TWI557229B - 使用改良之溶劑－清潔劑方法的病毒去活化 - Google Patents

使用改良之溶劑－清潔劑方法的病毒去活化 Download PDF

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Description

使用改良之溶劑-清潔劑方法的病毒去活化
本說明書係關於在蛋白質製造期間使病毒污染物去活化之方法。
優先權主張
本專利申請案依照35 U.S.C. § 119(e)規定主張2010年12月15日申請之美國臨時專利申請案第61/423,512號之優先權，其以全文引用的方式併入本文中。
作為治療影響個體健康之多種疾病、病症或病狀之方法，使用包含治療性蛋白質之醫藥組成物越來越重要。通常使用哺乳動物細胞株經重組生產或藉由自生物流體純化來獲得醫藥組成物中所用之多種蛋白質。然而，由該等方法製造之治療性蛋白質可能受到對個體健康有害之傳染性病原病毒污染。因此，重要的是處理治療性蛋白質以消除任何污染病毒活性，從而確保所得醫藥組成物可安全投與個體。
當前存在多種不同的使傳染性病原病毒去活化之方法，包括例如熱去活化、溶劑/清潔劑(S/D)去活化、pH值去活化、化學去活化及/或紫外線照射去活化。其中，S/D去活化或許為最廣泛接受之殺病毒方法，因為幾乎所有重要的人類病原體均為對細胞膜由溶劑及清潔劑引起之破壞敏感之包膜病毒。此外，與其他殺病毒方法相比，S/D方法更好地保留所處理流體之內含物及生物活性。舉例而言，使用熱、酸性pH值、化學物質及輻射之去活化方法存在問題，因為該等試劑為苛性及/或侵襲性試劑且傾向於使所純化之治療性蛋白質變性或以其他方式去活化。
在S/D去活化方法中，有機溶劑及清潔劑與包括所純化及培養之蛋白質之流體混合。溶劑建立促進清潔劑與囊封病毒之脂質膜之間聚集的環境，且清潔劑破壞該脂質膜中分子之間的相互作用。一旦遭到破壞，包膜病毒不再能結合於細胞並將其感染且不能進行複製，因為該等活性需要完整脂質膜。該去活化通常在高於20℃之溫度下進行，因為較高溫度可促進包膜破壞。舉例而言，根據世界衛生組織(World Health Organization/WHO)準則使用之典型條件為0.3%三(正丁基)磷酸酯(TNBP)與1%聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)在24℃下培養至少6小時，或0.3% TNBP與1%聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)在24℃下培養至少4小時。參見例如WHO Technical Report,Annex 4 Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products,第924期，第151-224頁,(2004)。
培養溶劑/清潔劑混合物達到高於20℃之溫度具有若干缺陷。首先，在較高溫度下去活化消耗時間，因為預先加熱混合物至高於20℃之溫度可使總加工時間增加約2至約6小時。其次，在此較高溫度下培養以及促進均勻加熱所必需之攪拌可增強蛋白質聚集體形成，從而引起活性及/或有效蛋白質產量降低。暴露於高於20℃之溫度亦使蛋白質對降解之敏感度增加。本說明書揭示解決該等缺陷之使來自樣品之傳染性病原病毒去活化之新穎S/D方法。本文中揭示之方法中所用培養時間少於2小時且培養溫度低於20℃。縮短培養時間可使處理及/或製造經重組生產或生物流體純化獲得之蛋白質所需之總時間縮短。此外，縮短時間與降低溫度可藉由降低蛋白質對聚集及降解之敏感度而引起蛋白質產率改良。
因此，本說明書之態樣揭示含有脂質層之病毒之去活化方法，該等方法包含以下步驟：a)提供包含具有活性之蛋白質之流體；b)混合有機溶劑及界面活性劑與流體，從而產生混合物；及c)培養混合物不超過約120分鐘；其中步驟(b)及(c)均在不高於約20℃之溫度下進行；其中混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒；且其中蛋白質在培養後之活性為步驟(a)中所提供活性之至少25%。流體可為細胞溶解產物、細胞上清液、來自先前純化步驟之洗提物或生物流體。可使用細胞株經重組生產或藉由自生物流體純化來獲得蛋白質。有機溶劑可為醚、醇或烷基磷酸酯，例如二烷基磷酸酯或三烷基磷酸酯。界面活性劑可為離子性界面活性劑，例如陰離子性界面活性劑或陽離子性界面活性劑，兩性離子性(兩性)界面活性劑或非離子性界面活性劑。該方法可進一步包含在步驟(c)後自混合物移除溶劑、界面活性劑及/或無活力病毒之步驟或可不包含該步驟。
本說明書之其他態樣揭示基本上不含含有脂質層之病毒的蛋白質，其由包含以下步驟之方法獲得：a)提供包含具有活性之蛋白質的流體；b)混合有機溶劑及界面活性劑與流體，從而產生混合物；及c)培養混合物不超過約120分鐘；其中步驟(b)及(c)均在不高於約20℃之溫度下進行；其中混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒；且其中蛋白質在培養後之活性為步驟(a)中所提供活性之至少25%。
本說明書之其他態樣揭示含有脂質層之病毒之去活化方法，該等方法包含以下步驟：a)提供包含具有活性之因子VIII(Factor VIII)之流體；b)混合有機溶劑及界面活性劑與流體，從而產生混合物；及c)培養混合物不超過約120分鐘；其中步驟(b)及(c)均在不高於約20℃之溫度下進行；其中混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒；且其中因子VIII在培養後之活性為步驟(a)中所提供活性之至少25%。
本說明書之其他態樣揭示基本上不含含有脂質層之病毒的因子VIII，其由包含以下步驟之方法獲得；a)獲得包含具有活性之因子VIII之流體；b)混合有機溶劑及界面活性劑與流體，從而產生混合物；及c)培養混合物不超過約120分鐘；其中步驟(b)及(c)均在不高於約20℃之溫度下進行；其中混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒；且其中因子VIII在培養後之活性為步驟(a)中所提供活性之至少25%。
本說明書之態樣部分地揭示含有脂質層之病毒。完整病毒顆粒(稱為病毒粒子)由核酸(DNA或RNA)組成，該核酸由稱為蛋白衣(capsid)之蛋白質保護層圍繞。病毒可分類為無包膜病毒及包膜病毒。如本文中所用，術語「含有脂質層之病毒」係指任何包含包括脂質之薄膜或外膜之病毒，諸如包膜病毒。包膜病毒之蛋白衣由脂蛋白膜或外膜圍繞。當病毒自其表面「出芽(bud)」時，此外膜源自宿主細胞且主要由未經病毒基因組編碼之脂質組成。儘管其攜帶用於連接及進入目標細胞之分子決定子且對包膜病毒之感染性必不可少，但其不受藥物抗性或抗原性轉換支配。包膜病毒大小在約45-55 nm至約120-200 nm範圍內。可感染哺乳動物細胞之含有脂質層之病毒包括DNA病毒，例如疱疹病毒科病毒(herpesviridae virus)、痘病毒科病毒(poxviridae virus)或肝病毒科病毒(hepadnaviridae virus)；RNA病毒，例如黃病毒科病毒(flaviviridae virus)、披膜病毒科病毒(togaviridae virus)、冠狀病毒科病毒(coronaviridae virus)、δ病毒科病毒(deltavirus virus)、正黏病毒科病毒(orthomyxoviridae virus)、副黏病毒科病毒(paramyxoviridae virus)、彈狀病毒科病毒(rhabdoviridae virus)、布尼亞病毒科病毒(bunyaviridae virus)或絲狀病毒科病毒(filoviridae virus)；及反轉錄病毒，例如反轉錄病毒科病毒(retroviridae virus)或肝病毒科病毒。含有脂質層之病毒之非限制性實例包括人類免疫缺乏病毒、辛德比病毒(sindbis virus)、疱疹單純型病毒(herpes simplex virus)、假性狂犬病毒(pseudorabies virus)、仙台病毒(sendai virus)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、西尼羅河病毒(West Nile virus)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus)、冠狀病毒(corona virus)、馬關節炎病毒(equine arthritis virus)、嚴重急性呼吸道症候群病毒、莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)或痘瘡病毒(vaccinia virus)。
