KR20060055410A - 면역 감마 글로불린의 바이러스 한외여과 후 확실한용매/세제 처리의 최적 배치 - Google Patents

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Abstract

용매-세제(S/D) 처리를 사용하여 혈장 제제 속에서 외피 바이러스를 불활성화한다. 세제 1.0% 및 트리-n-부틸 포스페이트 용매 0.3%의 농도가 바이러스 활성의 확실한 제거를 위해서 필요한 것으로 고려되어 왔으나, 본 발명자들은 상당히 감소된 용매 및 세제 농도를 요하는, 면역 감마 글로불린 제제의 분획화 및 나노여과 후의 용매-세제 처리의 유효성을 밝혀냈다. 감소된 수준의 용매 및 세제는 수율 증가 잠재성 및 공정 비용 감소와 함께 불활성화 후 이의 제거 효율을 증가시킨다.
바이러스 불활성화, 비레솔브 180 시스템, 한외여과, 정용여과, 용매-세제 처리

Description

면역 감마 글로불린의 바이러스 한외여과 후 확실한 용매/세제 처리의 최적 배치{Optimal placement of a robust solvent/detergent process post viral ultrafiltration of an immune gamma globulin}
도 1은 RhoGAM® 용매 세제 바이러스 불활성화 공정의 흐름도이다.
도 1a, 1b 및 1c는 본 발명의 프리온 및 바이러스 제거 공정에 사용되는 비레솔브 180 시스템(VIRESOLVE® 180 SYSTEM) 한외여과 시스템의 개요도이다. 도 1a, 1b 및 1c는 생성물 보유 탱크(1), 바이러스 제거 필터 홀더(2), 한외여과 필터 홀더(3), 50mM NaCl-글리신 완충액 저장 탱크(4), T-1 재순환 탱크(5), T-2 UF 재순환 탱크(6), P1 비레솔브 180 공급 펌프(7), 비레솔브 180 투과 펌프(8), UF 미터(9), UF 공급 펌프(10), UF 투과물(11), 샘플 포트(12), 및 생성물 회수 및 직렬식 멸균 여과(13)를 명시하고 있다.
도 2는 항-Rh 글로불린을 수득하기 위한 사람 혈장의 분획화 공정을 보여주는 흐름도이다.
도 3은 소 바이러스성 설사 바이러스-스파이크(spike)된 IgG에 대해 본 발명의 용매/세제(S/D) 처리 방법을 사용한 바이러스 불활성화를 보여주는 그래프이다( 실시예 2 참조).
도 4는 가성광견병 바이러스(Psudorabies virus)-스파이크된 IgG에 대해 본 발명의 S/D 처리 방법을 사용한 바이러스 불활성화를 보여주는 그래프이다(실시예 2 참조).
도 5는 BVDV-스파이크된 IgG에 대해 본 발명의 S/D 처리 방법을 사용한 바이러스 불활성화를 보여주는 그래프이다(실시예 2 참조).
도 6은 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)-스파이크된 IgG에 대해 본 발명의 S/D 처리 방법을 사용한 바이러스 불활성화를 보여주는 그래프이다(실시예 2 참조).
도 7은 SDR Hyper D 흡착제의 Triton X-100 및 TNBP 제거 능력의 평가 결과를 보여주는 그래프이다. Triton X-100 파괴(breakthrough)는 70ml가 컬럼을 통과한 후 관찰된다. TNBP에 대해 파괴가 보이지 않는데, 이는 Triton X-100의 농도가 흡착제의 필요량을 계산하는데 중요한 매개 변수임을 나타낸다.
도 8은 실시예 2에 사용된 바이러스 불활성화 방법의 흐름도이다.
본 발명은 혈액, 혈액 성분, 혈장, 또는 혈액 단백질을 함유하는 이의 임의의 분획, 농축물 또는 유도체, 불안정 단백질(예: 면역글로불린)을 함유하는 혈장 함유 제제 및 혈장 분획 함유 제제를 포함하는 혈액제제 및 혈액 제제 조성물에 대해 용매/세제 처리를 통해 바이러스를 불활성화시키는 분야에 관한 것이다. 특히, 용매로는 디알킬 및 트리알킬 포스페이트가 사용되고 세제로는 옥시에틸화 알킬 페놀, 특히 Tritons®을 포함하여 소르비탈 무수물의 부분 에스테르가 사용된다. 따라서, 혈액 제제는, 예를 들면, 간염 바이러스와 같은 외피 바이러스 및 기타 바이러스를 실질적으로 함유하지 않게되고, 이로써 이러한 혈액 제제 및 혈액 제제 조성물은 정제된다.
용매-세제(S/D) 공정은 혈장 제제 속의 외피 바이러스를 불활성화시키기 위해서 거의 20년 동안 사용되어 왔으며 계속해서 다른 신규한 방법들과 비교되는 바이러스 불활성화 방법이다. 세제 1.0%와 트리-n-부틸 포스페이트(TNBP) 용매 0.3%의 농도가 바이러스 활성의 확실한 제거에 필요한 것으로 여겨져 왔다. 불순물이 감소되고 제제가 대부분의 경우에 보다 명확하고 용적 감소와 함께 순도 및 효능이 증가하거나 바이러스 부하량(viral load)이 1회 이상의 확실한 바이러스 제거 단계에 의해 감소되는(즉, 외피 바이러스의 경우 4log 이상의 대수 감소율 및 비외피 바이러스의 경우 3log 이상의 대수 감소율이 야기됨) 공정의 후반기보다 공정 개시시(이 때는 통상적으로 순도 및 효능이 낮은 원료로 인해 공정 용적이 크고 제제가 덜 명확하다)에 S/D 처리가 수행되는 경우, 일반적으로 보다 많은 화학물질이 요구되고 시간이 오래 걸린다.
본 발명에서는 상당히 감소된 농도의 용매 및 세제를 사용할 수 있는, 면역 감마 글로불린 제제와 같은 혈액 제제 또는 혈액 제제 조성물의 분획화 및 나노여 과 또는 크기 배제 여과 후 용매-세제 처리의 효과가 기술된다. 본 발명은 또한 정제 단백질 시스템 속에서 크기 배제 여과 후 사용되는 경우, 외피 바이러스의 완벽한 불활성화를 이루는데 필요한 S/D 화학물질이 지난 20년에 걸쳐 당해 분야의 숙련인에 의해 사용되어온 S/D 바이러스 불활성화 농축물에 비해 10 내지 20배 덜 필요하다는 놀라운 발견을 기재한다.
본 발명의 바람직한 방법은 S/D 화학물질의 제거를 기재한다. 본 발명에 따라서, 단백질이 실리카에 결합하는 것을 감소시키기 위해서 기공 용적을 3차원 가교결합된 소수성 아크릴계 중합체로 충전된 실리카 비드를 함유한 확산 컬럼을 사용함으로써 S/D 화학물질이 효과적으로 제거될 수 있음을 기재한다. 이러한 컬럼은 명확한 단백질 용액으로부터 S/D의 제거를 위해서 특별히 고안된다. 본원에서 논의된 감소된 농도에서 용매/세제 처리를 수행함으로써 생성물을 바이러스 불활성화 처리 후 용매/세제로부터 제거하는데 필요한 컬럼 물질이 10 내지 20배 감소될 수 있다. 이렇게 소량을 충전함으로써 대부분의 경우에 각각 사용 후 크로마토그래피 물질을 처분할 수 있다. 이는 TSE와 관련된 생존 비외피 바이러스 및 프리온 입자의 존재로 인해 뱃치(batch)들간의 가능한 교차 오염을 조절하는데 있어서 중요하다.
S/D 공정은 여전히 혈액 제제 정제에 대한 보다 유리한 바이러스 불활성화 방법이고, 보다 침입적이고 파괴적인 다른 기술은 알데히드의 사용을 포함하며, 자외선은 단백질을 너무 변성시키거나 파괴하는 것으로 입증되었다. 혈액 제제 및 혈액제제 조성물 이외에, 바이러스 오염 가능성이 있는 모든 단백질 용액은 본 발 명의 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 예를 들면, 포유동물의 유즙, 복수액, 타액, 태반 추출물, 조직 배양 추출물, 발효 산물, 형질전환 유도 산물 제제 및 재조합 단백질을 포함하여, 단백질 함유 용액은 모두 당해 방법으로 정제될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 정제용으로 바람직한 단백질 용액은 혈액 제제 및 혈액 제제 조성물이다.
본 발명의 하나의 양태에 있어서, 단백질의 크기 배제 여과 후 사람 또는 동물 유래의 단백질의 제조 후 S/D 처리 방법(1), 당업계에서 종래 사용된 것보다 훨씬 적은 용매 및 세제를 사용하는 S/D 처리 방법(2), 및 단백질이 실리카에 결합하는 것을 감소시키기 위해 기공 용적이 3차원 가교결합된 소수성 아크릴계 중합체로 충전된 실리카 비드를 사용하여 S/D를 제거하는 수단(3)이 기재된다. 실리카 비드를 사용함으로써 세제를 제거할 수 있고 제제 내의 내독소 부하량을 감소시킬 수 있다. 비드는 실리카의 고유한 S/D 포획 능력을 사용하는 한편, 중합체는 표적 단백질(예: IgG)의 회수율이 95%를 초과하도록 한다.
본원에서는, 제조 후 단계로서 단백질 중의, 구체적으로 분획화 및 나노여과 후 정제된 면역글로불린 중의 바이러스 불활성화의 반응속도론이 기술된다. 본 발명자들은 용매 및 세제의 양은 감소될 수 있고 확실한 바이러스 불활성화를 여전히 유지할 수 있는 것으로 결정했다. TNBP 및 Triton X-100의 양을 감소시키는 능력은 S/D를 제거하는데 요구되는 물질의 양을, 흡수제를 단순히 폐기하는 것이 경제적으로 가능하여 물질을 재생시킬 필요성이 없을 정도로 감소시킬 수 있다. 이는 흡수제 재생을 확인할 필요성을 없애고 반복 사용 후 물질로부터 여과되는 S/D 화 학물질 또는 추출물의 파괴에 대한 우려를 최소화한다.
본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 바이러스 불활성화 방법은 한외여과된 RhoGAM®(제조원: Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Raritan NJ)로서 상업적으로 공지된 사람 면역 감마 글로불린에 대해 수행된다. Rho(D) 면역 글로불린(사람)은항체 매개된 면역 억제를 달성한 특정 항체의 최초의 성공적인 예방학적 사용이었다. RhoGAM®은 용량당 항-D 활성의 300㎍ 용량의 항-Rho(D)를 함유하는 IgG 면역글로불린 용액이다. RhoGAM®은 적절한 시기에 비면역화된 Rho(D) 음성 임산부에게 제공되어 Rho(D) 양성 자손에서의 미래 질환을 예방할 수 있다. 당해 질환은 신생아용혈병, 또는 보다 구체적으로 Rh-태아적모구증이라고 불린다.
보다 적은 용량의 항-Rho(D), MICRhoGAM® Rho(D) 면역 글로불린(사람) 마이크로 용량(항-Rho(D) 50㎍)이 또한 임신 12주 또는 그 이전에 유산 및 낙태한 여성을 치료하기 위해 본원 양수인에 의해 시판되고 있다. 전체 용량은 Rho(D) 양성 적혈구 15ml까지에 대해 수혈자를 보호하지만, 보다 적은 용량은 Rho(D) 양성 적혈구 2.5ml까지 보호한다. RhoGAM®은 임신 26 내지 28주에 산전 예방제로서 사용된다. 기타 지시로는 임신이 지속되는 임의의 단계에서의 절박유산, 임신 13주 또는 그 이전에 유산 또는 임신 종료, 복부 외상 또는 유전적 양수천자, 융모막융모 샘플링(CVS) 및 경피제대혈액체취법(PUBS)이 있다.
FDA 및 생물공학국(Bureau of Biologics)에 의해 사용이 승인된 대부분의 면 역글로불린 주사가능한 물질은 1940년대에 하버드의 콘 박사(Dr. E. Cohn)가 개발한 알콜 분획화 방법으로 생산되었다[참조: Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68, 459 (1946)]. 당해 방법은 가장 민감한 시험으로 측정된 간염 감염성, HIV 및 기타 혈액원성 병원체(blood-borne pathogen)에 대해 음성인 혈장의 신중한 선택과 결합되어 당해 방법으로 생성된 제제가 안전함을 보증한다. 이러한 사실은 수백만명의 비감염된 제제 수용자에 의해 쉽게 입증될 수 있다.
현행 한외여과 RhoGAM® 제조방법에 따르면, 항-D-함유 혈장을 분획화하고[참조: Cohn et al., supra] 생성된 침전물을 완충액에 재현탁시키고 비레솔브(Viresolve™) 한외여과막을 사용하여 바이러스를 제거한다. 바이러스 제거된 물질을 바이오맥스(Biomax) 크기 배제 필터를 사용하여 정용여과(diafiltration)하고 농축시킨다. 단백질 농도 및 pH를 조정하고 생성된 벌크 물질을 시린지에 충전시킨다[참조: 미국 특허 제6,096,872호].
용매/세제 처리는 혈장 및 혈장 유래의 치료학적 단백질에서 지질-외피 바이러스를 불활성화하는 방법으로서 널리 채택되고 있다. 다수의 연구는 혈장, 면역글로불린 제제, 응고 인자 농축물 및 기타 혈장 단백질에 대한 당해 방법의 유효성을 입증했다.
통상적으로, 용매/세제 처리를 수행하는 경우, 용매 및 세제를 제조 공정 개시시에 각각 1% 농도로 혈장에 가하거나 공정 중간 단계에 각각 0.3% 및 1.0%의 농도로 혈장에 가한다. 본 발명은 제조 후 보다 낮은 농도의 용매(약 0.003% 내지 0.3% 미만의 TNBP) 및 세제(약 0.01% 내지 1.0% 미만의 Triton X-100)를 사용하여 바이러스 제거된 지질 비함유 벌크 생성물을 불활성화하는, 독특한 바이러스 불활성화 단계를 기재한다. 최종 생성물로부터 용매 및 세제를 제거하는 방법도 또한 추출 단계없이 이루어지므로 독특하다. 그 대신에 용매 및 세제를 실리카 비드 흡착성 물질을 사용하여 직접 제거한다. 흡착성 물질은 재생될 수 있지만, 1회만 사용하는 것이 바람직하다.
