CN105524162A - 使用改进的溶剂-清洁剂方法进行病毒灭活 - Google Patents

Abstract

本申请说明书公开了灭活含有脂质外套的病毒的方法、以及由该方法获得的基本上不含含有脂质外套的病毒的蛋白质。

Description

使用改进的溶剂-清洁剂方法进行病毒灭活

M·费尔根豪尔、M·法尔西特、D·米松、F·蒙唐东

本申请是申请日为2011年12月14日、申请号为201180067642.8(国际申请号为PCT/US2011/064960)、名称为“使用改进的溶剂-清洁剂方法进行病毒灭活”的发明专利申请的分案申请。

优先权要求

本专利申请依据美国法典第35章第§119(e)条要求于2010年12月15日申请的美国临时专利申请系列号No.61/423,512的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本文。

技术领域

本申请说明书涉及在蛋白质制造期间灭活病毒污染物的方法。

背景技术

作为治疗许多影响个体健康的疾病、紊乱、或状况的方法，使用包含治疗性蛋白质的药物组合物的重要性一直在提高。许多在药物组合物中使用的蛋白质典型地是通过使用哺乳动物细胞系进行重组体生产、或者通过从生物液体中提纯而获得的。然而，通过这些方法制造的治疗性蛋白质可能会被对个体健康有害的传染性病原病毒污染。因此，重要的是加工治疗性蛋白质以便消除任何污染性病毒的活性、借此确保得到的药物组合物给药于个体是安全的。

当前有许多不同的用于灭活传染性病原病毒的方法，包括，例如加热灭活、溶剂/清洁剂(S/D)灭活、pH灭活、化合物灭活、和/或紫外线照射灭活。在这些方法中，S/D灭活或许是最为广泛接受的杀病毒方法，因为几乎所有重要的人类病原体都是包膜病毒，其对于通过溶剂和清洁剂破裂细胞膜是敏感的。另外，当与其他的杀病毒方法相比时，S/D方法可更好地保持被治疗的液体的含量和生物活性。例如，采用加热、酸性pH、化合物和辐射的灭活方法存在一些问题，因为这些试剂是刺激性的和/或侵袭性的，并且倾向于使待纯化的治疗性蛋白质变性、或者另外失去活性。

在S/D灭活方法中，将有机溶剂和清洁剂与包括被纯化蛋白质的液体混合，并且保温。该溶剂可产生促进在清洁剂和包封病毒的类脂膜之间聚集的环境，并且清洁剂可破坏在该类脂膜中分子之间的相互作用。一旦被破坏，包膜病毒就不再能结合并感染细胞，并且不能再生，因为完整的类脂膜对这些活性而言是必不可少的。该灭活一般在超过20℃的温度下进行，因为较高的温度可促进包膜的破裂。例如，根据世界卫生组织(WHO)指南使用的典型状况是0.3％磷酸三(正丁)酯(TNBP)和1％聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)在24℃下保温至少6小时、或者0.3％TNBP和1％聚氧乙烯辛基苯基醚(TRITONX-100)在24℃下保温至少4小时。参见，例如，WHO技术报告，附录4，“病毒灭活和去除工序以便保障人类血浆产物的病毒安全性”指南，档案号924，第151-224页，(2004)。

溶剂/清洁剂混合物保温至超过20℃的温度具有几个缺陷。首先，在较高的温度下灭活是费时的，因为预热混合物至温度高于20℃会增加给总加工时间大约2至大约6个小时。其次，在该较高的温度下保温、连同促进均匀加热所必需的搅拌会增强蛋白质聚集形成，导致有用的蛋白质的产率和/或活性下降。暴露于高于20℃的温度也会增加蛋白质对降解的敏感性。本申请说明书公开了一种新颖的用于灭活来自样品的传染性病原病毒的S/D方法，其可克服这些缺陷。在此公开的方法使用低于两个小时的保温时间，并且保温温度低于20℃。减少保温时间可减少加工和/或制造蛋白质所必需的总体时间，所述蛋白质是通过重组体生产或者生物液体提纯而获得的。另外，减少时间并且降低温度可通过降低蛋白质对聚集和降解的敏感性而导致提高的蛋白质产率。

发明内容

因此，本申请说明书的一些方面公开了灭活含有脂质外套的病毒的方法，该方法包括下述步骤：a)提供包含具有活性的蛋白质的液体；b)将有机溶剂和表面活性剂与该液体相混合，借此产生混合物；以及c)将该混合物保温至多大约120分钟；其中两个步骤(b)和(c)在不高于大约20℃的温度下进行；其中混合物在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒；并且其中所述蛋白质在保温后的活性为步骤(a)中所提供活性的至少25％。该液体可能是细胞裂解液、细胞上清液、来自在前提纯步骤的洗脱液、或者生物液体。该蛋白质可以通过使用细胞系进行重组体生产、或者通过从生物液体中提纯而得到。有机溶剂可以是醚、醇、或者烷基磷酸酯比如磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯。表面活性剂可以是离子型表面活性剂比如阴离子表面活性剂或者阳离子表面活性剂、两性离子型(两性)表面活性剂、或者非离子型表面活性剂。该方法可以、或者可以不进一步包括在步骤(c)之后从混合物中除去溶剂、表面活性剂和/或非存活病毒的步骤。

本申请说明书的其他方面公开了一种基本上不含含有脂质外套的病毒的蛋白质，其由包括下述步骤的方法获得：a)提供包含具有活性的蛋白质的液体；b)将有机溶剂和表面活性剂与该液体相混合，借此产生混合物；以及c)将该混合物保温至多大约120分钟；其中两个步骤(b)和(c)在不高于大约20℃的温度下进行；其中混合物在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒；以及其中所述蛋白质在保温后的活性为步骤(a)中所提供活性的至少25％。

本申请说明书的其他方面公开了灭活含有脂质外套的病毒的方法，该方法包括下述步骤：a)提供一种包含具有活性的因子VIII的液体；b)将有机溶剂和表面活性剂与该液体相混合，借此产生混合物；以及c)将该混合物保温至多大约120分钟；其中两个步骤(b)和(c)在不高于大约20℃的温度下进行；其中混合物在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒；并且其中因子VIII在保温后的活性为步骤(a)中所提供活性的至少25％。

本申请说明书的其他方面公开了一种基本上不含含有脂质外套的病毒的因子VIII，其由包括下述步骤的方法获得：a)获得包含具有活性的因子VIII的液体；b)将有机溶剂和表面活性剂与该液体相混合，借此产生混合物；以及c)将该混合物保温至多大约120分钟；其中两个步骤(b)和(c)在不高于大约20℃的温度下进行；其中混合物在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒；并且其中因子VIII在保温后的活性为步骤(a)中所提供活性的至少25％。

具体实施方式

本申请说明书的一些方面部分地公开了含有脂质外套的病毒。完整的病毒颗粒被称为病毒粒子，由核酸(或者为DNA、或者为RNA)组成，核酸被蛋白质保护层包围，该蛋白质保护层被称为病毒壳体。病毒可能被分组成非包膜病毒和包膜病毒。这里使用的术语“含有脂质外套的病毒”指的是任何包含细胞膜或包括比如脂质在内的包膜的病毒，比如包膜病毒。包膜病毒的病毒壳体被脂蛋白细胞膜、或者包膜包围。该包膜来源于宿主细胞，因为病毒由宿主细胞表面“发芽”并且该包膜主要由不被病毒基因组编码的脂质组成。尽管其携带有用于附着并进入靶细胞、并且对包膜病毒的传染性而言必不可少的的分子决定簇，但其不是抗药性或者抗原性转变的主体。包膜病毒的尺寸范围为从大约45-55nm至大约120-200nm。可能感染哺乳动物细胞的含有脂质外套的病毒包括：DNA病毒，比如疱疹病毒病毒、痘病毒病毒、或者肝DNA病毒病毒；RNA病毒，比如黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、δ病毒(丁型肝炎病毒，deltavirus)、正粘病毒、副粘病毒、弹状病毒(rhabdoviridae)、本雅病毒、或者纤丝病毒病毒；以及反向转录病毒，比如反转录病毒或肝DNA病毒。含有脂质外套的病毒的非限制性例子包括艾滋病毒、辛德毕斯病毒、单纯疱疹病毒、假狂犬病毒、仙台病毒、水泡性口膜炎病毒、西尼罗河病毒、牛病毒性腹泻病毒、冠状病毒、马关节炎病毒、严重急性呼吸综合症病毒、莫洛尼鼠白血病毒、或者牛痘病毒。

非包膜病毒指的是其病毒壳体缺少脂蛋白细胞膜、或者包膜的病毒。在非包膜病毒中，病毒壳体介导着对于宿主细胞的附着和穿透进入宿主细胞。病毒壳体一般是螺旋状或者二十面体状。非包膜病毒的尺寸范围为从大约18-26nm至大约70-90nm。可能感染哺乳动物细胞的非包膜病毒包括，例如，细小病毒、腺病毒、双RNA病毒(birnaviridae)、乳头瘤病毒、多瘤病毒(polyomaviridae)、小RNA病毒、呼肠孤病毒、以及杯状病毒(calciviridae)。

本申请说明书的一些方面部分地公开了包含具有活性的蛋白质的液体。液体可以是任何具有被病毒污染可能性的液体。液体的非限制性例子包括，例如，任何被纯化的液体、被部分地纯化的液体、或者粗的液体或者胶体，包括，例如，来自在前提纯步骤的洗脱液；组织提取物和细胞培养物提取物，比如细胞裂解液、细胞上清液、胎盘提取物、或者腹水液体；生物液体，比如血液、血浆、血清、乳、唾液、精液；或者任何其他的包括具有活性的蛋白质的液体。

具有活性的蛋白质可以是任何所关注的蛋白质，在其中期望任何污染性病毒活性被消除。在此公开的蛋白质可能是血液蛋白质，例如凝血蛋白质、白蛋白、和/或免疫球蛋白。血液蛋白质的非限制性例子包括：ADAMTS-13、α1-抗血纤维蛋白酶、α2-抗血纤维蛋白酶、抗凝血酶、抗凝血酶III、癌症前凝血剂、促红细胞生成素、因子II、因子V、因子VI、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纤连蛋白、纤维蛋白原、肝素辅因子II、高分子量激肽原、肌内免疫球蛋白、静脉内免疫球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、激肽释放酶原、蛋白质C、蛋白质S、蛋白质Z、蛋白质Z相关蛋白酶抑制剂、组织因子、组织纤溶酶原激活物、尿激酶、或者冯维勒布兰特因子。

在此公开的蛋白质可以是由可天然地表达蛋白质的生物体得到的蛋白质、由通过基因工程化而表达蛋白质的转基因生物体得到的蛋白质、或者由可通过重组方式生产蛋白质的细胞系得到的蛋白质。生物体的非限制性例子包括鸟和哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、山羊、绵羊、马、驴、牛、灵长类动物和人。转基因生物体的非限制性的例子包括在此公开的已经通过基因工程化而表达所关注蛋白质的生物体。来自生物体或者转基因生物体的在此公开的蛋白质可以通过使用本技术领域已知的常规方法由生物液体、组织或者器官提出物、或者来自生物体的其他来源得到。例如，为了得到血液蛋白质，可以在血清分离管中从生物体或者转基因生物体中抽出全血。该血液允许凝结，并且凝结的血液被离心成碎片团粒。得到的血清样品(即上清液)然后可以被等分并且/或者在-20℃储存直至需要时。用于血液收集和血清制品的具体方案的非限制性例子例如在下述文献中有描述：DiLorenzoandStrasinger,保健中的血液收集(FADavis公司,2001)；以及DianaGarza&KathleenBecan-McBride,放血手册：血液收集精要(PrenticeHall，第6次版,2002)。

可选地，也可以使用各种原核表达系统和/或真核表达系统，以便通过重组方式表达在此公开的蛋白质。表达系统可能包括下述多种特征中的任何一种，包括、但不限于：诱导表达、非诱导表达、组成性表达、组织特异性表达、细胞特异性表达、病毒调节的表达、牢固整合的表达、以及瞬时表达。本技术领域已知如何产生和使用这样的表达系统。

