CN110198952B - 制备含有生物分子的高度浓缩的液体制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改善的多步方法，用于制备含有生物分子的高度浓缩的液体制剂，该方法包括以下步骤：(a)第一超滤UF1；(b)第一渗滤DF1；(c)第二渗滤DF2；和(d)第二超滤UF2；其中一种或多种盐的水溶液作为液体介质B用于步骤(b)，且水或一种或多种盐的水溶液作为液体介质C用于步骤(c)，其中用于步骤(b)的一种或多种盐与用于步骤(c)的一种或多种盐相同或不同，并且其中液体介质B的离子强度高于液体介质C的离子强度。根据本发明的方法允许制备明确定义的高度浓缩的制剂，其含有用于药物或非药物用途的生物分子，特别是蛋白质。起始液体生物分子制剂的不想要的赋形剂可以在溶液条件下减少至非常低的水平或低于检测极限的水平。

Description

制备含有生物分子的高度浓缩的液体制剂的方法

序列表

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技术领域

本发明涉及制备含有生物分子的高度浓缩的液体制剂的改进的方法。

背景技术

制备明确定义的生物分子溶液的能力是基于生物分子的药物制剂开发过程中的重要方面。生物分子稳定性、离子强度、pH值和生物分子浓度以及生物分子完整性是要控制的主要参数。

作为可能的生物分子的代表，特别是蛋白质将在以下讨论中被考虑，特别是以下科学文献和专利公开。

已知通过赋形剂的存在改善蛋白质稳定性，所述赋形剂以某种方式与溶液中的蛋白质相互作用以稳定和溶解它并避免聚集体的形成。在通常的蛋白质制剂中，常用的赋形剂是例如盐化合物或其他离子物质、糖和洗涤剂。特别是关于药物制剂，蛋白质的稳定性和溶解性取决于制剂。

已知基于蛋白质的药物产品的稳定性是溶液条件(例如pH值和离子强度以及赋形剂的种类和浓度)的函数(Garidel P.,Bassarab S.(2008),Impact of formulationdesign on stability and quality,in:Quality for Biologics:Critical QualityAttributes,Process and Change Control,Production Variation,Characterisation,Impurities and Regulatory Concerns pp.94-113,Publishing,London,UK)。这适用于液体和固体(例如冻干或喷雾干燥)的蛋白质制剂(Schersch K.,Betz O.,Garidel P.,Muehlau S.,Bassarab S.,Winter G.(2013),Systematic investigation of the effectof lyophilizate collapse on pharmaceutically relevant proteins III:collapseduring storage at elevated temperatures,European journal of pharmaceutics andbiopharmaceutics:officialjournal of Arbeitsgemeinschaft für PharmazeutischeVerfahrenstechnik e.V,85(2),240-252)。

蛋白质和赋形剂之间的相互作用通常非常复杂，通常无法预测蛋白质性质和稳定性(例如Hoffmann C.,Blume A.,Miller I.,Garidel P.,Insights into protein-polysorbate interactions analysed by means of isothermal titration anddifferential scanning calorimetry,(2009),European Biophysics Journal,38(5),557-568Kamerzell T.J.,Esfandiary R.,Joshi S.B.,Middaugh C.R.,Volkin D.B.(2011),Protein-excipient interactions:Mechanisms and biophysicalcharacterization applied to protein formulation development,Advanced DrugDelivery Reviews,63(13),pp.1118-1159以及许多其他更多)。例如，Roberts及其同事研究了特定离子(氯化钠、氯化钙、硫酸钠和硫氰酸钠)和缓冲剂(乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、组氨酸、琥珀酸盐和tris)在单克隆抗体中对蛋白质-蛋白质相互作用的影响(Roberts D.,Keeling R.,Tracka M.,van der Walle C.F.,Uddin S.,Warwicker J.,Curtis R.(2015),Specific ion and buffer effects on protein-protein interactions of amonoclonal antibody,Molecular Pharmaceutics 2015,12,179-193)。这些相互作用影响蛋白质溶解度、蛋白质颗粒的形成和总蛋白质胶体稳定性(Garidel P.,Blume A.,WagnerM.,Prediction of colloidal stability of high concentration proteinformulations,(2015),Pharmaceutical Development and Technology,20(3),pp.367-374)。

在制造过程中，蛋白质溶液可能必须多次修饰以促进单元操作、储存和/或配制。每个阶段都可能涉及使用广泛描述为过滤的工艺-超滤(UF)、尺寸排阻色谱(SEC)、渗滤(DF)和逆流透析-单独或组合使用的溶液交换。这些方法有助于调节蛋白质并将溶液条件改变到特定范围(Janson H.-C.(ed.).(2011),Protein Purification,3^rd edition,Wiley,New Jersey)。

调节和制备蛋白质溶液的最常用方法，特别是在工业规模上，是超滤/渗滤(下文也简称为UF/DF)的组合(参见例如Brose D.J.,Dosmar M.,Jornitz M.W.(2002),Membranefiltration,Pharmaceutical biotechnology,14,pp.213-279)。事实上，UF/DF广泛用于下游加工，以浓缩蛋白质、交换缓冲溶液、为下游过程如色谱等调节蛋白质，并在制剂所需的浓度和缓冲溶液中回收蛋白质(Marshak D.R.,Kadonaga J.T.,Burgess R.R.,KnuthM.W.,Brennman W.A.,Lin S.-H.(1996),Protein Purification and Characterisation,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。超滤/渗滤(UF/DF)是通常用于调节pH值、改变溶液的离子分布/赋形剂组成和/或达到目标蛋白质浓度的方法。

UF/DF通常在切向流过滤(下文中也简称为“TFF”)模式下进行，其也称为交叉流动，其中进料-溶液流平行于膜并因此垂直于滤液流动。这种设置沿着膜表面扫描保留的分子，从膜室中扫出并返回到渗余物容器-提供比死端操作显著更高的过程通量(Flickinger,M.C.(ed.)(2013),Downstream industrial biotechnology,John Wiley&Sons,Hoboken Ney Jersey)。

TFF通常在膜的上游表面产生浓差极化、形成高浓度梯度和高浓度的溶质的边界层。因此，蛋白质吸附、变性、聚集或沉淀可能会污染膜(Field R.(2010),Fundamentals offouling,in:Peinemann K.-V.,Pereira Nunes S.,Membranes for water treatment,Volume 4,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA,Weinheim,chapter 1,1-23)。最终，这些系统的性能几乎完全取决于保留的溶质从膜上运走并返回到本体溶液中的速率(Bowen W.R.,Jenner R.(1995),Theoretical descriptions of membrane filtration of colloidsand fine particles:an assessment and review,Adv.Colloid Interface Sci 56,141-200)。这种现象称为浓差极化。

参考图1A，示出了渗滤(DF)步骤的示意图。渗滤是一种使用可渗透或多孔膜过滤器从含有生物分子的溶液中除去、替换或降低盐或溶剂浓度的技术。该方法使用膜过滤器根据其分子大小分离溶液和悬浮液的组分。由膜保留的溶液称为浓缩物或渗余物。穿过膜的溶液称为滤液或渗透物。在渗滤中，原料在膜上重复循环并返回到渗余物容器，在其中加入新的液体介质如缓冲剂，同时除去渗透物。如图1A所示，渗滤介质对应于添加到系统中的进料介质，而渗透物是从系统中除去的过滤介质。

在图1B中，示出了超滤(UF)步骤的示意图。超滤本身遵循相同的概念，并且基于与图1A中的渗滤所示相同的示意性设置，但没有添加新的液体介质。

超滤以及渗滤过程是广泛熟知的并在现有技术中有所描述：

例如，Marichal-Gallardo P.A.,Alvarez M.M.(2012),State-of-the-art indownstream processing of monoclonal antibodies:Process trends in design andvalidation,Biotechnology Progress,28,899–916和WO 2014/130064A1公开了缓冲剂交换步骤，其中含有感兴趣的蛋白质的溶液对水进行渗滤。

此外，在CA 2 643 508 A1中描述了一种用于获得具有高结合分子能力的人白蛋白溶液的方法，其包括：

a)第一透析(渗滤)；

b)用NaCl和一种或多种氨基酸稳定溶液，不添加脂肪酸；

c)加热溶液(巴氏灭菌)；和

d)第二透析(渗滤)。

也就是说，渗滤步骤的组合，例如，用于使患者的血液或血浆中的白蛋白解毒，目的是除去与白蛋白结合的物质。在这两个渗滤步骤之间，加热白蛋白，即通过巴氏灭菌进行病毒灭活的步骤，其中白蛋白在至少一种氨基酸和氯化钠存在下稳定。该方法允许除去与白蛋白结合的化合物，如脂质、脂肪酸，因为这些化合物降低白蛋白的结合能力。在本发明中不进行第一和第二渗滤之间的溶液加热。

此外，WO 91/00290 A1涉及一种从与蛋白质结合的多价金属离子中纯化蛋白质的方法，这些离子通过将离子与一价金属离子交换而从蛋白质中释放，然后除去多价金属离子。特别是通过渗滤或凝胶过滤的方法实现这些离子的释放和除去。特别是，对于从与蛋白质结合的多价金属离子(例如铝、铁或铅)清洁蛋白质如白蛋白和γ-球蛋白，使用两种凝胶过滤步骤的组合，包括高达1M的水和盐溶液，以除去多价金属离子并将它们与钠、钾或铵离子交换。然而，通过对与该方法的描述相关的所呈现的图的分析，不清楚凝胶过滤方法如何运行。此外，该文献描述了金属离子的清洁，但是对于有机离子例如磷酸根离子、琥珀酸根离子、乙酸根离子和含有这些有机离子的蛋白质溶液的控制，它是完全无法处理的。

根据WO 2002/051979 A2，提供了一种通过将含有蛋白质的溶液的pH调节至pH约7至约10而从蛋白质中除去柠檬酸根、铝、多价离子和污染物的方法，对水溶液与纯水进行渗滤以提供包含多价离子的滤液和包含该蛋白质的渗余物。在一个实施方案中，描述了在同一容器中进行两个渗滤步骤的非常具体的方法(参见权利要求11)。所使用的方法参数以及与超滤步骤相结合的渗滤步骤，特别是本发明公开的方法步骤顺序的安排没有清楚地描述。

此外，现有技术的一些文献涉及浓缩大分子的方法：

例如，WO 02/096457 A2涉及适用于肠胃外施用的稳定的抗体液体制剂。还提供了具有高度浓缩的治疗性抗体的水溶液，其可用于生产稳定液体制剂的治疗性液体制剂、用途，例如医学用途，并提供了制备稳定液体制剂的方法。制备治疗性液体制剂的方法包括浓度大于50mg/ml的抗体，其中在第一步中将合适缓冲剂中的抗体溶液浓缩至约10mg/ml至约50mg/ml的浓度；在第二步中，将第一步中得到的浓缩溶液用至少一种酸性组分的水溶液渗滤，所述酸性组分任选地含有MgCl₂和/或CaCl₂和/或其它合适的添加剂；以及，在第三步中，将第二步中得到的溶液进一步浓缩至浓度大于50mg/ml。因此，该方法使用浓缩步骤/渗滤步骤/浓缩步骤的顺序。浓缩步骤可以用超滤系统进行。为了提供较少混浊的溶液，描述了另外的5步骤方法，其涉及浓缩/渗滤/浓缩/渗滤/浓缩，以调节含有添加剂(例如MgCl₂和/或CaCl₂和/或其他添加剂)的最终制剂。

在WO 2004/042012 A2中，还提出了浓缩大分子的方法。其提供了一种从含有溶液组分的起始水溶液中浓缩大分子的方法，该溶液组分包含高分子和有机聚合物，该方法包括：

(1)对起始水溶液进行超滤以浓缩大分子，从而产生第一渗余物溶液，

(2)调节第一渗余物溶液的电导率，使得有机聚合物诱导的溶液组分的沉淀基本上被阻止或基本上反转，以产生第二渗余物溶液，和

(3)对第二渗余物溶液进行超滤以进一步浓缩大分子，从而产生浓缩溶液。根据实施方案，可以通过与水、合适的稀释剂或缓冲剂进行渗滤来调节电导率，使得该方法可以以超滤(UF)/渗滤(DF)/超滤(UF)步骤的组合进行。起始材料包括大分子和有机聚合物，例如PluronicF-68。

此外，已知超滤(UF)/渗滤(DF)的组合可用于浓缩抗体，如WO 2006/031560 A2示例性所示。在该文献中，描述了制备高度浓缩的抗体组合物的方法，包括：第一超滤第一抗体制备物以提供第二抗体制备物；渗滤第二抗体制备物以提供渗滤的中间抗体制备物；和第二超滤渗滤的中间抗体制备物，以提供第三抗体制备物；其中第一超滤、第二超滤和渗滤中的一步或多步在约30℃至约50℃完成。因此，提出了一种浓缩蛋白质的方法，包括超滤(UF)、渗滤(DF)和第二超滤(UF)顺序列，其中所有步骤均在升高的温度进行，例如高于约30，℃在方法步骤中要观察的特定的温度是必不可少的。

另外，WO 2009/073569 A2公开了包含水和蛋白质的水制剂，以及制备它们的方法。该发明的水制剂可以是高蛋白质制剂和/或可具有低水平的导电性，这是由低水平的离子赋形剂引起的。它也提供了一种制备包含蛋白质和水的水性制剂的方法，该方法包括：

a)在第一溶液中提供蛋白质；和

b)使用水作为渗滤介质对第一溶液进行渗滤，直至达到与水的至少五倍体积交换，从而制备水制剂。

因此，在渗滤(DF)步骤期间的纯水也用于DF/UF顺序中以产生具有低电导率的高度浓缩的蛋白质的溶液。然而，根据我们的经验，当生物分子带正电时，即使大的渗滤体积也可能不足以完全除去阴离子赋形剂。

因此，已经描述的现有技术中已知的传统UF/DF方法通常包括三个步骤。这种已知的3步UF/DF过程如图2所示。它显示使用两种超滤UF1和UF2调节和浓缩蛋白质溶液的UF/DF方法的示意图，并且在这两种超滤步骤之间进行一个渗滤步骤DF1。

图2的三个步骤是：

1.UF1：超滤，将蛋白质溶液浓缩至例如最终目标值的三分之一至二分之一；

2.DF：渗滤，通常在几个循环中进行，针对纯水以除去初始赋形剂；和

3.UF2：超滤，以将蛋白质溶液浓缩至所需的最终水平。

关于这种UF/DF方法，方法开发人员和制剂设计师通常假定a)所得溶液的赋形剂谱将被明确定义，b)最终的赋形剂谱将与介质-交换溶液的制剂或渗滤介质匹配，和c)超滤将去除残留的赋形剂，而渗滤将完全避免残留的残留物。

然而，已发现现有技术的传统三步UF/DF方法具有不充分的性能。虽然上述假设可能适用于非常低的蛋白质浓度，例如<<80mg/mL，但我们的研究表明，使用用水的渗滤步骤获得高蛋白质浓度的三步UF/DF具有以下缺点：浓度为例如4至10mM的初始缓冲离子的残留水平仍保留在溶液中。然而，许多产生的生物分子，例如单克隆抗体，需要具有确定的赋形剂含量的高度浓缩的的制剂(例如70mg/mL或更多)。因此，已知的UF/DF方法不能提供所需的质量标准，并且不能满足基于生物分子或基于蛋白质的制剂开发期间的永久增加的要求。

此外，如现有技术中已经显示和证明的那样，从含有生物分子如含有蛋白质的溶液中除去带电离子并不简单。正如研究中所讨论的那样(例如Donnan F.G.(1911),Thetheory of membrane equilibrium and membrane potential in the presence of anon-dialyzable electrolyte,A contribution to physical-chemical physiology,Zeitschrift für Elektrochemie und angewandte physikalische Chemie 17(10),572-581；Donnan F.G.(1927),Concerning the applicability of thermodynamics to thephenomena of life,J.General Physiology 8,685-688)带电离子穿过半透膜的不对称分布产生电势；影响取决于总离子浓度，更确切地说，取决于系统中的离子活度(StonerM.R.,Fischer N.,Nixon L.,Buckel S.,Benke M.,Austin F.,Randolph T.W.,&KendrickB.S.(2004),Protein-solute interactions affect the outcome of ultrafiltration/diafiltration operations,J.Pharm.Sci.93,2332-2342)。在总的可扩散离子浓度低的情况下，赋形剂离子和蛋白质之间的静电相互作用的影响相对较大(甚至包括蛋白质-赋形剂复合物的形成)，并且清除赋形剂离子变得困难。简而言之，跨膜电势抑制带电缓冲组分的自由交换。因此，预期用于去除这些离子的简单分离方法是不成功的。

具有恒定渗余物(retentate)体积的渗滤，如图1A所示，是最常见的方法。假设恒定的筛分系数，不同溶质的质量平衡考虑导致开发用于计算小分子清除率的模型(VanReis R.,Zydney A.L.(2013),Protein ultrafiltration,in:Flickinger MC.(ed.)Downstream industrial biotechnology:recovery and purification,1^st ed,JohnWley&Sons)中：

c＝c₀exp(-N·S) (1)

