un residuo de cisteina y un residuo de cisteina acetilada. En algunas modalidades, la primera molécula es una molécula de biotina unida la terminación N y la segunda molécula es un residuo de cisteina unido a la terminación C del polipéptido de la invención. En algunas modalidades, la primera molécula es un residuo de cisteina acetilada unido a la terminación N y la segunda molécula es un residuo de cisteina unido a la terminación C del polipéptido de la invención. En algunas modalidades, la primera molécula es un residuo de cisteina acetilada unido a la terminación N y la segunda molécula es un residuo de cisteina unido a la terminación C del polipéptido de la invención. En algunas modalidades, la cisteina C-terminal tiene una porción de NH2 unida. En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido de la invención en donde al menos un residuo de cisteina es sustituido por un aminoácido diferente. En algunas modalidades, al menos este residuo de cisteina es C309. En algunas modalidades, al menos este residuo de cisteina es C335. En algunas modalidades, al menos este residuo de cisteina está en C336. En algunas modalidades, al menos este residuo de cisteina es sustituido por un aminoácido diferente seleccionado del grupo que consiste de: alanina, serina o treonina. En algunas modalidades, el aminoácido diferente es alanina. En algunas modalidades, la invención establece además que el polipéptido se fusiona a un polipéptido heterólogo. En algunas modalidades, el polipéptido heterólogo es albúmina de suero. En algunas modalidades, el polipéptido heterólogo es una fracción Fc. En algunas modalidades, el polipéptido heterólogo es un péptido de señal. En algunas modalidades, el polipéptido heterólogo es una etiqueta de polipéptido. En algunas modalidades, la invención establece además que la región Fc se selecciona del grupo que consiste de: una región Fc de IgA; una región Fc de IgD; una región Fc de IgG, una región Fc de IgE; y una región Fc de IgM. En algunas modalidades, la invención establece además que la etiqueta de polipéptido se selecciona del grupo que consiste de: etiqueta FLAG; etiqueta Strep; etiqueta de polihistidina; etiqueta VSV-G; etiqueta de hemaglutinina del virus de influenza (HA); y etiqueta c-Myc. En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido de la invención unido a una o más porciones de polialquilenglicol. En algunas modalidades, la invención establece además que una o más de estas porciones de polialquilenglicol son una porción de polietilenglicol (PEG). En algunas modalidades, la invención proporciona además un polipéptido de la invención unido de 1 a 5 porciones de PEG. En algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de la invención. En algunas modalidades, la invención establece además que la secuencia de nucleótidos está unida de manera operable a un elemento de control de expresión (por ejemplo un promotor inducible, un promotor constitutivo o una señal de secreción) . Las modalidades adicionales incluyen un vector que comprende un polinucleótido aislado de la invención y una célula hospedante que comprende el vector. Las modalidades adicionales de la invención incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos, polinucleótidos, vectores o células hospedantes de la invención y en ciertas modalidades un portador farmacéuticamente aceptable. Las modalidades de la invención también incluyen métodos para promover la extensión de neuritas, que comprenden poner en contacto una neurona con un agente el cual incluye polipéptidos, polinucleótidos o composiciones de la invención, en donde el agente impide la inhibición de la extensión de neuritas mediada por el receptor de Nogo 1. En ciertas modalidades, la neurona es de un mamífero y en ciertas modalidades el mamífero es un humano. Las modalidades adicionales incluyen un método para inhibir la transducción de señales por medio del complejo de señalización de NgRl, que comprende poner en contacto una neurona con una cantidad efectiva de un agente el cual incluye polipéptidos, polinucleótidos o composiciones de la invención, en donde el agente inhibe la transducción de señales por medio del complejo de señalización de NgRl . En ciertas modalidades, la neurona es de un mamífero y en ciertas modalidades el mamífero es un humano. Otras modalidades incluyen un método para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central (CNS) en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero en necesidad de tratamiento una cantidad efectiva de un agente el cual incluye polipéptidos, polinucleótidos o composiciones de la invención, en donde el agente impide la inhibición de la extensión de neuritas mediada por el Receptor de Nogo 1. En ciertas modalidades, la enfermedad, trastorno o lesión se selecciona del grupo que consiste de esclerosis múltiple, ALS, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, apoplejía, lesiones traumáticas del cerebro, lesión de la médula espinal, neuritis óptica, glaucoma, pérdida de la audición y leucodistrofia adrenal.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 muestra la secuencia del FL-NgRl humano excluyendo el dominio GPI (SEC ID NO:22). La región LRRNT es representada por los aminoácidos 27-73. Las 8 regiones LRR son representadas por los aminoácidos 74-249. El dominio LRRCT es representado por los aminoácidos 250-310. La región LRRCT extendida es representada por los aminoácidos 311-337. La región de tallo es representada por los aminoácidos 338-438. Los enlaces de disulfuro determinados en este estudio están indicados con una linea negra que une residuos Cys particulares. Los residuos Cys en la forma de tiol libre están resaltados en color gris. Un residuo de hidroxiprolina (Hyp) está subrayado doblemente; los sitios de glicosilación están subrayados. Las secuencias de péptido de señal y etiqueta no se muestran. Un diagrama esquemático del FL-NgRl humano se muestra después de la secuencia. La FIGURA 2A muestra una SDS PAGE de varias proteínas de NgRI . La FIGURA 2B muestra un perfil de cromatografia de exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) de FL- NgRl. La FIGURA 2C muestra un diagrama de ELISA, utilizando un anticuerpo anti-NgRl para bloquear el enlace de AP-OMgp y AP-Lingo-1 a FL-NgRl . La FIGURA 3 muestra mapas de péptidos tripsinicos del FL-NgRl piridiletilado. Panel superior, digestión no reducida; panel inferior, digestión reducida. La FIGURA 4 muestra un espectro de EM/EM del péptido reducido parcialmente Tl que contiene un grupo NES (SEC ID NO: 18) . La FIGURA 5 muestra un espectro de masas simplificado del Pico 2 de la agrupación de péptidos tripsinicos unidos a disulfuro tratados con endo-Asp-N T21/T24/T28/T30 de FL-NgRl . Los iones y y b son debido a la fragmentación en la fuente. La figura muestra una secuencia parcial del péptido T21 (SEC ID NO: 19) y la secuencia completa del péptido T24 (SEC ID NO:20).

La FIGURA 6 muestra un Cromatograma de Ion total (TIC, por sus siglas en inglés) de la agrupación de péptidos unidos a disulfuro NEM-alquilados, parcialmente reducidos T21/T24/T28/T30 del FL-NgRI . Las identidades de los componentes de cada pico se listan en la Tabla 3. La FIGURA 7 muestra un espectro de EM/EM del péptido T30 que contiene los residuos 335-343 con un grupo NES (SEC ID NO: 21) el cual se generó a partir de la reducción del péptido tripsinico unido a disulfuro parcialmente reducido 335-343 y el péptido tripsinico 301-323. La FIGURA 8 muestra las posibles uniones de disulfuro en la agrupación de péptidos T21/T24/T28/T30. La figura muestra al secuencia completa de los péptidos T24 (SEC ID NO:20), T21 (SEC ID NO:27), T30 (SEC ID NO:28), T28 (SEC ID NO:29). La FIGURA 9 muestra las uniones de disulfuro en la agrupación de péptidos T21/T24/T28/T30. La figura muestra la secuencia completa de los péptidos T24 (SEC ID NO:20), T21 (SEC ID NO:27), T30 (SEC ID NO:28), T28 (SEC ID NO:29). La FIGURA 10 muestra el alineamiento de secuencia de proteínas de diferentes formas de NgR. La FIGURA 11 muestra los mapas de péptidos tripsinicos del NgRl(310) de rata piridiletilado . Solo los péptidos que contienen Cys que forman un enlace de disulfuro están etiquetados en los mapas. La figura muestra los péptidos T21 (SEC ID NO:30), T18 (SEC ID N0:31) y T25 (SEC ID NO: 32) del NgRl de rata. La FIGURA 12 muestra las estructuras de disulfuro en NgR2 y NgRl hechas a partir de diferentes construcciones. Las figuras muestran los aminoácidos 27-473 de la SEC ID NO: 2 (NgRl humano), aminoácidos 27-473 de la SEC ID NO:23 (NgRl de rata) y aminoácidos 31-420 de la SEC ID NO:24 (NgR2 humano).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica al cual pertenece esta invención. En caso de conflicto, dominará la presente solicitud que incluye las definiciones. A menos que sea requerido de otra manera por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán la forma singular. Todas las publicaciones, patentes y otras referencias mencionadas en este documento se incorporan a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera indicada especifica e individualmente para incorporase a manera de referencia. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en este documento se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. Los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se pretende que sean limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones . A fin de definir adicionalmente esta invención, se proporcionan los siguientes términos y definiciones. Se debe observar que el término "un" o "una" entidad, se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, "una molécula de inmunoglobulina" se entiende que representa una o más moléculas de inmunoglobulina. Como tales, los términos "un" (o "una) , "uno o más" y "al menos uno" se pueden utilizar de manera intercambiable en este documento. Por toda esta especificación y las reivindicaciones, la palabra "comprenden" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" indican la inclusión de cualquier número entero o grupo de números enteros citados pero no la exclusión de algún otro número entero o grupo de números enteros. Como se utiliza en este documento, el término "consiste de" o variaciones tales como "consisten de" o "que consiste de" utilizados por toda la especificación y las reivindicaciones, indican la inclusión de cualquier número entero o grupo de números enteros citados, pero que ningún número entero o grupo de números enteros adicionales se pueden agregar al método, estructura o composición especificado . Como se utiliza en este documento, el término "consiste esencialmente de", o variaciones tales como "consisten esencialmente de" o "que consiste esencialmente de" utilizados por toda la especificación y las reivindicaciones, indican la inclusión de cualquier número entero o grupo de números enteros citados y la inclusión opcional de cualquier número entero o grupo de números enteros citados que no cambien materialmente las propiedades básicas o novedosas del método, estructura o composición especificado. Como se utiliza en este documento, el término "polipéptidos" se propone para incluir un "polipéptido" singular asi como también "polipéptidos" plurales y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces de amida (también conocidos como enlaces peptidicos) . El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se refiere a una longitud especifica del producto. De esta manera, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteina", "cadena de aminoácido" o cualquier otro término utilizado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos están incluidos dentro de la definición de "polipéptidos" y el término "polipéptidos" se puede utilizar en lugar de, o de manera intercambiable con cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también se propone para referirse a los productos de modificaciones postexpresión del polipéptido, inclusive sin limitación la glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por medio de grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolitica o modificación por medio de aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o se puede producir por medio de tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar de cualquier manera, inclusive por medio de la sintesis química. Un polipéptido de la invención puede ser de un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1,000 o más o 2,000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tienen necesariamente esta estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida son referidos como plegados y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar preferiblemente un gran número de conformaciones diferentes y son referidos como no plegados. Como se utiliza en este documento, el término glicoproteina se refiere a una proteína acoplada a al menos una porción de carbohidrato que está unida a la proteina por via de una cadena lateral que contiene oxigeno o una cadena lateral que contiene nitrógeno de un residuo de aminoácido, por ej emplo un residuo de serina o un residuos de asparagina. Por un polipéptido "aislado" o un fragmento, variante, o derivado del mismo se propone un polipéptido que no está en su ambiente natural. No se requiere un nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede ser retirado de su ambiente nativo o natural. Los polipéptidos producidos de manera recombinante y las proteínas expresadas en células hospedantes se consideran aislados para propósitos de la invención, ya que son polipéptidos nativos o recombinantes los cuales se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente por medio de cualquier técnica adecuada. En la presente invención, un "fragmento de polipéptido" se refiere a una secuencia de aminoácido corta de un polipéptido más grande. Los fragmentos de proteínas pueden ser "independientes" o pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual el fragmento forma una parte de la región. Los ejemplos representativos de fragmentos de polipéptidos de la invención incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden aproximadamente 5 aminoácidos, aproximadamente 10 aminoácidos, aproximadamente 15 aminoácidos, aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 30 aminoácidos, aproximadamente 40 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 60 aminoácidos, aproximadamente 70 aminoácidos, aproximadamente 80 aminoácidos, aproximadamente 90 aminoácidos y aproximadamente 100 aminoácidos o más de longitud. Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a un polipéptido de la presente invención incluyen cualquier polipéptido el cual retenga al menos algo de actividad biológica. Los polipéptidos descritos en este documento pueden incluir moléculas de fragmentos, variantes o derivados en los mismos sin limitación, siempre y cuando el polipéptido sirva aún a su función. Los polipéptidos y los fragmentos de polipéptidos de NgRl de la presente invención pueden incluir fragmentos proteoliticos, fragmentos de supresión y en particular, fragmentos los cuales alcanzan más fácilmente el sitio de acción cuando son suministrados a un animal. Los fragmentos de polipéptidos incluyen además cualquier porción del polipéptido que comprenda un epitopo antigénico o inmunógeno del polipéptido nativo, inclusive los epitopos lineales asi como también tridimensionales. Los polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de NgRl de la presente invención pueden comprender regiones variantes inclusive fragmentos como se describiera anteriormente y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alterados debido a sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden ser de origen natural, tal como una variante alélica. Por una "variante alélica" se propone las formas alternativas de un gen que ocupa un sitio dado en un cromosoma de un organismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1985). Las variantes que no son de origen natural se pueden producir utilizando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Los polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de NgRl de la invención pueden comprender sustituciones, suspensiones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Los polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de NgRl de la presente invención también pueden incluir moléculas derivadas. Los polipéptidos variantes también pueden ser referidos en este documento como "análogos de polipéptidos". Como se utiliza en este documento, un "derivado" de un polipéptido o un fragmento de polipéptido se refiere a un polipéptido objetivo que tiene uno o más residuos derivatizados químicamente por la reacción de un grupo lateral funcional. También están incluidos como "derivados" aquellos péptidos los cuales contienen uno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos estándar. Por ejemplo, la 4-hidroxiprolina puede ser sustituida por prolina; la 5-hidroxilisina puede ser sustituida por lisina; la 3-metilhistidina puede ser sustituida por histidina; la homoserina puede ser sustituida por serina y la ornitina puede ser sustituida por lisina. Como se utiliza en este documento, el término "enlace de disulfuro" incluye un enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteina comprende un grupo tiol que puede formar un enlace o conexión de disulfuro con un segundo grupo tiol. Como se utiliza en este documento, una "proteina de fusión" significa una proteina que comprende un primer polipéptido conectado linealmente, por via de enlaces de polipéptidos, a un segundo polipéptido. El primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden ser idénticos o diferentes y pueden estar conectados directamente o conectados por via de un conector peptidico (véase posteriormente) . El término "polinucleótido" se propone para incluir un ácido nucleico singular asi como también ácidos nucleicos plurales y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada por ej emplo ARN mensajero (ARNm) o ADN plásmido (ADNp) . Un polinucleótido puede contener la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADNc de longitud completa, inclusive las secuencias 5' y 3' no traducidas, las secuencias codificadoras. Un polinucleótido puede comprender un enlace de fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ej emplo un enlace de amida, tal como se encuentra en los ácidos nucleicos peptidicos (PNA, por sus siglas en inglés) . El polinucleótido puede estar compuesto de cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, el cual puede ser ARN o ADN no modificado ARN o ADN modificado. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden estar compuestos de ADN de cadena individual-cadena doble, ADN que es una mezcla de regiones de cadena individual y cadena doble, ARN de cadena individual y cadena doble y ARN que es una mezcla de regiones de cadena individual y regiones de cadena doble, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de cadena individual o, más típicamente, de cadena doble o una mezcla de regiones de cadena individual y cadena doble. Como se utiliza en este documento, además, los polinucleótidos pueden estar compuestos de regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Los polinucleótidos también pueden contener una o más bases modificadas o estructuras principales de ADN o ARN modificadas por la estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tal como inosina. Se puede hacer una variedad de modificaciones al ADN y al ARN; de esta manera, "polinucleótido" incluye las formas modificadas química, enzimática o metabólicamente.

