CN111050809B - 孵育液体和灭活病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种孵育液体的方法、一种制备生物药物的方法以及一种制备生物药物的装置。

Description

孵育液体和灭活病毒的方法
技术领域
本发明涉及孵育液体的方法、制备生物药物的方法以及制备生物药物的装置。
背景技术
在许多连续处理过程中，将液体进行混合，然后通过使液体通过处理设备(例如管或柱)来进行孵育。然而，当(液体)通过过程所用结构时，与距离该结构的表面更远的液体部分相比，距离该结构的表面更近的液体部分倾向于以更低的速度流动。例如，当液体混合物流过中空管时，与在管的周围的液体部分相比，在管的中央的液体部分往往以更高的速度流动。结果，即使当液体的所有部分同时进入结构时，液体的不同部分也具有不同的停留时间。换言之，液体的不同部分显示出停留时间的分布。如果液体的不同部分之间的流经时间差异较大，则停留时间分布较宽；如果液体的不同部分之间的流经时间差异较小，则停留时间分布较窄。
当将液体混合物孵育一定的时间时，窄的停留时间分布是有利的。例如，在连续的生物药物生产过程中，可通过将含生物药物的液体与病毒灭活剂进行混合、使混合物在限定时间内通过过程中所用的结构对混合物进行孵育，来实现连续的病毒灭活。窄的停留时间分布使得混合物液体的所有部分与病毒灭活剂一起孵育相似的时间(即所需的时间)。如此，可避免液体的某些部分暴露于病毒灭活剂的时间过长(这可能会损害生物药物)，而液体的其他部分没有暴露于病毒灭活剂足够长的时间(这可能会导致病毒灭活不完全)。
当前已知的孵育流动液体的方法不能提供窄的停留时间分布，或者它们还具有其他严重的缺点。例如，在连续生产过程中，孵育液体混合物的最简单方法是使液体通过足够长的空心管，以提供所需的最低停留时间。然而，中空管中的停留时间分布极其宽且不可再现。可将静态混合物添加到管中以促进径向混合(参考文献1)。但是，对于此种设置，扩大规模(scale-up)以及将静态混合物加到长延伸管中都是一个问题。
或者，所谓的旋流逆变器(CFI，coiled flow inverter)通过使液体混合物通过具有附加90°弯曲的盘管来工作(参考文献2)。此设置可以在增加径向混合的同时最大程度地减少轴向混合，从而缩窄停留时间分布。最近描述了将该系统用于连续病毒灭活的用途(参考文献3、4)，并且最近使用了相同设置来缩窄杂质沉淀步骤中的停留时间分布(参考文献5)。但是，已证明CFI仅适用于直径为2mm至3mm的管，且扩大规模仍具有挑战性，因为系统中的流体动力学随管尺寸而变化。对于每个给定的设计，CFI还仅限于单一流量。
最近，有人提出通过引入不混溶的分离介质在微反应器中对产物流进行分段，以实现具有窄停留时间分布的病毒的连续灭活(参考文献6)。然而，此种方法仅限于使用微反应器，这使得扩大规模非常困难。
由于如上所述缺乏停留时间分布窄的孵育流动液体的合适方法，目前对时间灵敏的孵育通常以分批模式而不是连续模式进行。在分批模式下，在容器中孵育液体混合物，而孵育时间内的流是中断的。结果，分批模式下的生产率(例如，就单位时间段所孵育的液体的量而言，或就单位时间段所生产的生物药物的量而言)通常低于连续模式下的生产率。
鉴于上述情况，迫切需要一种改进的方法，该方法能够使液体孵育一段限定的时间，同时提供高生产率。
发明内容
通过提供以下实施方式，本发明满足了上述需求并解决了本领域中的上述问题。
特别地，本发明人惊奇地发现，使液体通过具有多个互连通道的结构提供了比先前已知的方法更窄的停留时间分布。因此，根据本发明，可以通过将至少两种液体混合并使混合物通过具有多个互连通道的结构，来孵育所述至少两种液体的混合物，其中，混合和通过连续进行。
发明人还发现，具有多个互连通道的结构可以是无孔珠(non-porous bead)的填充床。在此实施方式中，互连通道由无孔珠之间的空间形成。然后，发明人进行了大量实验来研究哪些性质会影响停留时间分布。发明人惊奇地发现，在测试范围内，形成填充床的珠粒的平均粒径和粒径分布对停留时间分布具有最大影响。具体地，发明人发现，当珠粒的平均粒径为0.05mm至1mm且当粒径分布窄时，所述无孔珠的填充床提供了特别窄的停留时间分布。此外，发明人发现，无孔珠的更大体积的填充床得到更窄的停留时间分布。此外，根据本发明，更长的珠床(例如，以柱的形式)也得到更窄的停留时间分布。
与当前所用的许多方法相反，本发明的方法可以容易地扩大规模。这是因为本发明的方法对流量和表观线速度(superficial linear velocity)的变化并不敏感，并且因为当使用具有更大体积和更长的无孔珠的填充床时，停留时间分布变窄。因此，本发明的方法可以容易地整合到商业生产过程中。
总言之，通过提供下文所述的优选实施方式，本发明提供了孵育液体的改进方法。
1.一种孵育至少两种液体的混合物的方法，该方法包括：
i)将所述至少两种液体混合，获得混合物；以及
ii)使所述混合物通过具有多个互连通道的结构，从而孵育所述混合物。
2.根据第1项所述的方法，其中，所述方法是连续流方法。
3.根据第1或2项所述的方法，其中，所述混合和通过连续进行。
4.根据前述项中任一项所述的方法，其中，具有多个互连通道的结构为无孔珠的填充床。
5.根据第4项所述的方法，其中，所述无孔珠为惰性无孔珠。
6.根据第4或5项所述的方法，其中，所述无孔珠为玻璃珠或陶瓷珠，或塑料珠，例如PMMA珠或钢珠。
7.根据第4至6项中任一项所述的方法，其中，无孔珠的平均粒径为0.05mm至1mm，优选为0.05mm至0.6mm，更优选为0.05mm至0.5mm，最优选为0.05mm至0.3mm。
8.根据第4至7项中任一项所述的方法，其中，95％的无孔珠对平均粒径偏离不超过50％，优选不超过35％，最优选不超过20％。
9.根据第1至8项中任一项所述的方法，其中，具有多个互连通道的结构的长度为至少5cm，或至少10cm，或至少20cm，或至少30cm，或至少50cm，或至少70cm，或至少100cm。
10.根据第1至9项中任一项所述的方法，其中，具有多个互连通道的结构的长度为至少20cm。
11.根据第4至10项中任一项所述的方法，其中，无孔珠的填充床可以通过包括对所述无孔珠进行振动处理的方法获得。
12.根据第4至11项中任一项所述的方法，其中，对于无孔珠的填充床，空隙体积占总体积的分数为0.2至0.45。
13.根据第4至12项中任一项所述的方法，其中，对于无孔珠的填充床，空隙体积占总体积的分数为0.37至0.42。
14.根据第4至13项中任一项所述的方法，其中，无孔珠的填充床被容纳在柱和/或反应器中。
15.根据第14项所述的方法，其中，所述柱的直径大于5mm，优选直径为至少10mm。
16.根据第4至15项中任一项所述的方法，其中，无孔珠的填充床的空隙体积为至少10mL，优选为至少40mL，更优选为至少150mL，甚至更优选为至少470mL，还更优选为至少700mL。
17.根据第1、9和10项中任一项所述的方法，其中，具有多个互连通道的结构为整料(monolith)或预制(precast)结构，例如3D打印的几何形状。
18.根据第17项所述的方法，其中，具有多个互连通道的结构为整料，并且其中，对于整料，空隙体积占总体积的分数为0.5至0.75。
19.根据第1至18中任一项所述的方法，其中，所述方法用于病毒灭活，并且其中，所述至少两种液体中的第一种液体为可能含有病毒的液体，并且其中，所述至少两种液体中的第二种液体包含病毒灭活剂。
20.根据第19项所述的方法，其中，所述第一种液体包含生物药物。
21.根据第19或20项所述的方法，其中，所述方法用于包膜病毒的病毒灭活。
22.根据第19至21项中任一项所述的方法，其中，所述病毒为逆转录病毒和/或黄病毒科(Flaviviridae family)的病毒。
23.根据第22项所述的方法，其中，所述病毒为逆转录病毒，优选为X-MuLV。
24.根据第22项所述的方法，其中，所述病毒为黄病毒科的病毒，优选为BVDV。
25.根据第19至24项中任一项所述的方法，其中，所述病毒灭活剂为适用于溶剂/去污剂病毒灭活处理的溶剂/去污剂混合物，或适用于低pH病毒灭活处理的酸性溶液。
26.根据第19至25项中任一项所述的方法，其中，所述病毒灭活剂为用于溶剂去污剂处理的溶剂/去污剂混合物。
27.根据第19至26项中任一项所述的方法，其中，所述方法对至少一种病毒实现了至少1Log10下降值(LRV，reduction value)，至少2LRV，至少4LRV或至少6LRV。
28.根据第27项所述的方法，其中，所述至少一种病毒为第22至24项中任一项所述的病毒。
29.根据第1至28项中任一项所述的方法，其中，所述混合物通过所述结构的表观线速度为600cm/h以下，或300cm/h以下，或200cm/h以下，或100cm/h以下，或50cm/h以下，或20cm/h以下。
30.根据第1至29项中任一项所述的方法，其中，当通过具有多个互连通道的所述结构时，所述混合物的博登斯坦数(Bodenstein number)为50以上，优选为300以上，更优选为400以上，还更优选为500以上，甚至更优选为600以上，最优选为800以上。
31.一种制备生物药物的方法，所述方法包括进行第20至31项中任一项所述的方法，以及回收所述生物药物。
32.一种制备生物药物的装置，所述装置包括无孔珠的填充床。
33.根据第32项所述的装置，其中，所述无孔珠为惰性无孔珠。
34.根据第32或33项所述的装置，其中，所述无孔珠为玻璃珠或陶瓷珠，或塑料珠，例如PMMA珠或钢珠。
35.根据第32至34项中任一项所述的装置，其中，所述无孔珠的平均粒径为0.05mm至1mm，优选为0.05mm至0.6mm，更优选为0.05mm至0.5mm，最优选为0.05mm至0.3mm。
36.根据第32至35项中任一项所述的装置，其中，无孔珠对平均粒径偏离不超过50％，优选不超过35％，最优选不超过20％。
37.根据第32至36项中任一项所述的装置，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少5cm，或至少10cm，或至少20cm，或至少30cm，或至少50cm，或至少70cm，或至少100cm。
38.根据第32至37项中任一项所述的装置，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少20cm。
39.根据第32至38项中任一项所述的装置，其中，所述无孔珠的填充床可以通过包括对所述无孔珠进行振动处理的方法获得。
40.根据第32至39项中任一项所述的装置，其中，对于无孔珠的填充床，空隙体积占总体积的分数为0.2至0.45。
41.根据第32至39项中任一项所述的装置，其中，对于无孔珠的填充床，空隙体积占总体积的分数为0.37至0.42。
42.根据第32至41项中任一项所述的装置，其中，无孔珠的填充床被容纳在柱和/或反应器中。
43.根据第42项所述的装置，其中，所述柱的直径大于5mm，优选地，直径为至少10mm。
44.根据第32至43项中任一项所述的装置，其中，无孔珠的填充床的空隙体积为至少10mL，优选为至少40mL，更优选为至少150mL，甚至更优选为至少470mL，甚至更优选为至少700mL。
45.根据第32至44项中任一项所述的装置，其中，所述装置还包括一个以上混合器，所述混合器连接至无孔珠的填充床。
46.根据第45项所述的装置，其中，所述混合器为静态混合器，例如T型连接混合器(T-junction mixer)，或者其中，所述混合器为动态混合器，例如动态搅拌器。
47.根据第32至46项中任一项所述的装置，其中，所述装置还包括过滤器，并且其中，优选地，所述过滤器位于无孔珠的填充床与第45或46项所述的静态混合器之间。
48.根据第47项所述的装置，其中，所述过滤器的孔径为0.2μm。
49.根据第32至48项中任一项所述的装置，其中，所述装置为连续流反应器。
50.一种调整连续流病毒灭活过程的方法，其中，所述调整包括：使用具有多个互连通道的结构进行连续流病毒灭活，以及使至少两种液体的混合物通过所述结构，从而孵育所述混合物以灭活病毒。
51.根据第50项所述的方法，其中，所述连续流病毒灭活过程是制备生物药物的过程。
52.根据第50至51项中任一项所述的方法，其中，所述病毒灭活过程使用病毒灭活剂进行病毒灭活，并且其中，所述至少两种液体中的第一种液体为可能含有病毒的液体，并且其中，所述至少两种液体中的第二种液体包含病毒灭活剂。
53.根据第50至52项中任一项所述的方法，其中，所述病毒灭活过程用于包膜病毒的病毒灭活。
54.根据第52或53项所述的方法，其中，在所述病毒灭活过程中所用的病毒灭活剂为适用于溶剂/去污剂病毒灭活处理的溶剂/去污剂混合物，或适用于低pH病毒灭活处理的酸性溶液。
55.根据第54项所述的方法，其中，在所述病毒灭活过程中所用的病毒灭活剂为用于溶剂去污剂处理的溶剂/去污剂混合物。
56.根据第50至55项中任一项所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使至少一种病毒达到至少1Log10下降值(LRV)，至少2LRV，至少4LRV或至少6LRV。
