CN102286436A - 免疫γ球蛋白的病毒超滤后强溶剂/去污剂处理的最佳配置 - Google Patents

免疫γ球蛋白的病毒超滤后强溶剂/去污剂处理的最佳配置 Download PDF

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Abstract

免疫γ球蛋白的病毒超滤后强溶剂/去污剂处理的最佳配置将溶剂-去污剂(S/D)方法用于灭活血浆产品中的有包膜病毒。尽管1.0％的去污剂和0.3％的磷酸三-正丁基酯溶剂的浓度对有力除去病毒活性是必需的，但我们显示在将免疫γ球蛋白制剂进行分级分离和纳滤后，需要显著减少浓度的溶剂-去污剂的溶剂-去污剂处理的有效性。减少溶剂和去污剂的水平使其灭活后的除去具有更高的效率，这潜在地带来更高的得率，并降低制备的费用。

Description

免疫γ球蛋白的病毒超滤后强溶剂/去污剂处理的最佳配置
本申请为分案申请，原申请的申请日为2005年11月18日，申请号为200510023022.0，发明名称为“免疫γ球蛋白的病毒超滤后强溶剂/去污剂处理的最佳配置”。 
发明背景 
本发明涉及在血液产品和血液产品组合物中使用溶剂/去污剂方法使病毒灭活的领域，该血液产品及其组合物包括血液、血液组分、血浆或其任何包含血液蛋白质的级分、浓缩物或衍生物、含血浆的产品和含易变性的蛋白质的含血浆级分的产品，例如免疫球蛋白。特别地，所用的溶剂包括磷酸二烷基酯和磷酸三烷基酯，且去污剂包括山梨糖醇酐偏酯(partial esters of sorbital anhydrides)，包括氧乙烯化烷基酚且具体是Tritons
Figure BSA00000517914800011
。由此，使得血液产品基本上不含有包膜病毒例如肝炎病毒和其他病毒传染性，从而纯化了所述血液产品和血液产品组合物。 
近20年来溶剂-去污剂(S/D)方法一直用于灭活血浆产品中的有包膜病毒；与其他新方法相比，它仍旧是病毒灭活的方法。浓度为1.0％的去污剂和0.3％的磷酸三正丁基酯(TNBP)溶剂被认为是强有力地除去病毒活性所需的。与在方法的后期完成S/D处理相比，在方法的开始完成S/D处理通常需要更多的化学制剂和更长的时间(原材料一般具有较低的纯度和效能，因此处理体积相应更大，并且产物更不好确定)，而在方法的后期，杂质减少，在大多数情况下产品更好确定，且纯度和效能提高，而体积减少，或者通过至少一个强有力的病毒除去步骤减少或消除病毒载量(即，导致有包膜病毒的对数除去(log removal)为≥/＝4logs，而对于无包被病毒为≥/＝3logs)。 
本发明公开了对血液产品或血液产品组合物例如免疫γ球蛋白制剂进行分级分离和纳滤(nanofiltration)或大小排阻过滤后进行溶剂-去污剂处理的效果，从而使得应用浓度显著减少的溶剂和去污剂。本发明进一步公开了一个惊奇的发现：当在纯化的蛋白质系统中采用大小排阻过滤时，完成有包膜病毒的完全灭活需要的S/D化学制剂的浓度，比过去20年来本领域分级分离器(fractionator)和专家所用的的S/D病毒灭活浓度小10至20倍。 
本发明一个优选的方法公开了S/D化学制剂的除去。据此，公开了S/D化学制剂可通过使用一个装有二氧化硅珠的扩散柱有效地除去，该二氧化硅珠  中的孔体积中充满了三维的交联疏水丙烯酸类聚合物，以减少蛋白质与二氧化硅的结合。该柱子是为从清楚明确的蛋白质溶液中除去S/D而特别设计的。通过以在此论述的降低的浓度来实施溶剂/去污剂方法，使用减少10至20倍的柱材料以除去病毒灭活处理后溶剂/去污剂的产物是可行的。少量的填料使得在大部分情况下除去每次使用之后的层析材料是可行的。由于存在活的无包被病毒以及伴随TSEs的朊病毒颗粒，所以这对控制每批之间交叉污染的可能性是很重要的。 
S/D方法仍旧是对血液产品纯化更好的病毒灭活方法；其他更具有侵入性和破坏性的技术包括醛和紫外光的使用，已证明这些方法会使蛋白质过度变性或破坏。除了血液产品和血液产品组合物之外，任何有病毒污染可能的蛋白质溶液都可用本发明的方法纯化。例如，含有蛋白质的溶液，包括哺乳动物的乳汁、腹水液、唾液、胎盘提取物、组织培养提取物、发酵产物、转基因衍生产品和重组蛋白质都可用这些方法纯化。在申请人的方法中，优选的可纯化的蛋白质溶液为血液产品和血液产品组合物。 
在本发明的一个实施方案中，公开了(1)一种在大小排阻过滤蛋白质之后，对来源于人或动物的蛋白质进行制备后S/D处理的方法；(2)一种该S/D处理的方法，其因此使用的溶剂和去污剂比先前工业上使用的量大大减少；(3)通过使用二氧化硅珠除去S/D的方法，该珠中的孔体积中充满三维的交联的疏水丙烯酸类聚合物，以减少蛋白质与二氧化硅的结合。后一种材料的运用使得能够除去去污剂并且降低产品中的内毒素载量。珠运用二氧化硅的天然性质来捕获S/D，而聚合物使得能够回收大于95％的目标蛋白质，例如IgG。 
在此处公开了作为制备后步骤的蛋白质病毒灭活的动力学，具体地，是在分级分离和纳滤后的纯化的免疫球蛋白中。我们测定了可减少并仍然维持强有力的病毒灭活的溶剂和去污剂量。减少TNBP和Triton X-100的量的能力可降低用来除去S/D的材料的量到达如下程度，即简单地将吸附剂丢弃，而不需要使材料再生是经济可行的。这将不需要使吸附剂再生，并使对重复使用后S/D化学制剂或从材料中浸出的提取物的临界点的考虑最小化。 
在本申请一个优选的实施方案中，病毒灭活方法可实施于人免疫γ球蛋白上，如商业上出售的RhoGAM
Figure BSA00000517914800021
Ultra Filtered。(Ortho-Clinical Diagnostics，Inc.，Raritan NJ)Rho(D)免疫球蛋白(人)是第一个实现抗体介导的免疫抑制的特  异性抗体的成功预防性应用。RhoGAM
Figure BSA00000517914800031
是一种IgG免疫球蛋白溶液，其所含的抗Rho(D)的剂量为每剂300微克抗-D活性。可在合适的时候将RhoGAM
Figure BSA00000517914800032
给予未经免疫的Rho(D)阴性孕妇，防止将来她的Rho(D)阳性后代患病。所述的疾病称为新生儿溶血病，更具体的说是胎儿Rh成红细胞增多症。 
本发明受让人还出售一种较低剂量的抗Rho(D)，MICRhoGAMRho(D)免疫球蛋白(人)微剂量(50微克抗Rho(D))，以治疗妊娠12周或更早时流产的妇女。尽管全剂量保护受体最高至15ml的Rho(D)阳性红细胞，而小剂量则提供最高至2.5ml的Rho(D)阳性红细胞的保护。RhoGAM
Figure BSA00000517914800034
被用作妊娠26至28周时的产前预防。其它适应症包括妊娠各阶段的继续妊娠的先兆性流产，在妊娠13周或之后发生的流产或妊娠终止，腹部创伤或遗传羊膜穿刺，绒毛膜绒毛取样(CVS)和经皮脐带血取样(PUBS)。 
FDA和Bureau of Biologics批准使用的多数免疫球蛋白类注射材料是用哈佛大学E.Cohn博士在1940年代期间开发的醇分级分离法生产的，并描述于Cohn等，J.Am.Chem.Soc.68，459(1946)。该方法与用可获得的最灵敏的检测方法测定的对肝炎感染性、HIV及其它血液携带的病原体呈阴性的血浆的仔细选择联用，确保了该方法所得制剂是安全的。数百万的产品受体没有被感染，这就可以证明该方法所得产品的确安全。 
根据目前的RhoGAM
Figure BSA00000517914800035
Ultra Filtered制备方法，含有抗D的血浆被分级分离(见Cohn等人，上述文献)并且将得到的沉淀物重新悬浮于缓冲液中，且使用ViresolveTM超滤膜除去病毒。除去病毒的材料进行渗滤(diafiltered)，并且用Biomax大小排阻滤器浓缩。蛋白质的浓度和pH值可进行调整，得到的主体(bulk)材料可装入注射器中。参见共同转让(co-assign)的美国专利No.6,096,872。 
溶剂/去污剂处理作为血浆和源自血浆的治疗用蛋白质中的有脂质包膜病毒灭活的方法得到广泛接受。许多研究已经证明了该方法在血浆、免疫球蛋白制剂、凝固因子浓缩物和其他血浆蛋白质中的功效。 
一般地，当实施溶剂/去污剂处理时，溶剂和去污剂在制备过程开始时(前端)以各自1％的浓度被加入血浆，或者在过程的中间步骤以分别0.3％和1.0％的浓度加入血浆。本发明公开了一种与众不同的病毒灭活步骤，其中在制备后，使用浓度更低的溶剂(大约0.003％-小于0.3％TNBP)和去污剂(大约0.01％至  小于1.0％Triton X-100)，以灭活除去病毒的无脂质的主体产品。从最终产品中除去溶剂和去污剂的除去方法也是与众不同的，因为完成它不需要提取步骤。取而代之的是，使用二氧化硅珠吸附剂材料直接除去溶剂和去污剂。虽然吸附剂材料可以再生，但优选所用的吸附剂材料为一次性的。 
如在此处公开的，优选在制备目前的RhoGAM
Figure BSA00000517914800041
Ultra Filtered方法之后加一个病毒灭活步骤。现有技术认为浓度为1.0％的去污剂和0.3％的磷酸三正丁基酯(TNBP)溶剂对于强力除去病毒活性是必需的。与这些高浓度的S/D相反，使用本发明的方法，人免疫γ球蛋白(RhoGAM
Figure BSA00000517914800042
)主体材料可在制备后用大约0.01％-小于1.0％的去污剂(例如Triton X-100)和大约0.003％至小于0.3％溶剂(例如磷酸三(正丁基)酯(TNBP))进行处理。在一个优选的实施方案中，该处理过程应在15℃-25℃下最少进行大约1小时。预期上述溶剂和去污剂的范围可根据温度和/或延长的温育时间的变化而有所不同；例如，温度增加和/或延长温育时间使得所需的S/D浓度甚至更低。处理后，优选将材料通过一个包含二氧化硅吸附剂材料的柱子以除去溶剂和去污剂，例如SDR Hyper D溶剂-去污剂除去吸附剂(BioSepra Division of Ciphergen BioSystems，Inc.，Fremont，CA制造)。吸附剂由二氧化硅珠组成，该珠中的孔体积中充满三维的交联的疏水性聚合物，其能够保持溶剂和去污剂。收集病毒灭活后的RhoGAM