El término "ácido nucleico" se refiere a cualquiera de uno o más segmentos de ácido nucleico, por ej emplo, fragmentos de ADN o ARN que están presentes en un polinucleótido. Por un ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se propone una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, la cual ha sido retirada de su ambiente nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgR de la invención contenido en un vector se considera aislado para propósitos de la presente invención. Los ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedantes heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vi tro de polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además estas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, un sitio de enlace del ribosoma o un terminador de transcripción. Como se utiliza en este documento, una "región de codificación" es una porción de ácido nucleico que consiste de codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de detención" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región de codificación, pero cualquier secuencia flanqueadora, por ejemplo promotores, sitios de enlace del ribosoma, terminadores de transcripción, intrones y similares no son parte de una región de codificación. Dos o más regiones de codificación de la presente invención pueden estar presentes en una construcción de polinucleótido individual, por ejemplo, en un vector individual o en construcciones de polinucleótido separadas, por ej emplo en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una región de codificación individual o puede comprender dos o más regiones de codificación, por ej emplo un vector individual puede codificar por separado una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones de codificación heterólogas, ya sea fusionadas o no fusionadas a un ácido nucleico que codifica un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgR de la presente invención. Las regiones de codificación heterólogas incluyen sin limitación elementos o configuraciones especializados, tal como un péptido de señal secretorio o un dominio funcional heterólogo. En ciertas modalidades, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso del ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico el cual codifica un polipéptido puede incluir normalmente un promotor y/u otros elementos de control de transcripción o traducción asociados de manera operable con una o más regiones de codificación. Una asociación operable es cuando una región de codificación para un producto génico, por ej emplo un polipéptido, está asociada con una o más secuencias reguladoras de tal manera que colocan la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) secuencia (s) reguladora (s) . Dos fragmentos de ADN (tal como una región de codificación de polipéptido y un promotor asociado con la misma) están "asociados de manera operable" si la inducción de la función del promotor da por resultado la transcripción del ARNm que codifica el producto génico deseado y si el carácter de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de expresión para dirigir la expresión del producto génico o interferir con la capacidad de la plantilla de ADN a transcribirse. De esta manera, una región promotora estarla asociada de manera operable con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor especifico para la célula que dirige la transcripción sustancial del ADN únicamente en células predeterminadas. Otros elementos de control de transcripción, además de un promotor, por ejemplo aumentadores, operadores, represores y señales de terminación de transcripción, pueden estar asociados de manera operable con el polinucleótido para dirigir la transcripción especifica para la célula. Los promotores adecuados y otras regiones de control de transcripción se dan a conocer en este documento. Una variedad de regiones de control de transcripción es conocida para aquellas personas expertas en la técnica. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de transcripción que funcionan en células de animales vertebrados, tales como, pero no limitadas a, segmentos promotores y aumentadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, en conjunto con el intrón A) , virus de simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (tal como virus de sarcoma Rous) . Otras regiones de control de transcripción incluyen aquellas derivadas de genes de animales vertebrados tales como actina, proteina de choque térmico, hormona de crecimiento bovino y ß-globina de conejo, asi como también otras secuencias capaces de controlar la expresión de genes en células eucarióticas. Las regiones de control de transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores específicos para tejidos y aumentadores asi como también promotores inducibles por linfocinas (por ej emplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas) .

Similarmente, una variedad de elementos de control de traducción es conocida para aquellas personas de experiencia ordinaria en la técnica. Estos incluyen, pero no están limitados a sitios de enlace del ribosoma, codones de inicio y „terminación de traducción y elementos derivados de picornavirus (particularmente un sitio de entrada del ribosoma interno, o IRES, también referidos como una secuencia CITE) . En otras modalidades, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en la forma de ARN mensajero (ARNm). Las regiones de codificación de polinucleótidos y ácido nucleico de la presente invención pueden estar asociadas con regiones de codificación adicionales las cuales codifican péptidos secretorios o de señal, los cuales dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por animales mamiferos tienen un péptido de señal o secuencia lider secretoria que es escindido de la proteina madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteina creciente a través del retículo endoplásmico rugoso. Aquellas personas de experiencia ordinaria en la técnica están concientes que los polipéptidos secretados por células de animales vertebrados tienen generalmente un péptido de señal fusionado a la terminación N del polipéptido, el cual es escindido del polipéptido completo o de "longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En ciertas modalidades, se utiliza el péptido de señal nativo, por ej emplo un péptido de señal de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está asociado de manera operable con éste. Alternativamente, se puede utilizar un péptido de señal heterólogo de mamífero o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia lider de tipo silvestre puede ser sustituida por la secuencia lider de un activador de plasminógeno de tejido humano. (TPA, por sus siglas en inglés) o ß-glucuronidasa de ratón. Como se utiliza en este documento, el término "diseñado" incluye la manipulación de moléculas de ácido nucleico o polipéptido por medios sintéticos (por ej emplo por medio de técnicas recombinantes, sintesis de péptidos in vi tro, por medio del acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas) . Como se utiliza en este documento, los términos "unido", "fusionado" o "fusión" se utilizan de manera intercambiable. Estos términos se refieren a la unión de dos o más elementos o componentes, por cualquier medio que incluye la conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión en el marco" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abierta de polinucleótido (ORFs, por sus siglas en inglés) para formar un ORF continuo más grande, de una manera que mantiene el marco de lectura de traducción correcta de los ORFs originales. De esta manera, una proteina de fusión recombinante es una proteina individual que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORFs originales (segmentos que no están unidos de esa manera en la naturaleza) . Aunque el marco de lectura se hace continuo de esta manera por todos los segmentos fusionados, los segmentos pueden ser separados fisica o espacialmente por, por ejemplo, una secuencia conectora en el marco. Una secuencia "conectora" es una serie de uno o más aminoácidos que separan dos regiones de codificación de polipéptido en una proteina de fusión. Un conector tipico comprende al menos 5 aminoácidos. Los conectores adicionales comprenden al menos 10 o al menos 15 aminoácidos. En ciertas modalidades, los aminoácidos de un conector peptidico se seleccionan de manera que el conector es hidrófilo. El conector (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3, (SEC ID NO: 3) es un conector preferido que es aplicable ampliamente a muchos anticuerpos ya que proporciona una flexibilidad suficiente. Otros conectores incluyen Glu Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEC ID NO:4), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr (SEC ID NO: 5), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln (SEC ID NO: 6), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp (SEC ID NO:7), Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly (SEC ID NO:8), Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser Leu Asp (SEC ID NO: 9) y Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp (SEC ID NO: 10) . Los ejemplos de conectores más cortos incluyen fragmentos de los conectores anteriores y los ejemplos de conectores más grandes incluyen combinaciones de los conectores anteriores, combinaciones de fragmentos de los conectores anteriores y combinaciones de los conectores anteriores con fragmentos de los conectores anteriores. En el contexto de los polipéptidos, una "secuencia lineal" o una "secuencia" es un orden de aminoácidos en un polipéptido en una dirección de terminal amino a carboxilo en la cual los residuos que colindan entre si en la secuencia son contiguos en la estructura primaria del polipéptido. El término "expresión" utilizado en este documento se refiere a un proceso por medio del cual un gen produce un elemento bioquímico, por ejemplo un ARN o polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula que incluye, sin limitación, la destrucción de genes asi como también tanto la expresión transitoria como la expresión estable. Incluye sin limitación la transcripción del gen en ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN de horquilla pequeña (ARNhp) , ARN interferente pequeño (ARNip) o cualquier otro producto de ARN y la traducción de este ARNm en polipéptido (s) , asi como también cualquier proceso el cual regula ya sea la transcripción o la traducción. Si el producto deseado final es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación de ese producto bioquímico y cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico". Como se utiliza en este documento, un producto génico puede ser ya sea un ácido nucleico, por ej emplo un ARN mensajero producido por medio de la transcripción de un gen o un polipéptido el cual es traducido de una transcripción. Los productos génicos descritos en este documento incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones posteriores a la transcripción, por ej emplo poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones posteriores a la traducción, por ej emplo metilación, glicosilación, la adición de lipidos, la asociación con otras subunidades de proteínas, la escisión proteolitica y similares. Como se utiliza en este documento, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a tanto el tratamiento terapéutico como las medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o disminuir la velocidad (reducir) un cambio o trastorno fisiológico indeseado, tal como el progreso de la esclerosis múltiple. Los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no están limitados a, el alivio de síntomas, reducción del grado de enfermedad, estado estabilizado (es decir sin empeoramiento) de la enfermedad, retardo o disminución de la velocidad de progreso de la enfermedad, mejoramiento o mitigación del estado de enfermedad y remisión (ya sea parcial o total) ya sea detectable o indetectable. El "tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe el tratamiento. Aquellas personas en necesidad de tratamiento incluyen aquellas que ya tienen la condición o trastorno asi como también aquellas propensas a tener la condición o trastorno o aquellas en las cuales se debe prevenir la condición o trastorno. Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero" se da a entender cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para quien se desea la diagnosis, prognosis o terapia. Los sujetos mamiferos incluyen pero no están limitados a, humanos, animales domésticos, animales de granja, animales de zoológico, animales deportivos, animales mascota tales como perros, gatos, cobayos, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado vacuno, vacas; primates tales como simios, monos, orangutanes y chimpancés; cánidos tales como perros y lobos; félidos tales como gatos, leones y tigres; équidos tales como caballos, burros y cebras; animales para alimento tales como vacas, cerdos y ovejas; ungulados tales como ciervos y jirafas; roedores tales como ratones, ratas, hámsters y cobayos; y asi sucesivamente. En ciertas modalidades, el mamífero es un sujeto humano. Como se utiliza en este documento, las frases tales como "un sujeto que se beneficiarla de la administración de un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgR de la presente invención" y "un animal en necesidad de tratamiento" incluyen sujetos, tales como sujetos mamiferos, que se beneficiarían de la administración de un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgR de la presente invención utilizado, por ej emplo, para la detección (por ej emplo, para un procedimiento de diagnóstico) y/o para el tratamiento, es decir mitigación o prevención de una enfermedad tal como MS, con un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgR de la presente invención. Como se describiera con mayor detalle en este documento, el polipéptido o fragmento de polipéptido se puede utilizar en forma no conjugada o se puede conjugar, por ej emplo, a un fármaco, profármaco o isótopo. Como se utiliza en este documento, una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Un resultado terapéutico puede ser, por ejemplo, la disminución de síntomas, supervivencia prolongada, movilidad mejorada y similares. Un resultado terapéutico necesario no es una "cura". Como se utiliza en este documento, una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, puesto que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. La invención se dirige a ciertos polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de NgRl que promueven la supervivencia neuronal, extensión de neuritas y regeneración axonal de neuronas, por ejemplo, neuronas del CNS. Por ejemplo, la presente invención proporciona polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de NgRl los cuales estimulan el crecimiento axonal bajo condiciones en las cuales el crecimiento axonal es inhibido normalmente. De esta manera, los polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de NgRl de la invención son útiles en el tratamiento de lesiones, enfermedades o trastornos que se pueden aliviar al promover la supervivencia neuronal o por medio de la estimulación del crecimiento axonal o regeneración en el CNS. Las enfermedades, trastornos o lesiones del CNS ejemplares incluyen, pero no están limitados a, esclerosis múltiple (MS) , leucoencefalopatia multifocal progresiva (PML, por sus siglas en inglés) , encefalomielitis (EPL, por sus siglas en inglés), mielosis central del puente (CPM, por sus siglas en inglés) , adrenoleucodistrofia, enfermedad de Alexander, enfermedad de Pelizaeus Merzbacher (PMZ, por sus siglas en inglés) , Leucodistrofia de células Globoides (enfermedad de Krabbe) y Degeneración de Wallerian, neuritis óptica, mielitis transversal, esclerosis lateral amilotrófica (ALS, por sus siglas en inglés) , enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, lesión traumática del cerebro, lesión postradiación, complicaciones neurológicas de la quimioterapia, apoplejía, neuropatía óptica isquémica aguda, deficiencia de vitamina E, síndrome de deficiencia de vitamina E aislado, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia del trigémino y parálisis de Bell. Entre estas enfermedades, la MS es la más diseminada, afectando aproximadamente a 2.5 millones de personas en todo el mundo.

Polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de NgR La presente invención se dirige a ciertos polipéptidos de receptores de Nogo, inclusive NgRl y NgR2 y fragmentos de polipéptidos útiles, por ej emplo, para promover la extensión de neuritas, para promover la supervivencia neuronal, para promover la supervivencia axonal o para inhibir la transducción de señales por el complejo de señalización de NgR. Típicamente, los polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de la invención actúan para bloquear la inhibición mediada por NgR de la supervivencia neuronal, extensión de neuritas o regeneración axonal de las neuronas del sistema nervioso central (CNS) . El polipéptido de NgRl humano se muestra a continuación como la SEC ID NO: 2 y tiene el número de acceso NP_075380 en Genbank. NgRl Humano de Longitud Completa (SEC ID NO:2) : MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCY EPKVTTSCPQQGLQAVPVG IPAASQRIFLHGNRISi VPAASFRACR LT-U-.WLHS-NVLA-RIDA-AAFTGL SDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNALQ A PDDTFRDLGI^THLFLHG RISSVPERAFRGLHSLDRLLLHQISIRVAHVE-PHAFR^ LGRIMTLYLFA-^MLSALPTE LAPLRAL^^ GSSSEVPCSLPQR AGRDLKRLAANDLQGCAVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKC CQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDSPPGNGSGPRHINDSPFGTLPGSAE PPLTAVRPEGSEPPGFPTSGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGGGGTGDSEGSGA LPSLTCSLTPLGLALVLWTVLGPC. El pol ipépt ido de NgRl de rata se muestra a continuación como la SEC I D NO : 23 y t iene el número de acceso NP_446065 en Genbank . NgRl de Rata de Longitud Completa ( SEC I D NO : 23 ) : 1V-KRASSGGSRLLAWVLWLQAWRVATPCPGACVCY EPKVTTSCPQQGLQAVPTGI PASSQ---UFLHG-^^SH - ASFQSC NLTm DNAQLHWDPTTFHGLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQA LPDNTF--U)LGNLTHLFLHGN-Rff^ GRLMTLYLFAJSi SMLPAEVLMPLRSLQYL^ GSSSEVPCNLPQRLADRDLKRLAASDLEGCAVASGPFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQ PDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDTPPGNGSGPRHINDSPFGTLPSSAEPPL TALRPGGSEPPGLPTTGPR-RRPGCSRiGSIRTRSHCRLGQAGSGASGTGDAEGSGALPA LACSLAPLGLALVLWTVLGPC El polipéptido de NgR2 humano se muestra a continuación como la SEC ID NO: 24 y tiene el número de acceso NP_848665 en Genbank. NgR2 Humano de Longitud Completa (SEC ID NO:24): MLPGLR-RLLQAPASACLL MLLALPLAAPSCPMLCTCYSSPPTVSCQA FSSVPLS LPPSTQRLFLQNNLIRTL-Ea'GTFGS LLTLWLFS -NLSTIYPGTFRHLQALEELDLGD NRHLRSLEPDTFQGLERLQSLHLYRCQLSSLPGNIFRGLVSLQYLYLQENSLLHLQD DLFA LANLSHLFLHGNR RLLTEHVFRGLGSLDRLLLHGNRLQGVHRAAFRG SR LTILYL-F NSLASLPGEALADLPSLEFL--- ,NAM>WACDCRARPLWAWFQRARVSSS DVTCATPPERQGRDLRALREADFQACPPAAPTRPGSRARGNSSS ?LYGVAEAGAP PADPSTLYRDLPAEDSRGRQGGDAPTEDDYWGGYGGEDQRGEQMCPGAACQAPP DSRGPALSAGLPSPLLCLLLLVPHHL En una modalidad, la presente invención proporciona un fragmento de polipéptido aislado de 40 residuos o menos, donde el fragmento de polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a los aminoácidos 309 a 344 de la SEC ID NO: 2, excepto por sustituciones de hasta uno, dos, tres, cuatro, diez o veinte aminoácidos individuales. Por "una secuencia de aminoácidos de referencia de NgRl", "una secuencia de aminoácidos de referencia de NgR2" o "una secuencia de aminoácidos de referencia" se da a entender la secuencia especificada sin la introducción de ninguna sustitución de aminoácido. Como entenderla una persona experta en la técnica, si no hay sustituciones, el "polipéptido aislado" de la invención comprende una secuencia de aminoácidos la cual es idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia. En una modalidad, la presente invención proporciona un fragmento de polipéptido aislado de 40 residuos o menos, donde el fragmento de polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a los aminoácidos 309 a 344 de la SEC ID NO: 2, excepto por sustituciones de hasta tres aminoácidos individuales. En otra modalidad, la presente invención proporciona un fragmento de polipéptido aislado de 40 residuos o menos, donde el fragmento de polipéptido comprende, consiste de o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos idéntica a los aminoácidos 309 a 344 de la SEC ID NO: 2, excepto por sustituciones de uno, dos o tres aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos ejemplares para los fragmentos de polipéptidos de acuerdo con esta modalidad incluyen sustituciones de residuos de cisteina individuales en los polipéptidos de la invención con diferentes aminoácidos. Los residuos de cisteina en los polipéptidos de la invención pueden ser sustituidos por cualquier aminoácido heterólogo. El aminoácido diferente que se utiliza depende de una variedad de criterios, por ejemplo el efecto de la sustitución sobre la conformación del fragmento de polipéptido, la carga del fragmento de polipéptido o la hidrofilicidad del fragmento de polipéptido. Las sustituciones de aminoácidos para los aminoácidos de los polipéptidos de la invención y la secuencia de aminoácidos de referencia pueden incluir aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ej emplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ej emplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ej emplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) , cadenas laterales no polares (por ej emplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ej emplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ej emplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Los aminoácidos típicos para sustituir por cisteinas en el aminoácido de referencia incluyen alanina, serina, treonina, en particular, alanina. Hacer estas sustituciones a través del diseño de un polinucleótido que codifica el fragmento de polipéptido está dentro de la habilidad común de una persona de experiencia ordinaria en la técnica. En ciertas modalidades, la cisteina es sustituida por un aminoácido pequeño sin carga el cual es menos probable que altere la conformación tridimensional del polipéptido, por ejemplo, alanina, serina, treonina. En ciertas modalidades, el aminoácido sustituido es alanina. En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado de la invención en donde al menos un residuo de cisteina es sustituido por un aminoácido diferente. Los residuos de cisteina que pueden ser sustituidos incluyen pero no están limitados a C27, C31, C33, C43, C80, C140, C264, C266, C287, C309, C335, C336, C419, C429, C455 y C473. La presente invención proporciona además un fragmento de polipéptido aislado de 40 residuos o menos, donde el fragmento de polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a los aminoácidos 309 a 344 de la SEC ID NO:2, excepto que: C309 es sustituido, C335 es sustituido, C336 es sustituido, C309 y C335 son sustituidos, C309 y C336 son sustituidos, C335 y C336 son sustituidos o C309, C335 y C336 son sustituidos. En un aspecto, la invención incluye un polipéptido que comprende dos o más fragmentos de polipéptidos como se describiera anteriormente en una proteina de fusión, asi como también proteínas de fusión que comprenden un fragmento de polipéptido como se describiera anteriormente fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga. La invención comprende además variantes, análogos o derivados de fragmentos de polipéptidos como se describiera anteriormente. En la presente invención, un polipéptido puede estar compuesto de aminoácidos unidos entre si por enlaces peptidicos o enlaces peptidicos modificados, es decir isoésteres peptidicos y puede contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por genes (por ej emplo aminoácidos que no son de origen natural). Los polipéptidos de la presente invención pueden modificarse ya sea por medio de procesos naturales, tal como el procesamiento posterior a la traducción o por medio de técnicas de modificación química las cuales son bien conocidas en la técnica. Estas modificaciones se describen en textos básicos y en monografías más detalladas, asi como también en la bibliografía de investigación voluminosa. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier parte en el polipéptido, inclusive la estructura principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y las terminaciones amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificaciones pueden estar presentes en grados iguales o variantes en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados, por ejemplo, como resultado de la ubiquitinación y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos naturales posteriores a la traducción o se pueden hacer por medio de métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción de heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lipido o derivado de lipido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlaces de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, conjugación con PEG, procesamiento proteolitico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación. ( Véase, por ejemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993) ; Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, páginas 1-12 (1983); Seifter y colaboradores, Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan y colaboradores, Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992) ) . Los polipéptidos descritos en este documento pueden ser cíclicos. La ciclización de los polipéptidos reduce la libertad adaptativa de péptidos lineales y da por resultado una molécula más constreñida estructuralmente. Muchos métodos de ciclización de péptidos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la ciclización de "estructura principal a estructura principal" por medio de la formación de un enlace de amida entre los residuos de aminoácidos N-terminales y C-terminales del péptido. El método de ciclización de "estructura principal a estructura principal" incluye la formación de conexiones de disulfuro entre dos residuos de aminoácido ?-tio (por ejemplo cisteina, homocisteina) . Ciertos péptidos de la presente invención incluyen modificaciones en la terminación N y C del péptido para formar un polipéptido cíclico. Estas modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, residuos de cisteina, residuos de cisteina acetilada, residuos de cisteina con una porción de NH2 y biotina. Otros métodos de ciclización de péptidos se describen en Li & Roller. Curr. Top . Med. Chem . 3:325-341 (2002), la cual se incorpora a manera de referencia en este documento en su totalidad. En los métodos de la presente invención, un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención se puede administrar directamente como un polipéptido preformado o indirectamente a través de un vector de ácido nucleico. En algunas modalidades de la invención, un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención se administra en un método de tratamiento que incluye: (1) transformar o transfectar una célula hospedante implantable con un ácido nucleico, por ej emplo un vector, que expresa un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención; y (2) implantar la célula hospedante transformada en un mamífero, en el sitio de una enfermedad, trastorno o lesión. Por ejemplo, la célula hospedante transformada se puede implantar en el sitio de una lesión crónica de MS . En algunas modalidades de la invención, la célula hospedante implantable es retirada de un mamífero, cultivada temporalmente, transformada o transfectada con un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención e implantada nuevamente en el mismo mamífero del cual se retiró. La célula puede ser, pero no es necesario que sea, retirada del mismo sitio en el cual se implanta. Estas modalidades, algunas veces conocidas como terapia génica ex vivo, pueden proporcionar un suministro continuo del polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención, localizado en el sitio de acción, durante un periodo de tiempo limitado. Los polipéptidos de NgR ejemplares, adicionales de la invención y los métodos y materiales para obtener estas moléculas para la práctica de la presente invención se describen a continuación.

