CN111053761A

CN111053761A - 一种吸入用双膦酸类药物及其制备方法及其在慢性阻塞性肺疾病的用途

Info

Publication number: CN111053761A
Application number: CN202010048692.2A
Authority: CN
Inventors: 陈燃; 粟波; 褚梦思; 陆泉
Original assignee: Hangzhou Dancheng Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Dancheng Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2020-04-24
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111053761B

Abstract

本发明公开了一种吸入用双膦酸类药物及其制备方法及其在慢性阻塞性肺疾病的用途，药物溶液配方包括：双膦酸类药物，pH调节剂，渗透压调节剂，pH值范围为8.2‑8.9，渗透压为等渗或高渗；优选的pH调节剂和渗透压调节剂为碳酸氢盐，以细胞外应用浓度计，双膦酸类药物含量为0.1μM‑100μM，碳酸氢盐的含量为1.5％(w/v)‑4.0％(w/v)；本发明研究出的药物剂量既有效又安全，能满足慢阻肺等病症的临床用药需求。

Description

一种吸入用双膦酸类药物及其制备方法及其在慢性阻塞性肺疾病的用途

技术领域

本发明涉及药物制剂技术领域，特别是一种吸入用双膦酸类药物及其制备方法和用途。

背景技术

双膦酸类药物(bisphosphonates，BPs)，又称双膦酸盐或二膦酸盐，是用于各类骨疾患及钙代谢性疾病的双膦酸类药物，主要包括利塞膦酸钠(risedronate)、阿仑膦酸钠(alendronate)、伊班膦酸钠(ibandronate)、和唑来膦酸(zoledronic acid、zoledronate)等。其中，利塞膦酸钠和阿仑膦酸钠以口服片剂为主，剂量5mg/日(体重约50kg，下同)或35mg/周，主要循细胞旁路通道吸收，吸收较慢且非常有限，口服生物利用度很低(约0.6％)，且易致消化道功能紊乱，如吞咽困难、消化道溃疡等。伊班膦酸钠和唑来膦酸的不良反应较为严重，目前以静脉注射液为主，剂量不超过4mg/次/4周。双膦酸类药物在体内不代谢，入血后半衰期较短，约为1.5h，绝大部分通过肾脏排泄消除，剩余部分通过与骨质中的羟基磷灰石特异结合集中于骨组织中。传统药效是通过抑制破骨细胞活性而抑制骨质吸收，适应症包括骨质疏松症、变形性骨炎、恶性肿瘤骨转移引起的高钙血症和骨痛症等。吸入给药能提高阿仑膦酸钠或利塞膦酸钠的生物利用度约3.5倍，且有可能降低毒副作用和改善用药顺应性。近年来的研究发现，该类药物在肺部给药后能通过抑制肺部巨噬细胞而缓解慢性阻塞性肺疾病的气道炎症和肺气肿症状，但给药剂量较高，超出通常口服剂量，此类适应症尚未得到认可。由于该类药物为酸性小分子，不能自由扩散进入细胞，而其作用靶点Farnesyl pyrophosphate synthase(法尼酰焦磷酸合酶，FDPS)在细胞内，因此，主要循胞饮和吞噬作用进入和作用于破骨细胞和巨噬细胞等具有活跃胞饮和吞噬作用的细胞。

慢性阻塞性肺疾病(简称：“慢阻肺”或“COPD”)，包括了绝大部分的慢性支气管炎和肺气肿，是以不完全可逆的气流阻塞为特征的慢性肺部疾病，常表现为反复发作的咳嗽、咳痰、呼吸困难(包括：喘息、气短，等)症状，通常呈现出进行性进展的特点，随着疾病发展，导致气道重构，最终发展为不可逆性气流阻塞乃至肺功能衰竭。慢阻肺在全球范围内严重威胁着公众的健康。据世界卫生组织估计，目前全球已有2.1亿慢阻肺患者，在中国约8000万-1亿人。支气管扩张药是慢阻肺治疗的首选药物，主要包括抗胆碱能制剂和β2受体激动剂。具体选择使用上有所区别：噻托溴铵(Tiotropium Bromide)是当前最有代表性的抗胆碱能制剂，药效平缓，无耐药性问题，是慢阻肺平稳期的首选支气管舒张剂(2017年版慢性阻塞性肺疾病诊断、治疗和预防全球策略，GOLD2017)，但其气道扩张效果较缓慢和不明显，主要用于慢阻肺平稳期患者长期坚持每日用药，预防出现呼吸困难症状，而不适用于慢阻肺加重期患者即已出现呼吸困难症状的快速缓解。我国国民慢阻肺知晓率低，肺功能检查率低，诊断率低，尤其是早期诊断率非常低，多数患者已出现呼吸困难等严重症状才来医院就诊，使得噻托溴铵的应用具有很大的局限性。β2受体激动剂(包括沙丁胺醇Salbutamol、沙美特罗Salmeterol、福莫特罗Frmoterol等)，尤其沙丁胺醇等短效β2受体激动剂(SABA)，气道扩张药效强烈且迅速，能够快速缓解呼吸困难症状，适合慢阻肺患者病情急性发作时使用，但存在明显的心脏和中枢神经系统兴奋的副作用，长期用药还存在药效下降的耐药性问题。慢性气道炎症和肺气肿是慢阻肺的病因本质性症状，但目前缺乏能有效改善慢阻肺气道炎症和肺气肿病理状况的治疗药物。吸入糖皮质激素对慢阻肺的疗效不确定，且存在诱发肺炎的风险。因此，GOLD2017不主张任何程度的慢阻肺患者单独吸入糖皮质激素治疗，也不主张轻度和中度慢阻肺患者吸入糖皮质激素，仅推荐重度和极重度慢阻肺患者联合使用长效支气管舒张剂和吸入糖皮质激素。