Figure BSA00000517914800043
(RhoGAM SDTM)，进行渗滤，并用Biomax滤器浓缩。然后可调节Polysorbate 80的浓度、pH和蛋白质的浓度，从而最终的RhoGAM SDTM产品与现有制剂一致。 
S/D步骤也可在制备过程的开始进行。当S/D步骤在发明方法的制备开始时进行时，优选使用大约0.2％去污剂和大约0.2％至大约1.0％溶剂。 
病毒灭活所需的计划制备步骤的流程图如图1所示。 
发明概述 
本发明提供一种血液产品的病毒灭活方法，其中使用浓度显著降低的溶剂和去污剂，其中溶剂/去污剂步骤优选用于产品的制备后。本发明的方法制备出基本上不含病毒的无菌血液产品或组合物，其中有脂质包膜病毒的灭活的程度大于所述病毒的4logs，并且其中血液产品蛋白质的得率至少为90％。 
该方法包括血液产品的病毒纯化，包括将所述制备后的血液产品与至少一种浓度范围为大约0.003％至小于0.3％的溶剂和至少一种浓度范围为大约0.01％至小于1.0％的去污剂接触，其中所述方法使有脂质包膜病毒的灭活的程度大于  所述病毒的4logs，并且其中血液产品蛋白质的得率至少为90％。在优选的实施方案中，溶剂的浓度范围为大约0.006％至小于0.3％，更优选大约0.015％至大约0.15％，更优选大约0.03％至大约0.15％，最优选大约0.03％至大约0.06％，最优选大约0.06％。在优选的实施方案中，去污剂的浓度范围为大约0.02％至小于1.0％，更优选大约0.05％至大约0.5％，更优选大约0.1％至大约0.5％，更优选大约0.1％至大约0.2％，最优选大约0.2％。 
在本发明的优选的方法中，溶剂-去污剂步骤可在大小排阻过滤之后进行，但也可以在制备过程的开始进行。当在过程开始进行S/D方法时，所用的溶剂优选大约0.2％至小于1.0％，且去污剂的浓度为大约0.2％至小于1.0％。 
就本发明的目的而言，血液产品或组合物可以是，例如，含蛋白质的溶液，包括哺乳动物的乳汁、腹水液、唾液、胎盘提取物、组织培养提取物、发酵产物、转基因衍生产品和重组蛋白质，单克隆或多克隆的IgG或凝固产物。 
在另一个实施方案中公开的是一种基本上病毒纯化的人免疫球蛋白的制备后方法，包括将所述完成的人免疫球蛋白产品与至少一种有机溶剂/至少一种去污剂接触，其中该方法使有脂质包膜病毒的灭活的程度比该病毒大4logs，且其中血液产品蛋白质的量至少为90％，并且其中用扩散吸附剂除去溶剂/去污剂。吸附剂材料可通过将溶剂/去污剂产品通过装有吸附剂的柱子运行来导入产品，或可将吸附剂直接导入产品，然后用离心法或排阻过滤(exclusion filtration)法，或倾析法除去。当使用扩散层析时，优选的实施方案是将产品通过一个吸附剂柱运行。 
本发明尤其是涉及制备一种基本不含有病毒体，同时含有相当大量的血液产品蛋白质的血液产品组合物，例如血液、血浆和血液级分等等。更特别的是，本发明涉及含脂质病毒的灭活，优选如乙肝和丙肝病毒的灭活。其他用本发明方法灭活的病毒包括如细胞肥大病毒、EB病毒、疱疹群病毒(herpes group virus)和副粘病毒。 
特别地，在本发明的方法中，血液产品优选为人免疫γ球蛋白，该免疫球蛋白用Cohn等人的上述文献以及共同转让的美国专利No.6,096,872公开的全部改良的Cohn-Oncley低温醇分级分离方案进行分级分离，之后用Viresolve 180大小排阻滤器(RhoGAM
Figure BSA00000517914800051
Ultra-Filtered Rho(D)Immune Globulin(Human)，Ortho-Clinical Diagnostics，Raritan，NJ)进行纳滤。该纳滤按照共同转让的美国专  利No.6,096,872公开的方法进行。 
该血液产品的提纯也可用切向过滤、离子交换层析、亲和层析或电泳方法或这些技术的结合来完成。 
附图简述 
图1是RhoGAM
Figure BSA00000517914800061
溶剂去污剂病毒灭活过程的流程图。 
图1A、1B和1C是用于本发明朊病毒和病毒的清除过程的VIRESOLVE180SYSTEM超滤系统的示意图。图1A、1B和1C标明1为产品保持罐，2为病毒清除滤器固定器，3为超滤滤器固定器，4为50mM氯化钠-甘氨酸缓冲液储存罐，5为T-1再循环罐，6为T-2UF再循环罐，7为P1 Viresolve 180进料泵，8为Viresolve 180渗透泵，9为UV计，10为UF进料泵，11为UF渗透泵，12为取样口，13为产品回收和串联(in-line)无菌过滤。 
图2是分级分离人血浆以获得抗Rh-球蛋白的流程图。 
图3是表明用本发明的S/D处理方法对掺加BVDV的IgG进行病毒灭活的图。见实施例2。 
图4是表明用本发明的S/D处理方法对掺加PRV的IgG进行病毒灭活的图。见实施例2。图4关于溶剂/去污剂处理研究-试验1。 
图5是表明用本发明的S/D处理方法对掺加BVDV的IgG进行病毒灭活的图。见实施例2。图5关于溶剂/去污剂处理研究-试验2。 
图6是表明用本发明的S/D处理方法对掺加WNV的IgG进行病毒灭活的图。见实施例2。图6关于溶剂/去污剂处理研究-试验2。 
图7是表明对SDR Hyper D吸附剂除去Triton X-100和TNBP的能力的评估的图。Triton X-100的临界点在70ml通过柱后观察到。而TNBP未出现临界点，表明Triton X-100的浓度是计算所需吸附剂量的关键参数。 
图8是实施例2中实施的病毒灭活规程的流程图。 
发明详述 
本发明描述了一种作为制备后步骤的蛋白质组合物，例如血液产品或血液产品组合物的病毒灭活方法，例如在血液产品或血液产品组合物大小排阻过滤之后，使用与现有技术方法相比浓度显著降低的溶剂和去污剂进行所述方法。在纯化的蛋白质系统中，大小排阻过滤后，与现有技术方法相比，完全灭活该纯化的血液产品中的有包膜病毒需要少10至20倍的S/D化学制剂。该纯化的  蛋白质系统是血液产品，更特别的是，是纯化的人免疫γ球蛋白或RhoGAMUltra-Filtered和MICRhoGAMUltrafiltered产品(Ortho-Clinical Diagnostics，Inc.，Raritan，NJ)。 
RhoGAM
Figure BSA00000517914800073
Ultra-Filtered是含人抗D免疫球蛋白的无菌溶液。它是用于防止暴露于Rh(D)阳性的红细胞下的Rh(D)阴性个体的Rh(D)免疫的肠胃外产品。该制剂打算用于肌内施用。它从Rh(D)阴性供体的血浆中获得，这些供体通过以前输血或怀孕而具有抗体，或曾经对D抗原进行过免疫。本发明受让人还出售一种较低剂量的抗Rho(D)，MICRhoGAMRho(D)免疫球蛋白(人)微剂量(50微克抗Rho(D))，用于治疗妊娠12周或更早时流产的妇女。尽管全剂量保护受体最高达15ml Rho(D)阳性红细胞，而较小剂量保护最高达2.5ml Rho(D)阳性红细胞。 
含有蛋白质的组合物，包括溶液在内，可用本发明的方法纯化。例如，可以被纯化的组合物包括血液产品和血液产品组合物，包括如全血、血浆或其任何含血液蛋白质的级分、浓缩物或衍生物、血浆浓缩物、血液成分、含血浆产品和含易变性的蛋白质的含血浆级分的产品，例如免疫球蛋白、从血浆分级分离得到的沉淀物、从血浆分级分离得到的上清液、血清、冷沉淀物、冷上清液(cryosupernatant)、细胞溶解产物和血液细胞中诱导的蛋白质，包括单克隆和多克隆的抗体。可用这些方法纯化的其他蛋白质包括哺乳动物乳汁、腹水液、唾液、胎盘提取物、组织培养提取物，包括转化的细胞提取物、发酵产物、转基因衍生产品和重组蛋白质。 
本发明的方法允许处理混合的血液产品组合物。该血液产品可以照现在的样子使用，或者如有需要也可进行进一步的处理，作为基本上病毒纯化的组合物使用。 
本发明尤其涉及制备一种基本不含有病毒体，然而含有相当大量的血液产品蛋白质的血液产品组合物，例如血液、血浆和血液级分等等。更具体的是，本发明涉及含脂质病毒的灭活，且优选如乙肝和丙肝病毒的灭活。 
本文公开了在处理液体的血液组分例如血浆和血浆级分方面的方法，但它也同样可用于处理血液的固体组分、其溶解产物或蛋白质，例如浓缩物以及相似的固体组合物和血液组分，等等。根据本发明的方法，可以处理血浆本身，或新鲜冷冻血浆或解冻后的冷冻血浆、冷沉淀物、冷冻血浆的冷上清液或浓缩  物，以及其稀释产物。该制剂可在制备过程的开始或制备之后，采用本发明的方法进行处理。 
特别地，该血液产品优选人免疫γ球蛋白，该免疫球蛋白用Cohn等人的上述文献以及共同转让的美国专利No.6,096,872公开的全部改良的Cohn-Oncley低温醇分级分离方案进行分级分离，之后用Viresolve 180大小排阻滤器(RhoGAM
Figure BSA00000517914800081
Ultra-Filtered Rho(D)Immune Globulin(Human)，Ortho-Clinical Diagnostics，Raritan，NJ)进行纳滤。该纳滤按照共同转让的美国专利No.6,096,872公开的方法进行。该材料在2-8℃的无菌的条件下贮存直到应用。 
血浆分级分离一般使用有机溶剂如乙醇、甲醇或聚乙二醇，在低温和受控制的pH下，以使含所需血浆蛋白质的被选的血浆级分沉淀下来。参见Cohn-Oncley分级分离法(Cohn等人，同上述文献)。所得的上清液本身可以被沉淀，直至达到所需的分级分离程度。参考图2，级分II和III可进一步进行分级分离以获得免疫γ球蛋白。 
在本发明的过程中，其中沉淀物II(例如，得自Cohn等人，同上述文献的过程)材料被稀释至约4.6-5.0mg/ml(约0.5％)，而后必须通过超滤法浓缩10倍，此外其中制剂用S/D进行制备后处理，重要的是使用低的初浓度的赋形剂(例如，Polysorbate 80)；上文提到的并优选约0.002％的赋形剂的浓度范围并不会对过程有不利影响。例如对于有包膜病毒来说这种不利影响是病毒从包膜分离，以及病毒粒子进入到滤液中。本发明受让人进行的研究，使用水泡性口膜炎病毒，即一种子弹形状的有包膜的含RNA的病毒，所述研究表明在使用于本发明中的赋形剂的浓度(100ppm或0.01％)，没有发生明显的病毒灭活。 