Proteínas de Fusión y Polipéptidos Conjugados Algunas modalidades de la invención implican el uso de un polipéptido de NgR que no sea la proteina de NgR de longitud completa, por ej emplo, fragmentos de polipéptidos de NgR, fusionados a una porción de polipéptido heteróloga para formar una proteina de fusión. Estas proteínas de fusión se pueden utilizar para alcanzar varios objetivos, por ejemplo una vida media en el suero incrementada, biodisponibilidad mejorada, fijación como objetivo in vivo para un tipo de órgano o tejido especifico, eficacia de expresión recombinante mejorada, secreción mejorada en células hospedantes, facilidad de purificación y avidez más alta. Dependiendo del (los) objetivo (s) a alcanzar, la porción heteróloga puede ser inerte o biológicamente activa. También, se puede seleccionar para fusionarse de manera estable a la porción de polipéptido de NgR de la invención o para ser escindible, in vi tro o in vivo . Las porciones heterólogas para alcanzar estos otros objetivos son conocidas en la técnica . Como una alternativa para la expresión de una proteina de fusión, se puede preformar una porción heteróloga seleccionada y se puede conjugar químicamente a la porción de polipéptido de NgR de la invención. En la mayoría de los casos, una porción heteróloga seleccionada funcionará similarmente, ya sea fusionada o conjugada a la porción de polipéptido de NgR. Por lo tanto, en la siguiente descripción de las secuencias de aminoácidos heterólogas, a menos que se observe de otra manera, se debe entender que la secuencia heteróloga puede unirse a la porción de polipéptido de NgR en la forma de una proteina de fusión o como un conjugado químico. Los polipéptidos farmacológicamente activos tales como los polipéptidos de NgR pueden exhibir una eliminación rápida in vivo, necesitando dosis más grandes para lograr las concentraciones terapéuticamente efectivas en el cuerpo. Además, los polipéptidos más pequeños que aproximadamente 60 kDa se someten potencialmente a la filtración glomerular, la cual conduce algunas veces a la nefrotoxicidad. La fusión o conjugación de polipéptidos relativamente pequeños tales como fragmentos de polipéptidos del dominio de señalización de NgR se puede emplear para reducir o evitar el riesgo de esta nefrotoxicidad. Se conocen varias secuencias de aminoácidos heterólogas, es decir, porciones de polipéptidos o "portadores" para incrementar la estabilidad in vivo, es decir, la vida media en el suero, de polipéptidos terapéuticos. Los ejemplos incluyen albúminas de suero tales como, por ej emplo, albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) o albúmina de suero humano (HSA, por sus siglas en inglés). Debido a su vida media prolongada, amplia distribución ín vivo y falta de función enzimática o inmunológica, la albúmina de suero humano esencialmente de longitud completa (HSA) o un fragmento de HSA, se utiliza comúnmente como una porción heteróloga. A través de la aplicación de métodos y materiales tales como aquellos enseñados en Yeh y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 89:1904-08 (1992) y Syed y colaboradores, Blood 89:3243-52 (1997), la HSA se puede utilizar para formar una proteina de fusión o conjugado de polipéptidos que exhibe actividad farmacológica en virtud de la porción de polipéptido de NgR mientras que exhibe una estabilidad in vivo significativamente incrementada, por ejemplo 10 veces a 100 veces más alta. La terminación C de la HSA se puede fusionar a la terminación N de la porción de polipéptido de NgR. Puesto que la HSA es una proteina secretada naturalmente, la secuencia de señal de la HSA puede ser explotada para obtener la secreción de la proteina de fusión en el medio de cultivo celular cuando la proteina de fusión se produce en un sistema de expresión eucariótico, por ej emplo de mamífero. En ciertas modalidades, los polipéptidos de NgR para el uso en los métodos de la presente invención comprenden además una porción de fijación como objetivo. Las porciones de fijación como objetivo incluyen una proteina o un péptido el cual dirige la localización a una cierta parte del cuerpo, por ejemplo, al cerebro o compartimientos en el mismo. En ciertas modalidades, los polipéptidos de NgR para el uso en los métodos de la presente invención se unen o fusionan a una porción de fijación como objetivo del cerebro. Las porciones de fijación como objetivo del cerebro se unen covalentemente (por ejemplo, fusión de traducción directa o por medio de la unión química ya sea directamente o a través de una molécula separadora, la cual puede ser escindible opcionalmente) o se une de manera no covalente (por ejemplo, a través de interacciones reversibles tales como avidina :biotina, proteina A:IgG, etcétera). En otras modalidades, los polipéptidos de NgR para el uso en los métodos de la presente invención se unen a una o más porciones de fijación como objetivo del cerebro. En modalidades adicionales, la porción de fijación como objetivo del cerebro se une a una pluralidad de polipéptidos de NgR para el uso en los métodos de la presente invención. Una porción de fijación como objetivo del cerebro asociada con un polipéptido de NgR mejora el suministro en el cerebro de este polipéptido de NgR. Se ha descrito una variedad de polipéptidos los cuales, cuando se fusionan a una proteina o agente terapéutico, suministran la proteina o agente terapéutico a través de la barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés). Los ejemplos no limitantes incluyen el anticuerpo de dominio individual FC5 (Abulrob y colaboradores (2005) J. Neurochem . 95, 1201-1214); mAB 83-14, un anticuerpo monoclonal para el receptor de insulina humana (Pardridge y colaboradores (1995) Pharmacol . Res . 12, 807-816); los péptidos B2, B6 y B8 que se enlazan al receptor de transferina humana (hTfR) (Xia y colaboradores (2000) J. Virol . 74, 11359-11366); el anticuerpo monoclonal 0X26 para el receptor de transferina (Pardridge y colaboradores (1991) J. Pharmacol . Exp. Ther. 259, 66-70); conjugados de toxina de difteria ( véase, por ej emplo, Gaillard y colaboradores, Interna tional Congress Series 1277:185-198 (2005); y las SEC ID NOs: 1-18 de la Patente Norteamericana No. 6,306,365. Los contenidos de las referencias anteriores se incorporan en este documento a manera de referencia en su totalidad. El suministro mejorado en el cerebro de una composición de NgR es determinado por una variedad de medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la administración a un animal de un polipéptido de NgR etiquetado de manera radioactiva unido a una porción de fijación como objetivo del cerebro; la determinación de la localización en el cerebro; y la comparación de la localización con un polipéptido de NgR etiquetado de manera radioactiva equivalente que no está asociado con una porción de fijación como objetivo del cerebro. Otros medios para determinar la fijación como objetivo mejorada se describen en las referencias anteriores. Algunas modalidades de la invención emplean una porción de polipéptido de NgR fusionada a una región de articulación y Fc, es decir la porción C-terminal de una región constante de cadena pesada de Ig. En algunas modalidades, los aminoácidos en la región de reticulación pueden ser sustituidos por diferentes aminoácidos. Las sustituciones ejemplares de aminoácidos para la región de articulación de acuerdo con estas modalidades incluyen sustituciones de residuos de cisteina individuales en la región de articulación con diferentes aminoácidos. Cualquier aminoácido diferente puede ser sustituido por una cisteina en la región de articulación. Las sustituciones de aminoácidos para los aminoácidos de los polipéptidos de la invención y la secuencia de aminoácidos de referencia pueden incluir aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ej emplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) , cadenas laterales no polares (por ej emplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ej emplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Los aminoácidos típicos para sustituir por cisteinas en el aminoácido de referencia incluyen alanina, serina, treonina, en particular serina y alanina. Hacer estas sustituciones a través del diseño de un polinucleótido que codifica el fragmento de polipéptido está dentro de la habilidad rutinaria de una persona de experiencia ordinaria en la técnica. Las ventajas potenciales de una fusión de polipéptido de NgR-Fc incluyen la solubilidad, estabilidad in vivo y multivalencia, por ejemplo, dimerización. La región Fc utilizada puede ser una región Fc de IgA, IgD o IgG (articulación-CH2-CH3) . Alternativamente, puede ser una región Fc de IgE o IgM (articulación-CH2-CH3-CH4 ) . La región Fc de IgG se utiliza generalmente, por ejemplo, una región Fc de IgGl o una región Fc de IgG4. Los materiales y métodos para la construcción y expresión de fusiones de Fc que codifican el ADN son conocidos en la técnica y se pueden aplicar para obtener fusiones sin experimentación indebida. Algunas modalidades de la invención emplean una proteina de fusión tal como aquellas descritas en Capón y colaboradores , Patentes Norteamericanas Nos. 5,428,130 y 5,565,335. La secuencia de señal es un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que inicia el transporte de una proteina a través de la membrana del retículo endoplásmico. Las secuencias de señal útiles para construir una inmunofusina incluyen las secuencias de señal de cadena ligera de anticuerpo, por ej emplo, el anticuerpo 14.18 (Gillies y colaboradores, J. Immunol . Meth., 125:191-202 (1989)), secuencias de señal de cadena pesada de anticuerpo, por ej emplo, la secuencia de señal de cadena pesada de anticuerpo MOPC141 (Sakano y colaboradores, Nature 286:5774 (1980)). Alternativamente, se pueden utilizar otras secuencias de señal. Véase, por ej emplo, Watson, Nucí. Acids Res . 12:5145 (1984). El péptido de señal es escindido usualmente en el lumen del retículo endoplásmico por peptidasas de señal. Esto da por resultado la secreción de una proteina inmunofusina que contiene la región Fc y la porción de polipéptido de NgR. En algunas modalidades, la secuencia de ADN puede codificar un sitio de escisión proteotilica entre el cásete de secreción y la porción de polipéptido de NgR. Este sitio de escisión puede proporcionar, por ej emplo, la escisión proteolitica de la proteina de fusión codificada, separando de esta manera el dominio Fc de la proteína objetivo. Los sitios de escisión proteolitica útiles incluyen secuencias de aminoácidos reconocidas por enzimas proteoliticas tales como tripsina, plasmina, trombina, factor Xa o enterocinasa K. El cásete de secreción se puede incorporar en un vector de expresión replicable. Los vectores útiles incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, cósmidos y similares. Un vector de expresión ejemplar es pdC, en el cual la transcripción del ADN de inmunofusina se coloca bajo control del potenciador y promotor del citomegalovirus humano. Véase, por ejemplo, Lo y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 1088:712 (1991); y Lo y colaboradores, Protein Engineering 11:495-500 (1998). Una célula hospedante apropiada se puede transformar o transfectar con un ADN que codifica un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención y se utiliza para la expresión y secreción del polipéptido. Las células hospedantes que se utilizan típicamente incluyen células de hibridoma inmortales, células de mieloma, células 293, células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), células Hela y célula COS. Las regiones Fc de tipo natural completamente intactas exhiben funciones efectoras que normalmente son innecesarias e indeseadas en una proteina de fusión Fc utilizada en los métodos de la presente invención. Por lo tanto, ciertos sitios de enlace son suprimidos típicamente de la región Fc durante la construcción del cásete de secreción. Por ejemplo, puesto que la coexpresión con la cadena ligera es innecesaria, el sitio de enlace para la proteina de enlace de cadena pesada, Bip (Hendershot y colaboradores, Immunol . Today 8:111-14 (1987)), es suprimido del dominio CH2 de la región Fc de la IgE, de tal manera que este sitio no interfiere con la secreción eficiente de la inmunofusina. Las secuencias de dominio transmembrana tales como aquellas presentes en IgM, también son suprimidas generalmente. La región Fc de IgGl se utiliza más frecuentemente. Alternativamente, la región Fc de las otras subclases de inmunoglobulina gamma (gamma-2, gamma-3 y gamma-4) se puede utilizar en el cásete de secreción. La región Fc de IgGl de inmunoglobulina gamma-1 se utiliza generalmente en el cásete de secreción e incluye al menos parte de la región de articulación, la región CH2 y la región CH3. En algunas modalidades, la región Fc de inmunoglobulina gamma-1 es una región Fc con CH2 suprimida, la cual incluye parte de la región de articulación y la región CH3, pero no la región CH2. Una región Fc con CH2 suprimida ha sido descrita por Gillies y colaboradores, Hum. Antibod. Hybridomas 1:47 (1990) . En algunas modalidades, se utiliza la región Fc de uno de IgA, IgD, IgE o IgM. Las proteínas de fusión de porción de polipéptido de NgR-Fc se pueden construir en varias configuraciones diferentes. En una modalidad, la terminación C de la porción de polipéptido de NgR se fusiona directamente a la terminación N de la porción de articulación Fc. En una configuración ligeramente diferente, un polipéptido corto, por ej emplo, 2-10 aminoácidos, se incorpora en la fusión entre la terminación N de la porción de polipéptido de NgR y la terminación C de la porción Fc. En la configuración alternativa, el polipéptido corto se incorpora en la fusión entre la terminación C de la porción de polipéptido de NgR y la terminación N de la porción Fc . Este conector proporciona flexibilidad adaptativa, lo cual puede mejorar la actividad biológica en algunas circunstancias. Si una porción suficiente de la región de articulación es retenida en la porción Fc, la fusión porción de polipéptido de NgR-Fc se dimerizará, formando de esta manera una molécula divalente. Una población homogénea de fusiones Fc monoméricas producirá dimeros bivalentes, monoespecificos . Una mezcla de dos fusiones Fc monoméricas que tienen cada una especificidad diferente producirá dímeros bivalentes, biespecificos. Cualquiera de una variedad de reticuladores que contienen un grupo amino-reactivo y un grupo tiol-reactivo correspondientes se pueden utilizar para enlazar un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención a la albúmina de suero. Los ejemplos de conectores adecuados incluyen reticuladores reactivos con amina que insertan una maleimida tiol-reactiva, por ejemplo, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS y GMBS . Otros conectores adecuados insertan un grupo haloacetato tiol-reactivo, por ejemplo, SBAP, SIA, SIAB. Los conectores que proporcionan un grupo tiol protegido o no protegido para la reacción con grupos sulfhidrilo para producir una unión reducible incluyen SPDP, SMPT, SATA y SATP. Estos reactivos son comercialmente disponibles (por ejemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, IL) . La conjugación no tiene que implicar la terminación N de un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención o la porción tiol en la albúmina de suero. Por ejemplo, las fusiones de polipéptido de NgR-albúmina se pueden obtener utilizando técnicas de ingeniería genética, en donde la porción de polipéptido de NgR se fusiona al gen de albúmina de suero en su terminación N, terminación C o ambas. Los polipéptidos de NgR de la invención se pueden fusionar a una etiqueta de polipéptido. El término "etiqueta de polipéptido" como se utiliza en este documento, se propone para referirse a cualquier secuencia de aminoácidos que pueda unirse a, conectarse a o enlazarse a un polipéptido de NgR y que se puede utilizar para identificar, purificar, concentrar o aislar el polipéptido de NgR. La unión de la etiqueta de polipéptido al polipéptido de NgR puede ocurrir, por ejemplo, al construir una molécula de ácido nucleico que comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica la etiqueta de polipéptido y (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de NgR. Las etiquetas de polipéptido ejemplares incluyen, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que se pueden modificar después de la traducción, por ejemplo secuencias de aminoácidos que son biotiniladas. Otras etiquetas de polipéptido ejemplares incluyen, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que pueden ser reconocidas y/o enlazadas por un anticuerpo (o un fragmento del mismo) u otro reactivo de enlace especifico. Las etiquetas de polipéptido que pueden ser reconocidas por un anticuerpo (o un fragmento del mismo) u otro reactivo de enlace especifico incluyen, por ej emplo aquellas que son conocidas en la técnica como "etiquetas de epitopos". Una etiqueta de epitopo puede ser una etiqueta de epitopo natural o artificial. Las etiquetas de epitopos naturales y artificiales son conocidas en la técnica, inclusive por ejemplo los epitopos artificiales tales como los péptidos FLAG, Strep o poli- histidina. Los péptidos FLAG incluyen la secuencia Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEC ID NO: 11) o Asp-Tyr-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys (SEC ID NO: 12) (Einhauer, A. y Jungbauer, A., J. Biochem . Biophys . Methods 49:1-3:455-465 (2001)). El epitopo Strep tiene la secuencia Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEC ID NO: 13) . El epitopo VSV-G también se puede utilizar y tiene la secuencia Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys (SEC ID NO: 14). Otro epítopo artificial es una secuencia poli-His que tiene seis residuos de histidina (His-His-His-His-His-His (SEC ID NO: 15) . Los epitopos de origen natural incluyen la secuencia de hemaglutinina de virus de influenza (HA) Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg (SEC ID NO: 16) reconocida por el anticuerpo monoclonal 12CA5 (Murray y colaboradores, Anal . Biochem . 229:170-179 (1995)) y la secuencia de once aminoácidos de c-myc humano (Myc) reconocido por el anticuerpo monoclonal 9E10 (Glu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn (SEC ID NO: 17) (Manstein y colaboradores, Gene 162:129-134 (1995)). Otro epitopo útil es el tripéptido Glu-Glu-Phe el cual es reconocido por el anticuerpo monoclonal YL 1/2. (Stammers y colaboradores FEBS Let t . 253:298-302(1991)). En ciertas modalidades, el polipéptido de NgR y la etiqueta de polipéptido se pueden conectar por via de una secuencia de aminoácidos de unión. Como se utiliza en este documento, una "secuencia de aminoácidos de unión" puede ser una secuencia de aminoácidos que pueda ser reconocida y/o escindida por una o más proteasas. Las secuencias de aminoácidos que pueden ser reconocidas y/o escindidas por una o más proteasas son conocidas en la técnica. Las secuencias de aminoácidos ejemplares son aquellas que son reconocidas por las siguientes proteasas: factor Vlla, factor IXa, factor Xa, APC, t-PA, u-PA, tripsina, quimiotripsina, enterocinasa, pepsina, catepsina B,H,L,S,D, catepsina G, renina, enzima de conversión de angiotensina, metaloproteasas de matriz (colagenasas, estromelisinas, gelatinasas) , elastasa de macrófago, Cir y Cis. Las secuencias de aminoácidos que son reconocidas por las proteasas mencionadas anteriormente son conocidas en la técnica. Las secuencias ejemplares reconocidas por ciertas proteasas se pueden encontrar, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,811,252. Las etiquetas de polipéptidos pueden facilitar la purificación utilizando medios de cromatografia comercialmente disponibles. En algunas modalidades de la invención, una construcción de fusión de polipéptido de NgR se utiliza para mejorar la producción de una porción de polipéptido de NgR en bacterias. En estas construcciones, una proteína bacteriana expresada y/o secretada normalmente a un nivel alto se emplea como el compañero de fusión N-terminal de un polipéptido o fracción de polipéptido de NgRl de la invención. Véase, por ejemplo, Smith y colaboradores, Gene 67:31 (1988); Hopp y colaboradores, Bíotechnology 6:1204 (1988); La Vallie y colaboradores, Bíotechnology 11:187 (1993). Al fusionar una porción de polipéptido de NgR en las terminaciones amino y carboxi de un compañero de fusión adecuado, se pueden obtener formas bivalentes o tetravalentes de un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención. Por ejemplo, una porción de polipéptido de NgRl se puede fusionar a las terminaciones amino y carboxi de una porción de Ig para producir un polipéptido monomérico bivalente que contiene dos porciones de polipéptido de NgR. Con la dimerización de dos de estos monómeros, en virtud de la porción de Ig, se obtiene una forma tetravalente de un polipéptido de NgR. Estas formas multivalentes se pueden utilizar para lograr una afinidad de enlace incrementada para el objetivo. Las formas multivalentes de un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención también se pueden obtener al colocar porciones de polipéptido de NgR en tándem para formar concatámeros, los cuales se pueden emplear solos o fusionados a un compañero de fusión tal como Ig o HSA.