双膦酸类药物的吸入剂型及慢阻肺治疗用途，国内外虽已有公开报道，例如：中国发明专利CN101522032A公开了二膦酸联合黏膜保护剂吸入制剂的粒径及喷雾器或雾化器中用药；美国专利US2016/0039852A1公开了二膦酸盐化合物可用作保护非癌性细胞对抗损害的细胞保护剂，所述损害可以与哮喘、慢阻肺等情况有关，可以以喷雾剂等形式应用；我们团队的中国发明专利CN105640924A、中国发明专利申请案201710786546.8、201710787763.9、201710787215.6等，分别公开了阿仑膦酸钠、伊班膦酸钠、利塞膦酸钠、唑来膦酸等4种双膦酸类药物吸入制剂的制备与用途等；但这些专利文献资料均未有描述如何促进双膦酸类药物在肺部吸收利用和驻留及有效安全剂量，缺少可以优化应用于支气管扩张(肺功能改善)用途的配方工艺、剂量、用药次数、疗程、疗程持续性、安全性限制等重要参数，未有指出要将双膦酸类药物溶液调节至碱性及等渗或高渗给药。理论上，酸性或中性pH环境下双膦酸解离度较低，有助于促进其吸收利用，因此，现有双膦酸类药物雾化吸入都是直接用其呈酸性的干粉或初始溶液或溶于PBS中性缓冲液。其它公开发表的研究也是如此，未能解决肺部给药剂量较大的瓶颈，安全性和临床实用性存疑，如：Katsumi等(2010)在《International Journal of Pharmaceutics》、Sultana等(2013)在《EnvironmentalToxicology and Pharmacology》分别报道了阿仑膦酸钠PBS溶液和阿仑膦酸钠乙醇盐溶液雾化吸入给药，但剂量均＞1mg/kg(约相当于支气管内＞33mM)，远超常规口服剂量(5mg/50kg)。Ueno等(2015)报道了对肺气肿小鼠进行阿仑膦酸钠或利塞膦酸钠肺部给药能够改善肺气肿症状，但剂量为3.25μg阿仑膦酸钠或3.5μg利塞膦酸钠/小鼠，约8mg/50kg(约相当于支气管内5.3mM)，超出常规口服剂量(5mg/50kg)。我们在中国发明专利CN105640924A、中国发明专利申请案201710786546.8、201710787763.9、201710787215.6的相关研究中发现对COPD大鼠或小鼠进行大剂量的干粉或溶于PBS的双膦酸类药物吸入给药(≥1.5mg/kg，约相当于支气管内≥50mM)，在5min之内即可迅速促进气道舒张，但1.5mg/kg的剂量远高于该类药物常规口服安全用量(＜0.1mg/kg)。由于双膦酸类药物等水溶性化合物通常循细胞旁路吸收，吸收非常有限且缓慢，吸收半衰期一般约为45～70min，并不能迅速抵达支气管平滑肌细胞内发挥气道扩张功效，因此，我们推测在肺部存在一种双膦酸类药物快速诱发支气管扩张的新机制。对于该机制的深入挖掘，有助于提供方案解决剂量过大的问题。

综上所述，现有公开的双膦酸类药物吸入给药报道，或没有明确所使用的剂量或剂量过大而存在安全性问题。吸入疗法将药物经雾化后吸入呼吸系统，在气道局部沉降形成较高浓度，直接作用于气道表面，并可从气道黏膜和肺部直接吸收，迅速发挥药理作用，一般要求剂量显著低于常规口服剂量以保证其安全性。如何将双膦酸类药物吸入给药的有效剂量降低至安全用量范围之内，是一个亟待攻克的难题。该问题的解决可以更好地满足慢阻肺、骨质疏松症等病症的临床用药需求，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种吸入用双膦酸类药物及其制备方法及其在慢性阻塞性肺疾病的用途，本发明通过研究找到一种能够有效满足慢阻肺病症的临床用药需求，且吸入给药的有效剂量降低至安全用量范围之内的吸入用双膦酸类药物。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种吸入用双膦酸类药物，组成包括：双膦酸类药物，pH调节剂，渗透压调节剂；pH值范围为8.2-8.9，渗透压为等渗或高渗。

前述的一种吸入用双膦酸类药物，pH调节剂为氢氧化钠，在细胞外应用浓度为8.0μM；渗透压调节剂为氯化钠，在细胞外应用浓度为150mM-200mM。

前述的一种吸入用双膦酸类药物，双膦酸类药物包括：利塞膦酸钠，阿仑膦酸钠，在细胞外应用浓度为0.1μM-100μM。

前述的一种吸入用双膦酸类药物，pH调节剂为甘氨酸-氢氧化钠，在细胞外应用浓度为甘氨酸50mM、氢氧化钠4mM；渗透压调节剂为氯化钠，在细胞外应用浓度为150mM。

前述的一种吸入用双膦酸类药物，pH调节剂和渗透压调节剂为碳酸氢盐；碳酸氢盐在细胞外应用浓度为1.5％(w/v)-6.0％(w/v)。

前述的一种吸入用双膦酸类药物，为在药用纯化水或注射用水中溶有0.004％(w/v)利塞膦酸钠，4.0％(w/v)碳酸氢钠。

前述的一种吸入用双膦酸类药物，为在药用纯化水或注射用水中溶有0.004％(w/v)阿仑膦酸钠，4.0％(w/v)碳酸氢钠。

前述的一种吸入用双膦酸类药物，为将利塞膦酸钠和碳酸氢钠按1∶500质量比混合加工成干粉，按100mg分装，在使用前加入5ml注射用水溶解使用或按100mg/5ml直接加到细胞外溶液中使用。

一种吸入用双膦酸类药物的制备方法，在配制罐中加入80％总体积的药用纯化水，加入按处方量称取的0.004％(w/v)利塞膦酸钠或阿仑膦酸钠和4.0％(w/v)碳酸氢钠或碳酸氢钾，搅拌至溶解，定容，依次经无菌过滤，包装。

一种吸入用双膦酸类药物在慢性阻塞性肺疾病的用途，吸入用双膦酸类药物，包括：双膦酸类药物，碳酸氢钠；双膦酸类药物在水溶液含量为0.004％(w/v)，pH值范围为8.2-8.5，渗透压为等渗或高渗；单剂量雾化吸入制剂单次用药剂量为5ml/50kg，能迅速改善肺功能动态顺应性，降低气道阻力。

本发明的有益之处在于：

本发明通过研究找到一种能够有效满足慢阻肺等病症的临床用药需求，且吸入给药的有效剂量降低至安全用量范围之内的吸入用双膦酸类药物；本发明采用的双膦酸类药物的用量≤5μg/kg，比常规口服剂量或同行报道的吸入剂量低200倍，无毒副作用；

本发明剂量的选择既有效又安全；

本发明的药剂采用的是单剂量，单剂量是指单次雾化吸入所使用的药用活性成分的剂量；单剂量包装避免了多剂量大包装溶液所导致的反复量取、反复稀释配制、剂量不准确、易污染变质等缺点；

本发明发现采用碳酸氢钠的配方工艺能同时提供所需的pH和渗透压，工艺简单，稳定性可靠，能长期保存备用；

本发明比常用的支气管扩张药具有更好的速效支气管扩张疗效(降低气道阻力/改善肺功能)；

本发明比常用药物具有更好的长效治疗疗效，包括肺功能增强、气道炎症及肺气肿病理改善等；

本发明研究的制剂同时也有利于骨质疏松症、心血管疾病等其它慢性疾病及肺癌的治疗。

附图说明

图1是本发明的原理示意图；

图2是本发明的包含碳酸氢钠的0.25μM利塞膦酸钠溶液刺激细胞产生NO的关系图(0.25％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、4.0％、6.0％：碳酸氢钠浓度)；

图3是本发明将溶于2％碳酸氢钠的0.1、1.0、10、100μM的利塞膦酸钠分别比对照溶于PBS的0.1、1、10、50mM的利塞膦酸钠的NO产生量比对结果图(处理时间5min)；