本发明处理过程中用的蛋白质的浓度范围为约0.1重量％至约1重量％。当蛋白质材料为单体或单克隆的时，可使用最高达约1％的浓度。对于本发明中所使用的沉淀物II免疫球蛋白，处理所用的蛋白质的初始浓度为约4.6-5.0mg/ml(约0.46-0.5％)。 
Cohn，美国专利No.2,390,074，其内容在此引入作为参考，公开了一种分级分离血液的方法，通过该方法制备γ球蛋白。用Cohn方法制备的γ球蛋白含19S球蛋白、纤溶酶原和脂质。虽然这样的γ球蛋白非常适合预防如麻疹和破伤风的疾病，然而对于预防对胎儿红细胞上Rh-因子的免疫作用，19S球蛋白、纤溶酶原和脂质的存在是非必需的杂质，且可能降低其效果。 
由本发明的有效方法生产的基本纯的抗-Rh球蛋白，是从含有清蛋白、纤溶酶原、α、β和γ球蛋白和各种脂质的人血浆中制备得到的。特别地，本发明的抗-Rh球蛋白是γ球蛋白。 
为获得抗-Rh球蛋白，可按照共同转让的美国专利申请No.3,449,314和Pollack等人提供的方法分级分离人血浆，该专利的教导被引入此处作为参考。参考附随的图2的流程图，分级分离人血浆的能力取决于血浆的各种组分的溶解度。在分级分离的每一阶段，级分的分离和抗-Rh球蛋白中不希望得到的那些组分的最后除去，是由临界控制pH、温度和沉淀剂的浓度和系统的离子强度决定的。 
低电解质常数的各种有机溶剂如丙酮和醇可使蛋白质沉淀，并且已经用于血浆的分级分离。本发明方法中使用的有机溶剂包括各种醇和丙酮，优选甲醇。优选甲醇是因为与其他有机溶剂相比其具有相对较低的毒性和操作起来更安全(例如，爆炸危险)。 
为了防止分级分离过程中蛋白质的变性，在低温下进行沉淀。因为蛋白质的溶解度是温度依赖性的，所以为了避免变性，每一步分级分离选用的温度必须是达到所需分离目的的最低温度。 
参照图2的流程图，本发明优选的获得蛋白质的方法，分级分离从人全血浆开始。血浆冷却至约1℃，然后离心，以从上清液中分离出低温不溶的沉淀物。进一步分级分离上清液得到沉淀物I和上清液I。弃去主要由纤维蛋白原组成的沉淀物I。进一步分级分离上清液I得到上清液II+III和沉淀物II+III。弃去含α和β球蛋白以及脂质的上清液II+III。沉淀物II+III主要由β和γ球蛋白和同种凝集素组成，但也含凝血酶原、纤溶酶原、胆固醇和其他脂质。进一步分级分离沉淀物II+III得上清液II+III W和沉淀物II+III W。β球蛋白、胆固醇和其他脂质主要在丢弃的上清液II+III W中被移出。沉淀物II+III W主要由γ球蛋白、同种凝集素、纤溶酶原和凝血酶原和一些β球蛋白、胆固醇和其他脂质组成。进一步分级分离沉淀物II+III W得到上清液III和沉淀物III。弃去含同种凝集素、纤溶酶原和凝血酶原的沉淀物III。上清液III主要由γ球蛋白和少量纤维蛋白原和脂质组成。最终的分级分离步骤得到沉淀物II，其是基本上纯的γG球蛋白，几乎完全不含19S球蛋白、纤溶酶原和脂质。本发明方法制备的沉淀物II是抗Rh-γ球蛋白。 
在本发明优选方法中，用于进行重悬的免疫球蛋白起始材料是从改良的Cohn等人(同上)方法制得的沉淀物II浆。必须注意的是，从血浆纯化的免疫γ球蛋白的该初始纯化也可通过过滤、沉淀亲和层析、离子交换或上述一或多个技术的组合来完成。 
本发明用来重悬沉淀物II浆的液体稀释剂包括药学上可接受的稀释剂，选自注射用水、U.S.P.(“W.F.I.”)、生理盐水U.S.P.、或各种合适的缓冲液的任意一种，缓冲液的优点在于可提供稳定的pH。合适的缓冲液选自pH约为6.4的磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液。优选的最初的稀释剂是重量为浆3倍的W.F.I，其然后经高离子强度缓冲液稀释后再进行第一次纳滤。本发明预期的高离子强度缓冲液也适合作为最初的稀释剂。采用的离子强度优选为150mM±20％，优选150mM±20％NaCl甘氨酸缓冲液；pH6.4。 
在本发明处理和过滤免疫球蛋白的过程中，优选用高离子强度缓冲液作为加工助剂以减少免疫球蛋白二聚体和三聚体的形成，从而使免疫球蛋白更完全地通过滤器。合适的高离子强度稀释剂是前文对重悬稀释剂所述的那些稀释剂，但离子强度更高，且pH约为6.4。优选的所述加工助剂的离子强度最优选约为150mM±20％，这接近生理离子强度。在本发明的最优选实施方案中，高离子强度加工助剂是150mM NaCl-甘氨酸缓冲液，pH6.4。 
在处理本发明基本上无朊病毒和无病毒的免疫球蛋白的时候，在所述过程的过滤步骤开始时将非离子赋形剂方便地与高离子强度缓冲液混合。这方面参考制备含有Polysorbate 80的高离子强度缓冲液的实施例1A。本发明的加工助剂可互相调节，从而如果Polysorbate 80的浓度增加，则使离子强度容量降低。在本发明的免疫球蛋白制剂中，且尤其是RhoGAM
Figure BSA00000517914800101
和MICRhoGAM
Figure BSA00000517914800102
制剂中，所述制剂被设计为单用途的肠胃外制剂，并不需要加入防腐剂。 
在本发明例如用小孔径第二纳滤滤器浓缩蛋白质并除去有机溶剂的步骤中，所述滤器的截断值为约10,000K-最高约60,000K，例如Biomax-50(截断值50,000K)滤器(Millipore Corporation，Bedford，MA)，高离子强度缓冲液任选地被更换成较低的离子强度，例如50mM的缓冲液。这一蛋白质浓缩步骤浓缩了纳滤的蛋白质产品，同时去除了一些赋形剂和有机溶剂。 
溶剂/去污剂方法开始之前的产品的过滤可以是任何可以显著降低潜在病  毒载量的过滤或纯化。其包含但不限于直接大小排阻过滤、切向大小排阻过滤、深度过滤(depth filtration)、亲和柱通道(affinity column passage)或离子交换层析。 
在用Viresolve-180膜系统进行过滤时，跨膜压力优选为约＞0至约3.0磅/英寸2(psi)，最优选低于约1.5磅/英寸2。筛分系数优选高于约60％。 
本发明的处理可在环境温度下进行。冷却温度下进行处理一般会延长过滤时间，因为这样的温度(例如16-17℃)通常会增加粘度。处理过程中的产品温度可以是约0℃或略高至约45℃，更优选是约15℃-30℃，最优选是约20℃-25℃。 
此处所用的术语有如下含义： 
交叉流流速：    进料溶液流经膜表面的流速，ml/分钟 
透过液：        通过膜的纯化产品 
保留液：        被膜保留的材料 
流量：          透过液流速/面积 
换算：          透过液流速/交叉流流速 
筛分系数：      透过液中蛋白质含量/保留液中蛋白质含量 
在本发明的一个实施方案中，参考图1、1A、1B和1C，和美国专利No.6,096,872，通过纳滤制备基本上纯的(除去朊病毒和病毒的)的免疫球蛋白，例如RhoGAM的制备规模加工进行如下： 
用Cohn纯化法(Cohn等，J.Am.Chem.Soc椈Vol.68，p.459-475)，但将乙醇换成甲醇，将Rho(D)免疫球蛋白纯化成“沉淀物II浆”，重悬在注射用水(WFI)，U.S.P.中，冷却至2-8℃。用下式计算W.F.I体积： 
沉淀物II重量(kg)×3L/kg＝所需W.F.I体积(L) 
将每kg沉淀物II浆重悬在3LW.F.I中。 
将混合物在维持罐-产品中涡流(无泡沫)3-8小时(1)，且使用前保存于4℃。对病毒清除系统进行就地蒸汽(Steam in place)(SIP)处理，其包括在病毒清除滤器固定器中安装Viresolve CIP/SIP模块(Millipore Corporation，Bedford，MA)(2)和在超滤滤器固定器上安装Pellicon CIP/SIP模块(Millipore Corporation，Bedford，MA)(3)。还对系统和50mM NaCl-甘氨酸缓冲液储罐进行CIP/SIP处理(4)。 
就地清洗(Clean in place)(CIP)过程是一种无需拆卸设备部件的设备清洗方法。对设备的要求包括：所有管道都是不锈钢的，节距和排布合理，垫圈数  最少。CIP的目的是免除手工清洗和避免批次间的交叉污染。可对该过程进行检验。清洗要素包括时间、温度、化学和机械参数。处理后残留物的类型将决定CIP程序所用的清洗剂。制药业的一般技术人员都熟悉CIP的过程和要求。 
SIP程序之后，Viresolve CIP/SIP模块(2)被替换为安装用于约40L重悬的沉淀物II体积的20叠Viresolve-180R模块(2)。(10叠Viresolve-180滤器可用于10-16L最终产品体积，而20叠可用于＞16-40L最终产品体积)。Pellicon CIP/SIP模块(3)被替换为安装4个Biomax-50盒(Millipore Corporation，Bedford，MA)。2个Biomax-50盒可用于10-16L重悬的沉淀物II体积，4个盒可用于＞16-40L的体积。Viresolve-180模块用氯消毒并清洗，直至二乙基苯二胺(DPD)方法测定的氯≤0.3ppm氯。 
消毒后对模块(2)进行压力保持测试。模块必须能承受最小10磅/英寸2压力，并且，在所需的5分钟测试时间段期间显示压降≤1磅/英寸2。 
用WFI、U.S.P.冲洗Biomax-50膜(3)。对最后透过的冲洗样品进行苯扎氯铵(Roccal)测定；苯扎氯铵含量必须≤10ppm。对Biomax-50盒进行扩散测试；如下计算释放速度： 
释放体积(cc)÷时间段(分钟)÷盒数目＝释放速度(cc/分钟/盒) 
释放速度必须≤18cc/分钟/盒。 
用Viresolve-180滤器(2)对50mM NaCl甘氨酸缓冲液进行病毒清除超滤。在病毒清除再循环罐(T-1)(5)中加入50mM NaCl-甘氨酸缓冲液。加入的最大体积是250L，最小是130L。 
缓冲液在T-1(5)中再循环，同时将缓冲液透过液收集在离线罐中。 
在病毒清除再循环罐(T-1)(5)中加入最少60L的150mM NaCl-甘氨酸缓冲液，以用于清洗罐和膜。 
如下处理沉淀物II重悬液。以形成涡流但不发泡的速度混合沉淀物II 15-30分钟，直到完全悬浮。用手持突眼计对沉淀物II重悬液通过折光指数测定蛋白质百分比(mg/ml蛋白质)。为达到5.0mg/ml蛋白质浓度所需的稀释的沉淀物II的最终体积用下式计算： 
