BRPI0615266A2 - polipeptìdeos nogo receptor e fragmentos de polipeptìdeo e usos destes - Google Patents

Abstract

POLIPEPTIDEOS NOGO RECEPTOR E FRAGMENTOS DE POLIPEPTIDEO E USOS DESTES. A presente invenção refere-se a um Nogo receptor 1(NgR1) é uma proteína de repetição rica em leucina que forma parte de um complexo de sinalização que modula regeneração de axon. Estudos anteriores têm mostrado que a região LRR total de Nogo receptor-1, incluindo capa de terminal-O de LRR, LRRCT, é necessária para ligação de ligante, e que a base CT adjacente do Nogo receptor-1 contribui para interação com seus coreceptores. A presente invenção é dirigida ao uso de certos polipeptídeos Nogo receptor-1 e Nogo receptor-2 e fragmentos de polipeptídeo para promoção de desenvolvimento de neurite, sobrevivência neuronal, e regeneração axonal em neurónios do sistema nervoso central (ONS). A invenção caracteriza moléculas e métodos úteis para inibir inibição de desenvolvimento de neurite, promovendo sobrevivência neuronal, e/ou promovendo regenera- ção axonal nos neurónios do sistema nervoso central (ONS).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍDEOSNOGO RECEPTOR E FRAGMENTOS DE POLIPEPTÍDEO E USOS DESTES".

Antecedentes da Invenção

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se à neurobiologia, neurologia e farmaco-logia. Mais particularmente, a invenção refere-se a neurônios e composiçõese métodos para mediação de crescimento axonal.

Técnica Anterior

Axônios e dendritos de neurônios são extensões celulares Ion-gas de neurônios. A ponta distai de um axônio de extensão ou neurite com-preende uma região especializada conhecida como o cone de crescimento,que detecta o ambiente local e guia o crescimento axonal em direção à célu-la-alvo de neurônio. A guia de crescimento no cone envolve várias classesde moléculas de adesão, sinais intercelulares, bem como fatores que estimu-lam e inibem o crescimento dos cones.

A função da célula nervosa é grandemente influenciada pelocontato entre o neurônio e outras células no ambiente imediato. Estas célu-las incluem células gliais oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC),e células de Schwann no sistema nervoso periférico (SNP), que embainhamo axônio neuronal com mielin (uma estrutura de isolamento de membranasmulticamadas). Enquanto os neurônios do SNC têm a capacidade de rege-nerarem-se após dano, eles são impedidos de fazerem assim devido à pre-sença de proteínas inibitórias presentes na mielin, e possivelmente tambémpor outros tipos de moléculas normalmente encontradas em seu ambientelocal (Brittis and Flanagan, Neuron 2001, 30, pp. 11-14; Jones et ai, J. Neu-rosci. 2002, 22, pp. 29792-2803; Grimpe et ai, J. Neurosci. 2002, 22, pp.3144-3160).

Várias proteínas inibitórias de mielin que são encontradas emoligodendrócitos foram caracterizadas, por exemplo, NogoA (Chen et ai,Nature. 2000, 403, 434-439; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444),milelin associada a glicoproteína (MAG, McKerracher et ai, Neuron 1994,13, 805-811; Mukhopadhyay et ai, Neuron 1994, 13, 757-767) e oligoden-drócito glicoproteína (OM-gp, Mikol and Stefansson, J. Cell. Biol. 1988, 106,1273-1279). Cada uma destas proteínas tem sido separadamente mostradacomo sendo um Iigante para o receptor Nogo neuronal-1 ("NgR1") (Wang etal., Nature 2002, 417, 941-944; Liu et ai, Science. 2002, 297, 1190-93;Grandpre et ai, Nature 2000, 403, 439-444; Chen et ai, Nature, 2000, 403-434-439; Domeniconi, 2002, 35, 283-90). Nogo-66 é um peptídeo de 66 ami-noácidos de NogoA tendo a capacidade de inibir desenvolvimento de neuri-te, e causar crescimento de colapso do cone. (Fournier et ai, Nature 2001,409, 341-346). Nogo receptor-1 (NgR1) é uma proteína de repetição rica emleucina (LRR) que contém oito LRRCT flanqueadas por domínios ricos emcisteína N-terminal e C-terminal (regiões de LRRNT e LRRCT, respectiva-mente, e região de base rica em Ser, Thr, Pro e Gly (base de CT) entre aLRRTC e um local de âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI). NgR1 formaum complexo de sinalização com LINGO-1 e p75 ou Taj (também conhecidocomo TROY). Sob interação com uma proteína inibitória (por exemplo, No-goA, MAG e OM-gp), o complexo de NgRI transduz sinais que conduzem acrescimento do colapso do cone, e inibição de desenvolvimento de neurite.Estudos anteriores mostram que a região de LRR total de Nogo-receptor-1,incluindo a capa C-terminal de LRR, LRRCT, é necessária para ligação deligante, e que a base de CT adjacente do Nogo-receptor-1 contribui para in-teração com seus co-receptores.

O dano axonal é uma patologia chave em muitos danos do sis-tema nervoso central (SNC), tais como dano da coluna cervical, dano trau-mático do cérebro e acidente vascular cerebral, bem como em esclerosemúltipla (MS). Uma estratégia recentemente desenvolvida para tratamentode danos do SNC e doenças do SNC é interferir com a inibição do cresci-mento axonal que ocorre através da interação de proteínas de mielin comseus receptores axonais, tais como NgR, LINGO-1, e p75 ou Taj. Por exem-plo, o anticorpo IN-1 anti-NogoA foi mostrado aperfeiçoar a recuperação fun-cional em ratos que suportaram atravessamento da coluna cervical. (Lee etai, Nature Reviews 2003, 2, 1-7). Em adição, um peptídeo de 40 resíduosconhecido como NEPI-40, um antagonista de NogoA, foi mostrado atenuaros efeitos de mielin ou Nogo-66 no crescimento do colapso de cone e de-senvolvimento de neurite, e aperfeiçoa o resultado in vivo em seguida aodano de coluna cervical. (Lee et ai, Nature Reviews 2003, 2, 1-7). Emboraestes reagentes tenham se mostrado grande promessa no tratamento de5 danos ao SNC1 permanece uma necessidade na técnica de compostos adi-cionais que inibam a sinalização de NgR1 e/ou atenuem o crescimento docolapso de cone mediado por mielin, e/ou inibam a inibição de desenvolvi-mento de neurite.

Sumário da Invenção

A presente invenção é dirigida ao uso de certos polipeptídeosNogo receptor, incluindo NgR1 e NgR2, e fragmentos de polipeptídeo destespara promoção de desenvolvimento de neurite, sobrevivência neuronal, eregeneração axonal nos neurônios do SNC. A invenção caracteriza molécu-las e métodos úteis para inibir a inibição de desenvolvimento de neurite,promovendo regeneração axonal nos neurônios do SNC.

Em algumas concretizações, a invenção proporciona um frag-mento de polipeptídeo isolado de 40 resíduos ou menos, compreendendoaminoácidos 309 a 344 de SEQ ID NO:2; exceto para até três substituiçõesde aminoácido.

Em algumas concretizações, a invenção proporciona um poli-peptídeo da invenção que é cíclico. Em algumas concretizações, o polipeptí-deo cíclico compreende adicionalmente uma primeira molécula ligada noterminal-N, e uma segunda molécula ligada no terminal-C; no qual a primeiramolécula e a segunda molécula são unidas uma à outra para formar referidamolécula cíclica. Em algumas concretizações, as primeira e segunda molé-culas são selecionadas a partir do grupo consistindo em: uma molécula debiotin, um resíduo de cisteína, e um resíduo de cisteína acetilatada. Em al-gumas concretizações, a primeira molécula é uma molécula de biotin fixadaao terminal-N, e a segunda molécula é um resíduo de cisteína fixado ao ter-minal-C do polipeptídeo da invenção. Em algumas concretizações, a primei-ra molécula é um resíduo de cisteína acetilatado fixado ao terminal-N, e asegunda molécula é um resíduo de cisteína fixado ao terminal-C do polipep-tídeo da invenção. Em algumas concretizações, a primeira molécula é umresíduo de cisteína acetilatado fixado ao terminal-N, e a segunda molécula éum resíduo de cisteína fixado ao terminal-C do polipeptídeo da invenção. Emalgumas concretizações, a cisteína de terminal-C tem uma porção de NH2fixada.

Em algumas concretizações, a invenção proporciona um poli-peptídeo da invenção no qual pelo menos um resíduo de cisteína é substitu-ído com um aminoácido diferente. Em algumas concretizações, pelo menosum resíduo de cisteína é C309. Em algumas concretizações, o pelo menosum resíduo de cisteína é C335. Em algumas concretizações, pelo menos ümresíduo de cisteína é C336. Em algumas concretizações, pelo menos umresíduo de cisteína é substituído com um aminoácido diferente selecionado apartir do grupo consistindo em: alanina, serina ou treonina. Em algumasconcretizações, o aminoácido diferente é alanina.

Em algumas concretizações, a invenção proporciona adicional-mente que o polipeptídeo seja fundido a um polipeptídeo heterólogo. Emalgumas concretizações, o polipeptídeo heterólogo é albumina de soro. Emalgumas concretizações, o polipeptídeo heterólogo é uma região Fe. Em al-gumas concretizações, o polipeptídeo heterólogo é um peptídeo de sinal. Emalgumas concretizações, o polipeptídeo heterólogo é uma etiqueta de poli-peptídeo. Em algumas concretizações, a invenção proporciona adicional-mente que a região Fc seja selecionada a partir do grupo consistindo em:uma região IgA Fc; uma região IgD Fe; uma região IgG Fe; uma região I-gEFc; e uma região IgM Fe. Em algumas concretizações, a invenção propor-ciona adicionalmente que a etiqueta de polipeptídeo seja selecionada a partirdo grupo consistindo em: etiqueta FLAG; etiqueta Strep; etiqueta poliistidina;etiqueta VSV-G; etiqueta de vírus da gripe hemaglutinin (HA); e etiqueta c-Myc.

Em algumas concretizações, a invenção proporciona um poli-peptídeo da invenção fixado a uma ou mais porções de polialquileno glicol.Em algumas concretizações, a invenção proporciona adicionalmente queuma ou mais porções de polialquileno glicol seja uma porção de polietilenoglicol (PEG). Em algumas concretizações, a invenção proporciona adicio-nalmente um polipeptídeo da invenção fixado a 1 a 5 porções de PEG.

Em algumas concretizações, a invenção proporciona um polinu-cleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo da invenção. Em algumasconcretizações, a invenção adicionalmente proporciona que a seqüência denucleotídeo seja operavelmente ligada a um elemento de controle de ex-pressão (por exemplo, um promotor induzível, um promotor constitutivo, ouum sinal de secreção). Concretizações adicionais incluem um vetor compre-endendo um polinucleotídeo isolado da invenção e uma célula hospedeiracompreendendo referido vetor.

Concretizações adicionais da invenção incluem composiçõesfarmacêuticas compreendendo os polipeptídeos, polinucleotídeos, vetoresou células hospedeiras da invenção, e, em certas concretizações, um veícu-lo farmaceuticamente aceitável.

Concretizações da invenção também incluem métodos parapromover desenvolvimento de neurite, compreendendo contactar um neurô-nio com um agente que inclui polipeptídeos, polinucleotídeos ou composi-ções da invenção, no qual referido agente inibe a inibição de desenvolvimen-to de neurite mediado por Nogo receptor-1. Em algumas concretizações, oneurônio está em um mamífero, e, em certas concretizações, o mamífero éum ser humano.

Concretizações adicionais incluem um método para inibir trans-dução de sinal por complexo de sinalização de NgR1, compreendendo con-tactar um neurônio com uma quantidade eficaz de um agente que inclui poli-peptídeo, polinucleotídeos, ou composições da invenção, no qual referidoagente inibe a transdução de sinal pelo complexo de sinalização de NgR1.Em certas concretizações, o neurônio está em um mamífero, e, em certasconcretizações, o mamífero é um ser humano.

Outras concretizações incluem um método para tratar uma do-ença, enfermidade ou dano do sistema nervoso central (SNC), em um mamí-fero, compreendendo administrar a um mamífero em necessidade de trata-mento uma quantidade eficaz de um agente que inclui polipeptídeos, polinu-cleotídeos, ou composições da invenção, no qual referido agente inibe inibi-ção de desenvolvimento de neurite mediado por Nogo receptor-1. Em certasconcretizações, a doença, enfermidade ou dano é selecionada a partir dogrupo consistindo em esclerose múltipla, ALS, doença de Huntington, doen-ça de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabética, acidente vascu-lar cerebral, danos traumáticos do cérebro, dano da coluna cervical, neuriteótica, glaucoma, perda de audição, e Ieucodistrofia adrenal.Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra a seqüência de FL-NgRI humana excluindo odomínio de GPI (SEQ ID NO:22). A região de LRRNT é representada pelosaminoácidos 27-73. As regiões de 8 LRR são representadas pelos aminoá-cidos 74-249. O domínio de LRRCT é representado pelos aminoácidos 250-310. A região de LRRCT extendida é representada pelos aminoácidos 311-337. A região de base é representada pelos aminoácidos 338-438. As Iiga-ções de dissulfito determinadas neste estudo são indicadas com uma linhanegra que une os resíduos Cys particulares. Os resíduos Cys na forma detiol livre são realçados em cinza. Um resíduo de hidroxiprolina (Hyp) é du-plamente sublinhado; os locais de glicosilação são sublinhados. O peptídeode sinal e seqüências de indicação não são mostrados. Um diagrama es-quemático da FL-NgRI humana é mostrada abaixo na seqüência.

A figura 2A mostra um SDS PAGE de várias proteínas de NgR1.

A figura 2B mostra um perfil de cromatografia de exclusão detamanho (SEC) de FL-NgRI.

A figura 2C mostra um gráfico ELISA, usando um anticorpo anti-NgR1 para bloquear a ligação de AP-OMgp e AP-Lingo-1 a FL-NgRI.

A figura 3 mostra mapas de peptídeo trípticos FL-NgRI piridileti-latado. Painel superior, digestão não-reduzida; painel inferior, digestão redu-zida.

A figura 4 mostra um espectro MS/MS do peptídeo parcialmentereduzido T1 contendo um grupo NES (SEQ ID NO: 18).

A figura 5 mostra um espectro de massa não-convoluto de Pico2 a partir de endo-Asp-N tratado com dissulfito-acoplamento de peptídeostrípticos ligados T21/T24/T28/T30 de FL-NgRI. Os íons y e b são devido àfragmentação de fonte interna. A figura mostra uma seqüência parcial depeptídeos T21 (SEQ ID N0:19) e a seqüência total de peptídeo T24 (SEQ IDN0:20).

A figura 6 mostra um Cromatograma de Ion total (TIC) de NEM-dissulfito alquilatado parcialmente reduzido-acoplamento de peptídeos liga-dos T21/T24/T28/T30 de FL-NgRI. As identidades dos componentes emcada pico são listadas na Tabela 3.

A figura 7 mostra um espectro MS/MS do peptídeo T30 contendoresíduos T30 contendo resíduos 335-343 com um grupo NES (SEQ IDN0:21) que foi gerado a partir da redução de dissulfito parcialmente reduzi-do-peptídeo tríptico ligado 335-343 e peptídeo tríptico 301-323.

A figura 8 mostra ligações de dissulfito possíveis no acoplamen-to de peptídeo T21/T24/T28/T30. A figura mostra a seqüência total de peptí-deos T24 (SEQ ID N0:20), T21 (SEQ ID NO:27), T30 (SEQ ID NO:28), T28(SEQ ID NO:29).

A figura 9 mostra as ligações de dissulfito no acoplamento depeptídeo T21/T24/T28/T30. A figura mostra a seqüência total de peptídeosT24 (SEQ ID N0:20), T21 (SEQ ID NO:27), T30 (SEQ ID NO:28), T28 (SEQID NO:29).

A figura 10 mostra o alinhamento de seqüência de proteína deformas diferentes de NgR.

A figura 11 mostra os mapas de peptídeo trípticos de NgR1 derato piridiíetilatado (310). Somente peptídeos contendo Cys que formam umaligação de dissulfito são etiquetados no mapa. A figura mostra peptídeos T21(SEQ ID N0:30), T18 (SEQ ID NO:31) e T25 (SEQ ID NO:32) de NgR1 derato.

A figura 12 mostra estruturas de dissulfito em NgR2 e NgR1 pro-duzidas de construções diferentes. As figura s mostram aminoácidos 27-473de SEQ ID NO:2 (NgR1 humano), aminoácidos 27-473 de SEQ ID NO:23(NgR1 de rato), e aminoácido 31-420 de SEQ ID NO:24 (NgR2 humano).Descrição Detalhada da Invenção

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos ecientíficos aqui usados têm o mesmo significado conforme comumente com-preendido por um versado na técnica ao qual esta invenção pertence. Emcaso de conflito, a presente aplicação, incluindo as definições, controlará. Amenos que de outro modo requerido pelo contexto, termos singulares podemincluir pluralidade e termos plurais podem incluir o singular. Todas as publi-cações, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadaspor referência em suas totalidades para toda a proposta como se cada publi-cação individual ou pedido de patente fossem especificamente e individual-mente indicados para serem incorporados por referência.

Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àquelesdescritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção,métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Os materiais, métodose exemplos são ilustrativos somente, e não são pretendidos para serem Iimi-tantes. Outras características e vantagens da invenção serão aparentes apartir da descrição detalhada e a partir das reivindicações.

De modo a definir adicionalmente esta invenção, os seguintestermos e definições são providos.

É para ser notado que o termo entidade "um" ou "uma" se referea um ou mais daquela entidade; por exemplo, "uma molécula de imunoglo-bulina", é compreendida para representar uma ou mais moléculas de imuno-globulina. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais", e "pelo menosum", podem ser usados intercambeavelmente aqui.

Através de todo este relatório descritivo e reivindicações, a pala-vra "compreende", ou variações tais como "compreende" ou "compreenden-do", indica a inclusão de qualquer inteiro recitado ou grupo de inteiros, masnão a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiros.

Conforme aqui usado, o termo "consiste em", ou variações taiscomo "consiste em" ou "consistindo em", conforme aqui usado através detodo relatório descritivo e reivindicações, indicam a inclusão de qualquer in-teiro recitado ou grupo de inteiros, mas que nenhum inteiro adicional ou gru-po de inteiros podem ser adicionados ao método, estrutura ou composiçãoespecificados.

Conforme aqui usado, o termo "consiste essencialmente de", ouvariações tais como "consiste essencialmente de" ou "consistindo essenci-almente de", conforme usado através de todo relatório descritivo e reivindi-cações, indica a inclusão de qualquer inteiro recitado ou grupo de inteiros, ea inclusão opcional de qualquer inteiro recitado ou grupo de inteiros que nãomudam materialmente as propriedades básicas ou novas do método, estru-tura ou composição especificados.

Conforme aqui usado, o termo "polipeptídeo" é pretendido paraenvolver um "polipeptídeo" singular, bem como "polipeptídeos" plurais, e serefere a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmenteligados por ligações de amida (também conhecidas como ligações de peptí-deo). O termo "polipeptídeo" se refere a qualquer cadeia ou cadeias de doisou mais aminoácidos, e se refere a um comprimento específico do produto.Desse modo, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteí-na", "cadeia de aminoácido", ou qualquer outro termo usado para se referir auma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, são inclusos na defini-ção de "polipeptídeo", e o termo "polipeptídeo" pode ser usado em vez de ouintercambeavelmente com qualquer destes termos. O termo "polipeptídeo" étambém pretendido para se referir aos produtos de modificações de pós-expressão do polipeptídeo, incluindo sem limitação glicosilação, acetilação,fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio co-nhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos que ocor-rem não-naturalmente. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte bio-lógica natural, ou produzido por tecnologia de recombinante, mas não é ne-cessariamente traduzido a partir de uma seqüência de ácido nucléico desig-nada. Ele pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo por síntese quími-ca.

Um polipeptídeo da invenção pode ser de um tamanho de cercade 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais,100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1000 ou mais, ou 2000 ou mais a-minoácidos. Os polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional defini-da, embora eles não tenham necessariamente tal estrutura. Os polipeptídeoscom uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrados, epolipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, maspreferivelmente podem adotar um grande número de conformações diferen-tes, e são referidos como não-dobrados. Conforme aqui usado, o termo gli-coproteína se refere a uma proteína acoplada a pelo menos uma porção decarboidrato que é fixada à proteína via uma cadeia lateral contendo oxigênioou contendo nitrogênio de um resíduo de aminoácido, por exemplo, um resí-duo de serina, ou um resíduo de aspargina.

Por um polipeptídeo "isolado" ou um fragmento, variante, ou de-rivado deste, é pretendido um polipeptídeo que não está em seu ambientenatural. Nível não particular de purificação é requerido. Por exemplo, um po-lipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Po-lipeptídeos recombinantemente produzidos e proteínas expressas em célu-las hospedeiras são considerados isolados para proposta da invenção, con-forme são polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados,fracionados, ou parcialmente ou substancialmente purificados por qualquertécnica adequada.

Na presente invenção, um "fragmento de polipeptídeo" se referea uma seqüência de aminoácido curta de um polipeptídeo maior. Os frag-mentos de proteína podem ser "de suporte livre", ou compreendidos dentrode um polipeptídeo maior do qual o fragmento forma uma parte de região.Exemplos representativos de fragmentos de polipeptídeo da invenção inclu-em, por exemplo, fragmentos compreendendo cerca de 5 aminoácidos, cer-ca de 10 aminoácidos, cerca de 15 aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos,cerca de 30 aminoácidos, cerca de 40 aminoácidos, cerca de 50 aminoáci-dos, cerca de 60 aminoácidos, cerca de 70 aminoácidos, cerca de 80 ami-noácidos, cerca de 90 aminoácidos, e cerca de 100 aminoácidos ou mais emcomprimento.