Polímeros Conjugados (diferentes de polipéptidos) Algunas modalidades de la invención involucran un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención, en donde uno o más polímeros son conjugados (unidos covalentemente) al polipéptido de NgR. Los ejemplos de polímeros adecuados para esta conjugación incluyen los polipéptidos (descritos anteriormente) , polímeros de azúcar y cadenas de polialquilenglicol. Típicamente, pero no necesariamente, un polimero se conjuga al polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención con el propósito de mejorar una o más de las siguientes: solubilidad, estabilidad o biodisponibilidad. La clase de polimero utilizado generalmente para la conjugación a un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención es un polialquilenglicol. El polietilenglicol (PEG) se utiliza mucho más frecuentemente. Las porciones de PEG, por ej emplo 1, 2, 3, 4 o 5 polímeros de PEG, se pueden conjugar a cada polipéptido de NgR para incrementar la vida media en el suero, en comparación con el polipéptido de NgR solo. Las porciones de PEG no son antigénicas y son en esencia biológicamente inertes. Las porciones de PEG utilizadas en la práctica de la invención pueden ser ramificadas o no ramificadas. El número de porciones de PEG unidas al polipéptido de NgR y el peso molecular de las cadenas de PEG individuales pueden variar. En general, mientras más alto sea el peso molecular del polimero, menos cadenas de polimero se unen al polipéptido. Usualmente, la masa total de polimero unida a un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl es de 20 kDa a 40 kDa. De esta manera, si se une una cadena de polimero, el peso molecular de la cadena es generalmente 20-40 kDa. Si se unen dos cadenas, el peso molecular de cada cadena es generalmente 10-20 kDa. Si se unen tres cadenas, el peso molecular es generalmente 7-14 kDa. El polimero, por ejemplo, PEG, se puede unir al polipéptido de NgR a través de cualquier grupo reactivo, expuesto, adecuado en el polipéptido. El (los) grupo (s) reactivo (s) expuesto (s) puede (n) ser, por ejemplo, un grupo amino N-terminal o el grupo épsilon de un residuo de lisina interno o ambos. Un polimero activado puede reaccionar y unirse covalentemente a cualquier grupo amino libre en el polipéptido de NgR. Los grupos carboxilicos libres, grupos carbonilo activados de manera adecuada, hidroxilo, guanidilo, imidazol, porciones de carbohidrato oxidado y grupos mercapto del polipéptido de NgR (si están disponibles) también se pueden utilizar como grupos reactivos para la unión del polimero. En una reacción de conjugación, se emplea típicamente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 10 moles de polimero activado por mol de polipéptido, dependiendo de la concentración del polipéptido. Usualmente, la relación seleccionada representa un balance entre maximizar la reacción mientras se minimizan las reacciones secundarias (frecuentemente no especificas) que pueden deteriorar la actividad farmacológica deseada de la porción de polipéptido de NgR. Preferiblemente, se retiene al menos 50% de la actividad biológica (como se demuestra, por ej emplo, en cualquiera de los ensayos descritos en este documento o conocidos en la técnica) del polipéptido de NgR y mucho más preferiblemente se retiene casi 100%. El polímero se puede conjugar al polipéptido de NgR utilizando la química convencional. Por ejemplo, la porción de polialquilenglicol se puede acoplar a un grupo épsilon-amino de la lisina del polipéptido de NgR. La unión a la cadena lateral de lisina se puede realizar con un éster activo de N-hidroxilsuccinimida (NHS) tal como succinato de PEG-succinimidilo (SS-PEG) y propionato de succinimidilo (SPA-PEG) . Las porciones de polialquilenglicol adecuadas incluyen, por ej emplo, carboximetil-NHS y norleucina-NHS, SC. Estos reactivos son comercialmente disponibles. Los conectores de PEG amina-reactivos adicionales pueden ser sustituidos por la porción de succinimidilo. Estos incluyen, por ejemplo, isotiocianatos, nitrofenilcarbonatos (PNP), epóxidos, carbonatos de benzotriazol, SC-PEG, tresilato, aldehido, epóxido, carbonilimidazol y carbonato de PNP. Las condiciones son optimizadas usualmente para maximizar la selectividad y el grado de reacción. Esta optimización de las condiciones de reacción está dentro de la experiencia ordinaria en la técnica. La conjugación a PEG se puede llevar a cabo por medio de cualquiera de las reacciones de conjugación a PEG conocidas en la técnica. Véase, por ej emplo Focus on Growth Factors, 3: 4-10, 1992 y las solicitudes de patente europeas EP 0 154 316 y EP 0 401 384. La conjugación a PEG se puede llevar a cabo utilizando una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de polietilenglicol (o un polimero soluble en agua, reactivo, análogo) . La conjugación a PEG por medio de la acilación implica generalmente hacer reaccionar un derivado de éster activo de polietilenglicol. Cualquier molécula reactiva de PEG se puede emplear en la conjugación a PEG. El PEG esterificado a N-hidroxisuccinimida (NHS) es un éster activado de PEG frecuentemente utilizado. Como se utiliza en este documento, la "acilación" incluye sin limitación los siguientes tipos de uniones entre la proteina terapéutica y un polimero soluble en agua tal como PEG: amida, carbamato, uretano y similares. Véase, por ejemplo, Bioconjugate Chem. 5: 133-140, 1994. Los parámetros de reacción se seleccionan generalmente para evitar condiciones de temperatura, solventes y pH que dañarían o inactivarian el polipéptido de NgR. Generalmente, la unión de conexión es una amida y típicamente al menos 95% del producto resultante es mono-, di- o tri-conjugado a PEG. Sin embargo, algunas especies con grados más altos de conjugación a PEG se pueden formar en cantidades que dependen de las condiciones de reacción especificas utilizadas. Opcionalmente, las especies purificadas conjugadas a PEG se separan de la mezcla, particularmente especies sin reaccionar, por medio de métodos de purificación convencionales, inclusive, por ej emplo, diálisis, precipitación por sales, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografia de filtración en gel, cromatografia de intercambio hidrófobo y electroforesis . La conjugación a PEG por medio de la alquilación implica generalmente la reacción de un derivado de aldehido terminal de PEG con un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención en presencia de un agente reductor. Además, uno puede manipular las condiciones de reacción para favorecer la conjugación a PEG sustancialmente solo en el grupo amino N-terminal del polipéptido de NgR, es decir una proteina mono-conjugada a PEG. En cualquier caso de la mono-conjugación a PEG o poli-conjugación a PEG, los grupos PEG se unen típicamente a la proteina por via de un grupo -CH2-NH- . Con referencia particular al grupo -CH2-, este tipo de unión es conocida como una unión de "alquilo". La derivatización por via de la alquilación reductiva para producir un producto mono-conjugado a PEG fijado como objetivo de manera N-terminal explota la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina contra la N-terminal) disponibles para la derivatización. La reacción se realiza a un pH que permite que uno tome ventaja de las diferencias de pKa entre los grupos épsilon-amino de los residuos de lisina y aquel del grupo amino N-terminal de la proteina. Por medio de esta derivatización selectiva, se controla la unión de un polimero soluble en agua que contiene un grupo reactivo, tal como un aldehido, a una proteina: la conjugación con el polimero toma lugar predominantemente en la terminación N de la proteina y no ocurre una modificación significativa de otros grupos reactivos, tales como los grupos amino de cadena lateral de lisina. Las moléculas de polimero utilizadas en los planteamientos tanto de acilación como de alquilación se seleccionan entre los polímeros solubles en agua. El polimero seleccionado se modifica típicamente para tener un grupo reactivo individual, tal como un éster activo para la acilación o un aldehido para la alquilación, de manera que el grado de polimerización puede controlarse como está previsto en los presentes métodos. Un aldehido de PEG reactivo, ejemplar es un propionaldehído de polietilenglicol, el cual es estable en agua o mono-alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono o derivados de ariloxi del mismo ( véase, por ej emplo, Harris y colaboradores, Patente Norteamericana No. 5,252,714). El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Para las reacciones de acilación, el (los) polimero (s) seleccionado (s) tiene (n) típicamente un grupo éster reactivo, individual. Para la alquilación reductiva, el (los) polimero (s) seleccionado (s) tiene (n) típicamente un grupo aldehido reactivo, individual. Generalmente, el polimero soluble en agua no se seleccionará de residuos de glicosilo de origen natural, debido usualmente a que éstos son hechos más convenientemente por los sistemas de expresión recombinante de mamiferos. Los métodos para preparar los polipéptidos de NgR conjugados a PEG de la invención incluyen generalmente los pasos que consisten en (a) hacer reaccionar un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención con polietilenglicol (tal como un éster reactivo o derivado de aldehido de PEG) bajo condiciones por medio de las cuales la molécula se une a uno o más grupos PEG y (b) obtener el (los) producto (s) de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación serán determinadas caso por caso basándose en los parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, mientras más grande sea la relación de PEG con respecto a la proteina, esto conducirá generalmente a un mayor porcentaje del producto poli-conjugado a PEG. La alquilación reductiva para producir una población sustancialmente homogénea de mono-polimero/polipéptido de NgR incluye generalmente los pasos que consisten en: (a) hacer reaccionar un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención con una molécula reactiva de PEG bajo condiciones de alquilación reductiva a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo amino N-terminal de NgR; y (b) obtener el (los) producto (s) de reacción. Para una población sustancialmente homogénea de mono-polimero/polipéptido de NgR, las condiciones de reacción de alquilación reductiva son aquellas que permiten la unión selectiva de la porción de polimero soluble en agua a la terminación N de un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención. Estas condiciones de reacción proporcionan generalmente diferentes pKa entre los grupos amino de cadena lateral de lisina y el grupo amino N-terminal. Para propósitos de la presente invención, el pH está generalmente en el rango de 3-9, típicamente 3-6. Los polipéptidos de NgR de la invención pueden incluir una etiqueta, por ej emplo, una porción que puede liberarse subsecuentemente por medio de la proteólisis. De esta manera, la porción de lisina se puede modificar selectivamente al hacer reaccionar primero una etiqueta de His modificada con un conector de bajo peso molecular tal como el reactivo de Traut (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) el cual reaccionará tanto con la lisina como con la terminación N y luego liberar esta etiqueta de His. El polipéptido entonces contendrá un grupo SH libre que se puede modificar selectivamente con un PEG que contiene un grupo principal tiol-reactivo tal como un grupo maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato o un SH libre o protegido. El reactivo de Traut se puede reemplazar por cualquier conector que establecerá un sitio especifico para la unión a PEG. Por ejemplo, el reactivo de Traut puede reemplazarse por SPDP, SMPT, SATA o SATP (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) . Similarmente, uno podria hacer reaccionar la proteina con un conector amina-reactivo que inserta una maleimida (por ejemplo SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS o GMBS), un grupo haloacetato (SBAP, SIA, SIAB) o un grupo vinilsulfona y hacer reaccionar el producto resultante con un PEG que contiene un SH libre. En algunas modalidades, la porción de polialquilenglicol se acopla a un grupo cisteina del polipéptido de NgR. El acoplamiento se puede efectuar utilizando, por ejemplo, un grupo maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato o un grupo tiol. Opcionalmente, el polipéptido de NgR se conjuga a la porción de polietilenglicol a través de un enlace lábil.

El enlace lábil puede ser escindido en, por ej emplo, hidrólisis bioquímica, proteólisis o escisión de sulfhidrilo. Por ejemplo, el enlace puede ser escindido bajo condiciones in vivo (fisiológicas). Las reacciones pueden tomar lugar por medio de cualquier método adecuado que sea utilizado para hacer reaccionar materiales biológicamente activos con polímeros inertes, generalmente a aproximadamente pH 5-8, por ejemplo, pH 5, 6, 7 u 8, si los grupos reactivos están en el grupo alfa-amino en la terminación N. Generalmente, el proceso implica preparar un polimero activado y después hacer reaccionar la proteína con el polímero activado para producir la proteina soluble adecuada para la formulación. Los polipéptidos de NgR de la invención, en ciertas modalidades, son polipéptidos solubles. Los métodos para hacer un polipéptido soluble o para mejorar la solubilidad de un polipéptidos son bien conocidos en la técnica.