其中c是以g/L表示的最终蛋白质浓度，c₀是以g/L表示的初始蛋白质进料浓度，N是透析体积(diavolume)的数量，S是小分子筛分系数。透析体积是总收集的滤液或渗透物(permeate)体积与恒定进料体积之间的比率(Kurnik R.T.,Yu A.W.,Blank G.S.,BurtonA.R.,Smith D.,Athalye A.M.,Van Reis R.(1995),Buffer exchange using sizeexclusion chromatography,countercurrent dialysis,and tangential flowfiltration:Models,development,and industrial application,Biotechnology andBioengineering,45(2),149-157)。筛分系数描述了滤液和渗余物中溶质浓度的比率。在自由溶质流动的理想情况下，小分子的渗透作为透析体积的函数在对数刻度上显示线性溶质减少，筛分系数达到1。等式1通常用于确定将小分子和杂质减少到特定水平所需的透析体积或循环数(Harinarayan C.,Skidmore K.,Kao Y.,Zydney A.L.,Van Reis R.(2009),Small molecule clearance in ultrafiltration/diafiltration in relation toprotein interactions:Study of citrate binding to a fab,Biotechnology andBioengineering,102(6),1718-1722)。然而，该等式不考虑非平衡状态。

在介质交换涉及添加新组分i的情况下，c根据以下公式计算：

c＝ci[1-exp(-N)] (2)

其中c_i是在渗滤过程中加入的组分i的本体(bulk)浓度。S假定为1。

然而，在实践中，渗滤通常需要比等式1和2更多的透析体积交换，这表明将杂质减少到给定水平。然而，增加渗滤循环的次数会增加处理时间，并且取决于蛋白质，会损害蛋白质稳定性并引发聚集体形成。

正如Harinarayan et al.(同前文献)报道，蛋白质-赋形剂相互作用和蛋白质-杂质相互作用可能影响小分子清除率。例如，Raibekas et al.(Raibekas A.A.,Bures E.J.,Siska C.C.,Kohno T.,Latypov R.F.,Kerwin B.A.(2005),Anion binding andcontrolled aggregation of human interleukin-1receptor antagonist,Biochemistry,44(29),9871-9879)描述了阴离子如焦磷酸根、柠檬酸根和磷酸根与人重组白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)的结合。估计的解离常数在毫摩尔范围内，并且结合强度与阴离子大小和每分子的离子化基团数相关。这些研究将结合位点鉴定为单个IL-1ra簇上的特异性带正电荷的赖氨酸氨基酸(Raibekas et al.，同前文献)。已知其他蛋白质-包括钙调蛋白、乳酸脱氢酶、柠檬酸合酶、延胡索酸酶和苹果酸脱氢酶-与柠檬酸根结合(Neufeld T.,Eisenstein M.,Muszkat K.A.,&Fleminger G.(1998),A citrate-bindingsite in calmodulin,Journal of Molecular Recognition 11,20-24)。这种赋形剂-蛋白质相互作用甚至可以导致相分离：Esue et al.(Esue O.,Kanai S.,Liu J.,PatapoffT.W.,Shire S.J.(2013),Carboxylate-dependent gelation of a monoclonalantibody,Pharm.Res.26(2009)2478–2485)描述了单克隆抗体的羧酸根依赖性凝胶化。

Shao和Zydney(Shao J,Zydney A.L.(2004a),Optimization ofultrafiltration/diafiltration processes for partially bound impurities,Biotechnology and Bioengineering,87(3),286-292；Shao J.,Zydney A.L.,(2004b),Retention of small charged impurities during ultrafiltration,Biotechnologyand Bioengineering,87(1),7-13)显示杂质和大分子(如蛋白质)之间的结合相互作用如何显著降低杂质清除率。因此，需要大量增加透析体积以获得给定水平的杂质去除。他们提出了一个分析表达式，用于计算适应蛋白质-赋形剂相互作用的最佳渗滤步骤。他们还指出这些相互作用降低了可用于最佳渗滤的蛋白质浓度。Shao和Zydney建议稀释进料溶液以反向驱动结合反应以增加“游离”杂质的浓度，从而减少总的超滤/渗滤过程时间。

基于这样的反应和来自等式1的模型，Harinarayan et al.(同前文献)发现测试的抗体片段(Fab)和三价柠檬酸根之间的特异性静电相互作用(而在Fab和单价乙酸根之间未观察到相互作用)(Harinarayan et al.同前文献)。

还应记住，UF/DF步骤，特别是涉及高度浓缩的蛋白质制剂时，会增加蛋白质电荷密度，从而增加蛋白质-赋形剂的静电相互作用。这些与Donnan效应有关，其中大的带电分子聚集在膜的一侧，在其上产生电荷梯度(例如Donnan F.G.,(1927),Concerning theapplicability of thermodymaics to the phenomena of life,J.General Physiology8,685-688；Donnan F.G.(1930),Theorie der Gleichgewichtsionenverteilung beieinem Gelsystem mitMizellenverteilung,Kolloid-Zeitschrift 51,24-27)。因此，Donnan效应在非透析性电解质的膜平衡和膜电位中起特别突出的作用(Brezesinski G.,/>H.S.,/>und Kolloide,(1993),Physikalisch-chemische Grundlagen,Spekrum Akademischer Verlag Heidelberg,Berlin,Oxford)。

各种研究人员尝试开发结合Donnan效应的理论模型，以更好地预测蛋白质溶液(例如单克隆抗体)中的赋形剂和pH变化(例如Van Reis R.,Goodrich E.M.,Yson C.L.,Frautschy L.N.,Whiteley R.,Zydney A.L.,(1997),Constant C(wall)ultrafiltrationprocess control,Journal of Membrane Science,130(1-2),123-140)。然而，迄今为止，这些努力尚未完全成功，特别是在生物分子和要除去的赋形剂具有相反电荷的情况下。

为了生产高度浓缩的的生物分子制剂，在已经提到的现有技术中，已经在超滤/渗滤(UF/DF)步骤中使用了纯水，或者已经添加了赋形剂例如甘氨酸或聚乙二醇以影响蛋白质溶剂化。然而，常规方法-用纯水渗滤以从含有生物分子的溶液(例如蛋白质溶液)洗涤所有赋形剂，然后进行超滤步骤以浓缩生物分子溶液-并不总是导致明确定义的制剂。一些赋形剂组分被残留。

例如，进行了一项测试，发现含有琥珀酸根/氯化钠的～10mg/mL蛋白质溶液即使在常规UF/DF(用纯水进行多达20次渗滤循环以及10倍至14倍蛋白质浓缩)后仍保留可测量的残留赋形剂。从25mM琥珀酸根、pH6开始，该方法在最终～100mg/mL蛋白质浓度导致～4-5mM琥珀酸根的残留。另一个试验开始于pH5.5的25mM乙酸根缓冲剂的起始溶液；在用纯水的15次渗滤循环和10倍蛋白质浓缩后，最终产物仍含有高达10mM乙酸根。

因此，对于两个简要描述的测试，不可能完全除去初始缓冲赋形剂。在现有技术中(Steele and Arias(2014)Accounting for the Donnan Effect in DiafiltrationOptimization for High-Concentration UFDF Applications,InternationalBioProcess 12(1),January 2014,50-54)，使用了多达40个透析体积用于除去99.995％的某些未披露的赋形剂。这从实际和经济的观点来看，不是一个合理的程序。

残留(carryover)程度取决于例如初始生物分子溶液的pH、生物分子-赋形剂相互作用和渗滤体积的数量。用纯水渗滤，即使有大量循环(约20-25)，也不能消除阴离子赋形剂如琥珀酸根和乙酸根的残留。在实践中，清除赋形剂所需的透析体积交换次数基本上超过了由上述等式1(用于计算渗滤的小分子清除的数学模型)计算的数量。此外，本领域技术人员必须记住，增加渗滤循环可能对蛋白质完整性产生负面影响并增加处理时间。

因此，本发明的一个目的是克服现有技术的缺陷并提供一种改进的方法，该方法允许制备含有生物分子，特别是蛋白质的明确定义的高度浓缩的制剂，用于药物或非药物用途。

本发明的另一个目的是使用该方法提供一种更纯净的液体生物分子制剂产品，该方法与现有技术方法相比可以更容易和更快地纯化，由此赋形剂，特别是阴离子赋形剂的残留程度减少甚至最小化。

本发明的另一个目的是提供一种方法，其中清除(一种或多种)赋形剂所需的透析体积交换次数在合理的范围内，以便不损害生物分子的稳定性和引发聚集体形成。

本发明的又一个目的是提供一种大规模可行的方法，以合理的成本提供所需的质量标准和操作效率。

发明内容

令人惊奇的是，发现可以克服现有技术中已知的缺点，特别是如果在采用第二渗滤(DF2)之前用确定高离子强度的液体介质进行额外的渗滤步骤DF1，可以显著减少或完全避免残留问题。

因此，为了克服上述缺点，提供了改进的和修改的双超滤和渗滤UF/DF方法。本发明的制备含有生物分子的高度浓缩的液体制剂的方法包括以下步骤：

(a)第一超滤UF1；

(b)第一渗滤DF1；

(c)第二渗滤DF2；和

(d)第二超滤UF2；

其中一种或多种盐的水溶液，作为液体介质B，用于步骤(b)，且水或一种或多种盐的水溶液，作为液体介质C，用于步骤(c)，其中用于步骤(b)中的一种或多种盐与用于步骤(c)的一种或多种盐相同或不同，并且其中液体介质B的离子强度高于液体介质C的离子强度。

在本发明的框架中的表述“含有生物分子的高度浓缩的液体制剂”应理解为(一种或多种)生物分子以70mg/ml或更高、或80mg/ml或高、或85mg/ml或更高的浓度存在于液体制剂中。

发现本发明的方法始终如一地降低起始液体生物分子制剂中存在的不需要的赋形剂的水平，优选低于检测极限，并产生所含生物分子的稳定液体制剂。如果生物分子被选定为蛋白质，则该方法产生仅具有足够的交换介质抗衡离子的溶液以平衡蛋白质的固有电荷并允许蛋白质自我缓冲。通常发现生物分子完整性和生物分子质量是可接受的或完全不变的。

此外，完全出乎意料的是，在溶液条件下，可以在本发明的方法中除去起始液体生物分子制剂中存在的任何种类的不想要的(一种或多种)赋形剂，例如(一种或多种)带正电的赋形剂、(一种或多种)带负电的赋形剂和(一种或多种)中性赋形剂。

根据本发明的方法的另一个优点在于，就施加在蛋白质上的物理应力而言，它是非常温和的。这可以通过整个方法步骤中的高度单体含量得出。

具体实施方式

本文未具体定义的术语应当以本领域技术人员根据本公开和上下文给出的含义给出。

例如，除非另有说明，根据本发明的表述“液体制剂”、“溶液”、“可溶的”和“溶解的”或“溶解的”应该以其最广泛的含义理解，并且包括液体介质(如真溶液、分散液、悬浮液等)中固体或液体的混合物的所有种类。

表述“高度浓缩的”应理解为液体生物分子制剂以高于起始浓度的浓度提供，优选显著高于之前的浓度。提供的浓度的精确增加取决于各自单独情况，生物分子和介质选择以及所使用的超滤和渗滤设备的条件和参数。

如本文所用，表述“超滤”或“UF”和类似术语是指任何技术，其中液体制剂经受保留生物分子(例如蛋白质)的半透膜，同时允许小于生物分子的溶剂和溶质分子通过。在本发明中，超滤用于增加液体制剂中生物分子(例如蛋白质)的浓度。

如本文所用，表述“渗滤”或“DF”和类似术语是指，例如，使用半透过滤膜从含有蛋白质、肽、核酸或其他生物分子的液体制剂中除去、替换或降低盐或溶剂的浓度。DF有两种形式，包括不连续模式下的DF和连续模式下的DF。可以根据任一模式进行本发明的方法。

如本文所用，术语“渗滤步骤”是指在渗滤方法中的总体积交换(尽可能)。

如本文所用，术语“渗滤/超滤”或“DF/UF”是指采用超滤和/或渗滤的任何方法、技术或技术组合。在本发明中，依次使用超滤和渗滤。

术语“赋形剂”或“(一种或多种)赋形剂”在本发明中是指一种或多种物质或化合物，例如除了生物分子本身和使用的溶剂，液体生物分子制剂中存在的助剂、离子、片段或任何种类的物质。存在于起始生物分子制剂中的(一种或多种)赋形剂是应根据本发明的方法尽可能地减少或除去的(一种或多种)赋形剂。这些赋形剂可以在水溶液中带电或中性。从起始液体生物分子制剂中除去的这些赋形剂在本文中也称为“第一赋形剂”或“起始赋形剂”。存在于起始液体生物分子制剂中的这些第一或起始赋形剂将与其它(第二)赋形剂交换，所述其他(第二)赋形剂更容易从液体生物分子制剂中除去，提供更好的相容性或由于其他原因而更可接受，以获得明确定义的液体生物分子制剂。第二赋形剂用于步骤(b)。还可任选地在步骤(c)中使用第三赋形剂。为了完整起见，也可任选地使用第四种赋形剂，即可在完成本发明方法后加入的赋形剂。即使术语“赋形剂”以单数使用，它也总是包含一种或多种赋形剂，如上下文所允许的。

术语“离子赋形剂”是指在水溶液中具有净电荷的离子。(一种或多种)离子赋形剂的实例包括但不限于衍生自无机和/或有机盐，例如无机和/或有机缓冲盐的阴离子，或阴离子或阳离子，其例如衍生自洗涤剂。离子赋形剂可以或可以不与存在的生物分子相互作用。

表述“盐”是指由酸和碱的中和产生的离子化合物。盐由带正电的离子即阳离子和带负电的离子即阴离子组成。这些离子可以是无机的或有机的。因此，“有机盐”是其中阳离子和/或阴离子是有机化合物的化合物。在使用的酸和碱是药学上可接受的情况下，其盐也是药学上可接受的。

术语“水”旨在表示可以使用的任何类型的水。纯水可能是优选的，但根据一些实施方案，也可使用自来水。所选择的水的类型取决于所获得的液体生物分子制剂的预期用途。根据本发明使用的纯水是经过纯化方法(例如蒸馏、反渗透、碳过滤、电容或电去离子、微滤或超滤、紫外氧化等以除去适合的杂质以使用)的水。也可以使用这些方法的组合以获得如此高纯度的水，例如超纯水，其痕量污染物以十亿分之一(ppb)或万亿分之一(ppt)来测量。在一个优选的实施方案中，根据ASTM D1193或ISO 3696，在本发明的方法中使用的水是超纯水，例如1型超纯水。根据另一个实施方案，所用的水可以是适于施用给对象的无菌水，例如注射用水(WFI)。此外，可以使用蒸馏水、双蒸水或去离子水。

在本发明中使用的术语“交换”必须以其最广泛的含义理解，其通常不代表含有(一种或多种)赋形剂的一种液体介质与含有其它(一种或多种)赋形剂的另一种液体介质的完全交换。这相当于一个洗出或稀释溶剂和/或(一种或多种)赋形剂。因此，例如，洗出水中的赋形剂琥珀酸根以用水中的赋形剂乙酸根替换(例如在步骤(b)中)。存在各种其他交换的例子。

根据本发明的“稳定”制剂是其中包含的生物分子，优选蛋白质，在储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。

表述“约”或“大约”是指给定值或范围的20％，优选10％，更优选5％。

此外，应该注意，明确提及的化学和生物物质不应该被理解为限于具体描述的物质，但是本领域技术人员知道具有相似或相当的效果、反应或性能的等同物质和化合物应当在目前的保护范围内。

下面描述根据本发明的多步骤方法。每个单独步骤的最佳方法条件和参数可以根据所用的特定生物分子、赋形剂、介质和过滤系统而变化。除非另有说明，否则本领域普通技术人员可以容易地选择每个方法步骤的方法条件和参数。示例性程序在实施例部分中提供。

根据本发明，已经开发了一种改善的方法来制备明确定义的生物分子制剂，其中最终产物由或基本上由高度浓缩的生物分子制剂(生物分子+(一种或多种)溶剂)和任选特定量的必需的(一种或多种)赋形剂组成，例如考虑到所使用的生物分子或其他原因；例如，可以或必须存在离子例如生物分子的抗衡离子。实质上，按顺序步骤(a)-步骤(b)-步骤(c)-步骤(d)或超滤UF1/渗滤DF1/渗滤DF2/超滤UF2的次序提供双超滤/渗滤。这是一种在第二超滤(UF2)之前，在初始浓缩超滤(UF1)和另一种用水或低离子强度溶液的渗滤(DF2)之间加入用高离子强度溶液进行渗滤(DF1)的方法。

参考图3，显示了根据本发明的UF/DF方法的一个示例性实施方案的示意图，该方法用于使用两个超滤和两个渗滤步骤调节和浓缩液体生物分子制剂。在图3中，图例如下：

c_P1：初始生物分子浓度；

c_P2：第一超滤步骤UF1后的生物分子浓度；

c_P3：第二超滤步骤UF2后的生物分子浓度。

首先在步骤(a)中的第一超滤步骤UF1之前，液体生物分子制剂以市售制造商的市售产品提供，或者基于现有技术中已知的标准程序制备。在初始状态下，生物分子包含在溶剂或溶剂混合物中，并以浓度c_P1存在。在本发明的框架中，术语“生物分子”本身应包括一种或多种生物分子，即使以单数形式使用。

除了所含的(一种或多种)生物分子外，起始液体制剂含有许多赋形剂(下文也称为起始赋形剂或第一赋形剂)，其通常表示为赋形剂XYZ。起始液体生物分子制剂中包含的(一种或多种)溶剂和(一种或多种)赋形剂在下文中表示为液体介质A.