본원에서 기재하는 바와 같이, 현행 RhoGAM® 한외여과 공정의 제조 후 바이러스 불활성화 단계를 추가하는 것이 바람직하다. 선행 기술에서는 바이러스 활성의 확실한 제거를 위해서 1.0% 세제 및 0.3% 트리-n-부틸 포스페이트(TNBP)가 필요하다고 여겨졌다. 이러한 고 농도의 S/D와 대조적으로, 본 발명의 방법을 사용하는 경우, 사람 면역 감마 글로불린(RhoGAM®) 벌크 물질은 제조 후 약 0.01% 내지 1.0% 미만의 세제(예: Triton X-100)와 약 0.003% 내지 0.3% 미만의 용매(예: 트리-n-부틸 포스페이트(TNBP))로 처리될 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 당해 처리는 최소 약 1시간 동안 15 내지 25℃에서 수행된다. 용매 및 세제에 대한 위의 범위는 온도 및/또는 연장된 배양 시간에 따라 변할 것으로 예상되는데, 예를 들면, 증가된 온도 및/또는 연장된 배양 시간은 S/D 농도를 훨씬 저하시킬 것이다. 처리 후, 용매 및 세제는 실리카 흡착성 물질, 예를 들면, SDR Hyper D 용매-세제 제거 흡착제(제조원: BioSepra Division of Ciphergen BioSystems, Inc., Fremont, CA) 함유 컬럼에 통과시켜 제거하는 것이 바람직하다. 흡착제는 기공 용적이 용매 및 세제를 보유하는 3차원 가교결합된 소수성 중합체로 충전된 실리카 비드로 이루 어진다. 바이러스 불활성화된 RhoGAM®(RhoGAM SD™)을 바이오맥스 필터를 사용하여 수집, 정용여과 및 농축시킨다. 이어서, 폴리소르베이트 80 농도, pH 및 단백질 농도를 최종 RhoGAM SD™ 제제가 현재 제형에 부합되도록 조정할 수 있다.
S/D 단계는 또한 제조 공정 개시시에 사용될 수 있다. S/D 단계가 제조 개시시에 본 발명의 공정에서 사용되는 경우, 약 0.2%의 세제 및 약 0.2% 내지 약 1.0%의 용매를 사용하는 것이 바람직하다.
바이러스 불활성화에 요구되는 제안된 단계의 흐름도가 도 1에 제공되어 있다.
본 발명은 상당히 감소된 농도의 용매 및 세제를 사용하는, 혈액 제제의 바이러스 불활성화 방법으로서, 용매/세제 단계가 바람직하게는 제제의 제조 후에 사용되는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 지질 외피 바이러스의 불활성화도가 언급된 바이러스의 4log보다 크고 혈액 제제 단백질의 수율이 90% 이상인, 실질적으로 바이러스를 함유하지 않는 멸균 혈액 제제 또는 조성물을 제조하도록 한다.
당해 방법은 혈액 제제를 제조 후 농도 범위가 약 0.003% 내지 0.3% 미만인 하나 이상의 용매와 농도 범위가 약 0.01% 내지 1.0% 미만인 하나 이상의 세제와 접촉시킴을 포함하여 혈액 제제의 바이러스를 제거함을 포함하며, 당해 방법은 지질-외피 바이러스의 불활성화도가 언급된 바이러스의 4log보다 크고 혈액 제제 단백질의 수율이 90% 이상이 되도록 한다. 바람직한 양태에 있어서, 용매의 농도 범 위는 약 0.006% 내지 약 0.3% 미만, 보다 바람직하게는 약 0.015% 내지 약 0.15%, 보다 더욱 바람직하게는 약 0.03% 내지 약 0.15%, 가장 바람직하게는 약 0.03% 내지 약 0.06%, 가장 바람직하게는 0.06%이다. 바람직한 양태에 있어서, 세제의 농도 범위는 약 0.02% 내지 1.0% 미만, 보다 바람직하게는 약 0.05% 내지 약 0.5%, 보다 더욱 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 0.5%, 보다 더욱 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 0.2%, 가장 바람직하게는 약 0.2%이다.
본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 용매-세제 단계는 크기 배제 여과 후에 수행되지만, 제조 공정 개시시에 수행될 수도 있다. S/D 방법이 당해 공정의 개시시에 수행되는 경우, 용매는 약 0.2% 내지 1.0% 미만의 농도로 사용되고 세제는 약 0.2% 내지 1.0% 미만의 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 목적상, 혈액 제제 또는 조성물은, 예를 들면, 포유동물의 유즙, 복수액, 타액, 태반 추출물, 조직 배양 추출물, 발효 산물, 형질전환 유도 산물 및 재조합 단백질, 모노클로날 또는 폴리클로날 IgG 또는 응고 생성물을 포함하는 단백질 함유 용액일 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 사람 면역 글로불린 완제품을 하나 이상의 유기 용매 및 하나 이상의 세제와 접촉시킴을 포함하는, 제조 후에 사람 면역 글로불린을 실질적으로 바이러스 정제하는 방법이 기술되는데, 여기서 당해 방법으로 지질-외피 바이러스의 불활성화도가 상기 바이러스의 4log보다 크게 되고 혈액 제제 단백질의 양이 90% 이상이 되며, 용매 세제는 확산 흡착제를 사용하여 제거된다. 흡착성 물질은 흡착제로 충전된 컬럼을 통해 용매/세제 제제를 유동시킴으로써 생성물 에 도입시킬 수 있거나, 흡착제를 제제에 직접 도입시킨 후, 원심 분리, 배제 여과 또는 경사분리에 의해 제거할 수 있다. 확산 크로마토그래피를 사용하는 경우, 바람직한 양태는 생성물을 흡착제 컬럼을 통해 유동시키는 것이다.
본 발명은 특히, 비리온을 실질적으로 함유하지 않는 상당량의 혈액 제제 단백질을 함유하는 혈액, 혈장 및 혈액 분획과 같은 혈액 제제 조성물의 제조에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 지질 함유 바이러스의 불활성화 및 바람직하게는 B형 및 C형 간염 바이러스의 불활성화에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 불활성화되는 기타 바이러스로는, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 헤르페스 그룹 바이러스 및 파라믹소바이러스가 있다.
특히 본 발명의 방법에 있어서, 이러한 혈액 제제는 바람직하게는 문헌[참조: Cohn et al., supra] 및 공동 양도된 미국 특허 제6,096,872호에 기재된 바와 같은 전면적으로 변형된 콘-온클레이(Cohn-Oncley) 냉 알콜 분획화 계획에 따라서 분획화된 후, 비레솔브(Viresolve) 180 크기 배제 필터(RhoGAM® 한외여과된 Rho(D)면역 글로불린(사람), Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, NJ)를 사용하여 나노여과한 사람 면역 글로불린이다. 이러한 나노여과는 공동 양도된 미국 특허 제6,096,872호의 방법에 따라서 수행된다.
이러한 혈액 제제의 정제는 또한 접선 여과(tangential filtration), 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동 수단 또는 이들 기술의 병용에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명은 단백질 조성물(예: 혈액 제제 또는 혈액 제제 조성물)을 제조 후 단계로서, 예를 들면, 혈액 제제 또는 혈액 제제 조성물을 크기 배제 여과한 후, 선행 기술의 방법보다 상당히 감소된 농도의 용매 및 세제를 사용하여 바이러스 불활성화하는 방법을 기재한다. 하나의 정제된 단백질 시스템에서, 크기 배제 여과 후, 선행 기술의 방법들에 비해 10 내지 20배 적은 S/D 화학물질이 당해 정제된 혈액 제제 속의 외피 바이러스를 완전히 불활성화하는데 필요하다. 이러한 정제된 단백질 시스템은 혈액 제제, 보다 특히, 정제된 사람 면역 감마 글로불린 또는 한외여과된 RhoGAM® 및 MICRhoGAM® 한외여과 제제(제조원: Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Raritan, NJ)이다.
한외여과된 RhoGAM®은 사람 항-D 면역글로불린을 함유하는 멸균 용액이다. 이는 Rh(D) 양성 적혈구에 노출된 Rh(D) 음성 개체에서 Rh(D) 면역화를 방지하는데 사용되는 비경구용 제품이다. 당해 제제는 근육내 투여를 목적으로 한다. 이는 이전의 수혈 또는 임신으로 인해 항체를 갖고 있거나 D 항원에 대해 면역화된 Rh(D) 음성 제공자의 혈장으로부터 수득된다. 적은 용량의 항-Rho(D), MICRhoGAM® Rho(D) 면역 글로불린(사람) 마이크로 용량(항-Rho(D) 50㎍)도 또한 본원의 양수인에 의해 임신 12주 또는 그 이전에 유산 및 낙태한 여성의 치료용으로 시판되고 있다. 전체 용량이 Rho(D) 양성 적혈구 15ml 이하의 경우 수혈자를 보호하는 한편, 보다 적은 용량은 Rho(D) 양성 적혈구 2.5ml 이하의 경우 수혈자를 보호한다.
용액을 포함하는 단백질 함유 조성물은 본 발명의 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들면, 정제될 수 있는 조성물로는 전혈, 혈장, 또는 혈액 단백질을 함유하는 이의 임의의 분획, 농축물 또는 유도체, 혈장 농축물, 혈액 성분, 불안정 단백질을 함유하는 혈장 함유 생성물 및 혈장 분획 함유 생성물(예: 면역 글로불린), 혈장 분획화로부터의 침전물, 혈장 분획화로부터의 상청액, 혈청, 동결침전물, 동결상청액, 세포 용해물, 및 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 포함하는 혈구에서 유도된 단백질을 포함하는 혈액 제제 또는 혈액 제제 조성물이 포함된다. 이들 방법을 사용하여 정제할 수 있는 기타 단백질로는 포유동물의 유즙, 복수액, 타액, 태반 추출물, 형질 전환된 세포 추출물을 포함하는 조직 배양 추출물, 발효 산물, 형질전환 유도 산물 및 재조합 단백질이 있다.
본 발명의 방법은 혼주 혈액 제제 조성물이 처리될 수 있도록 한다. 이어서, 이러한 혈액 제제는 그대로 사용되거나, 필요한 경우, 실질적으로 바이러스 정제된 조성물로서 추가로 가공될 수 있다.
본 발명은 특히, 비리온을 실질적으로 함유하지 않지만 상당량의 혈액 제제 단백질을 함유하는 혈액, 혈장 및 혈액 분획 등과 같은 혈액 제제 조성물의 제조에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 지질 함유 바이러스의 불활성화 및 바람직하게는 B형 및 C형 간염 바이러스와 같은 바이러스의 불활성화에 관한 것이다.
당해 방법은 본원중에서 혈장 및 혈장 분획과 같은 액상 혈액 성분의 처리면에서 기재되지만, 혈액의 고형 성분, 이의 용해물 또는 단백질(예: 농축물) 및 유사 고형 조성물 및 혈액 성분 등을 처리하는데도 유용하다. 본 발명의 방법에 따 르면 혈장 자체 또는 신선한 동결 혈장 또는 해동 동결된 혈장, 동결 침전물, 동결 상청액 또는 동결 혈장으로부터의 농축물 뿐만 아니라 이의 희석물도 처리할 수 있다. 이러한 제제들은 제조 개시시 또는 제조 후에 본 발명의 방법을 사용하여 처리될 수 있다.
특히, 이러한 혈액 제제는 바람직하게는 문헌[참조: Cohn et al., supra] 및 공동 양도된 미국 특허 제6,096,872호에 기재된 바와 같은 전면적으로 변형된 콘-온클레이 냉 알콜 분획화 계획에 따라서 분획화된 후, 비레솔브 180 크기 배제 필터(RhoGAM® 한외여과 Rho(D) 면역 글로불린(사람), Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, NJ)를 사용하여 나노여과한 사람 면역 글로불린이다. 이러한 나노여과는 공동 양도된 미국 특허 제6,096,872호의 방법에 따라서 수행된다. 당해 물질은 사용할 때까지 2 내지 8℃에서 멸균 조건 하에 저장된다.
혈장 분획화는 일반적으로 저온 및 pH 조절하에 에탄올, 메탄올 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 유기 용매를 사용하여 목적하는 혈장 단백질을 함유하는 선택된 혈장 분획을 침전시킴을 포함한다[참조: 위에서 기재한 콘 등의 콘-온클레이 분획화]. 이어서, 생성된 상청액 자체를 목적하는 분획화도가 얻어질 때까지 침전시킬 수 있다. 도 2를 참조하면, 분획 II와 III을 추가로 분획화하여 면역 감마 글로불린을 얻을 수 있다.
예를 들면, 위에서 언급한 콘 등의 방법으로 얻어진 침전물 II 물질을 약 4.6 내지 5.0mg/ml(약 0.5%)로 희석한 후, 한외여과를 통해 10배 농축해야 하고, 추가로 제제를 제조 후 S/D로 처리하는 본 발명의 공정에 있어서, 초기 농도가 낮 은 부형제(예: 폴리소르베이트 80)를 사용하는 것이 중요한데, 위에서 언급한 농도 범위, 바람직하게는 약 0.002% 양의 부형제는 공정에 악영향을 미치지 않는다. 이러한 악영향은, 예를 들면, 외피 바이러스의 경우, 외피로부터의 바이러스의 해리 및 바이러스 입자가 여액으로 통과하는 것일 수 있다. 수포성 구내염 바이러스인 탄알형(bullet-shaped) RNA 함유 외피 바이러스를 사용하여 수행한, 본원의 양도인의 연구는 본 발명에서 사용된 부형제의 농도(100ppm 또는 0.01%)에서는 감지가능한 바이러스 불활성화가 일어나지 않았음을 보여준다.
본 발명의 공정에서 사용된 단백질 농도의 범위는 약 0.1중량% 내지 약 1중량%이다. 약 1% 이하는 단백질 물질이 단량체성 또는 모노클로날인 경우에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용된 침전물 II 면역글로불린의 경우, 처리용으로 사용된 초기 단백질 농도는 약 4.6 내지 5.0mg/ml(약 0.46 내지 0.5%)이다.
본원에 참고로 인용된 콘의 미국 특허 제2,390,074호에는, 감마 글로불린을 제조하기 위한 혈액 분획화 방법이 기재되어 있다. 콘의 방법으로 제조된 감마 글로불린은 19 S 글로불린, 플라스미노겐 및 지질을 함유한다. 당해 감마 글로불린은 풍진 및 파상풍과 같은 질환에 대한 예방책으로서 매우 적합하지만, 19 S 글로불린, 플라스미노겐 및 지질의 존재는 불필요한 오염원이고 태아 적혈구 상의 Rh-인자에 대한 면역화 방지에 있어서 감마 글로불린의 효능을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 효과적인 방법으로 제조된 상당히 순수한 항-Rh 글로불린은 알부민, 플라스미노겐, 알파, 베타 및 감마 글로불린 및 각종 지질을 함유하는 사람 혈장으로부터 제조된다. 구체적으로, 본 발명의 항-Rh 글로불린은 감마 글로불린이 다.