Polinucleótidos La presente invención también incluye polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de los polipéptidos de NgR de la presente invención. La invención también incluye polinucleótidos que se hibridizan bajo condiciones moderadamente restrictivas o sumamente restrictivas a la cadena no codificadora, o complemente, de un polinucleótido que codifica cualquiera de los polipéptidos de la invención. Las condiciones restrictivas son conocidas para aquellas personas expertas en la técnica y se pueden encontrar en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. El polinucleótido del receptor de Nogo humano-1 se muestra a continuación como la SEC ID N0:1. El receptor de Nogo Humano-1 de Longitud Completa es codificado por el nucleótido 166 al nucleótido 1587 de la SEC ID NO:l: agcccagcca gagccgggcg gagcggagcg cgccgagcct cgtcccgcgg ccgggccggg gccgggccgt agcggcggcg cctggatgcg gacccggccg cggggagacg ggcgcccgcc ccgaaacgac tttcagtcsc cgacgcgccc cgcccaaccc ctacgatgaa gagggcgtcc gctggaggga gccggctgct ggcatgggtg ctgtggctgc aggcctggca ggtggcagcc ccatgcccag gtgcctgcgt atgctacaat gagcccaagg tgacgacaag ctgcccccag cagggcctgc aggctgtgcc cgtgggcatc cctgctgcca gccagcgcat cttcctgcac ggcaaccgca tctcgcatgt gccagctgcc agcttccgtg cctgccgcaa cctcaccatc ctgtggctgc actcgaatgt gctggcccga attgatgcgg ctgccttcac tggcctggcc ctcctggagc agctggacct cagcgataat gcacagctcc ggtctgtgga ccctgccaca ttccacggcc tgggccgcct acacacgctg cacctggacc gctgcggcct gcaggagctg ggcccggggc tgttccgcgg cctggctgcc ctgcagtacc tctacctgca ggacaacgcg ctgcaggcac tgcctgatga caccttccgc gacctgggca acctcacaca cctcttcctg cacggcaacc gcatctccag cgtgcccgag cgcgccttcc gtgggctgca cagcctcgac cgtctcctac tgcaccagaa ccgcgtggcc catgtgcacc cgcatgcctt ccgtgacctt ggccgcctca tgacactcta tctgtttgcc aacaatctat cagcgctgcc cactgaggcc ctggcccccc tgcgtgccct gcagtacctg aggctcaacg acaacccctg ggtgtgtgac tgccgggcac gcccactctg ggcctggctg cagaagttcc gcggctcctc ctccgaggtg ccctgcagcc tcccgcaacg cctggctggc cgtgacctca aacgcctagc tgccaatgac ctgcagggct gcgctgtggc caccggccct taccatccca tctggaccgg cagggccacc gatgaggagc cgctggggct tcccaagtgc tgccagccag atgccgctga caaggcctca gtactggagc ctggaagacc agcttcggca ggcaatgcgc tgaagggacg cgtgccgccc ggtgacagcc cgccgggcaa cggctctggc ccacggcaca tcaatgactc accctttggg actctgcctg gctctgctga gcccccgctc actgcagtgc ggcccgaggg ctccgagcca ccagggttcc ccacctcggg ccctcgccgg aggccaggct gttcacgcaa gaaccgcacc cgcagccact gccgtctggg ccaggcaggc agcgggggtg gcgggactgg tgactcagaa ggctcaggtg ccctacccag cctcacctgc agcctcaccc ccctgggcct ggcgctggtg ctgtggacag tgcttgggcc ctgctgaccc ccagcggaca caagagcgtg ctcagcagcc aggtgtgtgt acatacgggg tctctctcca cgccgccaag ccagccgggc ggccgacccg tggggcaggc caggccaggt cctccctgat ggacgcctg El polinucleótido del receptor de Nogo de rata-1 se muestra a continuación como la SEC ID NO: 25 y tiene el número de acceso NM 053613 en Genbank. atgaagaggg cgtcctccgg aggaagccgg ctgccgacat gggtgttatg gctacaggcc tggagggtag caacgccctg ccctggtgcc tgtgtgtgct acaatgagcc caaggtcaca acaagccgcc cccagcaggg cctgcaggct gtacccgctg gcatcccagc ctccagccag agaatcttcc tgcacggcaa ccgaatctct tacgtgccag ccgccagctt ccagtcatgc cggaatctca ccatcctgtg gctgcactca aatgcgctgg ccgggattga tgccgcggcc ttcactggtc tgaccctcct ggagcaacta gatcttagtg acaatgcaca gctccgtgtc gtggacccca ccacgttccg tggcctgggc cacctgcaca cgctgcacct agaccgatgc ggcctgcagg agctggggcc tggcctattc cgtgggctgg cagctctgca gtacctctac ctacaagaca acaacctgca ggcacttccc gacaacacct tccgagacct gggcaacctc acgcatctct ttctgcatgg caaccgtatc cccagtgttc ctgagcacgc tttccgtggc ttgcacagtc ttgaccgtct cctcttgcac cagaaccatg tggctcgtgt gcacccacat gccttccggg accttggccg actcatgacc ctctacctgt ttgccaacaa cctctccatg ctccccgcag aggtcctagt gcccctgagg tctctgcagt acctgcgact caatgacaac ccctgggtgt gtgactgcag ggcacgtccg ctctg'ggcct ggctgcagaa gttccgaggt tcctcatccg gggtgcccag caacctaccc caacgcctgg caggccgtga tctgaagcgc ctggctacca gtgacttaga gggttgtgct gtggcttcgg ggcccttccg tcccttccag accaatcagc tcactgatga ggagctgctg ggcctcccca agtgctgcca gccggatgct gcagacaagg cctcagtact ggaacccggg aggccggcgt ctgttggaaa tgcactcaag ggacgtgtgc ctcccggtga cactccacca ggcaatggct caggcccacg gcacatcaat gactctccat ttgggacttt gcccggctct gcagagcccc cactgactgc cctgcggcct gggggttccg agcccccggg actgcccacc acgggccccc gcaggaggcc aggttgttcc agaaagaacc gcacccgtag ccactgccgt ctgggccagg caggaagtgg gagcagtgga actggggatg cagaaggttc gggggccctg cctgccctgg cctgcagcct tgctcctctg ggccttgcac tggtactttg gacagtgctt gggccctgct ga El polinucleótido del receptor de Nogo humano-2 se muestra a continuación como la SEC ID NO: 26 y tiene el número de acceso BK001302 en Genbank. atgctgcccg ggctcaggcg cctgctgcaa gctcccgcct cggcctgcct cctgctgatg ctcctggccc tgcccctggc ggcccccagc tgccccatgc tctgcacctg ctactcatcc ccgcccaccg tgagctgcca ggccaacaac ttctcctctg tgccgctgtc cctgccaccc agcactcagc gactcttcct gcagaacaac ctcatccgca cgctgcggcc aggcaccttt gggtccaacc tgctcaccct gtggctcttc tccaacaacc tctccaccat ctacccgggc actttccgcc acttgcaagc cctggaggag ctggacctcg gtgacaaccg gcacctgcgc tcgctggagc ccgacacctt ccagggcctg gagcggctgc agtcgctgca tttgtaccgc tgccagctca gcagcctgcc cggcaacatc ttccgaggcc tggtcagcct gcagtacctc tacctccagg agaacagcct gctccaccta caggatgact tgttcgcgga cctggccaac ctgagccacc tcttcctcca cgggaaccgc ctgcggctgc tcacagagca cgtgtttcgc ggcctgggca gcctggaccg gctgctgctg cacgggaacc ggctgcaggg cgtgcaccgc gcggccttcc gcggcctcag ccgcctcacc atcctctacc tgttcaacaa cagcctggcc tcgctgcccg gcgaggcgct cgccgacctg ccctcgctcg agttcctgcg gctcaacgct aacccctggg cgtgcgactg ccgcgcgcgg ccgctctggg cctggttcca gcgcgcgcgc gtgtccagct ccgacgtgac ctgcgccacc cccccggagc gccagggccg agacctgcgc gcgctccgcg aggccgactt ccaggcgtgt ccgcccgcgg cacccacgcg gccgggcagc cgcgcccgcg gcaacagctc ctccaaccac ctgtacgggg tggccgaggc cggggcgccc ccagccgatc cctccaccct ctaccgagat ctgcctgccg aagactcgcg ggggcgccag ggcggggacg cgcctactga ggacgactac tgggggggct acgggggtga ggaccagcga ggggagcaga tgtgccccgg cgctgcctgc caggcgcccc cggactcccg aggccctgcg ctctcggccg ggctccccag ccctctgctt tgcctcctgc tcctggtgcc ccaccacctc tga Vectores Los vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de NgR de la invención también se pueden utilizar para producir un polipéptido para el uso en los métodos de la invención. La selección del vector y las secuencias de control de expresión a las cuales se unen de manera operable estos ácidos nucleicos depende de las propiedades funcionales deseadas, por ej emplo, la expresión de proteínas y la célula hospedante a ser transformada. Los elementos de control de expresión que son útiles para regular la expresión de una secuencia de codificación unida de manera operable son conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción y otros elementos reguladores. Cuando se utiliza un promotor inducible, éste puede ser controlado, por ej emplo por un cambio en el estado de los nutrientes o un cambio en la temperatura, en el medio de la célula hospedante. El vector puede incluir un replicón procariótico, es decir, una secuencia de ADN que tiene la capacidad para dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante extra-cromosómicamente en una célula hospedante bacteriana. Estos replicones son bien conocidos en la técnica. Además, los vectores que incluyen un replicón procariótico también pueden incluir un gen cuya expresión confiere un marcador detectable tal como la resistencia a fármacos. Los ejemplos de genes bacterianos de resistencia a fármacos son aquellos que confieren resistencia a la ampicilina o la tetraciclina. Los vectores que incluyen un replicón procariótico también pueden incluir un promotor procariótico o bacteriófago para dirigir la expresión de las secuencias de genes codificadores en una célula hospedante bacteriana. Las secuencias promotoras compatibles con los hospedantes bacterianos se proporcionan típicamente en vectores plásmidos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN a ser expresado. Los ejemplos de estos vectores plásmidos son pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) , pPL y pKK223. Cualquier hospedante procariótico adecuado se puede utilizar para expresar una molécula de ADN recombinante que codifica una proteina utilizada en los métodos de la invención. Para los propósitos de esta invención, se pueden emplear numerosos sistemas de vectores de expresión. Por ejemplo, una clase de vector utiliza elementos de ADN que se derivan de virus de animales tales como virus de papiloma bovino, virus de polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios de enlace del ribosoma internos. Adicionalmente, las células que han integrado el ADN en sus cromosomas se pueden seleccionar al introducir uno o más marcadores los cuales permiten la selección de células hospedantes transfectadas. El marcador puede proporcionar prototrofia a un hospedante auxotrofo, resistencia a biocidas (por ej emplo, antibióticos) o resistencia a metales pesados tales como cobre. El gen marcador seleccionable puede ya sea unirse directamente a las secuencias de ADN a ser expresadas o introducirse en la misma célula por medio de la cotransformación. El gen de neomicina fosfotransferasa (neo) es un ejemplo de un gen marcador seleccionable (Southern y colaboradores, J. Mol . Anal . Genet . 1:327-341 (1982)). También pueden ser necesarios elementos adicionales para la síntesis óptima del ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias de señales, señales de empalme, asi como también promotores transcripcionales, potenciadores y señales de terminación. En una modalidad, se puede utilizar un vector de expresión patentado de Biogen IDEC, Inc., referido como NEOSPLAMR (Patente Norteamericana No. 6,159,730). Este vector contiene el promotor/potenciador de citomegalovirus, el promotor principal de beta-globina de ratón, el origen de replicación de SV40, la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento de bovino, el exón 1 y el exón 2 de neomicina fosfotransferasa, el gen de dihidrofolato reductasa y la secuencia lider. Se ha descubierto que este vector da por resultado una expresión a un nivel muy alto con la transfección en células de CHO, seguido por la selección en un medio que contiene G418 y la amplificación de metotrexato. Naturalmente, cualquier vector de expresión que sea capaz de producir la expresión en células eucarióticas se puede utilizar en la presente invención. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen, pero no están limitados a los plásmidos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl y pZeoSV2 (disponibles de Invitrogen, San Diego, CA) y el plásmido pCl (disponible de Promega, Madison, Wl). Los vectores de expresión de células eucarióticas adicionales son conocidos en la técnica y son comercialmente disponibles. Típicamente, estos vectores contienen sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado. Los vectores ejemplares incluyen pSVL y pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pml2d (International Biotechnologies), pTDTl (ATCC 31255), vector de expresión retroviral pMIG y pLL3.7, vector de lanzadera de adenovirus pDC315 y vectores de AAV. Otros sistemas de vectores ejemplares se dan a conocer por ej emplo en la Patente Norteamericana No. 6,413,777.

En general, la identificación de grandes números de células transformadas por aquellas las cuales expresan niveles adecuadamente altos del antagonista es una experimentación de rutina la cual puede ser llevada a cabo, por ejemplo, por sistemas robóticos. Las secuencias reguladoras frecuentemente utilizadas para la expresión de células hospedantes de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y potenciadores derivados de LTRs retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), Virus de Simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (por ej emplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdmlP) ) , polioma y promotores fuertes de mamífero tales como promotores nativos de inmunoglobulina y actina. Para una descripción adicional de los elementos reguladores virales y secuencias de los mismos, véase por ej emplo, Stinski, Patente Norteamericana No. 5,168,062; Bell, Patente Norteamericana No. 4,510,245 y Schaffner, Patente Norteamericana No. 4,968,615. Los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedantes (por ej emplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospedantes en las cuales se ha introducido el vector ( véase por ej emplo, Axel, Patentes Norteamericanas Nos. 4,399,216; 4,634,665 y 5,179,017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a un fármaco, tal como G418, higromicina o metotrexato, en una células hospedante en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables frecuentemente utilizados incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para el uso en las células hospedantes dhfr- con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418). Los vectores que codifican polipéptidos o fragmentos de polipéptidos se pueden utilizar para la transformación de una célula hospedante adecuada. La transformación puede ser por cualquier método adecuado. Los métodos para la introducción del ADN exógeno en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen la transfección mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulamiento del (los) polinucleótido (s) en liposomas y la microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir en células de mamífero por medio de vectores virales. La transformación de las células hospedantes se puede realizar por medio de métodos convencionales que son adecuados para el vector y la célula hospedante empleados. Para la transformación de células hospedantes procarióticas, se pueden emplear métodos de electroporación y tratamiento con sal (Cohén y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 69:2110-14 (1972)). Para la transformación de células de animales vertebrados, se pueden emplear métodos de electroporación, tratamiento con lipidos catiónicos o sal. Véase, por ej emplo, Graham y colaboradores, Virology 52:456-467 (1973); Wigler y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 76: 1313-16 (1979). La linea de células hospedantes utilizada para la expresión de proteínas es mucho más preferiblemente de origen mamífero; aquellas personas expertas en la técnica están dotadas con la capacidad para determinar preferentemente las lineas de células hospedantes particulares que son más adecuadas para el producto génico deseado que es expresado en las mismas. Las lineas de células hospedantes ejemplares incluyen, pero no están limitadas a NSO, células SP2, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo Hep G2), células A549 DG44 y DUXB11 (lineas de Ovario de Hámster Chino, DHFR menos), HELA (carcinoma cervical humano), CVl (linea de riñon de mono) , COS (un derivado de CVl con el antigeno T de SV40) , R1610 (fibroblasto de hámster Chino) BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón), HAK (linea de riñon de hámster), SP2/0 (mieloma de ratón), P3x63-Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-lclBPT (células endoteliales de bovino), RAJI (linfocito humano) y 293 (riñon humano) . Las lineas de células hospedantes son disponibles típicamente de servicios comerciales, the American Tissue Culture Collection o de la bibliografía publicada. La expresión de polipéptidos a partir de las lineas de células de producción se puede mejorar utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de glutamina sintetasa (GS) se utiliza comúnmente para mejorar la expresión bajo ciertas condiciones. Véase, por ejemplo las Patentes Europeas Nos. 0 216 846, 0 256 055 y 0 323 997 y la Solicitud de Patente Europea No. 89303964.4. Los vectores de expresión de células eucarióticas son conocidos en la técnica y son comercialmente disponibles. Típicamente, estos vectores contienen sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado. Los vectores ejemplares incluyen pSVL y pKSV-10, pBPV-1, pml2d, pTDTl (ATCC 31255), vector de expresión retroviral pMIG, vector de lanzadera de adenovirus pDC315 y vectores de AAV. Los vectores de expresión de células eucarióticas pueden incluir un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen de resistencia a un fármaco. El gen de neomicina fosfotransferasa (neo) es un ejemplo de este gen (Southern y colaboradores, J. Mol. Anal. Genet. 1:327-341 (1982)). Las secuencias reguladores frecuentemente utilizadas para la expresión de células hospedantes de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión en células de mamífero, tales como promotores y potenciadores derivados de LTRs retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV) , Virus de Simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (por ej emplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdmlP) ) , polioma y promotores fuertes de mamífero tales como promotores nativos de inmunoglobulina y actina. Para una descripción adicional de los elementos reguladores virales y secuencias de los mismos, véase por ej emplo, Stinski, Patente Norteamericana No. 5,168,062; Bell, Patente Norteamericana No. 4,510,245 y Schaffner, Patente Norteamericana No. 4,968,615. Los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedantes (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospedantes en las cuales se ha introducido el vector ( véase, por ej emplo, Axel, Patentes norteamericanas Nos. 4,399,216; 4,634,665 y 5,179,017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a un fármaco, tal como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedante en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables frecuentemente utilizados incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para el uso en células hospedantes dhfr- con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (selección de G418) . Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de NgR de la invención y los vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico se pueden utilizar para la transformación de una célula hospedante adecuada. La transformación puede ser cualquier método adecuado. Los métodos para la introducción de ADN exógeno en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen la transfección mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulamiento del (los) polinucleótido (s) en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir en células de mamífero por medio de vectores virales. La transformación de células hospedantes se puede realizar por medio de métodos convencionales que son adecuados para el vector y la célula hospedante empleados. Para la transformación de células hospedantes procarióticas, se pueden emplear métodos de electroporación y tratamiento con sales (Cohén y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 69:2110-14 (1972)). Para la transformación de células de animales vertebrados, se pueden emplear métodos de electroporación, tratamiento con lipidos catiónicos o sales. Véase , por ej emplo, Graham y colaboradores, Virology 52:456-467 (1973); Wigler y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 76:1373-76 (1979) .