非包膜病毒係指蛋白衣不含脂蛋白膜或外膜之病毒。在非包膜病毒中，蛋白衣介導連接於且滲透入宿主細胞中。蛋白衣通常為螺旋狀或二十面體狀。非包膜病毒大小在約18-26 nm至約70-90 nm範圍內。可感染哺乳動物細胞之非包膜病毒包括例如微小病毒科病毒(parvoviridae virus)、腺病毒科病毒(adenoviridae virus)、雙核糖核酸病毒科病毒(birnaviridae virus)、乳頭狀瘤病毒科病毒(papillomaviridae virus)、多瘤病毒科病毒(polyomaviridae virus)、小核糖核酸病毒科病毒(picornaviridae virus)、呼腸孤病毒科病毒(reoviridae virus)及杯狀病毒科病毒(calciviridae virus)。
本說明書之態樣部分揭示包含具有活性之蛋白質之流體。流體可為任何可能受病毒污染之流體。流體之非限制性實例包括例如任何純化、部分純化或粗液體或膠體，包括例如來自先前純化步驟之洗提物；組織及細胞培養物提取物，例如細胞溶解產物、細胞上清液、胎盤提取物或腹水流體；生物流體，例如血液、血漿、血清、乳汁、唾液、精液；或任何其他包括具有活性之蛋白質的流體。
具有活性之蛋白質可為任何其中需要消除任何污染病毒活性之相關蛋白質。本文中揭示之蛋白質可為血蛋白，諸如凝血蛋白質、白蛋白及/或免疫球蛋白。血蛋白之非限制性實例包括ADAMTS-13、α1-抗血纖維蛋白溶酶、α2-抗血纖維蛋白溶酶、抗凝血酶、抗凝血酶III、癌症促凝素、紅血球生成素、因子II(Factor II)、因子V(Factor V)、因子VI(Factor VI)、因子VII(Factor VII)、因子VIII(Factor VIII)、因子IX(Factor IX)、因子X(Factor X)、因子XI(Factor XI)、因子XII(Factor XII)、因子XIII(Factor XIII)、纖維結合蛋白、纖維蛋白原、肝素輔因子II、高分子量激肽原、肌肉內免疫球蛋白、靜脈內免疫球蛋白、纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶原活化物抑制劑-1、纖維蛋白溶酶原活化物抑制劑-2、前激肽釋放酶、蛋白質C、蛋白質S、蛋白質Z、蛋白質Z相關蛋白酶抑制劑、組織因子、組織纖維蛋白溶酶原活化物、尿激酶或馮威里氏因子(Von Willebrand Factor)。
本文中揭示之蛋白質可自天然表現蛋白質之有機物、經遺傳工程改造以表現蛋白質之基因轉殖有機物或以重組方式產生蛋白質之細胞株獲得。有機物之非限制性實例包括鳥及哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、山羊、綿羊、馬、猴子、牛、靈長類動物及人類。基因轉殖有機物之非限制性實例包括本文中揭示之經遺傳工程改造以表現相關蛋白質之有機物。本文中揭示之來自有機物或基因轉殖有機物之蛋白質可使用此項技術中已知的常用方法自生物流體、組織或器官提取物或其他來自有機物之來源獲得。舉例而言，為獲得血蛋白，可將來自有機物或基因轉殖有機物之全血於血清分離管中進行提取。使血液凝結且凝結之血液經離心以使碎片成為集結塊。接著可將所得血清樣品(亦即上清液)等分及/或在-20℃下儲存直至需要使用。用於血液收集及血清製備之特定方案之非限制性實例描述於例如Di Lorenzo及Strasinger,Blood Collection in Healthcare(F.A. Davis Company,2001)；及Diana Garza及Kathleen Becan-McBride,Phlebotomy Handbook: Blood Collection Essentials(Prentice Hall,第6版,2002)中。
或者，亦可使用多種原核生物及/或真核生物表現系統以重組方式表現本文中揭示之蛋白質。表現系統可包括多種特徵中之任一者，包括(但不限於)可誘導之表現、非可誘導之表現、組成性表現、組織特異性表現、細胞特異性表現、病毒介導之表現、穩定整合之表現及暫時性表現。在此項技術中已知如何產生及使用該等表現系統。
通常，將編碼相關蛋白質之聚核苷酸選殖入表現載體中。原核生物表現載體通常包含複製起點、合適啟動子及/或強化子元件，以及核糖體結合、聚腺苷酸化、轉錄終止所需之位點，以及5'側接非轉錄序列及其他非轉錄遺傳元件。例示性原核載體包括使用啟動子(諸如噬菌體T7啟動子)之pET及pRSET。真核生物表現載體通常包含複製起點、合適啟動子及/或強化子元件，以及核糖體結合、聚腺苷酸化、剪接、轉錄終止所需之位點，以及5'側接非轉錄序列及其他非轉錄遺傳元件。例示性酵母載體包括使用諸如AOX1、AUG1、GAP及GALL之啟動子之pAO、pMET、pPIC、pPICZ及pYES。例示性昆蟲載體包括使用諸如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64及polh之啟動子之pAc5、pBAC、pIB、pMIB、pMT。例示性哺乳動物載體包括使用諸如β-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳清酸啟動子、HSV胸苷激酶、早期及晚期猿猴病毒40(SV40)、來自反轉錄病毒之LTR及小鼠金屬硫蛋白-1之啟動子之pBPV、pCMV、pCMVTNT、pDNA、pDisplay、pMSG、pOG44、pQBI25、pRc/RSV、pSECTag、pSECTag2、pSG、pSV2cat、pSVK3、pSVL、pUCIG-MET、pVAX1、pWLneo及pXT1。可選擇之標記包括安比西林(Ampicillin)、氯黴素轉移酶(Chloramphenicol transferase)、卡那黴素(Kanamycin)、新黴素(Neomycin)及四環素(Tetracycline)。合適表現載體在此項技術中已知且可自市場購得。
能夠表現相容載體之細胞包括原核細胞、真核細胞及衍生自原核細胞及真核細胞之細胞株。原核菌株之非限制性實例包括來源於例如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、產氣莢膜芽孢桿菌(Clostridia perfringens)、難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridia difficle)、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、外鏈甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)、奈瑟氏菌(Neisseria meningirulls)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)及鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)之菌株。酵母菌株之非限制性實例包括來源於例如甲醇酵母(Pichia pastoris)、畢赤嗜甲醇酵母(Pichia methonolica)、安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)之菌株。植物細胞及來源於植物之細胞株包括來自例如單子葉植物物種(諸如玉米(Zea mays))及雙子葉植物物種(諸如擬南芥(Arabidopsis thaiiana)、小麥(Triticum aestivum)、膨脹青萍(Lemna gibba)及浮萍(Lemna minor))之細胞。昆蟲細胞及來源於昆蟲之細胞株包括來自例如草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、果蠅(Drosophila melanogaster)及煙草天蛾(Manduca sexta)之細胞。昆蟲細胞株之非限制性實例包括High-Five、Kc、施奈德果蠅細胞株2(Schneider's Drosophila line 2/S2)、SF9及SF21細胞株。哺乳動物細胞及來源於哺乳動物細胞之細胞株包括來自例如小鼠、大鼠、倉鼠、豬、牛、馬、靈長類動物及人類之細胞。哺乳動物細胞株之非限制性實例包括1A3、3T3、6E6、10T1/2、APRT、BALB/3T3、BE(2)-C、BHK、BT、C6、C127、CHO、CHP3、COS-1、COS-7、CPAE、ESK-4、FB2、GH1、GH3、HeLa、HEK-293、HepG2、HL-60、IMR-32、L2、LLC-PK1、L-M、MCF-7、NB4、NBL-6、NCTC、Neuro 2A、NIE-115、NG108-15、NIH3T3、PC12、PK15、SBAC、SH-SY5Y、SK-Hep、SK-N-DZ、SK-N-F1、SK-N-SH、ST、SW-13及VV-1細胞株。細胞株可自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)、歐洲菌種保藏中心(European Collection of Cell Cultures)及/或德國微生物及細胞培養物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)獲得。