Figure BSA00000517914800121
所需150mM NaCl甘氨酸缓冲液体积用下式计算： 
所需的稀释的沉淀物II体积(L)-重悬的沉淀物II体积(L)＝要加入的缓冲液体积(L) 
加缓冲液是为了稀释沉淀物II，并以足够形成涡流但不发泡的速度混合最少30分钟。下一步处理之前，将混合物在15-30℃最多保存2.5小时。 
将稀释的沉淀物II分批加入病毒清除再循环罐T-1(5)进行超滤。TMP设定值约为3.0。然而，它可能会升高，如果达到了约12，那么膜可能被极化，并且应允许保留液洗涤膜(通过减少透过液)。如下计算Viresolve液面设定值： 
Figure BSA00000517914800131
如果以上结果小于50，则以50作为Viresolve液面设定值。将1/3总体积按四舍五入法调整到最接近的整数L。 
血液组分、血浆或其任何包含血液蛋白质的级分、浓缩物或衍生物，含血浆产品和含易变性的蛋白质的含血浆级分产品，例如免疫球蛋白： 
Figure BSA00000517914800132
如果以上结果小于20，则以20作为浓缩终点。如下计算超滤渗滤终点： 
浓缩终点-3＝渗滤终点 
渗滤器(diafilter)总设定值的计算如下： 
浓缩终点×5.5＝渗滤器总设定值(L) 
为了开始超滤/浓缩过程，将Viresolve-180进料泵(P1)(7)的速度斜升为对应于20叠滤器大小的75％-83％，或对应于10叠滤器大小的37％-42％。控制TMP；TMP由渗透泵(P2)的速度来控制；如果跨膜压力达到3.0，则降低泵速。将Viresolve渗透泵(P2)(8)的速度缓慢斜升到最高18％，若用10叠滤器则升高到9％。一旦P2升高，则保留压(PT3)保持在≥5.0磅/英寸2。一旦TMP达到平衡，就将泵速设定在对应于10叠滤器的9％-11％；对于20叠滤器的18％-23％。不控制TMP压力；然而，该压力优选相对较低，例如约低于3.0磅/英寸2，否则，膜会极化。如果TMP升高，例如3.0磅/英寸2，则可以停止渗透，从而使得保留液可洗涤膜。UV计(UV1)(9)应该介于下限4.0A.U.与上限7.7A.U.之间。透过液流速(FT1)介于下限0.81升/分钟(LPM)与上限0.98LPM之间；若为10叠  滤器，则介于0.40LPM-0.49LPM之间。处理温度保持在约15-30℃。在病毒清除/超滤过程中，对以上条件进行全程监控。UV计(UV1)(9)介于下限6.4A.U.与上限7.7A.U.之间。筛分系数应为约≥75％。 
当T-2(6)的体积达到约75-100L时，建立Pellicon系统(3)，并开始混合。启动/调高UF进料泵(P5)(10)，由泵速控制UF渗透流速。UF进料压(PT4)和UF保留压(PT5)保持为如下： 
UF进料压：≤30磅/英寸2
UF保留压：≤10磅/英寸2
保持进料压和保留压之间的压差≤20磅/英寸2。 
进料压(磅/英寸2)-保留压(磅/英寸2)＝压差(磅/英寸2) 
稀释的沉淀物II进料罐T-1(5)内的体积水平由T-1上的测压仪监控(通过重量)并做出响应。 
在T-1(5)中进行恒容渗滤。这次渗滤使得残留的蛋白质通过系统和Viresolve-180膜洗涤，从而提高得率。进行3次150mM NaCl-甘氨酸缓冲液渗滤；加入固定量的缓冲液，加入速度与其通过Viresolve-180渗透去除时的速度相同。一旦渗滤步骤完成，则如前所述，用氯方法消毒T-1(5)和Viresolve-180模块(2)，从而确保任何滞留的病毒被灭活。在T-2(6)内的主体(bulk)用病毒清除的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液进行的T-2(6)内恒容渗滤进行浓缩。这一步骤浓缩了主体产品，并将高离子强度缓冲液浓度更换为低离子强度缓冲液浓度，去除了Cohn方法中的甲醇以及约一半的Polysorbate 80。渗滤过程完成后，记录T-2(6)中的液面(L)。从T-2(6)中取样，以进行UF透过液样品的数字比电导测定。结果必须落于4.95-5.67×10-3mhos/cm范围内。如果第一次测试不满足以上要求，则必须继续恒容渗滤，直到测试结果落于该所需范围内。 
5.5X渗滤后T-2液面应该≤95％重悬的沉淀物II体积。如果T-2液面高于95％重悬的沉淀物II体积，则继续浓缩所述主体，直到T-2体积达到上限体积水平要求。一旦达到上限体积水平，则关闭UF渗透(11)，通过再循环混合所述主体，并无菌取样10.5ml(12)。用手持式突眼计对0.5ml样品等分试样通过折光指数测定蛋白质百分比。如果蛋白质浓度不是最小约5.5％，则必须进一步浓缩样品，直至达到上述最低百分比。将所述主体排放到一个临时容器中，并用下式通过重量分析计算所述主体的重量： 
装满的临时容器重量(kg)-临时容器的自重(kg)＝T-2内主体产品重量(kg) 
通过用下式确定达到最终主体体积所需加入的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液体积，可调节所述主体： 
Figure BSA00000517914800151
需加入的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液体积是如下进行计算的： 
所需最终体积(L)-T-2内的主体产品体积(L)＝所需的50mM NaCl-甘氨酸体积 
对剩余样品等分试样测定最初pH，这通过先用0.9％NaCl以1∶10稀释等分试样，然后用0.5N HCl或0.5N NaOH的1∶100稀释液滴定到pH 6.3-6.4来实现。 
如果需要调整，则如下所述计算调整所述主体的pH所需未稀释的0.5N试剂的量： 
所需最终体积(L)-所需的1∶100的滴定剂体积(ml)＝未稀释的0.5N试剂的体积(ml) 
根据可接受的方法对Viresolve-180滤器模块进行完整性检测。完整性检测值必须≥1.2，且必须如前所述对模块进行氯消毒和清洗。 
根据下式计算加入所述主体的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液： 
罐2的液面(L)+50mM NaCl-甘氨酸缓冲液所需体积(L)＝最终所需主体体积的罐2液面(L) 
达到所需的最终体积后，用泵将主体返回到T-2中，并在T-2中继续混合10-60分钟，然后无菌移取10.5ml主体产品等分试样用于测定pH。pH必须是6.3-6.4。如果pH不在该范围内，则必须如前所述稀释所述等分试样并滴定，直到达到可接受的pH，且应如前文所述计算未稀释的0.5N试剂的需要量，并在混合时加回到所述主体中。 
如前文所述，用手持式突眼计，通过折光指数测定蛋白质百分比。如果蛋白质浓度≥可接受的5.0％，则所述主体可进入下一步骤。 
任选通过0.2μ的Optiseal滤器(13)过滤所述主体，过滤过程中的压力不超过15磅/英寸2，然后对所述主体进行微生物学和血清学检测。 
对病毒清除系统进行由使用WFI和蒸汽进行清洗组成的就地清洗过程(前文所述的CIP过程)。 
表1列出了可接受的产品标准。 
表1
Figure BSA00000517914800161
本发明涉及使任意一种上述含蛋白质的组合物如血液产品与溶剂接触。特别地，该血液产品优选为用改良的Cohn-Oncley低温醇分级分离方案制备的人免疫γ球蛋白，如在Cohn等人，同上述文献和共同转让的美国专利申请No.6,096,872中公开的方案。分离IgG后，使溶液通过Millipore Viresolve大小排阻滤器以除去有包膜和无包被病毒。然后使除去了病毒的材料进行渗滤，并用Millipore BioMax(50,000MW)大小排阻滤器浓缩。在制备RhoGAM
Figure BSA00000517914800162
的这个阶段，优选使用S/D方法。 
将需要根据本发明进行病毒灭活的蛋白质组合物，尤其是人免疫γ球蛋白，包括人免疫γ球蛋白或RhoGAM
Figure BSA00000517914800163
，与去污剂接触，所述去污剂例如具有含1至10个碳原子，特别是含2至10个碳原子的烷基的磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯，例如磷酸三烷基酯，包括磷酸三正丁基酯、磷酸三叔丁基酯、磷酸三正己基酯、磷酸三-2-乙基己基酯、磷酸三正癸基酯。特别优选的磷酸三烷基酯是磷酸三正丁基酯。不同的磷酸三烷基酯的混合物也可以使用，同样可以使用的还有具有不同烷基链的烷基基团的磷酸酯，如磷酸乙基，二正丁基酯。类似地，也可以使用具有磷酸二烷基酯的不同烷基基团的混合物的各自的磷酸二烷基酯。此外，也可以使用磷酸二烷基酯和磷酸三烷基酯的混合物。 
当如在优选的实施方案中那样，S/D步骤在最终大小排阻过滤之后(制备后)进行时，使用的磷酸三烷基酯溶剂最优选为磷酸三正丁基酯(TNBP)，其浓度为大约0.003％至小于0.3％，更优选大约0.006％至小于0.3％，更优选大约0.015％至大约0.15％，更优选大约0.03％至大约0.15％，且最优选大约0.03％至0.06％，与之相比，现有技术使用的浓度为约1.0-0.3％mg/ml。在一个优选的实  施方案中，溶剂的浓度为大约0.06％。 
磷酸二或三烷基酯溶剂使用时，可加入或不加入表面活性剂，即去污剂。然而，优选磷酸二或三烷基酯与去污剂联合使用。该去污剂可在磷酸二或三烷基酯与血液产品组合物接触之前、同时或之后加入。加入去污剂的目的是加强血液产品组合物中的病毒与磷酸二或三烷基酯之间的接触。优选的实施方案是将需要病毒灭活的蛋白质组合物暴露于预先混合好的含S/D组合的溶液。 
优选的去污剂为非离子去污剂。特别地，预期的去污剂包括脂肪酸的聚氧乙烯衍生物、山梨糖醇酐偏酯，例如市场上出售的Tween 80
Figure BSA00000517914800171
和Tween 20
Figure BSA00000517914800172
，以及如Polysorbate 80，还有非离子油溶性水去污剂，例如在市场上以Triton X-100