Os termos "fragmento", "variante", "derivado" e "análogo", quan-do se referindo a um polipeptídeo da presente invenção, incluem qualquerpolipeptídeo que retém pelo menos alguma atividade biológica. Os polipeptí-deos conforme aqui descritos podem incluir fragmento, variante ou molécu-las derivadas destes sem limitação, considerando-se que o polipeptídeo ain-da serve sua função. Os polipeptídeos NgR e fragmentos de polipeptídeo dapresente invenção podem incluir fragmentos proteolíticos, fragmentos deanulação, e, em particular, fragmentos que alcançam mais facilmente o localde ação quando distribuído a um animal. Os fragmentos de polipeptídeo in-cluem adicionalmente qualquer porção do polipeptídeo que compreende umepítope antigênico ou imunogênico do polipeptídeo nativo, incluindo epítopeslineares, bem como tridimensionais. Os polipeptídeos NgR e fragmentos depolipeptídeo da presente invenção podem compreender regiões de variante,incluindo fragmentos conforme descritos acima, e também polipeptídeoscom seqüências de aminoácido alteradas devido a substituições de aminoá-cido, anulações, ou inserções. Variantes podem ocorrer naturalmente, talcomo uma variante alélica. Por uma "variante alélica" é pretendido formasalteradas de um gene ocupando um dado local em um cromossomo de umorganismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985).Variantes que ocorrem não-naturalmente podem ser produzidas usando-setécnicas de mutagênese conhecidas na técnica. Polipeptídeos NgR1 e frag-mentos de polipeptídeo da invenção podem compreender substituições deaminoácido conservativas ou não-conservativas, anulações ou adições. Ospolipeptídeos NgR1 e fragmentos de polipeptídeo da presente invenção po-dem também incluir moléculas derivadas. Polipeptídeos variantes podemtambém serem referidos aqui como "polipeptídeos análogos". Conforme aquiusado, um "derivado" de um polipeptídeo ou um fragmento de polipeptídeose referem a um polipeptídeo objeto tendo um ou mais resíduos quimica-mente derivatizados pela reação de um grupo lateral funcional. Também in-cluídos como "derivados" estão aqueles peptídeos que contêm um ou maisderivados de aminoácido que ocorrem naturalmente de vinte aminoácidospadrões. Por exemplo, 4-hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxiprolina pode ser substituída por lisina; 3-metilistidina pode ser substi-tuída por histidina; homosserina pode ser substituída por serina; e ornitinapode ser substituída por lisina.

Conforme aqui usado, o termo "ligação de dissulfito" inclui a li-gação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido ciste-ína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação de dissulfito, ouponte com um segundo grupo tiol.

Conforme aqui usado, "proteína de fusão" significa uma proteínacompreendendo um primeiro polipeptídeo linearmente conectado, via liga-ções de peptídeo, a um segundo polipeptídeo. O primeiro polipeptídeo e osegundo polipeptídeo podem ser idênticos Ou diferentes, e eles podem serdiretamente conectados, ou conectados via um Iigante de peptídeo (ver a-baixo).

O termo "polinucleotídeo" é pretendido para envolver um ácidonucléico singular, bem como ácidos nucléicos plurais, e se refere a uma mo-lécula de ácido nucléico isolada ou construção, por exemplo RNA mensagei-ro (mRNA) ou DNA de plasmídeo (pDNA). Um polinucleotídeo pode conter aseqüência de nucleotídeo da seqüência de DNA de comprimento total, inclu-indo as seqüências 5' e 3' não-transladadas, as seqüências de codificação.Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencio-nal, ou uma ligação não-convencional (por exemplo, uma ligação de amida,tal como encontrada em ácidos nucléicos de peptídeo (PNA)). O polinucleo-tídeo pode ser composto de qualquer polirribonucleotídeo ou polideoxirribo-nucleotídeo, que podem ser RNA ou DNA não-modificados, ou RNA ou DNAmodificados. Por exemplo, os polinucleotídeos podem ser compostos deDNA de trançado simples ou duplo, DNA que é uma mistura de regiões detrançado duplo, e RNA de trançado simples e duplo, e RNA que é uma mis-tura de regiões de trançado simples e duplo, moléculas híbridas compreen-dendo DNA e RNA que podem ser de trançado simples ou, mais tipicamen-te, de trançado duplo, ou uma mistura de regiões de trançado simples e du-plo. Conforme aqui usado, em adição, os polinucleotídeos podem ser com-postos de regiões de trançado triplo compreendendo RNA ou DNA ou ambosRNA ou RNA. Os polinucleotídeos podem também conter uma ou mais ba-ses modificadas ou suportes de DNA ou RNA modificados para estabilidade,ou para outras razões. As bases "modificadas" incluem, por exemplo, basestritilatadas e bases não-usuais, tal como inosina. Uma variedade de modifi-cações pode ser feita ao DNA e RNA; desse modo, o "polinucleotídeo" en-volve formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modifica-das.

O termo "ácido nucléico" se refere a qualquer um ou mais seg-mentos de ácido nucléico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, pre-sentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucléico ou polinucleotídeo "isola-do" é pretendido uma molécula de ácido nucléico, DNA ou RNA, que tenhasido removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo re-combinante que codifica um polipeptídeo NgR ou fragmento de polipeptídeoda invenção contidos em um vetor é considerado isolado para a proposta dapresente invenção. Exemplos adicionais de um polinucleotídeo isolado inclu-em polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras hete-rólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente)em solução. Moléculas de RNA isoladas incluem transcrições de RNA in vivoou in vitro de polinucleotídeos da presente invenção. Polinucleotídeos ouácidos nucléicos isolados de acordo com a presente invenção incluem taismoléculas produzidas sinteticamente. Em adição, o polinucleotídeo ou umácido nucléico podem ser ou podem incluir um elemento regulatório, tal co-mo um promotor, um local de ligação de ribossomo, ou um terminador detranscrição.

Conforme aqui usado, uma "região de codificação" é uma porçãode ácido nucléico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Em-bora um "códon de parada" (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em umaminoácido, ele pode ser considerado ser parte de uma região de codifica-ção, mas quaisquer seqüências de flanqueamento, por exemplo, promoto-res, locais de ligação de ribossomoas, terminações transcricionais, introns, esimilares, não são parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiõesde codificação da presente invenção podem estar presentes em uma cons-trução de polinucleotídeo simples, por exemplo, em um vetor simples, ou emconstruções de polinucleotídeo separadas, por exemplo, em vetores separa-dos (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma região de codi-ficação simples, ou pode compreender duas ou mais regiões de codificação,por exemplo, um vetor simples pode codificar separadamente uma regiãovariável de cadeia pesada de imunoglobulina, e uma região variável de ca-deia leve de imunoglobulina. Em adição, um vetor, polinucleotídeo, ou ácidonucléico da invenção podem codificar regiões de codificação heterólogas, oufundidas ou não-fundidas, em um ácido nucléico que codifica um polipeptí-deo NgR ou fragmento de polipeptídeo da presente invenção. Regiões decodificação heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos espe-cializados, tais como um peptídeo de sinal secretório, ou um domínio funcio-nal heterólogo.

Em certas concretizações, o polinucleotídeo ou ácido nucléico éDNA. No caso de DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nu-cléico que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotore/ou outra transcrição, ou elementos de controle de tradução operavelmenteassociados com uma ou mais regiões de codificação. Uma associação ope-rável é quando uma região de codificação para um produto de gene, por e-xemplo, um polipeptídeo, é associada com uma ou mais seqüências regula-tórias de tal modo a colocar a expressão do produto de gene sob a influênciaou controle da(s) seqüência(s) regulatória(s). Dois fragmentos de DNA (taiscomo uma região de codificação de polipeptídeo e um promotor associadocom esta) são "operavelmente associados" se indução de função promotoraresulta na transcrição de mRNA que codifica o produto de gene desejado, ese a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferemcom a capacidade da expressão de seqüências regulatórias para dirigir aexpressão do produto de gene, ou interferem com a capacidade do gabaritode DNA a ser transcrito. Desse modo, uma região promotora seria opera-velmente associada com um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo seo promotor foi capaz de efetuar transcrição daquele ácido nucléico. O pro-motor pode ser um promotor específico de célula que dirige transcriçãosubstancial do DNA somente em células predeterminadas. Outros elementosde controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, intensificado-res, operadores, repressores e sinais de terminação de transcrição, podemser operavelmente associados com o polinucleotídeo para dirigir transcriçãoespecífica de célula. Promotores adequados e outras regiões de controle detranscrição são aqui descritos.

Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conheci-da àquele versado na técnica. Estas incluem, sem limitação, regiões de con-trole de transcrição que funcionam em células de vertebrado, tais como, masnão limitadas a, segmentos de promotor e intensificador de citomegalovírus(o promotor precoce imediato, em conjunto com intron-A), vírus de símio 40(o promotor precoce), e retrovirus (tais como vírus sarcoma Rous). Outrasregiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes devertebrado, tais como actin, proteína de choque de calor, hormônio de cres-cimento bovino e beta-Globulin de coelho, bem como outras seqüências ca-pazes de controlar a expressão de gene em células eucarióticas. Regiões decontrole de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e intensifi-cadores específicos de tecido, bem como promotores induzíveis por Iinfocina(por exemplo, promotores induzíveis por interferons ou interleucinas).

Similarmente, uma variedade de elementos de controle de tra-dução é conhecida àquele versado na técnica. Estes incluem, mas não sãolimitados a, locais de ligação de ribossoma, códons de iniciação e termina-ção de tradução, e elementos derivados de picornavirus (particularmente umlocal de entrada de ribossoma interno, ou IRES, também referidos comouma seqüência de CITE).

Em outras concretizações, um polinucleotídeo da presente in-venção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA).

As regiões de codificação de polinucleotídeo e ácido nucléico dapresente invenção podem estar associadas com regiões de codificação adi-cionais que codificam peptídeos secretários ou de sinal, que dirigem a se-creção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presenteinvenção. De acordo com a hipótese de sinal, proteínas secretadas por célu-las de mamífero têm um peptídeo de sinal, ou seqüência condutora secretá-ria, que é clivada a partir da proteína matura uma vez que a exportação docrescimento da cadeia de proteína através do retículo endoplasmático rugo-so tenha sido iniciada. Aqueles técnicos no assunto estão atentos que ospolipeptídeos secretados por células de vertebrado geralmente têm um pep-tídeo de sinal fundido ao terminal N do polipeptídeo, que é clivado a partir dopolipeptídeo completo ou de "comprimento total" para produzir uma formasecretada ou "matura" a partir do polipeptídeo. Em certas concretizações, opeptídeo de sinal nativo, por exemplo, uma cadeia pesada de imunoglobuli-na ou peptídeo de sinal de cadeia leve, é usado, ou um derivado funcionaldaquela seqüência que retém a capacidade de dirigir a secreção do polipep-tídeo que é operavelmente associado com ele. Alternativamente, um peptí-deo de sinal de mamífero heterólogo, ou um derivado funcional deste, podeser usado. Por exemplo, a seqüência condutora tipo selvagem pode sersubstituída com a seqüência condutora de ativador de plasmogênio de teci-do humano (TPA), ou beta-glucuronidase de camundongo.

Conforme aqui usado, o termo "construído" inclui manipulaçãode ácido nucléico ou moléculas de polipeptídeo por meio sintético (por e-xemplo, por técnicas recombinantes, síntese de peptídeo in vitro, por aco-plamento enzimático ou químico de peptídeos, ou alguma combinação des-tas técnicas).

Conforme aqui usado, os termos "ligados", "fundidos" ou "fusão"são usados intercambeavelmente. Estes termos se referem à união junta dedois ou mais elementos ou componentes, por qualquer meio incluindo conju-gação química ou meio recombinante. Uma "fusão de estrutura interna" serefere à união de duas ou mais estruturas de leitura abertas de polinucleotí-deo (ORFs) para formar uma ORF mais longa contínua, em um número quemantém a estrutura de leitura translacional correta das ORFs originais. Des-se modo, uma proteína de fusão recombinante é uma proteína simples con-tendo dois ou mais segmentos que correspondem aos polipeptídeos codifi-cados pelas ORFs originais (cujos segmentos não são normalmente, dessemodo, unidos na natureza). Embora a estrutura de leitura seja desse modoproduzida contínua através dos segmentos fundidos, os segmentos podemser fisicamente ou espacialmente separados por, por exemplo, seqüência deligante de estrutura interna.

Uma seqüência de "ligante" é uma série de um ou mais aminoá-cidos separando duas regiões que codificam polipeptídeo em uma proteínade fusão. Um ligante típico compreende pelo menos 5 aminoácidos. Ligado-res adicionais compreendem pelo menos 10 ou pelo menos 15 aminoácidos.Em certas concretizações, os aminoácidos de um ligante de peptídeo sãoselecionados de modo que o ligante é hidrofílico. O ligante (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (SEQ ID N0:3) é um ligante preferido que é amplamente aplicável amuitos anticorpos, visto que proporciona flexibilidade suficiente. Outros Iiga-dores incluem Glu Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQID NO:4), Glu Gly Lys Ser Gly Ser Gly ser Glu Ser Lys Ser Thr (SEQ IDNO:5), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln (SEQ IDN0:6), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp (SEQ IDN0:7), Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly (SEQ IDN0:8), Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg PheArg Ser Leu Asp (SEQ ID NO:9), e Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu LeuAla Phe Arg Ser Leu Asp (SEQ ID N0:10). Exemplos de Iigadores mais cur-tos incluem fragmentos dos Iigadores acima, e exemplos de Iigadores maislongos incluem combinações dos Iigadores acima, combinações de fragmen-tos dos Iigadores acima, e combinações dos Iigadores acima com fragmen-tos dos Iigadores acima.

No contexto de polipeptídeos, uma "seqüência linear" ou uma"seqüência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em um aminopara direção terminal de carboxila em que resíduos que se avizinham naseqüência são contíguos na estrutura primária do polipeptídeo.

O termo "expressão", conforme aqui usado, se refere a um pro-cesso pelo qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um RNA oupolipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcionaldo gene dentro da célula, incluindo, sem limitação, gene básico, bem comoambas expressão transiente e expressão estável. Ele inclui, sem limitação,transcrição do gene no RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência(tRNA), RNA de grampo de cabelo pequeno (shRNA), RNA de interferênciapequeno (siRNA), ou qualquer outro produto de RNA1 e a tradução de talmRNA em polipeptídeo(s), bem como quaisquer processos que regulam outranscrição ou translação. Se o produto desejado final é um bioquímico, aexpressão inclui a criação daquele bioquímico e quaisquer precursores. Aexpressão de um gene produz um "produto de gene". Conforme aqui usado,um produto de gene pode ser, ou um ácido nucléico, por exemplo, um RNAmensageiro produzido por transcrição de um gene, ou um polipeptídeo que étraduzido de uma transcrição. Os produtos de gene descritos aqui incluemadicionalmente ácidos nucléicos com modificações pós-transcricionais, porexemplo, poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações pós-translacionais, por exemplo, metilação, glicosilação, a adição de lipídeos,associação com outras subunidades de proteína, clivagem proteolítica, esimilares.

Conforme aqui usado, os termos "tratar" ou "tratamento" se refe-rem a ambos tratamento terapêutico e medições profiláticas ou preventivas,no qual o objetivo é prevenir ou diminuir (reduzir) uma mudança fisiológicaindesejada ou enfermidade, tal como a progressão de esclerose múltipla.Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limita-dos a, alívio de sintomas, diminuição de extensão de doença, estado éstabi-lizado de doença (isto é, não piorando), retardo ou redução de progressãode doença, melhora ou paliação do estado da doença, e remissão (se parcialou total), se detectável ou não-detectável. "Tratamento" pode também signi-ficar prolongamento da sobrevivência conforme comparado a sobrevivênciaesperada se não recebendo tratamento. Aqueles em necessidade de trata-mento incluem aqueles já com a condição ou enfermidade, bem como aque-les propensos a ter a condição ou enfermidade, ou aqueles em que a condi-ção ou enfermidade é para ser prevenida.

Por "indivíduo", ou sujeito, ou "animal", ou "paciente", ou "mamí-fero", é significativo qualquer indivíduo, particularmente um indivíduo mamí-fero, de quem diagnóstico, prognóstico, ou terapia é desejado. Indivíduosmamíferos incluem, mas não estão limitados a, seres humanos, animais do-mésticos, animais de fazenda, animais do zôo, animais de esporte, animaisde estimação, tais como cães, gatos, porquinho-da-índia, coelhos, ratos,camundongos, cavalos, cabras, vacas; primatas, tais como macacos, oran-gotangos e chipanzés; "canids", tais como cães e lobos; felinos, tais comogatos, leões e tigres; eqüinos, tais como cavalos, burros e zebras; animaisfornecedores de alimento, tais como vacas, porcos e carneiro; ungulados,tais como veado e girafas; roedores, tais como camundongos, ratos, hams-ters e porquinho-da-índia; e assim por diante! Em certas concretizações, omamífero é um indivíduo humano.

Conforme aqui usado, frases tais como "um indivíduo que sebeneficiaria da administração de um polipeptídeo NgR ou fragmento de poli-peptídeo da presente invenção" e "um animal em necessidade de tratamen-to" incluem indivíduos, tais como indivíduos mamíferos, que se beneficiariamda administração de um polipeptídeo NgR ou fragmento de polipeptídeo dapresente invenção usados, por exemplo, para detecção (por exemplo, paraum procedimento de diagnóstico) e/ou para tratamento, isto é, paliação ouprevenção de uma doença, tal como MS, com um polipeptídeo NgR oufragmento de polipeptídeo da presente invenção. Conforme descrito emmaiores detalhes, o polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo pode ser u-sado na forma não-conjugada, ou pode ser conjugado, por exemplo, em umfármaco, pró-fármaco, ou um isótopo.

Conforme aqui usado, "quantidade terapeuticamente eficaz" serefere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo ne-cessários, para alcançar o resultado terapêutico desejado. Um resultado te-rapêutico pode ser, por exemplo, diminuição de sintomas, sobrevivência pro-longada, mobilidade aperfeiçoada, e similares. Um resultado terapêutico nãonecessita ser uma "cura".

Conforme aqui usado, uma "quantidade profilaticamente eficaz"se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de temponecessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente,desde que uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou em um es-tágio anterior da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor doque a quantidade terapeuticamente eficaz.A invenção é dirigida a certos polipeptídeos NgR e fragmentosde polipeptídeo que promovem sobrevivência neuronal, desenvolvimento deneurite e regeneração axonal de neurônios, por exemplo, neurônios do SNC.Por exemplo, a presente invenção proporciona polipeptídeos NgR e frag-mentos de polipeptídeo que estimulam crescimento axonal sob condiçõesnas quais crescimento axonal é normalmente inibido. Desse modo, os poli-peptídeos NgR e fragmentos de polipeptídeo da invenção são úteis no tra-tamento de danos, doenças ou enfermidades que podem ser aliviadas pelapromoção de sobrevivência neuronal, ou por estimulação de crescimentoaxonal, ou regeneração no SNC.

Doenças, enfermidades ou danos do SNC exemplares incluem,mas não são limitados a, esclerose múltipla (MS), Ieucoencefalopatia multi-focal progressiva (PML), encefalomielite (EPL), mielolise pontine central(COM), adrenoleucodistrofia, doença de Alexander1 doença de PelizaeusMerzbacher (PMZ), Leucodistrofia de célula Globóide (doença de Krabbe) eDegeneração de Wallerian, neurite ótica, mielite transversa, esclerose lateralamilotrópica (ALS), doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença deParkinson, dano da coluna cervical, dano traumático do cérebro, dano pós-radiação, complicações neurológicas de quimioterapia, acidente vascularcerebral, neuropatia ótica isquêmica aguda, deficiência de vitamina E, sín-drome de deficiência de vitamina E isolada, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, Ieucodistrofia metacromática,neuralgia trigeminal, e paralisia de Bell. Entre estas enfermidades, a esclero-se múltipla (MS) é a mais difundida, afetando aproximadamente 2,5 milhõesno mundo.

Polipeptídeos NgR e Fragmentos de Polipeptídeo

A presente invenção é dirigida a certos polipeptídeos Nogo re-ceptores, incluindo NgR1 e NgR2, e fragmentos de polipeptídeo úteis, porexemplo, para promoção de desenvolvimento de neurite, promoção de so-brevivência neuronal, promoção de sobrevivência axonal, ou inibição detransdução de sinal pelo complexo de sinalização de NgR. Tipicamente, ospolipeptídeos e fragmentos de polipeptídeo da invenção agem para bloquearinibição mediada por NgR de sobrevivência neuronal, desenvolvimento deneurite, ou regeneração axonal de neurônios do sistema nervoso central(SNC).

O polipeptídeo NgR1 humano é mostrado abaixo como SEQ IDNO:2, e tem o número de acesso NP 075380 no Banco de Gene (Genbank).

NgR1 humano de Comprimento Total (SEQ ID NO:2):

<table>table see original document page 22</column></row><table>

O polipeptídeo NgR1 de rato é mostrado abaixo como SEQ IDNO:23, e tem o número de acesso NP 446065 no Banco de Gene (Gen-bank).

NgR1 de Rato de Comprimento Total (SEQ ID NO:23):

Q polipeptídeo NgR2 humano é mostrado abaixo como SEQ IDNO:24, e tem o número de acesso NP 848665 no Banco de Gene (Gen-bank).

NgR2 humano de Comprimento Total (SEQ ID NO:24):

Em uma concretização, a presente invenção proporciona umfragmento de polipeptídeo isolado de 40 resíduos ou menos, onde o frag-mento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica aaminoácidos 309 a 344 de SEQ ID NO:2, exceto para até um, dois, três,quatro, dez, ou vinte substituições de aminoácidos individuais.

Por "uma seqüência de aminoácido de referência NgR1", "umaseqüência de aminoácido de referência NgR2", ou "seqüência de aminoáci-do de referência", é significativo à seqüência especificada sem a introduçãode quaisquer substituições de aminoácido. Conforme um versado na técnicacompreenderia, se não existem substituições, o "polipeptídeo isolado" dainvenção compreende uma seqüência de aminoácido que é idêntica à se-qüência de aminoácido de referência.

Em uma concretização, a presente invenção proporciona umfragmento de polipeptídeo isolado de 40 resíduos ou menos, onde o frag-mento de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica aaminoácidos 309 a 344 de SEQ ID NO:2, exceto para até três substituiçõesde aminoácidos individuais.

Em uma concretização, a presente invenção proporciona umfragmento de polipeptídeo isolado de 40 resíduos ou menos, onde o frag-mento de polipeptídeo compreende, consiste em, ou consiste essencialmen-te de, uma seqüência de aminoácido idêntica a aminoácidos 309 a 344 deSEQ ID NO:2, exceto para até um, dois ou três substituições de aminoáci-dos.

Substituições de aminoácido exemplares de fragmentos de poli-peptídeo de acordo com esta concretização incluem substituições de resí-duos de cisteína individuais nos polipeptídeos da invenção com aminoácidosdiferentes. Os resíduos de cisteína nos polipeptídeos da invenção podem sersubstituídos com qualquer aminoácido heterólogo. Qual aminoácido diferen-te é usado depende de um número de critérios, por exemplo, o efeito dasubstituição da conformação dos fragmentos de polipeptídeo, a carga dofragmento de polipeptídeo, ou a hidrofilicidade do fragmento de polipeptídeo.Substituições de aminoácido para os aminoácidos dos polipeptídeos da in-venção e a seqüência de aminoácido inclui aminoácidos com cadeias late-rais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas(por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polaresnão-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treoni-na, tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina,valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofan), cadeiaslaterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e cadei-as laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina).Aminoácidos típicos para substituir cisteínas no aminoácido de referênciaincluem alanina, serina, treonina, em particular, alanina. A produção de taissubstituições através da engenharia de um polipeptídeo que codifica o frag-mento de polipeptídeo está bem dentro da técnica de rotina de um versadona técnica. Em certas concretizações, a cisteína é substituída com um ami-noácido não-carregado pequeno que é o mínimo similarmente para alterar aconformação tridimensional do polipeptídeo, por exemplo, alanina, serina,treonina. Em certas concretizações, o aminoácido substituído é alanina.