存在的(起始或第一)赋形剂XYZ是例如用于在起始液体制剂中稳定\溶解和/或配制生物分子的助剂。然而，在获得的最终液体制剂中，这些赋形剂应尽可能地降低或甚至尽可能地除去，因为这些赋形剂可能对液体生物分子制剂的性能、性质和行为产生负面影响，例如，在进一步加工中。存在的(一种或多种)赋形剂XYZ产生可能不完全确定的制剂，其根本不是所希望的。

起始赋形剂可以是液体制剂中存在的任何形式，例如溶解或分散在存在的(一种或多种)溶剂中的固体、络合物、离子等。当然，(一种或多种)赋形剂在本文中应理解为仅指那些在如上定义的溶液中以任何形式存在的(一种或多种)赋形剂，因为不溶解和沉淀的赋形剂可以容易地与液体制剂分离。通过本发明的方法除去赋形剂XYZ，同时在整个方法中将生物分子保持在溶液中，以避免潜在的生物分子应激。

这些起始或第一赋形剂不受本发明的限制，它们可以是本领域已知的任何种类的赋形剂，其在水溶液中带电或中性。由于与生物分子的制造、储存、预处理或生物分子本身或所用(一种或多种)溶剂的性质或其他原因相关的几个原因，(一种或多种)赋形剂可存在于起始液体生物分子制剂中。

尽可能减少或除去的(一种或多种)赋形剂是在水溶液中带电或中性的起始赋形剂，例如，用于制备或加工生物分子的添加剂；不想要的物质或化合物，如起始液体生物分子制剂中含有的杂质；在生物分子的制造方法中形成的不希望的副产物；在生物分子的生产中形成的起始、中间或生物分子终产物的分解或降解产物。

例如，(一种或多种)赋形剂可以是细胞组分或碎片，细菌的降解产物，例如内毒素，DNA，RNA，不需要的脂质，HCP(宿主细胞蛋白)，脂多糖(LPS)或其部分；糖；洗涤剂，如带正电、带负电和非离子型物质；任何种类的带负电或带正电的离子，优选由有机和/或无机盐产生，例如有机和/或无机缓冲盐，和洗涤剂。

带电赋形剂可以是，例如，由溶解在水溶剂中的有机和/或无机盐产生的带电离子，例如阴离子或阴离子，优选阴离子。带电赋形剂可衍生自有机和/或无机缓冲盐。例如，由用于稳定生物分子(起始离子或第一离子)的缓冲系统产生的离子可以用其他离子(第二离子)替换。

因此，待除去的起始赋形剂可以理解为液体制剂的杂质。杂质通常以少量存在，但根据本发明的杂质可能以大量存在，例如缓冲体系的阴离子。因此，这些杂质在本文中更准确地称为赋形剂(起始或第一赋形剂)。

根据优选的实施方案，生物分子和起始赋形剂具有相反的电荷。例如，生物分子可以带正电荷，例如在蛋白质的情况下，并且通过该方法除去的赋形剂是带负电荷的赋形剂，例如阴离子。在这种情况下可以减少或除去的赋形剂可以是例如缓冲赋形剂，例如柠檬酸根、琥珀酸根、乙酸根和磷酸根。

因此，本发明的焦点可以特别涉及从液体生物分子制剂(例如液体蛋白质制剂)分离有机离子(例如单价或多价负离子)，而不是多价金属离子。

根据本发明使用的(一种或多种)生物分子根本不受限制，可以使用本领域技术人员已知的任何生物分子。生物分子是存在于活的生物体中的任何有机物质，包括大的大分子，如蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸，以及小分子，如初级代谢产物、次级代谢产物和天然产物。大多数必需的生物分子由元素碳、氢、氧、氮和任选的磷和硫组成。还可以存在其他元素，但仅少量。生物分子可以选自小分子、单体、大分子等。示例性的小分子是脂质，例如磷脂、糖脂、甾醇；维生素；激素；神经递质。可以提及但没有限制的单体是氨基酸、核苷酸、单糖等。可以根据本发明使用的大分子或所谓的生物聚合物是例如蛋白质或肽，例如寡肽；核酸，如DNA、RNA；寡糖、多糖如糖原、淀粉、几丁质、纤维素、果聚糖、葡聚糖。特别优选的生物分子是生物聚合物，特别是选自蛋白质或肽例如寡肽、核酸、寡糖和多糖。最优选的是蛋白质或肽。

术语“多肽”或“蛋白质”可互换使用。这些术语是指任何长度的氨基酸聚合物。这些术语还包括通过反应进行翻译后修饰的蛋白质，所述反应包括但不限于糖基化、糖化作用、乙酰化、磷酸化、氧化、酰胺化或蛋白质加工。可以在多肽的结构中进行修饰和改变，例如与其他蛋白质的融合，氨基酸序列取代、缺失或插入，同时分子保持其生物学功能活性。例如，可以在多肽或其基础核酸编码序列中进行某些氨基酸序列取代，并且可以获得具有相似或修饰特性的蛋白质。氨基酸修饰可以例如通过对其基础核酸序列进行位点特异性诱变或聚合酶链反应介导的诱变来制备。

因此，术语“多肽”和“蛋白质”还包括，例如，由免疫球蛋白组分(例如Fc组分)和生长因子(例如白细胞介素)、抗体或任何抗体衍生的分子形式或抗体片段组成的融合蛋白。

因此，术语“蛋白质”或“多肽”包括蛋白质、多肽、其片段、肽、融合蛋白，所有这些都可以在所选择的宿主细胞中表达。通常，蛋白质是重组蛋白质，即由分子克隆产生的重组DNA编码的蛋白质。此类蛋白质可以是抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子，受体和其衍生物或片段，以及可用作激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途或可用作研究试剂的任何其他多肽。优选地，蛋白质是分泌蛋白质或蛋白质片段，更优选是抗体或抗体片段或Fc融合蛋白。它也可以是反义RNA、tRNA、rRNA、其他是核糖蛋白或其他调节RNA的一部分的RNA。

本文所用的术语“抗体(antobody)”、“抗体(antibodies)”或“免疫球蛋白”涉及选自球蛋白的蛋白质，其由宿主生物与来自分化的B-淋巴细胞(浆细胞)的外来物质(＝抗原)的反应形成。它们用于专门防御这些外来物质。有多种类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY、IGW。优选地，抗体是IgG抗体，更优选IgG1抗体。术语免疫球蛋白和抗体可互换使用。抗体包括多克隆、单克隆、单特异性、双特异性、多特异性、单链抗体、抗体的抗原结合片段(例如Fab或F(ab')2片段)、二硫键连接的Fv等。抗体可以是任何种类并包括嵌合和人源化抗体。

“嵌合”抗体是其中抗体结构域或区域衍生自不同物种的分子。例如，重链和轻链的可变区可以衍生自大鼠或小鼠抗体和来自人抗体的恒定区。在“人源化”抗体中，仅最小序列衍生自非人物种。通常仅人抗体的CDR氨基酸残基被非人物种的CDR氨基酸残基替换，例如小鼠、大鼠、兔或美洲驼羊。有时对抗原结合特异性和亲和力有影响的几个关键框架氨基酸残基也被非人氨基酸残基取代。抗体可以通过化学合成，通过重组或转基因方式，通过细胞(例如，杂交瘤)培养或通过其他方式产生。

免疫球蛋白是由两对异二聚体组成的四聚体多肽，每个异二聚体由重链和轻链形成。异二聚体以及四聚体多肽的结构稳定化通过链间二硫桥发生。每条链由称为“免疫球蛋白结构域”或“免疫球蛋白区”的结构域组成，其中互换使用术语“结构域”或“区”。每个结构域含有约70-110个氨基酸并形成紧凑的三维结构。重链和轻链均在其N-末端含有“可变结构域”或“可变区”，其具有较少的保守顺序，其负责抗原识别和结合。轻链的可变区也称为“VL”，重链的可变区称为“VH”。

术语“Fab片段”(片段抗原结合＝Fab)或“Fab”由抗体重链和轻链(VH和VL)的可变区组成，它们由相邻的恒定区(CH1和CL)保持在一起。这些可以通过蛋白酶消化形成，例如用木瓜蛋白酶从常规抗体中消化，但同时也可以通过基因工程产生类似的Fab片段。其他抗体片段包括“F(ab')2片段”或“F(ab')2”，其可以通过用胃蛋白酶进行蛋白水解切割或通过基因工程制备，其中抗体的Fab臂仍然通过重链间二硫桥连接，所述二硫桥位于铰链区内。

由抗体重链的CH2和CH3结构域组成的免疫球蛋白片段由于其结晶倾向而被称为“Fc片段”、“Fc区”或“Fc”(Fc＝可结晶的片段)。这些可以通过蛋白酶消化形成，例如用常规的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化抗体也可以通过基因工程产生。Fc片段的N-末端部分可以根据铰链区仍然存在的氨基酸多少而变化。

术语“Fc-融合蛋白”描述了含有免疫球蛋白的天然或修饰(例如取代、缺失、插入)的Fc区作为融合配偶体的多肽。Fc融合蛋白可以是天然存在的蛋白质(例如抗体)或工程化的重组蛋白质(例如TNF受体-Fc融合蛋白或与Fc区融合的VH区)。Fc-融合蛋白可以作为单体或多聚体存在，由此多肽可以具有相同或不同的序列，可以在两个融合配偶体和/或部分铰链区或修饰的铰链区之间含有接头序列，或者多肽直接融合到CH2结构域。

使用基因工程方法，可以产生缩短的抗体片段，其仅由重链(VH)和轻链(VL)的可变区组成。这些被称为“Fv片段”(可变片段＝可变部分的片段)或“Fv”。由于这些Fv片段缺乏恒定链的半胱氨酸对两条链的共价键合，因此Fv片段通常是稳定的。通过短的肽片段(例如10至30个氨基酸，优选15个氨基酸)将重链和轻链的可变区短链接是有利的。以这种方式，获得由VH和VL组成的单个肽链，其通过肽接头连接。这种抗体蛋白质被称为“单链-Fv”或“scFv”。这种scFv-抗体蛋白的实例是已知的现有技术。另外，可以将多于一个VH和/或VL区连接在一起。

近年来，已经开发了各种策略用于制备作为多聚体衍生物的scFv。这旨在特别导致具有改善的药代动力学和生物分布特性以及增加的结合亲合力的重组抗体。为了实现scFv的多聚化，scFv制备为具有多聚化结构域的融合蛋白。多聚化结构域可以是例如IgG的CH3区或卷曲螺旋结构(螺旋结构)，例如亮氨酸-拉链结构域。然而，还存在scFv的VH/VL区之间相互作用的策略用于多聚化(例如，双-、三-和五体)。对于双抗体，本领域技术人员指二价同型二聚体scFv衍生物。将scFv分子中的接头缩短至5-10个氨基酸导致形成同源二聚体，其中发生链间VH/VL-叠加。另外通过掺入二硫桥可以稳定双抗体。从现有技术中已知双抗体-抗体蛋白的实例。

对于微抗体(minibody)，本领域技术人员指二价同源二聚体scFv衍生物。它由融合蛋白组成，其含有免疫球蛋白的CH3区，优选IgG，最优选IgG1作为二聚化区，其通过铰链区(例如也来自IgG1)和接头区与scFv连接。从现有技术中已知微抗体-抗体蛋白质的实例。

对于三体(triabody)，本领域技术人员指：三价同源三聚体scFv衍生物。其中VH-VL直接融合而没有接头序列的ScFv衍生物导致三聚体的形成。

本领域技术人员还将熟悉所谓的迷你抗体(miniantibody)，其具有二价、三价或四价结构并衍生自scFv。多聚化通过二-，三-或四聚体卷曲螺旋结构进行。

也称为单结构域抗体的纳米抗体是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。像完整抗体一样，它能够选择性地结合特定抗原。纳米抗体具有约12-15kDa的分子量，因此比分子量在150-160kDa范围内的普通抗体小得多，其由两个重蛋白链和两个轻链组成。它们也比Fab片段(约50kDa)和单链可变片段(约25kDa)小。

术语“抗体衍生的分子”可与“抗体衍生的片段”或“抗体片段”互换使用，并且是指仅含有一个或多个抗体结构域或区/或完整的结构域或区的(一或多个)部分的多肽。抗体片段可以是a)自身形成的分子，b)以不同组合相互连接，c)与非抗体序列融合，d)与非多肽(例如放射性核苷酸)融合或连接或d)以上的任何组合。这些多肽可以作为单体或作为多聚体存在，由此多肽可以具有相同或不同的序列。

然而，本身作为生物分子使用的蛋白质不应限于在制药和生物技术领域中的用途，而是可以使用任何类型的应用领域中的任何种类的蛋白质。还已知蛋白质用于各种非药物应用，例如食品工业、动物饲料工业、纺织工业、化学技术工业、洗涤剂工业和其他领域。

优选的蛋白质是治疗性蛋白质、非治疗性蛋白质、抗体、抗原结合片段或纳米抗体，特别是单克隆抗体和相关化合物或甲酸。

如果生物分子带正电荷并且通过该方法除去的赋形剂(起始或第一赋形剂)是带负电荷的赋形剂，则可以以特别有利的方式使用本发明的方法。

从液体生物分子制剂开始，进行提供的步骤(a)至步骤(d)。起始液体生物分子制剂的具体组成将决定哪种赋形剂应通过该方法交换或除去。

在步骤(a)中，进行第一超滤(UF1)，通过该第一超滤(UF1)浓缩含有生物分子的液体制剂，并达到生物分子的c_P2浓度。也就是说，步骤(a)的超滤UF1用于浓缩液体生物分子制剂，与液体生物分子制剂的初始浓度相比，优选浓缩高达约10％-70％，或更优选约15％-60％，或最优选约25％-50％。这种浓度具有减少下一个DF步骤的总处理量的优点，并且这还导致处理时间减少。

超滤以及随后的渗滤选择性地利用可渗透(多孔)膜过滤器，以基于它们的分子大小分离液体制剂的组分。膜本身保留比膜的孔大的生物分子，而较小的分子如盐、离子、溶剂例如水可自由地渗透穿过膜。选择膜的一个参数是其保留特性。作为一般规则，膜的截留分子量(MWCO)应为待保留的生物分子的分子量的1/3至1/6。当然，待除去的赋形剂具有比生物分子更低或甚至显著更低的分子量，从而保留生物分子而不是赋形剂。

在浓缩步骤(a)之后并且特别优选在其间没有任何中间步骤的情况下，进行本发明的其他步骤(b)和(c)。因此，步骤(a)中使用的液体生物分子制剂含有由溶剂和起始或第一赋形剂组成的液体介质A，由此介质A在步骤(b)中与介质B交换，在步骤(c)中介质B与介质C交换，由此得到主要含有液体介质C(和可能少量液体介质B和C)的液体生物分子制剂，其具有降低的起始赋形剂含量，优选低于检测水平。

因此，介质A含有或由溶剂和不希望的起始或第一赋形剂组成，所述起始或第一赋形剂计划被更换/替换，由此通过液体介质B将液体介质A更换为液体介质C。液体介质B包含溶剂和第二赋形剂或由溶剂和第二赋形剂组成，并且介质C含有溶剂和第三赋形剂或由溶剂和第三赋形剂组成，优选仅包含溶剂。

第二赋形剂和任选的第三赋形剂彼此相同或不同；两者都不同或至少部分不同于应除去的第一赋形剂。在某种意义上，必须理解“至少部分不同”，例如，第一赋形剂的一种或多种可与第二赋形剂的一种或多种相同。例如，氯化钠可以存在于第一赋形剂，也可以存在于第二赋形剂。这不会干扰要进行的方法。然而，总的来说第一和第二赋形剂之间总是存在差异，以便导致第一赋形剂与第二赋形剂的真实交换。事实上，赋形剂的类型不是特别重要，因为可以除去任何类型的带电荷或中性赋形剂。事实上，尽管存在强的生物分子-赋形剂相互作用，但本发明提供了除去任何类型的赋形剂的可能性。作为说明，在示例性简化实施方案中，第一赋形剂是乙酸根缓冲盐，其与第二赋形剂(例如琥珀酸根缓冲盐)交换，第二赋形剂与第三赋形剂(例如氯化物)交换。如果在最终产品中同时接受两种类型的阴离子，即琥珀酸根/氯化物，则这种实施方案是可能的。如果在最终产物(高度浓缩的液体生物分子制剂)中仅存在一种特定的赋形剂，则液体介质C由水组成或基本上由水组成。然而，反过来或另一种次序也是可能的：第一种赋形剂可以是琥珀酸根，其被作为第二种赋形剂的乙酸根替换，等等。

“第二赋形剂”和“第三赋形剂”在本文中可与“盐”互换使用，而“起始或第一赋形剂”以及“第四赋形剂”(可以加入到获得的最终液体生物分子制剂中)不仅是盐，而且也可以是本文所述的其他物质或化合物，例如任何种类的合适助剂(auxiliary agent)，例如洗涤剂、表面活性剂、糖等。

因此，起始液体生物分子制剂中存在的起始或第一赋形剂是不希望存在的赋形剂，并且应通过本发明的方法除去。为了实现这种降低的起始或第一赋形剂水平，步骤(b)中使用的液体介质B的离子强度高于步骤(c)中使用的液体介质C的离子强度。