在初始自有機物、基因轉殖有機物或細胞培養物系統收集後，本文中揭示之蛋白質可經歷蛋白質純化過程。通常，蛋白質純化包括捕獲蛋白質使其呈更濃縮形式、用於移除雜質之中間純化步驟、用於移除其他雜質及蛋白質變異體之精緻純化(polishing)。參見例如Current Protocols in Protein Science,「Conventional chromatographic Separations」,第8-9章,(John Wiley & Sons公司,Hoboken,N.J.,1995)。常用捕獲方法包括親和層析、凝膠過濾、沈澱及/或尺寸排阻層析。適用作中間步驟或精緻純化步驟之製程包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水交互作用層析及陶瓷羥基磷灰石層析、逆相HPLC、凝膠過濾、沈澱、滲濾、親和層析或聚焦層析(chromatofocusing)。
本文中揭示之方法可在該純化過程期間的任何時間進行。通常，當在製程開始時而非製程中稍後階段進行本文中揭示之方法時，需要較大試劑量及較長培養時間。此係因為處理體積較大且開始時產物純度通常較低，而稍後雜質減少且大多數情況下產物清晰且純度及效能更高同時體積減小，或其中病毒負荷已由先前純化程序降低或減少。
本說明書之態樣部分地提供混合本文中揭示之流體與有機溶劑及界面活性劑，從而產生混合物。流體與有機溶劑及界面活性劑之混合可進行任何時間長度，限制條件為所用混合時間引起混合物充分合併有有機溶劑及界面活性劑與流體。因此，混合應確保1)有機溶劑促進界面活性劑與囊封含有脂質層之病毒之脂蛋白外膜之間的接觸及2)界面活性劑破壞含有脂質層之病毒之脂蛋白膜中分子之間的相互作用。在此具體實例之態樣中，有機溶劑與界面活性劑之混合時間例如不超過1分鐘、不超過5分鐘或不超過10分鐘。在此具體實例之其他態樣中，有機溶劑與界面活性劑之混合時間介於例如約1分鐘至約5分鐘、約2分鐘至約5分鐘、約3分鐘至約5分鐘、約1分鐘至約10分鐘、約2分鐘至約10分鐘、約3分鐘至約10分鐘、約4分鐘至約10分鐘或約5分鐘至約10分鐘之間。如本文中揭示，有機溶劑與界面活性劑之混合在不高於約20℃之溫度下進行。
可混合單一有機溶劑與本文中揭示之流體，或可混合多種有機溶劑與本文中揭示之流體。在此具體實例之態樣中，可混合流體與至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種有機溶劑。有效有機溶劑產生促進界面活性劑與囊封病毒之脂蛋白外膜之間接觸的環境。因此，本文中揭示之方法中可使用任何促進該接觸之有機溶劑，包括(但不限於)醚、醇、烷基磷酸酯(例如二烷基磷酸酯或三烷基磷酸酯)或其任何組合。
適用於本文中揭示之方法中之醚包括具有式R1-O-R2之醚，其中R1及R2獨立地為可含有氧或硫原子之C1-C18烷基或C1-C18烯基，較佳為C1-C18烷基或C1-C18烯基。醚之非限制性實例包括二甲醚、乙醚、乙基丙基醚、甲基丁基醚、甲基異丙基醚及甲基異丁基醚。適用於本文中揭示之方法中之醇包括具有C1-C8烷基或C1-C8烯基之醇。醇之非限制性實例包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇及異戊醇。適用於本文中揭示之方法中之烷基磷酸酯包括具有C1-C18烷基或C1-C18烯基之烷基磷酸酯，該等C1-C18烷基或C1-C18烯基均可含有氧或硫原子。烷基磷酸酯之非限制性實例包括二烷基磷酸酯，例如二-(正丁基)磷酸酯、二-(第三丁基)磷酸酯、二-(正己基)磷酸酯、二-(2-乙基己基)磷酸酯、二-(正癸基)磷酸酯或乙基二(正丁基)磷酸酯；及三烷基磷酸酯，例如三-(正丁基)磷酸酯、三-(第三丁基)磷酸酯、三-(正己基)磷酸酯、三-(2-乙基己基)磷酸酯或三-(正癸基)磷酸酯。適用於本文中揭示之方法中之有機溶劑之其他非限制性實例可見於例如Winslow等人,,Methods and Compositions for Simultaneously Isolating Hemoglobin from Red Blood Cells and Inactivating Viruses,U.S. 2008/0138790中，其以全文引用的方式併入本文中。
可使用任何濃度之有機溶劑，限制條件為所用濃度足以促進界面活性劑與含有脂質層之病毒之脂蛋白膜之間的聚集。在此具體實例之態樣中，所用界面活性劑最終濃度為例如約0.01%(v/v)、約0.05%(v/v)、約0.075%(v/v)、約0.1%(v/v)、約0.2%(v/v)、約0.3%(v/v)、約0.4%(v/v)、約0.5%(v/v)、約0.6%(v/v)、約0.7%(v/v)、約0.8%(v/v)、約0.9%(v/v)或約1.0%(v/v)。在此具體實例之其他態樣中，所用界面活性劑最終濃度為例如至少0.01%(v/v)、至少0.05%(v/v)、至少0.075%(v/v)、至少0.1%(v/v)、至少0.25%(v/v)、至少0.5%(v/v)、至少0.75%(v/v)或至少1.0%(v/v)。在此具體實例之其他態樣中，所用界面活性劑最終濃度為例如約0.1%(v/v)至約0.5%(v/v)、約0.1%(v/v)至約0.75%(v/v)、約0.1%(v/v)至約1.0%(v/v)、約0.2%(v/v)至約0.5%(v/v)、約0.2%(v/v)至約0.75%(v/v)、約0.2%(v/v)至約1.0%(v/v)、約0.5%(v/v)至約0.75%(v/v)或約0.5%(v/v)至約1.0%(v/v)。
界面活性劑為降低液體之表面張力、使得易於蔓延及降低兩種液體之間或液體與固體之間界面張力的化合物。可混合單一界面活性劑與本文中揭示之流體，或可混合多種界面活性劑與本文中揭示之流體。在此具體實例之態樣中，可混合流體與至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種界面活性劑。有效界面活性劑可破壞含有脂質層之病毒之脂蛋白膜中分子之間的相互作用。因此，任何促進該破壞之界面活性劑均可用於本文中揭示之方法中，包括(但不限於)離子性界面活性劑、兩性離子性(兩性)界面活性劑、非離子性界面活性劑或其任何組合。
離子性界面活性劑包括基於永久性(硫酸根離子、磺酸根離子、磷酸根離子)或pH值依賴性(羧酸根離子)陰離子之陰離子性界面活性劑。陰離子性界面活性劑包括(但不限於)烷基硫酸鹽，例如十二烷基硫酸銨及十二烷基硫酸鈉(SDS)；烷基醚硫酸鹽，例如月桂醇聚醚(laureth)硫酸鈉及肉豆蔻醇聚醚(myreth)硫酸鈉；多庫酯鹽(docusate)，例如磺琥珀酸二辛酯鈉；磺酸鹽氟界面活性劑，例如全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)及全氟丁烷磺酸鹽；烷基苯磺酸鹽；烷基芳基醚磷酸鹽；烷基醚磷酸鹽；烷基羧酸鹽，例如脂肪酸鹽及硬脂酸鈉；十二烷醯肌胺酸鈉；及羧酸鹽氟界面活性劑，例如全氟壬酸鹽及全氟辛酸鹽。
離子性界面活性劑亦包括基於永久性或pH值依賴性陽離子之陽離子性界面活性劑。陽離子性界面活性劑包括(但不限於)烷基三甲基銨鹽，例如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)及十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)；十六烷基氯化吡啶鎓(pyridinium)(CPC)；聚乙氧基化動物脂(tallow)胺(POEA)；氯化苯甲烷銨(BAC)；苄索氯銨(BZT)；5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷；二甲基二(十八烷基)氯化銨；及二(十八烷基)二甲基溴化銨(DODAB)，以及pH值依賴性一級胺、二級胺或三級胺，例如其中一級胺在pH<10下變為帶正電或二級胺在pH<4變為帶電之界面活性劑，例如奧替尼啶二鹽酸鹽(octenidine dihydrochloride)。
兩性離子性界面活性劑基於一級胺、二級胺或三級胺或四級銨陽離子及磺酸根離子、羧酸根離子或磷酸根離子。兩性離子性界面活性劑包括(但不限於)3-[(3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS)；磺基甜菜鹼(sultaine)，例如椰油醯胺基丙基羥基磺基甜菜鹼；甜菜鹼，例如椰油醯胺基丙基甜菜鹼；或卵磷脂。