一般地，编码所关注蛋白质的多核苷酸被克隆入表达载体。原核表达载体典型地包含复制起点、合适的启动子和/或增强子元件、以及核糖体结合、聚腺苷酸化、转录终止的必需位点、以及5'侧翼非转录序列及其他非转录遗传元件。例举的原核载体包括使用启动子比如噬菌体T7启动子的pET和pRSET。真核表达载体典型地包含复制起点、合适的启动子和/或增强子元件、以及核糖体结合、聚腺苷酸化、拼接、转录终止的必需位点、以及5'侧翼非转录序列及其他非转录遗传元件。例举的酵母载体包括使用启动子比如AOX1、AUG1、GAP、以及GAL1的pAO、pMET、pPIC、pPICZ、以及pYES。例举的昆虫载体包括使用启动子比如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、以及polh的pAc5、pBAC、pIB、pMIB、pMT。例举的哺乳动物载体包括pBPV、pCMV、pCMVTNT、pDNA、pDisplay、pMSG、pOG44、pQBI25、pRc/RSV、pSECTag、pSECTag2、pSG、pSV2cat、pSVK3、pSVL、pUCIG-MET、pVAX1、pWLneo以及pXT1，这些载体使用启动子比如β-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳清酸启动子、HSV胸苷激酶、早期至晚期猴肾病毒40(SV40)、来自反向病毒的LTRs、以及小鼠金属硫蛋白-1。选择性标记包括氨苄青霉素、氯霉素转移酶、卡那霉素、新霉素、以及四环素。合适的表达载体在本技术领域是已知的，并且可在市场上买到。

能够表达兼容的载体的细胞包括原核细胞、真核细胞、以及由原核细胞和真核细胞衍生的细胞系。原核菌株的非限制性的例子包括例如由下述衍生的菌株：大肠杆菌、枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、产气荚膜梭菌(Clostridiaperfringens)、难辨梭状芽孢杆菌(Clostridiadifficle)、新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)、乳酸乳球菌、脱甲基杆菌(methylobacteriumextorquens)、曼宁奈瑟氏菌属(Neisseriameningirulls)、脑膜炎奈瑟氏球菌、荧光极毛杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。酵母菌株的非限制性例子包括例如由下述衍生的酵母菌株：巴斯德毕赤氏酵母、毕赤嗜甲醇酵母(Pichiamethanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)、粟酒酵母(Schizosaccharomycespombe)、酿酒酵母和解脂耶氏酵母。植物细胞和由植物衍生的细胞系包括例如来自下述的细胞：单子叶植物种类，比如，蜡质种玉米；和双子叶植物种类，比如，阿拉伯芥(Arabidopsisthaliana)、小麦、膨胀浮萍(Lemnagibba)和浮萍。昆虫细胞和由昆虫衍生的细胞系包括例如来自下述的细胞：草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、果蝇和烟草天蛾(Manducasexta)。昆虫细胞系的非限制性例子包括High-Five、K_C、施奈德果蝇细胞系2(S2)、SF9、以及SF21细胞系。哺乳动物细胞和由哺乳动物细胞衍生的细胞系包括例如来自下述的细胞：小鼠、大鼠、仓鼠、猪、牛、马、灵长类动物和人。哺乳动物细胞系的非限制性例子包括：1A3、3T3、6E6、10T1/2、APRT、BALB/3T3、BE(2)-C、BHK、BT、C6、C127、CHO、CHP3、COS-1、COS-7、CPAE、ESK-4、FB2、GH1、GH3、HeLa、HEK-293、HepG2、HL-60、IMR-32、L2、LLC-PK1、L-M、MCF-7、NB4、NBL-6、NCTC、Neuro2A、NIE-115、NG108-15、NIH3T3、PC12、PK15、SBAC、SH-SY5Y、SK-Hep、SK-N-DZ、SK-N-F1、SK-N-SH、ST、SW-13、以及VV-1细胞系。细胞系可以从美国典型培养物保藏中心、欧洲细胞培养物保藏中心和/或德国微生物和细胞培养物保藏中心得到。

在从生物体、转基因生物体、或者细胞培养系统初步收集后，在此公开的蛋白质可以经受蛋白质纯化处理。一般来讲，蛋白质纯化包括：将蛋白质捕集成更高浓度的形式、中间提纯步骤以便除去杂质、高纯度水处理(polishing)以便除去额外的杂质和蛋白质变体。参见例如下述文献：蛋白质科学中的当前方案(CurrentProtocolsinProteinScience),“常规色谱分离”,第8-9章,(JohnWiley&Sons公司，Hoboken，新泽西州，1995)。捕集的普通方法包括亲和层析、凝胶过滤、沉淀、和/或大小排阻色谱。可用作中间步骤或者高纯度水处理步骤的工艺包括阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、以及陶瓷羟基磷灰石色谱、反相HPLC、凝胶过滤、沉淀、渗滤、亲和层析、或者色谱聚焦(chromatofocusing)。

在此公开的方法可以在该纯化过程期间任一时间点进行。一般来讲，当在制造工艺开始、而不是在制造工艺较后期进行在此公开的方法时，较大的试剂量和较长的保温时间是必需的。这是因为，在加工开始阶段体积更大，并且产物典型地纯度较低。反之，后来杂质已经减少，并且产物在大多数情况下被更好地限定；并且随着体积减小，纯度和效价会更大；或者其中病毒载量已经通过在前纯化工序被减少或者减弱。

本申请说明书一些方面部分地提供下述步骤：将在此公开的液体与有机溶剂和表面活性剂混合，借此产生混合物。液体与有机溶剂和表面活性剂的混合可以进行任何时间长度，附带条件是，使用的混合时间可得到使有机溶剂和表面活性剂与所述液体充分地结合的混合物。这种情况下，所述混合应该确保：1)有机溶剂可促进在表面活性剂和包封含有脂质外套的病毒的脂蛋白包膜的接触；2)表面活性剂可破坏在含有脂质外套的病毒的脂蛋白细胞膜中分子之间的相互作用。在该实施方式的一些方面，有机溶剂和表面活性剂的混合持续的时间为，例如，不超过1分钟、不超过5分钟、或者不超过10分钟。在该实施方式的其他方面，有机溶剂和表面活性剂的混合持续的时间为：例如，大约1分钟至大约5分钟、大约2分钟至大约5分钟、大约3分钟至大约5分钟、大约1分钟至大约10分钟、大约2分钟至大约10分钟、大约3分钟至大约10分钟、大约4分钟至大约10分钟、或者大约5分钟至大约10分钟。如同在此公开的那样，有机溶剂和表面活性剂的混合物在不高于大约20℃的温度下进行。

或者可以将单一的有机溶剂与在此公开的液体混合，或者可以将多种有机溶剂与在此公开的液体混合。在该实施方式的一个方面，可以将液体与至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或者至少五种有机溶剂混合。有用的有机溶剂可产生促进表面活性剂与包封病毒的脂蛋白包膜之间的接触的环境。这种情况下，可以在本文公开的方法中使用可促进这种接触的任何有机溶剂，包括，但不限于：醚、醇、烷基磷酸酯比如磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯、或者它们的任何组合物。

可用于在此公开的方法的醚包括分子式为R¹-O-R²的醚，其中，R¹和R²独立地是能够含有氧原子或硫原子的C₁-C₁₈烷基或者C₁-C₁₈链烯基、优选C₁-C₁₈烷基或者C₁-C₁₈链烯基。醚的非限制性例子包括二甲醚、二乙醚、乙基丙基醚、甲基丁基醚、甲基异丙基醚、以及甲基异丁基醚。可用于在此公开的方法的醇包括具有C₁-C₁₈烷基或者C₁-C₁₈链烯基的醇。醇的非限制性例子包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇和异戊醇。可用于在此公开的方法的烷基磷酸酯包括具有C₁-C₈烷基或者C₁-C₈链烯基的烷基磷酸酯，所述C₁-C₁₈烷基和C₁-C₁₈链烯基都可以含有氧原子或者硫原子。烷基磷酸酯的非限制性例子包括：磷酸二烷基酯，比如磷酸二(正丁)酯、磷酸二(叔丁)酯、磷酸二(正己)酯、磷酸二(2-乙基己)酯、磷酸二(正癸)酯、或者磷酸乙基二(正丁基)酯；以及磷酸三烷基酯，比如磷酸三(正丁)酯、磷酸三(叔丁)酯、磷酸三(正己)酯、磷酸三(2-乙基己)酯、或者磷酸三(正癸基)酯。可用于在此公开的方法的有机溶剂的非限制性的例子能够在例如下述文献中发现：Winslow,etal.,用于同时从红血细胞分离血红蛋白和灭活病毒的方法和组合物，US2008/0138790，在此通过引用将其全部内容并入本文。

可以使用任何浓度的有机溶剂，附带条件是使用的浓度足以促进表面活性剂与含有脂质外套的病毒的脂蛋白细胞膜之间的聚集。在该实施方式的一个方面，使用的表面活性剂的终浓度是，例如：大约0.01％(v/v)、大约0.05％(v/v)、大约0.075％(v/v)、大约0.1％(v/v)、大约0.2％(v/v)、大约0.3％(v/v)、大约0.4％(v/v)、大约0.5％(v/v)、大约0.6％(v/v)、大约0.7％(v/v)、大约0.8％(v/v)、大约0.9％(v/v)、或者大约1.0％(v/v)。在该实施方式的其他方面，使用的表面活性剂的终浓度是，例如：至少0.01％(v/v)、至少0.05％(v/v)、至少0.075％(v/v)、至少0.1％(v/v)、至少0.25％(v/v)、至少0.5％(v/v)、至少0.75％(v/v)、或者至少1.0％(v/v)。在该实施方式的其他方面，使用的表面活性剂的终浓度是，例如：大约0.1％(v/v)至大约0.5％(v/v)、大约0.1％(v/v)至大约0.75％(v/v)、大约0.1％(v/v)至大约1.0％(v/v)、大约0.2％(v/v)至大约0.5％(v/v)、大约0.2％(v/v)至大约0.75％(v/v)、大约0.2％(v/v)至大约1.0％(v/v)、大约0.5％(v/v)至大约0.75％(v/v)、或者大约0.5％(v/v)至大约1.0％(v/v)。

表面活性剂是可降低液体的表面张力、而允许扩散比较容易、并且降低两种液体之间、或者液体和固体之间的界面张力的化合物。或者可以将单一的表面活性剂与在此公开的液体混合、或者可以将多个表面活性剂与在此公开的液体混合。在该实施方式的一个方面，可以将液体与至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或者至少五种表面活性剂混合。有用的表面活性剂可破坏含有脂质外套的病毒的脂蛋白细胞膜中分子之间的相互作用。这种情况下，可以在本文公开的方法中使用任何便于这样的破裂的表面活性剂，包括，但不限于：离子型表面活性剂、两性离子型(两性)表面活性剂、非离子型表面活性剂、或者它们中的任意组合。

离子型表面活性剂包括以持久的(硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐)或者pH依赖性的(羧酸盐)阴离子为基础的离子表面活性剂。阴离子型表面活性剂包括、但不限于：烷基硫酸盐，比如月桂基硫酸铵和十二烷基硫酸钠(SDS)；烷基醚硫酸盐，比如月桂醇聚醚硫酸钠和肉豆蔻醇聚醚(myreth)硫酸钠；多库酯盐，比如琥珀磺酸二辛钠；磺酸盐氟表面活性剂，比如全氟辛烷磺酸盐(PFOS)和全氟丁烷磺酸盐；烷基苯磺酸盐；烷基芳基醚磷酸盐；烷基醚磷酸盐；烷基羧酸盐，比如脂肪酸盐和硬脂酸钠；月桂酰肌氨酸钠；以及并且羧酸盐氟表面活性剂，比如全氟壬酸盐和全氟辛酸盐。

离子型表面活性剂还包括以持久的或者pH依赖性的阳离子为基础的阳离子表面活性剂。阳离子型表面活性剂包括，但不限于：烷基三甲基铵盐，比如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)；氯化十六烷吡啶(CPC)；聚乙氧基化动物脂胺(POEA)；苯扎氯铵(BAC)；氯化苄乙氧铵(BZT)；5-溴代-5-硝基-1,3-二氧杂环已烷；二甲基二(十八基)氯化铵；以及二(十八基)二甲基溴化铵(DODAB)；以及pH依赖性的伯胺、仲胺或者叔胺类表面活性剂，其中伯胺在pH<10下变得带正电、或者仲胺在pH<4下变得带电，比如奥替尼啶(octenidine)二盐酸盐。