介质B和C可选自可与生物分子联合使用的任何液体介质，其可能能够将生物分子保持在液体制剂中并且对所用生物分子的特性没有任何负面影响。当然，所用的液体介质B和C(和A)不应以任何方式转化或改变其中所含的生物分子。可接受的唯一相互作用是液体介质中包含的离子与生物分子的离子相互作用，以使其稳定。这是在生物分子和液体介质具有相反电荷的情况下。例如，所述生物分子是带正电荷的生物分子如蛋白质，且该液体介质的阴离子与蛋白质相互作用以使其稳定在溶液中。

介质B和C以及优选介质A代表水溶液。因此，技术方案总是含有水。此外，溶液含有溶剂或溶剂混合物，特别是溶液含有水和另一种溶剂或水和溶剂混合物。溶剂可以选自任何已知的与水混溶的溶剂，并且不以任何方式不利地影响溶解的生物分子(例如抗体或纳米抗体)的性质。在所提供的生物分子用于药物用途的情况下，当然所选择的溶剂同样也适用于药物用途。

根据优选的实施方案，一种或多种溶剂优选选自水和可与水混溶的有机溶剂的混合物。作为有机溶剂，可以示例性地提及但不限于醇，例如乙醇、甲醇、二元醇、糖醇，如甘油、丙酮、乙腈、甲基乙基甲酮、醚类(可与水混溶的那些)例如二恶烷、二甘醇二甲醚、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃等及其混合物。所用溶剂类型强烈取决于存在的生物分子和最终产品的预期用途。

溶液可主要含有有机溶剂；然而，如果溶剂主要由水组成，则可能是优选的，因此水代表存在的溶剂的主要部分。根据进一步优选的实施方案，所用溶剂可以仅由水组成或基本上由水组成。

液体介质A、B和C中使用的溶剂可以相同或不同。根据优选的实施方案，所用的溶剂在所有液体介质A、B和C中是相同的。根据特别优选的实施方案，溶剂是水。

作为液体介质B和/或C(以及液体介质A)，使用水性盐溶液，可以示例性地提及水中的有机盐溶液和/或无机盐溶液。所用的有机和/或无机盐优选是水溶性的并且对于所用的生物分子是完全惰性的。

在本发明的优选方式中，液体介质B包含浓度为约150至约900mM，越来越优选约200至约700mM，约400至约600mM，和约450至约550mM的氯化钠。当液体介质B不包含特定的低分子量缓冲剂时，该模式是特别优选的。

考虑到后续液体介质的pH值，这种模式是有利的。可能由于氯化钠没有缓冲能力的事实，这种方法步骤(b)和/或一个或多个以下步骤的pH值仅在较小范围内变化，即变化小于约0.4，优选小于约0.3pH，甚至更优选小于约0.2pH值。实施例3、6、9、10、11、12和13举例说明了200和500mMNaCl的这种模式，并且液体介质D的所得pH通常比液体介质B的pH值低约0至0.3，即略微更酸性。

本发明的这种模式特别适用于对较强pH变化敏感的生物分子。

如果它们可用于提供存在的生物分子的液体制剂，则根据本发明使用的有机和无机盐不受限制。用于液体介质B和/或C的盐可以是有机和/或无机盐，优选有机和/或无机缓冲盐，例如可用作生物缓冲剂。

已知缓冲剂是弱酸或弱碱与其共轭盐形式的组合，当加入的酸或碱进入系统时，其保持pH不会偏离最佳范围。当然，除了生物分子和抗衡离子之间允许的离子相互作用之外，所用液体介质中的缓冲剂不应以任何方式与其中包含的生物分子反应或改变或负面地相互作用。通常使用的缓冲剂易溶于水，难溶于其他溶剂，它们代表惰性体系。有多种不同类型的缓冲系统可供选择。本领域技术人员能够找到并选择可用于本发明的合适的缓冲系统。

因此，液体介质B和/或C(以及A)形式的水溶液代表或可含有基于水作为溶剂的缓冲剂或代表或可含有基于另一种或多种溶剂(但含有水)的缓冲剂。

制备缓冲剂或缓冲剂本身的有机酸和碱不受本发明框架的限制，但可以使用与所选生物分子有关的任何酸\碱或缓冲剂。在生物分子用于药物用途的情况下，缓冲剂也应选自药学上可接受的缓冲剂，例如生物缓冲剂。

因此，缓冲剂可以例如选自一种或多种药学上可接受的或相容的缓冲剂或缓冲试剂。在本发明中，可以使用所谓的生物缓冲剂，即从现有技术中已知用于生物系统或其背景的缓冲剂。

可以在根据本发明的液体介质A、B和C中使用的示例性生物缓冲剂可以如下列出但不限于所提及的具体实例：

可能的缓冲剂或缓冲盐基于N-(2-乙酰氨基)-氨基乙磺酸(ACES)及其盐、乙酸及其盐、乌头酸及其盐、己二酸及其盐、抗坏血酸及其盐、N-(2-乙酰氨基)-亚氨基二乙酸(ADA)及其盐、氨及其盐、氯化铵、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇、3-丙二醇(AMPD)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)及其盐、N,N-双-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)及其盐、苯甲酸及其盐、碳酸氢盐如碳酸氢钠、N,N'-双(2-羟乙基)-甘氨酸(bicine)、Tris缓冲剂如三(羟甲基)-氨基甲烷、[双-(2-羟乙基)-亚氨基]-三-(羟甲基甲烷)(Bis-Tris)、1,3-双[三(羟甲基)-甲基氨基]丙烷(Bis-Tris-Propane)、硼酸及其盐、二甲基胂酸(Cacodylate)及其盐、3-(环己基氨基)-丙磺酸(CAPS)及其盐、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)及其盐、碳酸及其盐、碳酸盐如碳酸钠、环己基氨基乙磺酸(CHES)及其盐、柠檬酸及其盐、3-[N-双(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)及其盐、甲酸及其盐、葡糖酸及其盐、甘油酸及其盐、谷氨酸及其盐、甘氨酸类如甘氨酰甘氨酸、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N'-乙磺酸(HEPES)及其盐、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N'-丙磺酸(HEPPS，EPPS)及其盐、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N'-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)及其盐、咪唑、乳酸及其盐、苹果酸及其盐、马来酸及其盐、2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)及其盐、3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)及其盐、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)及其盐、磷酸及其盐、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)及其盐、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)及其盐、吡啶、琥珀酸及其盐、3-{[三(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸(TAPS)及其盐、3-[N-三(羟甲基)-甲氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)及其盐、酒石酸及其盐、牛磺酸(2-氨基乙磺酸、AES及其盐)、三乙醇胺(TEA)、2-[三(羟甲基)-甲氨基]-乙磺酸(TES)及其盐、和N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸(三甲基甘氨酸)。

尽管上述大多数缓冲剂衍生自有机盐，但也可以使用基于无机盐的缓冲剂，例如磷酸根缓冲剂，例如磷酸氢钾缓冲剂等。

也可以使用含有无机盐和有机盐的混合缓冲剂。

同时缓冲的其他可用的有机盐(内盐)，特别是生物缓冲剂，是水溶液中的氨基酸。可以使用的氨基酸是，例如，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；特别优选的氨基酸是丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸和脯氨酸。

缓冲剂是物质的混合物，即弱碱和强共轭酸或弱酸和强共轭碱的混合物，然而，在本发明中，缓冲剂可以仅参考酸或碱或其各自的共轭盐形式表示。例如，“乙酸根”或“乙酸根缓冲剂”应理解为含有乙酸和乙酸盐的缓冲剂。本领域本领域技术人员可以容易地理解其被称为缓冲系统以及上下文中其中包含哪些组分。

可以作为或在介质B和/或C中使用的优选缓冲剂的示例性选择但不限于，选自磷酸及其盐、柠檬酸及其盐、tris、琥珀酸及其盐、苹果酸及其盐、酒石酸及其盐、乙酸及其盐、乳酸及其盐、乌头酸及其盐、抗坏血酸及其盐、谷氨酸及其盐、氯化铵、三乙醇胺、丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸和脯氨酸。

根据本发明，缓冲剂应理解为由溶剂和无机和/或有机盐组成，盐以溶解离子的形式存在，其在本文中也称为赋形剂(S)。

也可以使用其他盐替换有机和/或无机缓冲盐。例如，可以使用任何无机盐。无机盐不限于本发明，可以使用任何可溶于水溶液并且不干扰所用生物分子的无机盐。无机盐例如选自硫酸根、硝酸根、磷酸根、碳酸根、卤化物、硼酸根、硅酸根等的碱金属盐或碱土金属盐。

如果应提供药学上可接受的产品，则无机盐以及有机盐应选自本身已知的药学上可接受的盐。例如，药学上可接受的无机盐选自钠盐、例如卤化钠、优选氯化钠、硫酸钠、硼酸钠；钙盐如卤化钙、优选氯化钙、硫酸钙、硼酸钙；镁盐如卤化镁、优选氯化镁、硫酸镁、硼酸镁及其组合，以及其它药学上可接受的无机盐。

特别优选的无机盐是氯化钠，因为它具有优点。例如，氯化钠对pH值的影响很小，并且存在于许多已知的缓冲系统中。生物分子不会受到氯化钠的影响，并且已知它对动物和人类无害。

根据本发明，可以使用在水溶液中产生任何类型的带电离子的盐，例如任何单价或多价离子。例如，可以使用单价、二价或三价离子。根据一个实施方案，可以优选使用单价离子。

必须观察和满足的关于根据本发明的液体介质B和液体介质C的条件是液体介质B的离子强度高于液体介质C的离子强度。该要求是所提供的方法实现期望的结果的必要特征。

已知溶液的离子强度是溶液中离子浓度的量度。离子化合物溶解在水中，离解成离子并导致溶液的离子强度，这是所有存在的离子浓度的函数：

在该等式中，c_i是离子i的摩尔浓度(M，mol/L)，z_i是该离子的电荷数，并且该总和取自溶液中的所有离子n。对于氯化钠，离子强度等于浓度，但对于例如MgSO₄的盐，离子强度是四倍高，因此多价离子对离子强度有很大贡献。

此外，还已知如何调节盐溶液(例如缓冲剂)的所需离子强度；盐溶液的离子强度的设定可以根据存在的盐的浓度和离子效力来进行。此外，现有技术中存在大量出版物和专利文献，因此可以在手册、专论等中查找离子强度的特定值或范围。因此，本领域技术人员能够提供具有所需离子强度的盐溶液。

根据优选的实施方案，液体介质B具有高离子强度，其以浓度形式表达为至少约20mM或更高，或优选至少约100mM或更高，或最优选至少约200mM或更高。

此外，优选液体介质C具有以约150mM或更低，或优选约100mM或更低，或更优选约75mM或更低，或更优选约75mM或更低，或最优选约50mM或更低的浓度形式表达的低离子强度。

因此，与渗滤DF2中使用的液体介质C相比，渗滤DF1中使用的液体介质B具有更高的离子强度。作为规则，以浓度形式表示的液体介质B的离子强度可以在约20mM至盐的溶解度极限的范围内，或者，特别优选地，从约100mM至1000mM，或更优选约150mM至750mM，或最优选约200mM至500mM范围内。

溶解度极限应理解为在给定温度下可溶解的最大溶质浓度。物质在特定溶剂中的溶解度的程度例如以饱和浓度测量，其中添加更多的溶质不会增加溶液的浓度并开始沉淀过量的溶质。因此，盐的溶解度极限或定量溶解度是溶剂中导致系统仅具有一个相的盐的最大浓度。

尽管溶解度的极限取决于溶液的温度、压力和pH，但本领域技术人员将能够基于现有技术中已知的值选择和调节所需浓度。例如，以下示出盐在水(20-25℃)中的溶解度：

柠檬酸钠＝920g/l＝约3mol/l

氯化钠＝359克/升＝约6摩尔/升

乙酸钠＝1233克/升＝15摩尔/升。

因此，例如氯化钠可以以约20mM至约6mol/l的浓度给出的离子强度使用。

此外，液体介质C的离子强度(表示为浓度)可以在约0mM至150mM，或特别优选约0mM至100，或更优选约0mM至75mM，或最优选约0mM至50mM的范围内。

在本发明中，一种或多种盐的水溶液作为液体介质B用于步骤(b)，并且水或一种或多种盐的水溶液作为液体介质C用于步骤(c)，且液体介质B的离子强度高于液体介质C的离子强度。根据优选的实施方案，液体介质B的离子强度与液体介质C的离子强度之间的差异表示为浓度，优选至少为约100mM，或更优选至少约200mM，或最优选至少约500mM。

因此，如果液体介质B的离子强度选择为约500mM，则液体介质C的离子强度低于约500mM，优选选择为约400mM或更低，或更优选约300mM或更低，或最优选约0mM。例如，水是液体介质C，其具有约0mM的离子强度并且还具有约0mS/cm的电导率。

此外，起始液体介质A也优选具有比液体介质B低的离子强度。但这在不是在任何情况下都是必需的。如果液体介质A具有比液体介质B更高的离子强度，本发明的方法可以相应地分别调整步骤(b)的循环数和任选也步骤(C)可以优选地增加。本领域技术人员可以容易地相应地优化方法步骤。

如果由于液体介质的离子强度太高而导致生物分子的稳定性出现问题，则事实是必须使用较低的液体介质离子强度并且相应地调整方法步骤。

因此，通常液体介质A的离子强度高于液体介质B的离子强度，但反过来也是可能的。

可提供具有合适范围内离子强度的液体介质A，其可以通过浓缩步骤(a)来控制。液体介质A也可以用水稀释以获得较低的离子强度，但这不是优选的。

在特别优选的实施方案中，用于步骤(c)(DF2)的液体介质C是水。对于药物用途，优选在整个方法中使用的任何水本身或作为介质中的水溶液应该是非常纯的水，以避免液体生物分子制剂被水中含有的离子污染，如之前所解释的。因此，根据ASTM D1193或ISO3696，使用超纯水，例如1型超纯水是有用的。然而，对于其他非药物用途，也可以使用自来水。

因此，根据本发明的方法中的介质或溶剂交换步骤通过具有高离子强度(DF1)的液体介质进行到具有低离子强度(DF2)的介质中，以除去存在的不需要的赋形剂。不希望受理论束缚，推测从较高离子强度到较低离子强度的转移削弱了生物分子-赋形剂相互作用，从而可以尽可能地减少或除去这些赋形剂。

代替离子强度，可以使用与离子强度相关的电导率来确定所用的介质。经验方法依赖于电导率和离子强度之间的简化线性关系。因此，例如，离子强度在200mM至500mM范围内的液体介质B的电导率约为10mS/cm至50mS/cm。

由于简化的线性关系，上述电导率值仅出于说明目的和作为对照而给出，但离子强度(以浓度给出)似乎是本发明中的准确参数。

此外，低电导率可以指示液体制剂具有显著降低的赋形剂，包括离子赋形剂，使得电导率可以用于确定获得的纯化含量。

取决于所选择的生物分子和液体介质，本领域技术人员可以容易地从现有技术中已知的超滤和渗滤步骤的参数和条件中选择和调整。这属于本领域技术人员的一般知识。例如，如果选择的生物分子是蛋白质，则优选渗滤步骤DF1和DF2都在低于蛋白质等电点的pH下进行。详细情况在实施例部分给出。

例如，液体介质A、B、C的pH值在本发明的方法中不是问题，因为该方法在任何pH值起作用。如果带电离子仅根据调节的pH存在，则pH值可能是令人感兴趣的。例如，如果pH>3.75，则乙酸根阴离子仅存在于化学平衡乙酸根/乙酸中。因此，当然，在合适的pH值或范围内进行该方法，其中用于进行交换的盐或离子以合适的电荷存在。

另外，优选的是，两种渗滤在具有相同分离过滤器但不同介质B和C的相同渗滤系统中连续进行。其他实施方案也是可能的。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(b)的第一渗滤(DF1)可以在进行后续步骤(c)之前重复几次。也就是说，液体介质B的交换可以以介质循环的形式进行多次，如图1A所示。因此，液体介质B的交换可以进行x个介质循环，其中优选x＝2至10，更优选x＝2至8，最优选x＝2至6。

换句话说，如果x＝2，则步骤(b)重复2次，图2A的循环通过2次，并且对于任何循环，在每个循环中添加相同的液体介质B作为渗滤介质。作为一种规则，循环次数通常随着所用液体介质B的离子强度(或浓度)的降低而增加。可能的循环次数还取决于所使用的生物分子的类型，其必须能够耐受循环次数而没有损坏。

因此，优选以恒定的渗余物体积对介质B进行第一渗滤DF1，其量为介质B体积的至少约两倍至介质B体积的10倍。因此，方法步骤(b)以至少确定的体积交换进行，例如与液体介质B的2倍体积交换。

在本发明的另一个优选实施方案中，步骤(c)的第二渗滤(DF2)可以在进行后续步骤(d)之前重复几次。液体介质C的交换可以以介质循环的形式进行多次，如图1A所示。因此，液体介质C的交换可以进行y个介质循环，其中优选y＝2至10，更优选x＝2至8，最优选x＝2至6。

换句话说，如果y＝4，则步骤(c)重复4次，图2A的循环通过4次，并且对于任何循环，在每个循环中加入相同的液体介质C作为渗滤介质。

因此，优选以恒定的渗余物透析体积对介质C进行第一渗滤DF2，其量为介质C体积的至少约两倍至介质C体积的10倍。因此，方法步骤(c)以至少确定的体积交换进行，例如与液体介质C的2倍体积交换。

交换体积或交换循环的数量高度取决于所用的渗滤介质，例如所用的离子强度或浓度。本领域技术人员通过常规实验可以容易地分别找到步骤(b)和步骤(c)的最佳循环次数。

在一个优选的实施方案中，第二渗滤DF2根据本发明的方法进行，仅使用水作为渗滤介质C.