항-Rh 글로불린을 얻기 위한 사람 혈장의 분획화는 폴락(Pollack) 등에게 공동 양도된 미국 특허 제3,449,314호(이의 교시 내용은 본원에 참고로 인용된다)의 방법에 따라서 수행된다. 첨부된 도 2의 흐름도를 참조하면, 사람 혈장을 분획화하는 능력은 혈장의 각종 성분의 용해도에 따라 좌우된다. 분획화의 각 단계에서, 분획의 분리 및 항-Rh 글로불린에서 바람직하지 않은 성분들의 최종적 제거는 pH, 온도, 침전제의 농도 및 시스템의 이온 강도의 조절에 의해 결정된다.
유전 상수가 낮은 각종 유기 용매(예: 아세톤 및 알콜)는 단백질을 침전시키고, 혈장의 분획화에 사용되어 왔다. 본 발명에 사용되는 유기 용매로는 각종 알콜 및 아세톤이 있고, 메탄올이 바람직하다. 메탄올은 다른 유기 용매들보다 비교적 낮은 독성 및 안전한 취급성(예: 폭발 위험)으로 인해 바람직하다.
분획화하는 동안 단백질의 변성을 방지하기 위해서, 낮은 온도에서 침전을 수행한다. 단백질 용해도는 온도 의존성이므로, 분획화의 각 단계를 위해 선택된 온도는 변성을 방지하기 위해서 목적하는 분리를 허용하는 가능한한 가장 낮은 온도이어야 한다.
도 2의 흐름도를 참조하면, 본 발명에서 단백질을 수득하는 바람직한 방법인 분획화가 사람 전혈장으로부터 진행된다. 혈장을 약 1℃로 냉각시킨 후, 원심분리하여 상청액으로부터 차가운 불용성 침전물을 분리한다. 상청액을 추가로 분획화하여 침전물 I과 상청액 I을 얻는다. 주로 피브리노겐으로 이루어진 침전물 I을 폐기한다. 상청액 I을 추가로 분획화하여 상청액 II+III 및 침전물 II+III을 얻는 다. 폐기되는 상청액 II+III은 알파 글로불린, 베타 글로불린 및 지질을 함유한다. 침전물 II+III은 주로 베타 글로불린, 감마 글로불린 및 동종응집소로 이루어지지만, 프로트롬빈, 플라스미노겐, 콜레스테롤 및 기타 지질도 함유한다. 침전물 II+III을 추가로 분획화하여 상청액 II+IIIW 및 침전물 II+IIIW를 얻는다. 베타 글로불린, 콜레스테롤 및 기타 지질은 대부분 상청액 II+IIIW에 포함되어 폐기된다. 침전물 II+IIIW는 주로 감마 글로불린, 동종응집소, 플라스미노겐 및 프로트롬빈 및 일부 베타 글로불린, 콜레스테롤 및 기타 지질로 이루어진다. 침전물 II+IIIW를 추가로 분획화하여 상청액 III과 침전물 III을 얻는다. 버려지는 침전물 III은 동종응집소, 플라스미노겐 및 프로트롬빈을 함유한다. 상청액 III은 주로 감마 글로블린 및 소량의 피브리노겐과 지질을 함유한다. 분획화의 최종 단계에서는 침전물 II가 얻어지고, 이는 19S 글로불린, 플라스미노겐 및 지질이 거의 완전히 존재하지 않는 본질적으로 순수한 감마 G 글로불린이다. 본 발명의 공정으로 제조된 침전물 II는 항-Rh 감마 글로불린이다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 재현탁용 면역글로불린 출발물질은 변형된 콘 등의 방법으로 얻어지는 침전물 II 페이스트이다. 혈장으로부터 정제된 면역 감마 글로불린의 이러한 초기 정제는 또한 여과, 침전 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 또는 이들 하나 이상의 병용으로 수행될 수 있음을 주지해야 한다.
본 발명에서 침전물 II 페이스트를 재현탁시키는데 사용되는 액체 희석제는 주사용수, U.S.P.("W.F.I."), 보통 염수 U.S.P. 또는 일련의 적절한 완충액 중 어느 하나으로부터 선택된 약제학적으로 허용되는 희석제를 포함하고, 당해 완충액은 안정한 pH를 제공한다는 이점이 있다. 적합한 완충액은 pH 약 6.4의 포스페이트 완충액, 시트레이트 완충액, 보레이트 완충액, 아세테이트 완충액 및 글리신 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 초기 희석제는 W.F.I.의 중량을 기준으로 3X 페이스트이고, 이는 나중에 최초의 나노여과 전에 고 이온 강도 완충액 속에 희석된다. 본원에서 고려된는 고 이온 강도 완충액도 초기 희석제로서 적합하다. 바람직하게는, 150mM±20%의 이온 강도가 사용되고, 150mM±20% NaCl 글리신 완충액(pH 6.4)이 바람직하다.
본 발명의 면역글로불린의 처리 및 여과 동안, 고 이온 강도 완충액을 면역글로불린의 이량체 및 삼량체 형성을 감소시켜 필터를 보다 완전히 통과하도록 하는 공정 보조제로서 사용하는 것이 바람직하다. 적합한 고 이온 강도 희석제는 현탁 희석제에 대해 위에서 언급한 것들이지만, 비교적 높은 이온 강도를 갖고 pH는 약 6.4이다. 바람직하게는, 이러한 공정 보조제는 대략 생리학적 이온 강도인, 가장 바람직한 약 150mM±20% 농도의 이온 강도로 존재한다. 본 발명의 가장 바람직한 양태에 있어서, 고 이온 강도 공정 보조제는 150mM NaCl-글리신 완충액(pH 6.4)이다.
본 발명의 프리온 및 바이러스 비함유 면역글로불린의 처리에 있어서, 비이온성 부형제를 편의상 공정의 여과 단계의 개시시에 고 이온 강도 완충액과 함께 혼합할 수 있다. 이와 관련하여 폴리소르베이트 80을 함유하는 고 이온 강도 완충액의 제조에 대한 실시예 1A를 참조한다. 본 발명의 공정 보조제는 폴리소르베이트 80 농도가 증가되는 경우 고 이온 강도 완충액의 함량이 감소될 수 있도록 상대 적으로 조절될 수 있다.
본 발명의 면역글로불린 제형 및 특히 1회용 비경구 제제로서 고안된 RhoGAM® 및 MICRhoGAM® 제형에서, 방부제를 사용할 필요는 없다.
예를 들면, 약 10,000K 내지 약 60,000K 컷오프(cutoff)의 필터, 예를 들면, 바이오맥스-50(컷오프 50,000K) 필터(제조원: Millipore Corporation, Bedford, MA) 필터와 같은 제2의 소기공 크기 나노여과 필터를 사용하는 본 발명의 단백질 농축 및 유기 용매 제거 단계에서, 고 이온 강도 완충액은 비교적 낮은 이온 강도의, 예를 들면, 50mM 완충액으로 임의로 교환될 수 있다. 이러한 단백질 농축 단계는 부형제 및 유기 용매를 일부 제거하면서 나노여과된 단백질 생성물을 농축시키는 역할을 한다.
용매/세제 공정 개시전 생성물의 여과는 잠재적인 바이러스 부하량을 상당히 감소시킬 수 있는 임의의 여과 또는 정제일 수 있다. 이의 예로는 직접 크기 배제 여과, 접선 크기 배제 여과, 심층 여과, 친화성 컬럼 통과 또는 이온 교환 크로마토그래피가 포함되지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
비레솔브-180 막 시스템을 사용하여 여과하는 동안, 막간 차압(TMP)은 바람직하게는 약 0 초과 내지 약 3.0psi, 가장 바람직하게는 약 1.5psi 미만이다. 체 계수(sieving coefficient)는 바람직하게는 약 60%를 초과한다
본 발명의 처리는 주위 온도에서 수행될 수 있다. 냉장 온도에서의 처리는 이러한 온도(예: 16 내지 17℃)가 일반적으로 점도를 증가시키기 때문에 일반적으로 여과 시간을 연장시킨다. 처리 동안의 생성물의 온도는 약 0℃ 내지 약 45℃, 보다 바람직하게는 약 15 내지 30℃, 가장 바람직하게는 약 20 내지 25℃이다.
본원에서 사용되는 다음 용어들은 아래에 기재된 의미를 갖는다:
교차 유속(cross flow rate): 막 표면을 교차하는 공급 용액의 유속(ml/분)
투과물(permeate): 막을 통과하는 정제된 생성물
보유물(retentate): 막에 보유되는 물질
플럭스(Flux): 투과 유속/면적
전환율: 투과 유속/교차 유속
체질율(Sieving): 투과물의 단백질 함량/보유물의 단백질 함량.
본 발명의 하나의 양태에서, 도 1, 1a, 1b 및 1c 및 미국 특허 제6,096,872호를 참조하면, 나노여과에 의해 실질적으로 순수한(프리온 및 바이러스 제거된) 면역글로불린(예:RhoGAM®)을 생성시키는 제조 규모 처리는 다음과 같이 진행된다.
Rho(D) 면역 글로불린을 콘의 정제 방법[참조: Cohn et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 68, pages 459-475]을 사용하여 단계 "침전물 II 페이스트"로 정제하는데, 여기서 메탄올은 에탄올로 대체되고, 2 내지 8℃로 냉각된 주사용수(WFI), U.S.P.에 재현탁시킨다. WFI의 용적을 다음 식을 사용하여 계산한다:
Figure 112005066252954-PAT00001
각 침전물 II 페이스트(kg)를 WFI 3L에 재현탁시킨다.
혼합물을 생성물(1)의 보유 탱크 속에서 3 내지 8시간 동안 볼텍싱(vortexing)(발포 없음)하고 추가로 사용할 때까지 4℃에서 저장한다. 적절한 스 팀(steam in place; SIP) 과정을 바이러스 제거 시스템에서 수행하는데, 이는 바이러스 제거 필터 홀더(2)에 비레솔브 CIP/SIP 모듈(Millipore Corporation, Bedford, MA)을 설치하고 한외여과 필터 홀더(3)에 펠리콘(Pellicon) CIP/SIP 모듈(Millipore Corporation, Bedford, MA)을 설치하는 것을 포함한다. CIP/SIP 과정을 시스템 및 50 mM NaCl-글리신 완충액 저장 탱크(4)에서도 수행한다.
제자리세정(clean in place; CIP) 과정은 설비 부품의 해체없이 처리 설비를세정하는 방법이다. 당해 장비의 요건은 모든 배관이 스테인레스 강이고 피치 및 배열이 적절하고 최소 수의 가스켓을 갖는 것을 포함한다. CIP의 목적은 롯트(lot)의 수동 세정 및 교차 오염을 제거하는 것이다. 당해 과정은 이의 유효성이 입증될 수 있다. 세정의 요소로는 시간, 온도, 화학적 및 기계적 매개변수가 있다. 처리 후 남아있는 잔류물의 유형은 CIP 과정에 사용될 세정제를 결정한다. 약제학적 가공 분야의 숙련인은 CIP 공정 및 요건에 익숙하다.
SIP 과정 후에, 재현탁된 침전물 II 용적 약 40L에 대한 비레솔브-180R 모듈 20 스택(2)을 비레솔브 CIP/SIP 모듈의 적절한 위치에 설치한다(10 스택 비레솔브-180 필터는 최종 생성물 용적 10-16L에 대해 사용되고 20 스택은 16 내지 40L 초과의 최종 생성물 용적 대해 사용된다). 4개의 바이오맥스-50 카세트(Millipore Corporation, Bedford, MA)를 펠리콘 CIP/SIP 모듈(3)의 적절한 위치에 설치한다. 2개의 바이오맥스-50 카세트는 재현탁된 침전물 II 용적 10 내지 16L에 대해 사용되고 4개의 카세트는 16 내지 40L 초과의 용적에 대해 사용된다. 비레솔브-180 모듈을 염수로 살균한 후, 디에틸페닐렌 디아민(DPD) 과정에 의해 염소가 0.3ppm 이 하로 존재하는 것으로 측정될 때까지 세정한다.
압력 유지 시험을 살균 후 모듈(2)에서 수행한다. 모듈은 최소 10psi를 견뎌야 하고 요구되는 시험 기간 5분에 걸쳐 1psi 이하의 압력 강하를 보여야 한다.
바이오맥스-50 막(3)을 WFI, U.S.P.으로 플러싱한다. 벤잘코늄 클로라이드(Roccal)의 측정을 최종 투과된 플러싱 샘플에 대해 수행하는데, 벤잘코늄 클로라이드 함량은 10ppm 이하여야 한다. 확산 시험을 바이오맥스-50 카세트에서 수행하며, 방출 속도는 다음과 같이 계산된다:
Figure 112005066252954-PAT00002
방출 속도는 18cc/분/카세트 이하여야 한다.
비레솔브-180 필터(2)를 사용한 바이러스 제거 한외여과를 50mM NaCl 글리신 완충액에서 수행한다. 바이러스 제거 재순환 탱크(T-1)(5)를 50mM NaCl-글리신 완충액으로 충전시킨다. 최대 250L가 최소 130L로 충전된다.
완충액 투과물을 탱크(오프-라인)에 수집하면서 완충액을 T-1(5)에서 재순환시킨다.
바이러스 제거 재순환 탱크 T-1(5)를 150mM NaCl-글리신 완충액 최소 60L로 충전시켜 탱크와 막을 플러싱한다.
침전물 II 재현탁액을 다음과 같이 처리한다. 침전물 II를 완전히 현탁될 때까지 15 내지 30분 동안 발포없이 와류를 생성하는 속도에서 혼합한다. 굴절률에 의한 단백질%(단백질 mg/ml)을 침전물 II 재현탁액에서 핸드헬드 함수율측정기(hand held protometer)를 사용하여 수행한다. 5.0mg/ml의 단백질 농도를 달성하 는데 필요한 희석된 침전물 II의 최종 용적을 다음 식을 사용하여 계산한다:
Figure 112005066252954-PAT00003
150mM NaCl 글리신 완충액의 필요 용적은 다음 식을 사용하여 계산된다:
Figure 112005066252954-PAT00004
완충액을 희석된 침전물 II에 가하고 최소 30분 동안 발포없이 와류를 생성하기에 충분한 속도에서 혼합한다. 혼합물을 추가로 처리할 때까지 최대 2.5시간 동안 15 내지 30℃에서 저장한다.