57.根据第50至56项中任一项所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得通过具有多个互连通道的所述结构的混合物的博登斯坦数为50以上，优选为300以上，更优选为400以上，甚至更优选为500以上，甚至更优选为600以上，最优选为800以上。
58.根据第50至57项中任一项所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得混合物通过所述结构的表观线速度为600cm/h以下，或300cm/h以下，或200cm/h以下，或100cm/h以下，或50cm/h以下，或20cm/h以下。
59.根据第50至58项中任一项所述的方法，其中，所述调整包括：使用如第4至18项中任一项所述的具有多个互连通道的结构。
60.根据第56至59项中任一项所述的方法，其中，所述调整包括：调节所述混合物在所述结构中的流经时间，实现所述Log10下降值(LRV)；以及，通过调节混合物的表观线速度和/或所述结构的空隙体积，调节流经时间。
应理解，尽管上述优选实施方式描述了“孵育至少两种液体的混合物”和“将所述至少两种液体混合，获得混合物”，但是本发明不限于使用至少两种液体。例如，本发明的方法也可以是孵育至少一种液体和至少一种固体的混合物的方法，该方法包括：i)将所述至少一种液体和所述至少一种固体混合，获得混合物；ii)使所述混合物通过具有多个互连通道的结构，从而孵育所述混合物。例如，在根据本发明的病毒灭活方法中，病毒灭活剂可以以至少一种固体的形式加入。优选地，固体可为粉末形式。还应理解，所有上述优选实施方式也适用于使用至少一种液体和至少一种固体的此方法。
此外，还应理解，尽管上述优选实施方式描述了“孵育至少两种液体的混合物”和“将所述至少两种液体混合，获得混合物”，但是本发明不限于这些方法步骤，而是也可作为其中省略了混合步骤的方法来进行。例如，本发明还涉及孵育液体或孵育至少两种液体混合物的方法，该方法包括：使所述液体或所述混合物通过具有多个互连通道的结构，从而孵育所述液体或所述混合物。还应理解，所有上述优选实施方式也适用于此方法。本发明还涉及孵育至少一种液体和至少一种固体的混合物的方法，该方法包括：使所述混合物通过具有多个互连通道的结构，从而孵育所述混合物。再次应理解，所有上述优选实施方式也适用于此方法。
附图说明
图1：A)穿透(breakthrough)实验的UV曲线的实施例。垂直虚线表示在5％和50％信号处的洗脱体积(EV)。B)具有相应的EV/EV数和博登斯坦数的不同穿透曲线。与博登斯坦数相比，曲线的开始(对病毒灭活至关重要)在EV/EV数上得到了更好的体现。
图2：使用丙酮缓冲液和含溶剂/去污剂的缓冲液的穿透实验之间的比较。列出的是柱和表观线速度，在这些柱和表观线速度下使用不同的缓冲液体系进行成对的实验。计算各缓冲液体系的穿透曲线参数(即，EV5％/EV50％和博登斯坦数)。SD＝过程液体缓冲液和添加有溶剂/去污剂化学品的过程液体缓冲液的组合。
图3：使用丙酮缓冲液和含溶剂/去污剂的缓冲液的穿透实验之间的比较。每个数据点代表一对具有相同设置和不同缓冲液体系的实验：水和2％丙酮(丙酮)、加有溶剂/去污剂化学品的过程液体缓冲液(SD)。缓冲液体系之间的穿透曲线EV5％/EV50％和博登斯坦数的计算参数的相关性很高。
图4：柱参数和表观线速度对博登斯坦数和EV1％/EV50％的影响。
图5：柱长度对博登斯坦数和EV1％/EV50％的影响，作为RTD优度(goodness)的度量。柱都填充有相同批次的珠。在所有附图中所用的柱命名法都遵循以下规则：例如，对于名为“JS_10_陶瓷_HR_26/19.5_0.125_0.25mm”的柱，“10”是赋予柱的特殊整数，“陶瓷”表示无孔珠的材料，“26”为柱的直径[mm]，“19.5”为填充床的高度[cm]，“0.125_0.25mm”为由珠制造商的数据表明的粒径范围。
图6：表观线速度对EV1％/EV50％的影响。
图7：RTD优度参数的偏最小二乘(PLS)预测模型。预测是基于柱长、柱体积、表观线速度、平均珠直径和珠直径范围。
图8：RTD优度参数的PLS预测模型。预测是基于柱长、柱体积、平均珠直径和珠直径范围。
图9：填充质量对RTD的影响。柱JS_07手工填充了许多气泡(即，填充质量差)。在低的表观线速度下，填充不良的柱与用较大珠填充良好的柱的性能相似。但是，在较高的表观线速度下，填充不良的柱的性能不佳。
图10：降低检测限(LOD)。使用10％丙酮进行穿透实验。EV0.03％/EV50％(θ0.03％)和EV1％/EV50％(θ1％)之间的相关性很好，尤其是填充良好的柱。
图11：根据博登斯坦数，将本发明的填充有无孔珠的柱与已知的旋流逆变器(CFI)进行比较。填充床中使用无孔玻璃珠。
图12：根据博登斯坦数，将本发明的填充有无孔珠的柱与已知的旋流逆变器(CFI)进行比较。填充床中使用无孔陶瓷珠。
图13：根据博登斯坦数，将本发明的填充有无孔珠的柱与已知的旋流逆变器(CFI)进行比较。填充床中使用无孔玻璃珠、PMMA塑料珠或陶瓷珠。
图14：可用于病毒灭活的制备生物药物的装置的示例性实施方式。
图15：脉冲注入响应(pulse injection response)是实验穿透曲线的平滑导数(smoothened derivative)。灰色粗线表示当在两个维度上保持LOD点固定时最坏情况的洗脱曲线。黑色粗曲线表示实验数据。开始时的信号下降是由于在重新引导样品通过柱之前在旁通管上冲洗冲洗管的结果。
图16：A、B：可检测到的穿透曲线开始所需的停留时间(LOD时间)(取决于检测限(LOD))，以及假设在60分钟内以分批孵育模式获得了相同的LRV所需的病毒降低率，以及病毒对数降低动力学。
图17：进入连续病毒灭活反应器(CVI)之前混合液体。A：混合两种液体。B：混合三种液体。C：混合任意数量的液体。
图18：进入病毒灭活反应器(CVI)之前液体混合的顺序。A：混合两种液体。B：混合三种液体，其中先将两种液体混合再将第三种液体与所得混合液混合。C：可在混合另外的液体之前混合任意数量的液体。
图19：病毒灭活(CVI)上游的示例性处理步骤(以及对应的反应器单元)。A：在病毒灭活之前，引入缓冲罐(surge tank)。(左)CVI上游的分批式色谱(batchchromatography)。(中)CVI上游的逆流上样色谱(counter-current loadingchromatography)。(右)CVI上游的模拟移动床色谱。B：无缓冲罐的无缝直通处理。(左)分批式色谱。(中)逆流上样色谱。(右)模拟移动床色谱。
图20：病毒灭活下游的示例性处理步骤(以及对应的反应器单元)。A：逆流模式下的溶剂去污剂萃取。B：并流模式下的溶剂去污剂萃取。C：分批式色谱。D：逆流上样色谱。E：模拟移动床色谱。
图21：A：1.75L大型柱(停留时间分布窄得多)比任何(较小)实验室规模的柱的博登斯坦数大得多，而一些实验室规模的柱的博登斯坦数已完全超过旋流逆变反应器。B：除了标度为对数形式外，其他与图A相同。C：1.75L大型柱的性能非常好。相比之下，装有相同批次的珠的小型柱(d＝26mm，l＝19.5cm)的EV1％/EV50％得分为0.88至0.92，博登斯坦数为800至1800。
图22：用于柱填充的振动装置的说明性实施方式的图片。1.振动马达，2.钢框架，3.柱，4.运动传感器，5.数据记录仪，6.电源控制。
图23：表观线速度[cm/h]的说明性解释：表观线速度是假设结构(例如，无孔珠的填充床)是空的(例如未填充珠的)时流体行进的线速度。图中显示了示例性结构(以填充有互连通道的圆柱体(B)或空的圆柱体(A)的形式示出)。
图24：CVI设置的图。该设置包括两个泵、一个混合器和CVI。
图25：CVI过程出口处的浓度曲线。该图显示了以进口浓度(C0)为标准进行归一化的出口浓度(C)。该过程分为两个阶段：启动(或等待时间)阶段和稳态阶段。启动阶段由曲线的初始0％浓度部分和随后的浓度从0至100％的过渡表示。启动阶段代表预先在CVIR内进行的液相置换和冲洗，直至出口处的浓度与入口处的浓度匹配为止。稳态阶段由曲线的100％浓度部分表示。在此实施方式中，稳态开始于2VR之前。
图26：在30分钟和60分钟的孵育时间下CVI过程的病毒滴度结果(分别在左侧和右侧)。0VR处的标记表示与S/D组分混合之前加标(spike)测试项目的X-MuLV滴度。在1VR、2VR、3VR、4VR和5VR处的标记分别表示进行1、2、3、4和5个反应体积后CVIR出口处的X-MuLV滴度。实心标记表示病毒滴度，空心标记表示滴度低于LOD的样品。
图27：在30分钟和60分钟的孵育时间下连续病毒灭活过程期间收集的各样品的LRV(分别为顶部和底部)。所示样品是在进行1VR、2VR、3VR、4VR和5VR之后取样的，还包括一个保持对照(HC，hold control)。HC样品从同一注射器中抽取，该注射器包含在完成CVI之后(5VR之后)时间的加标测试。实心填充的条形显示了LRV数据，斜线填充的条形表示最小的LRV(这是由于样本低于LOD)。
图28：在传统的分批病毒灭活过程中收集的各样品的LRV。所示样品在孵育60分钟后获取，还包括一个保持对照(HC)。通过在与包含S/D灭活实验相同的条件下，在不含S/D化学品的情况下孵育加标测试品，获得HC样品。实心填充的条形显示了LRV数据，斜线填充的条形表示最小的LRV(这是由于样本低于LOD)。
图29：在30分钟和60分钟的孵育时间下CVI过程的病毒滴度结果(分别为左图和右图)。0VR处的标记表示加标测试品与S/D组分混合之前的BVDV滴度。在1VR、2VR、3VR、4VR和5VR处的标记分别表示在进行1、2、3、4和5个反应体积后CVIR出口处的BVDV滴度。实心标记表示病毒滴度，空心标记表示滴度低于LOD的样品。
图30：在30分钟和60分钟的孵育时间下连续病毒灭活过程中收集的各样品的LRV(分别为上图和下图)。所示样品在进行1VR、2VR、3VR、4VR和5VR后取样，还包括一个保持对照(HC)。HC样品从同一注射器中抽取，该注射器包含在完成CVI之后(5VR之后)时间的加标测试。实心填充的条形显示了LRV数据，斜线填充的条形表示最小的LRV(这是由于样本低于LOD)。
图31：在传统的分批病毒灭活过程中收集的各样品的LRV。所示样品在孵育60分钟后获取，还包括一个保持对照(HC)。通过在与含S/D灭活实验相同的条件下，在不含S/D化学品的情况下孵育加标测试品，获得HC样品。实心填充的条形显示了LRV数据，斜线填充的条形表示最小的LRV(这是由于样本低于LOD)。
具体实施方式
定义
除非下文另有定义，否则应根据本领域技术人员已知的通用含义来理解本发明中所用术语。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文以用于所有目的。
如本文所用，术语“停留时间”通常指从液体的一部分进入处理设备的一部分的时刻起，直至液体的相同部分离开处理设备的该部分所经过的时间的量。如果液体的一部分的平均线速度高，则停留时间短。如果一部分液体的平均线速度低，则停留时间长。在本发明的一个优选实施方式中，术语“停留时间”指从液体的一部分进入具有多个互连通道的结构的时刻起，直至该液体的相同部分离开具有多个互连通道的结构所经过的时间的量。替代地且更优选地，该术语指从液体的一部分进入具有多个互连通道的结构的时刻起，直至液体的相同部分离开具有多个互连通道的结构为止所通过的柱体积的数量。停留时间和洗脱体积通过以下公式关联：
洗脱体积(以柱体积为标准)＝停留时间·柱横截面·表观线速度
当液体的不同部分具有不同的停留时间时，即使液体的所有部分同时进入处理设备(例如，本发明的具有多个互连通道的结构)的一部分，液体的各部分也会在他们的停留时间方面具有分布。换言之，液体的不同部分显示出停留时间的分布，这也称为“停留时间分布”或“RTD”。如果液体的不同部分之间的流速之间存在较大差异，则停留时间分布宽；如果液体的不同部分之间的流速差异很小，则停留时间分布窄。本发明的具有多个互连通道的结构的优点之一是，它使得可以获得窄的停留时间分布。
应理解，术语“至少一种液体和至少一种固体的混合物”定义为当所述至少一种液体和至少一种固体混合时，该固体以固态存在。这不排除以下可能性：在所述至少一种液体和至少一种固体的混合物中，固体可溶解，例如同时进行根据本发明的其他方法步骤。
根据本发明的所有其他实施方式，两种液体的混合物或至少一种液体和至少一种固体的混合物可为水溶液。
如本文所用，术语“互连通道”指结构中的通道，该通道可被所述结构外部的流体进入。至少一些通道彼此互连。这样，当结构暴露于液体时，该液体可通过彼此互连的那些通道穿过该结构。应理解，与本发明有关的具有多个互连通道的结构使得适用于根据本发明使至少两种液体的混合物通过该结构。
如本文所用，与本发明的方法或过程或其步骤有关的术语“连续的”或“连续”或“连续流”具有本领域通常已知的含义。该术语描述了方法或过程或其步骤的进行不间断。如果本文使用与具体的方法步骤或过程步骤(例如，本发明的混合和通过步骤)有关的术语“连续的”或“连续”或“连续流”，则意味着该步骤不间断地发生。如果本文使用与本发明的方法或过程有关的术语“连续的”或“连续”或“连续流”，则意味着该方法或过程不间断地发生。优选地，在连续进行方法或过程的情况下，所有方法或过程方法步骤均连续进行。或者，也可能仅方法或过程的输出是连续的，而所述方法或过程的部分(例如特定方法步骤或过程步骤)不连续进行或半连续进行。例如，一系列的分批处理过程可以实现随时间的连续的输出，尽管各个过程不连续运行。