在本发明的另一优选方式中，已发现在步骤(c)(DF2)有利的，如果仅使用水作为溶剂，则可存在少量导电盐如氯化钠以控制导电率。如果仅存在水，则电导率为0mS/cm，从而不能获得可测量的值。这是因为一些UF/DF系统使用电导率探针运行。因此，为了更好地控制该方法，优选在步骤(c)(DF2)期间或之后加入少量例如0.001至0.003重量％的导电盐。因此，由于存在少量导电盐，液体介质C基本上由水组成。

根据另一个优选的实施方案，液体介质B和C是相同的，并且仅在所用的离子强度方面不同。例如，导电盐代表第二和第三赋形剂，仅以不同浓度存在。

在随后的步骤(d)中，进行第二超滤(UF2)以获得浓缩形式的液体生物分子制剂，并达到生物分子c_P3的浓度。因此，步骤(d)的超滤UF2用于将液体生物分子制剂浓缩至所需值。

根据步骤(a)和(d)的超滤可以用相同的超滤膜来完成。超滤步骤可以用任何合适的超滤器装置或已知的超滤膜进行。

根据优选的实施方案，本发明的方法可用于从含有生物分子(作为带正电荷的化合物)的起始液体介质A中除去带负电的赋形剂。在该实施方案中，一部分带负电荷的赋形剂可用于稳定液体制剂中的生物分子。例如，可以通过阴离子的存在来稳定带正电荷的蛋白质。采用本发明的方法，阴离子将尽可能地或必要地减少或除去。因此，存在于液体介质A中以稳定生物分子的阴离子(起始或第一赋形剂)将被存在于液体介质B中的阴离子(第二赋形剂)替换，使得步骤(b)中的阴离子的种类将代表生物分子的抗衡离子。具有比液体介质B低的离子强度的液体介质C(第三赋形剂，如果存在的话)通常不会导致已经存在于步骤(b)中作为生物分子的抗衡离子的阴离子(第二赋形剂)的交换。结果，存在于液体介质B中的阴离子(第二赋形剂)将确定生物分子的抗衡离子，从而可以相应地选择抗衡离子。因此，在该示例性情况下，液体介质B的赋形剂是形成于本发明方法的步骤(d)中获得的生物分子-赋形剂复合物的赋形剂。

此外，在溶液条件下进行的本发明方法中，可以使用任何赋形剂作为第一、第二或第三赋形剂，例如带正电的赋形剂、带负电的赋形剂和中性赋形剂。当然，如果第一或起始赋形剂具有特定电荷，则第二赋形剂也具有相同的相应电荷，以便在需要时替换第一赋形剂(如果出于任何原因需要)。例如，第一赋形剂带负电荷，与生物分子相互作用并应被替换，然后第二赋形剂带负电荷等。

可根据存在的生物分子、溶剂和第一赋形剂选择第二和任选的第三赋形剂。选择的第二和第三赋形剂为盐，优选有机和/或无机盐，更优选有机和/或无机缓冲盐或如本文所述的由其衍生的离子。

在该方法期间，在任何情况下有用的是在该方法的每个阶段进行赋形剂分析以监测溶液条件的变化。

在本发明的方法中，存在于液体介质A中的赋形剂尽可能地或需要地减少。根据优选的实施方案，存在于起始液体介质A中的赋形剂降低至低于检测水平。在这方面，使用术语“检测水平”(LOD)和“量化水平”(LOQ)。这些术语用于描述可通过分析程序可靠测量的被测量的最小浓度。通常，测试根本不能简单地精确测量低至零的分析物浓度。必须存在足够的分析物浓度以产生分析信号，该分析信号可以可靠地与“分析噪声”(即在没有分析物的情况下产生的信号)区分开。可以应用各种分析规范以确保LOD是有意义的并且与阴性或空白样品清楚地区分。在这点上，参考实施例部分。已找到以下LOD和LOQ

据推测，其他赋形剂在LOD和LOQ方面具有相同或非常相似的值。

优选地，方法步骤(a)至(d)在室温(20-25行。由于一些生物分子的温度敏感性，应避免在整个方法中使用比室温高得多的或低得多的温度。通常可接受的温度范围为约2至35/>优选约5至25/>最优选约20至25/>例如，在整个方法中根本不应进行加热。

此外，应该注意，该方法中顺序的次序是本发明的基本标准，并且这些步骤不可以相互交换；否则将无法实现创造性的益处。因此，步骤(a)是步骤1或在该方法中进行的第一步骤，步骤(b)是该方法的步骤2，步骤(c)是该方法的步骤3，步骤(d)是该方法的步骤4。另一顺序的次序不是预期的，也不是所希望的。

根据另一个优选的实施方案，步骤(b)和步骤(c)一个接一个地直接进行，从而在它们之间不进行中间方法步骤；即，在渗滤DF1之后直接进行渗滤DF2，其间没有任何中间步骤。优选地，步骤(a)和步骤(b)也一个接一个地直接进行，从而在它们之间不进行中间方法步骤。优选地，步骤(c)和步骤(d)也一个接一个地直接进行，从而在它们之间不进行中间方法步骤。因此，步骤(a)至(d)优选在其间没有中间步骤的情况下进行，即步骤(b)直接在步骤(a)之后进行，步骤(c)直接在步骤(c)之后且步骤(d)在步骤(c)之后直接进行。

本发明还涉及含有通过上述方法制备的生物分子的高度浓缩的液体制剂。

因此，根据本发明，提供了一种明确定义的液体生物分子制剂，其可用于药物或非制药领域或作为药物或非药物组合物开发的良好起点。本发明的方法可用于生产液体生物分子制剂，可以以精确的量加入确定的赋形剂(第四赋形剂)，从而提供具有精确浓度内容物的生物分子制剂。这些第四种赋形剂是上面已经描述的或已知的并且在现有技术中描述的可用于液体生物分子制剂的那些。

本发明的优点是多方面的：

利用本发明的方法，可以提供用于制备明确定义的生物分子制剂的改善的和修改的UF/DF方法，优选可以获得明确定义的蛋白质制剂。

已经发现，对于有问题的高生物分子浓度(例如70mg/mL或更高)，本发明的方法也是平稳运行的。该方法提供最终制剂，其包含或基本上仅由高度浓缩的生物分子溶液和减少量的杂质组成，所述杂质即剩余的赋形剂残余物，如生物分子的抗衡离子，如果仍然存在的话。

根据本发明的方法允许制备明确定义的高度浓缩的制剂，其含有用于药物或非药物用途的生物分子，特别是蛋白质。获得的生物分子制剂作为纯产品制剂提供，与现有技术方法相比，其可以更容易和更快地纯化。

此外，从用作起始材料的初始生物分子制剂中存在的起始赋形剂，特别是阴离子赋形剂如琥珀酸根和乙酸根的残留程度显著降低或甚至最小化。

根据本发明的方法，清除起始赋形剂所需的透析体积交换次数在合理的范围内，从而不影响生物分子的稳定性并且不支持聚集体形成。

根据本发明的方法的另一个优点是该方法对施加在蛋白质上的物理应力非常温和。这可以从在整个方法步骤中存在的高度单体含量得出。

由于根据本发明的方法的最终产物是明确定义的生物分子制剂，因此其进一步加工更简单和直接。此外，可以以更容易的方式提供定制的制剂，因为使用者可以通过掺入添加剂来添加所选的赋形剂(第四赋形剂)以达到所需的确定的制剂。

本发明的方法也可大规模实现，以合理的成本提供所需的质量标准和操作效率。

因此，提供了有效的UF/DF方法，其允许在溶液条件下除去赋形剂至非常低的水平，优选低于检测水平。本发明的UF/DF方法也可用于带电荷的赋形剂和带电荷的生物分子。例如，带负电荷的赋形剂，例如柠檬酸根，琥珀酸根和磷酸根，可以在溶液条件下降低至非常低的水平或低于检测极限的水平。优选的带电生物分子是例如蛋白质，例如可带正电荷的抗体。

因此，渗滤允许使用者调节液体生物分子制剂并通过除去杂质形式的赋形剂用另一种溶液替换一种溶液，例如，从制备条件如发酵或色谱法等测量方法所需的赋形剂中保留。

结果是，根据本发明的方法产生制剂，通过重复的超滤浓度和渗滤洗涤实现，其已经清除杂质或将其降低至不会影响最终产品的安全性、功效或储存的水平。

根据一个优选的实施方案，双渗滤UF/DF方法-结合两个渗滤步骤，一个在高离子强度下，一个在低离子强度下(例如纯水)-表明可以获得浓缩的生物分子制剂，优选蛋白质制剂，其中例如阴离子赋形剂如磷酸根、柠檬酸根、琥珀酸根和乙酸根离子已被完全除去。然后，优选产生的高度浓缩的蛋白质溶液例如仅由蛋白质、水和必要的最少选择的抗衡离子组成，例如氯化物、柠檬酸根、琥珀酸根或乙酸根，形成例如“蛋白质-氯化物”、“蛋白质-柠檬酸根”、“蛋白质-琥珀酸根”或“蛋白质-乙酸根”复合物。

因此，提供了一种允许获得具有确定含量的高度浓缩的液体生物分子制剂的方法。

为了更全面地理解本发明，提供以下实施例。这些实施例是为了说明本发明的实施方案，而不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。

具体实施

以下是说明本发明方法的代表性实施例，但不限于所述的具体实施例。

材料和方法

在实施例中，将本发明方法的实施方案应用于三种测试蛋白的制剂。向蛋白质提供各种初始缓冲离子，例如琥珀酸根、柠檬酸根、乙酸根、磷酸根。交换介质是例如乙酸根、氯离子、琥珀酸根。产生高达200mg/mL蛋白质的最终产物池。示例性过程显示出将残留的初始缓冲离子的水平一致地降低到低于检测极限并且产生仅具有足够的交换介质抗衡离子的液体制剂以平衡蛋白质的固有电荷并允许蛋白质自我缓冲。通过色谱法或乳白光评估蛋白质完整性。通常，蛋白质质量(通过单体含量测量)仅略微降低或保持不变。

研究的蛋白质1和蛋白质2是两种人源化单克隆抗体，均是同种型IgG和亚类1。它们的平均分子量为150kDa，等电点(IP)约为pH8.4(参见Karow A.R.,Bahrenburg S.,&Garidel P.(2013),Buffer capacity of biologics-from buffer salts to bufferingby antibodies,Biotechnol.Prog.29,480-492)。通过哺乳动物细胞培养在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系中产生mAb(参见Bergemann K.,Eckermann C.,Garidel P.,Grammatikos S.,Jacobi A.,Kaufmann H.,Kempken R.,&Pisch-Heberle S.(2007),Production andDownstream Processing,in:Handbook of Therapeutic Antibodies pp.199-237,Wiley-VCH Verlag GmbH；Jacobi A.,Enenkel B.,Garidel P.,Eckermann C.,KnappenbergerM.,Presser I.&Kaufmann H.(2014),Process Development and Manufacturing ofTherapeutic Antibodies,in:Handbook of Therapeutic Antibodies pp.601-664,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA)。有关详细信息，请参阅Jacobi et al.2014年(同前文献)和Garidel P.,Kliche W.,Pisch-Heberle S.,and Thierolf M.(2010),Characterization of proteins and related analytical techniques,in:ProteinPharmaceuticals-Formulation,Analytics&Delivery(Mahler,H.C.,Borchard,G.,&Lueβen,H.,eds.),pp.44-89,Editio Cantor Verlag,Aulendorf,Germany)，其全部公开内容通过引用并入本文。

研究的蛋白质3是纳米抗体(参见例如Gibbs W.W.(2005),Nanobodies,SciAm.Aug,293(2):78-83)，三聚体，平均分子量为40.7kDa，等电点在约pH8.4(理论值)/pH7.5(实验值)。纳米抗体通过大肠杆菌微生物发酵产生并相应地加工和纯化(参见Arbabi-Ghahroudi M.,Tanha J.,MacKenzie R.(2005),Prokaryotic expression ofantibodies,Cancer Metastasis Rev.Dec；24(4):501-19；Rahbarizadeh F,Rasaee MJ,Forouzandeh-Moghadam M.,Allameh A.A.(2005),High expression and purificationof the recombinant camelid anti-MUC1single domain antibodies in Escherichiacoli.,Protein Expr Purif.Nov.,44(1):32-8)。

蛋白质4是FC融合蛋白，氨基酸顺序示于实施例11中。蛋白质5与公开的利妥昔单抗序列100％相同，重链和轻链如实施例12中所示。

两种序列均列于所附序列表中的SEQ ID No.3(“人工序列”,“FC融合蛋白”),SEQID No.4(“人工序列”,“Rituximab HC”),和SEQ ID No.5(“人工序列”,“Rituximab LC”)。

通过超滤和离心过滤制备具有可接受的肠胃外赋形剂的各种制剂(参见Pramanick S.,Singodia D.,&Chandel V.(2013),Excipient selection in parenteralformulation development,Pharma Times 45,65-77)。具体制剂将在下面描述。

所有赋形剂均为分析级和肠胃外级。琥珀酸、三氯乙酸、柠檬酸三钠二水合物、乙酸和乙酸钠购自Merck KGaA；柠檬酸一水合物购自Jungbunzlauer Ladenburg GmbH；琥珀酸二钠六水合物和磷酸二氢钠购自Dr.Paul Lohmann GmbH；磷酸二钠购自ChemischeFabrik Budenheim KG；蔗糖购自Südzucker AG；氯化钠购自Akzo Nobel。

蛋白质分析

蛋白质浓度：mAb溶液的最终蛋白质浓度通过分光光度法(Lambda 35,PerkinElmer,Waltham,MA,USA)通过使用mAb特异性消光系数在λ＝280nm处的光吸收测定。

pH：使用具有偶联的pH电极(Mettler Toledo SevenGo,Columbus,OH,USA)的pH计评估每个阶段的蛋白质溶液的室温pH。在每次pH测量之前，用pH4和pH7的校准溶液(Mettler Toledo SevenGo,Columbus,OH,USA)进行两点校准。

重量摩尔渗透压浓度：使用冰点渗透压计(Osmomat 030,Gonotec,Berlin,Germany)测定重量摩尔渗透压浓度。

蛋白质完整性：蛋白质质量的研究主要集中在颗粒形成上，如目视检查，乳白光和高效尺寸排阻液相色谱(HP-SEC)所示(Garidel et al.2010,同前文献；den EngelsmanJ.,Garidel P.,Smulders R.,Koll H.,Smith B.,Bassarab S.,Seidl A.,Hainzl O.,&Jiskoot W.(2011),Strategies for the Assessment of Protein Aggregates inPharmaceutical Biotech Product Development,Pharm Res 28,920-933)。

目视检查：根据目前的药典进行目视检查。

乳白光：乳白光可能表明蛋白质颗粒形成(Sukumar M.,Doyle B.L.,CombsJ.L.,&Pekar A.H.(2004),Opalescent appearance of an IgG1antibody at highconcentrations and its relationship to noncovalent association,PharmaceuticalResearch 21,1087-1093)。乳白光的增加主要与蛋白质聚集或颗粒浓度的增加有关。通过光度测定法在400-600nm处的90°散射光，在福马肼浊度单位(FNU)中测量乳汁。根据European Pharmacopoeia(2013)，光度计(2100AN Laboratory Turbidimeter,Hach,Loveland,CO,USA)最初用20和100FNU的标准校准。

高效尺寸排阻液相色谱(HP-SEC)：单体含量和蛋白质聚集体(二聚体和更高种类)的水平通过尺寸排阻色谱法(Acquity HClass and TUV detector,均来自WatersCorporation,Milford,MA,USA；柱子是Waters Acquity UPLC 4.6mm x 300mm analyticalcolumn,也来自Waters Corporation,Milford,MA,USA)。流动相为200mM L-精氨酸、120mM硫酸铵和10％异丙醇，用85％磷酸调节至pH7.3。HP-SEC在室温下进行。

将所有样品稀释至终浓度为5mg/mL，注射体积为5μL，等度流速为0.2mL/min。通过UV检测器在λ＝280nm处的吸光度检测得到的峰显示二聚体和更高级聚集体的量；计算剩余单体的百分比。

强阳离子交换色谱(SCX)(对应于IEC离子交换色谱)：分析型强阳离子交换色谱(SCX)用于分离和定量蛋白质3(prot 3)的电荷变体。将SCX-10柱(4x 250mm,10μm,Thermo Scientific 074625)用于与UV-检测器联用的Alliance HPLC-System(Waters)上。将柱子回火至35/>在280nm的吸光度下检测分离的峰。在22分钟内通过梯度100％至64％缓冲剂A(10mM Na₂HPO₄，pH 7.0)以1mL*min^-1的恒定流速引起洗脱。该柱再生用100％缓冲剂B(10mM Na₂HPO₄,1M NaCl,pH 7)以1mL*min^-1的恒定流动进行4分钟。将蛋白质3用水稀释至浓度为0.2mg*mL^-1。注射稀释的蛋白质的40μL。缓冲剂A含有pH7.0的10mM Na₂HPO₄

赋形剂分析

羧酸分析(琥珀酸根、柠檬酸根、乙酸根)：通过高压液相色谱分析测定残留赋形剂(Micro,GE Healthcare,Little Chalfont,UK；Acclaim Organic Acid Column,5μm4.0x 250mm,Thermo Fischer,Waltham,MA,USA)。流动相为100mM硫酸钠，用99％的甲烷磺酸调节至pH值2.6。将柱温设定为30/>注射体积为10μL，等度洗脱，施加流速为0.6mL/min。通过调节至210nm的UV-Vis检测器测量羧基浓度。因为蛋白质干扰该波长的测量，所以首先用TCA(三氯乙酸)(10％)以3：1的比例(样品/TCA，V/V)沉淀mAb。产生校准曲线并用于确定残留的赋形剂水平。

蛋白质沉淀增加了溶液的排除体积，在计算赋形剂浓度时必须考虑这一点。当蛋白质浓度非常高时，这些偏差可以达到15％(200mg/mL)。定量极限(LOQ)和检测极限(LOD)是：乙酸根LOQ＝0.7mM&LOD＝0.1mM，柠檬酸根LOQ＝0.1mM&LOD＝0.01mM，琥珀酸根LOQ＝0.4mM&LOD＝0.01mM。

氯化物和磷酸根：离子特异性比色皿试剂盒(LCK311用于氯化物，LCK350用于磷酸根，Hach，Salford，UK)用于测定氯化物和磷酸根浓度。比色皿含有具有确定浓度的前剂量的试剂。样品制备包括与羧酸分析中使用相同的TCA蛋白沉淀，并且出于同样的原因：蛋白质将与试管中的试剂一起沉淀并且会干扰光度评估。

LCK311测试测量氯化物浓度在两个范围内：1-70mg/L(I)和70-1000mg/L(II)。在较低浓度1-70mg/L的测试中使用1mL样品体积；在70-1000mg/L范围内的测试使用0.1mL样品。将样品加入到比色皿中，然后摇动，保持3分钟，然后用光谱光度计(DR3900，Hach，Salford，UK)分析。氯化物LOQ＝14μM&LOD＝5μM。

磷酸根的LCK349测试确定2-20mg/L范围内的离子浓度。在分析中，将0.4mL样品加入到比色皿中，然后加入0.5mL试剂盒提供的溶液B。然后用DosiCapC密封比色皿。根据本发明，磷酸根LOQ＝0.05mg/L.