Em outra concretização, a presente invenção proporciona umpolipeptídeo isolado da invenção no qual pelo menos um resíduo de cisteínaé substituído com um aminoácido diferente. Os resíduos de cisteína que po-dem ser substituídos incluem, mas não estão limitados a, C27, C31, C33,C43, C80, C140, C264, C266, C287, C309, C335, C336, C419, C429, C455e C473. A presente invenção proporciona adicionalmente um fragmento depolipeptídeo isolado de 40 resíduos ou menos, onde o fragmento de polipep-tídeo compreende uma seqüência de aminoácido idêntica aos aminoácidos309 a 344 de SEQ ID NO:2, exceto que: C309 é substituído, C355 é substi-tuído, C336 é substituído, C309 e C335 são substituídos, C309 e C336 sãosubstituídos, C335 e C336 são substituídos, ou C309, C335 e C336 sãosubstituídos.

Em um aspecto, a invenção inclui um polipeptídeo compreen-dendo dois ou mais fragmentos de polipeptídeo conforme descrito acima emuma proteína de fusão, bem como proteínas de fusão compreendendo umfragmento de polipeptídeo conforme descrito fundido a uma seqüência deaminoácido heteróloga. A invenção envolve adicionalmente variantes, análo-gos, ou derivados de fragmentos de polipeptídeo conforme descrito acima.Na presente invenção, um polipeptídeo pode ser composto deaminoácidos unidos uns aos outros por ligações de peptídeo, ou ligações depeptídeo modificadas, isto é, isoésteres de peptídeo, e podem conter amino-ácidos outros do que os aminoácidos codificados de 20 genes (por exemplo,aminoácidos que não ocorrem naturalmente). Os polipeptídeos da presenteinvenção podem ser modificados por ou processos naturais, tais como pro-cessamento pós-translacional, ou por técnicas de modificação química quesão bem-conhecidas na técnica. Tais modificações são bem descritas nostextos básicos, e em monografias mais detalhadas, bem como na literaturade pesquisa extensa. As modificações podem ocorrer em qualquer polipeptí-deo, incluindo o suporte de peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e oterminal amino ou carboxila. Será apreciado que o mesmo tipo de modifica-ções pode estar presente no mesmo grau, ou em graus variados em várioslocais em um dado polipeptídeo. Também, um dado polipeptídeo pode con-ter muitos tipos de modificações. Os polipeptídeos podem ser ramificados,por exemplo, como um resultado de ubiquitinação, e eles podem ser cíclicos,com ou sem ramificação. Os polipeptídeos cíclicos, ramificados e ramifica-dos cíclicos podem resultar de processos naturais pós-translacionais, ou po-dem ser produzidos por métodos sintéticos. As modificações incluem aceti-lação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, fixação covalente de flavin, fixa-ção covalente de uma porção heme, fixação covalente de um nucleotídeo ouderivado de núcleotídeo, fixação covalente de um lipídeo ou derivado de lipí-deo, fixação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formaçãode ligação de dissulfito, demetilação, formação de reticulações covalentes,formação de cisteína, formação de piroglutamato, gama-carboxilação, glico-silação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, mi-ristoilação, oxidação, pegilação, processamento proteolítico, fosforilação,prenilação, racemização, selenoilação, sulfação, adição mediada por transfe-rência de RNA de aminoácidos para proteínas tais como arginilação, e ubi-quitinação. (Ver, por exemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties,2nd Ed., T.E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993);Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Aca-demic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et ai, Meth Enzymol 182-626-646 (1990); Rattan et al., Ann N YAcad Sci 663:48-62 (1992)).

Os polipeptídeos aqui descritos podem ser cíclicos. A ciclizaçãodos polipeptídeos reduz a liberdade conformacional de peptídeos lineares, eresulta em uma molécula estruturalmente mais restrita. Muitos métodos deciclização de peptídeo são conhecidos na técnica. Por exemplo, ciclizaçãode "suporte para suporte" pela formação de uma ligação amida entre os re-síduos de aminoácido N-terminal e C-terminal do peptídeo. O método deciclização de "suporte para suporte" inclui a formação de pontes de dissulfitoentre resíduos de aminoácido ω-tio (por exemplo, cisteína, homocisteína).Certos peptídeos da presente invenção incluem modificações nos terminaisN e C do peptídeo para formar um polipeptídeo cíclico. Tais modificaçõesincluem, mas não estão limitadas a, resíduos de cisteína, resíduos de cisteí-na acetilatada, resíduos de cisteína com uma porção de NH2 e biotin. Outrosmétodos de ciclização de peptídeo são descritos em Li & Roller. Curr. Top.Med. Chem. 3:325-341 (2002), que é incorporado por referência aqui em suatotalidade.

Nos métodos da presente invenção, um polipeptídeo NgR1 oufragmento de polipeptídeo da invenção pode ser administrado diretamentecomo um polipeptídeo pré-formado, ou indiretamente através de um vetor deácido nucléico. Em algumas concretizações da invenção, um polipeptídeoNgR1 ou fragmento de polipeptídeo da invenção é administrado em um mé-todo de tratamento que inclui: (1) transformação ou transfecção de uma célu-la hospedeira implantável com um ácido nucléico, por exemplo, um vetor,que expressa um polipeptídeo NgR1 ou fragmento de polipeptídeo da inven-ção; e (2) implantação da célula hospedeira transformada em um mamífero,no lugar de uma doença, enfermidade ou dano. Por exemplo, a célula hos-pedeira transformada pode ser implantada no lugar de uma lesão crônica deMS. Em algumas concretizações da invenção, a célula hospedeira implantá-vel é removida de um mamífero, cultivada temporariamente, transformada outransfectada com um ácido nucléico isolado que codifica um polipeptídeoNgR1 ou fragmento de polipeptídeo da invenção, e implantada de volta nomesmo mamífero do qual ela foi removida. A célula pode ser, mas não é re-querido que seja, removida do mesmo lugar no qual ela é implantada. Taisconcretizações, às vezes conhecidas com terapia de gene ex vivo, podemproporcionar um suprimento contínuo do polipeptídeo NgR1 ou fragmento depolipeptídeo da invenção, localizado no local de ação, por um período limita-do de tempo.

Exemplos adicionais de polipeptídeos NgR1 da invenção e mé-todos e materiais para obtenção destas moléculas para praticar a presenteinvenção são descritos abaixo.

Proteínas de Fusão e Polipeptídeos Conjugados

Algumas concretizações da invenção envolvem o uso de um po-lipeptídeo NgR1 que não é uma proteína NgR de comprimento total, por e-xemplo, fragmentos de polipeptídeo de NgR, fundidos a uma porção de poli-peptídeo heterólogo para formar uma proteína de fusão. Tais proteínas defusão podem ser usadas para alcançar vários objetivos, por exemplo, meia-vida de soro aumentada, biodisponibilidade aperfeiçoada, alvejamento invivo para um órgão específico ou tipo de tecido, eficiência de expressão re-combinante aperfeiçoada, secreção de célula hospedeira aperfeiçoada, faci-lidade de purificação, e avidez mais alta. Dependendo do(s) objetivo(s) aser(em) alcançado(s), a porção heteróloga pode ser inerte ou biologicamenteativa. Também, pode ser escolhida ser estavelmente fundida à porção depolipeptídeo NgR da invenção, ou ser clivável, in vitro ou in vivo. Porçõesheterólogas para alcançar estes outros objetivos são conhecidas na técnica.

Como uma alternativa à expressão de uma proteína de fusão,uma porção heteróloga escolhida pode ser pré-formada e quimicamente con-jugada à porção de polipeptídeo NgR da invenção. Em muitos casos, umaporção heteróloga escolhida funcionará similarmente, se fundida ou conju-gada à porção de polipeptídeo NgR. Portanto, na discussão que se seguedas seqüências de aminoácido heterólogas, a menos que de outro modonotado, é para ser compreendido que a seqüência heteróloga pode ser unidaà porção de polipeptídeo NgR na forma de uma proteína de fusão, ou comoum conjugado químico.Polipeptídeos farmacologicamente ativos, tais como polipeptí-deos NgR, podem exibir rápida folga in vivo, necessitando de grandes dosespara alcançar concentrações terapeuticamente eficazes no corpo. Em adi-ção, polipeptídeos menores do que cerca de 60 kDa suportam potencialmen-te filtração glomerular, que às vezes conduz a nefrotoxicidade. A fusão ouconjugação de polipeptídeos relativamente pequenos, tais como fragmentosde polipeptídeo de domínio de sinalização de NgR, pode ser empregada pa-ra reduzir ou evitar o risco de tal nefrotoxicidade. Várias seqüências de ami-noácido heterólogas, isto é, porções de polipeptídeo ou "veículos" para au-mentar a estabilidade in vivo, isto é, meia-vida de soro, de polipeptídeos te-rapêuticos são conhecidos. Exemplos incluem albuminas de soro, tais como,por exemplo, albumina de soro bovino (BSA), ou albumina de soro humano(HSA).

Devido a sua longa meia-vida, distribuição in vivo ampla, e faltade função enzimática ou imunológica, albumina de soro humano essencial-mente de comprimento total (HSA), ou um fragmento de HSA, é comumenteusado como uma porção heteróloga. Através da aplicação de métodos e ma-teriais, tais como aqueles ensinados em Yeh et ai, Proc. Natl. Acad. Sei.USA. 89:1904-08 (1992) e Syed et ai, Blood 89:3243-52 (1997), HSA podeser usado para formar uma proteína de fusão ou conjugado de polipeptídeoque revela atividade farmacológica em virtude da porção de polipeptídeoNgR, enquanto revela estabilidade in vivo significantemente aumentada, porexemplo, 10 vezes a 100 vezes mais alta. O terminal C do HSA pode serfundido ao terminal N da porção de polipeptídeo NgR. Desde que o HSA se-ja uma proteína naturalmente secretada, a seqüência de sinal de HSA podeser explorada para obter secreção da proteína de fusão no meio de culturade célula quando a proteína de fusão é produzida em um eucariótico, porexemplo, mamífero, sistema de expressão.

Em certas concretizações, os polipeptídeos NgR para uso nosmétodos da presente invenção compreendem adicionalmente uma porção-alvo. As porções-alvos incluem uma proteína ou um peptídeo que direcionalocalização a uma certa parte do corpo, por exemplo, ao cérebro ou compar-timentos. Em certas concretizações, polipeptídeos NgR para uso nos méto-dos da presente invenção são fixados ou fundidos a uma porção de alvejar océrebro. As porções de aljevamento de cérebro são fixadas covalentemente(por exemplo, fusão translacional direta, ou por ligação química ou direta-mente ou através de uma molécula espaçadora, que pode opcionalmenteser clivável), ou não-covalentemente fixada (por exemplo, através de intera-ções reversíveis, tais como avidin:biotin, proteína A:lgG, etc). Em outrasconcretizações, os polipeptídeos NgR para uso nos métodos da presenteinvenção são fixados a uma ou mais porções de alvejamento de cérebro. Emconcretizações adicionais, a porção de alvejamento de cérebro é fixada auma pluralidade de polipeptídeos NgR para uso nos métodos da presenteinvenção.

Uma porção de alvejamento de cérebro associada com um poli-peptídeo NgR aumenta a distribuição de cérebro de tal polipeptídeo NgR.Um número de polipeptídeos foi descrito que, quando fundidos a uma prote-ína ou agente terapêutico, distribui a proteína ou agente terapêutico atravésda barreira sangue-cérebro (BBB). Exemplos não-limitativos incluem o anti-corpo de domínio simples FC5 (Abulrob et al. (2005) J. Neurochem. 95,1201-1214); mAB 83-14, um anticorpo monoclonal ao receptor de insulinahumana (Pardridgen et al. (1995) Pharmacol. Res. 12, 807-816); a ligaçãode peptídeos B2, B6 e B8 ao receptor de transferin humano (hTfR) (Xia et al.(2000) J. ViroL 74, 11359-11366); o anticorpo monoclonal 0X26 ao receptorde transferin (Pardridge et al (1991) J. Pharmacol. Exp. Ther. 259, 66-70);conjugados de toxina de dipteria (ver, por exemplo, Gaillard et al., Internatio-nal Congress Series 1277:185-198 (2005); e SEQ ID Nos:1-18 da Patentedos Estados Unidos N0 6.306.365. Os conteúdos das referências acima sãoincorporados aqui por referência em sua totalidade.

A distribuição de cérebro aumentada de uma composição deNgR é determinada por um número de meios bem estabelecidos na técnica.Por exemplo, a administração a um animal de um polipeptídeo NgR radioati-vamente etiquetado ligado a uma porção de alvejamento de cérebro; deter-minação da localização do cérebro; e comparação da localização com umpolipeptídeo NgR radioativamente etiquetado equivalente que não é associ-ado com a porção de alvejamento de cérebro. Outros meios de determinaralvejamento aumentado são descritos nas referências acima.

Algumas concretizações da invenção empregam uma porção depolipeptídeo NgR fundida a uma articulação e região Fc, isto é, a porção determinal C de uma região constante de cadeia pesada lg. Em algumas con-cretizações, aminoácidos na região de articulação podem ser substituídoscom aminoácidos diferentes. Substituições de aminoácidos exemplares paraa região de articulação de acordo com estas concretizações incluem substi-tuições de resíduos de cisteína individuais na região de articulação com a-minoácidos diferentes. Qualquer aminoácido diferente pode ser substituídopor uma cisteína na região de articulação. As substituições de aminoácidopara os aminoácidos dos polipeptídeos da invenção e a seqüência de ami-noácido de referência pode incluir aminoácidos com cadeias laterais básicas(por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exem-pio, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina,tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina,leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofan), cadeias lateraisbeta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e cadeias late-rais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina). Ami-noácidos típicos para substituir cisteínas no aminoácido de referência inclu-em alanina, serina, treonina, em particular, serina e alanina. A produção de taissubstituições através da engenharia de um polinucleotídeo codificando o frag-mento de polipeptídeo está bem dentro da técnica de rotina de um versadona técnica.

Vantagens potenciais de um polipeptídeo NgR-fusão Fc incluemsolubilidade, estabilidade in vivo, e multivalência, por exemplo, dimerização.A região Fc usada pode ser uma região Fc IgA, IgD ou IgG (articulação-CH2-CH3). Alternativamente, ela pode ser uma região Fc IgE ou IgM (articulação-CH2-CH3-CH4). Uma região Fc IgG é geralmente usada, por exemplo, umaregião Fc IgGI, ou região Fc lgG4. Os materiais e métodos para construir eexpressar DNA codificando fusões Fc são conhecidos na técnica, e podemser aplicados para obter fusões sem experimentação indevida. Algumasconcretizações da invenção empregam uma proteína de fusão, tal como a -quela descrita em Capo et ai, Patente dos Estados Unidos N-s 5.428.130 e5.565.335.

A seqüência de sinal é um polinucleotídeo que codifica uma se-qüência de aminoácido que inicia transporte de uma proteína através damembrana do retículo endoplasmático. As seqüências de sinal úteis paraconstruir uma imunofusin incluem seqüências de sinal de cadeia leve de an-ticorpo, por exemplo, anticorpo 14.18 (Gillies et al., J. Immunol. Meth..125:191-202 (1989)), seqüências de sinal de cadeia pesada de anticorpo,por exemplo, a seqüência de sinal de cadeia pesada de anticorpo MOPC141(Sakano et al., Nature 286:5774 (1980)). Alternativamente, outras seqüên-cias de sinal podem ser usadas. Ver, por exemplo, Watson, Nucl. Acids Res.12:5145 (1984). O peptídeo de sinal é usualmente clivado no lúmen do retí-culo endoplasmático por peptidases de sinal. Isto resulta na secreção deuma proteína imunofusin contendo a região Fc e a porção de polipeptídeoNgR.

Em algumas concretizações, a seqüência de DNA pode codificarum local de clivagem proteolítica entre o cassete de secreção e a porção depolipeptídeo NgR. Tal local de clivagem pode proporcionar, por exemplo,clivagem proteolítica da proteína de fusão codificada, separando, desse mo-do, o domínio de Fc da proteína-alvo. Locais de clivagem proteolítica úteisincluem seqüências de aminoácido reconhecidas por enzimas proteolíticas,tais como tripsin, plasmin, trombin, fator Xá, enterokinase K.

O cassete de secreção pode ser incorporado em um vetor deexpressão replicável. Vetores úteis incluem ácidos nucléicos lineares, plas-mídeos, fagemídeos, cosmídeos e similares. Um vetor de expressão exem-plar é pdC, no qual a transcrição da imunofusin DNA é colocada sob o con-trole do intensificador e promotor do citomegalovírus humano. Ver, por e-xemplo, Lo et ai, Biochim. Biophvs. Acts 1088:712 (1991); e Lo et ai, Prote-in Enqineering 11:495-500 (1998). Uma célula hospedeira apropriada podeser transformada ou transfectada com um DNA que codifica o polipeptídeoNgR1 ou fragmento de polipeptídeo da invenção, e usada para a expressãoe secreção do polipeptídeo. As células hospedeiras que são tipicamente u-sadas incluem células de hibridoma imortais, células de mieloma, células293, células de ovário de hamster chinês (CHO), células Hela, e célulasCOS.

As funções de efeito de revelação de regiões Fc tipo selvagenstotalmente intactas que normalmente são desnecessárias e indesejadas emuma proteína de fusão Fc usadas nos métodos da presente invenção. Por-tanto, certos locais de ligação tipicamente são anulados da região Fc duran-te a construção do cassete de secreção. Por exemplo, desde que co-expressão com a cadeia leve é desnecessária, o local de ligação para a pro-teína de ligação de cadeia pesada, Bip (Hendershot et aí., Immunol. Todav8:111-14 (1987)), é anulado do domínio CH2 da região Fc de IgE, tal queeste local não interfere com a secreção eficiente da imunofusin. As seqüên-cias de domínio de transmembrana, tais como aquelas presentes em IgM,também são geralmente anuladas.

A região IgGI Fc é mais freqüentemente usada. Alternativamen-te, a região Fc da outra subclasse de gama imunoglobulina (gama-2, gama-3e gama-4) pode ser usada no cassete de secreção. A região IgGI Fc degama-imunoglobulina-1 é geralmente usada no cassete de secreção, e incluipelo menos parte da região de articulação, a região CH2, e a região CH3.Em algumas concretizações, a região Fc de gama imunoglobulina-1 é umaFc anulada de CH2, que inclui parte da região de articulação e a região CH3.mas não a região CH2. Uma Fc anulada de CH2 foi descrita por Gillies et al.,Hum. Antibod. Hvbridomas 1:47 (1990). Em algumas concretizações, a regi-ão Fc de um de IgA, IgD, IgE ou IgM é usada.

As proteínas de fusão de Fc de porção de polipeptídeo NgR po-dem ser construídas em várias con figura ções diferentes. Em uma con figu-ra ção, o terminal C da porção de polipeptídeo NgR é fundido diretamente aoterminal N da porção de articulação Fe. Em uma con figura ção levementediferente, um polipeptídeo curto, por exemplo, 2-10 aminoácidos, é incorpo-rado na fusão entre o terminal N da porção de polipeptídeo NgR e o terminalC da porção Fe. Na con figura ção alternativa, o polipeptídeo curto é incorpo-rado na fusão entre o terminal C da porção de polipeptídeo NgR e o terminalN da porção Fe. Tal articulador proporciona flexibilidade conformacional, quepode aperfeiçoar atividade biológica em algumas circunstâncias. Se umaporção suficiente da região de articulação é retida na porção Fc, a fusão Fcde porção de polipeptídeo NgR dimerizará, formando, desse modo, uma mo-lécula divalente. Uma população homogênea de fusões Fc monoméricasproduzirá dímeros bivalentes mono-específicos. Uma mistura de duas fusõesFc monoméricas cada tendo uma especificidade diferente produzirá dímerosbivalentes bi-específicos.

Qualquer de um número de reticuladores que contêm um grupoamino-reativo correspondente e grupo tiol-reativo podem ser usados paraligar um polipeptídeo NgR ou fragmento de polipeptídeo da invenção em al-bumina de soro. Exemplos de Iigadores adequados incluem articuladoresamino- reativos que inserem uma maleimida tiol-reativa, por exemplo,SMCC, AMAS, BMPS1 MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS e GMBS. Outrosligadores adequados inserem um grupo haloacetato tiol-reativo, por exem-plo, SBAP, SAI, SIAB. Os Iigadores que proporcionam um tiol protegido ounão-protegido para reação com grupos sulfidril para produzir uma ligaçãoreduzível incluem SPDT, SMPT, SATA e SATP. Tais reagentes são comercial-mente disponíveis (por exemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, IL).

A conjugação não tem que envolver o terminal N de um polipep-tídeo NgR ou fragmento de polipeptídeo da invenção, ou a porção de tiol naalbumina de soro. Por exemplo, as fusões de polipeptídeo NgR-albuminapodem ser obtidas usando-se técnicas de engenharia genética, no qual aporção de polipeptídeo NgR é fundida ao gene se albumina de soro em seuterminal N, terminal C, ou em ambos.

Os polipeptídeos NgR da invenção podem ser fundidos a umaetiqueta de polipeptídeo. O termo "etiqueta de polipeptídeo", conforme aquiusado, é pretendido para significar qualquer seqüência de aminoácidos quepode ser fixada a, conectada a, ou ligada a um polipeptídeo NgR, e que po-de ser usada para identificar, purificar, concentrar ou isolar o polipeptídeoNgR. A fixação da etiqueta de polipeptídeo ao polipeptídeo NgR pode ocor-rer, por exemplo, pela construção de uma molécula de ácido nucléico quecompreende: (a) uma seqüência de ácido nucléico que codifica a etiqueta depolipeptídeo, e (b) uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipep-tídeo NgR. Etiquetas de polipeptídeo exemplares incluem, por exemplo, se-qüências de aminoácido que são capazes de serem pós-translacionalmentemodificadas, por exemplo, seqüências de aminoácido que são biotinilatadas.Outras etiquetas de polipeptídeo exemplares incluem, por exemplo, seqüên-cias de aminoácido que são capazes de serem reconhecidas e/ou ligadaspor um anticorpo (ou fragmento deste), ou outro reagente de ligação especí-fico. As etiquetas de polipeptídeo que são capazes de serem reconhecidaspor um anticorpo (ou fragmento deste), ou outro reagente de ligação especí-fico incluem, por exemplo, aqueles que são conhecidos na técnica como "e-tiquetas epítopes". Uma etiqueta epítope pode ser uma etiqueta epítope na-tural ou artificial. Etiquetas epítope natural ou artificial são conhecidas natécnica, incluindo, por exemplo, epítopes artificiais, tais como peptídeosFLAG, Strep, ou de poliistidina. Os peptídeos FLAG incluem a seqüênciaAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID N0:11), ou Asp-Tyr-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO:12) (Einhauer, A. and Jungbauer, A., J. Bio-chem. Biophys. Methods 49:1-3:455-465 (2001)). O epítope Strep tem a se-qüência Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID ΝΟ.Ί3). O epítopeVSV-G pode também ser usado, e tem a seqüência Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys (SEQ ID NO 14). Outro epítope artificial é uma se-qüência poli-His tendo seis resíduos de histidina (His-His-His-His-His (SEQID NO:15). Epítopes que ocorrem naturalmente incluem a seqüência de he-maglutinin (HA) do vírus da gripe Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg (SEQ ID NO: 16) reconhecida pelo anticorpo monoclonal 12CA5(Murray et ai, Anal. Biochem. 229:170-179 (1995)), e a seqüência de onzeaminoácidos de c-myc humano (Myc) reconhecida pelo anticorpo monoclo-nal 9E10 (Glu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn (SEQ ID NO: 17)(Manstein et a!., Gene 162:129-134 (1995)). Outro epítope útil é o tripeptídeoGlu-Glu-Phe que é reconhecido pelo anticorpo monoclonal YL 1/2. (Stam-mers etal., FEBS Lett. 283-298-302(1991)).