图4是本发明将溶于2％碳酸氢钠的65μM利塞膦酸钠(RIS)添加到培养液中，30min、24h、48h的MTT细胞毒性观察分析(对照为PBS)；

图5是本发明的pH8.2-8.9的等渗或高渗的利塞膦酸钠溶液显著刺激细胞产生NO的关系图；+NaHCO₃：0.25μM利塞膦酸钠(RIS)加2％碳酸氢钠；+KHCO₃：0.25μM利塞膦酸钠(RIS)加2％碳酸氢钾；+NaCl 150：+NaHCO₃：0.25μM利塞膦酸钠(RIS)加150mM NaCl；+NaOH：0.25μM利塞膦酸钠(RIS)加8μM氢氧化钠；+NaOH+NaCl 150：0.25μM利塞膦酸钠(RIS)加8μM氢氧化钠加150mM NaCl；+NaOH+NaCl 200：0.25μM利塞膦酸钠(RIS)加8μM氢氧化钠加200mMNaCl；+Tris：0.25μM利塞膦酸钠(RIS)加10mM Tris pH 8.3；+Gly+NaCl 150：0.25μM利塞膦酸钠(RIS)加50mM甘氨酸pH8.6加150mM NaCl；

图6是本发明将溶于4％碳酸氢钠的130μM pH8.3利塞膦酸钠按1∶1比例加入到培养液中，处理细胞时间，5min、30min、1.5h、3h、6h、12h、24h的时间效应结果图；

图7是本发明的0.25μM利塞膦酸钠(RIS)、阿仑膦酸钠(ALN)、伊班膦酸钠(IBA)或唑来膦酸(ZOL)在2％碳酸氢钠中对A549细胞NO分泌量的变化对比图(处理时间5min)；

图8是本发明的COPD与对照组小鼠的气道阻力及病理检验结果图；(A，呼吸指数(RI)比对，control:健康小鼠，model:COPD小鼠；B，健康小鼠肺组织HE染色；C，COPD小鼠肺组织HE染色)；

图9是本发明的COPD小鼠吸入给药5mim后，药物组相对于PBS组的呼吸参数变化图；(A，呼吸参数(RI)变化比例；B，肺动态顺应性(Cdyn)变化比例。RIS：利塞膦酸钠；SALB：硫酸沙丁胺醇；SALM：沙美特罗替卡松；TIBR：噻托溴铵)；

图10是本发明的COPD小鼠连续每日吸入给药2次治疗28天后，药物组相对于PBS组的呼吸参数及病理变化图(RIS：利塞膦酸钠；BUD：布地奈德；SALM：沙美特罗替卡松；TIBR：噻托溴铵；A，呼吸参数(RI)变化比例；B,肺动态顺应性(Cdyn)变化比例；C，肺泡平均内衬间隔(mean linear intercept，MLI)；D，巨噬细胞(CD68⁺)数；E，PBS组肺组织HE染色；F，利塞膦酸钠组肺组织HE染色；G，PBS组肺组织CD68⁺免疫组化；H,利塞膦酸钠组肺组织CD68⁺免疫组化)。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一种吸入用双膦酸类药物，包括：双膦酸类药物，pH调节剂，渗透压调节剂；pH值范围为8.2-8.9，渗透压为等渗或高渗。作为一种实施例，双膦酸类药物包括：利塞膦酸钠，阿仑膦酸钠；pH调节剂和渗透压调节剂为碳酸氢盐，包括：碳酸氢钠，碳酸氢钾。双膦酸类药物与碳酸氢盐的质量比为1∶500-1∶1000。碳酸氢盐能把吸入用双膦酸类药物溶液的pH值稳定在8.2-8.5，发挥气道促吸收剂的功能，能短暂上调气道表面pH而促进双膦酸类药物吸收进入气道上皮细胞。以双膦酸类药物计，本发明采用的双膦酸类药物的用量≤5μg/kg，比常规口服剂量或同行报道的吸入剂量低200倍。

作为一种优选，一种吸入用双膦酸类药物，为在药用纯化水或注射用水中溶有0.004％(w/v)利塞膦酸钠，4.0％(w/v)碳酸氢钠。

作为一种优选，一种吸入用双膦酸类药物，为在药用纯化水或注射用水中溶有0.004％(w/v)阿仑膦酸钠，4.0％(w/v)碳酸氢钠。

作为一种优选，双膦酸类药物混合溶液为将利塞膦酸钠或阿仑膦酸钠和碳酸氢钠或碳酸氢钾按1∶500质量比混合加工成干粉，按100mg分装，在使用前加入5ml注射用水溶解使用或按100mg/5ml直接加到细胞外溶液中使用。

本发明采用的碳酸氢钠或碳酸氢钾等碳酸氢盐，在pH≤8.9时缓冲能力较弱，利于气道CO₂下调气道pH值至正常区间而避免长时间碱性环境对气道上皮的损伤，同时能将双膦酸类药物滞留在气道上皮细胞内，利于双膦酸类药物在气道上皮细胞内持续发挥药效。

该溶液的制备方法为：在配制罐中加入80％总体积的药用纯化水，加入按处方量称取的0.004％(w/v)利塞膦酸钠或阿仑膦酸钠和4.0％(w/v)碳酸氢钠或碳酸氢钾，搅拌至溶解，定容，依次经粗滤和精滤，作为一种实施例，粗滤为0.45μm粗滤，精滤为0.22μm精滤，均为无菌过滤，灌封于塑料或中性硼硅玻璃安瓿中，装量为5ml。

本发明采用的单剂量包装可以使用无菌化吹-灌-封三合一技术(Blow/Fill/Seal,BFS)的单剂量独立灌装、封口后，能确保药品的稳定性。

本发明提供的单剂量的双膦酸类药物雾化吸入混合溶液采用单剂量药物组合物及药用包装。所述的单剂量是指单次雾化吸入所使用的药用活性成分的剂量。单剂量包装避免了多剂量大包装溶液所导致的反复量取、反复稀释配制、剂量不准确、易污染变质等缺点。具体而言，所述的单剂量雾化吸入制剂单次用药剂量为5ml/50kg，可以迅速(5min)改善慢阻肺小鼠肺功能动态顺应性约60％，降低气道阻力约60％，药效能够持续到12hr。

本发明提供的用药方法为连续用药疗程，单次用药剂量为5ml/50kg的上述溶液，连续用药每日2次，每12h一次，持续用药4周为一个疗程，一个周期持续用药(疗程)4周，能显著改善气道炎症和肺气肿病理状况；连续进行用药6个疗程，小鼠存活率100％，未观测到用药组小鼠体重明显下降，未观察到用药组小鼠行为明显异常，未观察到明显毒性，具有良好的安全性。