摇动并保持10分钟后，用光谱光度计(DR3900，Hach，Salford，UK)分析样品。

调节和制备确定的蛋白质溶液

超滤/渗滤(UF/DF)方法：

使用根据本发明的UF/DF系统制备并调节mAb浓度直至160mg/mL的确定的蛋白质溶液，其具有以下四个步骤：

步骤(a)UF1，超滤使蛋白质溶液浓缩至25％-50％的目标；

步骤(b)DF1，用缓冲介质渗滤(高离子强度的介质B，因此导电率高)；

步骤(c)DF2，用水渗滤(低离子强度的介质C，因此导电率低)；和

步骤(d)UF2，超滤以将蛋白质浓缩至所需值。

使用聚醚砜膜CentramateT系列，截留值为30kDa，A＝200cm²(膜面积)(Pall，NewYork，USA)。流速低于0.8mL·min^-1·cm^-2。

UF/DF在以下条件运行：

入口压力＝1.5巴；出口压力＝0.5巴；并且跨膜压力为～1巴。

交换体积或交换循环的数量取决于所用的渗滤介质。

在每个阶段进行赋形剂分析以监测溶液条件的变化。

离心过滤：

测试第二个实施方案以交换起始缓冲剂并浓缩蛋白质溶液。离心过滤系统(再生纤维素，Amicon Ultra 15mL Centrifugal Filter,Merck Millipore,Billerica,MA,USA)用于蛋白质3纳米抗体。方法条件类似于UF/DF方法中用于蛋白质1和蛋白质2mAb的方法条件。

附图说明

结合附图给出了实验的详细方法描述，附图包含在说明书中并构成说明书的一部分，示出了本发明的优选实施方案，而不限于所描述的特定实施方案。附图与发明内容和具体实施方式一起用于解释本发明的原理。附图显示如下

图1A是渗滤(DF)步骤的示意图；

图1B是超滤(UF)步骤的示意图；

图2是根据现有技术的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示意图；

图3是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的示意图；

图4A是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的图：将蛋白质1(Prot1)的UF/DF-过程中的赋形剂和蛋白质浓度(y轴)相对于琥珀酸根-乙酸根交换中的每个方法步骤(步骤(a)至步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图4B是其中在图4A的蛋白质1(Prot1)(y轴)的UF/DF-方法期间的电导率，乳白光和单体含量在琥珀酸根乙酸根交换中相对于每个工艺步骤(步骤(a)至步骤步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图5A是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的图：将蛋白质1(Prot1)的UF/DF-过程中的赋形剂和蛋白质浓度(y轴)相对于琥珀酸根-乙酸根交换中的每个方法步骤(步骤(a)至步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图5B是其中在图5A的蛋白质1(Prot1)(y轴)的UF/DF-方法期间的电导率，乳白光和单体含量在琥珀酸根乙酸根交换中相对于每个工艺步骤(步骤(a)至步骤步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图6A是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的图：将蛋白质1(Prot1)的UF/DF-过程中的赋形剂和蛋白质浓度(y轴)相对于柠檬酸根-氯化物交换中的每个方法步骤(步骤(a)至步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图6B是其中在图6A的蛋白质1(Prot1)(y轴)的UF/DF-方法期间的电导率，乳白光和单体含量在柠檬酸根-氯化物交换中相对于每个工艺步骤(步骤(a)至步骤步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图7A是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的图：将蛋白质1(Prot1)的UF/DF-过程中的赋形剂和蛋白质浓度(y轴)相对于柠檬酸根-乙酸根交换中的每个方法步骤(步骤(a)至步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图7B是其中在图7A的蛋白质1(Prot1)(y轴)的UF/DF-方法期间的电导率，乳白光和单体含量在柠檬酸根乙酸根交换中相对于每个工艺步骤(步骤(a)至步骤步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图8是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的图：将蛋白质1(Prot1)的UF/DF-过程中的赋形剂和蛋白质浓度(y轴)相对于琥珀酸根-氯化物交换中的每个方法步骤(步骤(a)至步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图9是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的图：将蛋白质1(Prot1)的UF/DF-过程中的赋形剂和蛋白质浓度(y轴)相对于乙酸根-氯化物交换中的每个方法步骤(步骤(a)至步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图10A是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的图：将蛋白质2(Prot2)的UF/DF-过程中的赋形剂和蛋白质浓度(y轴)相对于磷酸根-琥珀酸根交换中的每个方法步骤(步骤(a)至步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图10B是其中在图10A的蛋白质2(Prot2)(y轴)的UF/DF-方法期间的电导率，乳白光和单体含量在磷酸根-琥珀酸根交换中相对于每个工艺步骤(步骤(a)至步骤步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图11是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的图：将蛋白质2(Prot2)的UF/DF-过程中的赋形剂和蛋白质浓度(y轴)相对于磷酸根-柠檬酸根交换中的每个方法步骤(步骤(a)至步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图12是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的图：将蛋白质2(Prot2)的UF/DF-过程中的赋形剂和蛋白质浓度(y轴)相对于磷酸根-氯化物交换中的每个方法步骤(步骤(a)至步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图13A是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的图：将蛋白质2(Prot2)的UF/DF-过程中的赋形剂和蛋白质浓度(y轴)相对于琥珀酸根-氯化物交换中的每个方法步骤(步骤(a)至步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图13B是其中在图10A的蛋白质2(Prot2)(y轴)的UF/DF-方法期间的单体含量和IEC(离子交换色谱)主峰在琥珀酸根-氯离子交换中相对于每个工艺步骤(步骤(a)至步骤步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；

图14是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的图：将蛋白质4(Prot4)的UF/DF-过程中的赋形剂和蛋白质浓度(y轴)相对于磷酸根-氯化物交换中的每个方法步骤(步骤(a)至步骤(d))的pH值(x轴)作图的图；和

图15是根据本发明的超滤/渗滤(UF/DF)方法的示例性实施方案的图：将蛋白质5(Prot5)的UF/DF-过程中的赋形剂和蛋白质浓度(y轴)相对于乙酸根/琥珀酸根/柠檬酸根-氯化物交换中的每个方法步骤(步骤(a)至步骤(d))的pH值(x轴)作图的图。

已经描述了图1A、1B、2和3。下面结合图4A至15解释根据本发明的实施例：

实施例

在所有实施例中使用的水是水。

符号“～”后跟一个数字应理解为该数字已四舍五入到最接近的整数。

实施例1：

-琥珀酸根-乙酸根交换-

根据实施例1，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用低水平的乙酸根替换初始琥珀酸根缓冲离子。因此，产生“蛋白质-乙酸根”制剂，其中乙酸根作为抗衡离子。

所使用的生物分子(以下称为“Prot1”)是单克隆抗体，其包含以下重链(氨基酸单字母代码，N至C末端)：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWIGYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSGYAWFIYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

和以下轻链(氨基酸单字母代码，N到C末端)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

两种序列均列于所附序列表中的SEQ ID No.1(“人工序列”,“单克隆抗体,重链”),SEQ ID No.2(“人工序列”,“单克隆抗体,轻链”)。

实施例1的详细条件如下：

UF1：10mg·ml^-1Prot1/25mM琥珀酸根/125mM NaCl/水/pH6.5；

DF1：用500mM乙酸根/水/pH5.0循环4次；

DF2：用水循环6次；

UF2(产物池)：150mg·ml^-1Prot1/26mM乙酸根/水/pH5.9。

因此，在实施例1中，起始溶液是超纯水中的10mg/mL蛋白质1mAb，其含有25mM琥珀酸钠和125mM氯化钠，pH6.5。

图4A显示了根据实施例1的琥珀酸根-乙酸根交换的结果。在y轴上输入蛋白质1(Prot1)的UF/DF方法期间的赋形剂和蛋白质浓度，UF/DF-方法包括渗滤步骤，其中用4个循环的500mM乙酸钠pH5.0(DF1)，然后是用1型超纯水(例如Merck Millipore的水)(pH6)(DF2)渗滤6个循环，以提供从初始溶液到DF1的阴离子组分(乙酸根)的赋形剂的完全交换。

x轴坐标为方法步骤和相应的pH。x轴上的各个点是：初始，UF1结束，DF1的循环#1/#2/#3/#4，DF2的循环#2/#4/#6和UF2结束时的最终产品(ProdPool)。

图4B显示实施例1的琥珀酸根-乙酸根交换的电导率，乳白光和单体含量的结果。

从图4A中可以看出，初始测量的氯化物浓度为125mM，琥珀酸根浓度为25mM。UF1将蛋白质浓缩至～40mg/mL。DF1由pH5.0的500mM乙酸钠进行4个渗滤循环组成，以将琥珀酸根水平降低至0.5mM并且氯化物浓度低于检测极限。增加渗滤循环的数量将进一步降低琥珀酸根的浓度，但是以处理时间和潜在的蛋白质应力为代价。

在DF2中，在pH6用纯水进行六个渗滤循环然后除去最后痕量的琥珀酸根，同时大大减少残留的DF1乙酸根，其降至～9mM。

完全除去乙酸根既不可能也不可取。在测试的pH条件下，蛋白质1带正电荷；残留的乙酸根阴离子起抗衡离子作用，在DF2结束时的乙酸根/蛋白质1比例为～30：1。

随后是UF2，将蛋白质1浓缩至≥150mg/mL。随着体积减小，乙酸根浓度增加至约26mM。得到的乙酸根/蛋白质比率为～26：1，非常接近DF2结束时40mg/mL蛋白质1溶液的水平：这是维持系统电荷中性所需的乙酸根抗衡离子的比例。观察到的30：1(DF2之后)和26：1(UF2之后)之间的差异可归因于测量阴离子和/或蛋白质浓度的微小误差。

在此阶段，产物池(最终产物)是pH5.9的150mg/mL蛋白质1mAb，具有～20mM乙酸根作为抗衡离子。因此，产物池的pH由蛋白质自身的自缓冲能力和抗衡离子决定并维持(Karow et al.2013，同前文献)。

通过乳白光和HP-SEC单体含量监测产品质量。电导率用于方法控制。正如预期的那样，在DF2之后，电导率从15毫西门子/厘米(mS·cm^-1)降低到接近1mS·cm^-1。在UF1期间，在琥珀酸根存在下，乳白光从10mg/mL的8FNU增加至40mg/mL的20FNU以上。在DF1中用乙酸根交换琥珀酸根使乳白光降低至～17FNU。在DF2期间除去乙酸根进一步将乳白光降低至3-4FNU。在UF2中最终浓缩蛋白质1后，乳白光再次增加，但仅增加到6-7FNU(参见图4B)。蛋白质的初始单体含量为97.5％，并且在整个方法中或多或少保持恒定。

图4B说明了在整个方法步骤中高度单体含量方面的良好产品质量。

实施例2

-在DF1中改变pH值的琥珀酸-乙酸根交换-

根据实施例2，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用低水平的乙酸根替换初始琥珀酸根缓冲离子，其中改变DF1步骤中的pH。

实施例2的详细条件如下：

UF1：10mg·ml^-1Prot1/25mM琥珀酸根/125mM NaCl/水/pH6.5；

DF1：用500mM乙酸根/水/pH5.0循环4次；

DF2：用水循环6次；

UF2(产物池)：138mg·ml^-1Prot1/20mM乙酸根/水/pH6.4。

图5A显示了根据实施例2的琥珀酸根-乙酸根交换的结果。在y轴上输入蛋白质1(Prot1)的UF/DF方法期间的赋形剂和蛋白质浓度，UF/DF-方法包括渗滤步骤，其中用4个循环的500mM乙酸钠pH6.0(DF1)，然后是用1型超纯水(例如Merck Millipore的水)(pH6)(DF2)渗滤6个循环，以提供从初始溶液到DF1的阴离子组分(乙酸根)的赋形剂的完全交换。阴离子的浓度取决于蛋白质的正净电荷量，其主要受pH和蛋白质浓度的影响。

x轴坐标为方法步骤和相应的pH。x轴上的各个点是：初始，UF1结束，DF1的循环#1/#3/#4，DF2的循环#2/#6和UF2结束时的最终产品(ProdPool)。

图5B显示实施例2的琥珀酸根-乙酸根交换的电导率，乳白光和单体含量的结果。

重复实施例1的四步UF/DF方法的实施方案，但改变DF1步骤，即在pH6而不是pH5用500mM乙酸钠进行渗滤(图5A)。比较图4A和5A显示在两个实施例中琥珀酸根清除率达到相似值。在实施例2中，最终产物池是138mg/mL蛋白质1，pH6.4，具有～20mM乙酸根作为抗衡离子(乙酸根/蛋白质比率22：1)并且没有可检测的琥珀酸根。

DF1中增加一单位至pH6导致乳白光略高于实施例1。单体含量始终保持不变，与实施例1中的水平相同(图5B)。

图5B还说明了在整个方法步骤中高度单体含量方面的良好产品质量。

实施例3：

-柠檬酸根-氯化物交换-

根据实施例3，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用氯化物替换初始柠檬酸根缓冲离子。

实施例3的详细条件如下：

UF1：10mg·ml^-1Prot1/48mM柠檬酸根/水/pH6.1；

DF1：用500mM氯化钠/水/pH6.0循环4次；

DF2：用水循环6次；

UF2(产物池)：144mg·ml^-1Prot1/20mM氯化物/水/pH6.4。

图6A显示了根据实施例3的柠檬酸根-氯化物交换的结果。在y轴上输入蛋白质1(Prot1)的UF/DF方法期间的赋形剂和蛋白质浓度，UF/DF-方法包括渗滤步骤，其中用4个循环的500mM NaCl pH6.0(DF1)，然后是用1型超纯水(例如Merck Millipore的水)(pH6)(DF2)渗滤6个循环，以提供从初始溶液到DF1的阴离子组分(氯化物)的赋形剂的完全交换。

x轴坐标为方法步骤和相应的pH。x轴上的各个点是：初始，UF1结束，DF2结束和UF2结束时的最终产品(ProdPool)。

图6B显示实施例3的柠檬酸根-氯化物交换的电导率，乳白光和单体含量的结果。

在实施例3中，清除柠檬酸根并用氯化物交换(图6A)。初始蛋白质溶液由10mg/mL蛋白质1mAb与48mM柠檬酸钠组成，在pH6.5没有额外的盐(图6A)。

在UF1将蛋白质浓缩至40mg/mL mAb后，DF1用pH6.0的500mM氯化钠进行。在4个渗滤循环后，柠檬酸根浓度降至2mM。

然后，用pH6的纯水进行六个DF2渗滤循环足以完全除去所有柠檬酸根。因此，使用目前的方法，可以完全减少柠檬酸根而不需要采用可能损害蛋白质的20、30或40个渗滤循环。

最终产物池是144mg/mL蛋白质1，pH5.8，具有20mM氯离子作为抗衡离子(图6A)，氯化物/蛋白质比率为21：1至26：1。

产品质量指数(图6B)显示在四个步骤的过程中单体含量少量减少(0.4％)。当蛋白质浓缩至100mg/mL水平时，这种降低并不罕见。程度取决于目标蛋白质浓度、蛋白质对UF/DF剪切应力的敏感性、缓冲剂和方法条件(例如膜材料、跨膜压力和通量)。