Em certas concretizações, o polipeptídeo NgR e a etiqueta depolipeptídeo podem ser conectados via uma seqüência de aminoácido deligação. Conforme aqui usado, uma "seqüência de aminoácido de ligação"pode ser uma seqüência de aminoácido que é capaz de ser reconhecidae/ou clivada por uma ou mais proteases. As seqüências de aminoácido quepodem ser reconhecidas e/ou clivadas por uma ou mais proteases são co-nhecidas na técnica. Seqüências de aminoácido exemplares são aquelasque são reconhecidas pelas seguintes proteases: fator Vila, fator IXa, fatorXa, APC, t-PA, u-PA, tripsin, quimotripsin, enterokinase, pepsin, catepsin B,H, L, S, D, catepsin G, renin, enzima de conversão de angiotensin, matrizmetaloproteases (colagenases, estromelisins, gelatinases), macrófago elas-tase, Cir e Cis. As seqüências de aminoácido que são reconhecidas pelasproteases antes mencionadas são conhecidas na técnica. Seqüências e-xemplares reconhecidas por certas proteases podem ser encontradas, porexemplo, na Patente dos Estados Unidos N9 5.811,252.

As etiquetas de polipeptídeo podem facilitar a purificação usan-do-se meio de cromatografia comercialmente disponível.

Em algumas concretizações da invenção, a construção de fusãode polipeptídeo NgR é usada para aumentar a produção de uma porção depolipeptídeo NgR na bactéria. Em tais construções, uma proteína bacterialnormalmente expressa e/ou secretada em um alto nível é empregada comoo co-participante de fusão de terminal N de um peptídeo NgR, ou fragmentode polipeptídeo da invenção. Ver, por exemplo., Smith et ai, Gene 67:31(1988); Hopp etal., Biotechnoloqy 6:1204 (1988); La Vallie etal., Biotechno-logy 11:187 (1993).

Pela fusão de uma porção de polipeptídeo NgR no terminal ami-no e carbóxi de um co-participante de fusão adequado, formas bivalente outetravalente de um polipeptídeo NgR ou fragmento de polipeptídeo da inven-ção podem ser obtidas. Por exemplo, uma porção de polipeptídeo NgR podeser fundida ao terminal amino e carbóxi de uma porção Ig para produzir umpolipeptídeo monomérico bivalente contendo duas porções de polipeptídeoNgR. Após dimerização de dois destes monômeros, em virtude da porção Ig,uma forma tetravalente de um polipeptídeo NgR é obtida. Tais formas multi-valentes podem ser usadas para alcançar afinidade de ligação aumentadapara o alvo. Formas multivalentes de um polipeptídeo NgR ou fragmento depolipeptídeo da invenção também podem ser obtidas pela colocação de por-ções de polipeptídeo NgR em tandem para formar concatâmeros, que po-dem ser empregados sozinhos ou fundidos a um co-participante de fusão, talcomo Ig ou HSA.

Polímeros Conjugados (outros que polipeptídeos)

Algumas concretizações da invenção envolvem um polipeptídeoNgR ou fragmento de polipeptídeo da invenção no qual um ou mais políme-ros são conjugados (covalentemente ligados) ao polipeptídeo NgR. Exem-plos de polímeros adequados para tal conjugação incluem polipeptídeos(discutidos acima), polímeros de açúcar, e cadeias de polialquileno glicol.Tipicamente, mas não necessariamente, um polímero é conjugado ao poli-peptídeo NgR1 ou fragmento de polipeptídeo da invenção para a propostade aperfeiçoar um ou mais dos seguintes: solubilidade, estabilidade, ou bio-disponibilidade.

A classe de polímero geralmente usada para conjugação a umpolipeptídeo NgR1 ou fragmento de polipeptídeo da invenção é um polialqui-leno glicol. O polialquileno glicol (PEG) é mais freqüentemente usado. Por-ções de PEG, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 polímeros de PEG, podem serconjugadas a cada polipeptídeo NgR para aumentar meia-vida do soro, con-forme comparado ao polipeptídeo NgR sozinho. Porções de PEG são não-antigênicas e essencialmente biologicamente inertes. As porções de PEGusadas na prática da invenção podem ser ramificadas ou não-ramifiçadas.

O número de porções de PEG fixadas ao polipeptídeo NgR e opeso molecular das cadeias de PEG individuais podem variar. Em geral,quanto mais alto o peso do polímero, menos cadeias de polímero fixadas aopolipeptídeo. Usualmente, a massa de polímero total fixada a um polipeptí-deo NgR ou fragmento de polipeptídeo é de 20 kDa a 40 kDa. Desse modo,se uma cadeia de polímero é fixada, o peso molecular da cadeia é geralmen-te 20-40 kDa. Se duas cadeias são fixadas, o peso molecular de cada cadeiaé geralmente 10-20 kDa. Se três cadeias são fixadas, o peso molecular égeralmente 7-14 kDa.

O polímero, por exemplo, PEG, pode estar ligado ao polipeptí-deo NgR através de qualquer grupo reativo exposto adequado no polipeptí-deo. O(s) grupo(s) reativo(s) exposto(s) pode(m) ser, por exemplo, um grupoamino N-terminal, ou grupo amino epsilon de um resíduo de Iisina interno, ouambos. Um polímero ativado pode reagir e se ligar covalentemente em qual-quer grupo de aminoácido livre no polipeptídeo NgR. Grupos carboxílicoslivres, grupos carbonila adequadamente ativados, grupos hidroxila, guanidila,imidazole, porções de carboidrato oxidadas, e grupos mercapto do polipeptí-deo NgR (se disponível) podem também serem usados como grupos reati-vos para fixação de polímero.

Em uma reação de conjugação, a partir de cerca de 1,0 a cercade 10 moles de polímero ativado por mol de polipeptídeo, dependendo daconcentração de polipeptídeo, é tipicamente empregado. Usualmente, a ra-zão escolhida representa um equilíbrio entre maximização da reação, en-quanto minimizam as reações laterais (freqüentemente não-específicas) quepodem conceder a atividade farmacológica da porção de polipeptídeo NgR.Preferivelmente, pelo menos 50% da atividade biológica (conforme demons-trado, por exemplo, em qualquer dos ensaios aqui descritos ou conhecidosna técnica) do polipeptídeo NgR é retida, e mais preferivelmente perto de100% é retida.

O polímero pode ser conjugado ao polipeptídeo NgR usando-sequímica convencional. Por exemplo, uma porção de polialquileno glicol podeser acoplada a um grupo Iisina epsilon amino do polipeptídeo NgR. A ligaçãoà cadeia lateral de Iisina pode ser realizada com um éster ativo N-hidroxilsucinimida (NHS), tal como PEG succinimidil succinato (SS-PEG) esuccinimidil propionato (SPA-PEG). Porções de polialquileno glicol adequa-das incluem, por exemplo, carboximetil-NHS e norleucina-NHS, SC. Estesreagentes são comercialmente disponíveis. Ligadores de PEG amina-reativos adicionais podem ser substituídos pela porção succinimidila. Estesincluem, por exemplo, isotiocianatos, nitrofenilcarbonatos (PNP), epóxidos,benzotriazol carbonatos, SC-PEG, tresilato, aldeído, epoxidocarbonilimidazole PNP carbonato. As condições são usualmente otimizadas para maximizara seletividade e extensão da reação. Tal otimização de condições de reaçãoestá dentro do perito na técnica.

PEGilação pode ser efetuada por qualquer da reação de PEGi-lação conhecida na técnica. Ver, por exemplo, Focus on Growth Factors13:4-10, 1992, e pedidos de patente Europeus EP O 154 316 e EP O 401 384.PEGilação pode ser efetuada usando-se uma reação de acilação, ou umareação de alquilação com uma molécula de polietileno glicol reativa (ou umpolímero solúvel em água reativo análogo).

PEGilação por acilação geralmente envolve reação de um derivadode éster ativo de polietileno glicol. Qualquer molécula de PEG reativa pode serempregada na PEGilação. O PEG esterificado a N-hidroxissuccinimida (NHS) éum éster de PEG ativado freqüentemente usado. Conforme aqui usado, "aci-lação" inclui, sem limitação, os seguintes tipos de ligações entre a proteínaterapêutica e um polímero solúvel em água, tal como PEG: amida, carbama-to, uretano, e similares. Ver, por exemplo, Bioconiuqate Chem. 5:133-140,1994. Os parâmetros de reação são geralmente selecionados para evitarcondições de temperatura, solvente e pH que danificariam ou inativariam opolipeptídeo NgR.

Geralmente, a ligação de conexão é uma amida e tipicamentepelo menos 95% do produto resultante é mono-, di- ou triPEGilatado. Contu-do, algumas espécies com graus mais altos de PEGilação podem ser forma-das em quantidades dependendo das condições de reação específicas usa-das. Opcionalmente, espécies PEGiIatadas purificadas são separadas a par-tir da mistura de espécies particularmente não-reagidas, por métodos de pu-rificação convencionais, incluindo, por exemplo, cromatografia, cromatografiade troca hidrofóbica, e eletroforese.

PEGilação por alquilação envolve geralmente reação de um de-rivado de aldeído terminal de PEG com um polipeptídeo NgR ou fragmentode polipeptídeo da invenção na presença de um agente de redução. Em adi-ção, pode-se manipular as condições de reação para favorecer PEGilaçãosubstancialmente somente no grupo amino N-terminal do polipeptídeo NgR1isto é, uma proteína monoPEGilatada. Em qualquer caso de monoPEGilaçãoou poli-PEGilação, os grupos PEG são tipicamente fixados à proteína via umgrupo -CH2-NH. Com referência particular ao grupo -CH2-, este tipo de liga-ção é conhecido como uma ligação "alquila".

Derivatização, via alquilação redutiva para produzir um produtomonoPEGilatado N-terminalmente alvejado explora reatividade diferencial detipos diferentes de grupos amino primários (lisina versus a N-terminal) dis-ponível para derivatização. A reação é realizada a um pH que permite quese leve vantagem das diferenças de pKa entre os grupos epislon-amino dosresíduos de lisina, e aquele do grupo N-terminal amino da proteína. Por talderivatização seletiva, fixação de um polímero solúvel em água que contémum grupo reativo, tal como um aldeído, a uma proteína, é controlada: a con-jugação com o polímero ocorre predominantemente no terminal-N da proteí-na, e nenhuma modificação significante de outros grupos reativos, tal comoos grupos amino de cadeia lateral de lisina, ocorre.

As moléculas de polímero usadas em ambas aproximações deacilação e alquilação são selecionadas entre polímeros solúveis em água. Opolímero selecionado é tipicamente modificado para ter um grupo reativosimples, tal como um éster ativo para acilação, ou um aldeído para alquila-ção, de modo que o grau de polimerização pode ser controlado conformeprovido nos métodos presentes. Um aldeído de PEG reativo exemplar é po-lietileno glicol propionaldeído, que é estável em água, ou mono Ci - Ci0 al-cóxi ou derivados alcóxi deste (ver, por exemplo, Harris et al., Patente dosEstados Unidos Ns 5.252.714). O polímero pode ser ramificado ou não-ramificado. Para a reação de acilação, o(s) polímero(s) selecionado(s) tipi-camente tem(têm) um grupo éster reativo simples. Para alquilação redutiva,o(s) polímero(s) selecionado(s) tipicamente tem um grupo aldeído reativosimples. Geralmente o polímero solúvel em água não será selecionado apartir de resíduos glicosila que ocorrem naturalmente, porque estes são u-sualmente feitos mais convenientemente por sistemas de expressão recom-binante de mamífero.

Métodos para preparação de polipeptídeos NgR PEGiIatados dainvenção geralmente incluem as etapas de (a) reação de um polipeptídeoNgR ou fragmento de polipeptídeo da invenção com polietileno glicol (talcomo um éster reativo, ou derivado de aldeído de PEG) sob condições pelasquais a molécula torna-se fixada a um ou mais grupos PEG1 e (b) obtençãodo(s) produto(s) de reação. Em geral, as condições de reação ótimas paraas reações de acilação serão determinadas caso a caso baseado nos parâ-metros conhecidos e no resultado desejado. Por exemplo, uma maior razãode PEG para proteína, geralmente conduz a uma maior percentagem deproduto poli-PEGilatado.

A alquilação redutiva para produzir uma população substancial-mente homogênea de mono-polímero/polipeptídeo NgR geralmente inclui asetapas de: (a) reação de um polipeptídeo NgR ou fragmento de polipeptídeoda invenção com uma molécula de PEG reativo sob condições de acilaçãoredutiva, em um pH adequado para permitir modificação seletiva do grupoamino N-terminal de NgR; e (b) obtenção do(s) produto(s) de reação.

Para uma população substancialmente homogênea de mono-polímero/polipeptídeo NgR, as condições de reação de alquilação redutivasão aquelas que permitem a fixação seletiva da porção de polímero solúvelem água ao N-terminal de um polipeptídeo NgR ou fragmento de polipeptí-deo da invenção. Tais condições de reação geralmente proporcionam dife-renças de pKa entre os grupos amino de cadeia lateral de Iisina e o grupoamino N-terminal. Para proposta da presente invenção, o pH é geralmentena faixa de 3-9, tipicamente 3-6.

Os polipeptídeos NgR da invenção incluem uma etiqueta, porexemplo, uma porção que pode ser subseqüentemente liberada pof proteóli-se. Desse modo, a porção de Iisina pode ser seletivamente modificada pri-meiro pela reação de uma etiqueta His modificada com um Iigante de pesomolecular baixo, tal como reagente de Traut (Pierce Chemical Company,Rockford, IL), que reagirá com ambos a Iisina e N-terminal, e, em seguida,liberando a etiqueta His. O polipeptídeo em seguida conterá um grupo SHlivre que pode ser seletivamente modificado com um PEG contendo um gru-po principal tiol-reativo, tal como um grupo maleimida, um grupo vinilsulfona,um grupo haloacetato, ou um grupo SH livre ou protegido.

O reagente de Traut pode ser substituído com qualquer Iiganteque comporá um local específico para fixação de PEG. Por exemplo, o reagen-te de Traut pode ser substituído com SPDP, SMTP, SATA, ou SATP (PierceChemical Company, Rockford, IL). Similarmente, pode-se reagir à proteínacom um Iigante de amina reativa que insere uma maleimida (por exemplo,SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH1 KMUS, ou GMBS), umgrupo haloacetato (SBAP, SAI, SIAB), ou um grupo vinilsulfona, e reagir oproduto resultante com um PEG que contém um SH livre.

Em algumas concretizações, a porção de polietileno glicol é a-coplada a um grupo de cisteína do polipeptídeo NgR. O acoplamento podeser efetuado usando-se, por exemplo, um grupo maleimida, um grupo vinil-sulfona, um grupo haloacetato, ou um grupo tiol.

Opcionalmente, o polipeptídeo NgR é conjugado à porção depolietileno glicol através de uma ligação instável. A ligação instável pode serclivada em, por exemplo, hidrólise bioquímica, proteólise, ou clivagèm sulfi-drila. Por exemplo, a ligação pode ser clivada sob condições in vivo (fisioló-gicas).

As reações podem ocorrer por qualquer método usado para rea-gir biologicamente materiais ativos com polímeros inertes, geralmente a cer-ca de pH 5-8, por exemplo, pH 5, 6, 7 ou 8, se os grupos reativos estão nogrupo alfa amino no terminal N. Geralmente o processo envolve um polímeroativado e, em seguida, reação da proteína com o polímero ativado para pro-duzir a proteína solúvel adequada para formulação.

Os polipeptídeos NgR da invenção, em certas concretizações,são polipeptídeos solúveis. Métodos de produção de um polipeptídeo solú-vel, ou aperfeiçoamento da solubilidade de um polipeptídeo, são bem-conhecidos na técnica.Polinucleotídeos

A presente invenção também inclui polinucleotídeos isoladosque codificam qualquer um dos polipeptídeos NgR da presente invenção. Ainvenção também inclui polinucleotídeos que hidridizam sob condições mo-deradamente estringentes, ou de alta estrigência, a cepa de não-codificação,ou complemento, de um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos poli-peptídeos da invenção. As condições estringentes são conhecidas àquelestécnicos no assunto, e podem ser encontradas em CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

O polinucleotídeo Nogo-receptor-1 humano é mostrado abaixocomo SEQ ID NO:1.

O Nogo-receptor-1 humano de comprimento total é codificadopelo nucleotídeo 166 a nucleotídeo 1587 de SEQ ID NO: 1.

agccpagçça gagccgggcg gagcggagcg cgcegagcct cgtcocgcgg ccgggecggggccgggccgt agcggcggcg cctggatgcg gncccggccg cggggagaeg ggcgcccgccccgaaecgec ttteagtccc cgacgcgccc ogccoaaccc CtfcCgatgaa gagggcgtccgctggaggga gccggctget ggcatgggtg ctgtggctgc aggcctggea ^gtggcagccccatgeecag gtgcctgcgt atgctacaat gagcccaagg ^gtscsgacaag ctgcccccagesgggcctgc aggctgtgcc cgtgggeatç çcçaçtçrçcíi gccsgcgeafc cttccfr«cã.eggcaaccgca tctcgcafcgt gccagctgcc agcttccgtg cetgcege^a cctcaccatccfcgtggetge Sctcgaafcgt gctggcecga atfegatgcgg ctgccttcac fcggcatggccctcctggagc agctggaect cagcgataat gcacagctcc ggtetgtggn ccctgccacattceaeggcc tgggecgcct acacacgctg cacctggace gctgcggcct gcaggagctgggecoggggc tgctccgogg ecfcggctgcc cfcgcagtacc Cctacctgca ggucaacgcgctgcaggeae fegeefcfwfcga caccttccgc gacetgggea ^cctcacaca cctcttcctgeacggçaacc gcatctccag ogtgccegag egegccttcc gtgggctgca cagçctegSCcgtctcctac tgcacoagaa ccgogtggcc catgtgcacc cgcatgcctt ccgtgaccttggecg.cctca tgacactcta tctgtttgec aaeaâtdtat cagcgctgcc cactgaggeecfcggoccccc tgcgtgccct geagtaectg aggefceascg acaacccetg ggtgtgfegacCgccgggcac gcccnctctg ggcctggctg cagaagttcc gcggctcctc ctcogaggtgccctgcagcc tcccgcaacg cctggctgge cgtgncctca aacgcctagc tgecaatgncctgcagggct gcgetgfcggc caccggccct taccatccca fcefcggaccgg cagggccaccgatgftggagc cgcfcggggct tcccaagtge tgecagcçag abgccgctga caaggecfco*gfcactggagc ctgsgaagae*? ^Stttcspca ggcaatgcgc fcgaagggaeg cgtgccgcccggtgacagce CgCCgggcaa cggotctggc ccacggcaça tcãatgactc accctttggg«iCtctgcctg gctctgctga gccecogefcc ftctgcagtgc ggcccgaggg OtCCgngccaccagggttee ccdcefecggg cccfcogccgg aggccagget gfefeçãpgeaa gaaccgcacecgcagccact gccgtctggg -ceaggcaggc agçgggggtg gcgggactgg tgactcãgaaggctcaggtg ccetaeccâg ccfccaccfcgc agcctcaccc çectgggcct ggcgctggtgctgtggncag tgcttgggcc ctgetgaecc ccagcggaca caagagcgfeg eteageagccaggtgtgfcgt aeataegggg tctctctcca cgccgccaag eeagepgggc ggccgacccgtggggcaggc caggccaggt cctecctget ggacgcctg

O polinucleotídeo Nogo-receptor-1 de rato é mostrado abaixocomo SEQ ID NO:25, e apresenta número de acesso NM_053613 no Gen-bank.afcgaagaggg egteetocgg a.ggaagccgg cfcgcegaeafc gggtgtfcabg gctacaggcetfSftfggtag caacgccctg cçctggtgee fcgfcgtgtgcfc acaatgagcc caaggtcácaacaagccgçç cceageeggg cctgeaggct gtaçecgçbg gcatceeagc cfcccagccagagaatcttcc tgcacggcaa cegaatcfcce fcaegtgceag ccgccagcfct ccsagteatgccggastctca ceatecfegtg getgcctca aatgegetçg eegggafcfcgn tgcegeggccttecactggfce fcgaccctcct ggageaacfca gatettagtâ acâãtgcaca gctccgtgtegtggftcecca ecaegttceg tggeefcggpse cacetgcaea cgçtgçaeet «gaeegatgci·ggccfcgeagg agetgaggec fcggcetafcte egfcgggefcgg eagefcctgca gtacetcfcacetMMflnea «caacetegea ggoaeteeee gacaàcaoct tccgagaesce g^gcftacetcaegeafcetct tEctgeetff esseegrtatc cccagtgttc cfegageaese tfcfccogtggcttgcaeagtc ttgaccgtct cctcttgcac cagaaccatg fcggctcgtgt gçaeeeaeatgccfctccggg aootfcggeeg ttgccaacaa cctcfccGatg

ctcecegcog aggtecfcagfc gcccctgagg tctctgcagfc accfcgcgact caatgacaee GGctgggtgt Qfcgaetgcag ggcacgtccg etcteggcct gecfcgcagaa gttccgaggttccteatccg gggtgcccag ceacotaccc eaacgcctgg caggccgtga tctg&agcgcctfgcteacca gbgaçtfcssei ^ggttgtgct gtggefctegg ggeeettecg tcccfetccagttflflaGteagc teactegafcga ggagefcgefcg ggccfccccca agfcgctgcça gecsptsetgemgacaagg cçtcagfcact gga&cccggg a.ggccggcgt ctgttâgáaa tgcactcaagggaopfc^tgc ctcccggbga çactccaeea ggça^eggct caggçcç«cg geacAtüãat- ^sctctocat fctgggaefctt §,ceeâg<3fcet géagageecüc ©aefcgáctgc: cctgcggcefegggggfctccg ag-OGCccggg acfcgcccaee acgggceccc gcaggaggcc aggttgtt.CC«gâaagaacc · gcaeccçtag · ceaofcgoeft etgggceags ^ggaagtgg gagcagtgga' 'actggcpgâtg cagaaggtte gggggccctg cetgeeçtgg ccfcgcageot fcgcfccetcftgggeettgcac tggtüefcfctg gadggfcgett gggcecfcgct ga ..·'" '

O polinucleotídeo Nogo-receptor-2 humano é mostrado abaixo co-mo SEQ ID NO:26, e apresenta número de acesso BK001302 no Genbank.

atgctgcccg ggetcaggcg cefcgetgcaa gcteccgeset cggcctgcct cctgctgatgctootggecc tgeccefcggo · fgeccecago fcgoeeeatgc Hsfcgeiieetg ctaçfcetócceegcee*OÇ9 fcgagefcgeca ggccaaeaae fctcfecctcfcg tgecgetgt© eetgccacee. agcactçag« gsetcfcfcccfc efeafaacaac. cfccafccegca qgefcgçfgce aggoaecfcttigetcaçsfcéfc gfcggcfcetfcc fceeaacaacc fcefcccaeeat etaqccgggc••«cfcfcfceos-e. aefctgcaagc. cctggaggag efcgga«çç.e9 gtgacaacog «cacctgqg© '; tcgctggagc cogscacctt ecagggccfcg gagcggctgc sgfcegefegca: ttfcgtaccgc"·' .tgee«tctea gcagcctgcc cggoaae&te-tfcçogaggçe fcggtcageefc gcagtacetctaeetccagg *eaaeageot. getccaccta «aogatgact fcgttegcgga cefeggecaac. efcg»g*K»cc fcetfceetcca ·· cgggaaecgc etgcggctgc tcacagagca cgtefcttcgeSBcctgggca gectggaccg getgcfcgctg caçggçsaaec sgctgcaggg cgtgcacegc. gcggccfetec geggceteatsr" ccgcoteeee atccfectaee «gfctcaacàa ·. oageetggeetcgctgcccg gcgsggcgct egecgácctg ccetcgctgg agttectgqggctcaacgctaaceeefeggg cgtgcgectç ccgcgcgegig ccgctctggg eceggttcca ^gqqcgcgcSfeftecagct epgac^tgac:. etgegeoMse: cecceggagc gccagggeeg ^ccfcgqgegcgct ccgeg íiggccgactt ecaggcgtgt: ccgcccgcgg eaeeeaeçgg gccgggcftgc

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Vetores

Vetores compreendendo ácidos nucléicos que codificam polipep-tídeos NgR da invenção podem também ser usados para produzir polipeptí-deo para uso nos métodos da invenção. A escolha do vetor e seqüências decontrole de expressão as quais tais ácidos nucléicos são operavelmente li-gados depende das propriedades funcionais desejadas, por exemplo, ex-pressão de proteína, e da célula hospedeira a ser transformada.