本发明吸入用双膦酸类药物溶液的药用机理包括相互关联的4个方面：(1)气道上皮细胞外通常存在大量(浓度一般约为1.5mM)的Ca²⁺(Ca²⁺ _e)；细胞内Ca²⁺(Ca²⁺ _i)在常规情况下很低(约0.1μM)。Ca²⁺ _i升高可以迅速激活细胞内eNOS一氧化氮(NO)合成酶，而NO为脂溶性小分子，具有高扩散性，能够快速扩散至气道平滑肌细胞内激活经典的cGMP-平滑肌舒张途径。eNOS/NO在COPD还具有抗炎、抗肺气肿、促进肺泡修复等功效，已为Thomassen等(1997)、Raychaudhuri等(1999)、Ito等(2013)、Boe等(2015)和Sonoda等(2018)相继研究报道所证实。(2)双膦酸类药物(NBP)对FDPS的特异强烈抑制性。NBP对FDPS具有高度特异的抑制作用，抑制体外重组纯化FDPS的IC₅₀约0.003μM-0.05μM。以利塞膦酸钠为例，≥0.1μM的利塞膦酸钠即能完全抑制体外重组纯化的FDPS。换而言之，理论上NBP进入细胞内(NBP_i)浓度达到≥0.1μM，即可以发挥抑制FDPS的药效。但由于NBP的低透膜性，约需≥100μM的细胞外浓度(NBP_e)才能有效地循胞饮途径进入破骨细胞、巨噬细胞等，而对于不具活跃胞饮或吞噬作用的气道上皮细胞，则需要更高浓度的NBP_e。因此，提高细胞膜对该类亲水小分子药物的通透性，使得低浓度的药物能够进入细胞内，是降低NBP药用剂量的关键。NBP_i抑制FDPS进而抑制RhoA及其下游的ROCK蛋白激酶，减少T495磷酸化对eNOS的抑制而上调eNOS活性。(3)细胞膜表面CX43半通道(HCX43)对细胞外高pH值(pH_e≥8.2)的高反应性。细胞外通常存在大量(浓度一般约为1.5mM)的Ca²⁺(Ca²⁺ _e)，HCX43常规处于被Ca²⁺ _e结合关闭状态。pH_e-≥8.2可刺激HCX43打开形成NBP和Ca²⁺等亲水小分子扩散通道，并同时活化Src酪氨酸激酶。Src可磷酸化eNOS的Y81位点而上调eNOS活性。(4)碳酸氢盐在pH≤8.9时的低缓冲性和安全性。本发明的吸入用双膦酸类药物溶液在吸入给药后，提供pH_e8.2-8.9刺激气道上皮细胞表面HCX43打开，促进给药的NBP(NBP_e)及气道内表面的Ca²⁺(Ca²⁺ _e)扩散进入细胞内(NBP_i、Ca² ⁺ _i)，NBP_i、Ca²⁺ _i与同时活化的Src，协同强烈激活eNOS产生大量NO扩散刺激气道扩张。随后，由于细胞CFTR离子泵能高效率地将HCO₃ ^-离子排出至细胞外，细胞内pH能够维持在安全范围，并且，由于碳酸氢盐在pH≤8.9时缓冲性较弱，气道CO₂溶解提供H⁺，可使得pH_e回复到正常中性至弱酸性，HCX43恢复关闭，Ca²⁺ _i恢复至常规低水平状态，避免细胞内pH(pH_i)环境失调和Ca²⁺ _i的持续高水平而造成细胞毒性。NBP_i则因为不代谢且不能透过细胞膜扩散，所以滞留在气道上皮细胞内持续抑制FDPS-RhoA-ROCK，持eNOS的活性和NO的产生和扩散，长时间发挥气道扩张、抗炎、抗肺气肿、促进肺泡修复等药效。本发明药用机理参见附图1，本发明提供的双膦酸类药刺激打开细胞膜上HCX43通道，细胞外双膦酸类药物(NBP_e)和Ca²⁺(Ca² ⁺ _e)涌入细胞内，与Src一起协同激活eNOS一氧化氮(NO)合成酶大量产生NO，快速扩散至气道平滑肌细胞内激活经典的cGMP-平滑肌舒张途径而促进支气管扩张，同时，eNOS/NO的上调在COPD还具有抗炎、抗肺气肿、促进肺泡修复等功效。

在测试中，我们发现尽管0.5％(60mM)的碳酸氢钠已足以让0.25μM利塞膦酸钠溶液达到pH 8.3，但1.5％(179mM)或更高浓度的碳酸氢钠比1％(119mM)或更低浓度的碳酸氢钠能更显著地促进细胞产生NO(参见实验一，附图2)。由于0.5％-6％碳酸氢钠溶液pH值相似，均在pH 8.2-8.5，这种现象表明除了pH 8.2-8.5的条件，还有其它碳酸氢钠浓度相关的因素在影响细胞产生NO。实验验证表明这种因素在于溶液的渗透压。我们以溶于PBS的0.25μM利塞膦酸钠溶液，分别以10mM Tris-HCl调节至pH8.3、50mM甘氨酸-NaOH调节至pH8.5、或以NaOH直接调至pH8.2的0.25μM利塞膦酸钠溶液，再分别添加150mM NaCl或200mM NaCl以保持溶液渗透压至等渗或高渗进行比对测试，结果显示，溶于PBS的0.25μM利塞膦酸钠溶液，及没有添加NaCl而仅以Tris调至pH8.3、以甘氨酸-NaOH调至pH8.6或直接以NaOH调至pH8.9的0.25μM利塞膦酸钠溶液，仅能温和地促进NO产生与分泌(约相当于PBS对照的2-3倍)，显著弱于包含2％NaHCO₃或KHCO₃或pH8.6(甘氨酸-NaOH)、pH8.9(NaOH)且包含等渗(150mM)或高渗(200mM)NaCl的利塞膦酸钠溶液(约相当于PBS对照的13-15倍)，表明pH≥8.2的等渗或高渗利塞膦酸钠溶液能最大化地促进NO的产生与分泌(参见实验二，附图3)。我们推测原理可能是等渗或高渗条件能够避免水分子大量涌入细胞内而有利于提升细胞内利塞膦酸钠和Ca²⁺浓度，激活前述的NBP_i/Ca²⁺ _i/Src-eNOS-NO信号机制。我们在实验中观察发现：NaOH组、碳酸氢钠组、碳酸氢钾组和甘氨酸组的细胞形态没有明显变化，2h后细胞密度保持正常，而Tris组细胞形态发生明显改变，并在2h后出现大面积凋亡现象，显示出明显的细胞毒性。MTT细胞活性分析显示，细胞在包含65μM利塞膦酸钠和2％碳酸氢钠的测试液中处理1h，再继续在普通培养液中培养24h-48h，并不影响细胞生长和活性(参见实验三，附图4)。包含碳酸氢钠的配方工艺能同时提供所需的pH和渗透压，工艺简单，且稳定性可靠，能够长期保存备用。