非離子性界面活性劑不易變性且因此適用於溶解膜蛋白及脂質同時保留蛋白質-蛋白質相互作用。界面活性劑之非限制性實例包括聚氧乙二醇脫水山梨糖醇烷基酯，例如聚山梨醇酯20脫水山梨糖醇單油酸酯( 20)、聚山梨酸酯40脫水山梨糖醇單油酸酯( 40)、聚山梨酸酯60脫水山梨糖醇單油酸酯( 60)、聚山梨醇酯61脫水山梨糖醇單油酸酯( 61)、聚山梨酸酯65脫水山梨糖醇單油酸酯( 65)、聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)及聚山梨醇酯81脫水山梨糖醇單油酸酯( 81)；泊洛沙姆(poloxamer)(聚乙烯-聚丙烯共聚物)，例如泊洛沙姆124( L44)、泊洛沙姆181(L61)、泊洛沙姆182(L62)、泊洛沙姆184(L64)、泊洛沙姆188( F68)、泊洛沙姆237( F87)、泊洛沙姆338( L108)、泊洛沙姆407( F127)；烷基酚聚乙二醇醚；聚乙二醇烷基芳基醚；聚氧乙二醇烷基醚，例如八伸乙基二醇單十二烷基醚、五伸乙基二醇單十二烷基醚、 30及 35；2-十二烷氧基乙醇(-PX)；聚氧乙二醇辛基酚醚，例如聚氧乙烯(4-5)對第三辛基酚( X-45)及聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)；聚氧乙二醇烷基酚醚，例如壬苯醇醚-9；苯氧基聚乙氧基乙醇，例如壬基苯氧基聚乙氧基乙醇及辛基苯氧基聚乙氧基乙醇；葡萄糖苷烷基醚，例如辛基葡萄哌喃糖苷；麥芽糖苷烷基醚，例如十二烷基麥芽哌喃糖苷；硫葡萄糖苷烷基醚，例如庚基硫葡萄哌喃糖苷；毛地黃皂苷(digitonin)；甘油烷基酯，例如月桂酸甘油酯；烷基芳基聚醚硫酸酯；磺酸醇酯；脫水山梨糖醇烷基酯；椰油醯胺乙醇胺，例如椰油醯胺單乙醇胺及椰油醯胺二乙醇胺；蔗糖單月桂酸酯；十二烷基二甲基氧化胺及膽酸鈉。適用於本文中揭示之方法中之界面活性劑之其他非限制性實例可見於例如Winslow等人,Methods and Compositions for Simultaneously Isolating Hemoglobin from Red Blood Cells and Inactivating Viruses,U.S. 2008/0138790；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Howard C. Ansel等人編,Lippincott Williams & Wilkins Publishers,第7版1999)；Remington: The Science and Practice of Pharmacy(Alfonso R. Gennaro編,Lippincott,Williams & Wilkins,第20版2000)；Goodman及Gilman之The Pharmacological Basis of Therapeutics(Joel G. Hardman等人編,McGraw-Hill Professional,第10版2001)；及Handbook of Pharmaceutical Excipients(Raymond C. Rowe等人,APhA Publications,第4版2003)中，其中各者均以全文引用的方式併入本文中。
可使用任何濃度之界面活性劑，限制條件為所用濃度足以破壞含有脂質層之病毒之脂蛋白膜中分子之間的相互作用，從而引起病毒去活化，在此具體實例之態樣中，所用界面活性劑濃度為例如約0.01%(v/v)、約0.05%(v/v)、約0.075%(v/v)、約0.1%(v/v)、約0.2%(v/v)、約0.3%(v/v)、約0.4%(v/v)、約0.5%(v/v)、約0.6%(v/v)、約0.7%(v/v)、約0.8%(v/v)、約0.9%(v/v)、約1.0%(v/v)、約2.0%(v/v)、約3.0%(v/v)、約4.0%(v/v)、約5.0%(v/v)、約6.0%(v/v)、約7.0%(v/v)、約8.0%(v/v)、約9.0%(v/v)或約10.0%(v/v)。在此具體實例之其他態樣中，所用界面活性劑之濃度為例如至少0.01%(v/v)、至少0.05%(v/v)、至少0.075%(v/v)、至少0.1%(v/v)、至少0.25%(v/v)、至少0.5%(v/v)、至少0.75%(v/v)、至少1.0%(v/v)、至少2.5%(v/v)、至少5.0%(v/v)、至少7.5%(v/v)或至少10.0%(v/v)。在此具體實例之其他態樣中，所用界面活性劑之濃度為例如約0.1%(v/v)至約0.5%(v/v)、約0.1%(v/v)至約1.0%(v/v)、約0.2%(v/v)至約0.5%(v/v)、約0.2%(v/v)至約1.0%(v/v)、約0.2%(v/v)至約2.0%(v/v)、約0.5%(v/v)至約1.0%(v/v)、約0.5%(v/v)至約5.0%(v/v)或約1.0%(v/v)至約10.0%(v/v)。
本文中揭示之流體可與單一有機溶劑及多種界面活性劑、多種有機溶劑及單一界面活性劑或多種有機溶劑及多種界面活性劑混合。通常，流體中有機溶劑及單一界面活性劑之最終濃度為約0.1%(v/v)至約5%(v/v)有機溶劑及約0.1%(v/v)至約10%(v/v)界面活性劑。當混合多種界面活性劑與流體時，有機溶劑之最終濃度為約0.1%(v/v)至約5%(v/v)，界面活性劑之最終濃度為約0.1%(v/v)至約10%(v/v)、約0.5%(v/v)至約5%(v/v)或約0.5%(v/v)至約1.0%(v/v)，且其餘界面活性劑之最終濃度為約0.1%(v/v)至約5%(v/v)、約0.1%(v/v)至約1.0%(v/v)或約0.2%(v/v)至約4%(v/v)。
在此具體實例之一個態樣中，混合流體與三(正丁基)磷酸酯及聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)使得最終濃度為例如約0.1%(v/v)至約1.0%(v/v)三(正丁基)磷酸酯及約1.0%(v/v)至約10.0%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)。在此具體實例之另一態樣中，混合流體與三(正丁基)磷酸酯及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)使得最終濃度為例如約0.1%(v/v)至約1.0%(v/v)三(正丁基)磷酸酯及約1.0%(v/v)至約10.0%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)。
在此具體實例之另一態樣中，混合流體與三(正丁基)磷酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)使得最終濃度為例如約0.1%(v/v)至約5.0%(v/v)三(正丁基)磷酸酯，約0.5%(v/v)至約10.0%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及約0.1%(v/v)至約5.0%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)。在此具體實例之又一態樣中，混合流體與三(正丁基)磷酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)使得最終濃度為例如約0.1%(v/v)至約0.7%(v/v)三(正丁基)磷酸酯，約0.6%(v/v)至約1.4%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及約0.1%(v/v)至約0.7%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)。在此具體實例之又一態樣中，混合流體與三(正丁基)磷酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)使得最終濃度為例如約0.1%(v/v)至約0.5%(v/v)三(正丁基)磷酸酯，約0.7%(v/v)至約1.3%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及約0.1%(v/v)至約0.5%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)。