Células Hospedantes Las células hospedantes para la expresión de un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención para el uso en un método de la invención pueden ser procarióticas o eucarióticas. Las células hospedantes eucarióticas ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, células de levadura y de animales mamíferos, por ej emplo, células de ovario de hámster chino (CHO) (Acceso de ATCC No.

CCL61), células de embriones de ratón NIH Swiss NIH-3T3 (Acceso de ATCC No. CRL1658) y células de riñon de hámster bebé (BHK) . Otras células hospedantes, eucarióticas, útiles incluyen células de insectos y células vegetales. Las células hospedantes procarióticas ejemplares son E . coli y Streptomyces . Las lineas de células de animales mamiferos disponibles como hospedantes para la expresión son conocidas en la técnica e incluyen muchas lineas de células inmortalizadas disponibles de the American Type Culture Collection (ATCC) . Estas incluyen, in ter alia , células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2 ) , células A549 y una variedad de otras lineas de células. La expresión de polipéptidos a partir de lineas de células de producción se puede mejorar utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de glutamina sintetasa (GS) se utiliza comúnmente para mejorar la expresión bajo ciertas condiciones. Véase, por ej emplo, las Patentes Europeas Nos. 0 216 846, 0 256 055 y 0 323 997 y la Solicitud de Patente Europea No. 89303964.4.

Terapia Génica Un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención se puede producir in vivo en un mamífero, por ej emplo, un paciente humano, utilizando un planteamiento de terapia génica para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso en el cual el antagonismo de la señalización mediada por NgR seria benéfico terapéuticamente. Esto implica la administración de un polipéptido de NgR adecuado que codifica un ácido nucleico unido de manera operable a secuencias de control de expresión adecuadas. Generalmente, estas secuencias se incorporan en un vector viral. Los vectores virales adecuados para esta terapia génica incluyen vectores adenovirales, vectores lentivirales, vectores baculovirales, vectores virales de Epstein-Barr, vectores papovavirales, vectores virales de vaccinia, vectores virales de herpes simple y vectores de virus adenoasociado (AAV) . El vector viral puede ser un vector viral defectuoso en la replicación. Los vectores adenovirales que tienen una supresión en su gen El o gen E3 se utilizan típicamente. Cuando se utiliza un vector adenoviral, el vector no tiene usualmente un gen marcador seleccionable.

Composiciones Farmacéuticas Los polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, polinucleótidos, vectores y células hospedantes de NgR de la invención se pueden formular en composiciones farmacéuticas para la administración a animales mamiferos, inclusive humanos. Las composiciones farmacéuticas utilizadas en los métodos de esta invención comprenden portadores farmacéuticamente aceptables, inclusive, por ejemplo, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero tales como albúmina de suero humano sustancias amortiguadoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos tales como sulfato de protamina, fosfato ácido de disodio, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, silice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina. Las composiciones utilizadas en los métodos de la presente invención se pueden administrar por medio de cualquier método adecuado, por ejemplo, por via parenteral, intraventricular, oral, por medio de una pulverización para inhalación, por la via tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o por via de un depósito implantado. El término "parenteral" como se utiliza en este documento incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. Como se describiera previamente, los polipéptidos de NgR de la invención actúan en el sistema nervioso para inhibir la señalización mediada por NgR. Por consiguiente, en los métodos de la invención, los polipéptidos de NgR se administran de tal manera que crucen la barrera hematoencefálica. Este cruce puede resultar de las propiedades fisico-quimicas inherentes en la molécula de polipéptido de NgR misma, de otros componentes en una formulación farmacéutica o del uso de un dispositivo mecánico tal como una aguja, cánula o instrumentos quirúrgicos para traspasar la barrera hematoencefálica. Donde el polipéptido de NgR es una molécula que no cruza inherentemente la barrera hematoencefálica, por ej emplo, una fusión a una porción que facilita el cruce, las rutas adecuadas para la administración son, por ej emplo, intratecal o intracraneal, por ej emplo, directamente en una lesión crónica de MS . Donde el polipéptido de NgR es una molécula que cruza inherentemente la barrera hematoencefálica, la ruta de administración puede ser por medio de una o más de las diversas rutas descritas posteriormente . Las formas inyectables estériles de las composiciones utilizadas en los métodos de esta invención pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas. Estas suspensiones se pueden formular de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica utilizando agentes adecuados de dispersión o humedecimiento y agentes de suspensión. La preparación inyectable, estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable, estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo como una suspensión en 1, 3-butanodiol . Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear se encuentra el agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos, estériles se emplean convenientemente como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo, blando inclusive mono- o di-glicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados de glicéridos son útiles en la preparación de productos farmacéuticos inyectables, ya que son aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas . Estas soluciones o suspensiones también pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes de dispersión similares los cuales se utilizan comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables que incluyen emulsiones y suspensiones. Otros surfactantes comúnmente utilizados, tales como TweensMR, SpansMR y otros agentes de emulsificación o potenciadores de la biodisponibilidad que se utilizan comúnmente en la manufactura de formas de dosificación sólidas, liquidas u otras formas farmacéuticamente aceptables también se pueden utilizar para los propósitos de la formulación. Las formulaciones parenterales pueden ser una dosis de bolo individual, una infusión o una dosis de bolo de carga seguida por una dosis de mantenimiento. Estas composiciones se pueden administrar en intervalos fijos o variables, específicos, por ej emplo, una vez al dia o en una base "como sea necesario". Ciertas composiciones farmacéuticas utilizadas en los métodos de esta invención se pueden administrar por la vía oral en una forma de dosificación aceptable que incluye, por ej emplo, cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas. Ciertas composiciones farmacéuticas también se pueden administrar por medio de un aerosol nasal o la inhalación. Estas composiciones se pueden preparar como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservadores adecuados, promotores de la absorción para mejorar la biodisponibilidad y/u otros agentes de solubilización o dispersión convencionales. La cantidad de un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención que se puede combinar con los materiales portadores para producir una forma de dosificación individual variará dependiendo del hospedante tratado y el modo particular de administración. La composición se puede administrar como una dosis individual, dosis múltiples o durante un periodo de tiempo establecido en una infusión. Los regímenes de dosificación también se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada, óptima (por ejemplo una respuesta terapéutica o profiláctica) . Los métodos de la invención utilizan una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un polipéptido de NgR. Esta cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo. Una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva también es una en la cual cualquiera de los efectos tóxicos o perjudiciales son sobrepasados por los efectos terapéuticamente benéficos. Un régimen especifico de dosificación y tratamiento para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores, inclusive el polipéptido de NgR particular utilizado, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente y el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad de la enfermedad particular que es tratada. El juicio de estos factores por profesionales médicos está dentro de la experiencia ordinaria en la técnica. La cantidad también dependerá del paciente individual que es tratado, la ruta de administración, el tipo de formulación, las características del compuesto utilizado, la gravedad de la enfermedad y el efecto deseado. La cantidad utilizada se puede determinar por medio de principios farmacológicos y farmacocinéticos bien conocidos en la técnica. En los métodos de la invención, los polipéptidos de NgR se administran en general directamente al sistema nervioso, por la via intracerebroventricular o intratecal, por ej emplo en una lesión crónica de MS . Las composiciones para la administración de acuerdo con los métodos de la invención se pueden formular de manera que se administre una dosificación de 0.001-10 mg/kg de peso corporal al dia del polipéptido de NgR. En algunas modalidades de la invención, la dosificación es 0.01-1.0 mg/kg de peso corporal al dia. En algunas modalidades, la dosificación es 0.001-0.5 mg/kg de peso corporal al dia. Los compuestos activos, complementarios también se pueden incorporar en las composiciones utilizadas en los métodos de la invención. Por ejemplo, un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención o una proteina de fusión del mismo, se puede coformular con y/o coadministrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Para el tratamiento con un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención, la dosificación puede variar, por ej emplo, de aproximadamente de 0.0001 a 100 mg/kg, y más usualmente de 0.01 a 5 mg/kg (por ej emplo, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etcétera), del peso corporal del hospedante. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del rango de 1-10 mg/kg, preferiblemente al menos 1 mg/kg. También se propone que las dosis intermedias en los rangos anteriores están dentro del alcance de la invención. A los sujetos se les puede administrar estas dosis diariamente, en dias alternos, semanalmente o de acuerdo con otro programa determinado por el análisis empírico. Un tratamiento ejemplar implica la administración en múltiples dosificaciones durante un periodo prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regimenes de tratamiento ejemplares, adicionales implican la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los programas de dosificación ejemplares incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en dias consecutivos, 30 mg/kg en dias alternos y 60 mg/kg semanalmente . En algunos métodos, dos o más polipéptidos o fragmentos de polipéptidos de NgRl se administran simultáneamente, caso en el cual la dosificación de cada polipéptido administrado se encuentra dentro de los rangos indicados. Los compuestos activos, complementarios también se pueden incorporar en las composiciones utilizadas en los métodos de la invención. Por ejemplo, un anticuerpo anti-NgRl u otro antagonista de NgRl se puede coformular con y/o coadministrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales. La invención incluye cualquier método de suministro adecuado para un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl a un tejido objetivo seleccionado, inclusive la inyección de bolos de una solución acuosa o el implante de un sistema de liberación controlada. El uso de un implante de liberación controlada reduce la necesidad de inyecciones repetidas . Los polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de NgRl utilizados en los métodos de la invención se pueden infundir directamente en el cerebro. Varios implantes para la infusión directa en el cerebro de los compuestos son conocidos y son efectivos en el suministro de compuestos terapéuticos a pacientes humanos que sufren de trastornos neurológicos. Estos incluyen la infusión crónica en el cerebro utilizando una bomba, implantada estereotáticamente, catéteres intersticiales temporales, implantes de catéteres intracraneales permanentes e implantes biodegradables implantados quirúrgicamente. Véase, por ejemplo Gilí y colaboradores, supra ; Scharfen y colaboradores, "High Activity Iodine-125 Interstitial Implant For Gliomas", Int . J. Radiation Oncology Biol. Phys. 24(4):583-91 (1992); Gaspar y colaboradores, "Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas", Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 43(5):977-82 (1999); capitulo 66, páginas 577-580, Bellezza y colaboradores, "Stereotactic Interstitial Brachytherapy", en Gildenberg y colaboradores , Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-Hill (1998) y Brem y colaboradores, "The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial" J. Neuro-Oncology 26:111-23 (1995). Las composiciones también pueden comprender un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención dispersado en un material portador biocompatible que funciona como un sistema de suministro o soporte adecuado para los compuestos. Los ejemplos adecuados de portadores de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en la forma de articulos conformados tales como supositorios o cápsulas. Las matrices de liberación sostenida implantables o microcapsulares incluyen polilactidas (Patente Norteamericana No. 3,773,319; EP 58,481), copolimeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman y colaboradores, Biopolymers 22:547-56 (1985)); poli (2-hidroxietil-metacrilato) , acetato de etilenvinilo (Langer y colaboradores, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)) o ácido poli-D- (-) -3hidroxibutirico (EP 133,988). En algunas modalidades, un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención se administra a un paciente por medio de la infusión directa en una región apropiada del cerebro. Véase, por ej emplo, Gilí y colaboradores, "Direct brain infusión of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease", Nature Med. 9: 589-95 (2003) . Están disponibles técnicas alternativas y se pueden aplicar para administrar un polipéptido de NgR de acuerdo con la invención. Por ejemplo, la colocación estereotáctica de un catéter o implante se puede realizar utilizando la unidad de Riechert-Mundinger y la unidad de localización multiusos ZD (Zamorano-Dujovny) . Una exploración de tomografia computarizada con contraste incrementado (CT) , inyectando 120 ml de OmnipaqueMR, 350 mg de yodo/ml, con un espesor de corte de 2 mm puede permitir una planificación de tratamiento multidireccional tridimensional (STP, Fischer, Freiburg, Alemania) . Este equipo permite la planificación en base a los estudios de formación de imágenes de resonancia magnética, que reúnen la información objetivo de CT y MRI para la confirmación clara de objetivos. El sistema estereotáctico LeksellMR (Downs Surgical, Inc., Decatur, GA) modificado para el uso con un explorador de CT GE (General Electric Company, Milwaukee, Wl) asi como también el sistema estereotáctico Brown-Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington, MA) se pueden utilizar para este propósito. De esta manera, en la mañana del implante, el anillo de base anular del bastidor estereotáctico BRW se puede unir al cráneo del paciente. Las secciones consecutivas de CT se pueden obtener en intervalos de 3 mm a través de la región (tejido objetivo) con un bastidor localizador de barra de grafito asegurado a la placa base. Un programa de planificación de tratamiento computarizado se puede conducir en una computadora VAX 11/780 (Digital Equipment Corporation, Maynard, Mass.) utilizando las coordenadas de CT de las imágenes de la varilla de grafito para cartografiar entre el espacio de CT y el espacio de BRW.

Métodos In Vitro La presente invención también incluye métodos para suprimir la inhibición del crecimiento de células neuronales in vi tro . Por ejemplo, la invención incluye métodos in vi tro para estimular el crecimiento de células neuronales en presencia de factores que, bajo circunstancias normales, causan la inhibición del crecimiento de células neuronales o el colapso de conos de crecimiento. Los métodos, de acuerdo con este aspecto de la invención, comprenden poner en contacto una célula neuronal que expresa un receptor de Nogo con un agente que causa la inhibición del crecimiento mediada por NgRl en presencia y ausencia de un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl aislado de la invención. Como se utiliza en este documento, la expresión "agente que causa la inhibición de crecimiento mediada por NgR" significa cualquier compuesto que interactúa con un componente de la via de transducción de señales del receptor de Nogo (por ej emplo, NgR o proteínas que interactúan con NgR) , estimulando en consecuencia la inhibición del crecimiento de células neuronales o el colapso de conos de crecimiento. Los agentes ejemplares que causan la inhibición del crecimiento mediada por NgR incluyen, por ej emplo, Nogo (por ej emplo, NogoA, Nogo-66) , glicoproteina asociada con mielina (MAG) , glicoproteina de oligodendrocitos (OMgp) y fragmentos y derivados de los mismos que inhiben el crecimiento de células que expresan el receptor de Nogo. La mielina misma es otro agente ejemplar que causa la inhibición del crecimiento mediada por NgR. La célula neuronal utilizada en la práctica de los métodos in vi tro de la invención puede, en ciertas modalidades, expresar un receptor de Nogo endógeno. En otras modalidades, la célula neuronal expresa un receptor de Nogo exógeno de un vector. La célula neuronal puede expresar tanto un receptor de Nogo endógeno como un receptor de Nogo exógeno. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención pueden comprender la supervisión del grado de inhibición de crecimiento neuronal o colapso de conos de crecimiento en presencia y/o ausencia de un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl aislado de la invención. Los métodos in vi tro de la invención se pueden utilizar para caracterizar el grado al cual es posibles que los polipéptidos de NgR candidatos supriman la inhibición del crecimiento de células neuronales o el colapso de conos de crecimiento que ocurre normalmente en presencia de un agente que causa la inhibición de crecimiento mediada por NgR. De esta manera, los métodos de la invención son útiles para identificar y caracterizar el rango completo de polipéptidos de NgR que tienen la capacidad de suprimir la inhibición de crecimiento de células neuronales. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención se pueden realizar en formatos de alto rendimiento. Otros métodos in vi tro e in vivo para someter a prueba la capacidad de los polipéptidos o fragmentos de polipéptidos de NgRl para inhibir la extensión de neuritas se describen en la publicación del PCT WO2005/016955 (incorporada en este documento a manera de referencia). Será fácilmente aparente para una persona de experiencia ordinaria en los campos relevantes que son obvias otras modificaciones adecuadas y adaptaciones a los métodos y aplicaciones descritos en este documento y que se pueden hacer sin apartarse del alcance de la invención o cualquier modalidad de la misma. Habiendo descrito ahora en detalle la presente invención, la misma será entendida más claramente por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se incluyen con la presente para propósitos de ilustración únicamente y no se propone que sean limitantes de la invención .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Pureza y Bioactividad de Proteínas de NgRl Los análisis de supresión previos sugieren que la región completa de LRR del receptor de Nogo-1 inclusive la tapa C-terminal de LRR, LRRCT, es necesaria para el enlace de ligandos y que el tallo de CT adyacente del receptor de Nogo- 1 contribuye a la interacción con sus co-receptores (por ejemplo, p75, TAJ y LINGO-1) . Para ilustrar adicionalmente que regiones de NgRl estuvieron implicadas en la interacción con sus correceptores, se analizaron varias construcciones de NgRl por su capacidad para enlazarse a los correceptores. El NgRl humano, excluyendo el dominio GPI (FL-NgRl, residuos 27- 438, Figura 1 (SEC ID NO:22)) con una etiqueta Flag en su terminación N se expresó en células CHO y se purificó como una proteina soluble del medio acondicionado por medio de pasos de cromatografia secuenciales en TMAE-Fractogel (EM Merck) y agarosa de Ni-NTAMR (Qiagen). El Ngl(310) humano (residuos 27-310) y el NgRl(344) humano (residuos 27-344) se expresaron como proteínas etiquetadas con histidina (etiqueta C-terminal) en células de insectos y se purificaron por medio de pasos secuenciales en SP-SepharoseMR (Amersham BioSciences) y agarosa de Ni-NTAMR. El NgRl(344) de Rata (residuos 27-344) -rata-Fe (IgGl) y el NgRl(310) de Rata (residuos 27-310) se expresaron en células de CHO. El NgRl (344) -rata-Fe de Rata se purificó en Protein A SepharoseMR (Amersham BioSciences) y el NgRl(310) de Rata en SP-SepharoseMR. Las muestras se analizaron por su pureza por medio de SDS-PAGE en geles con gradiente de 4-20% (NOVEX) y por la agregación mediante la cromatografia de exclusión de tamaño (SEC) en una columna Superdex 200MR (Amersham Biosciences) . La columna se condujo en PBS a una velocidad de flujo de 20 mL/h y el efluente de la columna se supervisó por la absorbancia a 280 nm. La SDS-PAGE indicó que la pureza de FL-NgRl fue mayor que 90% con una masa molecular promedio de aproximadamente 65 kDa (Figura 2A) . En la cromatografia de exclusión de tamaño (SEC), la proteina se eluyó como un pico individual con una masa de aproximadamente 80 kDa (Figura 2B) . El FL-NgRl se sometió a prueba por el enlace en un ensayo ELISA utilizando métodos conocidos en la técnica y se descubrió que se enlaza a LINGO-1, OMgp, Nogo-66, p75 y TAJ asi como también o mejor que las versiones truncadas que contenían la región LRR sola. Véase, por ej emplo, Shao y colaboradores, (2005), Neuron 45, 353-359. Se observó una afinidad 10 veces más alta por Taj utilizando el FL-NgRl en comparación con la versión truncada NgRl(310) que contenia solo la región LRR como se describe en Id. El análisis adicional del enlace en un ensayo ELISA de competencia, utilizando un anticuerpo anti-NgRl para bloquear el enlace de AP-OMgp y AP-Lingo-1 a NgRI, verificó las actividades de FL-NgRl (Figura 2C) .