双膦酸类药物的理论安全吸入剂量＝口服安全剂量(0.1mg/kg)÷吸入比口服生物利用度增加倍数(3.5)＝28.5μg/kg，约相当于支气管内1mM。细胞水平上的剂量效应测试显示，当溶于2％(w/v)的碳酸氢钠溶液中，0.1μM利塞膦酸钠即能将NO产生量增加约8.7倍，而溶于PBS中的利塞膦酸钠，在10mM以下的浓度，不能增加NO产生量，在50mM的浓度下，也仅能将NO产生量增加到约2.2倍。可见，2％的碳酸氢钠能使得RIS的速效工作浓度从≥50mM降低至0.1μM，降低幅度超过5×10⁵倍(参见实验四，附图5)。在细胞水平上的时间效应测试显示，细胞在包含2％碳酸氢钠的65μM利塞膦酸钠溶液的培养液中，NO产生量在5min时即进入高峰，30min时达到最高点，1.5h后虽开始显著下降，但12h后仍能相当于对照的2.8倍(参见实验五，附图6)。已知利塞膦酸钠的半衰期约为1.5h，按12h后药效浓度为0.25μM、药液在气道沉降后被粘液层稀释1倍估算，药效持续12h所需的支气管内起始药物浓度为：0.25μM×2^12/1.5×2＝128μM。换算后相当于3.7μg/kg，远低于理论安全吸入剂量(28.5μg/kg)，因此，以≥3.7μg/kg同时＜14.2μg/kg的剂量进行1日2吸给药，能够满足安全有效性要求。

在本发明过程中，我们对另外3种重要的双膦酸类药物：阿仑膦酸钠(ALN)、伊班膦酸钠(IBA)、唑来膦酸(ZOL)，也进行了测试，结果显示：同样以0.25μM的浓度溶于2％(w/v)的碳酸氢钠中，对A549刺激5min，NO产生量增加倍数分别为：7.0、7.2、11.2，ZOL稍弱于RIS，IBA与ALN相当，均显著弱于RIS(NO产生量增加倍数为13.9)，但仍能显著促进NO的产生(参见实验六，附图7)。IBA和ZOL静脉注射剂量与频次为≤4mg/次/4周，其以≥3.7μg/kg同时＜14.2μg/kg的剂量进行1日2吸给药的安全性存疑，而ALN的安全性与RIS相当，也能满足≥3.7μg/kg同时＜14.2μg/kg的剂量进行1日2吸给药的安全性要求，虽然其通过NO机制的疗效仅约相当于RIS的50％。

下通过实验验证本发明的有益效果；

实验一，包含碳酸氢钠的利塞膦酸钠溶液刺激细胞产生NO；

A549细胞，按1∶2稀释，按100μl/孔分装至96孔板中培养过夜，至90％饱和度，吸去培养液，分别加入100μl/孔的测试液，测试液为：溶于0.25％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、4.0％、6.0％碳酸氢钠的0.25μM利塞膦酸钠，对照孔加PBS；5min后，取样测试NO含量。结果显示，溶于1.5％及更高浓度碳酸氢钠的利塞膦酸钠测试液能强烈刺激NO产生，而溶于0.25％-1％碳酸氢钠的利塞膦酸钠测试液的NO促进效果较弱，如附图2。

实验二，pH 8.2-8.9的利塞膦酸钠溶液刺激细胞产生NO；

A549细胞，按1∶2稀释，按100μl/孔分装至96孔板中培养过夜，至90％饱和度，吸去培养液，分别加入100μl/孔溶于PBS、2％碳酸氢钠、2％碳酸氢钾、150mM NaCl、或直接以NaOH调pH 8.9、或溶于150mM或200mM NaCl再以NaOH调pH至8.9，或以10mM Tris调至pH8.3，或0.25μM利塞膦酸钠测试液，对照孔加PBS；5min后，取样测试NO含量。结果显示，溶于PBS或NaCl但没有将pH调节至≥8.2的利塞膦酸钠测试组没有明显增加产生NO，溶于碳酸氢钠或碳酸氢钾或溶于NaCl并用NaOH调pH至8.9或以50mM甘氨酸调至pH8.6并加150mM NaCl的利塞膦酸钠测试组增加NO产生量约13.0-15.4倍，不添加NaCl而以NaOH直接调pH至8.9的利塞膦酸钠溶液能增加NO产生量约3倍，如附图3。

实验三，细胞毒性观察；

A549细胞，按1∶6稀释，按100μl/孔分装至96孔板中培养过夜，至30％饱和度，吸去培养液，加65μM的利塞膦酸钠(溶于2％碳酸氢钠)测试液100μl/孔，对照孔加PBS；1h后，吸去测试液，加培养液继续培养24h、48hr，观察细胞形态和生长状况，并进行MTT分析。结果显示，测试液不影响细胞生长和存活，如附图4。

实验四，剂量效应；

A549细胞，按1∶2稀释，按100μl/孔分装至96孔板中培养过夜，至90％饱和度，吸去培养液，分别加入100μl/孔0.1、1.0、10、100、1000μM的利塞膦酸钠(溶于2％碳酸氢钠)或0.1、1、10、50mM的利塞膦酸钠(溶于PBS)测试液，对照孔加PBS；5min后，取样测试NO含量。结果显示，溶于2％碳酸氢钠的低浓度利塞膦酸钠能显著增加NO产生量(约8.7-14.2倍)，而溶于PBS的浓度更高的利塞膦酸钠则不能或只能较弱地刺激NO产生(约0.9-2.6倍)，如附图5。

实验五，时间效应；

第1天，将A549细胞，按1∶2稀释，按100μl/孔分装至96孔板中培养过夜，每组6孔，其中3孔用于药品测试，3孔用作PBS对照。第2天早上，按终点时间(12h后)倒推，将第1组药品测试孔，吸去50μl/培养液，加130μM的利塞膦酸钠(溶于4％碳酸氢钠)测试液50μl/孔，对照孔加PBS 50μl；6h后，将第2组；再3h后，对第3组；再1.5h后，对第4组；再1h后，对第5组；再30min后，对第6组；分别按第1组方法处理，再25min后，统一取样测试NO含量。结果显示，溶于碳酸氢钠的利塞膦酸钠测试液对细胞产生NO的刺激效果在30min达到高点，然后虽然呈明显回落趋势，但12h后，仍能比对照增加约2.8倍，如附图6。

实验六，4种双膦酸类药物的比对；

A549细胞，按1∶2稀释，按100μl/孔分装至96孔板中培养过夜，至90％饱和度，吸去培养液，分别加入100μl/孔的测试液，测试液为：溶于2.0％碳酸氢钠的0.25μM利塞膦酸钠、阿仑膦酸钠、伊班膦酸钠或唑来膦酸，对照孔加PBS；5min后，取样测试NO含量。结果显示，利塞膦酸钠的效果最强，唑来膦酸稍弱于利塞膦酸钠，，伊班膦酸钠和阿仑膦酸钠的效果，均约相当于利塞膦酸钠的50％，如附图7。