희석된 침전물 II의 뱃치를 한외여과용 바이러스 제거 재순환 탱크(T-1)(5)에 충전시킨다. TMP 설정값을 약 3.0으로 설정한다. 그러나, 상기 값은 더 높아질 수 있지만, 약 12에 이르는 경우, 막은 분극화될 수 있고, (투과물을 감소시킴으로써) 보유물이 막을 세척하도록 해야한다. 비레솔브 수준 설정값은 다음과 같이 계산된다:
Figure 112005066252954-PAT00005
위의 결과가 50 미만인 경우, 비레솔브 수준 설정값으로서 50이 도입된다. 1/3 총 용적은 가장 근접한 전체 용적(L)으로 반올림한다.
혈액 성분, 혈장, 또는 혈액 단백질을 함유하는 이의 분획, 농축물 또는 유도체, 혈장 함유 생성물, 및 불안정 단백질을 함유하는 혈장 분획 함유 생성물(예: 면역글로불린):
Figure 112005066252954-PAT00006
위의 결과가 20 미만인 경우, 농도 종말점으로서 20이 도입된다. 한외여과 정용여과 종말점은 다음과 같이 계산된다:
Figure 112005066252954-PAT00007
정용여과 필터 총 설정값은 다음과 같이 계산된다:
Figure 112005066252954-PAT00008
한외여과/농축 공정을 개시하기 위해서, 비레솔브-180 공급 펌프(P1)(7)의 속도를 20 스택 필터 크기에 대해서는 75 내지 83%로 증가시키거나 10 스택 필터 크기에 대해서는 37 내지 42% 증가시킨다. TMP 조절을 채용하고, TMP를 투과물 펌프(P2)의 속도에 의해 조절하고, 막간 차압이 3.0이 되는 경우, 펌프 속도를 둔화시킨다. 비레솔브 투과물 펌프(P2)(8) 속도는 10 스택 필터의 경우 18% 또는 9%까지 서서히 증가시킨다. P2가 증가되면, 5.0psi 이하의 보유물 압력(PT3)이 유지된다. TMP가 평형화되면, 펌프 속도 범위를 10 스택 필터의 경우에는 9 내지 11%로 성정하고 20 스택 필터의 경우에는 18 내지 23%로 설정하다. 막간 차압(TMP)은 조절되지 않지만, 바람직하게는, 비교적 낮은, 예를 들면, 약 3.0psi 미만이거나, 막은 분극화될 수 있다. TMP가 높아지는 경우, 예를 들면, 3.0psi인 경우, 투과물이 막을 세척할 수 있도록 투과가 중단될 수 있다. UV 미터(UV1)(9)는 하한치 4.0A.U. 내지 상한치 7.7A.U.여야 한다. 투과물 유속(FT1)은 하한치 0.81L/분 (LPM) 내지 상한치 0.98LPM이고, 10 스택 필터의 경우에는 0.40 내지 0.49LPM이다. 처리 온도는 약 15 내지 30℃에서 유지된다. 이들 조건은 바이러스 제거/한외여과 공정 전반에 걸쳐 모니터링된다. UV 미터(UV1)(9)는 하한치 6.4A.U. 내지 상한치 7.7A.U.이다. 체 계수는 약 75% 이상이어야 한다.
T-2(6) 용적이 대략 75 내지 100L에 이르면, 펠리콘 시스템(3)을 설치하고 혼합을 개시한다. UF 공급 펌프(P5)(10)를 작동시키고 속도를 증가시키며, UF 투과물 유속을 펌프 속도로 조절한다. UF 공급 압력(PT4) 및 UF 보유물 압력(PT5)은 다음과 같이 유지된다:
UF 공급 압력: 30psi 이하;
UF 보유 압력: 10psi 이하.
공급물 압력과 보유물 압력간의 차이는 20psi 이하로 유지된다:
공급물 압력(psi) - 보유물 압력(psi) = 차이(psi).
희석된 침전물 II 공급물 탱크(T-1)(5) 속의 용적 수준은 중량을 기준으로 모니터링되고 T-1 상의 로드셀에 반응한다.
일정 용적 정용여과를 T-1(5)에서 수행한다. 이러한 정용여과를 사용하여 시스템 및 비레솔브-180 막 전체에 잔류하는 단백질을 세척하여, 수율을 증가시킨다. 3× 150mM NaCl-글리신 완충액 정용여과를 수행하고, 설정된 양의 완충액을 비레솔브-180 투과물을 통해 제거되는 동일한 속도로 가한다. 정용여과 단계가 완료되면, T-1(5) 및 비레솔브-180 모듈(2)을 염소 공정을 사용하여 위에서 기재한 바와 같이 살균시켜, 남아있는 바이러스를 확실히 불활성화시킨다. T-2(6) 속의 벌크를 바이러스 제거된 50mM NaCl-글리신 완충액을 사용하여 T-2(6) 속에서 일정 용적 정용여과에 의해 농축시킨다. 당해 단계는 벌크 생성물을 농축시키고 고 이온 강도 완충액 농도를 저 이온 강도 농도로 교환하고 메탄올을 콘의 방법으로부터 제거하고 약 절반의 폴리소르베이트 80을 사용한다. 정용여과 공정이 완료된 후, T-2(6) 속의 용적 수준(L)을 기록한다. 샘플을 T-2(6)으로부터 꺼내어 UF 투과물 샘플에 대한 디지탈 비전도도 측정을 수행한다. 당해 결과는 4.95 내지 5.67×10-3mhos/cm에 있어야 한다. 첫번째 시험에서 당해 요건이 충족되지 않는 경우, 시험 결과가 당해 요구 범위에 포함될 때까지 일정 용적 정용여과를 계속 수행해야 한다.
5.5× 정용여과 후 T-2 수준은 재현탁된 침전물 II 용적의 95% 이하여야 한다. T-2 수준이 재현탁된 침전물 II 용적의 95%를 초과하는 경우, T-2 용적이 상한 용적 수준 요건을 충족시킬 때까지 벌크를 계속 농축시킨다. 용적 수준이 충족된 경우, UF 투과물을 차단시키고(11) 벌크를 재순환에 의해 혼합하고 샘플 10.5ml를 무균적으로 제거한다(12). 샘플 분취량 0.5ml에 대해 핸드 헬드 함수율측정기를 사용하여 굴절률에 의한 단백질%를 측정한다. 단백질 농도가 적어도 약 5.5%가 아닌 경우, 샘플은 이러한 최소 농도가 충족될 때까지 추가로 농축되어야 한다. 벌크를 임시 용기로 옮기고 벌크 중량을 다음 식을 사용하여 중량측정에 의해 계산한다:
Figure 112005066252954-PAT00009
벌크 조정은 다음 식을 사용하여 최종 벌크 용적을 달성하기 위해 가한 50mM NaCl-글리신 완충액의 용적을 측정함으로써 이루어질 수 있다:
Figure 112005066252954-PAT00010
가해지는 50mM NaCl-글리신 완충액의 필요 용적은 다음과 같이 계산된다:
Figure 112005066252954-PAT00011
먼저 0.9% NaCl로 분취액을 1:10으로 희석하여 잔류 샘플 분취액의 초기 pH를 측정하고, 0.5N HCl 또는 0.5N NaOH의 1:100 희석물로 pH 6.3 내지 6.4로 적정한다.
조정이 필요한 경우, 벌크의 pH를 조정하는데 필요한 희석되지 않은 0.5N 시약의 양을 다음과 같이 계산한다:
Figure 112005066252954-PAT00012
보전성 시험을 채택된 방법에 따라서 비레솔브-180 필터 모듈에서 수행한다. 보전성 시험값은 1.2 이상이어야 하고, 모듈은 위에서 기재한 바와 같이 염소로 살균되고 세정되어야 한다.
50mM NaCl-글리신 완충액을 다음 식에 의해 계산된 벌크에 가한다:
Figure 112005066252954-PAT00013
벌크를 T-2로 역으로 펌핑하고 최종 필요 용적에 도달한 후 10 내지 60분 동안 T-2 속에서 계속 혼합한 후, 벌크 생성물의 분취액 10.5ml를 pH 측정을 위해 무균적으로 제거한다. pH는 6.3 내지 6.4이어야 한다. pH가 언급된 범위를 벗어나 는 경우, 분취액은 위에서와 같이 허용되는 pH로 희석되고 적정되어야 하고, 희석되지 않은 0.5N 시약의 필요량을 위에서와 같이 계산하고 혼합하면서 벌크에 역으로 가해져야 한다.
단백질 %는 위에서와 같이 핸드 헬드 함수율측정기를 사용하여 굴절률에 의해 측정된다. 단백질 농도가 허용되는 5.0% 이상인 경우, 벌크를 다음 단계로 이동시킨다.
벌크는 여과 동안 15psi를 초과하지 않는 압력으로 하여 0.2μ 옵티실(Optiseal) 필터(13)를 통해 임의로 여과한 다음, 벌크를 미생물학적으로 및 혈청학적으로 시험한다.
WFI 및 스팀을 사용한 세정으로 이루어진 자체세정 과정을 바이러스 제거 시스템에서 수행한다(위에서 기재한 CIP 과정).
생성물에 대한 허용 기준을 표 1에 기재한다.
특성 요건
단백질 4.0 내지 6.0%
pH 6.3 내지 6.4
폴리소르베이트 80 80 내지 200ppm
메탄올 함량 50ppm 미만
본 발명은 위에서 기재한 단백질 함유 조성물들 중의 어느 하나, 예를 들면, 혈액 제제를 용매와 접촉시키는 것에 관한 것이다. 특히, 이러한 혈액 제제는 바람직하게는 문헌[참조: Cohn et al., supra] 및 공동 양도된 미국 특허 제6,096,872호에 기재되어 있는 변형된 콘-온클레이 냉 알콜 분획화 계획에 따라서 분획화된 사람 면역 감마 글로불린이다. IgG의 분리 후, 용액을 밀리포어 비레솔브 크기 배제 필터로 여과하여 외피 바이러스 및 비외피 바이러스를 제거한다. 이어서, 바이러스 제거된 물질을 밀리포어 바이오맥스 (50,000MW) 크기 배제 필터를 사용하여 정용여과 및 농축시킨다. RhoGAM®의 제조 공정의 당해 단계에서 S/D 처리가 바람직하게 사용된다.
사람 면역 감마 글로불린 또는 RhoGAM®을 포함하여, 본 발명에 따른 바이러스 불활성화가 요구되는 단백질 조성물, 특히 사람 면역 감마 글로불린을 세제, 예를 들면, 탄소수 1 내지 10, 특히 2 내지 10의 디알킬포스페이트 또는 트리알킬포스페이트, 예를 들면, 트리-(n-부틸)포스페이트, 트리-(t-부틸)포스페이트, 트리-(n-헥실)포스페이트, 트리-(2-에틸헥실)포스페이트 및 트리-(n-데실)포스페이트를 포함하는 트리알킬포스페이트와 접촉시킨다. 특히 바람직한 트리알킬포스페이트는 트리-(n-부틸)포스페이트이다. 상이한 트리알킬포스페이트의 혼합물이 또한 사용될 수 있고, 상이한 알킬 쇄의 알킬 그룹(예: 에틸)을 갖는 포스페이트, 예를 들면, 디(n-부틸)포스페이트도 사용될 수 있다. 유사하게, 디알킬포스페이트들의 상이한 알킬 그룹 혼합물의 디알킬포스페이트를 포함하여, 각각의 디알킬포스페이트가 사용될 수 있다. 또한, 디알킬포스페이트와 트리알킬포스페이트와의 혼합물이 사용될 수 있다.
S/D 공정이, 바람직한 양태로서 최종 크기 배제 여과 후(제조 후)에 사용되는 경우, 사용되는 트리알킬포스페이트 용매는 약 0.003% 내지 0.3% 미만, 보다 바람직하게는 약 0.006% 내지 0.3% 미만, 보다 더욱 바람직하게는 약 0.015% 내지 약 0.15%, 보다 더욱 바람직하게는 0.03% 내지 약 0.15%, 가장 바람직하게는 약 0.03% 내지 약 0.06% 농도 범위의 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP)이며, 이는 선행기술에서 사용된 농도와 비교하기 위해서 약 1.0 내지 0.3%mg/ml이다. 바람직한 양태에서, 사용되는 용매 농도는 약 0.06%이다.
디알킬 또는 트리알킬포스페이트 용매는 계면활성제, 즉 세제와 함께 또는 이의 첨가없이 사용될 수 있다. 그러나, 디알킬포스페이트 또는 트리알킬포스페이트는 세제와 함께 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 세제는 디알킬포스페이트 또는 트리알킬포스페이트가 혈액 제제 조성물과 접촉하기 전, 접촉과 동시에 또는 접촉 후에 첨가될 수 있다. 세제의 목적은 혈액 제제 조성물 속의 바이러스와 디알킬포스페이트 또는 트리알킬포스페이트와의 접촉을 향상시키는 것이다. 바이러스 불활성화될 단백질 조성물을 용매와 세제를 함께 함유하는 예비 혼합된 용액에 노출시키는 것이 바람직한 양태이다.
바람직한 세제는 비이온성 세제이다. 특히, 지방산의 폴리옥시에틸렌 유도체, 소르비탈 무수물의 부분 에스테르, 예를 들면, Tween 80® 및 Tween 20®으로서 시판되는 제품 및 폴리소르베이트 80, 상품명 Triton X-100®(옥시에틸화 알킬페놀)하에 시판되는 것과 같은 비이온성 지용성 수성 세제를 포함하는 세제가 고려된다. 나트륨 데옥시콜레이트가 고려되고, "설포베타인"으로서 알려져 있는 합성 양쪽이온성 세제(예: N-도데실-N,N-메틸-2-암모니오-1-에탄 설포네이트 및 이의 동종체) 또는 비이온성 세제(예: 옥틸-베타-D-글루코피라노시드)도 고려된다. 세제 Triton X-100이 용매와 함께 사용될 때 우수한 바이러스 불활성화 상승 효과로 인해 본 발명의 바람직한 양태에서 사용된다.
알킬포스페이트의 유효성을 향상시키는 물질로는 머캅토에탄올, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨 및 디티오옥탄산과 같은 환원제가 포함된다. 적합한 비이온성 계면활성제는 옥시에틸화 알킬 페놀, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 오일, 폴리옥시에틸렌 알콜 및 폴리옥시에틸렌 옥시프로필렌 지방산이다. 구체적인 예로는 알킬페녹시폴리에톡시 (30) 에탄올, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 트리스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 트리올레에이트, 폴리옥시에틸렌 (20) 팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 (20) 라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 (20) 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌 (20) 스테아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 (20) 올레일 에테르, 폴리옥시에틸렌 (25) 수소화 캐스터유 및 폴리옥시에틸렌 (25) 옥시프로필렌 모노스테아레이트이다.