两性离子表面活性剂是以伯胺、仲胺或叔胺或者季铵阳离子为基础，具有磺酸盐、羧酸盐、或者磷酸盐。两性表面活性剂包括，但不限于：3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)；磺基甜菜碱(sultaine)，比如椰油酰胺丙基羟基磺基丙基甜菜碱；甜菜碱，比如椰油酰胺丙基甜菜碱；或者卵磷脂。

非离子型表面活性剂变性较小，这样可用于增溶膜蛋白和脂质，同时保留蛋白质-蛋白质间的相互作用。表面活性剂的非限制性例子包括：聚氧乙二醇脱水山梨醇烷基酯，比如聚山梨酸酯20单油酸山梨醇酐酯(20)、聚山梨酸酯40单油酸山梨醇酐酯(40)、聚山梨酸酯60单油酸山梨醇酐酯(60)、聚山梨酸酯61单油酸山梨醇酐酯(61)、聚山梨酸酯65单油酸山梨醇酐酯(65)、聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)、以及聚山梨酸酯81单油酸山梨醇酐酯(81)；泊洛沙姆(聚乙烯-聚丙烯共聚物)，比如泊洛沙姆124(普卢兰尼克L44)、泊洛沙姆181(L61)、泊洛沙姆182(L62)、泊洛沙姆184( L64)、泊洛沙姆188(F68)、泊洛沙姆237(F87)、泊洛沙姆338(L108)、泊洛沙姆407(F127)；烷基酚聚乙二醇醚；聚乙二醇烷基芳基醚；聚氧乙二醇烷基醚，比如八乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十二烷基醚、30、以及35；2-十二烷基乙二醇(-PX)；聚氧乙二醇辛基苯酚醚，比如聚氧乙烯(4-5)对叔辛基酚(X-45)和聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)；聚氧乙二醇烷基酚醚，比如壬基酚聚氧乙烯醚(Nonoxynol)-9；苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇(phenoxypolyethoxylethanol)，比如壬基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇和辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇；葡萄糖苷烷基醚，比如辛基吡喃葡萄糖苷；麦芽糖苷烷基醚，比如十二基麦芽糖苷(dodecylmaltopyranoside)；硫葡糖苷烷基醚比如庚基硫代吡喃葡萄糖苷(heptylthioglucopyranoside)；毛地黄皂苷；甘油烷基酯，比如月桂酸甘油酯；烷基芳基聚醚硫酸盐；醇磺酸盐；脱水山梨醇烷基酯；椰油酰胺乙醇胺，比如椰油酰胺单乙醇胺和椰油酰胺二乙醇胺；蔗糖单月桂酸酯；十二基二甲胺氧化物、以及胆酸钠。可用于在此公开的方法的表面活性剂的非限制性例子能够在下述文献中发现：例如，Winslow,etal.,用于同时从红血细胞分离血红蛋白和灭活病毒的方法和组合物，US2008/0138790；药物剂量形式和药物传输系统(HowardC.Ansel等编辑，Lippincott,Williams&Wilkins出版社，第7版，1999)；Remington：药学科学和实践(AlfonsoRGennaro编辑，Lippincott,Williams&Wilkins出版社，第20版，2000)；Goodman&Gilman的治疗的药物学基础(JoelG.Hardman等编辑，McGraw-HillProfessional出版社，第10版，2001)；以及药物赋形剂手册(RaymondC.Roweetal.,APhA出版社，第4版，2003)。在此通过引用将这些文献的全部内容并入本文。

可以使用任何浓度的表面活性剂，附带条件是使用的浓度足以破坏含有脂质外套的病毒的脂蛋白细胞膜中分子之间的相互作用、以便造成病毒的灭活。在该实施方式的一个方面，表面活性剂的使用浓度是，例如，大约0.01％(v/v)、大约0.05％(v/v)、大约0.075％(v/v)、大约0.1％(v/v)、大约0.2％(v/v)、大约0.3％(v/v)、大约0.4％(v/v)、大约0.5％(v/v)、大约0.6％(v/v)、大约0.7％(v/v)、大约0.8％(v/v)、大约0.9％(v/v)、大约1.0％(v/v)、大约2.0％(v/v)、大约3.0％(v/v)、大约4.0％(v/v)、大约5.0％(v/v)、大约6.0％(v/v)、大约7.0％(v/v)、大约8.0％(v/v)、大约9.0％(v/v)、或者大约10.0％(v/v)。在该实施方式的其他方面，表面活性剂的使用浓度是，例如：至少0.01％(v/v)、至少0.05％(v/v)、至少0.075％(v/v)、至少0.1％(v/v)、至少0.25％(v/v)、至少0.5％(v/v)、至少0.75％(v/v)、至少1.0％(v/v)、至少2.5％(v/v)、至少5.0％(v/v)、至少7.5％(v/v)、或者至少10.0％(v/v)。在该实施方式的其他方面，表面活性剂的使用浓度是，例如：大约0.1％(v/v)至大约0.5％(v/v)、大约0.1％(v/v)至大约1.0％(v/v)、大约0.2％(v/v)至大约0.5％(v/v)、大约0.2％(v/v)至大约1.0％(v/v)、大约0.2％(v/v)至大约2.0％(v/v)、大约0.5％(v/v)至大约1.0％(v/v)、大约0.5％(v/v)至大约5.0％(v/v)、或者大约1.0％(v/v)至大约10.0％(v/v)。

可以将在此公开的液体与单一的有机溶剂和多种表面活性剂、多种有机溶剂和单一的表面活性剂、或者多种有机溶剂和多种表面活性剂混合。典型地，有机溶剂和单一表面活性剂在液体中的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约5％(v/v)的有机溶剂和大约0.1％(v/v)至大约10％(v/v)的表面活性剂。当将多种表面活性剂与液体混合时，有机溶剂的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约5％(v/v)，一种表面活性剂的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约10％(v/v)、大约0.5％(v/v)至大约5％(v/v)、或者大约0.5％(v/v)至大约1.0％(v/v)，并且剩余的表面活性剂的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约5％(v/v)、大约0.1％(v/v)至大约1.0％(v/v)、或者大约0.2％(v/v)至大约4％(v/v)。

在该实施方式的一个方面，将液体与磷酸三(正丁)酯和聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)混合，使得磷酸三(正丁)酯的终浓度是例如大约0.1％(v/v)至大约1.0％(v/v)、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)的终浓度是大约1.0％(v/v)至大约10.0％(v/v)。在该实施方式的另一个方面，将液体与磷酸三(正丁)酯和聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)混合，使得磷酸三(正丁)酯的终浓度是例如大约0.1％(v/v)至大约1.0％(v/v)、聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)的终浓度是大约1.0％(v/v)至大约10.0％(v/v)。

在该实施方式的另一个方面，将液体与磷酸三(正丁)酯、聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)以及聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)混合，使得磷酸三(正丁)酯的终浓度是例如大约0.1％(v/v)至大约5.0％(v/v)、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)的终浓度是大约0.5％(v/v)至大约10.0％(v/v)、聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯( 80)的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约5.0％(v/v)。在该实施方式的另一个方面，将液体与磷酸三(正丁)酯、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)以及聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)混合，使得磷酸三(正丁)酯的终浓度是例如大约0.1％(v/v)至大约0.7％(v/v)、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)的终浓度是大约0.6％(v/v)至大约1.4％(v/v)、聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约0.7％(v/v)。在该实施方式的又一个方面，将液体与磷酸三(正丁)酯、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)以及聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)混合，使得磷酸三(正丁)酯的终浓度是例如大约0.1％(v/v)至大约0.5％(v/v)、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)的终浓度是大约0.7％(v/v)至大约1.3％(v/v)、聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约0.5％(v/v)。

在该实施方式的另一个方面，将液体与磷酸三(正丁)酯、聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)以及聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)混合，使得磷酸三(正丁)酯的终浓度是例如大约0.2％(v/v)至大约0.5％(v/v)、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)的终浓度是大约0.7％(v/v)至大约1.3％(v/v)、聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯( 80)的终浓度是大约0.2％(v/v)至大约0.5％(v/v)。在该实施方式的另一个方面，将液体与磷酸三(正丁)酯、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)以及聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)混合，使得磷酸三(正丁)酯的终浓度是例如大约0.2％(v/v)至大约0.4％(v/v)、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)的终浓度是大约0.8％(v/v)至大约1.2％(v/v)、聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)的终浓度是大约0.2％(v/v)至大约0.4％(v/v)。在该实施方式的又一个方面，将液体与磷酸三(正丁)酯、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)以及聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)混合，使得磷酸三(正丁)酯的终浓度是例如大约0.3％(v/v)、聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)的终浓度是大约1.0％(v/v)、聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)的终浓度是大约0.3％。

在将液体与有机溶剂和表面活性剂混合之后，得到的混合物在规定温度下被保温给定时间。可以使用任何保温时间，附带条件是，使用的时间可在保温后得到基本上不含活的含有脂质外套的病毒的混合物。在该实施方式的一个方面，液体被保温一段时间，例如大约10分钟、大约20分钟、大约30分钟、大约40分钟、大约50分钟、大约60分钟、大约70分钟、大约80分钟、大约90分钟、大约100分钟、大约110分钟、或者大约120分钟。在该实施方式的其他方面，液体被保温一段时间，例如至多约为10分钟、至多约为20分钟、至多约为30分钟、至多约为40分钟、至多约为50分钟、至多约为60分钟、至多约为70分钟、至多约为80分钟、至多约为90分钟、至多约为100分钟、至多约为110分钟、或者至多约为120分钟。在该实施方式的其他方面，液体被保温一段时间，例如大约10分钟至大约60分钟、大约10分钟至大约90分钟、大约10分钟至大约120分钟、大约30分钟至大约60分钟、大约30分钟至大约90分钟、大约30分钟至大约120分钟、大约60分钟至大约90分钟、大约60分钟至大约120分钟、或者大约90分钟至大约120分钟。

本申请说明书的一些方面提供下述步骤：其中部分地将液体与有机溶剂和表面活性剂在不高于大约20℃的温度下混合，并且将混合物在不高于大约20℃的温度下保温。可以使用任何保温温度，附带条件是使用的温度是不高于大约20℃的温度，并且在保温后可得到基本上不含活的含有脂质外套的病毒的混合物，并且在保温后蛋白质的活性被恢复。尽管典型地在相同的温度下保温，但可以在一个温度下将液体与有机溶剂和表面活性剂混合、而混合物在不同的温度下保温。

在该实施方式的一些方面，液体被混合，并且混合物在下述的温度下保温：例如，大约2℃、大约4℃、大约6℃、大约8℃、大约10℃、大约12℃、大约14℃、大约16℃、大约18℃、或者大约20℃。在该实施方式的其他方面，液体被混合，并且在下述的温度下保温：例如，不超过2℃、不超过4℃、不超过6℃、不超过8℃、不超过10℃、不超过12℃、不超过14℃、不超过16℃、不超过18℃、或者不超过20℃。在该实施方式的其他方面，液体被混合，并且混合物在下述的温度下保温：例如，大约0℃至大约2℃、大约0℃至大约4℃、大约0℃至大约6℃、大约0℃至大约8℃、大约0℃至大约10℃、大约0℃至大约12℃、大约0℃至大约14℃、大约0℃至大约16℃、大约0℃至大约18℃、大约0℃至大约20℃、大约2℃至大约4℃、大约2℃至大约6℃、大约2℃至大约8℃、大约2℃至大约10℃、大约2℃至大约12℃、大约2℃至大约14℃、大约2℃至大约16℃、大约2℃至大约18℃、大约2℃至大约20℃、大约4℃至大约6℃、大约4℃至大约8℃、大约4℃至大约10℃、大约4℃至大约12℃、大约4℃至大约14℃、大约4℃至大约16℃、大约4℃至大约18℃、或者大约4℃至大约20℃。

在一种实施方式中，在此公开的混合物可以在任何不高于大约20℃的温度下被保温任何时间长度，附带条件是，使用的保温时间和温度可在保温后得到基本上不含活的含有脂质外套的病毒、并且包含具有活性的蛋白质的混合物。在该实施方式的一个方面，混合物在不高于大约20℃的温度下被保温不超过120分钟，比如，在不高于大约20℃的温度下保温不超过90分钟、在不高于大约20℃的温度下保温不超过60分钟、或者在不高于大约20℃的温度下保温不超过30分钟。在该实施方式的其他方面，混合物在不高于大约16℃的温度下被保温不超过120分钟、在不高于大约12℃的温度下保温不超过120分钟、或者在不高于大约8℃的温度下保温不超过120分钟。在该实施方式的其他方面，混合物在大约0℃至大约20℃的温度下被保温大约10分钟至大约120分钟、在大约0℃至大约16℃的温度下保温大约30分钟至大约120分钟、在大约0℃至大约12℃的温度下保温大约30分钟至大约120分钟、或者在大约2℃至大约8℃的温度下保温大约30分钟至大约120分钟。在该实施方式的其他方面，混合物在大约2℃至大约8℃的温度下被保温大约45分钟至大约75分钟、在大约2℃至大约8℃的温度下保温大约60分钟、在大约4℃的温度下保温大约45分钟至大约75分钟、或者在大约4℃的温度下保温大约60分钟。