药物一，制备200μg/5ml单剂量利塞膦酸钠雾化吸入溶液(1000支)之一；

处方：

利塞膦酸钠	200mg
		碳酸氢钠	200g
注射用水	加至5000ml

制备方法：

按处方量称取利塞膦酸钠，加入到4000ml的注射用水中，再加入按处方量称取的200g碳酸氢钠，搅拌溶解完全，加注射用水至5000ml，灌装、封口，每支5ml，检漏，质检，包装，即得200μg/5ml/支，共1000支。

主要技术指标检验：

性状：无色或几乎无色透明澄清液体，无可见异物；

含量：以含磷量计，含利塞膦酸钠(1-羟基-2-(3-吡啶基)乙叉-1，1-双膦酸钠，C7H10NNaO7P2)应为标示量的90.0％-110.0％；

pH值：8.2-8.5；

渗透压比：2.4-2.9；

无菌检验：无菌；

效价：≥8.0。

药物二，制备200μg/5ml单剂量利塞膦酸钠雾化吸入溶液(1000支)之二；

处方：

利塞膦酸钠	200mg
		碳酸氢钾	200g
注射用水	加至5000ml

制备方法：

按处方量称取利塞膦酸钠，加入到4000ml的注射用水中，再加入按处方量称取的200g碳酸氢钾，搅拌溶解完全，加注射用水至5000ml，灌装、封口，每支5ml，检漏，质检，包装，即得200μg/5ml/支，共1000支。

主要技术指标检验：

性状：无色或几乎无色透明澄清液体，无可见异物；

含量：以含磷量计，含利塞膦酸钠(1-羟基-2-(3-吡啶基)乙叉-1,1-双膦酸钠，C7H10NNaO7P2)应为标示量的90.0％-110.0％；

pH值：8.2-8.5；

渗透压比：2.4-2.9；

无菌检验：无菌；

效价：≥8.0。

药物三，制备200μg/5ml单剂量阿仑膦酸钠雾化吸入溶液(1000支)之一；

处方：

阿仑膦酸钠	200mg
		碳酸氢钠	200g
注射用水	加至5000ml

制备方法：

按处方量称取阿仑膦酸钠，加入到4000ml的注射用水中，再加入按处方量称取的200g碳酸氢钠，搅拌溶解完全，加注射用水至5000ml，灌装、封口，每支5ml，检漏，质检，包装，即得200μg/5ml/支，共1000支。

主要技术指标检验：

性状：无色或几乎无色透明澄清液体，无可见异物；

含量：以含磷量计，含阿仑膦酸钠((4-氨基-1-羟基亚丁基)二膦酸单钠盐，C₄H₁₂NNaO₇P₂)应为标示量的90.0％-110.0％；

pH值：8.2-8.5；

渗透压比：2.4-2.9；

无菌检验：无菌；

效价：≥4.0。

药物四，制备200μg/5ml单剂量阿仑膦酸钠雾化吸入溶液(1000支)之二；

处方：

阿仑膦酸钠	200mg
		碳酸氢钾	200g
注射用水	加至5000ml

制备方法：

按处方量称取阿仑膦酸钠，加入到4000ml的注射用水中，再加入按处方量称取的200g碳酸氢钾，搅拌溶解完全，加注射用水至5000ml，灌装、封口，每支5ml，检漏，质检，包装，即得200μg/5ml/支，共1000支。

主要技术指标检验：

性状：无色或几乎无色透明澄清液体，无可见异物；

pH值：8.2-8.5；

渗透压比：2.4-2.9；

无菌检验：无菌；

效价：≥4.0。

药物五，制备200μg单剂量利塞膦酸钠干粉(1000支)之一；

处方：

制备方法：

取利塞膦酸钠和碳酸氢钠原料药，经研细后过80目筛，按处方量称取，打开干燥的净化压缩空气，加入到多向运动混合机中充分混合，分散均匀，加入到气流粉碎机加料口中，粉碎压力为Ring压力6bar，Venturi压力8bar，粉碎时间约为2h，收集细粉后，重复进样再粉碎1次，注意不要阻塞加料口，待药物全部粉碎后，打开气流粉碎机的连接件，收集集料桶和布袋中的粉末。经检测合格后用胶囊填充机按100mg/只分装充填至胶囊中。化验合格后，抛光，铝塑包装。外包完成后，成品检验。检验合格后入库。

主要技术指标检验：

性状：能完全溶于5ml药用纯化水中成无色或几乎无色透明澄清液体，无可见异物

pH值：8.2-8.5；

渗透压比：2.4-2.9；

无菌检验：无菌；

效价：≥8.0。

实验六，效价测定。

以96孔板培养A549细胞至90％-100％饱和度，取本品适量，以2％碳酸氢钠溶液稀释530倍，吸去细胞培养液，向供试细胞孔加入稀释530倍的本品稀释液，100μl/孔，对照孔细胞加入100μl PBS，5min后，从各孔分别吸取50μl样品，用一氧化氮(NO)含量测定试剂盒和酶标仪测定NO含量，供试孔与对照孔的比值即为本品效价。按实验四连续制备了3批样品(201812001、201812002、201812003)，每次取样数20只，100％符合≥10的效价规定。

实验七，本发明吸入用双膦酸类药物溶液的稳定性影响因素试验；

根据国家食品药品监督局《化学药物制剂研究技术指导原则》，对本品进行了影响因素试验，为制剂工艺筛选、包装材料和容器的选择、贮存条件的确定等提供依据。试验设计为，从按实验四连续制备的3批样品各取40只，进行高温与强光照射试验，条件分别为在60℃±2℃、40℃±2℃、照度4500Lx±500Lx条件下，放置10天，于第5天和第10天取样检验。

检验结果见下表：

由结果可知，60℃10天，导致5％的供试品pH>8.5及效价不合格。主要原因是溶液中所含的碳酸氢钠中50℃以上的温度下开始分解生成碳酸钠，致使部分溶液pH上升，而pH>8.5的环境具有一定的细胞毒性导致效价下降。

实验八，本发明吸入用双膦酸类药物溶液的低温冻融试验；

根据《化学药物制剂研究技术指导原则》，对本品进行了冻融试验。参考指导原则，试验设计为，从按实验四连续制备的3批样品各取20只，做3次冻融循环，循环条件为在-20℃条件下放置2天，再在40℃条件下放置2天；于3次循环完成后(12天)，取样检验，并与0天的样品进行比较。检验结果见下表：

样品

天数

性状

含磷量

pH

渗透压比

无菌检验

效价

201812001

0

100％合格

201812002

0

100％合格

201812003

0

100％合格

201812001

12

100％合格

201812002

12

100％合格

201812003

12

100％合格

实验九，本发明吸入用双膦酸类药物溶液的加速稳定性试验；

根据国家食品药品监督管理局发布的《吸入制剂质量控制研究技术指导原则》，对本品进行了加速稳定性试验。试验设计为，选择40℃±2℃、RH25％±5％条件下进行6个月试验。在试验期间第0、1、2、3、6个月末取样检测考察指标。如在6个月内供试品经检测不符合质量标准要求或发生显著变化，则在中间条件30℃±2℃、RH65％±5％同法进行6个月试验。从按实验四连续制备的3批样品各取5×20只，按试验设计进行检验，结果见下表：