사용되는 경우, 세제의 양의 범위는 약 0.01% 내지 1.0% 미만, 보다 바람직하게는 약 0.02% 내지 1.0% 미만, 보다 더욱 바람직하게는 약 0.05% 내지 약 0.5%, 보다 더욱 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 0.5%, 가장 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 0.2%이다. S/D 공정이 최종 크기 배제 여과 후 사용되는 경우(제조 후), 사람 면역 감마 글로불린을 사용하는 바람직한 양태로서, 사용되는 세제는 가장 바람직하게는 약 0.1% 내지 0.2%의 Triton X-100이고, 0.2%가 가장 바람직한데, 비교 목적상 선행기술에서 사용되는 농도는 약 1.0%이다.
본 발명의 방법에 바람직하게 사용되는 S/D 조합물 및 비, 즉 약 0.03% 내지 약 0.06%의 트리(N-부틸)포스페이트(TNBP)와 약 0.1% 내지 약 0.2%의 Triton X-100이 이의 확실한 바이러스 불활성화로 인해 사용되는 배양 조건하에 가장 바람직하고, 본 명세서에 기재된 데이타는 바이러스 불활성화가 반응이 퀀칭되는 만큼 빨리 완료됨을 보여준다.
본 발명에 의해 고려되는 혈액 제제 조성물의 용매/세제를 사용한 처리는 약 -5 내지 70℃, 바람직하게는 약 15 내지 25℃의 온도에서 수행된다. 이러한 처리(접촉) 시간은 약 1분 이상, 바람직하게는 약 10분 내지 약 1시간, 가장 바람직하게는 약 1시간이다. 대기압보다 낮거나 높은 압력도 사용될 수 있지만, 보통 대기압에서 처리가 이루어진다. 본 발명의 바람직한 양태에 따라서 약 0.06%의 TNBP와 약 0.2%의 Triton X-100이 사용되는 경우, 약 1시간 동안 15℃ 내지 약 25℃에서 처리가 수행된다. 온도, 배양(접촉 시간) 및 압력의 증가는 사용되는 용매 및 세제의 사용적에 영향(적게 요구)을 주어 동일한 효과를 야기할 것으로 예상된다.
단백질 회수율은 세제-단백질 혼합방법에 따라 좌우된다. 세제(예: Triton X-100)를 최종 사람 면역 감마 글로불린과 혼합하는 방법은 S/D 처리 후 단백질 회수율에 영향을 준다. 희석되지 않은 세제를 단백질, 당해 경우에 사람 면역 감마 글로불린에 직접 가하는 경우, 단백질 회수율은 단지 80 내지 90%이다. 이러한 방법은 단백질-세제 결합을 일으키고 세제의 제거는 단백질의 동시 제거를 야기하는 것으로 이론화되어 있다. 보다 바람직한 방법은 위에서 언급한 S/D 농도를 이루기 위해서 10% 세제 용액(3% TNBP함유)을 단백질 용액에 가하고, 이로써 단백질 수율은 95% 이상이다.
재현탁된 침전물 II 물질(문헌[참조: Cohn et al., supra]의 콘-온클레이 냉 알콜 분획화 과정에 따라 얻어진 물질)(또는 다른 방법 또는 알콜 분획화, 침전 또는 친화성 크로마토그래피 등의 병용에 의해 정제된 혈장 유도체)에 가해지는 S/D의 양을 아는 것이 바이러스 불활성화 공정에서 중요하다. 제거 후 S/D의 잔류량이 약 10ppm 미만으로 측정될 수 있다는 것도 마찬가지로 중요하다. 생성물로 전달된 S/S의 양은 중량 및 용적 측정에 의해 측정할 수 있다. 폴리소르베이트 80 및 Triton X-10은 분광학적으로 및 HPLC을 통해 측정할 수 있고 TNBP는 가스 크로마토그래피로 측정할 수 있다[참조: Milwidsky, A., Analyst 1969; 94:377-86(폴리소르베이트 90의 경우); Karlsson, G. et al., J. Chromatography A 2002; Feb 8; 946 (1-2): 163-168 (Triton X-100의 경우); 및 Nellaiappan K. et al., J. Chromatography B Biomed Sci Appl.; 2001; Jun 5; 757(1): 181-189 (TNBP의 경우)].
일반적으로, 단백질 함유 조성물의 처리 후, S/D가 제거되지만, 본 발명의 방법을 사용하는 경우, 이러한 과정이 필요하지 않을 수 있다. 이는 S/D 의 농도가 비교적 낮기 때문이고 바이러스 불활성화제의 성질 및 단백질 함유 조성물(예: 혈액 제제 조성물)의 의도되는 추가 용도 및 처리에 따라 또한 좌우된다.
S/D 물질의 제거는 사람 면역 감마 글로불린의 바이러스 불활성화의 양태에 있어서 바람직하다. 통상적인 S/D 제거 방법으로는 C-19 컬럼으로 통과시키는 방법, S/D 또는 목적하는 혈액 제제 조성물을 보유하는 막을 통해 정용여과하는 방법, 및 크로마토그래피 지지체 또는 친화성 크로마토그래피 지지체에 S/D 또는 목적하는 혈액 제제 조성물을 흡착시키는 방법이 포함된다. 몇몇 추가 방법으로는 한외여과, 여과/흡착, 즉 규조토(즉 큐노 데리피드 플러스(Cuno Delipid Plus)) 및 흡착제로서 사용되고 예를 들면, 원심분리에 의해 조성물로부터 제거된 필터의 무정형 침전 실리카 Sipernat 50S를 함유하는 필터에 의한 여과/흡착이 있다.
바람직한 S/D 제거 방법은 흡착제를 사용하는 것이다. 두 가지 크로마토그래피 흡착제가 바람직하다. 가장 바람직한 제1 흡착제 SDR HyperD 용매-세제 제거 흡착제(Ciphergen Corporation, Fremont, CA)는 S/D 처리로부터 Triton X-100 및 TNBP를 제거하기 위해 특별히 제조된 3차원 가교결합된 소수성 중합체가 첨가된 실리카 비드이다. 제2의 암버크롬(Amberchrom) CG161C(제조원: Rohm and Hass, Philadelphia, PA)는 흡착제로서도 사용되고 역상 액체 크로마토그래피에서도 사용되는 디비닐벤젠 중합체 수지이다. 두 물질 모두를 사용한 결과는 매우 우수하다. 두 흡착제 모두는 10,000ppm의 Triton X-100과 3000ppm의 TNBP를 함유하는 S/D 처리된 RhoGAM®으로부터 Triton X-100과 TNBP의 양을 1ppm 미만의 수준으로 제거한다. 컬럼을 통한 유속 및 온도는 둘다 S/D 시약의 제거에 영향을 준다. 보다 낮은 유속 및 주위 온도(저온에 비해)는 파괴가 일어나기 전에 RhoGAM®으로부터 제거되는 S/D 시약의 양을 증가시킨다.
SDR Hyper D 컬럼은 S/D RhoGAM®의 중력 공급이 가능하기 때문에 바람직한 양태이지만, 연동 펌프를 사용하여 유속을 조절한다. 이러한 중력 공급 능력은 1회용 컬럼을 사용하여 다수의 샘플로부터 S/D 시약을 제거하는 단순한 방식을 개발하도록 하였다. 당해 방법은 바이러스 불활성화 연구에서 생물학적 유체로부터 S/D 시약을 제거하도록 하여 S/D 시약의 독성 효과를 제거하기 위해 샘플을 100 내지 1000배로 희석할 필요성을 없앴다. 이는 분석 감도를 2 내지 3log 증가시켰다.
확산 크로마토그래피 컬럼도 또한, 생성물을 불활성화하는데 사용된 용매/세제 시약과 함께 폴리소르베이트 80을 제거할 수 있는 것으로 결정되었다.
본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 바이러스 불활성화를 RhoGAM® 또는 MICRhoGAM®로도 알려진 사람 면역 감마 글로불린에 대해 수행하는 경우, 처리 후 S/D의 제거는 바람직하게는 S/D 제거 흡착제를 사용하여 이루어진다. 위에서 논의된 바와 같이, 바람직한 흡착제는 기공 용적이 3차원 가교결합된 소수성 중합체로 충전된 실리카 비드로 이루어진다. 이러한 물질의 컬럼에 노출된 후 관찰되는 잔류 S/D의 양(ppm)은 적다. SDR Hyper D 컬럼(Ciphergen)은 1회용 흡착제로서 사용되거나 S/D의 제거에 의해 재조건화/재생될 수 있다. 흡착제를 사용하여 S/D를 제거한 후, 글로불린 용액을 바이오맥스 50 필터(Millipore Corporation)에 통과시켜 완충액을 최종 제형으로 교환한다(도 1 참조)
본 발명의 방법은 비-지질 외피 바이러스에 대한 불활성화 방법을 포함하여 기타 방식의 바이러스 불활성화 방법(예: 혈액 제제 조성물의 가열)과 결합될 수 있다.
본 명세서에는 바이러스로 스파이크되고 1.0% 미만의 Triton X-100과 0.3% 미만의 트리-n-부틸-포스페이트(TNBP) 내지 약 0.005% Triton X-100과 약 0.0015% TNBP 범위의 농도로 1/2000 제조 규모에서 용매-세제 처리된, 나노여과 방법 후(제조 후) 수득된 혈액 제제 물질의 샘플에 대한 데이타가 기재되어 있다. 각각의 처리된 샘플의 분취량을 처리 동안 다양한 간격으로 제거하고 희석시켜 불활성화를 중단시키거나 용매-세제 흡착제 컬럼(SDR HyperD 용매-세제 제거 흡착제(Ciphergen Biosystems))을 통과시킨다. 바이러스 역가는 TCID50(당해 분야에서 다수의 세포 배양 마이크로플레이트 웰 또는 시험관의 50%를 감염시키는 특정된 현탁액 용적 속의 바이러스의 양으로 간주된다; TCID50 또는 조직 배양물 감염량(Tissue Culture Infectious Dose) 50으로 불린다)의 표준 방법에 의해 측정된다.
특히, S/D 불활성화 단계가, 예를 들면, 공급원 혈장[참조: Piet MPJ, et al., Transfusion 1990; 30: 591-598] 또는 공정 중간체에 대해 제조 전 또는 개시시에 수행되는 반면 바이러스를 제거하는 크기 배제 단계가 공정 말기에 수행[참조: Van Holten RW, et al., Vox Sang 2002; 9; 24-37]되는 선행 기술 방법과 대조적으로, 이러한 순서로 S/D 바이러스 불활성화 단계가 위치하는 것은 역사적 이유일 수 있고 최적이 아닐 수 있다. 본 발명에서, S/D 단계의 위치는 접선 유동 나노여과에 의한 바이러스 제거 후 제조 공정의 말기(제조 후)로 이동된다.
위에서 기재한 용액 및 조성물은 본 발명의 방법을 사용함으로써 B형 및 C형 간염 바이러스와 같은 바이러스의 4log보다 큰 바이러스 불활성화도로 적합한 단백질 수율, 예를 들면, 약 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 98 내지 100%가 되도록 정제할 수 있다.
바이러스 불활성화도가 바이러스의 4log보다 크고 단백질 활성 수율이 약 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 98 내지 100%로 되도록, B형 및 C형 간염 바이러스와 같은 지질 외피 바이러스를 실질적으로 함유하지 않는 분획화된 사람 면역 감마 글로불린이 본 발명에서 바람직한 것으로 고려된다
본 발명의 방법으로 처리된 성분의 단백질 활성은 단백질 활성을 측정하기 위해 당해 기술분야에 잘 알려진 표준 방법으로 측정될 수 있다.
본 발명의 용매-세제 처리는 이전에 보고된 것보다 상당히 낮은 용매 및 세제의 농도에서 유효한 것으로 밝혀졌다. 특히, 확실한 바이러스 불활성화를 위해 필요한 용매 및 세제의 농도는 종래에 사용된 것보다 상당히 낮을 수 있다. 생성물 순도 및 방해 물질(즉, 지질)의 부재가 바이러스 불활성화 반응속도론에 영향을 줄 수 있다. 용매 및 세제의 양의 감소는 수율 증가 및 공정 비용 감소 가능성과 함께 불활성화 후 이의 제거 효율을 증가시킨다.
제조 공정의 말기(및 특히 바람직한 양태에서, 접선 유동 나노여과에 의한 바이러스 제거 후)에 가까운 S/D 단계의 배치는 다음과 같은 이점이 있다:
1. 생성물이 정제 공정의 최종 단계에 명확하고 균일하여 사용될 S/D의 양을 감소시킨다;
2. 감소된 용적으로 인해 S/D의 제거가 보다 효율적으로 이루어질 수 있다;
3. S/D 처리 전에 나노여과에 의해 바이러스 부하량을 제거하므로 최종 생성물 중의 바이러스 파편의 잔류 가능성이 적어져서 양성 바이러스 PCR 분석 가능성을 감소시킨다.
혈액 제제를 처리할 때 S/D 혼합물에 지질을 도입한 결과, 시험 바이러스인 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 및 웨스트 나일 바이러스에 대한 바이러스 불활성화가 억제된다. 이러한 관찰은 혈장의 S/D 처리(공정 개시시)가 낮은 농도의 시약을 사용하여 관찰되는 효과와 동일한 효과를 얻는데 보다 긴 시간이 걸리고 증가된 S/D 농도가 요구되고, 혈장의 처리가 인자 VIII와 같은 혈장 정제된 생성물에 대해 사용되는 것보다 높은 용매 농도에서 일반적으로 수행되는 이유를 부분적으로 설명할 수 있다[참조: Horowitz, B. et al., Blood, Vol 79(3) 1992 pp 826-831].
제조 후(예를 들면, 크기 배제 여과를 통해 정제한 후) 생성물을 처리하는 능력은 컬럼으로 도입되는 단백질을 감소시킨다. 이는 제조업자가 세제를 제거하는데 사용되는 컬럼의 재생을 확인할 수 없는 경우에 중요하다.
생성물을 S/D 처리 전에 크기 배제 필터로 통과시키는 경우, 핵산 시험에 의한 바이러스 파편을 검출할 기회가 적다고 결론짓는 것이 또한 합리적이다. S/D 또는 저온살균은 시험된 바이러스의 감염성을 파괴하지만, PCR 역가에 영향을 주지 않을 것이다[참조: Hilfenhause, J. et al., Transfusion, Vol. 37, September 1997, pp 935-940].