本申请说明书的一些方面部分地提供了一种在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒的混合物。这里使用的术语“基本上不含含有脂质外套的病毒”意思指：仅痕量的活的含有脂质外套的病毒能够被仪器或者方法检测到或者被证实，并且这样的痕量的活的含有脂质外套的病毒不足以危害人类健康，其中所述仪器或者方法被用于检测或者证实活的含有脂质外套的病毒的存在或活性。在该实施方式的一个方面，混合物在保温后完全不含含有脂质外套的病毒。这里使用的术语“完全不含含有脂质外套的病毒”意思指：活的含有脂质外套的病毒在仪器或者方法的检测范围内不能被仪器或者方法检测到或者证实，其中所述仪器或者方法被用于检测或者证实活的含有脂质外套的病毒的存在或活性。在基本上不含或者完全不含活的含有脂质外套的病毒的液体内部包含的蛋白质能够被用于制备可安全给药于人的药物组合物，因为该病毒不足以危害人类健康。

在该实施方式的另一个方面，混合物在保温后包含小于1x10¹PFU/mL活的含有脂质外套的病毒。噬菌斑形成单位(PFU)是测量每单位体积能够形成噬菌斑的病毒颗粒数目的尺度。这是一个函数测量值、而不是颗粒绝对数量的测量值，因为无活性的、有缺陷的、或者未能感染它们的靶细胞的病毒颗粒不会产生噬菌斑，因此将不会被计数。在该实施方式的其他方面，混合物在保温后包含例如少于1x10⁰PFU/mL的活的含有脂质外套的病毒、少于1x10^-1PFU/mL的活的含有脂质外套的病毒、1x10^-2PFU/mL的活的含有脂质外套的病毒、或者1x10^-3pfu/ml的活的含有脂质外套的病毒。

在该实施方式的另一个方面，混合物在保温后包含小于ID₅₀的保温之前活的含有脂质外套的病毒。ID₅₀是将感染50％标靶细胞种群的病毒的量。这是个函数测量值，因为无活性的或者另外有缺陷的病毒的颗粒不会感染它们的靶细胞，因此不会被计数。在该实施方式的其他方面，混合物在保温后包含的活的含有脂质外套的病毒例如比在保温之前包含的活的含有脂质外套的病毒的ID₅₀低至少10倍、低至少100倍、低至少200倍、低至少300倍、低至少400倍、低至少500倍、低至少600倍、低至少700倍、低至少800倍、低至少900倍、或低至少1000倍。

在此使用的术语“灭活病毒”或者“病毒灭活”指的是一种方法，其中病毒不再能感染细胞、复制、增殖、以及自身病毒的去除。这种情况下，术语“病毒灭活”一般是指使得在此公开的液体完全不含传染性病毒污染物的方法。期望使用在此公开的方法进行任何程度的病毒灭活。然而，合乎需要的是，取得满足严格的药物安全指南所必需的病毒灭活程度。这些指南被WHO阐述，并且为本领域的技术人员所熟知。

通过任何能够定性地或者定量地测量活的含有脂质外套的病毒的活性存在的技术，能够完成活的含有脂质外套的病毒的检测。典型地，基于细胞培养的测定法被用于确定病毒的滴度水平，但是也可以使用体内传染性测定法。病毒扩增的检测可以通过例如显微镜检查(在可清楚地看见细胞致病作用的情况下)、基于PCR的检测测定法、或基于抗体的检测测定法来进行。一个非限制性实例是体外传染性测试，其被称为组织培养感染剂量50(TCID₅₀)测试。在该测定中，液体样品和其递减稀释液被分配进入接种有细胞的96孔板，该细胞能够用作被测定的含有脂质外套的病毒的寄主。在接种后，孔板在足以允许病毒在宿主细胞中复制的温度下被温育一定时间。在温育后，通过显微镜检验细胞的感染信号，比如，裂解的细胞、显示出细胞致病变作用的细胞、或者任何其他指示病毒感染的标准。由阳性(病毒感染)孔和阴性孔(无病毒感染)的分布，计算出病毒滴度。任何显示阳性感染信号的孔的缺少表示液体基本上不含含有脂质外套的病毒。

另一种基于细胞培养的测定是噬菌斑测定，其中在细胞培养物层中被病毒诱导的的效果是看得见的、或者使其能够肉眼看得见噬菌斑。任何噬菌斑的缺少表示液体基本上不含含有脂质外套的病毒。

本申请说明书部分地提供一种混合物，其在保温后具有的蛋白质活性为在与在此公开的有机溶剂和表面活性剂一起保温之前提供的蛋白质活性的至少25％。在该实施方式的一个方面，混合物在保温后具有的蛋白质活性例如为在保温之前提供的蛋白质活性的大约25％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、或者大约100％。在该实施方式的其他方面，混合物在保温后具有的蛋白质活性例如为在保温之前提供的蛋白质活性的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或者至少95％。在该实施方式的其他方面，混合物在保温后具有的蛋白质活性例如为在保温之前提供的蛋白质活性的大约25％至大约100％、大约30％至大约100％、大约40％至大约100％、大约50％至大约100％、大约60％至大约100％、大约70％至大约100％、大约75％至大约100％、大约80％至大约100％、大约85％至大约100％、大约90％至大约100％、大约25％至大约95％、大约30％至大约95％、大约40％至大约95％、大约50％至大约95％、大约60％至大约95％、大约70％至大约95％、大约75％至大约95％、大约80％至大约95％、大约85％至大约95％、大约90％至大约95％、大约25％至大约90％、大约30％至大约90％、大约40％至大约90％、大约50％至大约90％、大约60％至大约90％、大约70％至大约90％、大约75％至大约90％、大约80％至大约90％、或者大约85％至大约90％。

本申请说明书部分地提供如下方案，在保温后存在于混合物中的蛋白质活性例如是在与在此公开的有机溶剂和表面活性剂一起保温之前提供的蛋白质活性的至少25％。在该实施方式的一个方面，在保温后存在于混合物中的蛋白质活性例如为在保温之前提供的蛋白质活性的大约25％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、或者大约100％。在该实施方式的其他方面，在保温后存在于混合物中的蛋白质活性例如为在保温之前提供的蛋白质活性的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或者至少95％。在该实施方式的其他方面，在保温后存在于混合物中的蛋白质活性例如为在保温之前提供的蛋白质活性的大约25％至大约100％、大约30％至大约100％、大约40％至大约100％、大约50％至大约100％、大约60％至大约100％、大约70％至大约100％、大约75％至大约100％、大约80％至大约100％、大约85％至大约100％、大约90％至大约100％、大约25％至大约95％、大约30％至大约95％、大约40％至大约95％、大约50％至大约95％、大约60％至大约95％、大约70％至大约95％、大约75％至大约95％、大约80％至大约95％、大约85％至大约95％、大约90％至大约95％、大约25％至大约90％、大约30％至大约90％、大约40％至大约90％、大约50％至大约90％、大约60％至大约90％、大约70％至大约90％、大约75％至大约90％、大约80％至大约90％、或者大约85％至大约90％。

蛋白质活性的检测能够通过任何测定法来完成，所述测定法能够定性地或者定量地测量指示与被监控蛋白质有关的活性的特征，包括，但不限于：非特异性蛋白质测定，比如紫外线吸收、或者基于化合物的测定法比如Bradford测定；或者特异性蛋白质测定，比如体外测定、基于细胞的测定、或者体内测定。用于检测在此公开的蛋白质活性的实际测定法，可以由本领域技术人员通过考虑一些因素来确定，所述因素包括、但不限于：被测定的蛋白质、在保温后存在于混合物中的蛋白质含量、被测定的特征、以及本领域技术人员的偏好。

例如，以凝血级联为基础的显色分析能够被用于检测因子VIII活性。在该测定中，被凝血酶活化的因子VIII与因子IXa一起形成复合物，并且该复合物随后活化因子X。被激活的因子X活性能够通过显色底物水解来取得，该水解可释出显色基团比如对硝基-苯胺(pNA)。通过在dOD中于405nm处测量的每分钟吸光度变化而测定的pNA释放的初速度与样品中因子Xa活性、以及随后的因子VIII活性成正比。通过使用过量的因子IXa、以及因子X，因子X的激活速度单独地与存在于样品中的被凝血酶裂解的因子VIII含量成正比。作为另一种选择，因子IXa活性可以通过改变条件、以使得因子VIII和因子X过量来测定，这样，因子IXa是速度限制性的。类似地，因子X活性可以通过改变条件、以使得因子VIII和因子IXa过量来测定，这样，因子X是速度限制性的。因此、因子VIII活性，以及因子IXa并且和因子X、能够通过使用显色分析以凝血级联为基础来检测。

作为另一个实例，应用部分活化部分凝血活酶时间(APTT)的单级凝固性测试方法能够被用于检测因子VIII活性。在该测定中，包含因子VIII的样品与CaCl₂一起被加至因子VIII不足的血浆中，以便促进凝血，并且该样品对血浆的APTT凝固时间的影响是测量因子VIII活性的尺度。通过将观察到的因子VIII活性与由已知的因子VIII活性的样品产生的标准曲线相比较，计算出未知样品的活性。通过使用被测定蛋白质不足的血浆，该血液凝固测定也可以被用于任何与凝血级联有关的其他蛋白质。

本申请说明书部分地提供一种混合物，其在保温后基本上不含具有活性的蛋白质的蛋白质聚集体。这里使用的术语“基本上不含蛋白质聚集体”意思指仅有痕量的具有活性的蛋白质(所关注的蛋白质)的蛋白质聚集体能够通过仪器或者方法被检测到或者证实，所述仪器或者方法被用于检测或者证实蛋白质聚集体的存在或者活性。这样的痕量的蛋白质聚集体不足以危害人类健康，比如不足以援引个体中的免疫反应。在该实施方式的一个方面，混合物在保温后完全不含具有活性的蛋白质的蛋白质聚集体。这里使用的术语“完全不含蛋白质聚集体”意思指：具有活性的蛋白质(所关注的蛋白质)的蛋白质聚集体在仪器或者方法的检测范围内不能被仪器或者方法检测到或者证实，其中所述仪器或者方法被用于检测或者证实蛋白质聚集体的存在或活性。基本上不含或者完全不含具有活性的蛋白质(所关注的蛋白质)的蛋白质聚集体的液体能够被用于制备可安全给药于人的药物组合物，因为该蛋白质聚集体不足以危害人类健康。

在该实施方式的一些方面，在保温后混合物中呈聚集体形式的具有活性的蛋白质少于例如大约10％、大约9％、大约8％、大约7％、大约6％、大约5％、大约4％、大约3％、大约2％、大约1％、大约0.9％、大约0.8％、大约0.7％、大约0.6％、大约0.5％、大约0.4％、大约0.3％、大约0.2％、大约0.1％、大约0.09％、大约0.08％、大约0.07％、大约0.06％、大约0.05％、大约0.04％、大约0.03％、大约0.02％、或者大约0.01％。在该实施方式的其他方面，在保温后混合物中呈聚集体形式的具有活性的蛋白质例如为少于大约1％至大约0.01％、0.9％至大约0.01％、0.8％至大约0.01％、0.7％至大约0.01％、0.6％至大约0.01％、0.5％至大约0.01％、0.4％至大约0.01％、0.3％至大约0.01％、0.2％至大约0.01％、或者0.1％至大约0.01％。

形成蛋白质聚集体的检测能够通过任何测定法完成，所述测定法能够定性地或者定量地测量与被监控的所关注蛋白质有关的蛋白质聚集体的存在或者活性，包括、但不限于：在此公开的大小排阻色谱法结合非特异性和/或特异性蛋白质测定。用于检测在此公开的蛋白质聚集体的实际测定法，可以由本领域技术人员通过考虑一些因素来确定，所述因素包括、但不限于：被测定的蛋白质、在保温后存在于混合物中的蛋白质含量、被测定的特征、以及本领域技术人员的偏好。