图6B还说明了在整个方法步骤中高度单体含量方面的良好产品质量。

实施例4：

-柠檬酸根-乙酸根交换-

根据实施例4，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用乙酸根替换初始柠檬酸根缓冲离子。

实施例3的详细条件如下：

UF1：10mg·ml^-1Prot1/48mM柠檬酸根/水/pH6.1；

DF1：用500mM乙酸钠/水/pH6.0循环4次；

DF2：用水循环6次；

UF2(产物池)：160mg·ml^-1Prot1/23mM乙酸根/水/pH6.4。

图7A显示了根据实施例4的柠檬酸根-乙酸根交换的结果。在y轴上输入蛋白质1(Prot1)的UF/DF方法期间的赋形剂和蛋白质浓度，UF/DF-方法包括渗滤步骤，其中用4个循环的500mM NaCl pH6.0(DF1)，然后是用1型超纯水(例如Merck Millipore的水)(pH6)(DF2)渗滤6个循环，以提供从初始溶液到DF1的阴离子组分(乙酸根)的赋形剂的完全交换。

x轴坐标为方法步骤和相应的pH。x轴上的各个点是：初始，UF1结束，DF2结束和UF2结束时的最终产品(ProdPool)。

图7B显示实施例4的柠檬酸根-乙酸根交换的电导率，乳白光和单体含量的结果。

在实施例4中，用乙酸根交换初始柠檬酸根缓冲并清除柠檬酸根(图7A)。初始溶液是10mg/mL蛋白质1，含有48mM柠檬酸钠，pH6.1。

在DF1中，将40mg/mL蛋白质溶液用pH6.0的500mM乙酸钠渗滤。柠檬酸根很容易除去，在六个DF2循环后降至检测极限以下。并且在UF2之后，最终产物池是pH6.4的160mg/mL蛋白质1，具有23mM乙酸根抗衡离子(乙酸根/蛋白质比率为约22：1)。

在这些UF/DF缓冲条件下，单体含量从初始溶液到最终产物池减少约0.9％(图7B)。然而，考虑到产品质量，可以容易地优化该方法变体，使得单体含量仅略微降低或保持不变。

图7B还说明了在整个方法步骤中高度单体含量方面的良好产品质量。

实施例5：

-琥珀酸根-氯化物交换-

根据实施例5，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用氯化物替换初始琥珀酸根缓冲离子。

实施例5的详细条件如下：

UF1：10mg·ml^-1Prot1/25mM琥珀酸根/125mM NaCl/水/pH6.5；

DF1：用500mM氯化物/水/pH6.2循环4次；

DF2：用水循环6次；

UF2(产物池)：157mg·ml^-1Prot1/18mM氯化物/水/pH6.4。

图8显示了根据实施例5的琥珀酸根-氯化物交换的结果。在y轴上输入蛋白质1(Prot1)的UF/DF方法期间的赋形剂和蛋白质浓度，UF/DF-方法包括渗滤步骤，其中用4个循环的500mM乙酸钠pH6.2(DF1)，然后是用1型超纯水(例如Merck Millipore的水)(pH6)(DF2)渗滤6个循环，以提供从初始溶液到DF1的阴离子组分(氯化物)的赋形剂的完全交换。阴离子的浓度取决于蛋白质的正净电荷量，其主要受pH和蛋白质浓度的影响。

x轴坐标为方法步骤和相应的pH。x轴上的各个点是：初始，UF1结束，DF1结束，DF2结束和UF2结束时的最终产品(ProdPool)。

实施例6：

-乙酸根-氯化物交换-

根据实施例6，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用氯化物替换初始乙酸根缓冲离子。

实施例6的详细条件如下：

UF1：11mg·ml^-1Prot1/139mM乙酸根/150mM NaCl/水/pH5.8；

DF1：用500mM NaCl/水/pH6.0循环4次；

DF2：用水循环6次；

UF2(产物池)：157mg·ml^-1Prot1/23mM氯化物/水/pH5.7。

图9显示了根据实施例6的乙酸根-氯化物交换的结果。在y轴上输入蛋白质1(Prot1)的UF/DF方法期间的赋形剂和蛋白质浓度，UF/DF-方法包括渗滤步骤，其中用4个循环的500mM NaCl pH6.0(DF1)，然后是用1型超纯水(例如Merck Millipore的水)(pH6)(DF2)渗滤6个循环，以提供从初始溶液到DF1的阴离子组分(氯化物)的赋形剂的完全交换。阴离子的浓度取决于蛋白质的正净电荷量，其主要受pH和蛋白质浓度的影响。

x轴坐标为方法步骤和相应的pH。x轴上的各个点是：初始，UF1结束，DF1结束，DF2结束和UF2结束时的最终产品(ProdPool)。

在实施例5和6中，评价了用氯化物交换琥珀酸根(图8)和用氯化物交换乙酸根(图9)。在每种情况下，DF1用500mM氯化钠运行四个循环，然后用纯水进行六个DF2循环。在两种情况下，完全除去初始缓冲离子，产物池为157mg/mL蛋白质1，氯化物/蛋白质1比率为约20：1。产品质量指数在预期范围内，并且不受方法影响(数据未显示)。

实施例7：

-磷酸根-琥珀酸根交换-

根据实施例7，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用琥珀酸根替换初始磷酸根缓冲离子。

测试第二抗体IgG1mAb蛋白质2以研究用另一种蛋白质的双渗滤UF/DF性能(图10A和10B)。

实施例7的详细条件如下：

UF1：20mg·ml^-1Prot2/13mM磷酸根/146mM蔗糖/水/pH7.3；

DF1：用500mM琥珀酸根/水/pH5.7循环4次；

DF2：用水循环6次；

UF2(产物池)：89mg·ml^-1Prot2/4mM琥珀酸根/水/pH6.3。

图10A显示了根据实施例7的磷酸根-琥珀酸根交换的结果。在y轴上输入蛋白质2(Prot2)的UF/DF方法期间的赋形剂和蛋白质浓度，UF/DF-方法包括渗滤步骤，其中用4个循环的500mM 琥珀酸钠pH5.7(DF1)，然后是用1型超纯水(例如Merck Millipore的水)(pH6)(DF2)渗滤6个循环，以提供从初始溶液到DF1的阴离子组分(琥珀酸根)的赋形剂的完全交换。

x轴坐标为方法步骤和相应的pH。x轴上的各个点是：初始，UF1结束，DF1的循环#1/#2/#3/#4，DF2的循环#1/#2/#3/#4/#5/#6和UF2结束时的最终产品(ProdPool)。

图10B显示实施例7的磷酸根-琥珀酸根交换的电导率，乳白光和单体含量的结果。

实施例7(图10A和10B)开始于在pH7.3的13mM磷酸钠和146mM蔗糖中的20mg/mL蛋白质2的初始溶液(Wang W.(1999)Instability,stabilization,and formulation ofliquid protein pharmaceuticals.International Journal of Pharmaceutics 185,129-188.)。UF1将蛋白质浓缩至30mg/mL以上。DF1，用pH5.7的500mM琥珀酸钠运行，然后完全除去磷酸根。在DF2用水和UF2后，产物池为89mg/mL蛋白质2，具有4mM琥珀酸根和琥珀酸根/蛋白质比率低于10：1(注意，在这些pH条件下，琥珀酸根的电荷为-2。)。

琥珀酸根与乳白光和聚集的强烈增加相关(图10B)：在最终UF2浓度从30至89mg/mL期间，单体含量下降约2％。这表明在不存在蔗糖的情况下抗体-琥珀酸根制剂在较高蛋白质浓度下蛋白质稳定性降低(参见Ross P.D.and Shrake A.(1988),Decrease instability of human albumin with increase in protein concentration,Journal ofBiological Chemistry 263,11196-11202)。

图10B还说明了在整个方法步骤中高度单体含量方面的良好产品质量。

实施例8：

-磷酸根-柠檬酸根交换-

根据实施例8，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用柠檬酸根替换初始磷酸根缓冲离子。

实施例8的详细条件如下：

UF1：20mg·ml^-1Prot2/13mM磷酸根/146mM蔗糖/水/pH7.3；

DF1：用500mM柠檬酸根/水/pH6.0循环4次；

DF2：用水循环6次；

UF2(产物池)：64mg·ml^-1Prot2/1.5mM柠檬酸根/水/pH7.0。

图11显示了根据实施例8的磷酸根-柠檬酸根交换的结果。在y轴上输入蛋白质2(Prot2)的UF/DF方法期间的赋形剂和蛋白质浓度，UF/DF-方法包括渗滤步骤，其中用4个循环的500mM 柠檬酸钠pH6.0(DF1)，然后是用1型超纯水(例如Merck Millipore的水)(pH6)(DF2)渗滤6个循环，以提供从初始溶液到DF1的阴离子组分(柠檬酸根)的赋形剂的完全交换。

x轴坐标为方法步骤和相应的pH。x轴上的各个点是：初始，UF1结束，DF1的循环#1/#2/#3/#4，DF2的循环#1/#2/#3/#4/#5/#6和UF2结束时的最终产品(ProdPool)。

实施例9：

-磷酸根-氯化物交换-

根据实施例9，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用氯化物替换初始磷酸根缓冲离子。

实施例9的详细条件如下：

UF1：20mg·ml^-1Prot2/13mM磷酸根/146mM蔗糖/水/pH7.3；

DF1：用500mM NaCl/水/pH7.0循环4次；

DF2：用水循环6次；

UF2(产物池)：87mg·ml^-1Prot2/3mM氯化物/水/pH7.0。

图12显示了根据实施例9的磷酸根-氯化物交换的结果。在y轴上输入蛋白质2(Prot2)的UF/DF方法期间的赋形剂和蛋白质浓度，UF/DF-方法包括渗滤步骤，其中用4个循环的500mM NaCl pH7.0(DF1)，然后是用1型超纯水(例如Merck Millipore的水)(pH6)(DF2)渗滤6个循环，以提供从初始溶液到DF1的阴离子组分(氯化物)的赋形剂的完全交换。

x轴坐标为方法步骤和相应的pH。x轴上的各个点是：初始，UF1结束，DF1的循环#1/#2/#3/#4，DF2的循环#1/#2/#3/#4/#5/#6和UF2结束时的最终产品(ProdPool)。

通过用柠檬酸根或氯化物交换可以完全除去磷酸根(图11和12)。在实施例8中，蛋白质2和磷酸根的初始溶液用柠檬酸根渗滤。粘度增加，产量下降，最终产物池的浓度仅为64mg/mL蛋白质2。在实施例9中，其中初始磷酸根溶液在DF1中用氯化物渗滤，最终产物池达到87mg/mL蛋白质2的浓度。一般情况下，可以观察到蛋白质2比在类似条件下的蛋白质1较少溶解。有趣的是，阴离子/蛋白质比率低于5：1。

实施例10：

-琥珀酸根-氯化物交换-

根据实施例10，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用氯化物替换初始琥珀酸根缓冲离子。

实施例10的详细条件如下：

UF1：8mg·ml^-1Prot3/25mM琥珀酸根/水/pH7.3；

DF1：用200mM NaCl/水/pH4.5循环8次；

DF2：用水循环5次；

UF2(产物池)：125mg·ml^-1Prot3/30mM氯化物/水/pH4.5。

图13A显示了根据实施例10的琥珀酸根-氯化物交换的结果。在y轴上输入蛋白质3(Prot3)的UF/DF方法期间的赋形剂和蛋白质浓度，UF/DF-方法包括渗滤步骤，其中用8个循环的200mM NaCl pH4.5(DF1)，然后是用1型超纯水(例如Merck Millipore的水)(pH6)(DF2)渗滤5个循环，以提供从初始溶液到DF1的阴离子组分(氯化物)的赋形剂的完全交换。

x轴坐标为方法步骤和相应的pH。x轴上的各个点是：初始，UF1结束，DF1结束，DF2结束和UF2结束时的最终产品(ProdPool)。

图13B显示实施例10的琥珀酸根-氯化物交换的单体含量和IEC主峰的结果。

在实施例10中，使用Amicon超离心过滤器单元以小规模对UF/DF方法进行测试，以调节和浓缩蛋白质3(纳米抗体)。如实施例10，评估DF1的用氯化物替代琥珀酸根(图13A)。在酸性条件下(pH4.4)，初始蛋白质溶液是在25mM琥珀酸根中的8mg/mL蛋白质3。

UF1步骤将蛋白质3浓度增加至超过45mg/mL。因为蛋白质3在高离子强度下显示出溶解性问题，所以DF1用200mM氯化钠进行8个循环；这足以完全去除琥珀酸根。用纯水的五个DF2循环将氯化物含量降低至13mM。UF2使最终产物池的浓度在～30mM氯化物中达到125mg/mL蛋白质3，氯化物/蛋白质比率在10：1和14：1之间。

在这些方法条件下，离子交换峰的主峰不变，通过高效尺寸排阻色谱(HP-SEC)测量的聚集体数量仅减少0.5％-0.8％，这被认为对于纳米抗体是高度可接受的(图13B)。

图5B还说明了在整个方法步骤中高度单体含量方面的良好产品质量。

实施例11：

-磷酸根-氯化物交换-

根据实施例11，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用氯化物替换初始磷酸根缓冲离子。

所使用的生物分子(以下称为“Prot4”)是Fc融合蛋白。

FC融合蛋白的氨基酸序列如下：

该序列均列于所附序列表中的SEQ ID No.3(“人工序列”,“FC融合蛋白”)。

实施例11的详细条件如下：

UF1：5mg·ml^-1Prot4/27mM磷酸根/5mM氯化物/水/pH7.6；

DF1：用500mM NaCl/水/pH7.0循环4次；

DF2：用水/0.002wt％NaCl循环8次；

UF2(产物池)：212mg·ml^-1Prot4/水/pH7.2。

图14显示了根据实施例11的磷酸根-氯化物交换的结果。在y轴上输入蛋白质4(Prot4)的UF/DF方法期间的单体含量、赋形剂和蛋白质浓度，UF/DF-方法包括渗滤步骤，其中用4个循环的500mM NaCl pH7.0(DF1)，然后是用包括0.002wt％NaCl的1型超纯水(例如Merck Millipore的水)(pH6)(DF2)渗滤8个循环，以提供从初始溶液到DF1的阴离子组分(氯化物)的赋形剂的完全交换。

x轴坐标为方法步骤和相应的pH。x轴上的各个点是：初始，UF1结束，DF1的循环#1/#2/#3/#4，DF2的循环#1/#2/#3/#4/#5/#6/#7/#8和UF2结束时的最终产品(ProdPool)。

通过用氯化物交换可以完全除去磷酸根，产物池中的最终蛋白质浓度为212mg·ml^-1。从初始溶液的5mg·ml^-1到产物池中的212mg·ml^-1，可观察到单体含量的总损失为0.2％，这被认为对于融合蛋白是高度可接受的(图14)。

图14还说明了在整个方法步骤中高度单体含量方面的良好产品质量。

实施例12：

-乙酸根/琥珀酸根/柠檬酸根-氯化物交换-

根据实施例12，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用氯化物替换初始乙酸根、琥珀酸根和柠檬酸根缓冲离子。

所使用的生物分子(以下称为“Prot5”)具有与公开的利妥昔单抗序列100％相同的序列，其包含以下的重链(氨基酸单字母代码，N至C末端)：

和以下的轻链(氨基酸单字母代码，N到C末端)：

两种序列均列于所附序列表中的SEQ ID No.4(“人工序列”,“Rituximab HC”)和SEQ ID No.5“人工序列”,“Rituximab LC”)。

实施例12的详细条件如下：

UF1：16mg·ml^-1Prot5/50mM乙酸根/53mM琥珀酸根/51mM柠檬酸根/水/pH5.0；

DF1：用500mM NaCl/水/pH7.0循环4次；

DF2：用水/0.002wt％NaCl循环8次；

UF2(产物池)：160mg·ml^-1Prot5/水/pH4.9。

图15显示了根据实施例12的乙酸根/琥珀酸根/柠檬酸根-氯化物交换的结果。在y轴上输入蛋白质5(Prot5)的UF/DF方法期间的赋形剂浓度、蛋白质浓度和单体含量，UF/DF-方法包括渗滤步骤，其中用4个循环的500mM NaCl pH7.0(DF1)，然后是用包括0.002wt％NaCl的1型超纯水(例如Merck Millipore的水)(pH6)(DF2)渗滤8个循环，以提供从初始溶液到DF1的阴离子组分(氯化物)的赋形剂的完全交换。

x轴坐标为方法步骤和相应的pH。x轴上的各个点是：初始，UF1结束，DF1的循环#1/#2/#3/#4，DF2的循环#1/#2/#3/#4/#5/#6/#7/#8和UF2结束时的最终产品(ProdPool)。

通过用氯化物交换可以完全除去三种羧酸乙酸根、琥珀酸根和柠檬酸根。在最终浓缩步骤(UF2)期间，仅氯离子以与蛋白质浓缩相同的方式浓缩。乙酸根、琥珀酸根和柠檬酸根的浓度保持在量化极限(LOQ)之下。由于UF2结束时的酸性pH值4.9，因此抗衡离子氯离子的量显示出40mM的高水平。