Figure BSA00000517914800173
的商标出售的产品(氧乙烯化烷基酚)。同样预期的有脱氧胆酸钠，以及合成两性离子去污剂“Zwittergents”，称为“磺基三甲铵乙内酯”如N-十二烷基-N，N-甲基-2-铵基-1乙磺酸盐及其同类物(congener)，或非离子去污剂，如辛基-β-D-吡喃葡糖苷。去污剂Triton X-100由于其与溶剂联合使用时，会产生优秀的协同病毒灭活作用，所以用于本发明的优选实施方案。 
可以加强磷酸烷基酯的效果的物质包括还原剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇和二硫代辛酸。合适的非离子表面活性剂为氧乙烯化烷基酚、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯油脂和聚氧乙烯醇和聚氧乙烯氧丙烯脂肪酸。一些具体的例子包括如下：烷基苯氧基聚乙氧基(30)乙醇、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月硅酸酯，聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸酯、聚氧乙烯(20)棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)十二烷基醚、聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(20)硬脂基醚、聚氧乙烯(20)油基醚、聚氧乙烯(25)氢化蓖麻油和聚氧乙烯(25)氧丙烯单硬脂酸酯。 
如果使用去污剂，其量为大约0.01％至小于1.0％，更优选大约0.02％至小于1.0％，更优选大约0.05％至大约0.5％，更优选大约0.1％至大约0.5％，最优选大约0.1％至大约0.2％。当如在使用人免疫γ球蛋白的优选的实施方案中那样，在最终大小排阻过滤之后(制备后)进行S/D步骤时，所用的去污剂最优选为Triton X-100，其浓度为大约0.1％至0.2％，最优选0.2％，与此相比，现有技术中所用的浓度为大约1.0％。 
本发明方法中优选采用的S/D组合及比率，即，浓度为大约0.03％至大约0.06％的磷酸三正丁基酯(TNBP)，以及浓度为大约0.1％至大约0.2％的Triton X-100在所用的温育条件下是最优选的，这是因为其具有强效的病毒灭活作用；此处的数据显示反应一结束，病毒灭活即告完成。 
本发明预期的用溶剂/去污剂处理血液产品组合物的方法在大约-5℃至70℃的温度下起作用，优选大约15℃至25℃。该处理的时间(接触时间)至少为大约1分钟，优选约10分钟至大约1小时，且最优选大约1小时。该处理一般在大气压力下完成，尽管也可在小于和大于大气压力下完成。当根据本发明优选实施方案使用大约0.06％的TNBP和大约0.2％的Triton X-100时，处理在15℃至大约25℃下进行大约1小时。温度、温育(接触时间)和压力的增加影响达到同样的效果的溶剂和去污剂的使用量(因此需要更少的量)。 
蛋白质的回收依赖于去污剂-蛋白质混合方法。将去污剂(例如，Triton X-100)与最终得到的人免疫γ球蛋白混合的方法影响S/D处理后的蛋白质回收。将未稀释的去污剂直接加入蛋白质，在这种情况下是人免疫γ球蛋白，导致只有80-90％的蛋白质被回收。理论上，该方法会导致蛋白质-去污剂的结合，且除去去污剂也会导致蛋白质被一起除去。更优选的方法是将10％的去污剂溶液(含有3％TNBP)加入蛋白质溶液，以得到前面提到的S/D浓度，且因而蛋白质的得率为95％或更高。 
在病毒灭活过程中，关键是必须知道向重悬的沉淀物II材料(从Cohn-Oncley低温醇分级分离法得到；见Cohn等人，同上文献)(或向用其他方法，或醇分级分离、沉淀或亲和层析等的组合纯化得到的血浆衍生物)中加入的S/D的量。类似重要的是能够确定除去后S/D的残留量小于大约10ppm。向产品中送递的S/D的量可通过重量和体积测量来测定。Polysorbate 80和Triton X-100的测量可通过分光光度计和HPLC测得；TNBP则可通过气相层析测得。例如，可参考Milwidsky，A.，Analyst 1969；94：377-86(对于Polysorbate 80)；Karlsson，G等人，J.Chromatography A 2002；Feb 8；946(1-2)：163-168(对于Triton X-100)；和Nellaiappan K等人.，J.Chromatography B Biomed Sci Appl.；2001；Jun 5；757(1)：181-189(对于TNBP)。 
一般地，在处理含蛋白质的组合物后，应除去S/D，尽管如果应用本发明的方法则没有必要。这是因为S/D的相对低浓度，且这也取决于病毒灭活剂的特  性，以及含蛋白质组合物例如已这样处理过的血液产品组合物的预期的进一步用途和加工。 
人免疫γ球蛋白的病毒灭活的实施方案中优选除去S/D材料。用于S/D除去的一般方法包括通过C-18柱，通过膜进行渗滤，所述膜保留S/D或目的血液产品组合物，在层析支持体上或亲和层析支持体上吸附S/D或目的血液产品组合物。另外的几个方法包括超滤、过滤/吸附，即通过含硅藻土的滤器，即Cuno Delipid Plus，且滤器的无定形沉淀的二氧化硅Sipernat 50S一起用作吸附剂，并通过例如离心从组合物中除去。 
优选的S/D除去的方法是使用吸附剂。优选两种层析吸附剂。第一种且最优选的吸附剂，SDR HyperD溶剂-去污剂除去吸附剂(Ciphergen Coporation，Fremont，CA)是具有额外的三维交联的疏水性聚合物的二氧化硅珠，其特别制备为用于从S/D过程中除去Triton X-100和TNBP。第二种，Amberchrom CG161C(Rohm and Haas，Philadelphia，PA)是二乙烯基苯聚合物树脂，用作吸附剂和用于反相液相层析。这两种材料的结果都是极好的。两种吸附剂从含10,000ppm Triton X-100和3000ppm TNBP的经S/D处理的RhoGAM
Figure BSA00000517914800191
中有效地除去Triton X-100和TNBP至低于1ppm的水平。通过柱子的流动速率和温度都会影响S/D试剂的除去。在临界点前，较低的流动速率和环境温度(与较冷的温度比较)增加了从RhoGAM
Figure BSA00000517914800192
中除去的S/D试剂的量。 
SDR Hyper D柱子是优选的实施方案，这是因为尽管要用蠕动泵来控制流动速率，但S/D RhoGAM
Figure BSA00000517914800193
的重力自流进料是可能的。重力自流进料的能力已导致发展了一种使用一次性柱子从大量的样品中除去S/D试剂的简单方法。该方法已使得能够从病毒灭活研究的生物流体中除去S/D试剂，而不需要将该样品稀释100-1000倍来消除S/D试剂的毒性作用。这使测定的灵敏度增加2-3log。 
也已确定，扩散层析柱能够除去Polysorbate 80以及用于灭活该产品的溶剂/去污剂试剂。 
本发明优选的实施方案中，当对人免疫γ球蛋白，也已知为RhoGAM
Figure BSA00000517914800194
或MICRhoGAM
Figure BSA00000517914800195
，进行病毒灭活时，处理后对S/D的除去优选通过使用S/D除去吸附剂来完成。如上文讨论的，优选的吸附剂由二氧化硅珠制得，其中孔体积填充了三维交联的疏水聚合物。在暴露于由该材料制成的柱子后，观测到的S/D残留是较低的百万分之一(ppms)。SDR Hyper D柱(Ciphergen)可以作为一次性  吸附剂使用或通过除去S/D而回收/再生。使用吸附剂除去S/D后，球蛋白溶液通过Biomax 50滤器(Millipore Corporation)以与缓冲液更换得到最终制剂，参见图1。 
本发明的方法可以和其它病毒灭活方法联用，包括那些用于无脂质包膜病毒的灭活方法，如加热血液产品组合物。 
在此公开的是纳滤后(制备后)获得的血液产品材料的样品的数据，其掺加有病毒，并在1/2000制备规模下进行溶剂-去污剂处理，该溶剂-去污剂浓度范围为小于约1.0％的Trion X-100和小于0.3％的磷酸三正丁基酯(TNBP)至约0.005％的Trion X-100和大约0.0015％的TNBP。等分试样的每个处理过的样品在处理期间的各种时间间隔除去，并通过稀释而停止灭活或通过溶剂-去污剂吸附剂柱(SDR Hyper D溶剂-去污剂除去吸附剂(Ciphergen Biosystems))。通过TCID50(在现有技术中视为感染50％的微量培养板孔或管中细胞培养物数目的指定的悬浮体积中的病毒的量，称为TCID50或半数组织培养感染量)的标准方法学来测定病毒的效价。 
特别地，与现有技术中S/D灭活步骤相反，所述步骤在制备前或开始时进行，例如在源血浆上进行(Piet MPJ等人，Transfusion 1990；30：591-598)，或在过程中的中间体上进行，而例如除去病毒的大小排阻步骤放置在过程的末端(Van Holten RW等人，Vox Sang 2002；83：227-233；和Burnouf T等人，Haemophilia 2003；9：24-37)，S/D病毒灭活步骤的这种顺序安排是有历史原因的，且可能不是最优化的。在本发明中，S/D步骤安排在切向流纳滤除去病毒后，制备过程(制备后)的末端。 
如上列举的溶液和组合物可以用本发明的方法进行纯化，以使病毒灭活的程度大于4logs如乙肝和丙肝的病毒，同时具有适合的蛋白质得率，例如至少约80％，优选至少85％，更优选约95％和最优选98％至100％。 
本发明优选预期的是分级分离的人免疫γ球蛋白，其基本上不含有脂质包膜的病毒如乙肝和丙肝病毒，其程度为灭活了大于4logs的病毒，且蛋白质活性的得率为至少约80％，优选至少85％，更优选约95％，且最优选98％至100％。 
由本发明的方法处理的组分的蛋白质活性可以用本领域已知的测量蛋白质活性的标准技术来测量。 