在此公开的方法可以进一步包括在保温后从混合物中除去在此公开的方法中使用的有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分的步骤。在完成的在此公开的方法后，有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分可以被除去。通常使用的用于去除清洁剂的方法包括萃取、过滤、渗滤、缓冲液交换、亲合层析或者离子交换层析、沉淀、或者冻干。参见例如下述文献：蛋白质科学中的当前方案,“常规色谱分离”，第8-9章,(JohnWiley&Sons公司，Hoboken，新泽西州)，在此通过引用将其全部内容并入本文。在去除步骤后，残留的有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分的含量是当给药于人时基本上没有长期或持久的不利影响的含量。

在一种实施方式中，混合物在除去有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分之后基本上不含有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分。这里使用的术语“基本上不含有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分”意思指仅有痕量的有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分能够通过仪器或者方法被检测到或者证实，其中所述仪器或者方法被用于检测或者证实有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分的存在或活性，并且这样的痕量的有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分当给药于人时没有长期或持久的不利影响。在该实施方式的一个方面，混合物在除去有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分之后完全不含有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分。这里使用的术语“完全不含有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分”意思指：有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分在仪器或者方法的检测范围内不能被仪器或者方法检测到或者证实，其中所述仪器或者方法被用于检测或者证实有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分的存在或活性。在基本上不含或者完全不含有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分的混合物内部包含的蛋白质能够被用于制备可安全给药于人的药物组合物，因为该有机溶剂、表面活性剂、和/或其他试剂或者组分的含量不足以危害人类健康。

在该实施方式的一些方面，残留在混合物中的有机溶剂含量是例如大约1ppm、大约3ppm、大约5ppm、大约10ppm、大约15ppm、大约20ppm、大约25ppm、大约30ppm、或者大约35ppm。在该实施方式的其他方面，残留在混合物中的有机溶剂含量是例如不超过1ppm、不超过3ppm、不超过5ppm、不超过10ppm、不超过15ppm、不超过20ppm、不超过25ppm、不超过30ppm、或者不超过35ppm。在该实施方式的其他方面，残留在混合物中的有机溶剂含量是例如大约1ppm至大约20ppm、大约1ppm至大约25ppm、大约1ppm至大约30ppm、大约1ppm至大约35ppm、大约3ppm至大约20ppm、大约3ppm至大约25ppm、大约3ppm至大约30ppm、或者大约3ppm至大约35ppm。

在该实施方式的一些方面，残留在混合物中的表面活性剂含量是例如大约1ppm、大约3ppm、大约5ppm、大约10ppm、大约15ppm、大约20ppm、大约25ppm、大约30ppm、大约35ppm、大约40ppm、大约45ppm、大约50ppm、大约55ppm、大约60ppm、大约65ppm、大约70ppm、大约75ppm、大约80ppm、大约85ppm、大约90ppm、或者大约100ppm。在该实施方式的其他方面，残留在混合物中的表面活性剂含量是例如不超过1ppm、不超过10ppm、不超过20ppm、不超过30ppm、不超过40ppm、不超过50ppm、不超过60ppm、不超过70ppm、不超过80ppm、不超过90ppm、或者不超过100ppm。在该实施方式的其他方面，残留在混合物中的表面活性剂含量是例如大约1ppm至大约25ppm、大约1ppm至大约50ppm、大约1ppm至大约75ppm、大约1ppm至大约100ppm、大约5ppm至大约25ppm、大约5ppm至大约50ppm、大约5ppm至大约75ppm、大约5ppm至大约100ppm、大约10ppm至大约25ppm、大约10ppm至大约50ppm、大约10ppm至大约75ppm、或者大约10ppm至大约100ppm。

在该实施方式的一个方面，残留在混合物中的有机溶剂含量是不超过35ppm、并且残留在混合物中的表面活性剂含量是不超过100ppm。在该实施方式的另一个方面，残留在混合物中的有机溶剂含量是不超过3ppm、并且残留在混合物中的表面活性剂含量是不超过10ppm。在该实施方式的另一个方面，残留在混合物中的有机溶剂含量是大约1ppm至大约35ppm、并且残留在混合物中的表面活性剂含量是大约1ppm至大约100ppm。

在该实施方式的另一个方面，在此公开的方法不包含在保温后从混合物中除去有机溶剂的步骤。在该实施方式的另一个方面，在此公开的方法不包含在保温后从混合物中除去表面活性剂的步骤。

在此公开的方法可以进一步包含在保温后从混合物中除去病毒的步骤。这里使用的术语“除去病毒”或者“病毒的去除”指的是从在此公开的混合物中减少病毒、以使得病毒颗粒有效地从混合物中抽出的方法。该病毒可能是活的病毒或者灭活的病毒。去除(或除去)步骤典型地通过大小排阻色谱法或者阳性吸附色谱法完成，其中所关注的蛋白质结合于色谱树脂。在去除步骤后，残留的病毒的含量是当给药于人时基本上没有长期或持久的不利影响的含量。

在一种实施方式中，混合物在除去病毒步骤之后基本上不含病毒。这里使用的术语“基本上不含病毒”意思指：仅痕量的病毒能够被仪器或者方法检测到或者被证实，并且这样的痕量的病毒不足以危害人类健康，其中所述仪器或者方法被用于检测或者证实病毒的存在或活性。在该实施方式的一个方面，混合物在除去病毒步骤之后完全不含病毒。这里使用的术语“完全不含病毒”意思指：病毒在仪器或者方法的检测范围内不能被仪器或者方法检测到或者证实，其中所述仪器或者方法被用于检测或者证实病毒的存在或活性。在基本上不含或者完全不含病毒的混合物内部包含的蛋白质能够被用于制备可安全给药于人的药物组合物，因为该病毒不足以危害人类健康。

在该实施方式的其他方面，混合物在病毒去除步骤之后包含少于1x10¹PFU/mL的病毒、比如少于1x10⁰PFU/mL的病毒、少于1x10^-1PFU/mL的病毒、少于1x10^-2PFU/mL的病毒、或者少于1x10^-3PFU/mL的病毒。

在该实施方式的其他方面，混合物在病毒去除步骤之后包含的病毒例如比病毒的ID₅₀低至少10倍、比病毒的ID₅₀低至少100倍、比病毒的ID₅₀低至少200倍、比病毒的ID₅₀低至少300倍、比病毒的ID₅₀低至少400倍、比病毒的ID₅₀低至少500倍、比病毒的ID₅₀低至少600倍、比病毒的ID₅₀低至少700倍、比病毒的ID₅₀低至少800倍、比病毒的ID₅₀低至少900倍、或者比病毒的ID₅₀低至少1000倍。

在该实施方式的另一个方面，在此公开的方法不包含在保温后从混合物中除去病毒的步骤。

本申请说明书的一些方面还可以被描述如下：

1.一种灭活含有脂质外套的病毒的方法，该方法包括下述步骤：a)提供包含具有活性的蛋白质的液体；b)将有机溶剂和表面活性剂与该液体相混合，借此产生混合物；以及c)将该混合物保温至多大约120分钟；其中，两个步骤(b)和(c)在不高于大约20℃的温度下进行；其中，混合物在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒；以及其中，所述蛋白质在保温后的活性为步骤(a)中所提供活性的至少25％。

2.一种基本上不含含有脂质外套的病毒的蛋白质，其通过包括下述步骤的方法获得：a)提供包含具有活性的蛋白质的液体；b)将有机溶剂和表面活性剂与该液体相混合，借此产生混合物；以及c)将该混合物保温至多大约120分钟；其中，两个步骤(b)和(c)在不高于大约20℃的温度下进行；其中，混合物在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒；以及其中，所述蛋白质在保温后的活性为步骤(a)中所提供活性的至少25％。

3.一种灭活含有脂质外套的病毒的方法，该方法包括下述步骤：a)提供包含具有活性的因子VIII的液体；b)将有机溶剂和表面活性剂与该液体相混合，借此产生混合物；以及c)将该混合物保温至多大约120分钟；其中，两个步骤(b)和(c)在不高于大约20℃的温度下进行；其中，混合物在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒；以及其中，因子VIII在保温后的活性为步骤(a)中所提供活性的至少25％。

4.一种基本上不含含有脂质外套的病毒的因子VIII，其通过包括下述步骤的方法获得：a)获得包含具有活性的因子VIII的液体；b)将有机溶剂和表面活性剂与该液体相混合，借此产生混合物；以及c)将该混合物保温至多大约120分钟；其中，两个步骤(b)和(c)在不高于大约20℃的温度下进行；其中，混合物在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒；以及其中，因子VIII在保温后的活性为步骤(a)中所提供活性的至少25％。

5.如1-4所述的实施方式，其中，液体是细胞裂解液、细胞上清液、来自在前提纯步骤的洗脱液、或者生物液体。

6.如5所述的实施方式，其中，细胞裂解液是由哺乳动物细胞系获得的。

7.如6所述的实施方式，其中，细胞哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

8.如1-4所述的实施方式，其中，蛋白质是重组体蛋白质。

9.如1-4所述的实施方式，其中，蛋白质来自生物体或者转基因生物体。

10.如8-9所述的实施方式，其中，蛋白质是血液蛋白质。

11.如10所述的实施方式，其中，血液蛋白质是凝血蛋白质。

12.如8-10所述的实施方式，其中，血液蛋白质是ADAMTS-13、α1-抗血纤维蛋白酶、α2-抗血纤维蛋白酶、抗凝血酶、抗凝血酶III、癌症前凝血剂、促红细胞生成素、因子II、因子V、因子VI、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纤连蛋白、纤维蛋白原、肝素辅因子II、高分子量激肽原、肌内免疫球蛋白、静脉内免疫球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、激肽释放酶原、蛋白质C、蛋白质S、蛋白质Z、蛋白质Z相关蛋白酶抑制剂、组织因子、组织纤溶酶原激活物、尿激酶、或者冯维勒布兰特因子。

13.如1-12所述的实施方式，其中，有机溶剂是醚、醇、磷酸二烷基酯或者磷酸三烷基酯。

14.如13所述的实施方式，其中，醚是二甲醚、二乙醚、乙基丙基醚、甲基丁基醚、甲基异丙基醚、或者甲基异丁基醚。

15.如13所述的实施方式，其中，醇是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、或者异戊醇。

16.如13所述的实施方式，其中，磷酸二烷基酯是磷酸二(正丁)酯、磷酸二(叔丁)酯、磷酸二(正己)酯、磷酸二(2-乙基己)酯、磷酸二(正癸)酯、或者磷酸乙基二(正丁基)酯。

17.如13所述的实施方式，其中，磷酸三烷基酯是磷酸三(正丁)酯、磷酸三(叔丁)酯、磷酸三(正己)酯、磷酸三(2-乙基己)酯、磷酸三(正癸)酯、或者磷酸三(正癸)酯。

18.如1-17所述的实施方式，其中，有机溶剂的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约5.0％(v/v)、大约0.1％(v/v)至大约1.0％(v/v)、大约0.2％(v/v)至大约0.5％(v/v)、或者大约0.2％(v/v)至大约0.4％(v/v)、大约0.3％(v/v)。

19.如1-18所述的实施方式，其中，表面活性剂是离子型表面活性剂、两性离子型(两性)表面活性剂、或者非离子型表面活性剂。

20.如19所述的实施方式，其中，离子型表面活性剂是阴离子表面活性剂或者阳离子表面活性剂。

21.如20所述的实施方式，其中，阴离子表面活性剂是烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、多库酯、磺酸盐氟表面活性剂、烷基苯磺酸盐、烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐、烷基羧酸盐、月桂酰肌氨酸钠、或者羧酸盐氟表面活性剂。

22.如21所述的实施方式，其中，烷基硫酸盐是月桂基硫酸铵或者十二烷基硫酸钠(SDS)。

23.如21所述的实施方式，其中，烷基醚硫酸盐是月桂醇聚醚硫酸钠或者肉豆蔻醇聚醚硫酸钠。

24.如21所述的实施方式，其中，多库酯是琥珀磺酸二辛钠。

25.如21所述的实施方式，其中，磺酸盐氟表面活性剂是全氟辛烷磺酸盐(PFOS)或者全氟丁烷磺酸盐。

26.如21所述的实施方式，其中，烷基羧酸盐是脂肪酸盐或者硬脂酸钠。

27.如21所述的实施方式，其中，羧酸盐氟表面活性剂是全氟壬酸盐和全氟辛酸盐。

28.如20所述的实施方式，其中，阳离子表面活性剂是烷基三甲基铵盐、氯化十六烷吡啶(CPC)、聚乙氧基化动物脂胺(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、氯化苄乙氧铵(BZT)、5-溴-5-硝基-1,3-二氧杂环已烷、二甲基二(十八基)氯化铵、二(十八基)二甲基溴化铵(DODAB)、pH依赖性伯胺、pH依赖性仲胺、或者pH依赖性叔胺。