如本文所用，术语“无孔珠(non-porous bead)”指可用于本发明的无孔珠的填充床的任何合适的无孔珠。“无孔珠”可为球形或不规则形状。在本发明的所有其他实施方式的优选实施方式中，无孔珠优选为球形。例如，“无孔珠”可由与生物制药过程兼容的任何固体颗粒材料制成，例如塑料、玻璃或金属。
无孔珠为本领域已知且可商购。
玻璃珠在本领域中是已知的，例如可由二氧化硅玻璃制成。例如，玻璃珠可从Cospheric LLC购买。
塑料珠也是已知的，例如可由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)或聚苯乙烯(PS)制成。例如，塑料珠可从Cospheric LLC，Altuglas Arkema和KiskerBiotech购买。
钢珠在本领域中也是已知的，例如可由不锈钢制成。例如，钢珠可从Cosphere LLC购买。
如本文所用，术语“陶瓷珠”指适于形成本发明的“无孔珠的填充床”的任何陶瓷珠。例如，陶瓷珠可从Kuhmichel Abrasiv GmbH购买。
对本发明的无孔珠的填充床没有特别限制，例如可装在各种形状的容器(例如柱或反应器)中。容器的尺寸没有特别限制，可根据所需的通过量和孵育时间来选择。
与本发明的无孔珠有关的术语“惰性”具有该术语在本领域已知的含义。在一个优选的实施方式中，惰性无孔珠不以任何方式官能化。用于本发明的无孔珠的惰性材料可由本领域技术人员选择。例如，在本发明的方法或过程中，可选择适当的已知惰性材料，以使它们不或基本上不(例如，测量不到)与流过珠的床的液体或液体混合物反应。例如，本发明的惰性无孔珠优选为不与或基本上不与本发明的液体混合物发生化学反应的珠。本发明的惰性无孔珠优选为不向液体混合物中添加组分的珠。本发明的惰性无孔珠优选不吸收或吸收液体混合物中的组分。
如本文所用，术语“对平均粒径偏离”给定百分比指取决于平均粒径的偏差。例如，如果平均粒径为0.2mm的珠对平均粒径偏离不超过50％，则95％的珠的粒径为0.3mm以下且0.1mm以上。类似地，如果平均粒径为0.2mm的珠对平均粒径偏离不超过20％，则95％的珠的粒径为0.24mm以下且0.16mm以上。对于本发明所用的非球形颗粒，粒径指颗粒的最长轴。
如本文所用，术语“振动处理”指涉及振动并且适用于增加无孔珠的填充床的填充密度的任何处理。例如，可使用振动装置对无孔珠的填充床进行振动处理。
优选的振动装置包括架子，柱子固定在该架子上。在使用振动装置进行振动处理的实施例中，空柱被固定，并且在振动期间添加珠粒。然后，使用振动马达使架子振动。例如，所述马达可以电动驱动或气动驱动。可使用小于40kHz(优选1kHz至10kHz)的振动频率、小于10g(优选0g至5g)的加速度和小于5mm(优选最高2mm)的振动振幅，来填充无孔珠的填充床。用于进行柱填充的振动装置的说明性实施例如图22所示。
如本文所用，术语“反应器”指适于容纳流体的任何容器或其他结构。可使用反应器以使流体发生化学反应。然而，在本发明中，术语“反应器”还指其中不发生化学反应的反应器。应理解，可基于预期用途来调节反应器。例如，应理解，用于病毒灭活的反应器将适用于病毒灭活。同样，如果反应器用于制备生物药物，则该反应器将适用于该药物的制备。
如本文所用，术语“3D打印的几何形状”指使用3D打印机打印的任何预制的多孔结构。
本文所用的术语“包膜病毒”具有本领域技术人员已知的含义。例如，包膜病毒可为疱疹病毒科，例如单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒或爱泼斯坦-巴尔(Epstein–Barr)病毒；肝炎病毒科，例如乙型肝炎病毒；披膜病毒科，例如风疹病毒或甲病毒属；砂粒病毒科，例如淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒；黄病毒科，例如登革热病毒或牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、丙型肝炎病毒或黄热病病毒；正粘病毒科，例如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、伊萨病毒(isavirus)或托高土病毒属(thogotovirus)；副粘病毒科，例如麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒或犬瘟热病毒；布尼亚病毒科，例如加利福尼亚脑炎病毒或汉坦病毒；弹状病毒科，例如狂犬病毒；丝状病毒科，例如埃博拉病毒或马尔堡病毒；冠状病毒科，例如冠状病毒；玻那病毒科(Bornaviridae)，例如博纳病(Borna disease)病毒；或动脉病毒科(Arteriviridae)，例如动脉炎病毒属或马动脉炎病毒；逆转录病毒科，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)或异嗜性鼠白血病病毒(X-MuLV)、人类嗜T淋巴病毒1(HTLV-1)；痘病毒科，例如天花正痘病毒(天花病毒(Variolavirus))。
如本文所用，术语“溶剂/去污剂混合物”具有本领域技术人员已知的含义。术语“溶剂/去污剂混合物”还涉及仅包含溶剂或仅包含去污剂的混合物。在一个优选的实施方式中，本发明所用的溶剂/去污剂混合物包含除水以外的至少一种溶剂和至少一种去污剂。混合物中所含的不同溶剂和/或去污剂的数量没有特别限制。例如，溶剂/去污剂混合物可由磷酸三正丁酯、聚山梨酯80和Triton X-100组成。
如本文所用，术语“溶剂-去污剂病毒灭活处理”具有本领域技术人员已知的含义。在一个优选的实施方式中，可使用溶剂去污剂处理包膜病毒，例如通过去除包膜病毒的脂质膜。然而，本发明的“溶剂-去污剂病毒灭活处理”不限于此。例如，本发明的“溶剂-去污剂病毒灭活处理”还可包括对非包膜病毒的处理，例如，其通过使病毒(例如非包膜病毒)表面的蛋白质变性来起作用。
本文所用的术语“Log10下降值(Log10 reduction value)”或“LRV”是流体中感染性病毒颗粒减少的量度，定义为病毒灭活前感染性病毒颗粒浓度与病毒灭活后感染性病毒颗粒浓度的比率的对数(以10为底)。LRV值特定于给定类型的病毒。对于本领域技术人员而言显而易见的是，任何大于0的Log10下降值(LRV)对于提高方法和过程(例如生物制药生产方法和过程)的安全性都是有益的。根据本发明，LRV可通过本领域已知的任何适当方法来测量。优选地，本文所称的LRV是通过噬斑测定法或通过TCID50测定法测得的LRV，更优选为通过TCID50测定法测得的LRV。这些测定法是本领域技术人员已知的。优选地，本发明提及的LRV是包膜病毒的LRV。例如，本文所用的“TCID50测定法”指组织培养物感染量测定法。TCID50测定法是终点稀释测试，其中，TCID50值表示在50％的接种的细胞培养物中诱导细胞死亡或病理变化所需的病毒浓度。
本发明所用术语“流量(flow rate)”和“体积流量”可互换使用，指单位时间内通过本发明的具有多个互连通道的结构的混合物的体积。体积流量(或流量)优选以mL/min测量。体积流量(或流量)是恒定的，而与管道的直径无关，与具有多个互连通道的结构(例如，柱)的直径无关，也与泵活塞无关。通常通过改变泵速度来设置所需的流量。例如，如果在具有多个互连通道的结构的上游使用一个以上的泵，则体积流量(或流量)是所述泵单位时间置换的总体积。例如，活塞泵例如在活塞的各个冲程中输送限定体积的流体。注射泵由线性马达驱动。使用注射器直径和注射器活塞被马达推动的距离，可计算出单位时间的置换体积。或者，流量也可通过本领域已知的流量计来测量。
通常，“线速度”定义为流量除以液体所通过的结构的横截面积：
线速度＝(体积流量)/(横截面积)
与本发明的结构结合使用的术语“线速度”指体积流量除以具有多个互连通道的结构的横截面积。横截面通常可为圆形，即，横截面为圆。
在本发明的具有多个互连通道的结构(例如无孔珠的填充床)中，可区分出两种不同的线性流体速度：
a)表观线速度(优选以[cm/h]表示)：表观线速度是假设结构(例如无孔珠的填充床)是空的(例如，未装填珠)时流体流动的线速度。图23中显示了示例性结构(以填充有互连通道(B)或空的(A)的圆柱体的形式示出)。
b)间隙线速度(Interstitial linear velocity)(优选以[cm/h]表示)：间隙速度是通过具有多个互连通道的结构(例如通过无孔珠的填充床)的实际流体速度。由于流体只能通过互连通道(例如，围绕珠)流动，因此间隙速度始终高于表观速度。
除非另有说明，否则本文中所用的术语“线速度”的所有出现均指表观线速度。可以通过用流量(或体积流量)除以具有多个互连通道的结构的横截面积来计算表观线速度(假定结构是空的)。
如本文所用，术语“检测限”或“LOD”指物质的最低可检测份额，例如，指悬浮液中珠的最低可检测份额。如本文中所用，术语“检测限时间”或“LOD时间”指物质(例如，示踪物质，例如悬浮液中的珠)发出的信号(例如，来自细胞的信号)超过检测限(LOD)的时间点。
如本文所用，术语“博登斯坦数”具有本领域技术人员已知的含义。例如，其描述于Levenspiel，Chemical Reaction Engineering(第3版)，John Wiley&Sons，1999(参考文献8)，其全部内容通过引用并入本文以用于所有目的。博登斯坦数是无量纲的，它表征系统内的返混(backmixing)。因此，博登斯坦数可指示液体体积或化合物返混的程度。例如，小的博登斯坦数表示大程度的返混，而大的博登斯坦数表示小程度的返混。如本领域技术人员将知道的，博登斯坦数可用作停留时间分布的量度并且可通过本领域已知的方法来确定。在本发明中，优选地，可通过将函数F拟合到穿透曲线来计算博登斯坦数(例如实施例中所示；参见例如图1A)，其中，F(EV)表示高斯峰的积分(例如添加到混合物中的示踪物质的紫外线信号，所述混合物通过本发明的具有多个互连通道的结构)，并且Bo表示博登斯坦数，EV表示给定时间点的洗脱体积，EV50％表示平均值停留时间的洗脱体积：
Figure BDA0002402425860000161
图1B表示具有相应的EV/EV数和博登斯坦数的几种不同的穿透曲线。该图表明，与博登斯坦数相比，EV/EV数更好地反映了曲线的开始(对于病毒灭活至关重要)。
根据本发明，术语“包含”的每次出现可以可选地由术语“由...组成”代替。
在下文中，我们将描述本发明的特定实施方式，但是本发明不限于此。而且，根据本发明，以下任何实施方式都可以与以下任何其他任何实施方式组合。
根据本发明所用的具有多个互连通道的结构可为整料或预制结构，例如3D打印的几何形状，但是优选为无孔珠的填充床。因此，特别是无孔珠的填充床可与本发明的任何其他实施方式结合。
本发明所用的无孔珠的填充床可容纳在各种形状的容器中，例如柱和/或反应器中。优选地，无孔珠的填充床完全填充容器，即它不留下任何大间隙。优选地，所述容器包括位于容器相对端的至少一个入口和至少一个出口。这样，流体可通过入口进入容器，通过无孔珠的填充床，并通过出口离开容器。优选地，所述容器是柱。
本发明所用的无孔珠填充床的容器可具有任何形状，例如它可具有圆形基座、角形基座或矩形基座。优选地，容器具有圆形基座。在本发明的一个特别优选的实施方式中，本发明所用的无孔珠的填充床被容纳在具有圆形基座的柱中。
本发明所用无孔珠的填充床的长度没有特别限制，并且可考虑液体所需通过量、所需表观线速度和所需平均停留时间进行调节。特别地，可基于液体所需表观线速度和所需平均停留时间来选择无孔珠的填充床的长度。例如，如果所需表观线速度为20cm/h，并且假定无孔珠的填充床的孔隙率等于0.4，并且所需平均停留时间为至少1h，则无孔珠的填充床的长度需要为至少50cm。如果所需表观线速度为20cm/h，并且所需平均停留时间为至少3h，则无孔珠的填充床的长度需要为至少150cm。在一个优选的实施方式中，所需表观线速度为约20cm/h，所需平均停留时间为至少1小时，使得无孔珠的填充床需要具有至少50cm的长度。发明人发现，本发明所用的无孔珠的填充床越长，通过无孔珠的床的液体的停留时间分布越窄。因此，如果本发明所用无孔珠的填充床更长(例如，如果长度为至少5cm，或至少10cm，或至少20cm，或至少30cm，或至少50cm，或至少70cm，或至少100cm)，则对于窄的停留时间分布是有利的。
本发明所用的无孔珠的填充床的宽度或直径没有特别限制，并且可基于液体的所需通过量、所需表观线速度和所需平均停留时间进行选择。对于技术人员显而易见的是，无孔珠的填充床的宽度或直径的选择会考虑珠的尺寸。换言之，将选择无孔珠的填充床的宽度或直径，以使其足以容纳珠。在本发明的优选实施方式中，柱直径为5mm，优选为至少10mm。
本发明所用的无孔珠的填充床的体积没有特别限制，并且可考虑液体的所需通过量、所需表观线速度和所需平均停留时间来选择。然而，发明人惊奇地发现，当液体通过无孔珠的床时，大体积的无孔珠的填充床比小体积提供更窄的停留时间分布。因此，优选大体积的无孔珠的填充床，例如空隙体积为至少10mL，优选为至少40mL，更优选为至少150mL，甚至更优选为至少470mL，甚至更优选为至少700mL。