在此具體實例之另一態樣中，混合流體與三(正丁基)磷酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)使得最終濃度為例如約0.2%(v/v)至約0.5%(v/v)三(正丁基)磷酸酯，約0.7%(v/v)至約1.3%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及約0.2%(v/v)至約0.5%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)。在此具體實例之又一態樣中，混合流體與三(正丁基)磷酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)使得最終濃度為例如約0.2%(v/v)至約0.4%(v/v)三(正丁基)磷酸酯，約0.8%(v/v)至約1.2%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及約0.2%(v/v)至約0.4%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)。在此具體實例之又一態樣中，混合流體與三(正丁基)磷酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)使得最終濃度為例如約0.3%(v/v)三(正丁基)磷酸酯，約1.0%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及約0.3%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)。
在混合流體與有機溶劑及界面活性劑後，在指定溫度下培養所得混合物指定時間。可使用任何培養時間，限制條件為所用時間引起混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒。在此具體實例之態樣中，培養流體之時間例如為約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約60分鐘、約70分鐘、約80分鐘、約90分鐘、約100分鐘、約110分鐘或約120分鐘之時間。在此具體實例之其他態樣中，培養流體例如不超過約10分鐘、不超過約20分鐘、不超過約30分鐘、不超過約40分鐘、不超過約50分鐘、不超過約60分鐘、不超過約70分鐘、不超過約80分鐘、不超過約90分鐘、不超過約100分鐘、不超過約110分鐘或不超過約120分鐘。在此具體實例之其他態樣中，培養流體之時間介於例如約10分鐘至約60分鐘、約10分鐘至約90分鐘、約10分鐘至約120分鐘、約30分鐘至約60分鐘、約30分鐘至約90分鐘、約30分鐘至約120分鐘、約60分鐘至約90分鐘、約60分鐘至約120分鐘或約90分鐘至約120分鐘之間。
本說明書之態樣部分地提供其中流體與有機溶劑及界面活性劑在不高於約20℃之溫度下混合且其中混合物在不高於約20℃之溫度下培養。可使用任何培養溫度，限制條件為所用溫度為不高於約20℃之溫度且引起混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒且在培養後回收具有活性之蛋白質。儘管通常在同一溫度下培養，但可在一個溫度下混合流體與有機溶劑及界面活性劑且在不同溫度下培養混合物。
在此具體實例之態樣中，混合流體且在例如約2℃、約4℃、約6℃、約8℃、約10℃、約12℃、約14℃、約16℃、約18℃或約20℃之溫度下培養混合物。在此具體實例之其他態樣中，在例如不超過2℃、不超過4℃、不超過6℃、不超過8℃、不超過10℃、不超過12℃、不超過14℃、不超過16℃、不超過18℃或不超過20℃之溫度下混合及培養流體。在此具體實例之其他態樣中，混合流體且在介於例如約0℃至約2℃、約0℃至約4℃、約0℃至約6℃、約0℃至約8℃、約0℃至約10℃、約0℃至約12℃、約0℃至約14℃、約0℃至約16℃、約0℃至約18℃、約0℃至約20℃、約2℃至約4℃、約2℃至約6℃、約2℃至約8℃、約2℃至約10℃、約2℃至約12℃、約2℃至約14℃、約2℃至約16℃、約2℃至約18℃、約2℃至約20℃、約4℃至約6℃、約4℃至約8℃、約4℃至約10℃、約4℃至約12℃、約4℃至約14℃、約4℃至約16℃、約4℃至約18℃或約4℃至約20℃之溫度下培養混合物。
在一個具體實例中，可以任何時間長度且在不高於約20℃之任何溫度下培養本文中揭示之混合物，限制條件為所用培養時間及溫度引起混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒且包含具有活性之蛋白質。在此具體實例之態樣中，混合物在不高於約20℃之溫度下培養不超過120分鐘，例如在不高於約20℃之溫度下培養不超過90分鐘，在不高於約20℃之溫度下培養不超過60分鐘或在不高於約20℃之溫度下培養不超過30分鐘。在此具體實例之其他態樣中，混合物在不高於約16℃之溫度下培養不超過120分鐘，在不高於約12℃之溫度下培養不超過120分鐘或在不高於約8℃之溫度下培養不超過120分鐘。在此具體實例之其他態樣中，混合物在約0℃至約20℃之溫度下培養約10分鐘至約120分鐘，在約0℃至約16℃之溫度下培養約30分鐘至約120分鐘，在約0℃至約12℃之溫度下培養約30分鐘至約120分鐘或在約2℃至約8℃之溫度下培養約30分鐘至約120分鐘。在此具體實例之其他態樣中，混合物在約2℃至約8℃之溫度下培養約45分鐘至約75分鐘，在約2℃至約8℃之溫度下培養約60分鐘，在約4℃之溫度下培養約45分鐘至約75分鐘或在約4℃之溫度下培養約60分鐘。
本說明書之態樣部分地提供混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒。如本文中所用，術語「基本上不含含有脂質層之病毒」意謂用於偵測或確認含有脂質層之活病毒之存在或活性的器具或方法僅可偵測到或確認微量的含有脂質層之活病毒且該等微量的含有脂質層之活病毒不足以對人類健康造成損害。在此具體實例之一個態樣中，混合物在培養後完全不含含有脂質層之病毒。如本文中所用，術語「完全不含含有脂質層之病毒」意謂在用於偵測或確認含有脂質層之活病毒之存在或活性的器具或方法之偵測範圍內未偵測到或確認含有脂質層之活病毒存在。基本上不含或完全不含含有脂質層之活病毒之流體內所含蛋白質可用於製備可安全投與人類之醫藥組成物，因為病毒不足以對人類健康造成損害。
在此具體實例之另一態樣中，混合物在培養後包含小於1×101 PFU/mL含有脂質層之活病毒。斑塊形成單位(PFU)為每單位體積能夠形成斑塊之病毒粒子數目之量度。其為功能性量度而非絕對粒子量之量度，因為失活、有缺陷或因其他原因未能感染其目標細胞之病毒粒子將不會產生斑塊且因此未得以計數。在此具體實例之其他態樣中，混合物在培養後包含例如小於1×100 PFU/mL含有脂質層之活病毒，小於1×10-1 PFU/mL含有脂質層之活病毒，1×10-2含有脂質層之活病毒或1×10-3含有脂質層之活病毒。
在此具體實例之又一態樣中，混合物在培養後包含之病毒小於培養前活的含有脂質層之病毒之ID50。ID50為將感染50%目標細胞群體之病毒量。其為功能性量測值，因為失活或以其他方式有缺陷之病毒粒子將不會感染其目標細胞且因此未得以計數。在此具體實例之其他態樣中，混合物在培養後包含之病毒比培養前含有脂質層之活病毒之ID50例如小至少10倍、小至少100倍、小至少200倍、小至少300倍、小至少400倍、小至少500倍、小至少600倍、小至少700倍、小至少800倍、小至少900倍或小至少1000倍。
如本文中所用，術語「使病毒去活化」或「病毒去活化」係指其中病毒不再能感染細胞、複製及傳播以及移除病毒本身之過程。因此，術語「病毒去活化」通常係指使本文中揭示之流體完全不含感染性病毒污染物之過程。使用本文中揭示之方法進行之任何程度之病毒去活化均為所需的。然而，需要實現滿足嚴格的醫藥安全準則所必需的病毒去活化程度。該等準則由WHO闡述且為熟習此項技術者所熟知。
可藉由任何可定性或定量量測含有脂質層之活病毒之存在或活性的技術偵測含有脂質層之活病毒。通常，使用基於細胞-培養物之分析法測定病毒之效價水準，但亦可使用活體內感染性分析法。可例如藉由顯微鏡檢查(在明顯可見的致細胞病變作用情況下)、基於PCR之偵測分析法或基於抗體之偵測分析法偵測病毒擴增。一種非限制性實例為活體外感染性分析法，稱為組織培養物傳染劑量50(TCID50)分析法。在此分析法中，流體樣品及其連續稀釋物分配入用可充當所分析之含有脂質層之病毒之宿主的細胞接種之96孔培養盤中。接種後，培養盤在足以允許病毒在宿主細胞中複製之時間及溫度下培養。培養後，藉由顯微鏡檢查細胞之感染跡象，諸如細胞溶解細胞、呈現致細胞病變作用之細胞或任何其他指示病毒感染之準則。由陽性(病毒感染)及陰性(無病毒感染)孔之型態計算病毒效價。不存在任何展示陽性感染跡象之孔表明流體基本上不含含有脂質層之病毒。
另一種基於細胞-培養物之分析法為斑塊分析法，其中細胞培養物層中病毒誘導之作用為可見的或以斑塊形式巨觀可見。不存在任何斑塊表明流體基本上不含含有脂質層之病毒。