29.如28所述的实施方式，其中，烷基三甲基铵盐是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或者十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)。

30.如28所述的实施方式，其中，伯胺在pH<10下变得带正电，或者仲胺在pH<4下变得带电。

31.如20所述的实施方式，其中，阳离子表面活性剂是奥替尼啶二盐酸盐。

32.如20所述的实施方式，其中，两性离子表面活性剂是3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、磺基甜菜碱(sultaine)、甜菜碱、或者卵磷脂。

33.如32所述的实施方式，其中，磺基甜菜碱是椰油酰胺丙基羟基磺基丙基甜菜碱。

34.如32所述的实施方式，其中，甜菜碱是椰油酰胺丙基甜菜碱。

35.如20所述的实施方式，其中，非离子型表面活性剂是聚氧乙二醇脱水山梨醇烷基酯、泊洛沙姆、烷基酚聚乙二醇醚、聚乙二醇烷基芳基醚、聚氧乙二醇烷基醚、2-十二烷氧基乙醇(-PX)、聚氧乙二醇辛基苯酚醚、聚氧乙二醇烷基酚醚、苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇、葡萄糖苷烷基醚、麦芽糖苷烷基醚、硫葡糖苷烷基醚、毛地黄皂苷、甘油烷基酯、烷基芳基聚醚硫酸酯、醇磺酸酯、脱水山梨醇烷基酯、椰油酰胺乙醇胺、蔗糖单月桂酸酯、十二基二甲胺氧化物、或者胆酸钠。

36.如35所述的实施方式，其中，聚氧乙二醇脱水山梨醇烷基酯是聚山梨酸酯20单油酸山梨醇酐酯(20)、聚山梨酸酯40单油酸山梨醇酐酯(40)、聚山梨酸酯60单油酸山梨醇酐酯(60)、聚山梨酸酯61单油酸山梨醇酐酯(61)、聚山梨酸酯65单油酸山梨醇酐酯(65)、聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)、或者聚山梨酸酯81单油酸山梨醇酐酯(81)。

37.如35所述的实施方式，其中，泊洛沙姆是泊洛沙姆124(L44)、泊洛沙姆181(L61)、泊洛沙姆182(L62)、泊洛沙姆184( L64)、泊洛沙姆188(F68)、泊洛沙姆237(F87)、泊洛沙姆338(L108)、或者泊洛沙姆407(F127)。

38.如35所述的实施方式，其中，聚氧乙二醇烷基醚是八乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十二烷基醚、30、或者35。

39.如35所述的实施方式，其中，聚氧乙二醇辛基苯酚醚是聚氧乙烯(4-5)对叔辛基酚(X-45)或者聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)。

40.如35所述的实施方式，其中，聚氧乙二醇烷基酚醚是壬基酚聚氧乙烯醚-9。

41.如35所述的实施方式，其中，苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇是壬基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇或者辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇。

42.如35所述的实施方式，其中，葡萄糖苷烷基醚是辛基吡喃葡萄糖苷。

43.如35所述的实施方式，其中，麦芽糖苷烷基醚是十二基麦芽糖苷。

44.如35所述的实施方式，其中，硫葡糖苷烷基醚是庚基硫代吡喃葡萄糖苷。

45.如35所述的实施方式，其中，甘油烷基酯是月桂酸甘油酯。

46.如35所述的实施方式，其中，椰油酰胺乙醇胺是椰油酰胺单乙醇胺或者椰油酰胺二乙醇胺。

47.如1-46所述的实施方式，其中，表面活性剂的终浓度是大约0.1％(v/v)至约10.0％(v/v)、或者大约0.5％(v/v)至约5.0％(v/v)。

48.如1-47所述的实施方式，其中，表面活性剂是多种表面活性剂。

49.如1-48所述的实施方式，其中，多种表面活性剂是如权利要求19-46中所述的表面活性剂。

50.如48或49所述的实施方式，其中，一种表面活性剂的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约10.0％(v/v)、大约0.5％(v/v)至大约5.0％(v/v)、或者大约0.5％(v/v)至大约1.0％(v/v)，并且其余的表面活性剂的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约5％(v/v)、大约0.1％(v/v)至大约1.0％(v/v)、或者大约0.2％(v/v)至大约4％(v/v)。

51.如1-50所述的实施方式，其中，在步骤(c)中混合物被保温大约10分钟至大约90分钟。

52.如1-50所述的实施方式，其中，在步骤(c)中混合物被保温大约30分钟至大约60分钟。

53.如1-52所述的实施方式，其中，两个步骤(b)和(c)是在大约0℃和大约16℃之间的温度下进行。

54.如1-52所述的实施方式，其中，两个步骤(b)和(c)是在大约2℃和大约12℃之间的温度下进行。

55.如1-52所述的实施方式，其中，两个步骤(b)和(c)是在大约2℃和大约8℃之间的温度下进行。

56.如1-52所述的实施方式，其中，两个步骤(b)和(c)是在大约2℃和大约4℃之间的温度下进行。

57.如1-56所述的实施方式，其中，混合物在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒。

58.如1-57所述的实施方式，其中，混合物在保温后完全不含活的含有脂质外套的病毒。

59.如1-58所述的实施方式，其中，混合物在保温后包含少于1x10¹PFU/mL的活的含有脂质外套的病毒。

60.如1-59所述的实施方式，其中，混合物在保温后包含的活的含有脂质外套的病毒比在保温之前包含的活的含有脂质外套的病毒的ID₅₀低至少100倍。

61.如1-60所述的实施方式，其中，混合物在保温后基本上不含蛋白质聚集体。

62.如1-61所述的实施方式，其中，混合物在保温后完全不含蛋白质聚集体。

63.如1-62所述的实施方式，其中，混合物在保温后包含的呈聚集体形式的具有活性的蛋白质少于大约1％、少于大约0.9％、少于大约0.8％、少于大约0.7％、少于大约0.6％、少于大约0.5％、少于大约0.4％、少于大约0.3％、少于大约0.2％、或者少于大约0.1％。

64.如1-63所述的实施方式，其中，在保温后存在于混合物中的蛋白质活性是步骤(a)中所提供的蛋白质活性的至少50％、或者步骤(a)中所提供的蛋白质活性的至少75％。

65.如1-64所述的实施方式，其中，液体还包括含有脂质外套的病毒。

66.如65所述的实施方式，其中，含有脂质外套的病毒是DNA病毒、RNA病毒、或者反转录病毒。

67.如66所述的实施方式，其中，DNA病毒是疱疹病毒、痘病毒、或者肝DNA病毒。

68.如66所述的实施方式，其中，RNA病毒是黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、δ病毒、正粘病毒、副粘病毒、弹状病毒、本雅病毒、或者纤丝病毒。

69.如66所述的实施方式，其中，反转录病毒是反转录病毒或肝DNA病毒。

70.如65所述的实施方式，其中，含有脂质外套的病毒是艾滋病毒、辛德毕斯病毒、单纯疱疹病毒、假狂犬病毒、仙台病毒、水泡性口膜炎病毒、西尼罗河病毒、牛病毒性腹泻病毒、冠状病毒、马关节炎病毒、严重急性呼吸综合症病毒、莫洛尼鼠白血病毒、或者牛痘病毒。

71.如1-70所述的实施方式，其中，该方法还包括在步骤(c)之后从混合物中除去溶剂的步骤。

72.如1-71所述的实施方式，其中，该方法还包括在步骤(c)之后从混合物中除去非离子型表面活性剂的步骤。

73.如1-72所述的实施方式，其中，该方法还包括在步骤(c)之后从混合物中除去非存活病毒的步骤。

74.一种灭活含有脂质外套的病毒的方法，该方法包括下述步骤：a)提供包含具有活性的因子VIII的液体；b)将磷酸三(正丁)酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、以及聚山梨酸酯80脱水山梨醇与所述液体混合，借此产生混合物，其中磷酸三(正丁)酯的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约5.0％(v/v)、聚氧乙烯辛基苯基醚的终浓度是大约0.5％(v/v)至大约10.0％(v/v)、聚山梨酸酯80脱水山梨醇的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约5.0％(v/v)；以及c)将该混合物保温至多大约120分钟；其中，两个步骤(b)和(c)在不高于大约20℃的温度下进行；其中，混合物在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒；并且其中，因子VIII在保温后的活性为步骤(a)中所提供活性的至少25％。

75.一种基本上不含含有脂质外套的病毒的因子VIII，其由包括下述步骤的方法获得：a)获得包含具有活性的因子VIII的液体；b)将磷酸三(正丁)酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、以及聚山梨酸酯80脱水山梨醇与所述液体混合，借此产生混合物，其中磷酸三(正丁)酯的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约5.0％(v/v)、聚氧乙烯辛基苯基醚的终浓度是大约0.5％(v/v)至大约10.0％(v/v)、聚山梨酸酯80脱水山梨醇的终浓度是大约0.1％(v/v)至大约5.0％(v/v)；以及c)将该混合物保温至多大约120分钟；其中，两个步骤(b)和(c)在不高于大约20℃的温度下进行；其中，混合物在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒；并且其中，因子VIII在保温后的活性为步骤(a)中所提供活性的至少25％。

76.如74或75所述的实施方式，其中，磷酸三(正丁)酯的浓度是大约0.1％(v/v)至大约0.7％，聚氧乙烯辛基苯基醚的浓度是大约0.6％(v/v)至大约1.4％(v/v)，并且聚山梨酸酯80脱水山梨醇的浓度是大约0.1％(v/v)至大约0.7％。

77.如74或75所述的实施方式，其中，磷酸三(正丁)酯的浓度是大约0.1％(v/v)至大约0.5％，聚氧乙烯辛基苯基醚的浓度是大约0.7％(v/v)至大约1.3％(v/v)，并且聚山梨酸酯80脱水山梨醇的浓度是大约0.1％(v/v)至大约0.5％。

78.如74或75所述的实施方式，其中，磷酸三(正丁)酯的浓度是大约0.2％(v/v)至大约0.4％，聚氧化乙烯辛基苯基醚的浓度是大约0.8％(v/v)至大约1.2％(v/v)，并且聚山梨酸酯80脱水山梨醇的浓度是大约0.2％(v/v)至大约0.4％。

79.如74或75所述的实施方式，其中，磷酸三(正丁)酯的浓度是大约0.3％，聚氧化乙烯辛基苯基醚的浓度是大约1.0％(v/v)，并且聚山梨酸酯80脱水山梨醇的浓度是大约0.3％(v/v)。

80.如74-79所述的实施方式，其中，混合物在保温后包含的呈聚集体形式的具有活性的蛋白质少于大约1％、少于大约0.9％、少于大约0.8％、少于大约0.7％、少于大约0.6％、少于大约0.5％、少于大约0.4％、少于大约0.3％、少于大约0.2％、或者少于大约0.1％。

81.如74-80所述的实施方式，其中，在保温后存在于混合物中的蛋白质活性是步骤(a)中所提供的蛋白质活性的至少50％、或者步骤(a)中所提供的蛋白质活性的至少75％。

82.在本文中描述的如1-81所述的实施方式。

83.一种在本文中描述的灭活含有脂质外套的病毒的方法。

84.一种由在本文中描述的方法获得的基本上不含含有脂质外套的病毒的因子VIII。

85.一种由在本文中描述的方法获得的基本上不含含有脂质外套的病毒的蛋白质。

实施例

提供下述非限制性实施例，仅用于说明目的，以便有利于更全面地理解有代表性的优选的实施方式。这些实施例不应该被认为是限制本申请说明书中所述实施方式中的任何一种，包括那些属于在此公开的灭活含有脂质外套的病毒的方法和使用该方法处理的产物。

实施例1

病毒灭活评估

该实施例显示，在此公开的用于灭活含有脂质外套的病毒的方法可得到一种混合物，其在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒。