实验十，本发明吸入用双膦酸类药物溶液的长期稳定性试验；

根据化学药物(原料药和制剂)稳定性研究技术指导原则及中国药典原料药与药物制剂稳定性试验指导原则(中国药典2010版附录XIX C)，对本品进行了长期稳定性试验，目的为制定本品有效期提供依据。试验设计为，选择30℃±2℃、RH65％±5％条件，取样时间点在第一年每3个月末一次，第二年每6个月末一次，以后每年末一次。从按实验四连续制备的3批样品，每次取样数20只/批，目前已经完成了第一年的试验，结果见下表：

实验十一，本品对COPD小鼠速效治疗观察；

COPD小鼠建模采用烟熏结合弹性蛋白酶灌注构建。模型制备的主要流程如下：

(1)健康的Balb/c小鼠，雌鼠，6周龄，体重20±2g，共102只，其中6只为健康对照组，其余96只建立COPD模型。

(2)采用LPS(脂多糖)进行气管滴注诱发慢性炎症反应，一周2次，共4周8次。小鼠采用异氟烷气体麻醉机麻醉，气管插管后注入LPS 200μL(0.5mg/L)，释放小鼠，来回颠倒体位3-5次，使LPS均匀分布于两肺。对照组滴注200uL生理盐水。

(3)烟熏：从第三周起染毒箱中进行香烟熏，24只小鼠/箱，8只香烟/次，15min/次，每日熏2次。合计烟熏4周。对照组不进行烟熏。

(4)弹性蛋白酶气管灌注。第7周起采用弹性蛋白酶进行气管灌注，每周一次，共二次。猪胰弹性蛋白酶(elastase，Type I型，30units/mg protein)，溶于生理盐水配成10units/mL弹性蛋白酶溶液，无菌过滤后备用。小鼠采用异氟烷麻醉，气管内滴注弹性蛋白酶(4.8Units/100g体重)100uL。对照组滴注100uL生理盐水。

(5)第10周后进行大体检查，并采用FinePointe气道阻力和肺顺应性检测系统(RC系统)测定呼吸参数，重点关注建模组与对照组小鼠的呼吸指数(RI，Respiratory Index)的差别。RI为单位流量的压力，反映气道阻力大小。建模组RI约为对照组的200％，显示已经发生严重的气道阻塞。

(6)抽取小鼠，麻醉处死后，取肺组织，制成病理切片。重点观察肺部炎性细胞浸润情况，肺泡结构的损伤情况，从而确认COPD肺部损伤的病理基础。病理所见：模型小鼠鼠肺组织见大量炎性细胞，皮细胞增生、复层化，杯状细胞显著增生。肺泡腔扩大，大部分肺泡破裂融合形成肺大泡，肺泡数目显著减少。具有典型的COPD特征病理特点，确认建模成功。RI测定及病理检验结果参见附图8。

药物组采用溶于4％碳酸氢钠的利塞膦酸钠溶液，利塞膦酸钠浓度分别为0.025、0.25、2.5、25、250μM，阳性对照1采用硫酸沙丁胺醇(100μg/kg)，阳性对照2采用沙美特罗替卡松(以沙美特罗计，1μg/kg)，阳性对照3采用噻托溴铵(0.36μg/kg)，阴性对照采用PBS。以FinePointe RC气道阻力与肺顺应性检测系统(DSI/Buxco公司)进行雾化给药和肺功能测定。药物组和对照组各测试6只COPD小鼠。

步骤如下：

1.检查仪器密封性，调整基线。

2.对小鼠实行气道插管，置入仪器封闭舱中，连接相关设备线路和管道。

3.雾化给药及肺功能参数测定，进行相关数据采集：

A.适应阶段5min，

B.取100μl药物或对照加入仪器放样处，进行雾化约15s；雾化液滴颗粒大小≤7μm，

气体流速～0.1ml/min，雾化体积约25μl，

C.等待5min后，读取记录5min的数据。

4.导出数据为excel表格，分析数据。

结果显示，与阴性对照(PBS)组相比，利塞膦酸钠样品组当剂量浓度≥0.25μM时，呼吸指数(RI，Respiratory Index)下降约60％，动态顺应性(Cdyn)增强约60％。RI为单位流量的压力，反映气道阻力大小。Cdyn为单位压力下肺体积的变化，受肺组织弹性和气道阻力的双重影响。利塞膦酸钠样品组RI下降幅度与Cdyn上升幅度相当，反映给药5min后肺功能改善主要是源自气道阻力下降即支气管舒张。阳性对照1(硫酸沙丁胺醇)组、阳性对照2(沙美特罗替卡松)组，约改善肺功能20％-30％，具有速效支气管扩张功效，但弱于本发明利塞膦酸钠雾化吸入溶液；阳性对照3(噻托溴铵)组与阴性对照组无区别，显示噻托溴铵并无速效支气管扩张功效。参见附图9。

实验十二，本品对COPD小鼠长效治疗观察；

实验方法：药物组采用溶于4％碳酸氢钠的130μM利塞膦酸钠溶液；阳性对照1采用布地奈德，阳性对照2采用沙美特罗替卡松，阳性对照3采用噻托溴铵，剂量同实验十一；阴性对照采用PBS。COPD小鼠按6只/组饲养于鼠笼内，每日2次(12h一次)将6组小鼠移至6台小动物雾化给药仪动物箱(5L)内，将1ml药物或对照加入仪器进样处，以0.5ml/min的流速雾化喷入箱中，排风延时设置为60s，喷雾完成后，小鼠继续于箱内停留1min，再转移回鼠笼。小鼠呼吸频率按0.4s/次，吸气量按0.5ml/次估算，在5L箱中对小鼠雾化给药1min约相当于对成年人雾化吸入给药5ml。共对小鼠进行雾化给药28天。在第30天，将小鼠移至FinePointe RC气道阻力与肺顺应性检测系统(DSI/Buxco公司)进行肺功能测定，并抽取小鼠解剖后取出肺组织，进行石蜡包埋切片。石蜡块行HE染色和免疫组化分析。

实验结果：与阴性对照(PBS)组相比，利塞膦酸钠组RI平均下降约36％，Cdyn平均上升约42％，肺气肿MLI减小约40％，巨噬细胞浸润(CD68⁺)减少约30％；阳性对照1(布地奈德)组，RI平均下降约6％，Cdyn平均上升约6％，MLI及巨噬细胞浸润未有明显变化；阳性对照2(沙美特罗替卡松)组，RI平均下降约11％，Cdyn平均上升约12％，MLI未有明显变化；阳性对照3(噻托溴铵)组，RI平均下降约11％，Cdyn平均上升约11％，MLI及巨噬细胞浸润未有明显变化；从染色结果还可以看出经利塞膦酸钠治疗后，肺泡壁明显增厚，显示肺泡弹性功能也得到了改善；如附图10。