本发明的溶剂-去污剂处理在溶剂和去污剂浓度显著低于先前报道的浓度时被发现是有效的。特别地，强病毒灭活所需的溶剂和去污剂的浓度可以显著低于传统使用的浓度。产品的纯度和干扰物质(即脂质)的不存在可以影响病毒灭活的动力学。减少的溶剂和去污剂的水平使其灭活后的除去过程具有更高的效率，这潜在地带来更高的得率，并降低制备的费用。 
将S/D步骤安排在制备过程的末端(并且特别地在一个优选的实施例中，在切向流纳滤除去病毒后)具有以下好处： 
1.在纯化过程的最后阶段很好地确定产品，并使其均匀，从而使得能够使用减少量的S/D； 
2.因为减少的体积，所以可以更有效地完成S/D的除去；和 
3.在S/D处理前，通过纳滤除去病毒载量可能降低了最终产品中病毒碎片，从而减少阳性病毒PCR测定的可能性。 
处理血液产品时，向S/D混合物中引入脂质导致试验病毒牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和西尼罗病毒(WNV)的病毒灭活的结束。上述观察可以部分解释为什么血浆的S/D处理(前端处理)需要更长的时间以及增加的S/D浓度来获得与观察到的应用较少试剂获得的相同的效果；血浆的处理通常在与血浆纯化产物如因子VIII相比更高的溶剂浓度下进行(Horowitz，B等人，Blood，Vol 79(3)，826-831页)。 
对制备后的产品进行处理的能力(纯化后，例如通过大小排阻过滤)，导致较少的蛋白质被引入柱子。这在当制造者不能有效再生用来除去去污剂的柱子时尤其显著。 
也有理由推断如果产品在S/D处理之前通过大小排阻滤器，那么用核酸试验检测到病毒碎片的机会更少。S/D或巴氏灭菌法破坏了试验病毒的传染性，但是不能影响PCR效价(Hilfenhause，J等人，Transfusion，37卷，1997年9月，935-940页)。 
令人惊奇的是溶剂/去污剂处理的溶剂部分可以减少100倍，而没有对有包膜病毒的病毒灭活动力学造成不利影响。在本发明的实施方案中，其中S/D处理在前端(在非均质系统如汇集的血浆中)进行，使用更高量的TNBP和Trion X-100，同时使温育时间总是足够超出以留出如病毒载量或血浆的脂质含量的变量是明智的。我们发现在应用溶剂/去污剂之前，用Aerosil 380(Degussa AG，  Dusseldorf，德国)预处理血浆，可以增强病毒的灭活。 
如果一个或多个制备步骤已经就地除去了溶剂-去污剂化学制剂，那么在分级分离/纯化过程的早期安排溶剂-去污剂步骤是有利的。倘若目标蛋白质被吸附在层析树脂上，那么TNBP和去污剂将随同其它杂质通过柱子，并随后在目标蛋白质洗脱前被洗掉。但是，通过采用专门的可以有效地同时除去TNBP和去污剂的吸附剂，如优选在此所用的SDR Hyper D吸附剂，S/D步骤可以在制备过程的任意阶段进行。 
将S/D处理安排在过程的末端的优点是需要更少的TNBP和去污剂，因为需要处理的纯化蛋白质的体积应该有显著的减少。上述方法也可以成比例地减少除去S/D化学制剂所需的吸附剂量。对TNBP的暴露将减少。在这种情况下，40升满刻度批次的抗-D免疫球蛋白需要的S/D化学制剂的量少于用于处理900升初始血浆库(pool)所需的S/D化学制剂量的1/20。 
除了通过将病毒灭活步骤安排在制备过程的末端以减少得到的S/D之外，本发明评价了采用均减少体积的TNBP和Triton X-100进行病毒灭活的动力学。 
这里的数据表明，应用BVDV和PRV的初始运行显示出低至1.0％Trion X-100和0.3％TNBP标准浓度1/50的Triton X-100和TNBP稀度也足够灭活病毒到检测的限度。数据也表明灭活迅速发生；实际上，任何给定的样品发生的所有失活均出现在开始的2分钟内，除了该时间段外没有额外的灭活(图3-6)。 
二氧化硅扩散吸附剂SDR Hyper D溶剂/去污剂除去吸附剂(Ciphergen)是从S/D处理的材料中同时除去Trition X-100和TNBP的有效手段。通过以低于用于除去标准浓度的TritonX-100和TNBP所需比例的比例将掺加了病毒的样品通过SDR Hyper D柱来测定SDR Hyper D对于没有S/D存在下的病毒效价的作用。应用少于正常的体积将增强样品中病毒的任何除去。BVDV没有显著的减少(图3和5)，而PRV有大约1-log的减少(图4)。该PRV的丧失可能归因于PRV的大尺寸(120-200nm)，从而导致被吸附剂滞留；相对更小的BVDV(50-70nm)没有被滞留。还观察到15℃下的温育时间是PRV除去的决定因素。 
因为最初的运行表明了对测试的最低S/D稀度(1/50)的灭活，所以在第二组用BVDV和PRV进行的运行中，评估了S/D额外的稀度(1/100和1/200)。使S/D处理后的样品通过一次性的SDR Hyper D柱来除去S/D化学制剂。用该柱子处理使得要测试的样品是未稀释的，而不是在缓冲液里面将其稀释1/100，  因此增强了病毒分析的灵敏度。BVDV测定的灵敏度增加2-3logs(图6)，且PRV测定的灵敏度增加1log。观察到PRV是1log的增加而不是期望的2-3logs的增加与由SDR Hyper D导致的1log减少是一致的。1/100和1/200的S/D处理产生不完全的灭活。此外，在最初运行中显示对BVDV灭活至检测限度的S/D的1/50稀度现在在增加的灵敏度表现出不完全的灭活(图5)。在1/50稀度下，PRV继续表现出直至检测限度的完全的灭活。 
通过预过滤控制病毒污染，人们能够最优化吸附过程。加入更少的试剂可以减少过程的成本和时间，从而减少温育时间以及降低用于除去试剂的树脂的量。 
在减少的试剂浓度和较不苛刻的温育条件下处理的稳健性受到在S/D环境下初始温育后进行第二次病毒掺加的考验。该双重考验加强了即使在减少的S/D和温育时间，该处理仍是稳健的。参见表2和实施例2。 
表2
掺加了BVDV的RhoGAM的溶剂/去污剂处理 
0.2×S/D(0.2％Triton X-100、0.06％TNBP) 
  样品 病毒载量(Log10 TCID50)
  掺加的载量   7.83
  固定对照I   6.19
  固定对照II   5.87
  S/D T＝0分钟   2.64
  S/D T＝10分钟   2.64
  S/D T＝60分钟   2.64
  再掺加入S/D处理过的RhoGAM   7.83
  再掺加后T＝10分钟   1.69
据我们所知，比正常的0.3％TNBP、1.0％Triton X-100低50倍的S/D的浓度导致在相对短时间段期间显著的灭活。 
由于近年来西尼罗病毒在美国大陆的出现增加(Biggerstaff等人，Transfusion 42，2002年8月1019-1026页)，我们比较了S/D对于病毒WNV和BDVD的效果。我们确认了其它研究者的结果(Remington K M等人，Vox Sang.2004年  7月；87(1)10-18)，即BVDV和西尼罗病毒在其物理化学性质方法非常相似。这种相似性可以通过比较两种病毒的灭活动力学曲线观察到。比较图3-6。可以观察到灭活需要的时间和S/D浓度方面具有相似性。 
贯穿本申请始终，参考不同的专利和文献。为了更全面地描述到本发明此处所描述和请求保护的日期止的所述领域技术人员公知的技术状况，在此将所述专利和文献整体公开内容引入本申请作为参考。 
提供以下实施例仅作为阐明的目的，而不应被认为是对本发明范围的限制。 
实施例
实施例1
如美国专利No.6,096,872所述，用超滤方法制备除去病毒的RhoGAM
Figure BSA00000517914800241
，采用下列改进： 
将用改良的Cohn纯化方法纯化至步骤“沉淀物II浆”的6.802Kg Rho(D)免疫球蛋白重悬在20.406L注射用水(WFI)、U.S.P.中，冷却至4℃。将混合物涡流(不发泡)4小时，使用前保存于4℃。 
SIP程序后，安装用于约27.208L体积重悬的沉淀物II体积的Viresolve-180R模块(Millipore Corporation)(20叠)。Pellicon CIP/SIP模块被替换为安装2个Biomax-50盒。Viresolve-180模块用氯消毒并如上文所述进行清洗。用WFI、U.S.P冲洗Biomax-50膜。测定最后透过的冲洗样品的苯扎氯铵(Roccal)；苯扎氯铵含量为8ppm。对Biomax-50盒进行扩散测试；如前文所述计算释放速度；5分钟内的总释放体积是22cc，且实际释放速度是4.4cc/分钟。 
用Viresolve-180以245L的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液进行病毒清除超滤。在病毒清除再循环罐(T-1)中加入245L的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液。缓冲液在T-1中再循环，同时离线将缓冲液透过液收集在一个预先消毒过的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液储罐中。收集到的透过缓冲液体积是213L。病毒清除的缓冲液保存在约63-78℉的环境温度下。 
通过将缓冲液进料罐与病毒清除再循环罐(T-1)附着，用150mM NaCl-甘氨酸缓冲液(参见制备实施例1A)进行冲洗。在T-1中加入60L的150mM NaCl-甘氨酸缓冲液进行冲洗。 
如下所述处理沉淀物II重悬液。将沉淀物II(6.802Kg)混合55分钟，直到完全悬浮，混合速度形成涡流但不发泡。用手持式突眼计，通过折光指数测定沉  淀物II重悬液的蛋白质百分比(mg/ml蛋白质)，且结果为59mg/ml。 
计算得到蛋白质浓度为5.0mg/ml所需的稀释的沉淀物II体积： 
Figure BSA00000517914800251
或 
Figure BSA00000517914800252
用下式计算所需的150mM NaCl-甘氨酸缓冲液体积： 
所需的稀释的沉淀物II体积(L)-重悬的沉淀物II体积(L)＝要加入的缓冲液体积(L) 
或 
(321.054L)-(27.208L)＝293.846L要加入的缓冲液 
蛋白质浓度约为5.9％。 
将缓冲液(293.846L)加入27.208L稀释的沉淀物II中并混合30分钟，混合速度足以形成涡流但不发泡。 