Os elementos de controle de expressão úteis para regular a ex-pressão de uma seqüência de codificação operavelmente ligada são conhe-cidas na técnica. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, promotoresinduzíveis, promotores constitutivos, sinais de secreção, e outros elementosregulatórios. Quando um promotor induzível é usado, ele pode ser controla-do, por exemplo, por uma mudança no estado do nutriente, ou uma mudan-ça na temperatura, no meio de célula hospedeira.

O vetor pode incluir um replicon procariótico, isto é, uma se-qüência de DNA tendo a capacidade de dirigir replicação autônoma e manu-tenção da molécula de DNA recombinanté extra-cromossomalmente em umacélula hospedeira bacterial. Tais replicons são bem-conhecidos na técnica.Em adição, vetores que incluem um replicon procariótico podem tambémincluir um gene cuja expressão confere um marcador detectável, tal comouma resistência a fármaco. Exemplos de genes de resistência a fármacobacteriais são aqueles que conferem resistência à ampicilina ou tetraciclina.

Os vetores que incluem um replicon procariótico podem tambémincluir um promotor procariótico ou bacteriófago para direcionamento de ex-pressão das seqüência dé gene de codificação em uma célula hospedeirabacterial. Seqüências de promotor compatíveis com hospedeiros bacteriaissão tipicamente providas em vetores de plasmídeo contendo locais de restri-ção convencionais para inserção de um segmento de DNA a ser expresso.Exemplos de tais vetores de plasmídeo são pUC8, pUC9, pBR322 e pBR329(BioRad Laboratories, Hercules, CA), pPL e pKK223. Qualquer hospedeiroprocariótico adequado pode ser usado para expressar uma molécula deDNA recombinante que codifica uma proteína usada nos métodos da inven-ção.

Para a proposta desta invenção, numerosos sistemas de vetorde expressão podem ser empregados. Por exemplo, uma classe de vetorutiliza elementos de DNA que são derivados de vírus de animal, tais comovírus de papiloma bovino, vírus de polioma, adenovírus, vírus de vacina, ba-culovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV), ou vírus SV40. Outros envol-vem o uso de sistemas policistrônicos com locais de ligação de ribossomointernos. Adicionalmente, células que têm integrado o DNA em seus cro-mossomos podem ser selecionadas pela introdução de um ou mais marca-dores que permitem seleção de células hospedeiras transfectadas. O mar-cador pode proporcionar prototrofia para um hospedeiro auxotrópico, resis-tência a biocida (por exemplo, antibióticos), ou resistência a metais pesados,tal como cobre. O gene marcador selecionável pode ou ser diretamente liga-do às seqüências de DNA a serem expressas, ou introduzido na mesma cé-lula por co-transformação. O gene neomicin fosfotransferase (neo) é um e-xemplo de um gene marcador selecionável (Southern et aí., J. Moi Anal.Genet. 1:327-341 (1982)). Elementos adicionais podem também serem ne-cessários para síntese ótima de mRNA. Estes elementos podem incluir se-qüências de sinal, sinais de união, bem como promotores transcricionais,intensificadores, e sinais de terminação.

Em uma concretização, um vetor de expressão proprietário deBiogen IDEC, Inc., referido como NEOSPLA (Patente dos Estados Unidos6.159.730) pode ser usado. Este vetor contém o promotor/intensificador ci-tomegalovírus, o promotor maior beta-globin de camundongo, a origemSV40 de replicação, a seqüência de poliadenilação de hormônio de cresci-mento bovino, neomicin fosfotransferase exon 1 e exon 2, o gene diidrofolatoreductase e seqüência condutora. Este vetor tem sido encontrado para resul-tar em expressão de nível muito alta após transfecção em células CHO, se-guido pela seleção em meio contendo G418, e amplificação de metotrexato.Naturalmente, qualquer vetor de expressão que é capaz de elicitar expres-são em células eucarióticos pode ser usado na presente invenção. Exemplosde vetores adequados incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos pcD-NA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2,pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, e pZeoSV2 (disponíveis de Invitro-gen, San Diego, CA), e plasmídeo pCI (disponível de Promega, Madison,Wl). Vetores de expressão de célula eucariótica adicionais são conhecidosna técnica, e são comercialmente disponíveis. Tipicamente, tais vetores con-têm locais de restrição convenientes para inserção do segmento de DNAdesejado. Vetores exemplares incluem pSVL e pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pm12d (International Biotechnologies), pTDT1 (ATCC 31255), vetor deexpressão retroviral pMIG e pLL3.7, vetor de adenovirus pDC315, e vetoresAAV. Outros sistemas de vetor exemplares são descritos, por exemplo, naPatente dos Estados Unidos 6.413.777.

Em geral, a classificação de grandes números de células trans-formadas para aqueles que expressam níveis adequadamente altos do an-tagonista é experimentação de rotina que pode ser efetuada, por exemplo,por sistemas robóticos.

Freqüentemente seqüências regulatórias usadas para expressãode célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que dirigem altosníveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promo-tores e intensificadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalovírus(CMV) (tal como o promotor/intensificador CMV), Vírus Simian 40 (SV40) (talcomo o promotor/intensificador SV40), adenovirus, (por exemplo, o promotortardio maior adenovirus (Adm1 P)), polioma e promotores de mamífero fortes,tais como imunoglobulina nativa e promotores actin. Para descrição adicionalde elementos regulatórios virais e seqüências destes, ver, por exempio, Pa-tente dos Estados Unidos Nq 5.168.062; Bell, Patente dos Estados Unidos N94.510.245; e Schaffner, Patente dos Estados Unidos N- 4.968.615.

Os vetores de expressão recombinante podem transportar se-qüências que regulam replicação do vetor em células hospedeiras (por e-xemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O genemarcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais ovetor tenha sido introduzido (ver, por exemplo, Axel, Patente dos EstadosUnidos Ne 4.399.216; 4.634.665 e 5.179.017). Por exemplo, tipicamente ogene marcador selecionável confere resistência a um fármaco, tal comoG418, hidromicin ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetorfoi introduzido. Os genes marcadores selecionáveis freqüentemente usadosincluem o gene diidrofolato reductase (DHFR) (para uso em células hospe-deiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato), e o neo gene (paraseleção de G418).

Os vetores que codificam polipeptídeos ou fragmentos de poli-peptídeo podem ser usados para transformação de uma célula hospedeiraadequada. A transformação pode ser por qualquer método adequado. Osmétodos para introdução de DNA endógeno em células de mamífero sãobem-conhecidos na técnica, e incluem transfecção mediada por dextran,precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusãode protoplasto, eletroporação, encapsulamento do(s) polinucleotídeo(s) emlipossomas, e microinjeção direta do DNA no núcleo. Em adição, as molécu-las de ácido nucléico podem ser introduzidas em células de mamífero porvetores virais.

A transformação de células hospedeiras pode ser efetuada pormétodos convencionais adequados ao vetor e célula hospedeira emprega-dos. Para transformação de células hospedeiras procarióticas, eletroporaçãoe métodos de tratamento de sal podem ser empregados (Cohen et ai, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 69:2110-14 (1972)). Para transformação de células ver-tebradas, eletroporação, métodos de tratamento de lipídeo catiônico ou desal podem ser empregados. Ver, por exemplo, Graham et ai, Virology52:456-467 (1973); Wigler et ai, Proc, Nati Acad. Sei. USA 76:1373-76(1979).

A linha de célula hospedeira usada para expressão de proteína émais preferivelmente de origem de mamífero; aqueles técnicos no assuntosão creditados com capacidade de determinar preferencialmente linhas decélula hospedeira particulares que são adequadas para o produto de genedesejado para ser expresso. As linhas de célula hospedeira exemplares in-cluem, mas não estão limitadas a, NSO, células SP2, células de rim dehamster muito novo (BHK), células de rim de macaco (COS), células de car-cinoma hepatocelular humanas (por exemplo., Hep G2), células A549 DG44e DUXB11 (linhas de Ovário de Hamster Chinês, DHFR negativo), HELA(carcinoma cervical humano), CVI (linha de rim de macaco), COS (um deri-vado de CVI com antígeno SV40), R1610 (fibroblasto de hamster Chinês),BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linha de rim de hasmster),SP2/0 (mieloma de camundongo), P3x63-Ag3.653 (mieloma de camundon-go), BFA-1c1BPT (células endoteliais bovinas), RAJI (linfócito humano) e293 (rim humano). As linhas de célula hospedeira são tipicamente disponí-veis de serviços comerciais, a American Tissue Culture Collection, ou daliteratura publicada.

A expressão de polipeptídeos a partir das linhas de célula deprodução pode ser aumentada usando-se técnicas conhecidas. Por exemplo,o sistema de glutamina sintetase (GS) é comumente usado para aumentar aexpressão sob certas condições. Ver, por exemplo, Patentes Européias N-s0216846, 0256055 e 0323997, e Pedido de Patente Europeu N2 89303964.4.

Os vetores de expressão de célula eucariótica são conhecidosna técnica, e são comercialmente disponíveis. Tipicamente, tais vetores con-têm locais de restrição convenientes para inserção do segmento de DNAdesejado. Vetores exemplares incluem pSVL e pKSV-10, pBPV-1, pm12d,pTDT1 (ATCC 31255), vetor de expressão retroviral pMIG, vetor de adenovi-rus pDC315, e vetores AAV.

Os vetores de expressão de célula eucariótica podem incluir ummarcador selecionável, por exemplo, um gene de resistência da fármaco. Ogene neomicin fosfotransferase (neo) é um exemplo de tal gene (Southern etal.. J. Mol. Anal. Genet. 1:327-341 (1982)).

As seqüências regulatórias freqüentemente usadas para expres-são de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que dirigemaltos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais comopromotores e intensificadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalovírus(CVM) (tais como o promotor/intensificador de CMV), Vírus Simian 40(SV40) (tal como o promotor/intensificador SV40), adenovirus (por exemplo,o promotor tardio maior de adenovirus (AdmIP)), polioma e promotores demamífero fortes, tais como imunoglobulina nativa e promotores de actin. Pa-ra descrição adicional de elementos regulatórios virais, e seqüências destes,ver, por exemplo, Stinski, Patente dos Estados Unidos N- 5.168.062; Bell,Patente dos Estados Unidos N- 4.510.245; e Achaffner, Patente dos EstadosUnidos N2 4.968.615.

Os vetores de expressão recombinante podem conduzir seqüên-cias que regulam replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo,origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gane marcadorselecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor te-nha sido introduzido (ver, por exemplo, Axel, Patente dos Estados UnidosN-s 4.399.216; 4.634.665 e 5.179.017). Por exemplo, tipicamente o genemarcador selecionável confere resistência a um fármaco, tal como G418,higromicin ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi in-troduzido. Genes marcadores selecionáveis freqüentemente usados incluemo gene hidrofolato reductase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhrfcom seleção/amplificação de metotrexato), e o neo gene (para seleção deG418).

As moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos NgRda invenção, e vetores compreendendo estas moléculas de ácido nucléico,podem ser usados para transformação de uma célula hospedeira adequada.A transformação pode ser por qualquer método adequado. Os métodos paraintrodução de DNA endógeno em células de mamífero são bem-conhecidosna técnica, e incluem transfecção mediada por dextran, precipitação de fos-fato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, ele-troporação, encapsulamento do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomas, e mi-croinjeção direta do DNA no núcleo. Em adição, as moléculas de ácido nu-cléico podem ser introduzidas em células de mamífero por vetores virais.

A transformação de células hospedeiras pode ser efetuada pormétodos convencionais adequados ao vetor e célula hospedeira emprega-dos. Para transformação de células hospedeiras procarióticas, eletroporaçãoe métodos de tratamento de sal podem ser empregados (Cohen et a!., Proc.Nati Acad. Sei. USA 69:2110-14 (1972)). Para transformação de células ver-tebradas, eletroporação, métodos de tratamento de lipídeo catiônico ou desal podem ser empregados. Ver, por exemplo, Graham et ai, Virology52:456-467 (1973); Wigler et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA 76:1373-76(1979).

Células Hospedeiras

As células hospedeiras para expressão de um polipeptídeo NgRou fragmento de polipeptídeo da invenção para uso em um método da in-venção podem ser procarióticas ou eucarióticas. As células hospedeiras eu-carióticas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, células de levedu-ra e de mamíferos, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO)(ATCC N9 de Acesso CCL61), células de embrião de camundongo suíço NIHNIH-3T3 (ATCC Ne Acesso CRL1658), e células de rim de hamster muitonovo (BHK). Outras células hospedeiras eucarióticas úteis incluem célulasde inseto e células de planta. As células hospedeiras procarióticas exempla-res são E. coli e Streptomyces.

As linhas de células de mamífero disponíveis como hospedeiraspara expressão são conhecidas na técnica, e incluem muitas linhas de célulaimortalizadas a partir de American Type Culture Collection (ATCC). Estasincluem, entre outras, células de ovário de hamster chinês (CHO), NSO, cé-lulas SP2, células HeLa, células de rim de hamster muito novo (BHK), célu-las de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humanas(por exemplo., Hep G2), células A549, e um número de outras linhas de cé-lula.

A expressão de polipeptídeos a partir das linhas de célula deprodução pode ser aumentada usando-se técnicas conhecidas. Por exemplo, osistema de glutamina sintetase (GS) é comumente usado para aumentar a ex-pressão sob certas condições. Ver, por exemplo, Patentes Européias N-s0216846, 0256055 e 0323997, e Pedido de Patente Europeu N2 89303964.4.

Terapia de Gene

Um polipeptídeo NgR ou fragmento de polipeptídeo da invençãopode ser produzido in vivo em um mamífero, por exemplo, um paciente hu-mano, usando-se uma aproximação de terapia de gene para tratamento deuma doença de sistema nervoso, enfermidade ou dano no qual antagoniza-ção de sinalização de mediação de NgR seria terapeuticamente benéfica.Isto envolve administração de um polipeptídeo NgR adequado que codificaácido nucléico operavelmente ligado às seqüências de controle de expres-são adequadas. Geralmente, estas seqüências são incorporadas em um ve-tor viral. Vetores virais adequados para tal terapia de gene incluem vetoresadenovirais, vetores lentivirais, vetores baculovirais, vetores virais EpsteinBarr, vetores papovavirais, vetores virais de vacina, vetores virais de herpessimplex, θ vetores adeno-associados a vírus (AAV). O vetor viral pode serum vetor viral de replicaçao defectivo. Os vetores adenovirais que têm umaanulação em seu gene E1 ou gene E3 são tipicamente usados. Quando umvetor adenoviral é usado, o vetor usualmente não tem um gene marcadorselecionável.

Composições Farmacêuticas

Os polipeptídeos NgR, fragmentos de polipeptídeeo, polinucleo-tídeos, vetores e células hospedeiras da invenção podem ser formulados emcomposições farmacêuticas para administração a mamíferos, incluindo sereshumanos. As composições farmacêuticas usadas nos métodos desta inven-ção compreendem veículos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, porexemplo, trocadores de íon, alumina, estearato de alumínio, lecithin, proteí-nas de soro, tais como albumina de soro humano, substâncias tampões, taiscomo fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de gliciri-da parcial de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, taiscomo sulfato de protamina, dissódio hidrogêno fosfato, potássio hidrogênofosfato, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica-coloidal, trissilicato de magné-sio, polivinil pirrolidona, substâncias baseadas em celulose, polietileno glicol,sódio carboxímetilcelulose, poliacrilatos, ceras, polietileno-polioxipropileno-polímeros de bloco, polietileno glicol e gordura.

As composições usadas nos métodos da presente invenção po-dem ser administradas por qualquer método adequado, por exemplo, paren-teralmente, intraventricularmente, oralmente, por spray de inalação, tipica-mente, retalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente, ou via um reser-vatório implantado. O termo "parenteral", conforme aqui usado, inclui técni-cas de injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracranial, outécnicas de infusão. Conforme descrito anteriormente, os polipeptídeos NgRda invenção agem no sistema nervoso para inibir sinalização mediada porNgR. Conseqüentemente, nos métodos da invenção, os polipeptídeos NgRsão administrados de tal modo que eles cruzam a barreira sangue-cérebro.Este cruzamento pode resultar de propriedades físico-químicas inerentes naprópria molécula de polipeptídeo NgR, a partir de outros componentes emuma formulação farmacêutica, ou a partir do uso de um dispositivo mecâni-co, tal como uma agulha, cânula ou instrumentos sirúrgicos para romper abarreira sangue-cérebro. Onde o polipeptídeo NgR é uma molécula que nãocruza inerentemente a barreira sangue-cérebro, por exemplo, uma fusão auma porção que facilita o cruzamento, rotas adequadas de administraçãosão, por exemplo, intratecais ou intracraniais, por exemplo, diretamente emuma lesão crônica de MS. Onde o polipeptídeo NgR é uma molécula quecruza inerentemente a barreira sangue-cérebro, a rota de administração po-de ser por uma ou mais das várias rotas descritas abaixo.

Formas injetáveis estéreis das composições usadas nos méto-dos desta invenção podem ser suspensão aquosa ou aleaginosa. Estas sus-pensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas na téc-nica usando-se agentes de dispersão ou umedecimênto adequados, e agen-tes de suspensão. A preparação injetável estéril pode também ser uma solu-ção ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente parenteral-mente aceitável não-tóxico, por exemplo, como uma suspensão em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empre-gados estão água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotôni-ca. Em adição, óleos fixos estéreis são convencionalmente empregados co-mo um solvente ou meio de suspensão. Para esta proposta, qualquer óleofixo brando pode ser empregado, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos.Ácidos graxos, tais como ácido oléico e seus derivados de glicirida são úteisna preparação de injetáveis, e são óleos farmaceuticamente aceitáveis natu-rais, tais como óleo de oliva e óleo de rícino, especialmente em suas ver-sões polioxietilatadas. Estas soluções ou suspensões de óleo podem tam-bém conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tal comocarboximetil celulose, ou agentes dispersantes similares que são comumen-te usados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitá-veis incluindo emulsões e suspensões. Outros tensoativos comumente usa-dos, tais como Tweens, Spans e outros agentes emulsificantes ou intensifi-cadores de biodisponibilidade são comumente usados na manufatura de só-lido farmaceuticamente aceitável, líquido, ou outras formas de dosagem po-dem também ser usadas para a proposta de formulação.

Formulações parenterais podem ser uma dose de massa sim-ples, uma infusão, ou uma dose de massa de carregamento, seguida comuma dose de manutenção. Estas composições podem ser administradas emintervalos fixos específicos, ou variáveis, por exemplo, uma vez ao dia, ouem uma base "conforme necessário".

Certas composições farmacêuticas usadas nos métodos destainvenção podem ser oralmente administradas em uma forma de dosagemaceitável incluindo, por exemplo, cápsulas, comprimidos, suspensões aquo-sas ou soluções. Certas composições farmacêuticas podem também seradministradas por aerossol nasal ou inalação. Tais composições podem serpreparadas como soluções em salina, empregando benzil álcool, ou outrosconservantes adequados, promotores de absorção para aumentar biodispo-nibilidade, e/ou outros agentes de solubilízação e dispersão convencionais.

A quantidade de um polipeptídeo NgR ou fragmento de polipep-tídeo da invenção que pode ser combinada com materiais veículos para pro-duzir uma forma de dosagem simples variará dependendo do hospedeirotratado, e do modo particular de administração. A composição pode ser ad-ministrada como uma dose simples, doses múltiplas, ou sobre um períodoestabelecido de tempo em uma infusão. Os regimes de dosagem tambémpodem ser ajustados para proporcionar a resposta desejada ótima (por e-xemplo, resposta terapêutica ou profilática).

Os métodos da invenção usam uma "quantidade terapeutica-mente eficaz" ou uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um polipeptí-deo NgR. Tal quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz podevariar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo epeso do indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamenteeficaz é também uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais sãomais importantes pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

Uma dosagem específica e regime de tratamento para qualquerpaciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo o poli-peptídeo NgR particular usado, a idade do paciente, peso corpóreo, saúdegeral, sexo e dieta, e o tempo de administração, taxa de excreção, combina-ção do fármaco, e a severidade da doença particular sendo tratada. O jul-gamento de tais fatores pelos médicos está dentro do versado na técnica. Aquantidade também dependerá do paciente individual a ser tratado, da rotade administração, do tipo de formulação, das características do compostousado, da severidade da doença, e do efeito desejado. A quantidade usadapode ser determinada pelos princípios farmacológicos e farmacocinéticosbem-conhecidos na técnica.