本說明書部分地提供混合物在培養後具有之蛋白質活性為在與本文中所揭示之有機溶劑及界面活性劑一起培養前所提供蛋白質活性之至少25%。在此具體實例之態樣中，混合物在培養後之蛋白質活性為培養前所提供蛋白質活性之例如約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約100%。在此具體實例之其他態樣中，混合物在培養後之蛋白質活性為培養前所提供蛋白質活性之例如至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在此具體實例之其他態樣中，混合物在培養後之蛋白質活性介於培養前所提供蛋白質活性之例如約25%至約100%、約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約75%至約100%、約80%至約100%、約85%至約100%、約90%至約100%、約25%至約95%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%、約70%至約95%、約75%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約25%至約90%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約75%至約90%、約80%至約90%或約85%至約90%之間。
本說明書部分地提供在培養後存在於混合物中之蛋白質活性為在與本文中所揭示之有機溶劑及界面活性劑一起培養前所提供蛋白質活性之例如至少25%。在此具體實例之態樣中，培養後存在於混合物中之蛋白質活性為培養前所提供蛋白質活性之例如約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約100%。在此具體實例之其他態樣中，培養後存在於混合物中之蛋白質活性為培養前所提供蛋白質活性之例如至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在此具體實例之其他態樣中，培養後存在於混合物中之蛋白質活性介於培養前所提供蛋白質活性之例如約25%至約100%、約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約75%至約100%、約80%至約100%、約85%至約100%、約90%至約100%、約25%至約95%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%、約70%至約95%、約75%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約25%至約90%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約75%至約90%、約80%至約90%或約85%至約90%之間。
可藉由任何可定性或定量量測指示與所監測之蛋白質相關之活性之特性的分析法來偵測蛋白質活性，包括(但不限於)非特異性蛋白質分析法，例如UV吸收或基於化學之分析法，例如布萊德福分析法(Bradford assay)；或特異性蛋白質分析法，例如活體外分析法、基於細胞之分析法或活體內分析法。可由一般熟習此項技術者藉由考慮包括(但不限於)所分析之蛋白質、培養後存在於混合物中之蛋白質量、所分析之特性及一般熟習此項技術者之偏好之因素確定實際用於偵測本文中揭示之蛋白質活性之分析法。
舉例而言，可使用基於凝血級聯(blood coagulation cascade)之顯色分析法偵測因子XIII活性。在此分析法中，凝血酶活化之因子XIII與因子IXa形成複合物，且此複合物隨後活化因子X。可由釋放顯色基團(例如對-硝基-苯胺(pNA))之顯色底物之水解評估活化之因子X活性。初始pNA釋放速率(如由dOD中405 nm下量測之每分鐘吸光度變化測定)與因子Xa活性成比例且隨後與樣品中因子VIII活性成比例。藉由使用過量因子IXa及因子X，因子X之活化速率僅與存在於樣品中的凝血酶裂解之因子VIII量成比例。或者，可藉由改變條件使得因子VIII及因子X過量且因此因子IXa速率限制來測定因子IXa活性。類似地，可藉由改變條件使得因子VIII及因子IXa過量且因此因子X速率限制來測定因子X活性。因此，可使用基於凝血級聯之顯色分析法偵測因子VIII活性以及因子IXa及因子X活性。
作為另一實例，可將應用部分活化部分凝血活酶時間(APTT)之單階段凝血分析法用於偵測因子VIII活性。在此分析法中，包含因子VIII以及CaCl2之樣品添加至缺乏因子VIII之血漿中以促進凝結且此樣品對血漿之APTT凝血時間之作用為因子VIII活性之量度。藉由比較所觀測之因子VIII活性與由已知因子VIII活性樣品產生之標準曲線來計算未知樣品活性。藉由使用在所分析之蛋白質中缺乏之血漿，此凝血分析法亦可用於與凝血級聯有關的任何其他蛋白質。
本說明書部分地提供混合物在培養後基本上不含具有活性之蛋白質之蛋白質聚集體。如本文中所用，術語「基本上不含蛋白質聚集體」意謂用於偵測或確認蛋白質聚集體之存在或活性的器具或方法僅可偵測到或確認微量的具有活性之蛋白質(相關蛋白質)之蛋白質聚集體且該等微量蛋白質聚集體不足以對人類健康造成損害，例如不足以引起個體中之免疫反應。在此具體實例之一個態樣中，混合物在培養後完全不含具有活性之蛋白質之蛋白質聚集體。如本文中所用，術語「完全不含蛋白質聚集體」意謂在用於偵測或確認蛋白質聚集體之存在或活性的器具或方法之偵測範圍內未偵測到或確認具有活性之蛋白質(相關蛋白質)之蛋白質聚集體的存在。基本上不含或完全不含具有活性之蛋白質(相關蛋白質)之蛋白質聚集體的流體可用於製備可安全投與人類之醫藥組成物，因為蛋白質聚集體不足以對人類健康造成損害。
在此具體實例之態樣中，混合物在培養後具有小於例如約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.9%、約0.8%、約0.7%、約0.6%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、約0.1%、約0.09%、約0.08%、約0.07%、約0.06%、約0.05%、約0.04%、約0.03%、約0.02%或約0.01%呈聚集體形式之具有活性之蛋白質。在此具體實例之其他態樣中，混合物在培養後具有小於介於例如約1%至約0.01%、0.9%至約0.01%、0.8%至約0.01%、0.7%至約0.01%、0.6%至約0.01%、0.5%至約0.01%、0.4%至約0.01%、0.3%至約0.01%、0.2%至約0.01%或0.1%至約0.01%之間的呈聚集體形式之具有活性之蛋白質。
可由任何可定性或定量量測與所監測之相關蛋白質相關之蛋白質聚集體之存在或活性的分析法偵測蛋白質聚集體的形成，包括(但不限於)尺寸排阻層析結合本文中揭示之非特異性及/或特異性蛋白質分析法。可由一般熟習此項技術者藉由考慮包括(但不限於)所分析之蛋白質、培養後存在於混合物中之蛋白質量、所分析之特性及一般熟習此項技術者之偏好之因素確定實際用於偵測本文中揭示之蛋白質聚集體之分析法。
本文中揭示之方法可進一步包含在培養後自混合物移除本文中揭示之方法中所用的有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分之步驟。在本文中揭示之方法完成後，可移除有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分。用於移除清潔劑之常用方法包括萃取、過濾、滲濾、緩衝液交換、親和力層析或離子交換層析、沈澱或凍乾。參見例如Current Protocols in Protein Science,「Conventional Chromatographic Separations」,第8-9章,(John Wiley & Sons公司,Hoboken,N.J.)，其以全文引用的方式併入本文中。移除後，剩餘有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分之量為當投與人類時實質上無長期或永久性不利影響之量。
在一個具體實例中，在移除有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分後，混合物基本上不含有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分。如本文中所用，術語「基本上不含有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分」意謂用於偵測或確認有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分之存在或活性的器具或方法僅可偵測到或確認微量的有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分且該微量的有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分在投與人類時不具有長期或永久性不利影響。在此具體實例之一個態樣中，在移除有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分後，混合物完全不含有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分。如本文中所用，術語「完全不含有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分」意謂在用於偵測或確認有機溶劑之存在或活性的器具或方法之偵測範圍內未偵測到或確認有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分的存在。基本上不含或完全不含有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分之混合物內所含的蛋白質可用於製備可安全投與人類之醫藥組成物，因為有機溶劑、界面活性劑及/或其他試劑或組分之量不足以對人類健康造成損害。