용매/세제 처리의 용매 부분이 외피 바이러스의 바이러스 불활성화 반응속도론을 희생시키지 않고 100배 감소될 수 있다는 것은 놀랍다. S/D 처리가 (혼주 혈장과 같은 비균질 시스템에서) 제조 공정 개시시에 수행되는 본 발명의 양태에서, TNBP 및 Triton X-100의 양은 보다 높고 배양 시간은 항상 바이러스 수 또는 혈장의 지질 함량과 같은 변수를 참작하여 충분하도록 하는 것이 현명하다. 용매/세제 처리 전에 에어로실(Aerosil) 380(Degussa AG, Dusseldorf, Germany)로 혈장을 예비처리함으로써 바이러스 불활성화를 향성시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
분획화/정제 공정보다 앞선 용매-세제 처리 단계의 배치는 하나 이상의 제조 단계가 이미 적소에 용매-세제 화학물질을 제거한 경우에 유리하다. 표적 단백질이 크로마토그래피 수지에 흡착되는 경우, TNBP 및 세제를 다른 오염원과 함께 컬럼에 통과시킨 다음, 세척하고 이어서 표적 단백질을 용출시킨다. 그러나, 본원에서 사용되는 바람직한 SDR Hyper D 흡착제와 같이 TNBP와 세제 둘 다를 동시에 효율적으로 제거할 수 있는 특정 흡착제를 사용하는 경우, S/D 단계는 제조 공정 어디에서든 수행될 수 있다.
S/D 처리 단계가 공정 말기에 위치하는 것은 처리될 정제된 단백질의 용적이 상당히 감소되어야 하기 때문에 TNBP와 세제가 적게 필요하다는 잇점이 있다. 이는 또한 S/D 화학물질을 제거하는데 필요한 흡착제의 양의 비례적으로 감소시킨다. TNBP에 대한 노출은 감소될 것이다. 이러한 경우, 전체 항-D 면역 글로불린의 실제규모 롯트 40L은 900L의 출발 혼주 혈장을 처리하는데 사용되는 S/D 화학물질의 양의 1/20 미만을 요한다.
바이러스 불활성화 단계를 제조 공정 말기에 위치시킴으로써 얻어지는 S/D의 감소 이외에, 본 발명은 감소된 용적의 TNBP와 Triton X-100에 의한 바이러스 불활성화 반응속도론을 평가한다.
본원에 기재된 데이타는 BVDV 및 PRV를 사용한 초기 시행이 1.0%의 Triton X-100과 0.3%의 TNBP의 표준 농도의 1/50 정도로 낮은 Triton X-100과 TNBP의 희석액이 검출 한계치까지 바이러스를 불활성화하는데 충분하다는 것을 나타냈을 보여준다. 데이타는 또한 불활성화가 신속하게 일어나고 임의의 소정의 샘플에 대해 발생한 실질적으로 모든 불활성화가 초기 2분 이내에 일어나고 이러한 시간 간격한을 초과한 추가의 불활성화가 필요없음을 보여준다(도 3 내지 6).
실리카 확산 흡착제 SDR Hyper D 용매-세제 제거 흡착제(Ciphergen)는 S/D 처리된 물질로부터 Triton X-100과 TNBP 둘다를 제거하는 효율적인 수단이다. S/D의 존재없이 바이러스 역가에 대한 SDR HyperD의 효과를 바이러스 스파이크된 샘플을 표준 농도의 Triton X-100 및 TNBP를 제거하는데 사용되는 것보다 낮은 비율의 SDR Hyper D의 컬럼에 통과시켜 측정한다. 표준 용적보다 낮은 용적을 사용하는 것은 샘플로부터의 바이러스 제거를 역설한다. BVDV에서는 현저한 감소가 없었고(도 3 및 5) PRV에서는 대략 1-log 감소했다(도 4). 이러한 PRV 손실은 대형 PRV(120 내지 200nm)에 기인할 가능성이 있고 이로 인해 흡착제에 보유될 수 있고, 비교적 작은 BVDV(50 내지70nm)는 보유되지 않는다. 본 발명자들은 15℃에서의 배양 시간이 PRV 제거율에 있어서 결정적인 인자임을 또한 관찰하였다.
제1 시행이 시험될 가장 낮은 S/D 희석액(1/50)에 대한 불활성화를 보여주었기 때문에, BVDV 및 PRV를 사용한 제2 세트의 시행에서는 추가의 S/D 희석액(1/100 및 1/200)을 평가한다. S/D 후 처리된 샘플을 1회용 SDR Hyper D 컬럼에 통과시켜 S/D 화학물질을 제거한다. 당해 컬럼 처리는 시험될 샘플을 완충액 속에 1/100으로 희석시키지 않고 오히려 바이러스 분석 감도를 향상시킨다. BVDV 분석의 감도는 2-3 log 증가(도 6)하고 PRV 분석은 1log 증가된다. PRV의 경우 예상된 2-3log가 아닌 1log 증가는 SDR Hyper D에 기인하는 1log 감소와 일관된다. 1/100 및 1/200 S/D 처리 둘다는 불완전한 불활성화를 제공한다. 또한, 첫번째 시행에서 검출 한계치까지 BVDV 불활성화를 보여준 1/50 S/D 희석액이 현재는 분석 감도 증가와 함께 불완전한 불활성화를 보여주었다(도 5). PRV는 계속해서 1/50 희석액에서 검출 한계치까지의 완전한 불활성화를 보여준다.
바이러스 오염을 예비여과에 의해 조절하여, 당해 흡착제 공정을 최적화할 수 있다. 공정 비용 및 시간은 시약을 적게 가하고 배양시간을 감소시키고 시약을 제거하는데 필요한 수지의 양을 감소시킴으로써 감소시킬 수 있다.
감소된 시약 농도 및 덜 엄격한 배양 조건에서의 처리의 확실성은 S/D 환경에서의 초기 배양 후 제2 바이러스 스파이크를 수행함으로써 시험하였다. 이러한 이중 시험은 감소된 S/D 및 배양 시간에서도 처리가 확실함을 강화한다(표 2 및 실시예 2 참조).
BVDV 스파이크된 RhoGAM의 용매/세제 처리[0.2× S/D(0.2% Triton X-100, 0.06% TNBP)
샘플 바이러스 부하량(Log10 TCID50)
스파이크된 부하량 7.83
보유 대조군 I 6.19
보유 대조군 II 5.87
S/D T=0분 2.64
S/D T=10분 2.64
S/D T=60분 2.64
S/D 처리된 RhoGAM로 재스파이크됨 7.83
재스파이크한지 10분 후 1.69
보통 0.3% TNBP 및 1.0% Triton X-100보다 50배 덜 농축된 S/D 농도는 비교적 단시간에 걸쳐 상당한 불활성화를 일으킨다.
최근 몇년 사이 미국 대륙에서 웨스트 나일 바이러스의 출현 증가[참조: Biggerstaff et al., Transfusion 42, August 2002 pg 1019-1026]의 결과로, 바이러스 WNV 및 BDVD 둘다에 대한 S/D의 효과를 비교했다. BVDV 및 웨스트 나일 바이러스가 이들의 생리화학적 특성에 있어서 매우 유사하다는 다른 조사자의 결과[참조: Remington K. M. et al., Vox Sang. 2004 Jul; 87(1) 10-18]를 확인했다. 이러한 유사성은 두 바이러스 모두의 불활성화 반응속도론 프로파일을 비교함으로써 관찰될 수 있다(도 3 내지 6 비교). 불활성화에 요구되는 시간 및 S/D 농도에서의 유사성이 관찰된다.
본원 전체에 걸쳐 각종 특허 및 논문이 인용된다. 이의 내용은 본원에 기재되고 청구된 발명 현재 당해 기술분야의 숙련인에게 알려진 기술을 보다 완전히 기재하기 위해서 본원에 참고로 인용된다.
다음 실시예는 예시하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예
실시예 1
한외여과에 의해 바이러스 제거된 RhoGAM®의 제조를 다음과 같이 변형된 미국 특허 제6,096,872호에서와 같이 진행시킨다.
변형된 콘의 정제 방법을 사용하여 단계 "침전물 II 페이스트"로 정제된 Rho(D) 면역 글로불린 6.802kg을 4℃로 냉각된 주사용수(WFI), U.S.P. 20.406L에 재현탁시킨다. 혼합물을 4시간 동안 (발포없이) 볼텍싱시키고 추가로 사용할 때까지 4℃에서 저장한다.
SIP 과정 후, 재현탁된 침전물 II 대략 27.208L에 대한 비레솔브-180R 모듈(Millopore Corporation)(20 스텍)을 설치한다. 2개의 바이오맥스-50 카세트를 펠리콘 CIP/SIP 모듈의 적절한 위치에 설치한다. 비레솔브-180 모듈을 위에서 기재한 바와 같이 염수로 살균한 후 세정한다. 바이오맥스-50 막을 WFI, U.S.P.로 플러싱한다. 벤잘코늄 클로라이드(Roccal)의 측정을 최종 투과된 플러싱 샘플에 대해 수행하는데, 벤잘코늄 클로라이드 함량은 8ppm이다. 확산 시험을 바이오맥스-50 카세트에서 수행하며, 총 방출된 용적은 5분 내에 22cc로 계산되고 실제 방출 속도는 4.4cc/분이다.
비레솔브-180을 사용한 바이러스 제거 한외여과를 50mM NaCl 글리신 완충액 245L에서 수행한다. 바이러스 제거 재순환 탱크(T-1)(5)를 50mM NaCl-글리신 완충액으로 충전시킨다. 완충액 투과물을 앞서 살균된 50mM NaCl-글리신 완충액 저장 탱크(오프-라인)에 수집하면서 완충액을 T-1(5)에서 제순환시킨다. 수집된 투과 완충액의 용적은 213L이다. 바이러스 제거된 완충액을 63 내지 78℉의 주위 온도에서 저장한다.
150mM NaCl-글리신 완충액(제조를 위한 실시예 1A 참조)을, 완충액 공급 탱크를 바이러스 제거 재순환 탱크(T-1)에 부착하여 플러싱한다. T-1을 150mM NaCl-글리신 완충액 60L로 충전시켜 플러싱한다.
침전물 II 재현탁액을 다음과 같이 처리한다. 침전물 II(6.802kg)를 완전히 헌탁될 때까지 55분 동안 발포없이 볼텍싱하는 속도로 혼합한다. 굴절률에 의한 단백질%(단백질 mg/ml)를 핸드헬드 함수율측정기를 사용하여 침전물 II 재현탁액에서 측정하고, 그 결과는 59mg/ml이다.
5.0mg/ml의 단백질 농도를 달성하는데 필요한 희석된 침전물 II의 필요 용적을 다음 식을 사용하여 계산한다:
Figure 112005066252954-PAT00014
또는
Figure 112005066252954-PAT00015
150mM NaCl 글리신 완충액의 필요 용적은 다음 식을 사용하여 계산된다:
Figure 112005066252954-PAT00016
; 또는
Figure 112005066252954-PAT00017
.
단백질 농도는 약 5.9%이다.
완충액(293.846L)을 희석된 침전물 II 27.208L에 가하고 30분 동안 발포없이 와류를 생성하기에 충분한 속도로 혼합한다.
바이러스 제거 재순환 탱크를 희석된 침전물 II 107L로 충전시킨다. 바이러스 제거 재순환 탱크(펌프 1)를 20 스택 비레솔브-80 모듈이 사용되는 경우 80%의 공급 펌프의 속도에서 개시한다. 바이러스 제거 투과물 펄프 유속(펌프 2)을 20 스택 모듈의 경우 0.91LPM(20%)으로 증가시켜 초기 막간 차압(TMP)을 1.6psi 미만으로 유지시킨다. 유지되는 실제 압력은 1.2psi이다. 생성물 펌프 속도(펌프 3)를 균일한 조절 속도로 조정한다. TMP는 바이러스 제거 재순환 탱크의 보유물 측면에서 단백질 농도를 모니터링함으로써 공정 전반에 걸쳐 3.0psi 미만으로 유지시킨다. 직렬식 UV 모니터를 관찰하고 단백질 함량 4.5 내지 5.5mg/ml에서의 단백질 함량에 상응하는 흡광도 단위 6.4 내지 7.7의 범위에서 유지시킨다.
바이러스 제거 탱크로부터 얻어진 투과물 대략 75L를 한외여과 탱크(UF)에 충전시킨 후, 한외여과 공급 펌프(펌프 5)를 10%에서 작동시킨다. 펌프 속도를 UF 투과물 유속이 바이러스 제거 투과물 유속과 동일해질 때까지(25%까지) 증가시킨 후, 25%에서 설정하여 용적을 유지시킨다. UF 투과물 유속은 0.91LPM이고 VC 투과물 유속은 0.91LPM이다. 유지되는 UF 탱크 일정 용적은 152L이다. UF 공급 압력은 4.0psi이고 UF 투과물 압력은 0.1psi이며 UF 보유물 압력은 0.7psi이다.
탱크가 약 15 내지 20L를 함유하면, 일정 용적 정용여과를 T-1에서 수행한다. 정용여과는 150mM NaCl 글리신 완충액의 최소 3회 완충액 교환하면서(총 용적 약 60L) 유지한다. 정용여과가 완료된 경우, 바이러스 제거 탱크 펌프 및 혼합기를 끈다. 유지되는 VC 재순환 탱크 일정 용적은 15L이다. 교환된 총 완충액 용적은 45L이다.
T-2 속의 벌크를 재순환시켜 50mM NaCl-글리신 완충액의 바이러스 제거된 롯트와 함께 T-2-에서 일정 용적 정용여과에 의해 농축시킨다. 이로써 벌크가 재현탁된 침전물 II의 대략적 초기 용적으로 농축된다. 투과물 밸브를 완전히 개방하고, UF 공급물 펌프 속도는 70%이며, 공급 압력은 30psi 미만이고, 보유물 루프(loop)에 역압을 가함으로써 압력 편차를 14 내지 17psi로 유지한다. 유지되는 UF 일정 컬럼은 22L이고, 교환된 총 완충액 용적은 121.2L이다. 샘플을 T-2로부터 꺼내어 UF 투과물 샘플에 대해 디지탈 비전도도 측정을 수행한다. 결과는 5.47×10-3mhos/cm이다. 용적 수준이 충족되면, UF 투과물을 차단하고 벌크를 재순환에 의해 혼합하여 샘플 10.5ml를 무균적으로 제거한다. 단백질%를 샘플 분취액 0.5ml에서핸드 헬드 함수율측정기를 사용하여 굴절률에 의해 측정한다. 단백질 농도는 7.9%이다.