Nos métodos da invenção os polipeptídeos NgR são geralmenteadministrados ao sistema nervoso, intracerebroventricularmente, ou intrate-calmente, por exemplo, em uma lesão crônica de MS. As composições paraadministração de acordo com os métodos da invenção podem ser formula-das de modo que uma dosagem de 0,001 - 10 mg de peso corpóreo por diado polipeptídeo NgR é administrada. Em algumas concretizações da inven-ção, a dosagem é 0,01-1,0 mg/kg de peso corpóreo por dia. Em algumasconcretizações, a dosagem é 0,001 -0,5 mg/kg de peso corpóreo por dia.

Os compostos ativos suplementares podem também ser incorpo-rados nas composições usadas nos métodos da invenção. Por exemplo, umpolipeptídeo NgR ou fragmento de polipeptídeo da invenção, ou uma proteí-na de fusão deste, pode ser co-formulado com e/ou co-administrado com umou mais agentes terapêuticos adicionais.

Para tratamento com um polipeptídeo NgR ou fragmento de po-lipeptídeo da invenção, a dosagem pode variar, por exemplo, de cerca de0,0001 a 100 mg/kg, e, mais usualmente, 0,01 a 5 mg/kg (por exemplo, 0,02mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), do pesocorpóreo do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 1 mg/kg depeso corpóreo, ou 10 mg/kg de peso corpóreo, ou dentro da faixa de 1-10mg/kg, preferivelmente pelo menos 1 mg/kg. Doses intermediárias nas faixasacima são também pretendidas para estar dentro do escopo da invenção. Osindivíduos podem ser administrados com tais doses diárias, em dias alterna-tivos, semanalmente, ou de acordo com qualquer tabela determinada pôranálise empírica. Um tratamento exemplar requer administração em dosa-gens múltiplas sobre um período prolongado, por exemplo, de pelo menosseis meses. Regimes de tratamento exemplares adicionais requerem admi-nistração uma vez de duas em duas semanas, ou uma vez por mês, ou umavez de 3 a 5 meses. Tabelas de dosagem exemplares incluem 1-10 mg/kg,ou 15 mg/kg em dias consecutivos, 30 mg/kg em dias alternativos, ou 60mg/kg semanalmente.

Em alguns métodos, dois ou mais polipeptídeos NgR ou frag-mentos de polipeptídeo são administrados simultaneamente, em cujo caso adosagem de cada polipeptídeo administrada cai dentro das faixas indicadas.Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nascomposições usadas nos métodos da invenção. Por exemplo, um anticorpoanti-NgR, ou outro antagonista de NgR, podem ser co-formulados com e/ouco-administrados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

A invenção envolve qualquer método de distribuição adequadopara um polipeptídeo NgR ou fragmento de polipeptídeo de um tecido-alvoselecionado, incluindo injeção de massa de uma solução aquosa, ou implan-tação de um sistema de liberação controlada. O uso de um implante de libe-ração controlada reduz a necessidade de injeções repetidas.

Os polipeptídeos NgR1 e fragmentos de polipeptídeo usadosnos métodos da invenção podem ser diretamente infundidos no cérebro. Vá-rios implantes para infusão direta no cérebro de compostos são conhecidose são eficazes na distribuição de compostos terapêuticos em pacientes hu-manos que sofrem de enfermidades neurológicas. Estes incluem infusãocrônica no cérebro usando uma bomba, estereotaticamente implantada, ca-teteres intersticiais temporários, implantes de cateter intracranial permanen-te, e implantes biodegradáveis cirurgicamente implantados. Ver, por exem-plo, Gill et al., supra; Acharfen et al., "High Activity lodine-125 Interstitial Im-plant For Gliomas." Int. J. Radiation Oncoloqy Biol. Phvs 24(4):583-91(1992); Gaspar et al., "Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gli-omas", Int. J. Radiation Oncoloqy Biol. Phvs. 43(5):977-82 (1999); capítulo66, páginas 577-580, Bellezza et al., "Stereotactic Interstitital Brachythe-rapy", in Gildenberg et ai, Textbook of Stereotactic and Functional Neuro-surgery, MeGraw-HiII (1998); e Brem et ai, "The Safety of Interstitital Chemo-therapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in theTreatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial", J. Neuro-Oncoloqy 26:111-23 (1995).

As composições podem também compreender polipeptídeo N-gR1 ou fragmento de polipeptídeo da invenção disperso em um material veí-culo biocompatível que funciona como um sistema de distribuição e suporteadequados para os compostos. Exemplos adequados de veículos de Iibera-ção sustentada incluem matrizes de polímero semi-impermaeáveis na formade artigos moldados, tais como supositórios e cápsulas. Matrizes de libera-ção sustentada implantáveis ou microcapsulares incluem polilactídeos (Pa-tente dos Estados Unidos N- 3.773.319; EP 58.481), copolímeros de ácidoL-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et ai, Biopolymers 22:547-56(1985)); poli(2-hidroetil-metacrilato), etileno vinil acetato (Langer et ai, J. Bi-omed. Mater. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12-98-105(1982)), ou poli-D-(-)-ácido 3-hidroxibutírico (EP 133.988).

Em algumas concretizações, um polipeptídeo NgRI ou fragmen-to de polipeptídeo da invenção é administrado a um paciente por infusãodireta em uma região apropriada do cérebro. Ver, por exemplo, Gill et at.,"Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinsondisease", Nature Med, 9:589-95 (2003). Técnicas alternativas são disponí-veis, e podem ser aplicadas para administrar um polipeptídeo NgR de acor-do com a invenção. Por exemplo, colocação estereotática de um cateter ouimplante pode ser efetuada usando-se a unidade Riechert-Mundinger e uni-dade de localização de multiproposta ZD (Zamorano-Dujovny). Um escane-amento de tomografia computadorizada aumentado de contraste (CT), inje-ção de 120 ml de omnipaque, 350 mg de iodine/ml, com espessura de união,pode permitir planejamento de tratamento multiplanar tridimensional (STP,Físher, Freiburg, Alemanha). Este equipamento permite planejamento nabase de estudos de imagem de ressonância magnética, fundindo a informa-ção-alvo CT e MRI para confirmação-alvo clara.O sistema estereotático Leksell (Downs Surgical, Inc, Decatur,GA) modificado para uso com um escaneador GE CT (General ElectricCompany, Milwaukee, Wl), bem como o sistema estereotático Brown-Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington, MA), pode ser usado para estaproposta. Desse modo, na manhã do implante, o anel de base anular da es-trutura estereotática BRW pode ser fixado à cabeça do paciente. Seções CTem série podem ser obtidas em intervalos de 3 mm através da região (tecidoalvo) com uma estrutura Iocalizadora de haste de grafite presa à placa base.Um programa de planejamento de tratamento computadorizado pode seroperado em um computador VAX 11/780 (Digital Equipment Corporation,Maynard1 Mass) usando-se coordenadas CT das imagens de haste de grafi-te para mapear entre espaço CT e espaço BRW.

Métodos In Vitro

A presente invenção também inclui métodos de supressão deinibição de crescimento de célula neuronal in vitro. Por exemplo, a invençãoincJui métodos in vitro para estimular crescimento de célula neuronal na pre-sença de fatores que, sob circunstâncias normais, causam inibição de cres-cimento de célula neuronal, ou colapso de cone de crescimento.

Os métodos, de acordo com este aspecto da invenção, cómpre-endem contactar uma célula neuronal que expressa um Nogo receptor comum agente que causa inibição de crescimento mediada por NgR na presençae ausência de um isolado de um polipeptídeo NgR1 ou fragmento de poli-peptídeo da invenção. Conforme aqui usado, a expressão "agente que cau-sa inibição de crescimento mediada por NgR" significa qualquer compostoque interage com um componente da trajetória de transdução de sinal deNogo receptor (por exemplo, NgR ou proteínas de interação de NgR), esti-mulando, desse modo, a inibição de crescimento de célula neuronal, ou co-lapso de cone de crescimento. Agentes exemplares que causam inibição decrescimento mediada por NgR, por exemplo, Nogo (por exemplo, NogoA,Nogo-66), glicoproteína associada com mielin (MAG), oligodendrócito glico-proteína (OMgp), e fragmentos e derivados destes que inibem o crescimentode células que expressam o Nogo receptor. O próprio mielin é outro agenteexemplar que causa inibição de crescimento mediada por NgR.

A célula neuronal usada na prática dos métodos in vitro da in-venção pode, em certas concretizações, expressar um Nogo receptor endó-geno. Em outras concretizações, a célula neuronal expressa um Nogo recep-tor exógeno de um vetor. A célula neuronal pode expressar ambos um Nogoreceptor endógeno e um Nogo receptor exógeno.

Os métodos de acordo com este aspecto da invenção podemcompreender monitoramento da extensão de inibição de crescimento neuro-nal, ou colapso de cone de crescimento na presença e/ou ausência de umisolado de polipeptídeo NgR1 ou fragmento de polipeptídeo da invenção. Osmétodos in vitro da invenção podem ser usados para caracterizar a extensãoa qual polipeptídeos NgR candidatos são capazes de suprimir inibição decrescimento de célula neuronal, ou colapso de cone de crescimento quenormalmente ocorrem na presença de um agente que causa inibição decrescimento mediada por NgR. Desse modo, os métodos da invenção sãoúteis para identificar e caracterizar a faixa total de polipeptídeos NgR tendo acapacidade de suprimir inibição de crescimento de célula neuronal. Os mé-todos de acordo com este aspecto da invenção podem ser realizados emformatos de produção altos.

Outros métodos in vitro e in vivo para testar a capacidade depolipeptídeos NgR1 ou fragmentos de polipeptídeo para inibir crescimentode neurite são descritos na publicação PCT W02005/016955 (aqui incorpo-rada por referência).

Será prontamente aparente a um versado na técnica nas áreasrelevantes que outras modificações e adaptações adequadas aos métodos eaplicações aqui descritas são óbvias, e podem ser feitas sem fugir do esco-po da invenção ou qualquer concretização desta. Tendo-se agora descrito apresente invenção, a mesma será mais claramente compreendida por refe-rência aos exemplos seguintes, que são inclusos aqui para a proposta deilustração somente, e não são pretendidos para limitarem a invenção.EXEMPLOS

Exemplo 1

Pureza e Bioatividade de Proteínas NgR1

As análises de anulação prévias sugerem que a região LRR totalde Nogo-receptor-1, incluindo a capa C-terminal de LRR, LRRCT, é neces-sária para ligação de ligante, e que a haste CT adjacente do Nogo receptor-1contribui para interações com seus co-receptores (por exemplo, p75, TAJ eLINGO-1). Para elucidar adicionalmente quais regiões de NgR1 foram envol-vidas na interação com seus co-receptores, várias construções de NgR1 fo- ram analisadas por sua capacidade de ligarem-se aos co-receptores. NgR1humano, excluindo o domínio GPI (FL-NgRI, resíduos 27-438, figura 1 (SEQID NO:22)) com uma etiqueta de bandeira em seu N-terminal foi expressoem células CHO e purificado como uma proteína solúvel a partir do meiocondicionado por etapas de cromatografia seqüencial em TMAE-FractogeI(EM Merck) e Ni-NTA agarose (Qiagen). NgR1 humano (310) (resíduos 27-310) e NgR1 humano (344) (resíduos 27-344) foi expresso como proteínasetiquetadas com histidina (etiqueta C-terminal) em células de inseto, e purifi-cado por etapas de seqüenciamento em SP-Sefarose (Amersham BioScien-ces) e Ni-NTA agarose. NgR1 de rato (resíduos 27-344)-rato-Fc(lgG1) eNgR de rato (310) (resíduos 27-310) foram expressos em células CHO. NgRde rato (344)-rato-Fc foi purificado em Proteína A Sefarose (Amersham Bi-oSciences) e NgR de rato (310) em SP-Sefarose. As amostras foram anali-sadas para pureza por SDS-PAGE em 4-20% de géis gradientes (NOVEX),e para agregação por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em umacoluna Superdex® 200 (Amersham Biosceinces). A coluna foi operada emPBS a uma taxa de fluxo de 20 mL/h, e o efluente da coluna monitorado paraabsorvância a 280 nm.

SDS-PAGE indicou que a pureza de FL-NgRI era maior do que90% com uma massa molecular média de cerca de 65 kDa (figura 2A). Nacromatografia de exclusão de tamanho (SEC), a proteína eluiu como um picosimples com uma massa de cerca de 80 kDa (figura 2B). FL-NgRI foi testa-do para ligação em um ensaio ELISA usando-se métodos conhecidos natécnica, e foi verificado se ligar a LINGO-1, OMgp, Nogo 66, p75 e TAJ, bemcomo ou melhor do que versões truncadas contendo a região LRR sozinho.Ver, por exemplo, Shao, et ai, (2005), Neuron 45,353-359. Uma afinidademais alta 10 vezes para Taj foi vista usando-se FL-NgRI comparada com aversão truncada NgR1(310) contendo apenas a região LRR conforme descritoem Id. Análises adicionais de ligação em uma competição ELISA, usando-seum anticorpo anti-NgR1 para bloquear a ligação de AP-OMgp e AO-Lingo-1para NgRI, verificaram as atividades de FL-NgRI (figura 2C).

Exemplo 2

Análise da Seqüência de Aminoácido de Proteína NgR1 Humanade Comprimento Total

A seqüência de aminoácido de FL-NgRI foi confirmada por ma-peamento de peptídeo tríptico em um sistema LC-MS. O mapeamento depeptídeo foi feito em amostras de proteína com e sem tratamento de PNGa-se F. Primeiro, glicans N-Iigadas foram removidas a partir de proteínas nati-vas com PNGase F. Cerca de 1 μί de PNGase F (2,5 υ/μί, Prozyme) foiadicionado a 25 μ\- de uma solução contendo cerca de 20 μί de proteína; asolução foi incubada a 37°C por 24 horas. Em seguida outro 1 μί de PNGa-se F foi adicionado, e a solução foi mantida à temperatura ambiente por umadicional de 24 horas. Alquilação foi feita sob desnaturação, mas condiçõesde não-redução. Cerca de 0,3 μί de 4-vinilpiridina foi adicionado em 50 μίda solução de proteína, e imediatamente após 50 mg de guanidina cloridrato(GuHCI) foi adicionado à solução. A solução foi incubada à temperaturaambiente no escuro por 60 minutos. As proteínas alquilatadas foram recupe-radas por precipitação com 40 volumes de etanol arrefecido conforme des-crito em Pepinsky, R. B. (1991) Anal. Biochem. 195, 177-181. A solução foiarmazenada a -20°C e, em seguida, centrifugada a 14000 X g por 8 minutosa 4°C. O sobrenadante foi descartado, e a precipitado -20 μί/ίΓβεοο) foi la-vado uma vez com etanol arrefecido.

A tripsin foi escolhida como a enzima de clivagem para estudosde ligação de dissulfito, visto que era esperado gerar o conjunto mais sim-ples de peptídeos contendo cisteína. As digestões foram realizadas em pH6,5 para minimizar troca de dissulfito. Para superar o problema da taxa maisbaixa de hidrólise por tripsin a pH 6,5, as proteínas foram tratadas com en-do-Lys-C protease antes de clivagem de tripsin. Cerca de 20 μς cada dasproteínas alquilatadas, deglicosilatadas ou totalmente glicosilatadas, foi dige-rido com 5% (peso/peso) de endo-protease Lys-C (endo-Lys-C, Wako) em 1M de uréia, 0,2 M de Tris-HCI, pH 6,5, 10 mM de metilamina, 1 mM de Ca-Cl2, por 5 horas à temperatura ambiente; em seguida, 5% (peso/peso) detripsin (Promega) foi adicionado, e a solução foi incubada por um adicionalde 10-12 horas à temperatura ambiente. O volume final foi 55 μΙ_. Antes daanálise das digestões em um sistema de Cromatografia Líqui-da/Espectrometria de Massa (LC-MS), 55 μΙ_ de 8M de uréia recentementepreparada foi adicionado, e a solução foi dividida em duas partes: uma foianalisada após redução por 1 hora a 37°C com 40 mM de DTT, e a outraparte foi diretamente analisada sem redução. As digestões reduzidas e não-reduzidas foram analisadas em um sistema LC-MS composto de um HPLC(2690 Aüiance Separations Module), um detector de UV de comprimento deonda duplo de 2847, e um espectrômetro de massa LCT (Watyers Corp.,Milford, MA). A HPLC foi equipada com coluna de 1,0 mm χ 25 cm YMC Ci8(AA12S052501WT), ou uma coluna de 1,0 mm χ 25 cm Vydac Ci8(218TP51), e foi eluída com um gradiente de 200 minutos (0,70% de acetoni-trila) em 0,03% de ácido trifluoracético a uma taxa de fluxo de 0,07mL/minuto a uma temperatura de 30°C.

As proteínas foram separadas em uma coluna de fase reversaC18 com um espectrômetro de Massa on-line ESI-TOF. Todos os picos sig-nificantes foram identificados e contados para 97% de seqüência de NgR1prognosticada (Tabela 1). Não-detectados nos mapas de peptídeo forampeptídeos pequenos e hidrofílicos que co-eluem presumivelmente com o pi-co de solvente. Nos peptídeos identificados, oito locais não-prognosticadosde modificações pós-translacionais incluíram: hidroxilação em Prolina-352(cerca de 75%; o pico elui a 51,5 minutos na figura 2 e é designado T31<Hyp-352> na Tabela 1) e glicosilação O-Iigada em sete locais no PeptídeoT34 (resíduos 378-414, Tabela 1). O local de hidroxilação foi identificado porseqüenciamento de Espectrometria de Massa em tandem (MS/MS) no1652.9 Da peptídeo (dados não mostrados). O pico contendo o glicopeptídeotríptico T34 (resíduos 378-414) foi coletado, e cerca de 0,1 μς do peptídeofoi secado sob vácuo, e ressuspenso em 10 μΙ de PBS. Para remover ácidossiálicos, uma alíquota de 0,5 μΙ de sialidase (10 um^L, Boehringer Man-nheim) foi adicionada, após o qual a solução foi incubada à temperatura am-biente por 20 horas. Endoprotease Glu-C (endo-Glu-C, Sequencing Grade,Roche), digestão foi efetuada pelo tratamento do glicopeptídeo com 0,05 μgda enzima à temperatura ambiente por 24 horas. O peptídeo T34 tríptico tra-tado com sialidase foi analisado em um espectrômetro de massa VoyagerSTR (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando-se DHB como uma ma-triz. A digestão endo-GluC de desialidatado T34 foi analisada em um sistemade nano-fluxo LC-MS conforme descrito acima. A análise mostrou que o lo-cal de glicosilação N-ligado, Asparagina-380, em T34 não é ocupado, masque todos as quatro Serinas e três resíduos de Treonina no peptídeo sãoglicosilatados em algum grau, embora o peptídeo contenha, principalmente,um total de 4-6 glicans O-Iigadas (dados não mostrados). Os resultados ana-líticos são consistentes com predições feitas usando-se o programa NetO-Glyc 3.1.

Tabela 1. Análise de C-MS de peptídeos de uma digestão tríptica de FL-NgFreduzido e piridiletilatado

<table>table see original document page 62</column></row><table>Tabela 1. -continuação-

<table>table see original document page 63</column></row><table>Tabela 1. -continuação-

<table>table see original document page 64</column></row><table>

Designações ¥ denotam peptídeos trípticos prognosticados deseqüência de FL-NgRI onde T1 é o peptídeo N-terminal e T41 é o peptídeoC-terminal. *Leu é de etiqueta de Bandeira no N-terminal de FL-NgRI. § é afração tratada com sialidase antes da análise de espectrometria de massa.Exemplo 3

Análise de Cisteína Livre e Resíduos de Cisteína Ligada comDissulfito em Proteína NgR Humana

Para acessar diretamente quais dos resíduos de Cisteína na es-trutura madura estavam livres, uma digestão tríptica do FL-NgRI piridiletila-tado não-reduzido foi analisada em um sistema LC-MS após a digestão tersido reduzida com DTT. Devido a proteína ativa ser alquilatada com 4-vinilpiridina antes de clivagem enzimática, quaisquer resíduos de Cisteína noestado tiol livre devem ter sido piridiletilatados, resultando em um aumentode massa de 105 Da para cada grupo alquila. Por outro lado, resíduos deCisteína envolvidos em ligações de dissulfito devem ser detectados comocisteína livre, isto é, tendo um grupo tiol livre após redução. FL-NgRI contémquatorze resíduos de Cisteína - quatro no LRRNT, dois no LRRs, quatro noLRRTC, e quatro na haste CT. Todos os peptídeos contendo cisteína prog-nosticados no mapa de peptídeo tríptico foram identificados, exceto paraaqueles contendo Cisteína-80 e Cisteína 429, que, sendo pequeno, presu-mivelmente eluiu com o pico de solvente, e não foram analisados. O painelinferior da figura 3 mostra os mapas de peptídeo tríptico para o FL-NgRIpiridiletilatado após redução. Todos os peptídeos identificados são listadosna Tabela 1 com peptídeos contendo cisteína em negrito. A análise destesdados mostrou que 11 dos 12 resíduos de Cisteína identificados foram naforma de tiol livre após redução, e que Cisteína-140 no peptídeo T10 (resí-duos 140-151) era piridiletilatado. Portanto, nós podemos inferir que dozedos resíduos de Cisteína no FL-NgRI são envolvidos em seis ligações dedissulfito, e dois são não-emparelhados. Além disso, utilizando-se informa-ção a partir da estrutura de cristal de NBgRI (310), pode-se prognosticar queCisteína-80 existe como um tiol livre, visto que na estrutura de cristal, ela éenterrada na região LRR. Por inferência, Cisteína-429 na região de hasteCT, não presente na estrutura de cristal, deve ser envolvida na formação deligação de dissulfito.Exemplo 4

Análise de Ligações de Dissulfito em Proteína FL-NgRI

Estruturas de dissulfito dentro do NgR1 foram determinadas pelaanálise de mapas de peptídeo de digestões não-reduzidas. Baseado na es-trutura de dissulfito vista na estrutura de cristal de NgR1(310), conformedescrito em He, et ai, (2003) Neuron, 38, 177-185 e Baron, et ai, (2003)EMBO J. 22, 3291-3302, a digestão não-reduzida deve conter dois gruposde peptídeos ligados por dissulfito, um a partir da região LRRNT e o outro apartir da região LRRCT. De fato, a análise do mapa de peptídeo da digestãonão-reduzida revelou um grupo de peptídeos ligados por dissulfito (T1/T2) apartir da região LRRNT eluindo em 74,3 minutos (figura 3, painel superior). Aanálise espectrométrica de massa do pico mostrou gue ele continha doispeptídeos, T1 (resíduos 27-38) e T2 (resíduos 39-61), ligados por duas liga-ções de dissulfito (massa observada, 3698,77 Da; massa calculada, 3698,77Da; Tabela 2). O pico contendo os peptídeos T1 e T2 desapareceu guando adigestão foi reduzida com DTT e, concomitantemente, no mapa reduzido,dois novos picos correspondentes aos peptídeos individuais, T1 e T2 (figura3, painel inferior) foram observados. O peptídeo T1 contém três cisteínas.Devido a falta de uma protease gue pode clivar entre Cisteína-27 e Cisteína-29, e Cisteína 29 e Cisteína 33, as ligações de dissulfito exatas em T1/T2tinham gue ser determinadas por redução parcial com Tris (2-carboxietil)fosfina cloridrato (TCEP, Pierce) e alguilação com N-etilmaleimida (NEM,Pierce), seguido por análise de LC-MS/MS. Para efetuar isto, os peptídeostrípticos ligados por dissulfito foram parcialmente reduzidos usando-seTCEP, Pierce em 0,1 M de tampão de citrato, pH 3, contendo 6 M de guani-dina HCI, conforme descrito em Burns, et a!., J. Org. Chem. 1991, 56, 2648-2650. Várias guantidades de TCEP foram adicionadas à solução para en-contrar condições ótimas. As guantidades ótimas de TCEP foram encontra-das para serem 5 nmols para 20 mmols dos peptídeos ligados por dissulfitona região LRRNT, e 5 nmols para 10 pmols dos peptídeos ligados por dissul-fito na LRRCT e regiões de haste. O volume total da solução foi 2,5 μΙ. Aredução foi efetuada a 37°C por 15 minutos, e foi cessada por alguilação dospeptídeos parcialmente reduzidos com um excesso de NEM em 0,4 M detampão de citrato, pH 4,5 contendo 6 M de guanidina HCI. A concentraçãofinal de NEM em uma solução (5 p1) foi 10 mM; a solução foi mantida a 37°Cpor 1 hora. Os peptídeos parcialmente reduzidos e NEM-alquilatados foramanalisados em um sistema de nano-fluxo LC-MS/MS, conforme descrito aci-ma, ou diretamente ou após fracionamento adicional em um Módulo de Se-paração 2690 Alliance com uma coluna de 1,0 mm χ 15 cm Atlantic dCie(186001283, Waters Corp.). Um gradiente de 70 minutos (5-70% de acetoni-trila) em 1% de ácido trifluoracético em uma taxa de fluxo de 0,07 mL/minuto foi usada, a 30°C, para fracionamento. Os componentes nos picos nos ma-pas de peptídeo foram identificados usando-se software MassLynx (WatersCorp.). Espectros MS/MS foram adquiridos usando-se a função de aquisiçãodependente de dados (DDA) em um sistema de nano-fluxo LC-MS/MS, con-forme descrito acima. A energia de colisão em rampa 21-40 ev foi usada pa-ra experimentos MS/MS e espectros MS/MS foram coletados na faixa m/z50-1800, com amostragem todo 0,5 segundo, separação de 0,05 segundoentre espectros consecutivos. Os espectros MS ou MS/MS adquiridos a par-tir de Q-TOF Premier foram decifrados pelo programa MaxEnt. Os peptídeosligados por ligações de dissulfito foram adicionalmente identificados porcomparação do mapa da digestão não-reduzida com o mapa da amostrareduzida correspondente.