通过收集细胞培养基、并且离心除去细胞碎屑，来收获可将蛋白质分泌入细胞培养基中的CHO细胞系所产生的重组因子VIII。在保持等于或低于10℃的低温室中，稀释被收获的上清液，通过0.2μM过滤器过滤，并且通过流过包含固定化α-因子VIII小鼠单克隆抗体的免疫亲和层析柱并收集洗脱液来捕集因子VIII。通过使免疫亲和层析法洗脱液流过包含带负电的磺化基团的阳离子交换层析柱，来进一步处理因子VIII。从该交换柱收集的洗脱液然后被冷却至大约2℃或大约10℃。

冷却的洗脱液然后被分成三个等分，并且以1:13的比率(例如、24mL加工进料加2mL的病毒保藏液)加入被脂质包裹的模型病毒假狂犬病毒。然后将这些等分与溶剂/清洁剂溶液混合，并且冷却至相同的温度，如下所述：等分1，0.21％(v/v)磷酸三(正丁)酯(TNBP)、0.7％(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)和0.21％(v/v)聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)；等分2，0.06％(v/v)磷酸三(正丁)酯(TNBP)、0.2％(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)和0.06％(v/v)聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯( 80)；等分3，0.03％(v/v)磷酸三(正丁)酯(TNBP)、0.1％(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)和0.03％(v/v)聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)。溶剂/清洁剂溶液的组分浓度分别等同于这些组分在常规制造期间标准浓度的70％、20％和10％。这些次最佳的浓度通过采用最小有利于病毒灭活的条件被用于评估该方法的实用性，以及用于评估灭活动力学。

为了取得S/D处理的有效性，测定被脂质包裹的病毒的log₁₀下降值。抽取来自掺入病毒的起始原料的和在S/D处理期间的样品；在病毒滴定之前通过用冷的细胞培养基立即稀释，停止样品中溶剂/清洁剂组分的病毒灭活效果。通过从掺入病毒的起始原料的(Log)滴度减去最终样品的(Log)滴度，计算出Log下降倍数。如果在最终的样品中没有能够发现传染性，则取为该计算的检测极限。

结果表明，在大约2℃或大约10℃下，假狂犬病毒灭活出现在大约1至大约2分钟内(表1)。当实验性操作是在等于或低于溶剂/清洁剂组分含量下限处、并且低于S/D处理持续时间的下限处进行时，获得的下降倍数是大规模工艺的病毒灭活能力的实用估计值。这些结果显示，在大约10℃和在大约2℃下的S/D处理是实用的，并且可非常有效地并快速地灭活脂质包膜病毒。

实施例2

病毒灭活评估

该实施例显示，在此公开的用于灭活含有脂质外套的病毒的方法可得到一种混合物，其在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒。

基本上按照在实施例1中描述的方法表达并纯化重组因子VIII。从阳离子交换柱收集的洗脱液然后被冷却至大约2℃。

冷却后的洗脱液然后被分成6个等分，并且将脂质包膜病毒以1:13的比率(例如，24mL工艺进料加2mL的病毒保藏液)加至这些等分中，如下所述：等分1和等分2，加入假狂犬病毒(PRV)；等分3和等分4，加入莫洛尼鼠白血病毒(X-MuLV)；等分5和等分6，加入牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。然后将这些等分与溶剂/清洁剂溶液混合，并且冷却至大约2℃，如下所述：等分1、等分3和等分5；0.21％(v/v)磷酸三(正丁)酯(TNBP)、0.7％(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)和0.21％(v/v)聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)；等分2、等分4和等分6；0.03％(v/v)磷酸三(正丁)酯(TNBP)、0.1％(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)和0.03％(v/v)聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)。溶剂/清洁剂溶液的组分浓度分别等同于这些组分在常规制造时标准浓度的70％和10％。这些次最佳的浓度通过采用最小有利于病毒灭活的条件被用于评估该方法的实用性，以及用于评估灭活动力学。

为了取得S/D处理的有效性，测定三种被脂质包裹的病毒中的每一个的log₁₀下降值。抽取来自掺入病毒的起始原料的和在S/D处理期间的样品；在病毒滴定之前通过用冷的细胞培养基立即稀释，停止样品中溶剂/清洁剂组分的病毒灭活效果。通过从掺入病毒的起始原料的(Log)滴度减去最终样品的(Log)滴度，计算出Log下降倍数。如果在最终的样品中没有能够发现传染性，则取为该计算的检测极限。

结果表明，当与70％溶剂/清洁剂溶液一起孵育时，PRV、X-MuLV、以及BVDV灭活在大约2℃下全都出现在大约1-2分钟内(表2)。当实验性操作是在等于或低于溶剂/清洁剂组分含量下限处、并且低于S/D处理持续时间的下限处进行时，获得的下降倍数是大规模工艺的病毒灭活能力的实用估计值。这些结果显示，S/D处理在大约2℃下是实用的，并且可非常有效地并快速地灭活脂质包膜病毒。

实施例3

混合时间、过滤、以及蛋白质产率的评估

该实施例显示，在此公开的用于灭活含有脂质外套的病毒的方法对溶剂/清洁剂组分的混合时间、在过滤期间溶剂/清洁剂组分的保持、以及蛋白质过滤量没有消极影响。

为了评估较低温度对溶剂/清洁剂组分混合时间的影响，通过添加0.3％(v/v)TNBP、1.0％(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)和0.3％(v/v)聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)、并在4±2℃下搅拌10、20、或30分钟，制备出50mL溶剂/清洁剂溶液。因为溶剂/清洁剂溶液已经含有0.1％聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)，所以该化合物的终浓度是0.4％。通过使用具有折光率检测器(RID)的C18RP-HPLC，同时地测定TNBP和聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)的浓度。通过使用蒸发光散射检测器(ELSD)，用C1RP-HPLC测定聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)的浓度。对于TNBP和聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)的HPLC分析，采用使用水中68％甲醇的无梯度洗脱。在聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)的测定中，采用从水中60％甲醇至100％甲醇的梯度洗脱。

这些结果证实，TNBP、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)和聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)的浓缩在10分钟内快速固定化，并且4℃±2℃的低温对溶剂/清洁剂组分的混合时间没有消极影响(表3)。

为了影响温度对于在过滤步骤期间溶剂/清洁剂组分的可能残留的影响，通过添加0.3％(v/v)TNBP、1.0％(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)和0.3％(v/v)聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)、在4±2℃下搅拌30分钟，制备出50mL溶剂/清洁剂溶液，并且按如上所述方法测量各组分的浓度。然后在下述三个不同的温度条件下处理溶剂/清洁剂溶液：22.5℃加热期为大约8小时；22.5℃加热期为大约2小时；4℃，没有任何加热或者预热步骤。在保温期间末了，样品通过0.2μm过滤器进行过滤，并且通过HPLC测量TNBP、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)和聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)的浓度。

结果表明，没有溶剂/清洁剂组分被保留在0.2μm过滤器上(表4)。另外，较低的保温温度(4℃±2℃)对溶剂/清洁剂组分的滤过率没有消极影响。

为了评估较低温度对恢复的蛋白质活性的影响，通过添加0.3％(v/v)TNBP、1.0％(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)和0.3％(v/v)聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯( 80)、在4±2℃下搅拌30分钟，制备出50mL溶剂/清洁剂溶液。然后在下述三个不同的温度条件下处理溶剂/清洁剂溶液：22.5℃加热期为大约8小时；22.5℃加热期为大约2小时；4℃，没有任何加热或者预热步骤。在保温期间末了，样品通过0.2μm过滤器进行过滤，并且在过滤之前和过滤之后通过使用显色底物测定法来测量因子VIII活性。

为了进行因子VIII活性的显色分析，1等分的溶剂/清洁剂处理溶液在样品稀释度缓冲液(50mMTris、5mMCaCl₂、225mMNaCl、0.1％聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯( 80)、pH6.7±0.2))中被预稀释至大约25IU/mL，然后在因子VIII减少的血浆中进一步稀释至1IU/mL。然后将100μL的预稀释样品与0.03MCaCl₂、0.06mM磷脂、100μL的0.3μM因子IXa、100μL的1μM因子X、以及500μL的3.4μM显色底物CH₃OCO-D-环己基甘氨酰-甘氨酰基-精氨酰对硝基苯胺混合，以确保因子VIII是反应的速率限制组分。混合物在37℃下保温90秒钟，然后读取在405nm处的分光光度计读数，以便测定显色底物水解和对硝基-苯胺释放的速率。

在0.2μm过滤步骤之前和之后测量的因子VIII活性是等价的。该结果证实，在缺少S/D组分时，较低的温度对在0.2μm过滤步骤之后因子VIII的回收率没有消极影响。

结果表明，对于所有评估的温度条件，因子VIII回收率是大约100％；并且蛋白质活性在过滤步骤之前和之后是等价的，尽管存在溶剂/清洁剂组分(表5)。

实施例4

灭活包含具有活性的蛋白质的液体中的含有脂质外套的病毒

该实施例显示了在此公开的用于灭活包含具有活性的蛋白质的液体中的含有脂质外套的病毒的方法。

为了评估在此公开的用于灭活含有脂质外套的病毒的方法对于恢复的蛋白质活性的总体影响，通过添加0.3％(v/v)TNBP、1.0％(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)和0.3％(v/v)聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)、在4±2℃下搅拌30分钟，制备出50mL溶剂/清洁剂溶液。然后在下述三个不同的温度条件下处理溶剂/清洁剂溶液：22.5℃加热期为大约8小时；22.5℃加热期为大约2小时；4℃，没有任何加热或者预热步骤。在保温期间末了，样品通过离子交换柱色谱进行纯化，并且基本上按照在实施例3中描述的方法，在过滤之前和过滤之后通过使用显色底物测定法来测量因子VIII活性。

结果表明，用溶剂/清洁剂在4℃下进行处理2小时，因子VIII的平均回收率是83.02％；在22.5℃下进行处理2小时，平均回收率是82.83％；在22.5℃下进行处理8小时，平均回收率是80.93％(表6)。

这些结果证实，用溶剂/清洁剂在4℃下进行处理2小时不会显著地影响活性因子VIII的回收率。另外，当保温在4℃下进行而不是在22.5℃下进行时，因子VIII的比活力显示出保持得更好。当溶剂/清洁剂处理在22.5℃下进行时，损失大约6％的比活力；反之当溶剂/清洁剂处理在4℃下进行时，在因子VIII中观察到仅有轻微的比活力降低，降低大约1％。因此，用溶剂/清洁剂在低温下进行处理，观察到因子VIII平均回收率预料不到的提高。

实施例5

蛋白质聚集体的评估

该实施例显示，在此公开的用于灭活含有脂质外套的病毒的方法可预防蛋白质聚集。

为了评估低温下病毒灭活步骤对蛋白质聚集体形成的影响，在下述三个不同的温度条件下进行溶剂/清洁剂溶液处理：22.5℃加热期为大约8小时；22.5℃加热期为大约2小时；4℃，没有任何加热或者预热步骤。在所有的条件中，当达到目标温度时，加入溶剂/清洁剂试剂。在保温期间后，对于所有的温度条件设定为1小时，通过离子交换层析除去溶剂/清洁剂组分，并且在最终本体溶液中测量聚集体含量。所有的溶剂/清洁剂条件被重复三次。

通过在配备有Bio-Sep-SEC-S4000柱子的HPLC系统上进行大小排阻色谱(SEC)，进行聚集体(表示为百分率)的测定。固定相含有与二氧化硅支持物成键的亲水基团，该支持物适合于分离分子量范围是15-2,000kDa的蛋白质。取自溶剂/清洁剂处理溶液的样品被稀释降至50μg/mL，并且将11μL注射到柱子上。洗脱缓冲液是20mMTris、250mMNaCl、3mMCaCl₂二水合物、0.05％(v/v)聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)、7.5％(v/v)乙二醇、pH调节至7.0±0.2。在等浓度的流动相缓冲液下进行分离。使用荧光检测器在285nm激发波长和335nm发射波长处进行检测。响应值与存在于所得色谱的不同峰值中的蛋白质含量成正比。聚集体的百分比被计算为组分峰面积与总峰面积的比率(表7)。

出乎意料的是，在4℃下进行实验会导致不能检测到(<0.25％)最终本体洗脱液中的聚集体含量；反之，在22.5℃下进行该工序，检测到很大量的聚集体形成(0.7％和0.6％)。在最终本体溶液中聚集体的减少是重要的，因为聚集体通常被识别为增强对抗蛋白质单体形式的免疫反应。