在这些方法条件下，通过超效尺寸排阻色谱法(UP-SEC)测量的单体含量保持在初始百分比并且在该方法期间没有变化。

图15还说明了在整个方法步骤中高度单体含量方面的良好产品质量。

结果显示，所示出的实施例表明，根据本发明的方法可用于抗体以及非抗体形式。它允许调节明确定义的制剂，并且通过掺入额外的赋形剂，可以产生特定的、明确定义的制剂。

实施例13：

该方法的稳健性

-在乙酸根-氯化物交换中示例性地证明-

为了确定根据本发明的方法是否代表导致一致结果的可靠方法，重复该方法3次以验证该方法的稳健性。即，首先，进行包括步骤(a)至(d)(包括UF1/DF1/DF2/UF2)的本发明方法，并研究所得(第一)生物分子制剂。然后，重复使用相同原料和相同条件的相同方法，并研究所得(第二)生物分子制剂。最后，再次重复使用相同原料和相同条件的相同方法，并研究所得(第三)生物分子制剂。所有三种制剂的比较显示，如果使用相同的起始材料和相同的方法条件，所获得的三种生物分子制剂的结果是否相同或实际上相同(在可能的公差范围内)，从而可以得出结论该方法是一种值得信赖的方法。

进行第一轮

根据实施例13，应用根据本发明的4步UF/DF方法的实施方案来浓缩蛋白质并用氯化物替换初始的乙酸根缓冲离子。进行与实施例6中已经描述的相同的程序，但是选择的详细条件如下：

UF1：10mg ml^-1Prot1/≈150mM乙酸根/≈170mM NaCl/水/pH5.9；

DF1：用500mM NaCl/水/pH6循环4次；

DF2：用水/0.002wt％NaCl循环6次；

在最后一步(d)中，获得的产物如下：

UF2-1(产物池)：198mgml^-1Prot1/21mM氯化物/水/pH5.7。

发现UF2后除去乙酸根并且量接近测定的LOQ。

进行第二轮

用与之前相同的原料和相同的条件重复上述4步UF/DF方法。在最后一步(d)中，获得的产物如下：

UF2-2(产物池)：195mg ml^-1Prot1/21mM氯化物/水/pH5.7。

发现UF2后除去乙酸根并且量接近测定的LOQ。

进行第三轮

用与之前相同的原料和相同的条件重复上述4步UF/DF方法。在最后一步(d)中，获得的产物如下：

UF2-3(产物池)：202mg ml^-1Prot1/20mM氯化物/水/pH5.7。

发现UF2后除去乙酸根并且量接近测定的LOQ。

结果显示，所有3轮导致相同或几乎相同的结果(在可接受的容差内)，使得根据本发明的方法已被证明是提供一致结果的可靠方法。

本发明包括在下面的语句中公开的方面：

语句

1.一种制备含有生物分子的高度浓缩的液体制剂的方法，包括以下步骤：

(a)第一超滤UF1；

(b)第一渗滤DF1；

(c)第二渗滤DF2；和

(d)第二超滤UF2；

其中一种或多种盐的水溶液作为液体介质B用于步骤(b)，且水或一种或多种盐的水溶液作为液体介质C用于步骤(c)，其中用于步骤(b)的盐与用于步骤(c)的盐相同或不同，液体介质B的离子强度高于液体介质C的离子强度。

2.根据语句1的方法，

其特征在于

液体介质B具有高离子强度，以浓度形式表示，其范围为约20mM至盐的溶解度极限，特别优选约100mM至1000mM，更优选约150mM至750mM，最优选约200mM至500mM

并且优选地

液体介质C具有低离子强度，以浓度形式表示，其范围为约0mM至150mM，特别优选约0mM至100mM，更优选约0mM至75mM，最优选约0mM至50mM。

3.根据语句1或2的方法，

其特征在于

液体介质B的离子强度高于液体介质C的离子强度，因此液体介质B的离子强度与液体介质C的离子强度之间的差异以浓度的形式表示为至少约100mM，更优选至少约200mM，最优选至少约500mM。

4.根据前述语句1至3中任一项的方法，

其特征在于

步骤(a)中所使用的液体生物分子制剂含有液体介质A，其为水溶液并含有一种或多种赋形剂，液体介质A在步骤(b)和(c)中通过液体介质B与液体介质C交换，其中步骤(c)和(d)中获得的液体生物分子制剂具有降低的所述赋形剂含量。

5.根据语句4的方法，

其特征在于

赋形剂选自在水溶液中带电或中性的赋形剂；

优选地，赋形剂选自用于制备或加工生物分子的添加剂；不想要的物质或化合物，如起始液体生物分子制剂中含有的杂质；在生物分子的制造方法中形成的不希望的副产物；在生物分子的生产中形成的起始、中间或生物分子终产物的分解或降解产物；

特别优选的细胞组分或碎片，细菌的降解产物例如内毒素，DNA，RNA，不需要的脂质，HCP(宿主细胞蛋白)，脂多糖(LPS)或其部分；糖；洗涤剂，如带正电、带负电和非离子物质；任何种类的带负电或带正电的离子，优选由盐产生。

6.根据前述语句1至5中任一项的方法，

其特征在于

盐选自有机盐和/或无机盐。

7.根据前述语句1至6中任一项的方法，

其特征在于

无机盐选自硫酸根、硝酸根、磷酸根、碳酸根、卤化物、硼酸根、硅酸根等的碱金属盐或碱土金属盐：，

或者

无机盐选自药学上可接受的无机盐，优选钠盐如卤化钠，特别优选氯化钠、硫酸钠、硼酸钠；钙盐如卤化钙，特别优选氯化钙、硫酸钙、硼酸钙；镁盐如卤化镁，特别优选氯化镁、硫酸镁、硼酸镁，及其组合，

最优选的无机盐是氯化钠。

8.根据前述语句1至7中任一项的方法，

其特征在于

液体介质B包含浓度为约150至约900mM，越来越优选约200至约700mM，约400至约600mM，和约450至约550mM的氯化钠。

9.根据前述语句1至7中任一项的方法，

其特征在于

盐是有机和/或无机缓冲盐。

10.根据前述语句1至9中任一项的方法，

其特征在于

缓冲盐是缓冲剂的基础，优选生物缓冲剂，选自以下：N-(2-乙酰氨基)-氨基乙磺酸(ACES)及其盐、乙酸及其盐、乌头酸及其盐、己二酸及其盐、抗坏血酸及其盐、N-(2-乙酰氨基)-亚氨基二乙酸(ADA)及其盐、氨及其盐、氯化铵、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇、3-丙二醇(AMPD)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)及其盐、N,N-双-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)及其盐、苯甲酸及其盐、碳酸氢盐如碳酸氢钠、N,N'-双(2-羟乙基)-甘氨酸(bicine)、Tris缓冲剂如三(羟甲基)-氨基甲烷、[双-(2-羟乙基)-亚氨基]-三-(羟甲基甲烷)(Bis-Tris)、1,3-双[三(羟甲基)-甲基氨基]丙烷(Bis-Tris-Propane)、硼酸及其盐、二甲基胂酸(Cacodylate)及其盐、3-(环己基氨基)-丙磺酸(CAPS)及其盐、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)及其盐、碳酸及其盐、碳酸盐如碳酸钠、环己基氨基乙磺酸(CHES)及其盐、柠檬酸及其盐、3-[N-双(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)及其盐、甲酸及其盐、葡糖酸及其盐、甘油酸及其盐、谷氨酸及其盐、甘氨酸类如甘氨酰甘氨酸、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N'-乙磺酸(HEPES)及其盐、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N'-丙磺酸(HEPPS，EPPS)及其盐、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N'-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)及其盐、咪唑、乳酸及其盐、苹果酸及其盐、马来酸及其盐、2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)及其盐、3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)及其盐、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)及其盐、磷酸及其盐、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)及其盐、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)及其盐、吡啶、琥珀酸及其盐、3-{[三(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸(TAPS)及其盐、3-[N-三(羟甲基)-甲氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)及其盐、酒石酸及其盐、牛磺酸(2-氨基乙磺酸、AES及其盐)、三乙醇胺(TEA)、2-[三(羟甲基)-甲氨基]-乙磺酸(TES)及其盐、和N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸(三甲基甘氨酸)；

或者生物缓冲剂是水溶液中的氨基酸，所述氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；

特别优选的生物缓冲剂选自磷酸及其盐、柠檬酸及其盐、tris、琥珀酸及其盐、苹果酸及其盐、酒石酸及其盐、乙酸及其盐、乳酸及其盐、乌头酸及其盐、抗坏血酸及其盐、谷氨酸及其盐、氯化铵、三乙醇胺、丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸和脯氨酸。

11.根据前述语句1至10中任一项的方法，

其特征在于

液体介质C由水组成或基本上由水组成。

12.根据前述语句1至11中任一项的方法，

其特征在于

生物分子和从液体生物分子制剂中待除去的赋形剂具有相反的电荷，

优选地，所述生物分子带正电荷，并且通过该方法待除去的赋形剂是带负电荷的赋形剂，

最优选地，所述生物分子是带正电荷的蛋白质，所述带负电荷的赋形剂是阴离子。

13.根据前述语句1至12中任一项的方法，

其特征在于

在进行后续步骤(c)之前，可以重复若干次方法步骤(b)，优选地，液体介质B的交换可以进行x个介质循环，其中优选x＝2至10，更优选x＝2至8，最优选x＝2至6。

14.根据前述语句1至13中任一项的方法，

其特征在于

在进行后续步骤(d)之前，可以重复若干次方法步骤(c)，优选地，液体介质C的交换可以进行y个介质循环，其中y＝2至10，更优选y＝2至8，最优选y＝2至6。

15.根据前述语句1至14中任一项的方法，

其特征在于

与液体生物分子制剂的初始浓度相比，步骤(a)的超滤UF1用于将液体生物分子制剂浓缩优选高达约10％-70％，更优选约15％-60％，最优选约25％-50％。

16.根据前述语句1至15中任一项的方法，

其特征在于

步骤(d)的超滤UF2用于将液体生物分子制剂浓缩至所需值。

17.根据前述语句1至16中任一项的方法，

其特征在于

步骤(b)和步骤(c)一个接一个地直接进行，从而在它们之间不进行中间方法步骤；

优选地，步骤(a)和步骤(b)也一个接一个地直接进行，从而在它们之间不进行中间方法步骤；

优选地，步骤(c)和步骤(d)也一个接一个地直接进行，从而在它们之间不进行中间方法步骤。

18.根据前述语句1至17中任一项的方法，

其特征在于

生物分子选自由以下：

-小分子，优选脂质，例如磷脂、糖脂、甾醇；维生素；激素；神经递质；

-单体，优选氨基酸、核苷酸、单糖；

-生物聚合物，优选蛋白质或肽；核酸，如DNA、RNA；寡糖、多糖如糖原、淀粉、几丁质、纤维素、果聚糖、葡聚糖；

特别优选的是蛋白质或肽、核酸、寡糖和多糖；

最优选的是蛋白质或肽。

19.根据前述语句1至18中任一项的方法，

其特征在于

方法步骤(a)至(d)在室温(20-25)℃进行。

20.根据前述语句1至19中任一项的方法，

其特征在于

使用切向流过滤(TFF)系统或离心过滤系统进行方法步骤(a)至(d)。

21.含有生物分子的高度浓缩的液体制剂，其通过根据语句1至20中任一项的方法制备。

序列表

<110> 勃林格殷格翰国际公司

<120> 制备含有生物分子的高度浓缩的液体制剂的方法

<130> B52pct

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 单克隆抗体，重链

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Gln

20 25 30

Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Asp Ser Pro Lys Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Pro Asp Arg Ser Gly Tyr Ala Trp Phe Ile Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 单克隆抗体，轻链

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Val Ala Ile Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 383

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc-融合蛋白

<400> 3

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu

35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg

50 55 60

Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met

65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser

85 90 95

Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp

100 105 110

Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

115 120 125

Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu

130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val

165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

180 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

210 215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

225 230 235 240

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

275 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

305 310 315 320

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

340 345 350

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

355 360 365

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 4

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Rituximab HC

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 5

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Rituximab LC

<400> 5

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims (36)

1.一种制备含有生物分子的高度浓缩的液体制剂的方法，包括以下步骤：

(a)第一超滤UF1；

(b)第一渗滤DF1；

(c)第二渗滤DF2；和

(d)第二超滤UF2；

其中一种或多种盐的水溶液作为液体介质B用于步骤(b)，且水或一种或多种盐的水溶液作为液体介质C用于步骤(c)；其中用于步骤(b)的一种或多种盐与用于步骤(c)的一种或多种盐相同或不同；

液体介质B具有高离子强度，所述离子强度以浓度形式表示，其范围为100mM至750mM；

并且

液体介质C具有低离子强度，所述离子强度以浓度形式表示，其范围为0mM至50mM；

并且

液体介质B的离子强度高于液体介质C的离子强度，使得液体介质B的离子强度与液体介质C的离子强度之间的以浓度形式表示的差异为至少100mM；

所述生物分子选自蛋白质和肽；

所述高度浓缩的液体制剂包含70mg/mL或更高浓度的生物分子，且

所述生物分子带正电荷，并且通过该方法待除去的赋形剂是带负电荷的赋形剂，且

步骤(a)中所使用的液体生物分子制剂含有液体介质A，液体介质A为水溶液并含有一种或多种赋形剂，液体介质A在步骤(b)和(c)中通过液体介质B与液体介质C交换，由此步骤(c)和(d)中获得的液体生物分子制剂具有降低的所述赋形剂含量。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于

液体介质B具有高离子强度，所述离子强度以浓度形式表示，其范围为150mM至750mM

并且

液体介质C具有低离子强度，所述离子强度以浓度形式表示，其范围为0mM至50mM。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于

液体介质B具有高离子强度，所述离子强度以浓度形式表示，其范围为200mM至500mM

并且

液体介质C具有低离子强度，所述离子强度以浓度形式表示，其范围为0mM至50mM。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

液体介质B的离子强度高于液体介质C的离子强度，使得液体介质B的离子强度与液体介质C的离子强度之间的以浓度形式表示的差异为至少200mM。

5.根据权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

液体介质B的离子强度高于液体介质C的离子强度，使得液体介质B的离子强度与液体介质C的离子强度之间的以浓度形式表示的差异为至少500mM。

6.根据权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

赋形剂选自：用于制备或加工生物分子的添加剂；起始液体生物分子制剂中含有的杂质；在生物分子的制造方法中形成的不希望的副产物；在生物分子的生产中形成的起始、中间或生物分子终产物的分解或降解产物。

7.根据权利要求6的方法，其特征在于

所述添加剂源自

细胞组分或碎片，细菌的降解产物；糖；洗涤剂；由盐产生的带负电的离子。

8.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

所述盐选自有机盐或无机盐。

9.根据前述权利要求8的方法，其特征在于

所述无机盐是选自卤化物的碱金属盐或碱土金属盐。

10.根据前述权利要求8的方法，其特征在于

所述无机盐选自药学上可接受的无机盐，所述药学上可接受的无机盐包含钠盐、钙盐、镁盐或其组合。

11.根据权利要求10的方法，其特征在于

所述钠盐包含卤化钠；

所述钙盐包含卤化钙；

所述镁盐包含卤化镁。

12.根据权利要求11的方法，其特征在于

所述钠盐包含氯化钠；

所述钙盐包含氯化钙；

所述镁盐包含氯化镁。

13.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

液体介质B包含浓度为150至750mM的氯化钠。

14.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

液体介质B包含浓度为200至700mM的氯化钠。

15.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

液体介质B包含浓度为400至600mM的氯化钠。

16.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

液体介质B包含浓度为450至550mM的氯化钠。

17.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

所述盐是有机和/或无机缓冲盐。

18.根据权利要求17的方法，其特征在于

所述缓冲盐是生物缓冲剂，其选自磷酸及其盐、柠檬酸及其盐、Tris、琥珀酸及其盐、苹果酸及其盐、酒石酸及其盐、乙酸及其盐、乳酸及其盐、乌头酸及其盐、抗坏血酸及其盐、谷氨酸及其盐、和氯化铵。

19.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

液体介质C由水组成。

20.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

所述生物分子是带正电荷的蛋白质，并且通过该方法待除去的赋形剂包含阴离子。

21.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

在进行后续步骤(c)之前，重复若干次方法步骤(b)。

22.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

液体介质B的交换进行x个介质循环，其中x＝2至10。

23.根据前述权利要求22的方法，其特征在于

x＝2至8。

24.根据前述权利要求22的方法，其特征在于

x＝2至6。

25.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

在进行后续步骤(d)之前，重复若干次方法步骤(c)。

26.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

液体介质C的交换进行y个介质循环，其中y＝2至10。

27.根据前述权利要求26的方法，其特征在于

y＝2至8。

28.根据前述权利要求26的方法，其特征在于

y＝2至6。

29.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

与液体生物分子制剂的初始浓度相比，步骤(a)的超滤UF1用于将液体生物分子制剂浓缩多达10％-70％。

30.根据前述权利要求29的方法，其特征在于

与液体生物分子制剂的初始浓度相比，步骤(a)的超滤UF1用于将液体生物分子制剂浓缩多达15％-60％。

31.根据前述权利要求29的方法，其特征在于

与液体生物分子制剂的初始浓度相比，步骤(a)的超滤UF1用于将液体生物分子制剂浓缩多达25％-50％。

32.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

步骤(d)的超滤UF2用于将液体生物分子制剂浓缩至所需值。

33.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

步骤(b)和步骤(c)一个接一个地直接进行，从而在它们之间不进行中间方法步骤；

步骤(a)和步骤(b)一个接一个地直接进行，从而在它们之间不进行中间方法步骤；和/或

步骤(c)和步骤(d)一个接一个地直接进行，从而在它们之间不进行中间方法步骤。

34.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

方法步骤(a)至(d)在20℃至25℃的室温进行。

35.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于

使用切向流过滤系统或离心过滤系统进行方法步骤(a)至(d)。

36.含有生物分子的高度浓缩的液体制剂，其通过根据权利要求1至35中任一项的方法制备。