在此具體實例之態樣中，殘留在混合物中之有機溶劑量為例如約1 ppm、約3 ppm、約5 ppm、約10 ppm、約15 ppm、約20 ppm、約25 ppm、約30 ppm或約35 ppm。在此具體實例之其他態樣中，殘留在混合物中之有機溶劑量為例如不超過1 ppm、不超過3 ppm、不超過5 ppm、不超過10 ppm、不超過15 ppm、不超過20 ppm、不超過25 ppm、不超過30 ppm或不超過35 ppm。在此具體實例之其他態樣中，殘留在混合物中之有機溶劑量介於例如約1 ppm至約20 ppm、約1 ppm至約25 ppm、約1 ppm至約30 ppm、約1 ppm至約35 ppm、約3 ppm至約20 ppm、約3 ppm至約25 ppm、約3 ppm至約30 ppm或約3 ppm至約35 ppm之間。
在此具體實例之態樣中，殘留在混合物中之界面活性劑量為例如約1 ppm、約3 ppm、約5 ppm、約10 ppm、約15 ppm、約20 ppm、約25 ppm、約30 ppm、約35 ppm、約40 ppm、約45 ppm、約50 ppm、約55 ppm、約60 ppm、約65 ppm、約70 ppm、約75 ppm、約80 ppm、約85 ppm、約90 ppm或約100 ppm。在此具體實例之其他態樣中，殘留在混合物中之界面活性劑量為例如不超過1 ppm、不超過10 ppm、不超過20 ppm、不超過30 ppm、不超過40 ppm、不超過50 ppm、不超過60 ppm、不超過70 ppm、不超過80 ppm、不超過90 ppm或不超過100 ppm。在此具體實例之其他態樣中，殘留在混合物中之界面活性劑量介於例如約1 ppm至約25 ppm、約1 ppm至約50 ppm、約1 ppm至約75 ppm、約1 ppm至約100 ppm、約5 ppm至約25 ppm、約5 ppm至約50 ppm、約5 ppm至約75 ppm、約5 ppm至約100 ppm、約10 ppm至約25 ppm、約10 ppm至約50 ppm、約10 ppm至約75 ppm或約10 ppm至約100 ppm之間。
在此具體實例之一個態樣中，殘留在混合物中之有機溶劑量不超過35 ppm且殘留在混合物中之界面活性劑量不超過100 ppm。在此具體實例之另一態樣中，殘留在混合物中之有機溶劑量不超過3 ppm且殘留在混合物中之界面活性劑量不超過10 ppm。在此具體實例之又一態樣中，殘留在混合物中之有機溶劑量為約1 ppm至約35 ppm且殘留在混合物中之界面活性劑量為約1 ppm至約100 ppm。
在此具體實例之另一態樣中，本文中揭示之方法不包含在培養後自混合物移除有機溶劑之步驟。在此具體實例之又一態樣中，本文中揭示之方法不包含在培養後自混合物移除界面活性劑之步驟。
本文中揭示之方法可進一步包含在培養後自混合物移除病毒之步驟。如本文中所用，術語「移除病毒」或「病毒移除」係指自本文中揭示之混合物去除病毒使得自混合物有效提取病毒粒子之過程。病毒可為活的病毒或去活化病毒。典型地藉由尺寸排阻層析或正吸附層析(其中相關蛋白質結合於層析樹脂)實現移除。移除後，剩餘病毒量為當投與人類時實質上無長期或永久性不利影響之量。
在一個具體實例中，移除病毒後，混合物基本上不含病毒。如本文中所用，術語「基本上不含病毒」意謂用於偵測或確認病毒之存在或活性的器具或方法僅可偵測到或確認微量的病毒且該微量的病毒不足以對人類健康造成損害。在此具體實例之一個態樣中，在移除病毒後，混合物完全不含病毒。如本文中所用，術語「完全不含病毒」意謂在用於偵測或確認病毒之存在或活性的器具或方法之偵測範圍內未偵測到或確認病毒的存在。基本上不含或完全不含病毒之混合物內所含蛋白質可用於製備可安全投與人類之醫藥組成物，因為病毒不足以對人類健康造成損害。
在此具體實例之其他態樣中，在移除病毒後，混合物包含小於1×101 PFU/mL病毒，諸如小於1×100 PFU/mL病毒、小於1×10-1 PFU/mL病毒、1×10-2 PFU/mL病毒或1×10-3 PFU/mL病毒。
在此具體實例之其他態樣中，混合物在移除病毒後包含之病毒小於病毒之ID50，諸如比病毒之ID50小至少10倍、比病毒之ID50小至少100倍、比病毒之ID50小至少200倍、比病毒之ID50小至少300倍、比病毒之ID50小至少400倍、比病毒之ID50小至少500倍、比病毒之ID50小至少600倍、比病毒之ID50小至少700倍、比病毒之ID50小至少800倍、比病毒之ID50小至少900倍或比病毒之ID50小至少1000倍。
在此具體實例之另一態樣中，本文中揭示之方法不包含在培養後自混合物移除病毒之步驟。
本說明書之態樣亦可描述如下：
1.　一種含有脂質層之病毒之去活化方法，該方法包含以下步驟：a)提供包含具有活性之蛋白質之流體；b)混合有機溶劑及界面活性劑與該流體，從而產生混合物；及c)培養該混合物不超過約120分鐘；其中步驟(b)及(c)均在不高於約20℃之溫度下進行；其中該混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒；且其中該蛋白質在培養後之活性為步驟(a)中所提供活性之至少25%。
2.　一種基本上不含含有脂質層之病毒之蛋白質，其係自包含以下步驟之方法獲得：a)提供包含具有活性之蛋白質之流體；b)混合有機溶劑及界面活性劑與該流體，從而產生混合物；及c)培養該混合物不超過約120分鐘；其中步驟(b)及(c)均在不高於約20℃之溫度下進行；其中該混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒；且其中該蛋白質在培養後之活性為步驟(a)中所提供活性之至少25%。
3.　一種含有脂質層之病毒之去活化方法，該方法包含以下步驟：a)提供包含具有活性之因子VIII之流體；b)混合有機溶劑及界面活性劑與該流體，從而產生混合物；及c)培養該混合物不超過約120分鐘；其中步驟(b)及(c)均在不高於約20℃之溫度下進行；其中該混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒；且其中該因子VIII在培養後之活性為步驟(a)中所提供活性之至少25%。
4.　一種基本上不含含有脂質層之病毒之因子VIII，其係自包含以下步驟之方法獲得：a)獲得包含具有活性之因子VIII之流體；b)混合有機溶劑及界面活性劑與該流體，從而產生混合物；及c)培養該混合物不超過約120分鐘；其中步驟(b)及(c)均在不高於約20℃之溫度下進行；其中該混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒；且其中該因子VIII在培養後之活性為步驟(a)中所提供活性之至少25%。
5.　第1項至第4項之具體實例，其中該流體為細胞溶解產物、細胞上清液、來自先前純化步驟之洗提物或生物流體。
6.　第5項之具體實例，其中該細胞溶解產物係自哺乳動物細胞株獲得。
7.　第6項之具體實例，其中該細胞哺乳動物細胞株為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。
8.　第1項至第4項之具體實例，其中該蛋白質為重組蛋白。
9.　第1項至第4項之具體實例，其中該蛋白質來自生物或基因轉殖生物。
10.　第8項至第9項之具體實例，其中該蛋白質為血蛋白。
11.　第10項之具體實例，其中該血蛋白為凝血蛋白質。
12.　第8項至第10項之具體實例，其中該血蛋白為ADAMTS-13、α1-抗血纖維蛋白溶酶、α2-抗血纖維蛋白溶酶、抗凝血酶、抗凝血酶III、癌症促凝素、紅血球生成素、因子II、因子V、因子VI、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纖維結合蛋白、纖維蛋白原、肝素輔因子II、高分子量激肽原、肌肉內免疫球蛋白、靜脈內免疫球蛋白、纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶原活化物抑制劑-1、纖維蛋白溶酶原活化物抑制劑-2、前激肽釋放酶、蛋白質C、蛋白質S、蛋白質Z、蛋白質Z相關蛋白酶抑制劑、組織因子、組織纖維蛋白溶酶原活化物、尿激酶或馮威里氏因子。