在病毒清除再循环罐中加入107L稀释的沉淀物II。启动病毒清除再循环罐(1号泵)，对于使用的20叠的Viresove-180模块，进料泵的速度为80％。对于20叠的模块，将病毒清除渗透泵流速(2号泵)斜升至0.91LPM(20％)，以保持初始跨膜压力(TMP)低于1.6磅/英寸2。实际压力保持在1.2磅/英寸2。调整产品泵速度(3号泵)至液面控制速度。在处理全过程中，通过监控病毒清除再循环罐保留侧的蛋白质浓度来保持TMP低于3.0磅/英寸2。观察串联UV监控器，并将吸光度单位保持在对应于4.5-5.5mg/ml的蛋白质含量的6.4-7.7。 
在将来自病毒清除罐的约75L透过液加入超滤罐(UF)后，启动超滤进料泵(5号泵)，速度为10％。提高泵速(至25％)，直到UF透过液流速等于病毒清除透过液的流速，然后设定在25％以保持体积。UF透过液流速为0.91LPM，且VC透过液流速为0.91LPM。保持UF罐内体积恒定在152L。UF进料压力为4.0磅/英寸2，UF渗透压力为0.1磅/英寸2，而UF保留压力为0.7磅/英寸2。 
一旦罐含有约15-20L，则在T-1内进行恒容渗滤。用150mM NaCl-甘氨酸缓冲液(总体积约60L)最少更换3次缓冲液以维持渗滤。渗滤完成时，关闭病毒清除罐的泵和混合器。保持VC再循环罐体积恒定在15L。更换的缓冲液的总体  积为45L。 
对T-2内的主体进行再循环，并从而用除去了病毒的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液批次在T-2中进行恒容渗滤浓缩。从而将主体浓缩到接近初始重悬的沉淀物II体积。将透过液阀完全打开，且UF进料泵速为70％；通过给保留回路(loop)施加背压(back pressure)保持进料压力低于30磅/英寸2，并保持压力差为14-17磅/英寸2。将UF恒定柱维持在22L，更换的缓冲液总体积为121.2L。从T-2中取样，以测定UF透过液样品的数字比电导。结果为5.47×10-3mhos/cm。一旦达到体积水平，则关闭UF渗透，并通过再循环混合所述主体，且无菌取样10.5ml。对于0.5ml样品的等分试样，用手持式突眼计通过折光指数测定蛋白质百分比。蛋白质浓度为7.9％。 
将所述主体从T-2转移到临时主体容器中，并称量容器的总重量(总重)。将所述主体返回到T-2，并称量空的临时主体容器重量： 
总重(kg)-空容器重量(kg)＝主体重量(kg) 
或 
58.180(kg)-25.24kg＝32.94kg主体重量 
要达到5％蛋白质含量所需的最终主体体积计算如下： 
Figure BSA00000517914800261
或 
Figure BSA00000517914800262
用剩余样品等分试样测定最初pH，这通过先用0.9％NaCl以1∶10稀释等分试样，然后用0.5N HCl或0.5N NaOH的1∶100稀释液滴定至pH6.3-6.4。pH为6.55。 
为了调节pH，加入1.35ml滴定剂，即溶于0.9％NaCl的0.5N HCl溶液，且最终的pH为6.35。如果需要调节，则如下计算调节主体的pH所需未稀释的0.5N试剂的量： 
所需最终体积(L)-所需1∶100滴定剂体积(ml)＝未稀释的0.5N试剂的体积(ml) 
或，在情形中： 
34.128L×1.35ml＝46.1ml未稀释的0.5N试剂 
根据已接受的方法测试Viresolve-180滤器模块的完整性。完整性测试值必须≥1.2，且模块必须如前文所述用氯消毒并清洗。 
用0.801L除去了病毒的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液将主体调节到计算的所需的最终体积，并混合10分钟。 
无菌取样10.5ml主体产品等分试样以测定pH。pH必须是6.3-6.4。两次读数的实际pH是6.38和6.345。 
最终的蛋白质产品满足如下接受标准： 
蛋白质＝5.3％ 
pH＝如上 
气相层析测得的甲醇含量为53.9ppm。 
两次测试的Polysorbate 80＝101.7ppm和102.2ppm，平均值为101.9ppm。 
实施例1A
如下所述制备实施例1中使用的150mM NaCl-甘氨酸缓冲液： 
计算需制备的合适缓冲液量如下： 
[重悬的浆体积(L)×10L]×2+60＝大约需制备的缓冲液体积 
[27.208L×10L]×2+60＝需制备的604.16L缓冲液 
确定并测量所需的材料量，加入到校准的除去了热原的容器中： 
表3
材料              所需浓度    ×每批大小    ＝所需量 
NaCl              8.87g/L     604.16L       5,358.90g 
氨基乙酸          15.01g/L    604.16L       9,068.44g 
Polysorbate 80    0.02g/L     604.16L       12.08g 
多次用总计约2L的注射用水，U.S.P.清洗称量Polysorbate的容器几次，将每次的清洗等分试样都加入每批容量中，补足到604L。确定以下材料的量： 
表4
材料              所需浓度    ×每批大小    ＝所需量 
1.0N NaOH         0.125ml/L   604.16L       75.52ml 
用注射用水，U.S.P.稀释混合物到一定体积，并将最后所得的量混合60分钟。测定pH；要求是6.3-6.5。pH为6.38。如果不合要求，则需添加1.0N HCl  或1.0N NaOH，直到获得要求的pH；每次添加后都应该将溶液混合15-30分钟，并确认pH测定结果。 
测定数字比电导；要求是25℃时为14.15-15.59×10-3mhos/cm。结果是15.18×10-3mhos/cm。如果不合要求，则必须弃去并制备新鲜试剂。 
测量Polysorbate 80；测试样品必须为15-24ppm Polysorbate 80。浓度为19.5ppm。 
实施例2
Figure BSA00000517914800281
UF可行性研究 
材料和方法 
抗-D免疫球蛋白 
由完全改良的Cohn-Oncley分级分离法获得人免疫球蛋白，(参见美国专利No.6,096,872，和本文的实施例1和1A)，紧接着，应用Viresolve 180大小排阻滤器的纳滤来制备RhoGAM
Figure BSA00000517914800282
Ultra-Filtered Rh(D)免疫球蛋白(人)，(Ortho-Clinical Diagnostics，Raritan，NJ)。该材料在使用前保存在2℃-8℃的无菌条件中。 
病毒的制备 
在掺加进免疫球蛋白前，将病毒制备成确定了效价的储用培养物。根据工业标准操作方法来制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、假狂犬病病毒(PRV)和西尼罗病毒(WNV)(病毒株AID V-554-110-522，ATCC，Manassas，VA)的储用培养物。 
对由Orho Clinical-Diagnostics方法采集的样品进行TCID50测定之前，用Vero细胞接种平板。连续地稀释试验样品，并以每孔50μl接种于8、80或800个重复孔中。阴性对照以每孔50μl接种于8个重复孔中。将阳性对照，即作为掺加材料的的原液病毒的相同批次，连续地稀释，并将每个稀释液以每孔50μl接种于8个重复孔中。接种后5天观察培养物的致细胞病变效应(CPE)以用于测定病毒效价。包括阴性对照培养物的有效试验的标准必须显示没有病毒诱导的CPE。阳性对照的病毒效价必须在核准的病毒效价的±1.0log内。 
溶剂—去污剂吸附剂 
溶剂—去污剂吸附剂用于除去一些用S/D处理的样品中的Triton X-100和  TNBP。对每个样品而言，将1.0mL等分试样的重悬SDR HyperD溶剂-去污剂除去吸附剂(Ciphergen Biosystems，Fremont，CA)加入到3mL Bond Elut Reservoir(Varian Inc.，Palo Alto，CA)中。用4mL的50mM的NaCl-甘氨酸缓冲液洗涤SDR HyperD。把2mL用S/D处理的样品加入储存器(reservoir)，并使其经过重力自流进料通过SDR HyperD，进行大约5分钟，之后，用1.0mL的50mM的NaCl-甘氨酸缓冲液进行洗涤。收集该样品和缓冲剂洗涤物，采用标准TCID50方法来测定病毒。使用后弃去储存器。参见图1，其是IgG的S/D处理的流程图。IgG的S/D处理的方法见实施例4。 
溶剂-去污剂处理 
S/D储液制备 
将S/D试剂制备成含10％去污剂和3％TNBP的储液；1份的所述储液加入9份的将要处理的材料中以使最终浓度为1％去污剂和0.3％TNBP。通过把10.0g去污剂(Triton X-100)加入到大约70mL的50mM的NaCl-甘氨酸缓冲液(其是最后的人免疫γ球蛋白(RhoGAM
Figure BSA00000517914800291
或MICRhoGAM)制剂所用的缓冲剂，参见美国专利No.6,046,872和本申请的实施例1)中来制备储液。需要十分有力的搅拌以使粘性的去污剂溶解于缓冲液中。一旦溶解，则在约10分钟期间内缓慢加入3.0g的TNBP，再一次十分有力的搅拌。制得S/D储液，并在室温下保存，且在使用前混合。因为去污剂的浊点，所以该溶液表现出有点混浊。 
在50mM的NaCl-甘氨酸缓冲液，pH6.4中制备10％Triton X-100(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)和3％磷酸三正丁基酯(TNBP)(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)的储液，以及1％Triton X-100和0.3％TNBP的储液。使用前在15℃-30℃下保存溶液。 