A partir da estrutura de cristal NgR1(310), conforme descrita emHe, et-ai., (2003) Neurort, 38-177-185 e Barton, et ai, (2003) EMBO J.22,3291-3302, nós podemos inferir que T1 terá uma ligação de dissulfito in-tra-peptídeo, e é ligado por uma ligação de dissulfito inter-peptídeo. A análi-se espectrométrica de massa dos produtos da redução parcial e alquilação,após separação em uma coluna Ci8, detecta os seguintes peptídeos NEM-alquilatados prognosticados parcialmente reduzidos: T1 contendo uma liga-ção de dissulfito e um grupo N-etilsuccinimidila (NES) (observado MH+ =1519,64, calculado MH+ = 1519,64), T2 um grupo NES (observado MH+ =2433,26, calculado MH+ = 2433,25) e T1/T2 contendo uma ligação de dissul-fito inter-peptídeo, e dois grupos NES (observado MH+ = 3951,90, calculadoMH+ = 3951,89 Da). Os espectros MS/MS para T1 contendo uma ligação dedissulfito e um grupo NES, mostrados na figura 4, indicam que o grupo NESestá na Cisteína 29 (íons de fragmento interno, PGAC (NES) ePGAC(NES)V, íons relacionados a yn, figura 4), que significa que Cisteína éligada a Cisteína-27 por uma ligação de disulfiuto intra-peptídeo, e que Cis-teína-29 é ligada a Cisteína-43 por uma ligação de dissulfito inter-peptídeo.O seqüenciamento MS/MS resulta de T1/T2 contendo uma ligação de dissul-fito inter-peptídeo e dois grupos NES são consistentes com esta conclusão,visto que a análise mostrou que os dois grupos NES estavam em Cistéína-027 e Cisteína-33 (dados não mostrados).

A estrutura de cristal da região LRRTC de NgR1(310), conformedescrita em He, et al., (2003) Neuron, 38-177-185 e Barton, et ai, (2003)EMBO J. 22,3291-3302, revelou ligações de dissulfito de Cisteína-264 paraCisteína-287 e Cisteína-266 para Cisteína-309. Portanto, os quatro resíduosde Cisteína na região LRRCT devem estar contidos em três peptídeos trípti-cos - T21 (resíduos 257-267), T24 (resíduos 280-292), e T28 (resíduos 301-323) ligados juntos por duas ligações de dissulfito inter-peptídeo (a massacalculada para este grupo deve ser 5088,68 Da). Os três peptídeos individu-ais, T21, T24 e T28 (Painel inferior da figura 3 e Tabela 1), foram facilmenteidentificados no mapa da digestão reduzida, mas nenhum pico significantecorrespondente a este grupo de peptídeo, T21/T24/T28, foi encontrado nomapa da digestão não-reduzida. Em vez, um pico proeminente com massade 6032,62 Da ocorreu, que corresponde a um grupo de quatro peptídeoscontendo T21, T24, T28 e T30 (resíduos 335-343) ligados por três ligaçõesde dissulfito (massa calculada = 6032,68 Da; painel superior da figura 3, eTabela 2). Desde que os peptídeos T21 e T30 cada contêm dois resíduos deCisteína, uma Cisteína no peptídeo T21 deve formar uma ligação de dissulfi-to com uma no peptídeo T30, embora as ligações exatas não possam serdeterminadas. A análise de mapeamento de peptídeo tríptico também mos-trou que o pico em 19,0 minutos contém os outros dois peptídeos contendoCisteína na região de haste CT, e que eles são ligados por uma ligação dedissulfito entre Cisteína-419 e Cisteína-429 (Tabela 2 e figura 3, painel supe-rior).

Para determinar ligações de dissulfito em complexo T21/T24/T28/T30de peptídeo, o pico contendo os peptídeos ligados por dissulfito no LRRCT e re-gião de haste no mapa de peptídeo tríptico foi coletado, secado sob vácuo, eressuspenso em 10 μΙ de 0,1 M de Tris-HCI, pH 6,5, 1 mM de MgCI2. Cercade 0,02 μg de endo-protease Asp-N (endo-Asp-N, Sequecing Grade, Roche)foi adicionado a 0,6 μg dos peptídeos, após o qual a solução foi incubada àtemperatura ambiente por 6 horas. A digestão foi analisada em um sistemade nano-fluxo LC-MS composto de um nano-fluxo HPLC (NanoAcquity, Wa-ters Corp., Milford, MA) e um espectrômetro de massa Q-TOF Premier (Wa-ters Corp., Milford, MA). Uma coluna de 0,10 mm χ 10 cm Atlantic dCi8(186002831, Waters Corp.) foi usada para a separação com um gradiente de50 minutos (0-70% de acetonitrila) em 0,1% de ácido fórmico a uma taxa defluxo de 400 nL/minuto. A temperatura foi 35°C.

Desde que os peptídeos T21 e T30 cada um contém dois resí-duos de Cisteína, uma Cys no peptídeo T21 deve formar uma ligação dedissulfito com uma no peptídeo (figura 8). Existem oito estruturas de dissulfi-to possíveis para o grupo T21/T24/T28/T30 de peptídeo (figura 8).

Dois picos significantes foram detectados por análise espectro-métrica de massa na digestão não-reduzida (dados não mostrados). MH+detectado 2076,89 (figura 5) no segundo pico equipara o MH+ calculado2076,91 para peptídeo T21 e peptídeo T24 ligado por uma ligação de dissul-fito entre Cisteína-264 e Cisteína-287, conforme visto na estrutura de cristalde NgR1(310). A identidade deste fragmento foi confirmada pela observaçãode íons de fragmentação na fonte (figura 5). O MH+ observado 2879,50 Dano outro pico se equipara ao MH+ calculado 2879,25 Da para o grupo de trêspeptídeos, resíduos 265-267 (derivado de T21), resíduos 305-323 (derivadode T28), e resíduos 335-338 (derivado de T30), ligados por duas ligações dedissulfito inter-peptídeo, que indica que Cisteína-266 e Cisteína-309 na regi-ão LRRCT formam ligações de dissulfito com Cisteína-335 e Cisteína-336 naregião de haste CT (dados não mostrados). A determinação dos empare-Ihamentos de dissulfito exatos, Cisteína-266 e Cisteína-309 com Cisteína-335 e Cisteína-336, neste caso, foi complicada pelo fato que nenhum rea-gente existe que possa clivar o suporte entre Cisteína-335 e Cisteína-336.

O arranjo de emparelhamento de dissulfito no complexoT21/T24/T28/T30 foi adicionalmente elucidado pela sujeição do mesmo aredução parcial com TCEP, seguido por alquilação com NEM e análise pornano-LC-MS. A figura 6 mostra os resultados de nano-fluxo (TIC), e a Tabela3 lista as identidades dos componentes nos picos. Os picos duplos vistospara certos peptídeos são devido aos estereoisômeros gerados por alquila-ção NEM. Os espectros MS/MS são os mesmos para picos individuais emcada par (dados não mostrados). O pico duplo contendo T28/T30 com umaligação de dissulfito e um grupo NES foi coletado de um fracionamento ope-rado em uma coluna de 1 mm χ 150 mm, e adicionalmente analisado em umsistema nano-LCMS/MS após ter sido totalmente reduzido com DTT. A figu-ra 7 mostra os espectros MS/MS do peptídeo T30 contendo um grupo NES.Ambos os íons bi e y8, detectados por seqüenciamento de MS/MS, mostramque o grupo NES está na Cisteína-356, não na Cisteína-366, porque o m/zobservado é 229,08 para b, e 847,38 para y8 (o valor m/z calculado é 229,06para bi e 847,36 para y8, se Cisteína-335 é alquilatada com NEM; o m/z cal-culado é 104,10 para bi e 972,46 para y8, se Cisteína-336 é alquilatada comNEM), que indica que Cisteína-336 forma uma ligação de dissulfito com Cis-teína-309. Conseqüentemente, Cisteína-335 deve ser ligada a Cisteína-266.Ligações de dissulfito experimentalmente determinadas no complexoT21/T24/T28/T30 são mostradas na figura 9. Nossa análise da estrutura dedissulfito no domínio LRRCT de FL-NgRI não somente demonstra que aestrutura de dissulfito prognosticada para a LRRCT de NgR1 é incorreta,mas também identifica uma estrutura de emparelhamento de cisteína alter-nativa. Enquanto não estando ligado pela teoria, acredita-se que a ligaçãode Cys-266 a Cys-309 vista em NgR1(310) é um artefato criado por mutilação.Tabela 2. Peptídeos ligados por dissulfito detectados em um mapa de peptí-deo tríptico da digestão não-reduzida de FL-NgRI piridiletilatado

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Tabela 3. Análise de LC-MS de componentes a partir do grupo de peptídeoparcialmente reduzido NEM-alquilatado T21/T24/T28/T30

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Exemplo 5

Análise das Estruturas de Dissulfito de Proteínas NgR1 e NgR2Produzidas de Construções Diferentes

As estruturas de dissulfito em NgR2(FL)-Fc humano, proteínaNgR1(310) humana, proteína NgR(344) humana, proteína NgR(310) de rato,e proteína de fusão NgRI(344)-ratoFc(lgGI) [ratoNgRI(344)-Fc] foram tam-bém analisadas por mapeamento de peptídeo tríptico. O alinhamento dasseqüências é mostrado na figura 10. A figura 11 mostra os mapas de peptí-deo tríptico para NgR(310) de rato como um exemplo. Os resultados sãoresumidos na Tabela 4 e figura 12. Estas análises mostraram que estruturasde dissulfito em proteínas NgR2(FL)-Fc humana, NgR1(310) de rato e N-gR1(310) humana com falta dos dois resíduos de Cisteína, Cisteína-335 eCisteína-336, na região de haste CT1 são as mesmas conforme visto na es-trutura de cristal de NgR1(310) humano, é que as estruturas de dissulfito nasproteínas NgRI(344)-Fc de rato e NgRI(344) humana que não tem os doisresíduos de Cisteína na região de haste CT são as mesmas conforme vistoem FL-NgRI. A análise espectrométrica de massa mostra os dois resíduosde Cisteína na haste-CT de NgR2(FL)-Fc são ligadas por uma ligação dedissulfito conforme visto em NgR1. A análise também identificou um local deglicosilação O-ligado, Thr-313, no LRRCT de NgR2(FL)-Fc. A ocupação dolocal de glicosilação é cerca de 35%.

Tabela 4. Resumo de análise espectrométrica de massa para estruturas dedissulfito em proteínas NgR1 produzidas de construções diferentes

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Exemplo 6

Ensaio de Crescimento de Neurite

O efeito de polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeo de Nogoreceptor solúveis da invenção no crescimento de neurite é testado pela reali-zação de experimentos com crescimento de células na presença e ausênciade laminin. O crescimento de célula neuronal no meio sem Iaminin é pobre, emodela as condições de estresse neuronais.

Ganglions de raiz dorsais (DRGs) são dissecados de ratos no-vos de 6-7 dias pós-natal (P6-7), dissociados em células simples, e coloca-dos em placas de 96 cavidades pré-revestidas com 0,1 mg/ml de poli-D-Iisina (Sigma®). Em algumas cavidades, 2 μg/ml de laminin é adicionado por2-3 horas, e enxaguadas antes das células serem revestidas. Após uma in-cubação de 18-20 horas, as placas são fixadas com 4% de para-formal-deído, manchadas com anticorpo de coelho anti-Beta-lll-tubulin diluído 1:500(Covancel®), e anti-HuC/D diluído 1: 100 (Sondas Moleculares), e anticorpossecundários fluorescentes (Sondas Moleculares) são adicionados em dilui-ção de 1:200.

O ArrayScan® Il (Cellomics®) pode ser usado para capturar i- magens digitais 5x e para quantificar crescimento de neurite como cresci-mento de neurite médio/neuron por cavidade, pelo uso da aplicação de cres-cimento de Neurite. Imagens suficientes são analisadas para permitir análiseestatística dos resultados.

Em alguns experimentos, um sub-clone de células PC12 (Neu-roscreen) é usado (Cellomics). As células Neuroscreen são pré-diferencia-das por 7 dias com 200 ng/ml de NGF, destacadas e revestidas novamenteem placas de 96 cavidades pré-revestidas com poli-D-lisina. Em algumascavidades, 5 μg/ml de laminin é adicionado por 2-3 horas, e enxaguado an-tes das células serem revestidas. Após 2 dias de incubação, as placas sãofixadas com 4% de para-formaldeído, manchadas com anticorpo de coelho eBeta-Ill tubulin diluído 1:500 (Covancel®) e Hoechst (mancha nuclear). OArrayScan® Il é usado para quantificar crescimento de neurite como nascélulas DRG conforme descrito acima.

Os polipeptídeos NgR1 e fragmentos de polipeptídeo da inven-ção, por exemplo, fragmentos de polipeptídeo NgR1 (309-344), são adiciona-dos em solução em neurons P6-7 DRG, e as células Neuroscreen® diferen-ciadas no tempo de revestimento.O efeito dos polipeptídeo NgR1 ou fragmentos de polipeptídeono crescimento de neurite é acessado.Exemplo 7

Ensaio de Crescimento de Neurite

Lâminas de cultura Lab-Tek® (4 cavidades) são revestidas com0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma). CNS mielin sozinho ou misturado com umpolipeptídeo NgR1 ou fragmento de polipeptídeo da invenção, por exemplo,fragmento de polipeptídeo NgR1 (309-344), são separadamente manchadoscomo gotas de 3μΙ. As microesferas fluorescentes (PoIysciences) são adicio-nadas ao milelin/PBS para permitir identificação tardia nas gotas (Grandpreet al., Nature 403, (2000)). As lâminas Lab-Tek® são, em seguida, enxagua-das e revestidas com 10μ g/ml de Iaminin (Gibco TM).

Ganglions de raiz dorsais (DRGs) de ratos novos P3-4 SpragueDawley são dissociados com 1 mg/ml de colagenase tipo 1 (Worthington)1triturados com pipetas Pasteur polidas no fogo pré-revestidas para enrique-cer nas células neuronais, e finalmente revestidos a 23.000 células/cavidadenas lâminas de cultura Labtek pré-revestidas. O meio de cultura é, por e-xemplo, F12 contendo 5% de soro de cavalo doador inativado quente, 5% desoro bovino fetal inativado quente e 50 ng/ml de mNGF, e incubado a 37°C e5% de C02 por 6 horas.

As lâminas são fixadas por 20 minutos com 4% de paraformalde-ído contendo 20% de sacarose e manchadas para o marcador neuronal antibeta-lll tubulin (Covance TUJ1) diluído 1:500. Conforme o anticorpo anti-camundongo Alexa Fluor® 594 (Sondas Moleculares) é diluído 1:300 e aslâminas são cobertas com Gel/MountTM (BimedaTM). Imagens digitais 5xsuficientes são adquiridas com software OpenLab, e analisadas pelo uso dosoftware MetaMorph® para quantificação de crescimento de neurite.

A capacidade do polipeptídeo NgR1 ou fragmentos de polipeptí-deo para proteger DRG neurons de inibição mediada por mielin de cresci-mento de neurite é acessado.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Biogen Idec MA Inc.Lee, .Daniel H.S.Pepinsky, R. BlakeWen, Dingyi

<120> POLIPEPTÍDEOS NOGO RECEPTOR E FRAGMENTOS DE POLIPEPTÍDEO E USOS DESTES

<130> 2159.065PC01

<140> To Be Assigned<141> 2006-08-25

<150> 60/710,864<151> 2005-08-25

<160> 32

<170> PatentIii version 3 .3

<210> 1<211> 1719<212> DNA

<233> Receptor-IdeNogohumano<400> 1

agcccagcca gagccgggcg gagcggagcg cgccgagcct cgtcccgcgg ccgggccggg 60

gccgggccgt agcggcggcg cctggatgcg gacccggccg cggggagacg ggcgcccgoc 120

ccgaaacgac tttcagtocc cgacgcgccc cgcccaàccc ctacgatgaa gagggcgtcc 1B0'

gctggaggga gccggctgct ggcatgggtg ctgtggctgc aggcctggca ggtggcagcc 240

ccatgcccag gtgcctgcgt atgctacaat gagcccaagg tgacgacaag ctgcccccag 300

cagggcctgc aggctgtgcc cgtgggcatc cctgctgcca gccagcgcat cttcctgcac 360

ggcaaccgca tctcgcatgt gccagctgcc agcttcegtg cctgccgcaa cctcaccatc 420

ctgtggctgc actcgaatgt gctggcccga attgatgcgg ctgccttcac tggcctggcc 480

ctcctggagc agctggacct cagcgataat gcacagctcc ggtctgtgga ccctgccaca 540

ttccacggcc tgggccgcct acacacgctg cacctggacc gctgcggcct gcaggagctg 600

ggcccggggc tgttccgcgg cctggctgcc ctgcagtacc tctacctgca ggacaacgcg 660

ctgcaggcac tgcctgatga caccttccgc gacctgggca acctcacaca cctcttcctg 720

cacggcaacc gcatctccag cgtgcccgag cgcgccttcc gtgggctgca cagcctcgac 780

cgtctcctac tgcaccagaa ccgcgtggcc catgtgcacc cgcatgcctt ccgtgacctt 840

ggccgcctca tgacactcta tctgtttgcc aacaatctat cagcgctgcc cactgaggcc 900

ctggcccccc tgcgtgccct gcagtacctg aggctcaacg acaacccctg ggtgtgtgac 960

tgccgggcac gcccactctg ggcctggctg cagaagttcc gcggctcctc ctccgaggtg 1020ccctgcagcc tcccgcaacg cctggctggc cgtgacctca aacgcctagc tgccaatgac 1080ctgcagggct gcgctgtggc caccggccct taccatccca tctggaccgg cagggccacc 1140gafcgaggagc cgctggggct tcccaagtgc tgccagccag atgccgctga caaggcctca 1200gtactggagc ctggaagacc agcttcggca ggcaatgcgc tgaagggacg cgtgccgccc 1260ggtgacagcc cgccgggcaa cggctctggc ccacggcaca tcaatgactc accctttggg 1320actctgcctg gctctgetga gcccccgctc actgcagtgc ggcccgaggg ctccgagcca 1380ccagggttcc ccacctcggg ccctcgccgg aggccaggct gttcacgcaa gaaccgcacc 1440cgcagccact gccgtctggg ccaggcaggc agcgggggtg gcgggactgg tgactcagaa 1500ggctcaggtg ccctacccag cctcacctgc agcctcaccc ccctgggcct ggcgctggtg 1560ctgtggacag tgcttgggcc ctgctgaccc ccagcggaca caagagcgtg ctcagcagcc 1620aggtgtgtgt acatacgggg tctctctcca cgccgccaag ccagccgggc ggccgacccg 1680tggggcaggc caggccaggt cctccctgat ggacgcctg 1719

<210> 2

<211> 473<212> PRT<213> NgR-1 humano

<400> 2

Met Lys Arg Ala Ser Ala Glv Qly Ser Arg Leu Leu Ala Xrp Val Leu1 5 10 15

Trp Iieu Gln Ala Trp Gln Val Ala Ala Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val20 25 30

Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln Gly Leu35 40 45

Gln Ala Val Pro Val Gly Ile Pro Ala Ala Ser Gln Arg Ile Phe Leu50 55 60

His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Arg Ala Cys65 70 75 80

Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser Asn Val Leu Ala Arg Ile85 90 95

Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Ala Leu Leu Glu Gln Leu Asp Leu100 105 HOSer Asp Asn Ala Gln Leu Arg Ser Val Asp Pro Ala Thr Phe Hia Gly115 120 125

Leu Gly Arg Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Gln Glu130 135 140

Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr145 150 155 160

Leu Gln Asp Asn Ala Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asp Thr Phe Arg Asp165 170 175

Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Ser Ser180 185 190

Val Pro Glu Arg Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu195 200 205

Leu His Gln Asn Arg Val Ala His Val His Pro His Ala Phe Arg Asp210 215 220

Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Léu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Ala225 230 235 240