形成本发明所用的无孔珠的填充床的无孔珠可具有各种平均粒径。应理解，可容易地选择无孔珠的直径，使得由珠之间的空间形成的互连通道适用于使液体(例如，本发明所用混合物)的组分(例如，生物药物)通过无孔珠的填充床。另一方面，发明人惊奇地发现，形成本发明的无孔珠填充床的珠的平均粒径越小，通过填充床的液体的停留时间分布越窄。因此，本发明所用的珠优选为0.05mm至1mm，更优选为0.05mm至0.6mm，甚至更优选为0.05mm至0.5mm，并且最优选为0.05mm至0.3mm。而且，发明人惊奇地发现，本发明所用的珠的平均粒径越均匀，通过无孔珠填充床的液体的停留时间分布越窄。因此，本发明所用的珠对平均粒径偏离优选不超过50％，更优选不超过35％，最优选不超过20％。
优选地，形成本发明所用的无孔珠的填充床的无孔珠为惰性。
优选地，形成本发明所用的无孔珠的填充床的无孔珠为球形。
可通过各种方式装填无孔珠，以形成本发明所用的无孔珠的填充床。发明人发现，装填质量的差异会影响通过无孔珠的填充床的液体的流动路径，并因此影响停留时间分布。
装填本发明所用的无孔珠的示例性手段是在经过和不经过振动处理情况下的干式装填或湿式装填。液体装填可通过重力或在流动下进行。装填本发明所用的无孔珠的优选方式是装填振动处理。还优选湿式装填，更优选与振动处理结合。可以例如通过确定通过无孔珠填充床的液体的停留时间分布，来确定装填质量。窄的停留时间分布表明装填质量好，宽的停留时间分布表明装填质量差。
用于孵育至少两种液体的混合物的本发明方法包括：将所述至少两种混合物混合，获得混合物，以及，使所述混合物通过具有多个互连通道的结构，从而孵育所述混合物。优选地，所述混合和通过连续进行。令人惊讶地，发明人发现，当根据本发明使液体(例如至少两种液体的混合物)通过具有多个互连通道的结构以孵育所述液体(例如所述混合物)时，发生了停留时间分布特别窄的孵育。此种窄停留时间分布对于所有类型的连续操作过程(其中必须将液体混合并孵育一定的时间)都是有利的，因为这样可更精确地选择孵育时间。
在本发明的孵育方法中，混合物通过具有多个互连孔的结构的表观线速度没有特别限制，并且可基于所需通过量进行选择。发明人发现，与较高的表观线速度相比，本发明的液体(例如，本发明所用的混合物)以较低的表观线速度通过具有多个互连通道的结构提供了更窄的停留时间分布。因此，本发明的孵育方法中的表观线速度优选为600cm/h以下，或300cm/h以下，或200cm/h以下，或100cm/h以下，或50cm/h以下，或20cm/h以下。最优选地，表观线速度50cm/h以下。
如本领域技术人员将知道的，博登斯坦数可用作停留时间分布的量度。小的博登斯坦数指示宽的停留时间分布，大的博登斯坦数指示窄的停留时间分布。如上所述，在根据本发明的孵育方法中，非常优选地，通过具有多个互连通道的结构的混合物具有窄的停留时间分布。因此，在根据本发明的孵育方法中，优选地，通过具有多个互连通道的结构的混合物的博登斯坦数为50以上，更优选为300以上，甚至更优选为400以上，甚至更优选为500以上，甚至更优选为600以上，最优选为800以上。
过程的一个实例是连续病毒灭活，在该过程中，液体(例如，至少两种液体的混合物)在通过具有多个互连通道的结构的同时被孵育一段确定的时间。因此，在本发明的优选实施方式中，根据本发明的孵育方法用于连续灭活病毒。在此优选实施方式中，所述至少两种液体的第一种液体是可能含有病毒的液体，所述至少两种液体的第二种液体包括病毒灭活剂。当孵育可能含有病毒的液体和包含病毒灭活剂的液体的混合物时，可选择孵育时间，以使该时间足够长，以实现给定病毒足够的Log10下降值(LRV)。另一方面，优选地，还可以选择孵育时间，使得孵育时间足够短以确保液体中可能包含的其他成分(例如生物药物)不会被病毒灭活剂破坏。如果对于液体(例如，至少两种液体的混合物)的所有(或至少多数)部分，孵育时间是相似的，则可更容易地实现既不短也不长的合适孵育时间。因此，根据本发明获得的窄停留时间分布是有利的，因为它们例如使得可以选择此种合适的孵育时间。
在生物药物生产过程中，通常使包含生物药物的混合物中的病毒失活，以确保将生物药物制成药物组合物后，该药物组合物不会对患者造成任何伤害。因此，根据本发明的病毒灭活的方法或过程在生物制药生产过程中特别有用。因此，在本发明的病毒灭活的方法或过程的优选实施方式中，至少两种液体的混合物(该混合物通过具有多个互连通道的结构)中的第一种液体包括生物药物。因此，本发明还涉及一种制备生物药物的方法，其中，在进行本发明的孵育方法之后，回收所述生物药物。
在进行本发明的孵育方法之后可合适地用于回收生物药物的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，可使用各种色谱方法来回收生物药物。此类方法可由本领域技术人员在考虑生物药物的性质、其获得来源(例如，重组或其他来源，例如人血浆)以及预期生物制药应用(例如，是否将其通过皮下或静脉注射等方式给药)后进行选择。
对本发明的生物药物没有特别限制。它们包括重组生物药物和其他来源的生物药物，例如人血浆来源的生物药物。根据本发明的生物药物包括但不限于血液因子、免疫球蛋白、替代酶、疫苗、基因治疗载体、生长因子及其受体。优选的血液因子包括I因子(纤维蛋白原)、II因子(凝血酶原)、组织因子、V因子、VII因子和VIIa因子、VIII因子、IX因子、X因子、XI因子、XII因子、XIII因子、von Willebrand因子(VWF)、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI1)和纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)。本发明所用的血液因子旨在包括功能性多肽变体和编码血液因子或编码此种功能性变体多肽的多核苷酸。优选的免疫球蛋白包括来自人血浆的免疫球蛋白、单克隆抗体和重组抗体。根据本发明的生物药物优选为相应的人或重组人蛋白或其功能性变体。
在回收通过本发明的制备生物药物的方法获得的生物药物之后，可将该生物药物制成药物组合物。可根据制备药物组合物的已知标准来制备此种药物组合物。例如，可以以能够适当地存储和施用的方式来制备组合物，例如，通过使用药学上可接受的组分(例如载体、赋形剂或稳定剂)。当将药物组合物施用于患者时，这种药学上可接受的组分的用量是无毒的。
与本发明的病毒灭活的方法或过程的所有实施方式有关，优选地，所述方法或过程为连续病毒灭活的方法或过程。
特别地，在本发明的病毒灭活的方法或过程中，监测液体在具有多个互连通道的结构中的停留时间及其停留时间分布可能是有益的。此种监测使得可以识别通过具有多个互连通道的结构的混合物的液体的任何给定部分是否没有在具有多个互连通道的结构中度过足够的时间。在本发明的连续病毒灭活的方法中，识别通过具有多个互连通道的结构的混合物的液体的任何给定部分是否没有在具有多个互连通道的结构中度过足够的时间是有益的，因为在此种情况下，第一种液体(例如，包含生物药物)暴露于病毒灭活剂的时间可能没有足够长，无法达到给定病毒所需的Log10下降值。在此种情况下，本领域技术人员可以修改本发明的病毒灭活的方法或过程，例如通过增加具有多个互连通道的结构的长度和/或通过降低表观线速度。
在本发明的病毒灭活的方法或过程中，为了监测液体在具有多个互连通道的结构中的停留时间及其停留时间分布，可将示踪剂样品周期性地加标到该具有多个互连通道的结构的上游。例如，可将示踪剂样品周期性地加标到第一种液体中，然后将其与第二种液体和任选的其他液体混合。或者，可将示踪剂样品周期性地加标到至少两种液体的混合物中，并与所述混合物混合。随后，当使包含示踪剂的混合物通过本发明的具有多个互连通道的结构时，可在具有多个互连通道的结构的上游和下游处监测混合物中示踪剂的浓度。可通过任何合适的方法来进行此监测。合适的分析方法是本领域技术人员已知的。例如，此类方法可基于荧光检测、吸光度检测或核磁共振(NMR)。因此，在一个优选的实施方式中，本发明的病毒灭活的方法或过程包括监测液体(例如，本发明所用的至少两种液体的混合物)在具有多个互连通道的结构中的停留时间和停留时间分布的步骤，所述步骤包括：将示踪剂样品周期性地加标到所述液体中(例如加到本发明所用的至少两种液体的所述混合物中)，以及监测具有多个互连通道的结构的上游和下游处所述液体(例如本发明所用的至少两种液体的所述混合物)中所述示踪剂的浓度。此步骤的优点在于，它使得可以在连续生产过程中监测具有多个互连通道的结构的质量，例如，为了检测结构的潜在堵塞或其他干扰。此外，该步骤的优点还在于，它使得可以监测具有多个互连通道的结构的停留时间分布能否保持足够窄从而提供例如所需的LRV，例如LRV为4。
在本发明的灭活病毒的方法或过程中，优选病毒灭活剂为适用于溶剂/去污剂病毒灭活处理的溶剂/去污剂混合物。对本发明的溶剂/去污剂混合物没有特别限制。例如，溶剂/去污剂混合物可包含单一有机溶剂和多种表面活性剂、多种有机溶剂和单一表面活性剂，或多种有机溶剂和多种表面活性剂。应理解，去污剂和/或溶剂的类型及其各自的浓度可由技术人员适当地选择，例如考虑液体中可能存在的病毒、所需LRV、生物药物的性质、生物药物制造过程的特征(例如，灭活将在哪个温度下进行)。通常，在本发明的孵育期间，有机溶剂和单一表面活性剂的最终浓度为约0.1％(v/v)至约5％(v/v)的有机溶剂和约0.1％(v/v)至约10％(v/v)的表面活性剂。当使用多种表面活性剂时，一种有机溶剂的最终浓度为约0.1％(v/v)至约5％(v/v)；一种表面活性剂的最终浓度为约0.1％(v/v)至约10％(v/v)、约0.5％(v/v)至约5％(v/v)或约0.5％(v/v)至约1.0％(v/v)；并且其余表面活性剂的最终浓度为约0.1％(v/v)至约5％(v/v)、约0.1％(v/v)至约1.0％(v/v)或约0.2％(v/v)至约4％(v/v)。
在本发明的一个实施方式中，溶剂/去污剂混合物包含磷酸三正丁酯和聚氧乙烯辛基苯基醚(也称为例如
Figure BDA0002402425860000211
X-100)。在另一个实施方式中，溶剂/去污剂混合物包含磷酸三正丁酯和聚氧乙烯(80)脱水山梨醇单油酸酯(也称为例如聚山梨酯80或
Figure BDA0002402425860000212
80)。
在本发明的另一个实施方式中，溶剂/去污剂混合物包含磷酸三正丁酯、聚氧乙烯辛基苯基醚(
Figure BDA0002402425860000213
X-100)和聚氧乙烯(80)脱水山梨醇单油酸酯(也称为例如聚山梨酯80或
Figure BDA0002402425860000214
80)。
在根据本发明的病毒灭活的方法或过程的优选实施方式中，将包含生物药物的第一种液体和包含适于溶剂/去污剂病毒灭活处理的溶剂/去污剂混合物的第二种液体混合，并且使混合物随后通过具有多个互连通道的结构。对本领域技术人员显而易见的是，例如，可在具有多个互连孔的结构的上游或在具有多个互连孔的结构的下游，监测通过具有多个互连通道的结构的混合物中用于溶剂/去污剂病毒灭活处理的混合物中一种或多种组分的浓度。例如，可使用本领域技术人员众所周知的UV VIS光谱和傅立叶变换红外(FTIR)光谱，来跟踪通过具有多个互连通道的结构的混合物的一种或多种组分。
或者，在本发明的连续病毒灭活方法中，病毒灭活剂可为适用于低pH病毒灭活处理的酸性溶液。适用于低pH病毒灭活处理的酸性溶液可包含适用于低pH病毒灭活处理的任何无机酸或有机酸。
在本发明的灭活病毒的方法或过程中，优选地，该方法对至少一种病毒实现了至少1Log10下降值(LRV)，或至少一种病毒的至少2Log10下降值(LRV)，或至少一种病毒的至少3Log10下降值(LRV)，或至少一种病毒的至少4Log10下降值(LRV)，或至少一种病毒的至少5Log10下降值(LRV)，或至少一种病毒的至少6Log10下降值(LRV)，或至少一种病毒的至少7Log10下降值(LRV)，或至少一种病毒的至少8Log10下降值(LRV)，最优选对至少一种病毒实现了至少4Log10下降值(LRV)。当然，对于本领域技术人员显而易见的是，至少一种病毒的任意Log10下降值(LRV)都是有益的，因为它提高了例如生物制药生产过程的安全性。本发明提到的LRV优选为包膜病毒的LRV。
如本领域技术人员已知地确定本发明的病毒灭活的方法实现的Log10下降值(LRV)。例如，LRV可通过在使液体进行本发明的连续病毒灭活方法之前和之后测定液体中的感染性病毒颗粒浓度来确定。更具体地，LRV可通过如下方式测定：测定第一种液体中的感染性病毒颗粒浓度；将第一种液体与包含病毒灭活剂的第二种液体混合，使第一种液体进行本发明的连续病毒灭活方法；以及在进行本发明的连续病毒灭活方法后，测定第一种液体和第二种液体的混合物中的感染性病毒颗粒浓度。在测定病毒灭活之前和之后的感染性病毒颗粒浓度后，任何给定病毒的LRV可通过如下方式确定：计算病毒灭活前感染性病毒颗粒(＝病毒灭活前感染性病毒颗粒的浓度*病毒灭活前的体积(例如第一种液体的体积))与病毒灭活后感染性病毒颗粒(＝病毒灭活后(例如第一种液体和第二种液体的混合物中)感染性病毒颗粒的浓度*病毒灭活后的体积(例如第一种液体的体积+第二种液体的体积))的比率的对数(以10为底)。