在1/2000制备规模下进行溶剂-去污剂处理。以1∶20的比率将病毒掺加入免疫球蛋白。将20mL等分试样的掺加了病毒的免疫球蛋白平衡至15℃，并在强力混合下缓慢加入溶剂-去污剂溶液(2.0ml)。评价七个浓度的S/D并且在各种时间间隔取出等分试样进行病毒测定。参见关于掺加了病毒的IgG样品的病毒灭活方法的流程图的图8。 
进行了三个单独的病毒灭活试验，这里称为试验1、试验2和试验3，每个试验具有2或3个流程(run)。 
试验1
在试验1中，(参见图3&4)在标准浓度的S/D(1.0％Triton X-100，0.3％TNBP)和标准浓度的1∶10、1∶30和1∶50水平下测试BVDV和PRV。在1∶20的稀度下，把病毒掺加进不含溶剂/去污剂的载量样品。用于2个流程的载量材料和病毒的总体积分别是125ml和6.6ml。每种情况下的病毒载量是7logs。2.0ml的等分试样在加入S/D后立刻获得，并在加入所有浓度后60分钟获得，而对于加入1∶10和1∶30的浓度则在10、20、30和180分钟获得。这段时间中待测样品保持在5℃。另外，非S/D处理的样品通过SDR HyperD柱子来测定树脂对病毒效价是否有任何影响。所有的样品都在缓冲剂中立即稀释1∶100。参见图4(BVDV)和5(PRV)。 
试验2
在试验2中，在标准浓度的S/D和标准浓度的1∶10、1∶50、1∶100和1∶200水平下测试BVDV和PRV。2.0ml的等分试样在加入S/D后立刻获得，并在加入所有浓度后10分钟获得，而对于加入1∶50浓度则在20分钟获得，对于加入1∶100和1∶200的浓度则在20和60分钟获得。温育期间，样品保持在25℃。在每次试验时间间隔取得2个2.0mL的样品。一个样品在缓冲剂中立即稀释1∶100。第二个2.0mL等分试样立即通过SDR HyperD柱子。参见BVDV的图5。 
试验3
在试验3中，在S/D的标准浓度的1∶10、1∶1∶20和1∶50水平下测试BVDV。在标准浓度的S/D和标准浓度的1∶10、1∶20、1∶50、1∶100和1∶200水平下测试WNV。2.0ml的等分试样在加入S/D后立刻获得，并在加入所有浓度后10分钟获得，而对于加入1∶20和1∶50浓度则在20分钟获得，对于加入1∶100和1∶200的浓度则在20和60分钟获得。温育期间，样品保持在15℃。在每次试验时间间隔取得2个样品。一个样品在缓冲剂中立即稀释1∶100。第二个2.0mL等分试样立即通过SDR HyperD柱子。 
结果 
对于假狂犬病病毒(PRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的最初研究(参见表5)表明标准浓度的S/D以及标准S/D浓度的1∶10、1∶30和1∶50水平灭活两种病毒至检测限度。这个实验中的一个对照流程是通过SDR HyperD柱的掺加了病毒的样品(未用S/D处理)。数据(未显示)表明SDR HyperD对于BVDV的效价没有作用。 
在试验2中，用标准S/D和S/D的1∶10水平灭活BVDV至检测限度。1∶50的S/D样品显示4.63log减少，但是没有达到检测限度。用标准S/D浓度和1∶10和1∶50的S/D水平灭活PRV至检测限度。 
试验3显示1∶20水平的S/D灭活BVDV至检测限度，而1∶50的S/D水平有4.69log的减少，这非常接近试验2的结果。令人惊奇地是，1∶10水平的S/D没有表现出检测限度的灭活。标准S/D浓度以及1∶10和1∶20的S/D水平灭活WNV至检测限度。每个试验具有2或3个流程。 
Figure BSA00000517914800321
在进一步的研究中，下文表6中概述的S/D试剂的下列最终浓度在RhoGAM
Figure BSA00000517914800331
中得到评价： 
表6
    Triton X-100(ppm)   TNBP(ppm)
  标准浓度(1.0x)   10,000   3000
  1∶10浓度(0.10x)   1000   300
  1∶20浓度(0.05x)   500   150
  1∶50浓度(0.02x)   200   60
  1∶100浓度(0.01x)   100   30
  1∶200浓度(0.005x)   50   15
来自试验1的数据(参见图3和4，以及表6)表明标准浓度的S/D以及1∶10的浓度在加入后2分钟内可有效灭活BVDV和PRV至检测限度。另外，在1∶50浓度下，PRV在10分钟内降低至检测限度，但是灭活的BVDV量没有与使用更高S/D浓度灭活的的量一样高。在试验2(参见图5和6，以及表6)中，用1∶10和1∶50浓度重复BVDV流程，并且加入1∶20浓度。数据证实在1∶10浓度下完全的灭活，且也表明在1∶20浓度下的完全灭活。和在试验1中相同，1∶50浓度下灭活不完全。WNV数据表明相似的结果，其中1∶10和1∶20浓度下在2分钟内完全灭活。 
从数据的图表中可以清楚地看到，通常无论发生什么病毒的灭活，都发生在加入后的起初的2分钟内，而随着暴露于S/D时间的增加没有进一步的减少。据认为，暴露于S/D基本上不会影响病毒的一个群体。当第二次掺加加入S/D病毒混合物时，在没有加入更多的溶剂/去污剂时，病毒载量又可显著地减少。(参见上表6) 
实施例3
柱能力研究
实施实验来评价SDR HyperD吸附剂除去Triton X-100和TNBP的能力。这些结果使得我们能够确定有效除去溶剂和去污剂所需的材料的近似量。将15mL溶于50mM NaCl-甘氨酸缓冲液的10％Triton X-100/3.0％TNBP加入135  mL的RhoGAM
Figure BSA00000517914800341
主体产品(由实施例4的方法得到)，同时在22℃下混合。加入的速率是1.5mL/分钟。混合1小时后，以流速1.0mL/分钟，泵送145mL通过预处理的1×10cm的SDR HyperD柱。从柱子收集等分试样(10mL)且对Triton x-100和TNBP进行测定。如图8所示，70mL通过柱子后观察到Triton x-100的临界点。对于TNBP没有观察到临界点，显示Triton x-100的浓度是计算所需吸附剂量的关键参数。 
实施例4
Figure BSA00000517914800342
制备一批规模为完全制备规模～1/8的中试批次。从RhoGAM制备过程中得到大约1.3kg的IgG沉淀物II浆。该浆在注射用水中重悬之前，在-20℃下保持2个星期，然后被稀释入含Polysorbate 80的高盐缓冲液(150mM的NaCl-甘氨酸)。在溶剂/吸附剂处理之前，进行Viresolve超滤、使用渗滤进行的缓冲液更换以及经BioMAX 50滤器的主体浓缩。 
按照如Millipore Corporation提供的Viresolve Virus Removal Module User Guide p36451 REV 4/02提出的说明书，在2-1平方英尺(sq.ft)标准面积模块结构上进行Viresolve大小排阻超滤。超滤过程在大规模运行的相似条件下进行(参见实施例1)，其中对交叉流和渗透流进行调节以考虑所用模块中的膜的较小尺寸。跨膜压力(TMP)保持在低于3磅/英寸2，且在整个运行过程中进行对比筛分。 
采用具有Biomax 50K(50kD)膜的Millipore Pellicon 2Mini系统，将除去了病毒的免疫球蛋白浓缩至3-5升，然后，对4.5体积的50mM的NaCl-甘氨酸缓冲液进行渗滤。在该操作过程中，使用3个0.1m2的Millipore BioMAX 50滤器。 
处理后的主体在开始用溶剂/去污剂处理前保持在21℃。当该主体混合时，将10％Triton x-100/3.0％TNBP储液通过蠕动泵加入所述主体中，最终浓度为0.2％Triton x-100/0.06％TNBP。RhoGAM主体混合1小时，然后泵送通过SDRHyper-D柱以除去溶剂/去污剂。通过SDR Hyper-D后，产物用50mM的NaCl-甘氨酸渗滤三次，并然后浓缩至大约5％。该柱子也除去Polysorbate 80至1ppm以下。通过在10分钟时间段内泵送2000ppm的储液，来替换产物中的Polysorbate 80。 

Claims (9)

1.一种含病毒的血液产品的病毒灭活方法，包括：
(a)对血液产品进行大小排阻纳滤；
(b)将步骤(a)纳滤的透过液与0.003-0.15％w/v磷酸二-或三-烷基酯溶剂和0.01-0.5％w/v非离子去污剂混合足够长时间，以灭活该病毒；和
(c)除去所述磷酸二-或三-烷基酯溶剂和非离子去污剂。
2.权利要求1的方法，其中所述的血液产品是免疫球蛋白。
3.权利要求1的方法，其中所述的磷酸二-或三-烷基酯是磷酸三-正丁基酯，且所述的非离子去污剂是氧乙烯化烷基酚。
4.权利要求3的方法，其中所述的氧乙烯化烷基酚是Triton
Figure FSA00000517914700011
。
5.权利要求1的方法，其中从免疫球蛋白中除去磷酸三-正丁基酯和Triton通过选自通过C-18柱、通过膜进行渗滤、在层析支持体上吸附、在亲和层析支持体上吸附、超滤、过滤和吸附，及采用吸附剂的方法实现。
6.权利要求5的方法，其中采用二氧化硅珠吸附剂材料从免疫球蛋白中除去磷酸三-正丁基酯和Triton
Figure FSA00000517914700013
。
7.权利要求6的方法，其中从免疫球蛋白中除去二氧化硅珠吸附剂材料。
8.一种含病毒的免疫球蛋白产品的病毒灭活方法，包括：
(a)使免疫球蛋白与含赋形剂的高离子强度缓冲液混合；
(b)对步骤(a)的产物进行大小排阻纳滤；
(c)使步骤(b)纳滤的透过液与约0.06％的磷酸三-正丁基酯和约0.2％的Triton混合约1分钟-1小时；
(d)使步骤(c)的产物与二氧化硅珠吸附剂材料混合，以除去磷酸三-正丁基酯和Triton
Figure FSA00000517914700015
；和
(e)从产物中除去吸附剂材料。
9.一种含病毒的血浆的病毒灭活方法，包括：
(a)使血浆与约0.2至小于1.0％的磷酸三-正丁基酯和约0.2至小于1.0％的Triton
Figure FSA00000517914700016
混合足够长时间，以灭活该病毒；和
(b)对步骤(a)的产物进行血浆分级分离。
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