T-2로부터의 벌크를 임시 벌크 용기에서 제거하고 전체 용기를 칭량한다(총중량). 벌크를 T-2로 반송하고, 빈 임시 벌크 용기를 칭량한다:
Figure 112005066252954-PAT00018
; 또는
Figure 112005066252954-PAT00019
5% 단백질 함량을 달성하는데 필요한 벌크의 최종 용적을 다음과 같이 계산한다:
Figure 112005066252954-PAT00020
; 또는
Figure 112005066252954-PAT00021
.
먼저 0.9% NaCl로 분취액을 1:10으로 희석하여 잔류 샘플 분취액의 초기 pH를 측정하고, 0.5N HCl 또는 0.5N NaOH의 1:100 희석액으로 pH 6.3 내지 6.4로 적정한다.
pH를 조정하기 위해서, 0.9% NaCl 속의 0.5N HCl 적정액 1.35ml를 가하고, 최종 pH는 6.35이다. 조정이 필요한 경우, 벌크의 pH를 조정하는데 필요한 희석되지 않은 0.5N 시약의 양을 다음과 같이 계산한다:
Figure 112005066252954-PAT00022
; 또는
Figure 112005066252954-PAT00023
보전성 시험을 비레솔브-180 필터 모듈에서 허용되는 방법에 따라서 수행한다. 보전성 시험값은 1.2 이상이어야 하고, 모듈은 위에서 기재한 바와 같이 염소로 살균되고 세정되어야 한다.
벌크를, 바이러스 제거된 50mM NaCl-글리신 완충액 0.801L를 사용하여 계산된 필요 최종 용적으로 조정하고 10분 동안 혼합한다.
벌크 생성물 분취액 10.5ml를 pH 측정을 위해 무균적으로 제거한다. pH는 6.3 내지 6.4이어야 한다. 두 시약에 대한 실제 pH 판독치는 6.38 및 6.345이다.
최종 단백질 생성물은 다음과 같은 허용 기준을 충족시킨다:
단백질 = 5.3%;
pH = 위에서 기재한 바와 같음;
가스 크로마토그래피로 측정된 메탄올 함량은 53.9ppm이고; 폴리소르베이트 80은 두 시험에서 101.7ppm 및 102.2ppm이고, 평균은 101.9ppm이다.
실시예 1A
실시예 1에서 사용되는 150mM NaCl-글리신 완충액은 다음과 같이 제조된다.
제조할 완충액의 적당량을 다음과 같이 계산한다:
[재현탁된 페이스트 용적(L) × 10L] × 2 + 60 = 제조할 완충액의 근사 용적
[27.208L ×10L] ×2 + 60 = 제조할 완충액 604.16L
필요한 물질의 양을 결정하고 보정된 발열원 제거된 용기에 맞춘다.
물질 필요 농도 ×롯트 크기 = 필요량
NaCl 8.87g/L 604.16L 5,358.90g
아미노아세트산 15.01g/L 604.16L 9,068.44g
폴리소르베이트 80 0.02g/L 604.16L 12.08g
폴리소르베이트 칭량 용기를 주사용수 전체 약 2L로 수회 세정히고 각각의 세정 분취액을 뱃치에 가하고 604L가 되도록 한다. 다음 물질의 양을 측정한다.
물질 필요 농도 ×롯트 크기 = 필요량
1.0N NaOH 0.125ml/L 604.16L 75.52ml
혼합물을 주사용수로 용적까지 희석시키고 최종량을 60분 동안 혼합한다. pH를 측정하고; 요건은 6.3 내지 6.5이다. pH는 6.38이다. 상기 요건이 충족되지 않은 경우, 요구되는 pH가 얻어질 때까지 1.0N HCl 또는 1.0N NaOH를 가할 필요가 있으며, 용액을 각각 첨가한 후 15 내지 30분 동안 혼합하여 pH 측정을 확인한다.
디지탈 비전도도 측정을 수행하는데, 25℃에서의 요건은 14.15 내지 15.59×10-3mhos/cm이다. 결과는 15.18×10-3mhos/cm이다. 당해 요건이 충족되지 않은 경우, 당해 시약을 버리고 신선한 시약을 제조해야 한다.
폴리소르베이트 80 측정을 수행하는데, 시험 샘플은 폴리소르베이트 80 15 내지 24ppm이어야 한다. 측정된 농도는 19.5ppm이다.
실시예 2
S/D 및 흡착제를 사용한 RhoGAM®에서의 바이러스 불활성화
UF 가능성 연구
물질 및 방법
항-D 면역 글로불린
전면적으로 변형된 콘-온클레이 분획화[참조: 미국 특허 제6,096,872호 및 본원의 실시예 1 및 1A] 후, 비레솔브 180 크기 배제 필터를 사용하여 나노여과하여 RhoGAM® 한외여과된 Rho(D) 면역 글로불린(사람)(Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, NJ)을 제조한다. 당해 물질은 사용할 때까지 2 내지 8℃에서 멸균 조건 하에 저장한다.
바이러스 제제
바이러스를 면역글로불린으로 스파이크하기 전에 적정된 스톡 배양물로서 제조한다. 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV), 가성광견병 바이러스(PRV) 및 웨스트 나일 바이러스(MNV)(균주 NIAID V-554-110-522, ATCC, Manassas, VA)에 대한 스톡 배양물을 산업 표준 작업 과정에 따라서 제조한다.
오르토 클리니컬-디아그노스틱스 방법(Ortho Clinical-Diagnostics process)으로 수집된 샘플에 대한 TCID50 분석을 수행하기 전에 플레이트에 베로 세포(vero cell)를 접종한다. 시험 샘플을 순차적으로 희석하고 8, 80 또는 800개의 복제 웰에 웰당 50㎕로 접종한다. 음성 대조군을 8개의 복제 웰에 웰당 50㎕로 접종한다. 양성 대조군인, 스파이크 물질과 동일한 수의 스톡 바이러스를 순차적으로 희석하고 각각의 희석액을 8개의 복제 웰에 웰당 50㎕로 접종한다. 접종 후 5일째 세포병변 효과(CPE)에 대한 배양물의 관찰내용을 사용하여 바이러스 역가를 측정한다. 유효 시험에 대한 기준은 음성 대조군 배양물이 바이러스 유도된 CPE의 부재를 나타내야 함을 포함한다. 양성 대조군 배양물은 바이러스 유도된 CPE의 존재를 나타내야 한다. 양성 대조군의 바이러스 역가는 보정된 바이러스 역가의 ±1.0log 이내이어야 한다.
용매-세제 흡착제
용매-세제 흡착제를 사용하여 S/D 처리된 샘플 일부로부터 Triton X-100 및 TNBP를 제거한다. 각각의 샘플에 있어서, 재현탁된 SDR HyperD 용매-세제 제거 흡착제(Ciphergen Biosystems, Fremont, CA)의 분취액 1.0ml를 3mL 본드 용출 저장기(Bond Elut Reservoir; Varian Inc., Palo Alto, CA)에 가한다. SDR Hyper D를 50mM NaCl-글리신 완충액 4ml로 세척한다. S/D 처리된 샘플 2ml를 저장기에 가하고 약 5분 동안 SDR HyperD를 통해 중력 공급되도록 한 후, 50mM NaCl-글리신 완충액 1.0ml로 세척한다. 샘플 및 완충액 세척액을 수집하고 표준 TCID50 방법을 사용하여 바이러스에 대해 분석한다. 저장기는 사용 후 폐기한다. IgG의 S/D 처리의 흐름도인 도 1을 참조한다. IgG의 S/D 처리 방법은 실시예 4에 기재된다.
용매-세제 처리
S/D 모액 제조
S/D 시약을 10% 세제와 3% TNBP를 함유하는 모액으로서 제조하고, 상기 모액의 일부를 처리될 물질 9부에 가하여 1% 세제와 0.3% TNBP의 최종 농도를 얻는다. 모액은 세제(Triton X-100) 10.0g을 50mM NaCl-글리신 완충액(이는 최종 사람 면역 감마 글로불린(RhoGAM® 또는 MICRhoGAM®) 제형에 사용되는 완충액이다; 미국 특허 제6,046,872호 및 본원 실시예 1을 참조한다) 대략 70ml에 가함으로써 제조된다. 완충액 속의 점성 세제를 용해시키기 위해서는 상당히 격렬한 교반이 요구된다. 용해되면, TNBP 3.0g을 대략 10분에 걸쳐 서서히 가하고 다시 상당히 격렬하게 교반한다. S/D 모액을 제조하여 실온에서 저장하고, 사용전에 혼합한다. 당해 용액은 세제의 구름점(cloud point)으로 인해 다소 탁하게 보일 수 있다.
10% Triton X-100(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)과 3% 트리스-n-부틸 포스페이트(TNBP)(Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI)의 모액 및 1% Triton X-100과 0.3% TNBP의 모액을 50mM NaCl-글리신 완충액(pH 6.4) 속에서 제조한다. 용액을 사용할 때까지 15 내지 30℃에서 저장한다.
1/2000 제조 규모로 용매-세제 처리를 수행한다. 바이러스를 1:20의 비로 면역 글로불린에 스파이크한다. 바이러스 스파이크된 면역글로불린의 분취액 20ml를 15C℃로 평형화하고 용매-세제 용액(2.0ml)을 격렬히 교반하면서 서서히 가한다. 7가지 농도의 S/D를 평가하고 분취액을 바이러스 분석을 위한 다양한 간격으로 제거한다. 바이러스 스파이크된 IgG 샘플에 대한 바이러스 불활성화 방법의 흐름도인 도 8을 참조한다.
3가지 독립된 바이러스 불활성화 시험(시험 1, 시험 2 및 시험 3)을 각각 2 또는 3회 수행한다.
시험 1
시험 1(도 3 및 4 참조)에서는, 표준 농도의 S/D (1.0% Triton X-100, 0.3% TNBP) 및 표준 농도의 1:10, 1:30 및 1:50 수준의 S/D를 사용하여 BVDV 및 PRV를 시험한다. 바이러스를 용매/세제없이 1:20의 희석율로 샘플에 스파이크한다. 2회 시행에 필요한 부하 물질과 바이러스의 총 용적은 각각 125ml 및 6.6ml이다. 각 경우에 바이러스 부하량은 7log이다. 모든 농도에 대해 S/D 첨가 직후 및 60분 후, 1:10 및 1:30 농도에 대해서는 10, 20, 30 및 180분 후에 2.0ml 분취액을 수득한다. 이 시간 동안 시험 샘플은 5℃에서 유지시킨다. 또한, S/D 처리되지 않은 샘플을 SDR HyperD 컬럼에 통과시켜 수지가 바이러스 역가에 영향을 미쳤는지를 측정한다. 모든 샘플을 즉시 완충액 속에 1:100으로 희석시킨다[도 4(BVDV) 및 도 5(PRV) 참조].
시험 2
시험 2에서는, 표준 농도의 S/D 및 표준 농도의 1:10, 1:50, 1:100 및 1:200 수준의 S/D를 사용하여 BVDV 및 PRV를 시험한다. 모든 농도에 대해 S/D 첨가 직후 및 10분 후, 1:50 농도에 대해서는 20분 후, 및 1:100 및 1:200 농도에 대해서는 20분 및 60분 후에 2.0ml의 분취액을 수득한다. 배양 동안 샘플은 25℃에서 유지된다. 두 가지 샘플 2.0ml를 각각의 시험 간격으로 수득한다. 하나의 샘플은 즉시 완충액 속에 1:100으로 희석한다. 또 다른 분취액 2.0ml는 즉시 SDR HyperD 컬럼에 통과시킨다[도 5(BVDV) 참조].
시험 3
시험 3에서는, 표준 농도의 1:10, 1:20 및 1:50 수준의 S/D를 사용하여 BVDV 를 시험한다. 표준 농도의 S/D 및 표준 농도의 1:10, 1:20, 1:50, 1:100 및 1:200 수준의 S/D를 사용하여 WNV를 시험한다. 모든 농도에 대해 S/D 첨가 직후 및 10분 후, 1:20 및 1:50 농도에 대해서는 20분 후, 및 1:100 및 1:200 농도에 대해서는 20분 및 60분 후에 2.0ml씩 분취한다. 배양 동안 샘플은 15℃에서 유지된다. 두 가지 샘플을 각각의 시험 간격으로 수득한다. 하나의 샘플은 완충액 속에서 1:100으로 즉시 희석한다. 또 다른 분취액 2.0ml는 즉시 SDR HyperD 컬럼으로 통과시킨다.
결과
가성광견병 바이러스(PRV) 및 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)에 대한 초기 연구(표 5 참조)는 표준 농도의 S/D 뿐만 아니라 표준 농도의 1:10, 1:30 및 1:50 수준의 S/D 농도로도 두 바이러스 모두를 검출 한계치까지 불활성화시킴을 보여준다. 당해 실험에서 시행된 대조군들 중 하나는 SDR HyperD 컬럼에 통과된 바이러스 스파이크된 샘플(S/D 비처리)이다. 데이타(제시하지 않음)는 SDR HyperD가 BVDV의 역가에 대한 효과가 없음을 나타낸다.
시험 2에서, BVDV는 표준 농도 및 1:10 수준의 S/D를 사용해서 검출 한계치까지 불활성화된다. 1:50 S/D 샘플은 4.63log 감소를 나타내지만 이는 검출 한계치는 아니다. PRV는 표준 S/D 농도 뿐만 아니라 1:10 및 1:50의 S/D 수준에 의해 검출 한계치까지 불활성화된다.
시험 3은 1:20 수준의 S/D에 대해 검출 한계치까지의 BVDV의 불활성화를 보이고 1:50 수준의 S/D에 대해 4.69log 감소를 보임으로써, 시험 2의 결과에 근접하게 일치한다. 1:10 수준의 S/D는 놀랍게도 검출 한계치까지의 불활성화를 보이지 않았다. WNV는 표준 S/D 농도 뿐만 아니라 1:10 및 1:20의 S/D 수준에 의해 검출 한계치까지 불활성화된다. 모든 시험은 2 또는 3회 수행하였다.
Figure 112005066252954-PAT00024
추가 조사에서, 표 6에 기재된 다음 최종 농도의 S/D 시약이 RhoGAM®에서 평가되었다.