实验十三，小鼠给药安全性；

6只小鼠/组，以溶于4％碳酸氢钠的130μM利塞膦酸钠溶液对COPD小鼠以实验十二的方法连续进行用药6个疗程(每日2次雾化给药，每次1ml/5L给药1min，每个疗程28天)，对照组采用PBS。实验期间，未观测到用药组小鼠体重明显下降，未观察到用药组小鼠行为明显异常，未观察到明显毒性。6个疗程完成后，用药组小鼠存活率为100％，显著优于对照组(3只死亡，存活率50％)，显示本发明利塞膦酸钠雾化吸入溶液具有很好的安全有效性。

本发明的有益效果首先体现在本发明比常用的支气管扩张药具有更好的速效支气管扩张疗效(降低气道阻力/改善肺功能)。β2激动剂(包括短效和长效)和抗胆碱能药物是慢阻肺和哮喘常用的支气管扩张药。硫酸沙丁胺醇、沙美特罗(常用复方：沙美特罗替卡松)、噻托溴铵分别是短效β2激动剂、长效β2激动剂、抗胆碱能药。在对COPD小鼠气道给药5min后，本发明提供的优选剂量(4μg/kg体重)的利塞膦酸钠雾化吸入溶液的支气管扩张疗效约相当于按推荐使用最大剂量(100μg/kg体重)给药的硫酸沙丁胺醇吸入溶液的2.9倍。在对COPD小鼠气道给药30min后，本发明提供的优选剂量(4μg/kg体重)的利塞膦酸钠的支气管扩张疗效约相当于按推荐使用最大剂量(沙美特罗1μg/kg体重)给药的沙美特罗替卡松粉吸入剂的1.8倍。按推荐使用剂量(0.36μg/kg体重)的噻托溴铵粉吸入剂给药无速效支气管扩张效果(参见实验十一，附图9)。

本发明的有益效果还体现在本发明比常用药物具有更好的长效治疗疗效，包括肺功能增强、气道炎症及肺气肿病理改善等。吸入性糖皮质激素是最常用的气道抗炎药，主要品种包括：氟替卡松(常用复方：沙美特罗替卡松)和布地奈德。如上文所述，本发明提供的用药方法4μg/kg的利塞膦酸钠或阿仑膦酸钠雾化吸入溶液，每日用药2次，持续用药4周，病理切片观察，可以观察到炎症细胞浸润减少，尤其是巨噬细胞浸润数量减少约30％，同时改善慢阻肺小鼠肺气肿病理，肺大泡平均直径分别减少约40％，沙美特罗替卡松或布地奈德或噻托溴铵吸入给药，未观察到巨噬细胞浸润数量减少、肺大泡现象未见明显变化(参见实验十二，附图10)。

本发明的有益效果还体现在本发明提供的用药剂量和方法具有良好的安全性。慢阻肺和哮喘都是需要长期用药的慢性病，尤其是慢阻肺，一般需要终生每日用药，对药物的安全性要求很高。现有的支气管扩张药和吸入性糖皮质激素都存在明显的副作用，一般需要间隔使用，给患者造成了不便。通过促进气道上皮细胞对双膦酸类药物的吸收和驻留，不仅能降低双膦酸类药物使用剂量需求，而且能比常规口服或注射给药方式延缓和减少双膦酸类药物直接吸收入血排泄，进一步增强其系统安全性。由于双膦酸类药物并不代谢，吸收和驻留在气道上皮细胞内的双膦酸类药物仍会缓慢释放入血，继续循常规路径部分沉积于骨骼发挥抗骨质疏松功效。因此，也有利于骨质疏松症的治疗。本发明提供的用药方法单次用药4μg/kg的利塞膦酸钠雾化吸入溶液，连续用药每日2次，持续用药4周为一个疗程，连续进行用药6个疗程，未观察到明显毒性，用药组小鼠存活率为100％，显著优于对照组(存活率50％)，显示本发明利塞膦酸钠雾化吸入溶液具有很好的安全有效性，适于多疗程连续使用(参见实验十三)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种吸入用双膦酸类药物，其特征在于，组成包括：双膦酸类药物，pH调节剂，渗透压调节剂；pH值范围为8.2-8.9，渗透压为等渗或高渗。

2.根据权利要求1所述的一种吸入用双膦酸类药物，其特征在于，所述双膦酸类药物包括：利塞膦酸钠，阿仑膦酸钠，在细胞外应用浓度为0.1μM-100μM。

3.根据权利要求1所述的一种吸入用双膦酸类药物，其特征在于，所述pH调节剂为氢氧化钠，在细胞外应用浓度为8.0μM；渗透压调节剂为氯化钠，在细胞外应用浓度为150mM-200mM。

4.根据权利要求1所述的一种吸入用双膦酸类药物，其特征在于，所述pH调节剂为甘氨酸-氢氧化钠，在细胞外应用浓度为甘氨酸50mM、氢氧化钠4mM；渗透压调节剂为氯化钠，在细胞外应用浓度为150mM。

5.根据权利要求1所述的一种吸入用双膦酸类药物，其特征在于，所述pH调节剂及渗透压调节剂为碳酸氢盐；碳酸氢盐在细胞外应用浓度为1.5％(w/v)-6.0％(w/v)。

6.根据权利要求5所述的一种吸入用双膦酸类药物，其特征在于，为在药用纯化水或注射用水中溶有0.004％(w/v)利塞膦酸钠，4.0％(w/v)碳酸氢钠。

7.根据权利要求5所述的一种吸入用双膦酸类药物，其特征在于，为在药用纯化水或注射用水中溶有0.004％(w/v)阿仑膦酸钠，4.0％(w/v)碳酸氢钠。

8.根据权利要求5所述的一种吸入用双膦酸类药物，其特征在于，为将利塞膦酸钠和碳酸氢钠按1:500质量比混合加工成干粉，按100mg分装，在使用前加入5ml注射用水溶解使用或按100mg/5ml直接加到细胞外溶液中使用。

9.一种吸入用双膦酸类药物的制备方法，其特征在于，在配制罐中加入80％总体积的药用纯化水，加入按处方量称取的0.004％(w/v)利塞膦酸钠或阿仑膦酸钠和4.0％(w/v)碳酸氢钠或碳酸氢钾，搅拌至溶解，定容，依次经无菌过滤，包装。

10.一种吸入用双膦酸类药物在慢性阻塞性肺疾病的用途，其特征在于，吸入用双膦酸类药物，包括：双膦酸类药物，碳酸氢钠；双膦酸类药物在水溶液含量为0.004％(w/v)，pH值范围为8.2-8.5，渗透压为等渗或高渗；单剂量雾化吸入制剂单次用药剂量为5ml/50kg，能迅速改善肺功能动态顺应性，降低气道阻力。