实施例6

灭活包含具有活性的蛋白质的液体中的含有脂质外套的病毒

该实施例显示了在此公开的用于灭活包含具有活性的蛋白质的液体中的含有脂质外套的病毒的方法。

通过冷却至10℃、收集细胞培养基、以及离心除去细胞碎屑，来收获在2,500升生物反应器中培养、并且将蛋白质分泌入细胞培养基中的CHO细胞系所产生的重组因子VIII。在等于或低于10℃的低温室中，收获的上清液被稀释，并且通过0.2μm过滤器过滤，通过流过包含固定化α-因子VIII小鼠单克隆抗体的免疫亲和层析柱并收集洗脱液，来捕集因子VIII。通过使免疫亲和层析法洗脱液流过包含带负电的磺化基团的阳离子交换层析柱，来进一步处理因子VIII。大约8升来自该交换柱的被收集的洗脱液然后被冷却至大约4℃，并且与溶剂/清洁剂溶液混合大约10分钟、冷却至相同的温度，用量为16.6g溶剂/清洁剂溶液每kg阳离子交换器洗脱液。该溶剂/清洁剂溶液以18.3:66.3:20.2的重量比率包含磷酸三(正丁)酯(TNBP)、聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)、以及聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)。这等同于终浓度为大约0.3％(v/v)磷酸三(正丁)酯(TNBP)、大约1.0％(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)和大约0.3％(v/v)聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)。在大约4℃下连续混合不超过大约120分钟后，经溶剂/清洁剂处理的洗脱液然后通过0.2μm过滤器过滤，以便除去病毒碎片。经过滤的溶剂/清洁剂处理溶液用阴离子交换色谱平衡缓冲液稀释，并且进一步通过流过阴离子交换层析柱进行处理，以便除去溶剂/清洁剂组分。从阴离子交换色谱洗脱组分中收集最终的包含因子VIII的纯化溶液。然后在最终的包含因子VIII的纯化溶液中测量含有脂质外套的病毒的存在、因子VIII活性、聚集体含量、以及溶剂/清洁剂组分的痕量。

为了测定在最终的包含因子VIII的纯化溶液中活的含有脂质外套的病毒的存在或者活性，进行TCID₅₀测试。抽取经过滤的溶剂/清洁剂处理溶液的样品，并且用Vero细胞培养基按1:00或者1:10稀释。在Vero细胞培养基中制备系列的0.5log₁₀稀释样品，并且将100μL每个稀释度加至接种有Vero细胞的微孔板柱中8个孔的每一个孔中。微孔板在湿润的、并且调控CO₂的保温箱中在36±2℃下保温7天。在温育后，通过显微镜检验细胞的感染信号，比如，裂解的细胞、显示出细胞致病变作用的细胞、或者任何其他指示病毒感染的标准。由阳性(病毒感染)孔和阴性孔(无病毒感染)的分布，根据泊松分布计算出病毒滴度，并且表示为PFU/mL和log₁₀[TCID₅₀/mL]。在任何孔中缺少感染的阳性信号表明处理后的溶液基本上不含含有脂质外套的病毒。

为了测定在最终的纯化溶液中存在的因子VIII活性含量，进行因子VIII活性的显色分析。1等分的经过滤的溶剂/清洁剂处理溶液被预稀释在样品稀释缓冲液(50mMTris、5mMCaCl₂、225mMNaCl、0.1％聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)、pH6.7±0.2)中至大约25IU/mL，然后在因子VIII减少的血浆中进一步稀释至1IU/mL。然后将100μL的预稀释样品与0.03MCaCl₂、0.06mM磷脂、100μL的0.3μM因子IXa、100μL的1μM因子X、以及500μL的3.4μM显色底物CH₃OCO-D-环己基甘氨酰-甘氨酰基-精氨酰对硝基苯胺混合，以确保因子VIII是反应的速率限制组分。混合物在37℃下保温90秒钟，然后读取在405nm处的分光光度计读数，以便测定显色底物水解和对硝基-苯胺释放的速率。

为了测定在最终的纯化溶液中存在的因子VIII活性含量，进行因子VIII活性的单级凝血分析。1等分的经过滤的溶剂/清洁剂处理溶液被预稀释在样品稀释缓冲液(50mMTris、5mMCaCl₂、225mMNaCl、0.1％聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯(80)、pH6.7±0.2)中至大约25IU/mL，然后在因子VIII减少的血浆中进一步稀释至1IU/mL。然后将100μL的预稀释样品与100μL因子VIII不足的血浆混合。将混合物在37℃下保温3分钟，并且加入100μL的25mMCaCl₂以便启动凝血工序。通过将APTT凝固时间数值与通过仪器运行计算程序计算的标准曲线相比较，确定存在的因子VIII含量，其中所述计算程序可产生凝固时间对因子VIII浓度的双对数曲线图。设计凝血分析仪和适当的用于凝血分析的试剂，以便在生理学范围内测量凝血活性参数。结果表明，因子VIII的平均比活力是大约6,120UI/mg。该平均比活力高于5,809UI/mg，5,809UI/mg是通过使用病毒灭活方法处理的因子VIII的平均比活力，所述方法是将液体在有机溶剂/表面活性剂混合物中在大约20℃至大约25℃下保温。

为了分析存在于最终的包含因子VIII的纯化溶液中的蛋白质聚集体含量，基本上按照在实施例5中描述的方法进行大小排阻色谱和UV吸收实验。

为了分析存在于最终的包含因子VIII的纯化溶液中的溶剂/清洁剂组分的痕量，基本上按照在实施例3中描述的方法进行RP-HPLC实验。

最后，应当理解，虽然本申请说明书的一些方面通过特定的实施方式而被突出显示，但是本领域的技术人员将容易理解，这些公开的实施方式仅用于说明在此公开的主题的原理。因此，应理解，被公开的主题决不限于在此描述的特定方法论、方案、和/或试剂等。这种情况下，根据在此教导，在不脱离本申请说明书精神的情况下能够产生所公开的主题的各种变型或者变化、或者可选的构造。最终，在此使用的术语是仅用于描述特定实施方式的目的，并且不用于限制本发明的保护范围，本发明的保护范围通过权利要求单独地限定。因此，本发明不局限于精确显示和描述的内容。

在本文中描述了本发明的特定的实施方式，包括已知为发明人用于实施本发明的最佳实施方式在内。当然，对本领域的技术人员而言，一旦阅读上述描述，对这些被描述的实施方式进行变化将变得显而易见。发明人预期本领域的技术人员可视情况而定使用这些变化，并且发明人预期以与在此具体描述不同的方式来实施本发明。因此，本发明包括在附后的权利要求书中叙述的主题的所有变型和等价形式，这是适用法律所允许的。另外，本发明包括上述实施方式的任何组合的所有可能变化，除非另有陈述或者上下文清楚地排斥。

不应将可替代的实施方式的集合、本发明的要素或步骤理解为限制。每一个组中成员可以涉及并且分别要求或者与在此公开的其他组中成员进行任意组合。出于对便利性和/或专利性的考虑，预期一个组中的一个以上成员可以被包含于一个组中、或者被从该组中删除。当出现任何这样的包含或缺失时，说明书被认为含有改进的组，因此满足在附后的权利要求中使用马库什规则的所有文字描述。

除非另有说明，在本申请说明书和权利要求书中使用的对于特征、项目、数量、参数、特性、术语或类似项的所有数字表达应被理解为在一切情况下涉及有“大约”。这里使用的术语“大约”意思指特征、项目、数量、参数、特性、或者术语的定量包括超过和低于该特征、项目、数量、参数、特性、或者术语的本数加上、或者减去10％的范围。因此，除非有相反指示，在说明书和附后的权利要求书中的数值参数是可以变化的近似值。至少，在不用于限制本申请相应于权利要求的范围的前提下，每个数字指示应该被理解为报告的有效数字，使用了普通的四舍五入技术。尽管阐述本发明的宽广范围的数值范围和数值可以是近似值，但本申请已经尽可能精确地报道了具体实施例的数值范围和数值。然而，任何数值范围或者数值可固有地含有在各个试验测量中发现的标准偏差必然带来的某种误差。数值的数值范围的引述在本文中仅仅用作分别地涉及落入范围内的每个单独数值的简写方法。除非在此另有说明，数值范围内每个单个的数值都被并入本申请说明书好象其在此分别地被叙述一样。

在本发明上下文中(尤其在权利要求中)使用的术语“一”、“一种”、“该”和类似的冠词应被理解为覆盖单数和复数，除非在此另有说明、或者被上下文清楚地排斥。所有在此描述的方法能够以任何合适的顺序进行，除非在此另有说明、或者另外被上下文清楚地排斥。在此提供的任何和所有的实例、或者示例性的语言(例如，“比如”)的使用仅仅是为了更好地阐明本发明，并且不用于限制本发明要求保护的范围。在本说明书中没有语言应被理解为对本发明的实施方式不必要的限定。

在本文中公开的特定的实施方式可以通过使用“由......组成”或者“主要由......组成”的语言被进一步限定在权利要求书中。当在权利要求书中使用时，每次修改不论申请还是添加，过渡性术语“由......组成”排除任何未在权利要求中限定的组成成分、步骤、或者成分。过渡性术语“基本上由......组成”将权利要求的范围限定为特定的材料或者步骤，并且实质上不影响基本的和新颖的特征。如此要求的本发明的实施方式被固有地或者清楚地描述，并且在此能够实施。

为描述和公开目的，在本说明书中参考和注明的所有专利、专利公开、以及其他公开被分别地清楚地通过引用被并入本文，例如，在这些公开中描述的组合物和方法论可以被用于本发明。单独地提供这些公开，因为它们在本申请申请日之前被公开。这点上不应该被理解为由于在前的发明或者其他原因，本发明人没有资格在比这些公开实际早的日期已完成本发明。这些文件的内容中关于日期或者表述的所有声明是以申请人得到的信息为基础的，并且不构成改正这些文件的日期或内容的任何认可。

Claims (13)

1.一种灭活含有脂质外套的病毒的方法，该方法包括下述步骤：a)提供包含具有活性的重组因子VIII的液体；b)将TNBP、TRITONX-100以及吐温80与该液体相混合，借此产生混合物，其中所述TNBP的终浓度是0.1％(v/v)至5.0％(v/v)，所述TRITONX-100的终浓度是0.5％(v/v)至10.0％(v/v)，所述吐温80的终浓度是0.1％(v/v)至5.0％(v/v)，；以及c)将该混合物保温不超过120分钟；其中，步骤(b)和(c)两者都在2℃至8℃的温度下进行；其中，所述混合物在保温后仅包含痕量的或者完全不含活的含有脂质外套的病毒；其中，所述重组因子VIII在保温后的活性为步骤(a)中所提供活性的至少25％；并且其中，所述方法能够降低液体中疱疹病毒传染性的至少4log。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TNBP的浓度是0.3％(v/v)，所述TRITONX-100的浓度是1.0％(v/v)，和所述吐温80的终浓度是0.3％(v/v)。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体是细胞裂解液、细胞上清液、来自在前提纯步骤的洗脱液、或者生物液体。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疱疹病毒是假狂犬病病毒(PRV)。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法能够降低液体中黄病毒传染性的至少4log。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述黄病毒是牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中混合物被保温10分钟至90分钟。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中混合物被保温30分钟至60分钟。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)和(c)两者都是在2℃和4℃之间的温度下进行。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物在保温后包含的活的含有脂质外套的病毒的ID₅₀比在保温之前低至少100倍。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物在保温后包含的活的含有脂质外套的病毒少于1×10¹PFU/mL。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有脂质外套的病毒是DNA病毒、RNA病毒、反转录病毒、艾滋病毒、辛德毕斯病毒、单纯疱疹病毒、假狂犬病毒、仙台病毒、水泡性口膜炎病毒、西尼罗河病毒、牛病毒性腹泻病毒、冠状病毒、马关节炎病毒、严重急性呼吸综合症病毒、莫洛尼鼠白血病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、痘病毒、肝DNA病毒；黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、δ病毒、正粘病毒、副粘病毒、棒状病毒、本雅病毒、纤丝病毒、反转录病毒和/或肝DNA病毒。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法在步骤(c)之后还包括一个以上如下步骤：从混合物中除去所述TNBP；从混合物中除去所述TRITONX-100和吐温80；以及/或者从混合物中除去非存活病毒。