Ejemplo 2 Análisis de la Secuencia de Aminoácidos de la Proteina de NgRl Humano de Longitud Completa Las secuencias de aminoácidos de FL-NgRl se confirmó por medio de la cartografía de péptidos tripsinicos en un sistema de CL-EM. La cartografía de péptidos se realizó sobre muestras de proteina con y sin el tratamiento con PNGase FMR. Primero, los glicanos N-unidos se retiraron de las proteínas nativas con PNGase FMR. Aproximadamente 1 µL de PNGase FMR (2.5 mU/µL, Prozyme) se agregó a 25 µL de una solución que contenia aproximadamente 20 µg de proteina; la solución se incubó a 37 °C durante 24 horas. Luego se agregó otro 1 µL de PNGase FMR y la solución se mantuvo a temperatura ambiente durante 24 horas adicionales. La alquilación se realizó bajo condiciones desnaturalizantes pero no reductoras. Aproximadamente 0.3 µL de 4-vinilpiridina se agregaron en 50 µL de la solución de proteina e inmediatamente después se agregaron 50 mg de clorhidrato de guanidina (GuHCl) a la solución. La solución se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 60 minutos. Las proteínas alquiladas se recuperaron por medio de la precipitación con 40 volúmenes de etanol frió como se describe en Pepinsky, R. B. (1991) Anal . Biochem . 195, 177-181. La solución se almacenó a -20°C durante 1 hora y luego se centrifugó a 14000 X g durante 8 minutos a 4°C. El sobrenadante se desechó y el producto precipitado (~20 µg/frasquito) se lavó una vez con etanol frió. La tripsina se seleccionó como la enzima de escisión para los estudios de unión de enlaces de disulfuro puesto que se esperaba que generara el conjunto más simple de péptidos que contenían cisteina. Las digestiones se realizaron a pH 6.5 para minimizar el intercambio de disulfuro. Para superar el problema de la proporción más baja de hidrólisis por tripsina a pH 6.5, las proteínas se trataron con endo-proteasa Lys-C antes de la escisión con tripsina. Aproximadamente 20 µg de cada una de las proteínas alquiladas, desglicosiladas o glicosiladas completamente, se digirieron con 5% (p/p) de endo-proteasa Lys-C (endo-Lys-C, Wako) en urea 1 M, Tris-HCl 0.2 M, pH 6.5, metilamina 10 mM, CaCl2 1 mM, durante 5 horas a temperatura ambiente; luego se agregó 5% (p/p) de tripsina (Promega) y la solución se incubó durante 10-12 horas adicionales a temperatura ambiente. El volumen final fue 55 µL . Antes del análisis de las digestiones en un sistema de Cromatografia Líquida/Espectrometría de Masas (CL-EM) se agregaron 55 µL de urea 8 M recientemente preparada y la solución se dividió en dos partes: una se analizó después de la reducción durante 1 hora a 37°C con DTT 40 mM y la otra parte se analizó directamente sin reducción. Las digestiones reducidas y no reducidas se analizaron en un sistema de CL-EM compuesto de una CLAR (2690 Alliance Separations Module), un detector de luz ultravioleta de doble longitud de onda 2487 y un espectrómetro de masas LCT (Waters Corp., Milford, MA) . La CLAR se equipó con una columna Cíe YMC de 1.0 mm x 25 cm (AA12S052501WT) o una columna C?8 Vydac de 1.0 mm x 25 cm (218TP51) y se eluyó con un gradiente de 200-minutos (acetonitrilo al 0-70%) en ácido trifluoroacético 0.03% a una velocidad de flujo de 0.07 mL/minuto a una temperatura de 30°C Los péptidos se separaron en una columna de fase inversa C18 con un espectrómetro de masas en linea ESI-TOF. Todos los picos significativos se identificaron y constituían 97% de la secuencia de NgRl predicha (Tabla 1) . En los mapas de péptidos no se detectaron los péptidos pequeños e hidrófilos que se co-eluyeron presumiblemente con el pico de solvente. En los péptidos identificados, ocho sitios no predichos de modificación posterior a la traducción incluyeron: hidroxilación en Prolina-352 (aproximadamente 75%; el pico se eluye en 51.5 minutos en la Figura 2 y se designa T3KHyp-352> en la Tabla 1) y glicosilación O-unida en siete sitios en el Péptido T34 (residuos 378-414, Tabla 1) . El sitio de hidroxilación se identificó por medio de la secuenciación en tándem de Espectrometría de Masas (EM/EM) en el péptido de 1652.9-Da (datos no mostrados) . El pico que contenia el glicopéptido tripsinico T34 (residuos 378-414) se recolectó y aproximadamente 0.1 µg del péptido se secó bajo vacío y se resuspendió en 10 µl de PBS. Para retirar los ácidos siálicos, se agregó una alícuota de 0.5 µl de sialidasa (10 mU/µL, Boehringer Mannheim), después de lo cual la solución se incubó a temperatura ambiente durante 20 horas. La digestión con endoproteasa Glu-C (endo-Glu-C, Sequencing Grade, Roche) se llevó a cabo al tratar el glicopéptido con 0.05 µg de la enzima a temperatura ambiente durante 24 horas. El péptido tripsinico tratado con sialidasa T34 se analizó en un espectrómetro de masas Voyager STR (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando DHB como una matriz. La digestión con endo-Glu-C del péptido T34 desialidado se analizó en un sistema de CL-EM de nanoflujo como se describiera anteriormente. El análisis mostró que el sitio de glicosilación N-unido, Asparagina-380, en T34 no está ocupado pero la totalidad de cuatro residuos de Serina y tres residuos de Treonina en el péptido son glicolizados en algún grado, aunque el péptido contiene, principalmente, un total de 4-6 glicanos O-unidos (datos no mostrados) . Los resultados analíticos son consistentes con las predicciones hechas utilizando el programa NetOGlyc 3.1.

Tabla 1. Análisis C-EM de péptidos de una digestión tripsinica de FL-NgF reducido y piridiletilado Las designaciones ¥ representan péptidos tripsínicos predichos de la secuencia de FL-NgRl donde Tl es el péptido N-terminal y T41 el péptido C-terminal. *Leu es de la etiqueta Flag en la terminación N de FL-NgRl . § es una fracción tratada con sialidasa antes del análisis espectrométrico de masas.

Ejemplo 3 Análisis de Residuos de Cisteina Libre y Cisteina Unida a Disulfuro en la Proteina de NgRl Humana Para evaluar directamente cual de los residuos de Cisteina en la estructura madura estaba libre, una digestión tripsinica del FL-NgRl no reducido piridiletilado se analizó en un sistema de CL-EM después de que la digestión había sido reducida con DTT. Debido a que la proteina nativa se alquiló con 4-vinilpiridina antes de la escisión enzimática, cualquier residuo de Cisteina en el estado de tiol libre debe haber sido piridiletilada, dando por resultado un incremento de masa de 105-Da para cada grupo alquilo. Por otra parte, los residuos de Cisteina involucrados en enlaces de disulfuro deben ser detectados como cisteina libre, es decir que tienen un grupo tiol libre después de la reducción. El FL-NgRl contiene catorce residuos de Cisteina -- cuatro en la LRRNT, dos en las LRRs, cuatro en la LRRCT y cuatro en el tallo de CT . Todos los péptidos predichos que contenían cisteina en el mapa de péptidos tripsinicos de la digestión reducida se identificaron, excepto que por aquellos que contenían Cisteina-80 y Cisteina-429, los cuales al ser pequeños se eluyeron presumiblemente con el pico de solvente y no se analizaron. El panel más bajo de la Figura 3 muestra el mapa de péptidos tripsinicos para el FL-NgRl piridiletilado después de la reducción. Todos los péptidos identificados se listan en la Tabla 1 con los péptidos que contienen Cisteina en negrita. El análisis de estos datos mostró que 11 de 12 residuos de Cisteina identificados estaban en la forma de tiol libre después de la reducción y que la Cisteina-140 en el péptido TÍO (residuos 140-151) estaba piridiletilada. Por lo tanto, se puede deducir que doce de los residuos de Cisteina en el FL-NgRl nativo están involucrados en seis enlaces de disulfuro y dos no están pareados. Además, utilizando información de la estructura cristalina de NgRl(310), uno puede predecir que la Cisteina-80 existe como un tiol libre, puesto que en la estructura cristalina está escondida en la región de LRR. Por deducción, la Cisteina-429 en la región del tallo de CT, que no está presente en la estructura cristalina, debe estar involucrada en la formación de enlaces de disulfuro.

Ejemplo 4 Análisis de Uniones de Disulfuro en la Proteina de FL-NgRl Las estructuras de disulfuro dentro del NgRl se determinaron al analizar los mapas de péptidos de digestiones no reducidas. Basándose en la estructura de disulfuro observada en la estructura cristalina de NgRl(310) como se describe en He y colaboradores, (2003) Neuron, 38, 177-185 y Barton y colaboradores, (2003) EMBO J. 22, 3291-3302, la digestión no reducida debe contener dos grupos de péptidos unidos a disulfuro, uno de la región de LRRNT y el otro de la región de LRRCT. De hecho, el análisis del mapa de péptidos de la digestión no reducida reveló un grupo de péptidos unidos a disulfuro (T1/T2) de la región de LRRNT eluyendo en 74.3 minutos (Figura 3, panel superior). El análisis espectrométrico de masas del pico mostró que contiene dos péptidos, Tl (residuos 27-38) y T2 (residuos 39-61), unidos por dos enlaces de disulfuro (masa observada, 3698.77 Da; masa calculada, 3698.77 Da; Tabla 2). El pico que contenía los péptidos Tl y T2 desapareció cuando la digestión se redujo con DTT y, concomitantemente, en el mapa reducido, se observaron dos nuevos picos que correspondían a los péptidos individuales, Tl y T2 (Figura 3, panel inferior) . El péptido Tl contiene tres cisteinas. Debido a la falta de una proteasa que puede escindir entre la Cisteina-27 y la Cisteina-29 y la Cisteina-29 y la Cisteína-33, las uniones de disulfuro exactas en T1/T2 tuvieron que ser determinadas por la reducción parcial con clorhidrato de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP, Pierce) y la alquilación con N-etilmaleimida (NEM, Pierce) seguida por el análisis de CL-EM/EM. Para realizar esto, los péptidos tripsinicos unidos a disulfuro se redujeron parcialmente utilizando TCEP, Pierce en amortiguador de citrato 0.1 M, pH 3, que contenia HCl de guanidina 6 M como se describe en Burns y colaboradores, J^_ Org. Chem. 1991, 56, 2648-2650. Se agregaron varias cantidades de TCEP a la solución para encontrar las condiciones óptimas. Se descubrió que las cantidades óptimas de TCEP eran 5 nmol para 20 pmol de los péptidos unidos a disulfuro en la región de LRRNT y 5 nmol para 10 pmol de los péptidos unidos a disulfuro en las regiones de LRRCT y de tallo. El volumen total de la solución fue 2.5 µl . La reducción se llevó a cabo a 37 °C durante 15 minutos y se detuvo por la alquilación de los péptidos parcialmente reducidos con un exceso de NEM en amortiguador de citrato 0.4 M, pH 4.5 que contenia HCl de guanidina 6 M. La concentración final de NEM en la solución (5 pl) fue 10 mM; la solución se mantuvo a 37 °C durante 1 hora. Los péptidos reducidos parcialmente y NEM-alquilados se analizaron en un sistema de CL-EM/EM de nanoflujo como se describiera anteriormente, ya sea directamente o después del fraccionamiento adicional en un módulo 2690 Alliance Separations con una columna dC?8 Atlantic 1.0 mm x 15 cm (186001283, Waters Corp.). Se utilizó un gradiente de 70 minutos (acetonitrilo al 5-70%) en ácido trifluoroacético al 0.1% a una velocidad de flujo de 0.07 mL/minuto, a 30 °C, para el fraccionamiento. Los componentes en picos en los mapas de péptidos se identificaron utilizando el equipo lógico MassLynx 4.0MR (Waters Corp.). Los espectros de EM/EM se adquirieron utilizando la función de adquisición dependiente de datos (DDA, por sus siglas en inglés) en un sistema de CL-EM/EM de nanoflujo como se describiera anteriormente. La energia de colisión de rampa 21-40 ev se utilizó para los experimentos de EM/EM y los espectros de EM/EM se recolectaron en el rango m/z 50-1800, con toma de muestras cada 0.5 segundos, separación de 0.05 segundos entre espectros consecutivos. Los espectros de EM o EM/EM adquiridos del dispositivo Q-TOF Premier se simplificaron por medio del programa MaxEnt 3MR. Los péptidos unidos por enlaces de disulfuro se identificaron adicionalmente al comparar el mapa de la digestión no reducida con el mapa de la muestra reducida correspondiente. A partir de la estructura cristalina de NgRI(310) como se describe en He y colaboradores, (2003) Neuron, 38, 177-185 y Barton y colaboradores, (2003) EMBO J. 22, 3291-3302, se deduce que Tl tendrá un enlace de disulfuro dentro de un péptido y está unido a T2 por un enlace de disulfuro entre péptidos. El análisis espectrométrico de masas de los productos de la reducción parcial y alquilación, después de la separación en una columna C?8, detectó los siguientes péptidos NEM-alquilados, parcialmente reducidos, predichos: Tl que contenia un enlace de disulfuro y un grupo N-etilsuccinimidilo (NES) (MH+ observado = 1519.64, MH+ calculado = 1519.64), T2 con un grupo NES (MH+ observado = 2433.26, MH+ calculado = 2433.25) y T1/T2 que contiene un enlace de disulfuro entre péptidos y dos grupos NES (MH+ observado = 3951.90, MH+ calculado = 3951.89 Da). El espectro de EM/EM para Tl que contenia un enlace de disulfuro y un grupo NES, mostrado en la Figura 4, indica que el grupo NES está en la Cisteina-29 (iones fragmento internos, PGAC(NES) y iones relacionados yn Figura 4), lo cual significa que la Cisteína-33 está unida a la Cisteina-27 por un enlace de disulfuro dentro de un péptido y que la Cisteina-29 está unida a la Cisteina-43 en T2 por un enlace de disulfuro entre péptidos. Los resultados de la secuenciación de EM/EM para T1/T2 que contenia un enlace de disulfuro entre péptidos y dos grupos NES son consistentes con esta conclusión, puesto que el análisis mostró que los dos grupos NES estaban en la Cisteina-27 y la Cisteina-33 (datos no mostrados). La estructura cristalina de la región de LRRCT de NgRl(310) como se describe en He y colaboradores, (2003) Neuron, 38, 177-185 y Barton y colaboradores, (2003) EMBO J. 22, 3291-3302) reveló uniones de disulfuro de la Cisteína-264 a la Cisteína-287 y de la Cisteina-266 a la Cisteina-309. Por lo tanto, los cuatro residuos de Cisteina en la región de LRRCT deben estar contenidos en tres péptidos tripsinicos — T21 (residuos 257-267), T24 (residuos 280-292) y T28 (residuos 301-323) unidos por dos enlaces de disulfuro entre péptidos (la masa calculada para esta agrupación debe ser 5088.68 Da). Los tres péptidos individuales, T21, T24 y T28 (Panel inferior de la Figura 3 y Tabla 1) , se identificaron fácilmente en el mapa de la digestión reducida, pero no se encontró un pico significativo que correspondiera a esta agrupación de péptidos, T21/T24/T28 en el mapa de la digestión no reducida. En lugar de eso, apareció un pico prominente con una masa de 6032.62 Da el cual corresponde a la agrupación de cuatro péptidos que contenia T21, T24, T28 y T30 (residuos 335-343) unidos por tres enlaces de disulfuro (masa calculada = 6032.68 Da; panel superior de la Figura 3, y Tabla 2) . Puesto que cada uno de los péptidos T21 y T30 contiene dos residuos de Cisteína, una Cisteina en el péptido T21 debe formar un enlace de disulfuro con una en el péptido T30, aunque las uniones exactas no se podrían determinar. El análisis de cartografía de péptidos tripsinicos también mostró que el pico en 19.0 minutos contiene los otros dos péptidos que contienen Cisteína en la región de tallo de CT y que se unen por medio de un enlace de disulfuro entre la Cisteina-419 y la Cisteina-429 (Tabla 2 y Figura 3, panel superior) . Para determinar las uniones de disulfuro en el complejo de péptidos T21/T24/T28/T30, se recolectó el pico que contenia los péptidos unidos a disulfuro en la región de LRRCT y de tallo en el mapa de péptidos tripsinicos, se secó al vacio y se resuspendió en 10 µl de Tris-HCl 0.1 M, pH 6.5, MgCl2 1 mM. Aproximadamente 0.02 µg de la endo-proteasa Asp-N (endo-Asp-N, Sequencing Grade, Roche) se agregaron a 0.6 µg de los péptidos, después de lo cual la solución se incubó a temperatura ambiente durante 6 horas. La digestión se analizó en un sistema de CL-EM de nanoflujo compuesto de una CLAR de nanoflujo (NanoAcquity, Waters Corp., Milford, MA) y un espectrómetro de masas Q-TOF PremierMR (Waters Corp., Milford, MA) . Una columna dCi8 Atlantic de 0.10 mm x 10 cm (186002831, Waters Corp.) se utilizó para la separación con un gradiente en 50 minutos (acetonitrilo al 0-70%) en ácido fórmico al 0.1% a una velocidad de flujo de 400 nL/minuto. La temperatura fue 35°C. Puesto que cada uno de los péptidos T21 y T30 contiene dos residuos de Cys, una Cys en el péptido T21 debe formar un enlace de disulfuro con una en el péptido T30 (Figura 8). Existen ocho estructuras de disulfuro posibles para la agrupación de péptidos T21/T24/T28/T30 (Figura 8) . Se detectaron dos picos significativos por medio del análisis espectrométrico de masas en la digestión no reducida (datos no mostrados). El MH+ detectado 2076.89 (Figura 5) en el segundo pico corresponde con el MH+ calculado 2076.91 para el péptido T21 y el péptido T24 unido por un enlace de disulfuro entre la Cisteina-264 y la Cisteina-287, como se observa en la estructura cristalina de NgRl(310). La identidad de este fragmento se confirmó por medio de la observación de iones de fraccionamiento en la fuente (Figura 5). El MH+ observado 2879.50 Da en el otro pico corresponde al MH+ calculado 2879.25 Da para el grupo de tres péptidos, residuos 265-267 (derivados de T21), residuos 305-323 (derivados de T28) y residuos 335-338 (derivados de T30), unidos por dos enlaces de disulfuro entre péptidos, lo cual indica que la Cisteina-266 y la Cisteina-309 en la región de LRRCT forman enlaces de disulfuro con la Cisteina-335 y Cisteina-336 en la región de tallo de CT (datos no mostrados) . La determinación de los apareamientos de disulfuro exactos, Cisteína-266 y la Cisteína-309 con Cisteína-335 y Cisteína-336, en este caso, se complicó por el hecho que no existen reactivos que puedan escindir la estructura principal entre la Cisteína-335 y la Cisteina-336. La disposición de apareamiento de disulfuro en el complejo T21/T24/T28/T30 se ilustró adicionalmente al sujetarlo a una reducción parcial con TCEP seguida por la alquilación con NEM y el análisis por medio de nano-CL-EM. La Figura 6 muestra los resultados de CL-EM de nanoflujo (TIC) y la Tabla 3 lista las identidades de los componentes en los picos. Los picos dobles observados para ciertos péptidos son debido a estereoisómeros generados por la NEM alquilación. Los espectros de EM/EM son los mismos para picos individuales en cada doblete (datos no mostrados) . El pico doblete que contiene T28/T30 con un enlace de disulfuro y un grupo NES se recolectó de una conducción de fraccionamiento en una columna de 1 mm x 150 mm y se analizó adicionalmente en un sistema de nano-CLEM/EM después de que se habla reducido completamente con DTT. La Figura 7 muestra el espectro de EM/EM del péptido T30 que contiene un grupo NES. Ambos iones bi e y8, detectados por medio de la secuenciación de EM/EM, muestran que el grupo NES está en la Cisteina-356 , no en la Ci s t eina-366 , debido a que el valor m/z observado es 229.08 para b y 847.38 para y8 (el valor m/z calculado es 229.06 para bi y 847.36 para y8, si la Cisteina-335 es alquilada con NEM; El valor m/z calculado es 104.10 para bi y 972.46 para y8, si la Cisteina-336 es alquilada con NEM), lo cual indica que la Cisteina-336 forma un enlace de disulfuro con la Ci s teina- 309. Consecuentemente, entonces, la Cisteína-335 debe unirse a la Cist e ina-266. Las uniones de disulfuro determinadas experimentalmente en el complejo T21/T24/T28/T30 se muestran en la Figura 9. Los análisis de la estructura de disulfuro en el dominio de LRRCT de FL-NgRl no demuestran únicamente que la estructura de disulfuro predicha para la LRRCT del NgRl es incorrecta, sino que también identifica una estructura de apareamiento de Cisteina alternativa. Mientras que no se limita por una teoria, se cree que la unión de Cys-266 a Cys-309 observada en el NgRl(310) es un artefacto creado por el truncamiento.