技术人员知晓用于确定液体中感染性病毒颗粒浓度的多种方法。例如但不限于，液体中的感染性病毒颗粒浓度可优选通过噬斑测定法或通过TCID50测定法来测定，更优选通过TCID50测定法来测定。
如本领域技术人员所知，通过将液体与适用于溶剂/去污剂病毒灭活处理的溶剂/去污剂混合物混合来灭活病毒，以及通过将液体与适用于低pH值病毒灭活处理的酸性溶液混合来灭活病毒，对于灭活包膜病毒特别有效。因此，在一个优选的实施方式中，本发明的病毒灭活的方法或过程用于包膜病毒的连续病毒灭活。
本发明还公开了一种根据本发明的方法制备生物药物的装置。所述装置包括无孔珠的填充床。由于包括无孔珠填充床的装置优选用于本发明的方法，因此包含在装置中的珠填充床优选具有与如上所述本发明所用的无孔珠填充床相同的实施方式。
在本发明的制备生物药物的方法中，将包含生物药物的第一种液体和包含病毒灭活剂的第二种液体混合，然后使混合物通过具有多个互连通道的结构。在本发明的可选实施方式中，在使混合物通过具有多个互连通道的结构之前，可使用静态混合器来混合至少两种液体。因此，在本发明的一个实施方式中，本发明的制备生物药物的装置包括静态混合器。在本实施方式的一个优选方面，所述静态混合器位于无孔珠填充床的上游。在本实施方式的另一个优选方面，所述静态混合物是T型连接混合器。
在本发明的制备生物药物的方法中，至少两种液体的混合物可包含碎片(例如细胞碎片)或上游生物制药生产过程中的其他不溶性成分。因此，可能需要例如通过过滤从混合物中除去所述不溶性成分。因此，在本发明的一个实施方式中，本发明的制备生物药物的装置包括过滤器。在本实施方式的一个优选方面，所述过滤器位于无孔珠填充床的上游。在本实施方式的一个甚至更优选的方面，过滤器位于无孔珠的填充床的上游，并且在混合器例如T型连接混合器或动态混合器的下游。过滤器的孔径没有特别限制，并且将由本领域技术人员通过考虑例如需要通过过滤器的生物药物的尺寸以及应从该过程中去除的成分(例如细胞碎片或上游生物制药生产过程中的其他不溶性成分)的尺寸来进行选择。在一个优选的实施方式中，过滤器的孔径为0.2μm。
在根据上述实施方式的另一个实施方式中，本发明的制备生物药物的装置为连续流反应器，其包括无孔珠的填充床。对于本领域技术人员显而易见的，本发明的反应器可与本发明的制备生物药物的装置的所有其他实施方式组合。例如，反应器可包括无孔珠填充床上游的混合器，例如T型连接混合器。或者，反应器可包括无孔珠填充床上游的过滤器，例如孔径为0.2μm的过滤器。作为替代，反应器可包括无孔珠填充床上游的过滤器(例如孔径为0.2μm的过滤器)以及过滤器上游的混合器(例如T型连接混合器)。在本实施方式的一个优选方面，反应器是柱，其包括无孔珠填充床上游的过滤器(例如孔径为0.2μm的过滤器)以及过滤器上游的静态混合器(例如T型连接混合器)。
在根据本发明的所有其他实施方式的一个实施方式中，连续流反应器适用于连续灭活病毒。本发明的用于连续病毒灭活的连续流反应器优选包括用于连接至无孔珠的填充床的两种液体、三种液体或四种液体或更多种液体的混合器。这些混合器位于无孔珠的填充床的上游，使得液体可在进入无孔珠的填充床之前混合。此类混合配置的非限制性实施方式在图17中给出。混合的顺序没有特别限制。例如，三种液体可以以如下方式混合：将两种液体混合，然后将第三种液体与所得的混合物混合；或者可以在混合其他液体之前混合任何数量的液体。此类混合配置的非限制性实施例在图18中给出。
本发明的用于连续病毒灭活的连续流反应器优选在无孔珠的填充床的上游包括另外的单元，该单元可包括缓冲罐。在非限制性实施方式中，缓冲罐可连接到缓冲罐上游的分批式色谱单元，或者连接到缓冲罐上游的用于逆流上样色谱的单元，或者连接到缓冲罐上游用于模拟移动床色谱的单元。在无孔珠填充床上游的此类单元的非限制性实例显示在图19A中。或者，优选地，本发明的用于连续病毒灭活的连续流反应器在无孔珠粒填充床的上游还包括其他单元，该单元包括用于不具有缓冲罐的无缝直通处理的单元。在非限制性实施方式中，用于无缝直通处理的单元可为分批式色谱单元、用于逆流上样色谱的单元或用于模拟移动床色谱的单元。无孔珠填充床上游的此类单元的非限制性实例显示在图19B中。
优选地，本发明的用于连续病毒灭活的连续流反应器在无孔珠填充床的下游包括其他单元，包括但不限于用于以逆流模式萃取溶剂-洗涤剂的单元、用于以并流模式萃取溶剂-洗涤剂的单元、分批式色谱单元、用于逆流上样色谱的单元和用于模拟移动床色谱的单元。无孔珠填充床下游的此种单元的非限制性实例显示在图20中。
应理解，用于本发明的连续病毒灭活的反应器的上述单元也可与本发明的过程和方法结合使用。
在下文中，将通过实施例对本发明进行说明，但本发明不限于此。
实施例
实施例1：穿透实验的常规设置
可通过所谓的穿透实验获得填充有无孔珠的柱中的累积停留时间分布。对于本发明的实施例，穿透实验通过以下三个步骤来进行：
1.用平衡缓冲液冲洗柱
在本发明的实验中，水用于平衡。
2.用含有分析物丙酮的缓冲液冲洗柱外管(旁通带有柱阀)
除非另有说明，在本发明的实施例中使用2％的丙酮。显示2％丙酮是根据本发明的混合物(其包括适用于溶剂/洗涤剂病毒灭活处理的溶剂/洗涤剂混合物)的合适模型系统(参见实施例2)。使用丙酮系统代替包含溶剂/去污剂混合物的混合物可使实验室工作更加方便。当指示时，使用10％丙酮进行其他实验以提高灵敏度。
3.通过将柱阀切换到所选柱来开始穿透测量
使用紫外线检测器，在装填有无孔珠的柱的下游检测紫外线响应。归一化的紫外线响应代表累积的停留时间分布(图1A)。
在本发明的实施例中，将紫外线检测器设定为280nm的波长，除非使用根据本发明的包含适用于溶剂/去污剂病毒灭活处理的溶剂/去污剂混合物的混合物。如果使用包含溶剂/去污剂混合物的混合物，则将UV检测器设置为300nm的波长，因为在具有最大UV信号的波长(即在280nm)下，UV检测器饱和。穿透实验在GE Healthcare色谱系统Aekta Avant上以不同的表观线速度进行，表观线速度范围为2cm/h至300cm/h。对于本发明的实施例，UV光谱在
Figure BDA0002402425860000241
编程环境中使用内部处理脚本进行处理。将UV响应归一化为0％至100％。洗脱体积(EV)以柱体积(CV)表示。计算了不同浓度的流通溶液(丙酮在水中)的洗脱体积(例如5％时的洗脱体积和50％时的洗脱体积，参见图1A)。
当使用填充柱时，预计低强度峰拖尾会比低强度峰前沿更长。然而，在本发明的病毒灭活的方法中，峰拖尾不如峰前沿重要，因为病毒灭活随时间增加。因此，所获得的UV曲线的窄度可优选地通过以下参数来描述：
Figure BDA0002402425860000251
EV50％是停留时间分布的平均值，而EVx通常表示信号达到最低可靠检测限(“检测限”，LOD)时的洗脱体积。在本发明的实施例中，通常使用EV1％和EV5％。应理解，独立于本实施例，可以根据本发明的所有实施方式一般性地使用EV1％和EV5％。使用这些实施例的设置，当使用10％丙酮溶液时，可检测到低至EV0.03％的洗脱体积。如果θx接近1，则RTD会很窄，即流过填充有无孔珠的柱的液体流接近理想的平推流。相对地，如果θx接近0，则RTD会非常宽，即RTD显示出严重的峰前沿。一般来说，θx越接近1，RTD曲线越陡。
此外，对于每条穿透曲线，通过将函数F拟合到归一化的UV信号来计算博登斯坦数，其中，F(EV)表示高斯峰的积分，Bo表示博登斯坦数，EV表示给定时间点的洗脱体积，EV50％表示RTD平均值时的洗脱体积：
Figure BDA0002402425860000252
如本领域技术人员已知的，博登斯坦数也可用作停留时间分布的量度。较小的博登斯坦数指示RTD较宽，而较大的博登斯坦数指示RTD较窄。
实施例2：丙酮与包含溶剂/去污剂的混合物的性能比较
使用溶剂/去污剂混合物可能是危险的，这使得实验室工作不便。因此，为能够更方便进行实验室工作，测试了丙酮溶液是否是包含溶剂/洗涤剂混合物的混合物的合适模型系统，所述溶剂/洗涤剂混合物适用于根据本发明的溶剂/洗涤剂病毒灭活处理。
各种柱填充有玻璃珠。如上所述(参见实施例1)，使用2％丙酮/水混合物或添加了溶剂/去污剂化学品的过程液体缓冲液与过程液体缓冲液的组合进行了穿透实验。计算各个实验的EV5％与EV50％的比率(θ5％)和博登斯坦数。
如图2和图3所示，实验的θ5％和博登斯坦数非常相似，不同之处在于是否使用了2％丙酮/水的混合物或过程液体缓冲液与添加了溶剂/去污剂化学品的过程液体缓冲液的组合。因此，除非另有说明，否则在进一步的实验中仅使用水和2％丙酮的组合。
实施例3：柱参数对停留时间分布的影响
为了研究填充无孔珠的柱的各种参数对停留时间分布的影响，分析了图2中汇总的数据，包括柱高度、柱直径、线速度、珠直径和珠直径范围。通常，结合本发明，术语“高度”和“长度”可互换使用，并且它们总是表示结构的高度，例如填充床的高度。
具体地，对图2中汇总数据的输入参数(柱高、柱体积、线速度、平均珠直径、珠直径分布)和两个输出参数(博登斯坦数和θ1％)进行偏最小二乘(PLS)分析。正交PLS(OPLS)回归用于表示各个输入参数对输出的影响。
在本案中，OPLS与PLS相同，只是为了更直观地表示而旋转了坐标系(参考文献7)。更具体地，可从第一OPLS分量(OPLS component)观察到各个参数对输出的影响。如果正值的参数增加，则输出增加。如果负值的参数减小，则输出减小。如果某个参数的第一OPLS分量的绝对值很高，则该参数对输出的影响很大。(在此种情况下，第二OPLS分量不相关-为了简化说明，可将其解释为与参数可变性相关。)
对前两个主分量(principal component)的绘图表明，在研究范围内，珠尺寸的影响是最重要的参数(图4)。珠越小且越均一，则RTD越窄。另一个重要因素是柱长度。更长的柱可提供更窄的RTD。影响最小的因素是柱体积和线速度。后者意味着为了扩大规模，可通过使用降低的线速度来改变柱直径和/或增加保留时间，这在测试范围内对RTD的影响很小。但是，观察到较低的线速度和较大的柱体积均会导致RTD有所改善。上述考虑对于描述RTD的两个参数(即博登斯坦数和θ1％)是一致的。
进行另一项实验以确认柱长对RTD的影响。用相同批次的陶瓷珠填充不同尺寸的柱，并以不同的线速度进行穿透实验。同样在此实验中，发现较短的柱具有较低的θ1％，即宽RTD(图5)。
进行另一个实验，以确认线性流速对RTD的影响。使用振动式柱填充站，填充适用于本发明的连续病毒灭活方法的柱(“MP_7_PMMA_HS_16/13.2_0.2-0.4mm；材料：PMMA塑料；直径：16mm；高度：13.2cm；珠尺寸：0.3μm±0.1μm)。不同的流经时间应导致不同的流量，从而导致不同的RTD。因此，在从1分钟到30分钟的整个流量时间范围，使用EV1％/EV50％(θ1％)评估RTD。假设孔隙率为0.4±0.05，则表观线性流速将为5cm/h至180cm/h。在此范围，朝向更高的速度，RTD变宽，即θ1％变低(图6)。在所测试的线速度范围内，柱性能下降了4％(以θ1％计算)。值得注意的是，与预期用于生物制药生产过程的柱相比，本实验中所用柱较短。由于更长的柱将产生更窄的RTD(参见上文)，预期在生物制药生产过程中的RTD会更窄。
实施例4：预测柱参数和线性流速对RTD的影响
当例如扩大柱规模以整合到生物制药生产过程中时，能够准确预测柱参数和线性流速对RTD的影响非常重要。对所有5个输入参数(柱长、柱体积、线性流速、平均珠直径和珠直径范围)以及除线速度之外的相同输入参数进行RTD PLS预测。分别如图5和图6所示，使用与观察到的实验数据相关性良好的PLS预测模型(无论EV1％至EV50％(θ1％))，预测输入参数对RTD的影响，或者使用博登斯坦数评估RTD。但是，与博登斯坦数相比，θ1％与输入参数的线性相关性更大。
实施例5：柱填充对RTD的影响
为了评估柱填充对RTD的影响，用陶瓷珠手工填充直径相同(1cm)、长度相似(28.5cm至30.5cm)的柱。其中一个(JS_07)故意填充得不好，即填充后里面有很多气泡。在较低的表观线速度下，填充不良的柱与用较大珠填充良好的柱的性能类似(图7)。但是，在较高的表观线速度下，填充不良的柱的性能要差得多，即θ1％低得多，指示宽的RTD。这些结果表明，柱填充质量会影响RTD。值得注意的是，可使用例如定制的振动台来完成高质量的柱填充。
实施例6：降低检测限
使用2％丙酮，穿透实验的检测限(LOD)在洗脱体积的1％范围内(EV1％)。然而，本发明的病毒灭活的方法优选实现至少4的Log10下降值(LRV)。LRV为4等同于从100％感染性病毒颗粒减少至0.01％感染性病毒颗粒。就这一点而言，EV1％的检测限相对较大。
为了获得更低的LOD，使用10％的丙酮。在此种情况下，可将280nm紫外处的LOD设置为0.03％。当使用10％丙酮和装填有陶瓷珠的柱进行穿透实验时，θ0.03％(EV0.03％/EV50％)和θ1％(EV1％/EV50％)的相关性非常好，尤其是在使用装填良好的柱时(参见图11)。因此，使用θ1％评估各种参数对RTD的影响是合理的。值得注意的是，可使用荧光实验来获得更低的检测限。
实施例7：与已知方法的比较
在已知方法中，使用了旋流逆变器(CFI)来实现窄的RTD。然而，在规模扩大方面，本发明的无孔珠填充床远远优于CFI，因为对于无孔珠的填充床，当使用更长的床时RTD变得更窄，并且床对流量变化不是很敏感。与此相对，已证明CFI仅适用于直径为2mm至3mm的管，并且由于不理想的流体动力学，其扩大规模的能力值得怀疑。此外，对于每个给定的设计，CFI都限于单一流量。