Leu Pro Thr Glu Ala Leu Ala Pro Leu Arg Ala Leu Gln Tyr Leu Arg245 250 255

Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp260 265 270

Ala Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Ser275 280 285

Leu Pro Gln Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Asn290 295 300

Asp Leu Gln Gly Cys Ala Val Ala Thr Gly Pro Tyr His Pro Ile Trp305 310 315 320

Thr Gly Arg Ala Thr Asp Glu Glu Pro Leu Gly Leu Pro Lys Cys Cys325 330 335

Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala Ser Val Leu Glu Pro Gly Arg Pro340 345 350

Ala Ser Ala Gly Asn Ala Leu Lys Gly Arg Val Pro Pro Gly Asp Ser355 360 365

Pro Pro Gly Asn Gly Ser Gly Pro Arg His Ile Asxi Asp Ser Pro Phe370 375 380

Gly Thr Leu Pro Gly Ser Ala Glu Pro Pro Leu Thr Ala Val Arg Pro385 390 395 400

Glu Gly Ser Glu Pro Pro Gly Phe Pro Thr Ser Gly Pro Arg Arg Arg405 410 415

Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg Ser His Cys Arg Leu Gly420 425 430

Gln Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Glu Gly Ser Gly435 440 445

Ala Leu Pro Ser Leu Thr Cys Ser Leu Thr Pro Leu Gly Leu Ala Leu450 455 460

Val Leu Trp Thr Val Leu Gly Pro Cys465 470

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<2i3> Seqüência Artificial<220>

<223> "Ligante" sintético

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15

<210> 4<211> 15<212> PRT

<2i3> Seqüência Artificial<220>

<223> "Ligante" sintético<400> 4

Glu Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser15 10 15

<210><211><212> PRT

<213 > Seqüência Artificial<220>

<223> "Ligante" sintético<400> 5

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr1 5 10

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> "Ligante" sintético

<400> 6

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln1 5 10 15

<210> 7

<211> 14

<212> PRT<213>

Seqüência Artificial<220>

<223> "Ligante" sintético

<400> 7

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp1 5 10

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<2i3> Seqüência Artificial<220>

<223> "Ligante" sintético

<400> 8

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly1 5 10

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> "Ligante" sintético<400> 9

Lys Glu Ser Gly Ser Val ser Ser Glu Gln Leu JVla Gln Phe Arg Ser15 10 15

Leu Asp

<210> 10<211> 16<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> "Ligante" sintético<400> 10

Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu AspX 5 10 15

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<22 3 > Etiqueta de epitopo sintética usada para identificar, purificar, concentrar ou isolar o polipeptideoNgR

<400> 11

Asp Tyr Lys Asp Aep Asp Asp Lys1 . 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<2i3> Seqüência Artificial<220>

<223> Etiqueta de epitopo sintética

<400> 12

Asp Tyr Lys Asp Glu Asp Asp Lys1 5

<210> 13

<211> 9

<212 > PRT

<2i3> Seqüência Artificial<220>

<223> Etiqueta de epitopo sintética<400> 13

Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly1 5

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<2ΐ3> Seqüência Artificial<220>

<223> Etiqueta de epitopo sintética

<400> 14

Tyr Thr Asp Xle Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys1 5 10

156

PRT

Seqüência Artificial<220>

< 2 2 3 > Etiqueta de epitopo sintética

<400 > 15

His His His His His His1 5

1613PRT

Hemaglutinina (HA) vírus influenza<400> 16'

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ile Glu Gly Arg1 5 10

<210><211><212 ><213>

<210><211><212 ><213>

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213 > c-myc humano 9Myc)

<400> 17

Glu Gln Lys Leu Leu Ser Glu Glu Asp Leu Asn1 5 10

<210> 18

<211> 13

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Digestão triptica de NgR-1

<400> 18

Leu Cys Pro Gly Ala Cys Val Cys Tyr Asn Glu Pro Lys1 5 10

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> Digestão triptica de NgR-1

<400> 19

Asp Asn Pro Trp Val Cys

<210> 20

<211> 13

<212> PRT

<2i3> Seqüência Artificial<220>

<223> Digestão triptica de NgR-1

<400> 20

Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Ser Leu Pro Gln Arg1 5 10

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Digestão triptica de NgR-1

<400> 21

Cys Cys Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys1 5

<210> 22

<211> 412

<212> PRT

<213> Human KgR-I

<400> 22

Cys Pro Gly Ala Cys Val Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Tlir Ser15 10 15Cys Pro Gln Gln Gly Leu Gln Ala Val Pro Val Gly Ile Pro Ala Ala20 25 30

Ser Gln Arg Ile Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala35 40 45

Ala Ser Phe Arg Ala Cys Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser50 55 60

Asn Val Leu Ala Arg Ile Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Ala Leu65 70 75 80

Leu Glu Gln Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Gln Leu Arg Ser Val Asp85 90 95

Pro Ala Thr Phe His Gly Leu Gly Arg Leu His Thr Leu His Leu Asp100 105 110

Arg Cys Gly Leu Gln Glu Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala115 120 125

Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr Leu Gln Asp Asn Ala Leu Gln Ala Leu Pro130 135 140

Asp Asp Thr Phe Arg Asp Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His145 150 155 160

Gly Asn Arg Ile Ser Ser Val Pro Glu Arg Ala Phe Arg Gly Leu His165 170 175

Ser Leu Asp Arg Leu Leu Leu His Gln Asn Arg Val Ala His Val His180 185 190

Pro His Ala Phe Arg Asp Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe195 200 205

Ala Asn Asn Leu Ser Ala Leu Pro Thr Glu Ala Leu Ala Pro Leu Arg210 215 220

Ala Leu Gln Tyr Leu Arg Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys225 230 235 240

Arg Ala Arg Pro Leu Trp Ala Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser245 250 255Ser Glu Val Pro Cys Ser Leu Pro Gln Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu260 265 270

Lys Arg Leu Ala Ala Asn Asp Leu Gln Gly Cys Ala Val Ala Thr Gly275 280 285

Pro Tyr His Pro Ile Trp Thr Gly Arg Ala Thr Asp Glu Glu Pro Leu290 295 300

Gly Leu Pro Lys Cys Cys Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala Ser Val305 310 315 320

Leu Glu Pro Gly Arg Pro Ala Ser Ala Gly Asn Ala Leu Lys Gly Arg325 330 335

Val Pro Pro Gly Asp Ser Pro Pro Gly Asn Gly Ser Gly Pro Arg His340 345 350

Ile Asn Asp Ser Pro Phe Gly Thr Leu Pro Gly Ser Ala Glu Pro Pro355 360 365

Leu Thr Ala Val Arg Pro Glu Gly Ser Glu Pro Pro Gly Phe Pro Thr370 375 380

Ser Gly Pro Arg Arg Arg Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg385 390 395 400

Ser His Cys Arg Leu Gly Gln Ala Gly Ser Gly Gly405 410

<210> 23<211> 473<212> PRT<213> Rat NgRl<400> 23

Met Lys Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu15 10 15

Trp Leu Gln Ala Trp Arg Val Ala Thr Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val20 25 '30

Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln Gly Leu35 40 45

Gln Ala Val Pro Thr Gly He Pro Ala Ser Ser Gln Arg Ile Phe Leu50 55 60

His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Gln Ser Cys65 70 75 80

Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser Asn Ala Leu Ala Arg Ile85 90 95

Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Thr Leu Leu Glu Gln Leu Asp Leu100 105 110

Ser Asp Asn Ala Gln Leu His Val Val Asp Pro Thr Thr Phe His Gly115 120 125

Leu Gly His Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Arg Glu130 135 140

Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr145 150 155 160

Leu Gln Asp Asn Asn Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asn Thr Phe Arg Asp165 170 175

Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Pro Ser180 185 190

Val Pro Glu His Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu195 200 205

Leu His Gln Asn His Val Ala Arg Val His Pro His Ala Phe Arg Asp210 215 220

Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Met225 230 235 240

Leu Pro Ala Glu Val Leu Met Pro Leu Arg Ser Leu Gln Tyr Leu Arg245 250 255

Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp260 265 270

Ala Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Asn275 280 285

Leu Pro Gln Arg Leu Ala Asp Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Ser290 295 300Met Leu Cys Thr Cys Tyr Ser Ser Pro Pro Thr Val Ser Cys Gln Ala35 40 45

Asn Asn Phe Ser Ser Val Pro Leu Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Arg50 55 60

Leu Phe Leu Gln Asn Asn Leu Xle Arg Thr Leu Arg Pro Gly Thr Phe65 70 75 80

Gly Ser Asn Leu Leu Thr Leu Trp Leu Phe Ser Asn Asn Leu Ser Thr85 90 95

Ile Tyr Pro Gly Thr Phe Arg His Leu Gln Ala Leu Glu Glu Leu Asp100 105 no

Leu Gly Asp Asn Arg His Leu Arg Ser Leu Glu Pro Asp Thr Phe Gln115 120 125

Gly Leu Glu Arg Leu Gln Ser Leu His, Leu Tyr Arg Cys Gln Leu Ser130 135 X40

Ser Leu Pro Gly Asn Ile Phe Arg Gly Leu Val Ser Leu Gln Tyr Leu145 150 155 160

Tyr Leu Gln Glu Asn Ser Leu Leu His Leu Gln Asp Asp Leu Phe Ala165 170 X75

Asp Leu Ala Asn Leu Ser His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Leu Arg180 X85 X90

Leu Leu Thr Glu His Val Phe Arg Gly Leu Gly Ser Leu Asp Arg Leu195 200 205

Leu Leu His Gly Asn Arg Leu Gln Gly Val His Arg Ala Ala Phe Arg210 2X5 220

Gly Leu Ser Arg Leu Thr Ile Leu Tyr Leu Phe Asn Asn Ser Leu Ala225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Glu Ala Leu Ala Asp Leu Pro Ser Leu Glu Phe Leu245 250 255

Arg Leu Asn Ala Asn Pro Trp Ala Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu260 265 270

Trp Ala Trp Phe Gln Arg Ala Arg Val Ser Ser Ser Asp Val Thr Cys275 280 285

Ala Thr Pro Pro Glu Arg Gln Gly Arg Aap Leu Arg Ala Leu Arg Glu290 295 300

Ala Asp Plie Gln Ala Cys Pro Pro Ala Ala Pro Thr Arg Pro Gly Ser305 310 315 320

Arg Ala Arg Gly Asn Ser Ser Ser Asn His Leu Tyr Gly Val Ala Glu325 330 335

Ala Gly Ala Pro Pro Ala Asp Pro Ser Thr Leu Tyr Arg Asp Leu Pro340 345 350

Ala Glu Asp Ser Arg Gly Arg Gln Gly Gly Asp Ala Pro Thr Glu Asp355 360 365

Asp Tyr Trp Gly Gly Tyr Gly Gly Glu Asp Gln Arg Gly Glu Gln Met370 375 380

Cys Pro Gly Ala Ala Cys Gln Ala Pro Pro Asp Ser Arg Gly Pro Ala385 390 395 400

Leu Ser Ala Gly Leu Pro Ser Pro Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Val405 410 415

Pro His His Leu420

<210> 25

<211> 1422

<212> DNA

< 213 > Receptor-1 Nogo de rato

<400> 25

atgaagaggg cgtcctccgg aggaagccgg ctgccgacat gggtgttatg gctacaggcc 60tggagggtag caacgccctg ccctggtgcc tgtgtgtgct kcaatgagcc caaggtcaca 12 0acaagccgcc cccagcaggg cctgcaggct gtacccgctg gcatcccagc ctccagccag 180agaatcttcc tgcacggcaa ccgaatctct tacgtgccag ccgccagctt ccagtcatgc 240cggaatctca ccatcctgtg gctgcactca aatgcgctgg ccgggattga tgccgcggcc 300ttcactggtc tgaccctcct ggagcaacta gatcttagtg acaatgcaca gctccgtgtc 360gtggacccca ccacgttccg tggcctgggc cacctgcaca cgctgcacct agaccgatgc 420ggcctgcagg agctggggcc tggcctattc cgtgggctgg cagctctgca gtacctctac 480ctacaagaca acaacctgca ggcacttccc gacaacacct tccgagacct gggcaacctc 540acgcatctct ttctgcatgg caaccgtatc cccagtgttc ctgagcacgc tttccgtggc 600ttgcacagtc ttgaccgtct cctcttgcac cagaaccatg tggctcgtgt gcacccacat 660gccttccggg accttggccg actcatgacc ctctacctgt ttgccaacaa cctctccatg 720ctccccgcag aggtcctagt gcccctgagg tctctgcagt acctgcgact caatgacaac 780ccctgggtgt gtgactgcag ggcacgtccg ctctgggcct ggctgcagaa gttccgaggt 840tcctcatccg gggtgcccag caacctaccc caacgcctgg caggccgtga tctgaagcgc 900ctggctacca gtgacttaga gggttgtgct gtggcttcgg ggcccttccg tcccttccag 960accaatcagc tcactgatga ggagctgctg ggcctcccca agtgctgcca gccggatgct 1020gcagacaagg cctcagtact ggaacccggg aggccggcgt ctgttggaaa tgcactcaag 1080ggacgtgtgc ctcccggtga cactccacca ggcaatggct caggcccacg gcacatcaat 1140gactctccat ttgggacttt gcccggctct gcagagcccc cactgactgc cctgcggcct 1200gggggttccg agcccccggg actgcccacc acgggccccc gcaggaggcc aggttgttcc 1260agaaagaacc gcacccgtag ccactgccgt ctgggccagg caggãagtgg gagcagtgga 1320actggggatg cagaaggttc gggggccctg cctgccctgg cctgcagcct tgctcctctg 1380ggccttgcac tggtactttg gacagtgctt gggccctgct ga 1422

<210> 26

<211> 1263

<212> DNA

<213> Receptor-2 Nogo de humano

<400> 26

atgctgcccg ggctcaggcg cctgctgcaa gctcccgcct cggcctgcct cctgctgatg 60ctcctggccc tgcccctggc ggcccccagc tgccccatgc tctgcacctg ctactcatcc 120ccgcccaccg tgagctgcca ggccaacaac ttctcctctg tgccgctgtc cctgccaccc 180agcactcagc gactcttcct gcagaacaac ctcatccgca cgctgcggcc aggcaccttt 240gggtccaacc tgctcaccct gtggctcttc tccaacaacc tctccaccat ctacccgggc 300actttccgcc acttgcaagc cctggaggag ctggacctcg gtgacaaccg gcacctgcgc 360tcgctggagc ccgacacctt ccagggcctg gagcggctgc agtcgctgca tttgtaccgc 420tgccagctca gcagcctgcc cggcaacatc ttccgaggcc tggtcagcct gcagtacctc 480tacctccagg agaacagcct gctccaccta caggatgact tgttcgcgga cctggccaac 540ctgagccacc tcttcctcca cgggaaccgc ctgcggctgc tcacagagca cgtgtttcgc 600ggcctgggca gcctggaccg gctgctgctg cacgggaacc ggctgcaggg cgtgcaccgc 660gcggccttcc gcggcctcag ccgcctcacc atcctctacc tgttcaacaa cagcctggcc 720

tcgctgcccg gcgaggcgct cgccgacctg ccctcgctcg agttcctgcg gctcaacgct 780

aacccctggg cgtgcgactg ccgcgcgcgg ccgctctggg cctggttcca gcgcgcgcgc 840

gtgtccagct ccgacgtgac c^gcgccacc cccccggagc gccagggccg agacctgcgc 900

gcgctccgcg aggccgactt ccaggcgtgt ccgcccgcgg cacccacgcg gccgggcagc 960

cgcgcccgcg gcaacagctc ctccaaccac ctgtacgggg tggccgaggc cggggcgccc 1020

ccagccgatc cctccaccct ctaccgagat ctgcctgccg aagactcgcg ggggcgccag 1080

ggcggggacg cgcctactga ggacgactac tgggggggct acgggggtga ggaccagcga 1140

ggggagcaga tgtgccccgg cgctgcctgc caggcgcccc cggactcccg aggccctgcg 1200

ctctcggccg ggctccccag ccctctgctt tgcctcctgc tcctggtgcc ccaccacctc 12 60

tga 1263

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

< 213 > Seqüência Artificial<220>

<223> Digestão tríptica de NgR-1

<40o> 27

Leu Asn Asp Asn Pro Trp Vai Cys Asp Cys Arg1 5 10

<210> 28

<211> 9

<212>. PRT

<2i3> Seqüência Artificial<220>

<223> Digestão tríptica de NgR-1

<400> 28

Cys Cys Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys1 5

<210> 29

<211> 23

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Digestão tríptica de NgR-1

<400> 29Leu Ala Ala Asn Asp Leu Gln Gly Cys Ala Val AIa Thr Gly Pro Tyr1 5 10 15

His Pro Ile Trp Thr Gly Arg20

<210> 30

<211> 13

<212 > PHT

<2i3> Seqüência Artificial<220>

<223> Digestão tríptica de rato NgR-1

<400> 30

Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Asn Leu Pro Gln Arg1 5 10

<210> 31<211> 11<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Digestão tríptica de rato NgR-1<400> 31Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys 1 5 10<210> 32<211> 10<212> PRT<213 > Seqüência Artificial<220> <223 > Digestão tríptica de rato NgR-1<400> 32

Leu Ala Ala Ser Asp Leu Gln Gly Cys Ala1 5 10

Claims (39)

1. Fragmento de polipeptídeo isolado de 40 resíduos ou menos,compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica aos aminoácidos309 a 344 de SEQ ID NO:2; exceto para até três substituições de aminoácido.

2. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1,no qual pelo menos uma das referidas substituições de aminoácido é produ-zida em um resíduo de cisteína a partir do grupo consistindo em C309, C335e C336.

3. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2,no qual referido resíduo de cisteína é C309.

4. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2,no qual referido resíduo de cisteína é C335.

5. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2,no qual referido resíduo de cisteína é C336.

6. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 5, no qual referido resíduo de cisteína é substituído comum aminoácido diferente selecionado a partir do grupo consistindo em: ala-nina, serina ou treonina.

7. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 6,no qual referido amino ácido diferente é alanina.

8. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 -7, que é cíclico.

9. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8,compreendendo adicionalmente uma primeira molécula ligada no terminal-Ne uma segunda molécula ligada no terminal-C; no qual referida primeira mo-lécula e referida segunda molécula são unidas uma à outra para formar refe-rida molécula cíclica.

10. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 9,no qual referidas primeira e segunda moléculas são selecionadas a partir dogrupo consistindo em: uma molécula de biotin, um resíduo de cisteína, e umresíduo de cisteína acetilatada.

11. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação-10, no qual referida primeira molécula é uma molécula de biotin fixada aoterminal-N, e a referida segunda molécula é um resíduo de cisteína fixado aoterminal-C de referido polipeptídeo.

12. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação-10, no qual a referida primeira molécula é um resíduo de cisteína acetilatadofixado ao terminal-N, e referida segunda molécula é um resíduo de cisteínafixado ao terminal-C de referido polipeptídeo.

13. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com qualquer umadas reivindicações 10 a 12, no qual referida cisteína de terminal-C tem uma porção de NH2 fixada.

14. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 13, fundido a um polipeptídeo heterólogo.

15. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação-14, no qual referido polipeptídeo heterólogo é albumina de soro.

16. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação-14, no qual referido polipeptídeo heterólogo é uma região Fc.

17. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação-14, no qual referido polipeptídeo heterólogo é um peptídeo de sinal.

18. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação-14, no qual referido polipeptídeo heterólogo é uma etiqueta de polipeptídeo

19. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação-16, no qual a referida região Fc é selecionada a partir do grupo consistindoem: uma região IgA Fc; uma região IgD Fe; uma região IgG Fc; uma regiãoIgEFc; e uma região IgM Fc.

20. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação-18, no qual referida etiqueta de polipeptídeo é selecionada a partir do grupoconsistindo em: etiqueta FLAG; etiqueta Strep; etiqueta poliistidina; etiquetaVSV-G; etiqueta de vírus da gripe hemaglutinin (HA); e etiqueta c-Myc.

21. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 20, no qual o referido polipeptídeo é fixado a uma oumais porções de polialquileno glicol.

22. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação-21, no qual a referida uma ou mais porções de polialquileno glicol é umaporção de polietileno glicol (PEG).

23. Fragmento de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação-22, no qual referido polipeptídeo é fixado a 1 a 5 porções de PEG.

24. Polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência denucleotídeo que codifica um fragmento de polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 23.

25. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 24, no qual areferida seqüência de nucleotídeo é operávelmente ligada a um elemento decontrole de expressão.

26. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 25, no qualreferido elemento de controle de expressão é selecionado a partir do grupoconsistindo em: um promotor induzível, um promotor constitutivo, e um sinalde secreção.

27. Vetor compreendendo o polinucleotídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 24 a 26.

28. Célula hospedeira compreendendo o vetor como definido nareivindicação 27.

29. Composição farmacêutica compreendendo o fragmento depolipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, eum veículo farmaceuticamente aceitável.

30. Composição farmacêutica compreendendo o polinucleotídeocomo definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 26, e um veículofarmaceuticamente aceitável.

31. Composição farmacêutica compreendendo o vetor como de-finido na reivindicação 27, ou a célula hospedeira como definido na reivindi-cação 28, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

32. Método de promover desenvolvimento de neurite compreen-dendo contactar um neurônio com um agente selecionado a partir do grupoconsistindo em:(a) o fragmento de polipeptídeo como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 23;(b) o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivin-dicações 24 a 26; e(c) a composição como definido em qualquer uma das reivindi-cações 29 a 31;no qual referido agente inibe inibição de desenvolvimento deneurite mediado por Nogo receptor-1.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, no qual referidoneurônio está em um mamífero.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, no qual referidomamífero é um ser humano.

35. Método de inibir transdução de sinal por complexo de sinali-zação de NgR1, compreendendo contactar um neurônio com uma quantida-de eficaz de um agente selecionado a partir do grupo consistindo em:(a) o fragmento de polipeptídeo de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 23;(b) o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 24 a 26; e(c) a composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 29 a 31;no qual referido agente inibe a transdução de sinal pelo comple-xo de sinalização de NgR1.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, no qual referidoneurônio está em um mamífero.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, no qual referidomamífero é um ser humano.

38. Método de tratar uma doença, enfermidade ou dano do sis-tema nervoso central (CNS), em um mamífero, compreendendo administrara um mamífero em necessidade de tratamento uma quantidade eficaz de umagente selecionado a partir do grupo consistindo em:(a) o fragmento de polipeptídeo como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 23;(b) o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivin-dicações 24 a 26; e(c) a composição como definido em qualquer uma das reivindi-cações 29 a 31;no qual referido agente inibe inibição de desenvolvimento deneurite mediado por Nogo receptor-1.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, no qual referidadoença, enfermidade ou dano é selecionada a partir do grupo consistindoem esclerose múltipla, ALS, doença de Huntington, doença de Alzheimer,doença de Parkinson, neuropatia diabética, acidente vascular cerebral, da-nos traumáticos do cérebro, dano da medula espinal, neurite ótica, glauco-ma, perda de audição, e Ieucodistrofia adrenal.