Tabla 2. Péptidos unidos a disulfuro detectados en un mapa de péptidos tripsinicos de la digestión no reducida de FL-NgRl piridiletilado Tabla 3. Análisis de CL-EM de componentes de la agrupación de péptidos NEM-alquilados , parcialmente reducidos T21/T24/T28/T30 Ejemplo 5 Análisis de Estructuras de Disulfuro de Proteínas de NgRl y NgR2 Hechas a partir de Diferentes Construcciones Las estructuras de disulfuro en el NgR2(FL)-Fc humano, proteína de NgRl(310) humano, proteína de NgRl(344) humano, proteína de NgRl(310) de rata y proteína de fusión de NgRI (344) -rata-Fe ( IgGl) de rata [rataNgRl (344 ) -Fc] también se analizaron por medio de la cartografía de péptidos tripsinicos. El alineamiento de las secuencias se muestra en la Figura 10. La Figura 11 muestra los mapas de péptidos tripsinicos para el NgRl(310) de rata como un ejemplo. Los resultados se resumen en la Tabla 4 y la Figura 12. Estos análisis mostraron que las estructuras de disulfuro en las proteínas de NgR2(FL)-Fc de humano, NgRl(310) de rata y NgRl(310) de humano que carecen de los dos residuos de Cisteina, Cisteina-335 y Cisteina-336, en la región de tallo de CT son las mismas observadas en la estructura cristalina del NgRl(310) de humano y que las estructuras de disulfuro en las proteínas de NgRl(344)-Fc de rata y NgRI(344) de humano las cuales no tienen los dos residuos de Cisteína en la región de tallo de CT son las misma observadas en el FL-NgRI . El análisis espectrométrico de masas mostró que los dos residuos de Cys en el tallo de CT del NgR2(FL)-Fc son unidos por un enlace de disulfuro como se observa en el NgRl. El análisis también identificó un sitio de glicosilación 0-unido, Thr-313, en la LRRCT del NgR2(FL)-Fc. La ocupación de sitios de glicosilación es aproximadamente 35%.

Tabla 4. Breve descripción de análisis espectrométricos de masas para estructuras de disulfuro en proteínas de NgRl hechas de diferentes construcciones Ejemplo 6 Ensayo de Extensión de Neuritas El efecto de los polipéptidos y fragmentos de polipéptidos del receptor de Nogo solubles de la invención sobre la extensión de neuritas se somete a prueba al realizar experimentos con células desarrolladas en presencia y ausencia de laminina. El crecimiento de células neuronales en medios sin laminina es pobre y modela las condiciones de tensión neuronales. Los ganglios de raiz dorsal (DRG's, por sus siglas en inglés) son disectados de crias de rata de 6-7 dias posparto (P6-7), se disocian en células individuales y se colocan en placas de 96 pocilios revestidas previamente con 0.1 mg/ml de poli-D-lisina (SigmaMR) . En algunos pocilios se agregan 2 µg/ml de laminina durante 2-3 horas y se enjuagan antes de que se coloquen las células. Después de una incubación de 18-20 horas, las placas se fijan con paraformaldehído al 4%, se tiñen con anticuerpo anti-Beta-III-tubulina de conejo diluido 1:500 (CovanceMR) y anti-HuC/D diluido 1:100 (Molecular Probes) y anticuerpos secundarios fluorescentes (Molecular Probes) se agregan en una dilución de 1:200. El dispositivo ArrayScan IIMR (CellomicsMR) se puede utilizar para capturar imágenes digitales 5x y para cuantificar la extensión de neuritas como extensión de neuritas promedio/neurona por pocilio, al utilizar la aplicación de extensión de neuritas. Se analizan suficientes imágenes para permitir un análisis estadístico de los resultados . En algunos experimentos, se utiliza un sub-clon de células PC12 (Neuroscreen) (Cellomics) . Las células Neuroscreen son diferenciadas previamente durante 7 dias con 200 ng/ml de NGF, se separan y se reemplazan en placas de 96 pocilios revestidas previamente con poli-D-lisina. En algunos pocilios se agregan 5 µg/ml de laminina durante 2-3 horas y se enjuagan antes de que se coloquen las células. Después de 2 dias de incubación, las placas se fijan con para-formaldehido al 4%, se tiñen con anticuerpo anti-beta-III-tubulina de conejos diluido 1:500 (CovanceMR) y Hoechst (tinción nuclear) . El dispositivo ArrayScan IIMR se utiliza para cuantificar la extensión de neuritas co o en las células de DRG como se describiera anteriormente. Los polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de NgRl de la invención, por ej emplo el fragmento de polipéptidos NgRl (309-34 ) , se agregan en una solución a las neuronas de DRG P6-7 y a las células NeuroscreenMR diferenciadas al momento de la colocación en placas. Se evalúa el efecto de los polipéptidos o fragmentos de polipéptidos de NgRl sobre la extensión de neuritas.

Ejemplo 7 Ensayo de Extensión de Neuritas Los portaobjetos de cultivo Lab-TekMR (4 pocilios) son revestidos con 0.1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma). La mielina del CNS sola o mezclada con un polipéptido o fragmento de polipéptido de NgRl de la invención, por ej emplo el fragmento de polipéptido NgRl (309-344 ) se coloca por separado como gotas de 3 µl . Se agregan microesferas fluorescentes (Polysciences) a la mielina/PBS para permitir la identificación posterior de las gotas (Grandpre y colaboradores, Nature 403, (2000)). Los portaobjetos Lab-TekMR entonces se enjuagan y se revisten con 10 µg/ml de laminina (GibcoMR) . Los ganglios de raíz dorsal (DRG's) de crías de rata Sprague Dawley P3-4 son disociados con 1 mg/ml de colagenasa tipo 1 (Worthington) , se trituran con pipetas Pasteur pulidas al fuego colocadas en placas previamente para el enriquecimiento en células neuronales y finalmente se colocan en placas a 23,000 células/pocilio en los portaobjetos de cultivo LabtekMR revestidos previamente. El medio de cultivo es, por ejemplo, F12 que contiene suero de caballo donador inactivado térmicamente al 5%, suero de bovino fetal inactivado térmicamente al 5% y 50 ng/ml de mNGF y se incuba a 37°C y C02 al 5% durante 6 horas. Los portaobjetos se fijan durante 20 minutos con paraformaldehido al 4% que contiene sacarosa al 20% y se tiñen para el marcador neuronal anti-beta-III-tubulina (Covance TUJ1) diluido 1:500. Como el anticuerpo secundario, el anticuerpo anti-ratón Alexa Fluor 594MR (Molecular Probes) se diluye 1:300 y los portaobjetos se cubren con Gel/MountMR (BimedaMR) . Se adquieren suficientes imágenes digitales 5x con el equipo lógico OpenLabMR y se analizan por medio del uso del equipo lógico MetaMorphMR para la cuantificación de la extensión de neuritas. Se evalúa la capacidad del polipéptido o fragmentos de polipéptido de NgRl para proteger las neuronas de DRG de la inhibición mediada por mielina de la extensión de neuritas . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (39)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un fragmento de polipéptido aislado de 40 residuos o menos, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a los aminoácidos 309 a 344 de la SEC ID NO: 2, excepto por sustituciones de hasta tres aminoácidos .
2. 2. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una de las sustituciones de aminoácidos se hace en el residuo de cisteina seleccionado del grupo que consiste de C309, C335 y C336.
3. 3. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el residuo de cisteína es C309.
4. 4. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el residuo de cisteina es C335.
5. 5. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el residuo de cisteina está en C336.
6. 6. El fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque el residuo de cisteina es sustituido por un aminoácido diferente seleccionado del grupo que consiste de: alanina, serina o treonina.
7. 7. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el aminoácido diferente es alanina.
8. 8. El fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque es cíclico.
9. 9. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque además comprende una primera molécula unida en la terminación N y una segunda molécula unida en la terminación C; en donde la primera molécula y la segunda molécula se unen entre si para formar la molécula cíclica.
10. 10. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la primera molécula y la segunda molécula se seleccionan del grupo que consiste de: una molécula de biotina, un residuo de cisteina y un residuo de cisteina acetilada.
11. 11. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la primera molécula es una molécula de biotina unida a la terminación N y la segunda molécula es un residuo de cisteína unido a la terminación C del polipéptido.
12. 12. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la primera molécula es un residuo de cisteina acetilada unido a la terminación N y la segunda molécula es un residuo de cisteina unido a la terminación C del polipéptido.
13. 13. El fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque la cisteina C-terminal tiene una porción de NH2 unida.
14. 14. El fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque está fusionado a un polipéptido heterólogo.
15. 15. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido heterólogo es albúmina de suero.
16. 16. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido heterólogo es una región Fc.
17. 17. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido heterólogo es un péptido de señal.
18. 18. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido heterólogo es una etiqueta de polipéptido.
19. 19. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la región Fc se selecciona del grupo que consiste de: una región Fc de IgA; una región Fc de IgD; una región Fc de IgG, una región Fc de IgE; y una región Fc de IgM.
20. 20. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la etiqueta de polipéptido se selecciona del grupo que consiste de: etiqueta FLAG; etiqueta Strep; etiqueta de poli-histidina; etiqueta VSV-G; etiqueta de hemaglutinina de virus de influenza (HA) ; y etiqueta de c-Myc.
21. 21. El fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el polipéptido está unido a una o más porciones de polialquilenglicol .
22. 22. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque una o más de las porciones de polialquilenglicol es una porción de polietilenglicol (PEG) .
23. 23. El fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el polipéptido está unido a 1 a 5 porciones de PEG.
24. 24. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.
25. 25. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos está unida de manera operable a un elemento de control de expresión.
26. 26. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el elemento de control de expresión se selecciona del grupo que consiste de: un promotor inducible; un promotor constitutivo; y una señal de secreción.
27. 27. Un vector, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26.
28. 28. Una célula hospedante, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 27.
29. 29. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 y un portador farmacéuticamente aceptable.
30. 30. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26 y un portador farmacéuticamente aceptable.
31. 31. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 27 o la célula hospedante de conformidad con la reivindicación 28 y un portador farmacéuticamente aceptable .
32. 32. Un método para promover la extensión de neuritas, caracterizado porque comprende poner en contacto una neurona con un agente seleccionado del grupo que consiste de: (a) el fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23; (b) el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26; y (c) la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, en donde el agente evita la inhibición de la extensión de neuritas mediada por el receptor de Nogo 1.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la neurona está en un mamífero.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el mamífero es un humano.
35. 35. Un método para inhibir la transducción de señales por el complejo de señalización de NgRl, caracterizado porque comprende poner en contacto una neurona con una cantidad efectiva de un agente seleccionado del grupo que consiste de: (a) el fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23; (b) el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26; y (c) la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, en donde el agente inhibe la transducción de señales por el complejo de señalización de NgRl .
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la neurona está en un mamífero.
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el mamífero es un humano.
38. 38. Un método para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central (CNS) en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero en necesidad de tratamiento una cantidad efectiva de un agente seleccionado del grupo que consiste de: (a) el fragmento de polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23; (b) el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26; y (c) la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, en donde el agente evita la inhibición de la extensión de neuritas mediada por el receptor de Nogo 1.
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la enfermedad, trastorno o lesión se selecciona del grupo que consiste de esclerosis múltiple, ALS, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, apoplejía, lesiones traumáticas del cerebro, lesión de la médula espinal, neuritis óptica, glaucoma, pérdida de audición y leucodistrofia adrenal.