为比较CFI的RTD与本发明的填充有无孔珠的柱的RTD，将通过CFI获得并在Klutz等(参考文献2)中公开的博登斯坦数与通过本发明的填充柱获得的博登斯坦数进行比较。令人惊讶的是，无论使用玻璃珠(图11)、陶瓷珠(图12)还是PMMA塑料珠(图13)，直径大于5mm、长度大于10cm且具有直径小于600μm珠的柱的博登斯坦数都高于已知方法中描述的CFI的博登斯坦数。
实施例8：本发明的柱和比较例的柱在不同柱尺寸下的停留时间分布
接下来，发明人研究了柱的尺寸对停留时间分布的影响，并且还将本发明的柱与转化流逆变器(CFI)柱进行了比较。结果显示在图21中。在图21A中，每个圆圈表示一个实验。圆的大小与博登斯坦数成正比。因此，圆越大意味着博登斯坦数越大，意味着系统越接近理想的平推流。在x轴上显示平均停留时间(或流经时间)，在y轴上显示流量。空心圈代表本发明的填充柱的实验，实心圈代表来自比较例的旋流逆变器(CFI)的数据。虚线代表当使用单个反应器(或具有相同空隙体积的多个反应器)时以不同流量获得的轨迹。该图的目的是(在所用的流量和反应器尺寸方面)使比较正确地进行，因为比较以非常不同的流量或不同规模进行的两种方法之间的博登斯坦数是不合适的。
尽管发明人已证明，与CFI装置相比，本发明的柱具有更小的空隙体积，并且随着柱规模的扩大，停留时间分布(RTD)变得更窄，但发明人还以图的形式进行了另外的直接比较。在图21A的曲线图中，还显示了一个大型填充柱的结果。尽管其他柱的空隙体积比所示大多数CFI装置小，该大型柱的空隙体积比所有CFI装置都要大。大型柱的性能明显优于所有小型(实验室规模)柱以及所有CFI装置(注：大的空心圆属于大型柱)。
除比例尺是对数形式之外，图21B与图21A相同。因此，具有相同空隙体积(相同反应器)的实验位于一条直线上。
针对大型柱进行的实验在图21C中进行了更详细的描绘。特别是，直径为5cm、长度为89cm的柱(GE Healthcare XK 50/100)装填有直径为125μm至250μm的陶瓷珠。填充柱的总体积为1.75L，空隙体积为0.7L。该柱使用振动式柱填充站进行填充。目的是为了证实随着柱规模的增加，保留时间分布(RTD)变窄的趋势，以及为了证明比比较例的旋流逆变器(CFI)反应器更大的柱也具有较窄的RTD。
以5cm/h、10cm/h、15cm/h、20cm/h和30cm/h的表观线速度进行实验。体积流量的范围在上限和下限上仍比在CFI反应器中所用流量范围宽。
如本发明所预期的，大型柱产生非常窄的RTD(图21C)。相比之下，用相同批次的珠填充的小型柱(d＝26mm，l＝19.5cm)的EV1％/EV50％得分范围为0.88至0.92，博登斯坦数为800至1800。
实施例9：用于制备生物药物的装置的示例性实施方式
用于制备生物药物的装置的示例性实施方式在图14中示出。将过程流体与单独的溶剂/去污剂化学品的储备溶液混合。天平提供反馈控制，以确保所有组分的流量正确，以达到所需的最终浓度。在线混合器(inline mixer)均化溶液。均质溶液通过绝对过滤器(例如0.2μm过滤器)除去颗粒后，进入灭活柱。
实施例10：估算病毒灭活的数学方法
Klutz等(参考文献3)建议了两种获得病毒灭活的方法进行连续设置。第一种方法基于峰起始检测(检测限设置为穿透的0.5％)，其中，峰起始洗脱时间应与相应分批反应器中的病毒灭活时间相同。99.5％的过程流体的孵育时间比分批处理过程更长，因此，连续设置的对数下降值(LRV)预计会高于分批处理操作。
Figure BDA0002402425860000291
第二种方法是假设病毒灭活具有指数性质(已通过实验性的分批灭活动力学结果得到证实)。第二种方法的有效LRV定义为通过停留时间分布(RTD)加权的平均LRV。于是，此种方法允许缩短在反应器中的停留时间，因为目的是达到与分批操作相同的LRV。但是，这些建议并没有进行计算。
RTD峰的开始是关键部分，因为在峰最开始时早期洗脱的病毒的孵育时间相对较短。本领域已知的方法尚未考虑研究峰的开始部分。
因此，在本发明的基于填充柱的方法中，我们建议将穿透曲线分为两部分——在我们能够检测到穿透曲线的开始部分之前和之后。一旦信号超过检测下限(LOD)，就会发生此种情况。检测之前曲线是未知的。穿透曲线代表累积停留时间分布(cumulativeresidence time distribution)，而脉冲注入曲线代表正常停留时间分布(normalresidence time distribution)。因此，穿透曲线上升至超过LOD时的洗脱时间(LOD时间，t始)是RTD峰的
Figure BDA0002402425860000303
份额洗脱的时间：
Figure BDA0002402425860000304
如果假设在检测限
Figure BDA0002402425860000305
之前的初始部分没有灭活病毒，则检测限应非常低以实现所需LRV。
在我们的柱中，颗粒没有任何粘合，也没有孔，因此RTD预计只有一个峰。如果只有一个峰，则在假设单个峰曲线的情况下，具有最短平均停留时间的理论最坏情况将是在可检测到的洗脱峰(即极端峰前沿)洗脱之前的恒定样品浓度(图15)。
假设病毒灭活具有指数性质并且出现了上述最坏情况的峰前沿情况，
Figure BDA0002402425860000306
的病毒下降率(由RV始表示)可如下计算：
Figure BDA0002402425860000301
指数病毒灭活的衰减系数(k)可根据所需的分批病毒灭活孵育时间(t0)和相应的病毒灭活下限计算得出(RV最小＝下降值)。
RV最小＝exp10(-kt0)
LOD之后洗脱的物质的孵育时间设置为LOD时间。结合的下降值(RV总)根据两个贡献计算得出，并且应等于RV最小。
Figure BDA0002402425860000302
根据上式，可计算出所需的RV最小和给定的LOD所需的LOD时间(图16)。
分步实施例：
1)上文显示，通过使用10％丙酮和UV检测器可实现LOD<0.03％。因此，在本实施例中，发明人使用：
Figure BDA0002402425860000307
所需LRV为4log，以及分批孵育时间(t0)为1小时。所需的LOD时间可由图16中的曲线估算出来。可通过对最后一个方程式进行数值求解来获得精确值。从该图估计的值为1.05。t始＝1.05；t0＝1.05*60＝63分钟。
2)发明人还在上文表明，对于LOD＜0.03％，LOD时间与平均停留时间之间的比率高于0.8是可实现的((EV0.03％)/(EV50％)＝0.8)。因此，平均停留时间(t平均)为：t平均＝tLOD/0.8＝79分钟。
3)典型的孔隙度为约0.4。这取决于粒径分布。对于本实施例，我们可假设孔隙率为＝0.4且所需的方法Ф通过量＝1L/小时。在此种情况下，总柱体积(CV)应为：
Figure BDA0002402425860000311
实施例11：病毒灭活
根据本发明的示例性病毒灭活可如下进行。在下面的实施例中，整个设置以及所有溶液均在室温下。整个灭活过程均连续进行。
将包含蛋白质产品的缓冲溶液(20mM MES、10mM CaCl2、0.1％聚山梨酯80、500mMNaCl，pH 6.35)与溶剂去污剂化学品的储备溶液持续进行混合：磷酸三正丁酯，Triton X-100和聚山梨酯80(储备溶液中三种化学品的质量百分比：17.47％：63.25％：19.28％)。使用动态在线混合器混合两种溶液。对于溶剂去污剂储备液和含产品的料流，两种料流的体积流量分别为0.161mL/min和10.0mL/min。所得的均匀混合物通过在线过滤器除去任何颗粒。然后将溶液直接送入装有无孔珠且柱体积为2134mL的灭活柱中。柱高为27.2cm，柱直径为10cm。该柱是用缓冲液(20mM MES、10mM CaCl2、0.1％聚山梨酯80、500mM NaCl，pH 6.35)平衡的柱，该缓冲液的SD浓度与产物溶液和SD化学储备溶液的混合物中存在的SD浓度相同。
病毒灭活柱的流出物通过过滤器过滤，用缓冲溶液(50mM Tris、5mM CaCl2、0.1％聚山梨酯80)以1：4.5的比例在线稀释，然后上样到宽孔(wide-bore)阴离子交换柱上。
实施例12：病毒灭活(X-MuLV，5％S/D)
下文描述了连续病毒灭活(CVI)的实验实例，其中，使用溶剂/去污剂(S/D)方法，并且将连续病毒灭活与工业标准的S/D分批孵育进行比较。
实验根据行业相关准则相应地进行，例如但不限于：ICH Q5A(R1)1999准则、ICHCPMP/BWP/268/95 1996准则和EMEA CHMP/BWP/398498/2005 2009准则。
通过50％组织培养物感染量(TCID50)方法确定病毒滴度。本领域技术人员针对TCID50评估了检测限(LOD)和样品缺乏干扰。
连续病毒灭活反应器(CVIR)用于在连续操作模式下进行病毒灭活。反应器体积(VR)等于EV1％，并通过停留时间分析进行评估。设计并操作反应器以提供30分钟和60分钟的孵育时间。与CVIR体积相比，前CVIR(pre-CVIR)体积小，并且在停留时间分布分析中未被考虑。
连续病毒灭活的设置如图24所示。在本实施例中，使用两个泵来泵送测试项目(过程中间体的替代物)和S/D试剂，这两个流在在线混合器中会聚并被均质化。均质化后，将单股流进一步泵送通过CVIR，在该处病毒灭活连续发生。
CVIR是装有聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)球形无孔珠的圆柱管，该无孔珠的直径为200μm至400μm，平均直径为300μm。使用定制的振动辅助装填站填充反应器。填充得到反应器的填充高度为132mm，空隙体积为10.66±0.06mL。10cm/h时的博登斯坦数>875。10cm/h时的EV1/EV50为0.882，因此CVIR体积计算为9.40±0.15mL。
CVIR的入口和出口处的流量使得孵育时间分别为30分钟和60分钟，得到CVIR内部的线速度分别为4.68cm/h和9.35cm/h。
该过程在运行2VR之前已达到稳态，并且在2VR下系统已处于稳态。一旦出口处的S/D组分浓度达到与入口处相同的浓度，系统便达到了稳态，如图25所示。由于不包含任何S/D组分的CVIR内部的液相转移，CVI过程显示出等待期和延迟开始的稳态，因此没有发生病毒灭活或发生有限的病毒灭活。
测试项目由产业相关的缓冲液和人血清白蛋白(作为生物药物的实例)组成。本实施例中的测试项目再现了生物药物生产过程中的过程中间体的关键特性(pH、电导率、总蛋白)。本领域技术人员根据相关准则将X-MuLV预先加标到测试项目。
该非限制性实例的S/D试剂是具有病毒灭活作用的溶剂和去污剂的混合物。在本实施例中，使用了Triton X-100(TX-100)、聚山梨酯80(PS80)和磷酸三正丁酯(TnBP)。将S/D试剂在混合器中稀释以达到0.0473％(w/w)TX-100、0.0144％(w/w)PS80和0.0131％(w/w)TnBP的目标浓度。
在开始CVI实验之前，抽取加标测试项目样品以确定初始病毒滴度。CVIR出口处的流在1VR、2VR、3VR、4VR和5VR处采样。立即将出口样品稀释20倍以终止病毒灭活过程，并立即滴定病毒滴度，以确定CVI过程后的滴度。完成CVI实验后，抽取加标测试项目样品作为保持对照(HC)。
根据下面的公式1，通过计算对数下降值(LRV)来判断病毒的失活。公式1反映了连续操作的特定性质，以及反映了在本实施例中有两个流被泵送通过CVIR而只有一个流从CVIR流出。因此，根据流的病毒滴度及其各自的体积流量，可计算出病毒灭活前每单位时间的病毒输入量和病毒灭活后每单位时间的病毒输出量。对滴度出口进行病毒灭活终止稀释度的校正。
Figure BDA0002402425860000331
在图26中，显示了在CVI过程孵育30分钟和60分钟后的X-MuLV滴度曲线。一旦操作达到稳态，在30分钟的孵育时间内，X-MuLV将从CVIR入口处的≥6.3E+5TCID50/mL降低到CVIR出口处的≤4.0E+2TCID50/mL，并且在60分钟的孵育时间内降低至≤8.0E+1TCID50/mL。在达到稳态之前(即在1VR时)，X-MuLV滴度为2.5E+2TCID50/mL，高于稳态阶段的X-MuLV滴度。如上所述，此种差异可通过1VR时S/D组分的浓度低于目标浓度来解释。
一旦处于稳态(从2VR开始)，在30分钟的孵育时间时观察到LRV≥3.5，在60分钟的孵育时间时观察到LRV>3.9(图27)。对于30分钟和60分钟的孵育，保持对照显示病毒损失低于1log10——本领域技术人员认为有意义的且已被行业相关准则接受的最小差异值。
本领域技术人员按照行业相关指南进行分批实验用于比较。传统批次的数据(例如图28所示)显示LRV≥3.8，与连续运行模式下CVIR中获得的数据相当。这种直接比较表明，使用CVIR的连续病毒灭活与传统的分批处理操作一样有效。
这表明，本发明的连续病毒灭活是高度有利的，因为它与分批模式下病毒灭活的理想灭活条件一样有效(例如，由于窄的停留时间分布，混合物的所有部分的停留时间基本相等，使得混合物中所有部分均有效灭活病毒)，同时具有其他优势，即可连续进行。