Triton X-100 (ppm) TNBP (ppm)
표준 농도 (1.0X) 10,000 3000
1:10 농도 (0.10X) 1000 300
1:20 농도 (0.05X) 500 150
1:50 농도 (0.02X) 200 60
1:100 농도 (0.01X) 100 30
1:200 농도 (0.005X) 50 15
시험 1로부터의 데이타(도 3, 도 4 및 표 6 참조)는 표준 농도의 S/D 뿐만 아니라 1:10 농도의 S/D가 첨가한지 2분 이내에 BVDV 및 PRV 둘다를 검출 한계치까지 불활성화시키는데 효과적임을 보여준다. 또한, 1:50 농도의 경우, PRV는 10분 이내에 검출 한계치까지 감소되지만 불활성화된 BVDV의 양은 더 높은 농도의 S/D를 사용하는 경우만큼 많지 않다. 시험 2에서(도 5, 도 6 및 표 6 참조), BVDV에 대해 1:10 및 1:50 농도의 S/D를 사용하여 반복 시행하고 1:20 농도의 S/D를 가한다. 당해 데이타는 1:10 농도에서의 완전한 불활성화를 확인시키고 1:20 농도에서의 완전한 불활성화도 보여준다. 시험 1에서와 같이, 1:50 농도는 불완전한 불활성화를 제공한다. WNV 데이타는 1:10 및 1:20 농도가 2분 이내에 완전한 불활성화를 제공하는 유사한 결과를 보여준다.
데이타 그래프로부터 바이러스 불활성화는 모두 첨가한 지 초기 2분 이내에 일어나고 S/D에 대한 추가 노출로 인한 추가 감소는 없음을 알 수 있다. S/D 노출에 의해 본질적으로 영향을 받지 않는 바이러스 집단이 있는 것으로 여겨진다. 제2의 스파이크가 S/D 바이러스 혼합물에 가해지는 경우, 바이러스 부하량은 보다 많은 용매/세제의 첨가없이 다시 상당히 감소된다(위의 표 6 참조).
실시예 3
컬럼 능력 조사
SDR HyperD 흡착제의 Triton X-100과 TNBP 제거 능력을 조사하는 실험을 행한다. 당해 실험 결과는 용매 및 세제의 효과적인 제거에 필요한 물질의 대략적인 양을 측정할 수 있게 한다. 50mM NaCl/글리신 완충액 속의 10% Triton X-100/3.0% TNBP 15ml를 22℃에서 혼합하면서 RhoGAM® 벌크 생성물(실시예 4의 방법으로 수득) 135ml에 가한다. 첨가 속도는 1.5ml/분이다. 1시간 동안 혼합한 후, 145ml를 예비조건화된 SDR Hyper D 1x10cm 컬럼을 통해 1.0ml/분의 유속으로 펌핑한다. 컬럼으로부터 분취액(10ml)을 수집하고 Triton X-100과 TNBP에 대해 분석한다. 도 8에 도시된 바와 같이, Triton X-100 파괴는 70ml가 컬럼을 통과한 후 관찰된다. TNBP에 대한 파괴는 보이지 않는데, 이는 Triton X-100 농도가 흡착제 필요량을 계산하는데 중요한 매개변수임을 나타낸다.
실시예 4
S/D 처리를 이용한 RhoGAM® 제조 및 흡착제를 사용한 제거
전체 제조 규모의 약 1/8인 파일럿 롯트(pilot lot)를 제조한다. 제조 공정중의 RhoGAM®으로부터 IgG 침전물 II 대략 1.3kg을 얻는다. 페이스트를 2주 동안 -20℃에서 유지한 후 주사용수에 재현탁시키고 폴리소르베이트 80을 함유하는 고 염 완충액(150mM NaCl-글리신)으로 희석한다. 용매/세제 처리하기 전에 비레솔브 한외여과 및, 바이오맥스 50 필터를 통한 정용여과 및 벌크 농축에 의한 완충액 교환을 수행한다.
비레솔브 크기 배제 한외여과를 비레솔브 바이러스 제거 모듈 사용자 지침서 P36451 REV 4/02(공급원: Millipore Corporation)에 제공된 지시대로 장착된 2-1 sq. ft2 표준 면적 모듈에서 수행한다. 한외여과 공정은 전규모 시행(실시예 1 참조) 동안 사용된 조건과 유사한 조건하에 시행되고, 교차 유동 및 투과물 유동을 조정하여, 사용되는 모듈에서 보다 작은 크기의 막을 고려한다. 막간 차압(TMP)을 3psi 미만으로 유지시키고 시행 전체에 걸쳐 유사한 체질을 수행한다.
바이오맥스 50K(50kD) 막을 갖는 밀리포어 펠리콘 2 미니 시스템을 사용하여 바이러스 제거된 면역 글로불린을 3 내지 5L로 농축시킨 후, 50mM NaCl-글리신 완충액 4.5용적에 대해 정용여과한다. 3개의 0.1m2 밀리포어 바이오맥스 50 필터를 당해 작업동안 사용한다.
처리된 벌크의 온도는 용매/세제 처리 개시전에 21℃이다. 벌크를 혼합하면서, 10% Triton X-100/3.0% TNBP 모액을 연동 펌프에 의해 벌크에 가하여 최종 농도가 0.2% Triton X-100/0.06% TNBP가 되도록 한다. RhoGAM 벌크를 1시간 동안 혼합한 후, SDR 하이퍼-D 컬럼을 통해 펌핑하여 용매/세제를 제거한다. SDR Hyper D 컬럼에 통과시킨 후, 생성물을 50mM NaCl-글리신으로 3회 정용여과한 후, 대략 5%로 농축시킨다. 당해 컬럼은 또한 폴리소르베이트 80도 1ppm 미만으로 제거한다. 폴리소르베이트 80은 10분에 걸쳐 2000ppm 모액 속에서 펌핑함으로써 생성물 중에서 대체된다.
본 발명에 의해서, 상당히 감소된 농도의 용매 및 세제를 사용하는 혈액 제제의 바이러스 불활성화 방법으로써, 용매/세제 단계가 제제의 제조 후에 사용되고 지질 외피 바이러스의 불활성화도가 크고 혈액 제제 단백질의 수율이 높은, 실질적으로 바이러스를 함유하지 않는 멸균 제제 또는 조성물을 제조할 수 있도록 하는 방법이 제공된다.

Claims (43)

  1. 혈액 제제를 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 약 0.006% 내지 0.3% 미만의 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트 용매 및 약 0.01% 내지 1.0% 미만의 비이온성 세제와 접촉시킴을 포함하고, 혈액 제제 단백질의 수율이 90% 이상인, 바이러스 함유 혈액 제제 중의 바이러스 불활성화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트가 트리-n-부틸-포스페이트이고 비이온성 세제가 옥시에틸화 알킬페놀인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 옥시에틸화 알킬페놀이 Triton®인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 혈액 제제가 약 0.003% 내지 0.3% 미만의 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트 및 약 0.02% 내지 1.0% 미만의 비이온성 세제와 접촉되는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 혈액 제제가 약 0.06%의 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트 및 약 0.2%의 비이온성 세제와 접촉되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 혈액 제제가 전혈, 혈장, 또는 혈액 단백질을 함유하는 이 의 분획, 농축물 또는 유도체, 혈장 농축물, 혈액 성분, 불안정 단백질을 함유하는 혈장 함유 생성물 및 혈장 분획 함유 생성물, 면역 글로불린, 혈장 분획화로부터의 침전물, 혈장 분획화로부터의 상청액, 혈청, 동결침전물, 동결상청액, 세포 용해물, 및 모노클로날 및 폴리클로날 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, C-18 컬럼 통과, 막을 통한 정용여과, 크로마토그래피 지지체로의 흡착, 친화성 크로마토그래피 지지체로의 흡착, 한외여과, 여과 및 흡착, 및 흡착제 사용으로부터 선택된 방법으로 혈액 제제 단백질로부터 용매 및 세제를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 흡착제가 실리카 비드 흡착성 물질인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 혈액 제제가 면역글로불린인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 혈액을 용매 및 세제와 접촉시키기 전에 혈액 제제의 정제 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 정제가 여과, 직접 크기 배제 여과, 접선 크기 배제 여과, 심층 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 침전 친화성 크로마토그래피, 나노여과, 접선 유동 여과, 친화성 크로마토그래피, 전기영동 및 이들의 조합 기술로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 정제가 나노여과인 방법.
  13. 면역글로불린에 대해 나노여과를 수행하는 단계, 당해 면역글로불린을 약 0.06%의 트리-n-부틸-포스페이트 및 약 0.2%의 Triton®과 접촉시키는 단계 및 면역글로불린으로부터 트리-n-부틸-포스페이트 및 Triton®을 제거하는 단계를 포함하고, 면역글로불린의 수율이 약 90% 이상인, 바이러스 함유 면역글로불린 중의 바이러스 불활성화 방법.
  14. 제13항에 있어서, 트리-n-부틸-포스페이트 및 Triton®이 C-18 컬럼 통과, 막을 통한 정용여과, 크로마토그래피 지지체로의 흡착, 친화성 크로마토그래피 지지체로의 흡착, 한외여과, 여과 및 흡착, 및 흡착제 사용으로부터 선택된 방법에 의해 면역글로불린으로부터 제거되는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 트리-n-부틸-포스페이트 및 Triton®이 실리카 비드 흡착성 물질을 사용하여 면역글로불린으로부터 제거되는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 실리카 비드 흡착성 물질이 면역글로불린으로부터 제거되는 방법.
  17. (a) 혈액 제제에 대해 크기 배제 나노여과를 수행하는 단계,
    (b) 단계(a)의 나노여과 투과물을 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트 용매 및 비이온성 세제와 혼합하는 단계 및
    (c) 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트 용매 및 비이온성 세제를 제거하는 단계를 포함하는, 바이러스 함유 혈액 제제 중의 바이러스 불활성화 방법.
  18. 제17항에 있어서, 혈액 제제가 면역글로불린인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트가 트리-n-부틸-포스페이트이고 비이온성 세제가 옥시에틸화 알킬페놀인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 옥시에틸화 알킬페놀이 Triton®인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트 용매가 약 0.006% 내지 0.3% 미만으로 존재하고 비이온성 세제가 약 0.01% 내지 1.0% 미만으 로 존재하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트 용매가 약 0.003% 내지 0.3% 미만으로 존재하고 비이온성 세제가 약 0.02% 내지 1.0% 미만으로 존재하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트가 약 0.06%로 존재하고 비이온성 세제가 약 0.2%로 존재하는 방법.
  24. 제17항에 있어서, 트리-n-부틸 포스페이트 및 Triton®이 C-18 컬럼 통과, 막을 통한 정용여과, 크로마토그래피 지지체로의 흡착, 친화성 크로마토그래피 지지체로의 흡착, 한외여과, 여과 및 흡착, 및 흡착제 사용으로부터 선택된 방법에 의해 면역글로불린으로부터 제거되는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 트리-n-부틸 포스페이트 및 Triton®이 실리카 비드 흡착성 물질을 사용하여 면역글로불린으로부터 제거되는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 실리카 비드 흡착성 물질이 면역글로불린으로부터 제거되는 방법.
  27. (a) 면역글로불린을 부형제 함유 고 이온 강도 완충액과 혼합하는 단계,
    (b) 단계(a)의 제제에 대해 크기 배제 나노여과를 수행하는 단계,
    (c) 단계(b)의 나노여과 투과물을 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 약 0.06%의 트리-n-부틸-포스페이트 및 약 0.2%의 Triton®과 혼합하는 단계,
    (d) 단계(c)의 제제를 실리카 비드 흡착성 물질과 혼합하여 트리-n-부틸 포스페이트 및 Triton®을 제거하는 단계 및
    (e) 흡착성 물질을 상기 제제로부터 제거하는 단계를 포함하는, 바이러스 함유 면역글로불린 제제 중의 바이러스 불활성화 방법.
  28. (a) 혈액 제제를 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트 용매 및 비이온성 세제와 혼합하는 단계 및
    (b) 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트 용매 및 비이온성 세제를 혈액 제제로부터 제거하는 단계를 포함하는, 바이러스 함유 혈액 제제 중의 바이러스 불활성화 방법.
  29. 제28항에 있어서, 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트 용매 및 비이온성 세제가 C-18 컬럼 통과, 막을 통한 정용여과, 크로마토그래피 지지체로의 흡착, 친화성 크로마토그래피 지지체로의 흡착, 한외여과, 여과 및 흡착, 및 흡착 제 사용으로부터 선택된 방법에 의해 혈액 제제로부터 제거되는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트 및 비이온성 세제가, 혈액 제제를 실리카 비드 흡착성 물질과 혼합함으로써 혈액 제제로부터 제거되는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트가 트리-n-부틸-포스페이트이고 비이온성 세제가 옥시에틸화 알킬페놀인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 옥시에틸화 알킬페놀이 Triton®인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트 용매가 약 0.006% 내지 0.3% 미만으로 존재하고 비이온성 세제가 약 0.01% 내지 1.0% 미만으로 존재하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트가 약 0.003% 내지 0.3% 미만으로 존재하고 비이온성 세제가 약 0.02% 내지 1.0% 미만으로 존재하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트가 약 0.06% 로 존재하고 비이온성 세제가 약 0.2%로 존재하는 방법.
  36. 제28항에 있어서, 혈액 제제가 면역글로불린인 방법.
  37. 제30항에 있어서, 확산 흡착제를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  38. (a) 면역글로불린을 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 약 0.06%의 트리-n-부틸-포스페이트 및 약 0.2%의 Triton®과 혼합하는 단계,
    (b) 단계(a)의 제제를 실리카 비드 흡착성 물질과 혼합하여 트리-n-부틸 포스페이트 및 Triton®을 제거하는 단계 및
    (c) 제제로부터 흡착성 물질을 제거하는 단계를 포함하는, 바이러스 함유 면역글로불린 제제 중의 바이러스 불활성화 방법.
  39. (a) 혈장을 약 0.2% 내지 1.0% 미만의 트리-n-부틸-포스페이트 및 약 0.2% 내지 1.0% 미만의 Triton®과 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 혼합하는 단계 및
    (b) 단계(a)의 제제에 대해 혈장 분획화를 수행하는 단계를 포함하는, 바이러스 함유 혈장 중의 바이러스 불활성화 방법.
  40. 제13항의 방법으로 제조된, 실질적으로 바이러스를 함유하지 않는 면역글로불린.
  41. 제27항의 방법으로 제조된, 실질적으로 바이러스를 함유하지 않는 면역글로불린.
  42. 제38항의 방법으로 제조된, 실질적으로 바이러스를 함유하지 않는 면역글로불린.
  43. 제39항의 방법으로 제조된, 실질적으로 바이러스를 함유하지 않는 면역글로불린.
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