本领域技术人员应理解，病毒灭活实施例中所用条件不限制本发明的范围。例如，虽然以直径为200μm至400μm，平均直径为300μm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)球形无孔珠为例，但根据本发明可使用任何具有多个互连通道的结构(例如任何填充有无孔珠的柱)。类似地，虽然使用通过定制振动辅助装填站装填的圆柱形管作为填料高度为132mm，空隙体积为10.66±0.06mL且CVIR体积为9.40±0.15mL的CVIR，但可以使用本发明所述的任何CVIR。
实施例13：病毒灭活(BVDV，5％S/D)
下文描述了连续病毒灭活(CVI)的实验实例，其中，使用溶剂/去污剂(S/D)方法，并且将连续病毒灭活与工业标准的S/D分批孵育进行比较。
实验根据行业相关准则相应地进行，例如但不限于ICH Q5A(R1)1999准则、ICHCPMP/BWP/268/95 1996准则和EMEA CHMP/BWP/398498/2005 2009准则。
通过50％组织培养物感染量(TCID50)方法确定病毒滴度。本领域技术人员针对TCID50评估了检测限(LOD)和样品缺乏干扰。
连续病毒灭活反应器(CVIR)用于在连续操作模式下进行病毒灭活。反应器体积(VR)等于EV1％，并通过停留时间分析进行评估。设计并操作反应器以提供30分钟和60分钟的孵育时间。与CVIR体积相比，前CVIR体积小，并且在停留时间分布分析中未被考虑。
先前实施例的图24中描述了连续病毒灭活的设置。在本实施例中，使用两个泵来泵送测试项目(过程中间体的替代品)和S/D试剂，这两个流在在线混合器中会聚并被均质化。均质化后，将单股流进一步泵送通过CVIR，在该处病毒灭活连续发生。
CVIR是装有聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)球形无孔珠的圆柱管，该无孔珠的直径范围为200μm至400μm，平均直径为300μm。使用定制的振动辅助装填站装填反应器。填充得到反应器的填充高度为132mm，空隙体积为10.66±0.06mL。10cm/h时的博登斯坦数>875。10cm/h时的EV1/EV50为0.882，因此CVIR体积计算为9.40±0.15mL。
CVIR入口和出口的流量使得孵育时间分别为30分钟和60分钟，得到CVIR内部的线速度分别为4.68cm/h和9.35cm/h。
该过程在运行2个反应体积(VR)之前已达到稳态，并且在2VR时系统已处于稳态。一旦出口处的S/D组分浓度达到与入口处相同的浓度，系统便达到了稳态，如先前实施例中的图25所示。由于不包含任何S/D组分的CVIR内部的液相转移，CVI过程显示出等待期和延迟开始的稳态，因此没有发生病毒灭活或发生有限的病毒灭活。
测试项目由与产业相关的缓冲液和人血清白蛋白(作为生物药物的实例)组成。本实施例中的测试项目再现了生物药物生产过程中的过程中间体的关键特性(pH、电导率、总蛋白)。本领域技术人员根据相关准则将BVDV预先加标到加标的测试项目。
S/D试剂是具有病毒灭活作用的溶剂和去污剂的混合物。在本实施例中，使用了Triton X-100(TX-100)、聚山梨酯80(PS80)和磷酸三正丁酯(TnBP)。将S/D试剂在混合器中稀释以达到0.0473％(w/w)TX-100、0.0144％(w/w)PS80和0.0131％(w/w)TnBP的目标浓度。
在开始CVI实验之前，抽取加标测试项目样品以确定初始病毒滴度。CVIR出口处的流在1VR、2VR、3VR、4VR和5VR处采样。立即将出口样品稀释20倍以终止病毒灭活过程，并立即滴定病毒滴度，以确定CVI过程后的滴度。完成CVI实验后，抽取加标测试项目样品作为保持对照(HC)。
如先前实施例中的公式1，通过计算对数下降值(LRV)来判断病毒的失活。稀释因子用于说明加标测试项目流被S/D试剂流稀释的情况。对滴度出口进行病毒灭活终止稀释度的校正。
在图29中，描述了CVI过程孵育30分钟和60分钟后的BVDV滴度曲线。一旦操作达到稳态，无论孵育时间如何，BVDV将从CVIR入口处的≥7.9E+5TCID50/mL降低到CVIR出口处的≤2.5E+2TCID50/mL。在达到稳态之前(即在1VR时)，BVDV滴度≤5.0E+2TCID50/mL，高于稳态阶段的BVDV滴度。如上所述，此种差异可通过1VR时S/D组分的浓度低于目标浓度来解释。
一旦处于稳态(从2VR开始)，在30分钟的孵育时间时观察到LRV≥4.5，在60分钟的孵育时间时观察到LRV≥4.9(图30)。孵育30分钟后，保持对照显示病毒损失低于1log10(本领域技术人员认为是有意义的并已被行业相关准则接受的最小差异值)。孵育60分钟后，保持对照显示病毒高于1log10，但这可通过实验持续时间来解释。对于30分钟的CVI实验，在加标测试项目制备后约150分钟(5×30分钟)回收保持对照；对于60分钟的CVI实验，在加标测试项目制备后约300分钟(5×30分钟)回收保持对照。因此，由于加标测试项目暴露于物理化学条件(pH、盐、缓冲液、温度等)的时间延长，这可解释在保持对照样品中观察到的病毒损失。尽管在60分钟实验中观察到了HC的病毒损失，但很明显，病毒的失活是由于与S/D组分的接触所致，如在2VR时观察到的，此种情况发生在加标测试物制备后150分钟之前——30分钟CVI实验中进行HC采样所花费的时间。
本领域技术人员按照行业相关指南进行分批实验用于比较。传统批次的数据(例如图31所示)在60分钟的孵育时间下的LRV为3.5至3.7，这与连续操作模式下CVIR中获得的数据相当。这种直接比较表明，使用CVIR进行的连续病毒灭活与传统的分批处理操作一样有效。
这表明，本发明的连续病毒灭活是高度有利的，因为它与分批模式下病毒灭活的理想灭活条件一样有效(例如，由于窄的停留时间分布，混合物的所有部分的停留时间基本相等，使得混合物中所有部分均有效地灭活病毒)，同时具有其他优势，即可连续进行。
本领域技术人员应理解，病毒灭活实施例中所用条件不限制本发明的范围。例如，虽然以直径为200μm至400μm、平均直径为300μm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)球形无孔珠为例，但根据本发明可使用任何具有多个互连通道的结构(例如任何填充有无孔珠的柱)。类似地，虽然使用通过定制振动辅助装填站装填的圆柱形管作为填料高度为132mm、空隙体积为10.66±0.06mL且CVIR体积为9.40±0.15mL的CVIR，但可以使用本发明所述的任何CVIR。
工业适用性：
本发明的方法、过程和产品可用于工业生产过程中物质的孵育。例如，本发明可用于生物制药的工业生产。因此，本发明在工业上是可应用的。
参考文献：
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Claims (111)

1.一种孵育至少两种液体的混合物的方法，所述方法包括：
i)将所述至少两种液体混合，获得混合物；以及
ii)使所述混合物通过无孔珠的填充床，从而孵育所述混合物，
其中，所述方法用于病毒灭活，所述至少两种液体中的第一种液体为可能含有病毒的液体，所述至少两种液体中的第二种液体包含病毒灭活剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述方法是连续流方法；和/或
所述混合和通过连续进行；和/或
所述无孔珠为惰性无孔珠。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述无孔珠为玻璃珠，或陶瓷珠，或塑料珠，或钢珠。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述塑料珠为PMMA珠。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的平均粒径为0.05mm至1mm。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的平均粒径为0.05mm至0.6mm。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的平均粒径为0.05mm至0.5mm。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的平均粒径为0.05mm至0.3mm。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，95％的无孔珠对平均粒径偏离不超过50％。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，95％的无孔珠对平均粒径偏离不超过35％。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，95％的无孔珠对平均粒径偏离不超过20％。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少5cm。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少10cm。
14.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少20cm。
15.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少30cm。
16.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少50cm。
17.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少70cm。
18.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少100cm。
19.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床通过包括对所述无孔珠进行振动处理的方法获得。
20.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，对于无孔珠的填充床，空隙体积占总体积的分数为0.2至0.45。
21.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，对于无孔珠的填充床，空隙体积占总体积的分数为0.37至0.42。
22.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床被容纳在柱中。
23.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床被容纳在反应器中。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述柱的直径大于5mm。
25.根据权利要求22所述的方法，其中，所述柱的直径为至少10mm。
26.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床的空隙体积为至少10mL。
27.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床的空隙体积为至少40mL。
28.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床的空隙体积为至少150mL。
29.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床的空隙体积为至少470mL。
30.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述无孔珠的填充床的空隙体积为至少700mL。
31.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述第一种液体包含生物药物；和/或
所述方法用于包膜病毒的病毒灭活；和/或
所述病毒为逆转录病毒和/或黄病毒科的病毒。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述逆转录病毒为X-MuLV，和/或所述黄病毒科的病毒为BVDV。
33.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述病毒灭活剂为适用于溶剂/去污剂病毒灭活处理的溶剂/去污剂混合物，或适用于低pH病毒灭活处理的酸性溶液；和/或
所述病毒灭活剂为用于溶剂去污剂处理的溶剂/去污剂混合物。
34.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法对至少一种病毒实现了至少1Log10下降值。
35.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法对至少一种病毒实现了至少2Log10下降值。
36.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法对至少一种病毒实现了至少4Log10下降值。
37.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法对至少一种病毒实现了至少6Log10下降值。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中，所述至少一种病毒为逆转录病毒和/或黄病毒科的病毒。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述逆转录病毒为X-MuLV，和/或所述黄病毒科的病毒为BVDV。
40.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述混合物通过所述无孔珠的填充床的表观线速度为600cm/h以下。
41.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述混合物通过所述无孔珠的填充床的表观线速度为300cm/h以下。
42.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述混合物通过所述无孔珠的填充床的表观线速度为200cm/h以下。
43.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述混合物通过所述无孔珠的填充床的表观线速度为100cm/h以下。
44.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述混合物通过所述无孔珠的填充床的表观线速度为50cm/h以下。
45.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述混合物通过所述无孔珠的填充床的表观线速度为20cm/h以下。
46.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，当通过所述无孔珠的填充床时，所述混合物的博登斯坦数为50以上。
47.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，当通过所述无孔珠的填充床时，所述混合物的博登斯坦数为300以上。
48.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，当通过所述无孔珠的填充床时，所述混合物的博登斯坦数为400以上。
49.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，当通过所述无孔珠的填充床时，所述混合物的博登斯坦数为500以上。
50.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，当通过所述无孔珠的填充床时，所述混合物的博登斯坦数为600以上。
51.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，当通过所述无孔珠的填充床时，所述混合物的博登斯坦数为800以上。
52.一种制备生物药物的方法，所述方法包括：进行权利要求31所述的方法，所述第一种液体包含生物药物；以及回收所述生物药物。
53.装置用于连续病毒灭活的用途，其中，所述装置是用于制备生物药物的装置，所述装置为适用于连续病毒灭活的连续流反应器，所述装置包括无孔珠的填充床。
54.根据权利要求53所述的用途，其中，所述无孔珠为惰性无孔珠。
55.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠为玻璃珠，或陶瓷珠，或塑料珠，或钢珠。
56.根据权利要求55所述的用途，其中，所述塑料珠为PMMA珠。
57.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的平均粒径为0.05mm至1mm。
58.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的平均粒径为0.05mm至0.6mm。
59.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的平均粒径为0.05mm至0.5mm。
60.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的平均粒径为0.05mm至0.3mm。
61.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠对平均粒径偏离不超过50％。
62.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠对平均粒径偏离不超过35％。
63.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠对平均粒径偏离不超过20％。
64.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少5cm。
65.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少10cm。
66.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少20cm。
67.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少30cm。
68.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少50cm。
69.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少70cm。
70.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床的长度为至少100cm。
71.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床通过包括对所述无孔珠进行振动处理的方法获得。
72.根据权利要求53或54所述的用途，其中，对于无孔珠的填充床，空隙体积占总体积的分数为0.2至0.45。
73.根据权利要求53或54所述的用途，其中，对于无孔珠的填充床，空隙体积占总体积的分数为0.37至0.42。
74.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床被容纳在柱中。
75.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床被容纳在反应器中。
76.根据权利要求74所述的用途，其中，所述柱的直径大于5mm。
77.根据权利要求74所述的用途，其中，所述柱的直径为至少10mm。
78.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床的空隙体积为至少10mL。
79.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床的空隙体积为至少40mL。
80.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床的空隙体积为至少150mL。
81.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床的空隙体积为至少470mL。
82.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述无孔珠的填充床的空隙体积为至少700mL。
83.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述装置还包括一个以上混合器，所述混合器连接至无孔珠的填充床。
84.根据权利要求83所述的用途，其中，所述混合器为静态混合器或动态混合器。
85.根据权利要求84所述的用途，其中，所述静态混合器为T型连接混合器，和/或所述动态混合器为动态搅拌器。
86.根据权利要求53或54所述的用途，其中，所述装置还包括过滤器。
87.根据权利要求86所述的用途，其中，所述过滤器的孔径为0.2μm。
88.根据权利要求86所述的用途，其中，所述装置还包括静态混合器，所述过滤器位于无孔珠的填充床与静态混合器之间。
89.根据权利要求88所述的用途，其中，所述静态混合器是T型连接混合器。
90.一种调整连续流病毒灭活过程的方法，其中，所述调整包括：使用无孔珠的填充床进行连续流病毒灭活，以及使至少两种液体的混合物通过所述无孔珠的填充床，从而孵育所述混合物以灭活病毒，
所述病毒灭活过程使用病毒灭活剂进行病毒灭活，所述至少两种液体中的第一种液体为可能含有病毒的液体，所述至少两种液体中的第二种液体包含病毒灭活剂。
91.根据权利要求90所述的方法，其中，所述连续流病毒灭活过程是制备生物药物的过程。
92.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述病毒灭活过程用于包膜病毒的病毒灭活，和/或
在所述病毒灭活过程中所用的病毒灭活剂为适用于溶剂/去污剂病毒灭活处理的溶剂/去污剂混合物，或适用于低pH病毒灭活处理的酸性溶液。
93.根据权利要求92所述的方法，其中，在所述病毒灭活过程中所用的病毒灭活剂为用于溶剂去污剂处理的溶剂/去污剂混合物。
94.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使至少一种病毒达到至少1Log10下降值。
95.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使至少一种病毒达到至少2Log10下降值。
96.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使至少一种病毒达到至少4Log10下降值。
97.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使至少一种病毒达到至少6Log10下降值。
98.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得通过无孔珠的填充床的混合物的博登斯坦数为50以上。
99.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得通过无孔珠的填充床的混合物的博登斯坦数为300以上。
100.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得通过无孔珠的填充床的混合物的博登斯坦数为400以上。
101.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得通过无孔珠的填充床的混合物的博登斯坦数为500以上。
102.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得通过无孔珠的填充床的混合物的博登斯坦数为600以上。
103.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得通过无孔珠的填充床的混合物的博登斯坦数为800以上。
104.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得混合物通过所述无孔珠的填充床的表观线速度为600cm/h以下。
105.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得混合物通过所述无孔珠的填充床的表观线速度为300cm/h以下。
106.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得混合物通过所述无孔珠的填充床的表观线速度为200cm/h以下。
107.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得混合物通过所述无孔珠的填充床的表观线速度为100cm/h以下。
108.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得混合物通过所述无孔珠的填充床的表观线速度为50cm/h以下。
109.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：调整病毒灭活过程，使得混合物通过所述无孔珠的填充床的表观线速度为20cm/h以下。
110.根据权利要求90或91所述的方法，其中，所述调整包括：使用如权利要求2至30中任一项所述的无孔珠的填充床。
111.根据权利要求94所述的方法，其中，所述调整包括：调节所述混合物在所述无孔珠的填充床中的流经时间，实现所述Log 10下降值；以及，通过调节混合物的表观线速度和/或所述无孔珠的填充床的空隙体积，调节流经时间。
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