13.　第1項至第12項之具體實例，其中該有機溶劑為醚、醇、二烷基磷酸酯或三烷基磷酸酯。
14.　第13項之具體實例，其中該醚為二甲醚、乙醚、乙基丙基醚、甲基丁基醚、甲基異丙基醚或甲基異丁基醚。
15.　第13項之具體實例，其中該醇為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇或異戊醇。
16.　第13項之具體實例，其中該二烷基磷酸酯為二-(正丁基)磷酸酯、二-(第三丁基)磷酸酯、二-(正己基)磷酸酯、二-(2-乙基己基)磷酸酯、二-(正癸基)磷酸酯或乙基二(正丁基)磷酸酯。
17.　第13項之具體實例，其中該三烷基磷酸酯為三-(正丁基)磷酸酯、三-(第三丁基)磷酸酯、三-(正己基)磷酸酯、三-(2-乙基己基)磷酸酯或三-(正癸基)磷酸酯。
18.　第1項至第17項之具體實例，其中該有機溶劑之最終濃度為約0.1%(v/v)至約5.0%(v/v)、約0.1%(v/v)至約1.0%(v/v)、約0.2%(v/v)至約0.5%(v/v)或約0.2%(v/v)至約0.4%(v/v)、約0.3%(v/v)。
19.　第1項至第18項之具體實例，其中該界面活性劑為離子性界面活性劑、兩性離子性(兩性)界面活性劑或非離子性界面活性劑。
20.　第19項之具體實例，其中該離子性界面活性劑為陰離子性界面活性劑或陽離子性界面活性劑。
21.　第20項之具體實例，其中該陰離子性界面活性劑為烷基硫酸鹽、烷基醚硫酸鹽、多庫酯鹽、磺酸鹽氟界面活性劑、烷基苯磺酸鹽、烷基芳基醚磷酸鹽、烷基醚磷酸鹽、烷基羧酸鹽、十二烷醯肌胺酸鈉或羧酸鹽氟界面活性劑。
22.　第21項之具體實例，其中該烷基硫酸鹽為十二烷基硫酸銨或十二烷基硫酸鈉(SDS)。
23.　第21項之具體實例，其中該烷基醚硫酸鹽為月桂醇醚硫酸鈉或肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉。
24.　第21項之具體實例，其中該多庫酯鹽為磺琥珀酸二辛酯鈉。
25.　第21項之具體實例，其中該磺酸鹽氟界面活性劑為全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)或全氟丁烷磺酸鹽。
26.　第21項之具體實例，其中該烷基羧酸鹽為脂肪酸鹽或硬脂酸鈉。
27.　第21項之具體實例，其中該羧酸鹽氟界面活性劑為全氟壬酸鹽及全氟辛酸鹽。
28.　第20項之具體實例，其中該陽離子性界面活性劑為烷基三甲基銨鹽、十六烷基氯化吡啶鎓(CPC)、聚乙氧基化動物脂胺(POEA)、氯化苯甲烷銨(BAC)、苄索氯銨(BZT)、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、二甲基二(十八烷基)氯化銨、二(十八烷基)二甲基溴化銨(DODAB)、pH值依賴性一級胺、pH值依賴性二級胺或pH值依賴性三級胺。
29.　第28項之具體實例，其中該烷基三甲基銨鹽為十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)或十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)。
30.　第28項之具體實例，其中該一級胺在pH<10下變為帶正電或該二級胺在pH<4下變為帶電。
31.　第20項之具體實例，其中該陽離子性界面活性劑為奧替尼啶二鹽酸鹽。
32.　第20項之具體實例，其中該兩性離子性界面活性劑為3-[(3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS)、磺基甜菜鹼、甜菜鹼或卵磷脂。
33.　第32項之具體實例，其中磺基甜菜鹼為椰油醯胺基丙基羥基磺基甜菜鹼。
34.　第32項之具體實例，其中該甜菜鹼為椰油醯胺基丙基甜菜鹼。
35.　第20項之具體實例，其中該非離子性界面活性劑為聚氧乙二醇脫水山梨糖醇烷基酯、泊洛沙姆、烷基酚聚乙二醇醚、聚乙二醇烷基芳基醚、聚氧乙二醇烷基醚、2-十二烷氧基乙醇(-PX)、聚氧乙二醇辛基酚醚、聚氧乙二醇烷基酚醚、苯氧基聚乙氧基乙醇、葡萄糖苷烷基醚、麥芽糖苷烷基醚、硫葡萄糖苷烷基醚、毛地黃皂苷、甘油烷基酯、烷基芳基聚醚硫酸酯、醇磺酸酯、脫水山梨糖醇烷基酯、椰油醯胺乙醇胺、蔗糖單月桂酸酯、十二烷基二甲基氧化胺或膽酸鈉。
36.　第35項之具體實例，其中該聚氧乙二醇脫水山梨糖醇烷基酯為聚山梨酸酯20脫水山梨糖醇單油酸酯( 20)、聚山梨酸酯40脫水山梨糖醇單油酸酯( 40)、聚山梨酸酯60脫水山梨糖醇單油酸酯( 60)、聚山梨酸酯61脫水山梨糖醇單油酸酯( 61)、聚山梨酸酯65脫水山梨糖醇單油酸酯( 65)、聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)或聚山梨醇酯81脫水山梨糖醇單油酸酯( 81)。
37.　第35項之具體實例，其中該泊洛沙姆為泊洛沙姆124( L44)、泊洛沙姆181(L61)、泊洛沙姆182( L62)、泊洛沙姆184( L64)、泊洛沙姆188( F68)、泊洛沙姆237( F87)、泊洛沙姆338( L108)或泊洛沙姆407(F127)。
38.　第35項之具體實例，其中該聚氧乙二醇烷基醚為八伸乙基二醇單十二烷基醚、五伸乙基二醇單十二烷基醚、 30或 35。
39.　第35項之具體實例，其中該聚氧乙二醇辛基酚醚為聚氧乙烯(4-5)對-第三辛基酚( X-45)或聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)。
40.　第35項之具體實例，其中該聚氧乙二醇烷基酚醚為壬苯醇醚-9。
41.　第35項之具體實例，其中該苯氧基聚乙氧基乙醇為壬基苯氧基聚乙氧基乙醇或辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。
42.　第35項之具體實例，其中該葡萄糖苷烷基醚為辛基葡萄哌喃糖苷。
43.　第35項之具體實例，其中該麥芽糖苷烷基醚為十二烷基麥芽哌喃糖苷。
44.　第35項之具體實例，其中該硫葡萄糖苷烷基醚為庚基硫葡萄哌喃糖苷。
45.　第35項之具體實例，其中該甘油烷基酯為月桂酸甘油酯。
46.　第35項之具體實例，其中該椰油醯胺乙醇胺為椰油醯胺單乙醇胺或椰油醯胺二乙醇胺。
47.　第1項至第46項之具體實例，其中該界面活性劑之最終濃度為約0.1%(v/v)至約10.0%(v/v)，或約0.5%(v/v)至約5.0%(v/v)。
48.　第1項至第47項之具體實例，其中該界面活性劑為多種界面活性劑。
49.　第1項至第48項之具體實例，其中該多種界面活性劑如技術方案第19項至第46項所定義。
50.　第48項或第49項之具體實例，其中該一種界面活性劑之最終濃度為約0.1%(v/v)至約10.0%(v/v)、約0.5%(v/v)至約5.0%(v/v)或約0.5%(v/v)至約1.0%(v/v)，且該等其餘界面活性劑之最終濃度為約0.1%(v/v)至約5%(v/v)、約0.1%(v/v)至約1.0%(v/v)或約0.2%(v/v)至約4%(v/v)。
51.　第1項至第50項之具體實例，其中在步驟(c)中，該混合物培養介於約10分鐘與約90分鐘之間的時間。
52.　第1項至第50項之具體實例，其中在步驟(c)中，該混合物培養介於約30分鐘與約60分鐘之間的時間。
53.　第1項至第52項之具體實例，其中步驟(b)及(c)均在介於約0℃與約16℃之間的溫度下進行。
54.　第1項至第52項之具體實例，其中步驟(b)及(c)均在介於約2℃與約12℃之間的溫度下進行。
55.　第1項至第52項之具體實例，其中步驟(b)及(c)均在介於約2℃與約8℃之間的溫度下進行。
56.　第1項至第52項之具體實例，其中步驟(b)及(c)均在介於約2℃與約4℃之間的溫度下進行。
57.　第1項至第56項之具體實例，其中該混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒。
58.　第1項至第57項之具體實例，其中該混合物在培養後完全不含含有脂質層之活病毒。
59.　第1項至第58項之具體實例，其中該混合物在培養後包含小於1×101 PFU/mL含有脂質層之活病毒。
60.　第1項至第59項之具體實例，其中該混合物在培養後對含有脂質層之活病毒之ID50小於培養前至少100倍。
61.　第1項至第60項之具體實例，其中該混合物在培養後基本上不含蛋白質聚集體。
62.　第1項至第61項之具體實例，其中該混合物在培養後完全不含蛋白質聚集體。
63.　第1項至第62項之具體實例，其中該混合物在培養後具有小於約1%、小於約0.9%、小於約0.8%、小於約0、7%、小於約0.6%、小於約0.5%、小於約0.4%、小於約0.3%、小於約0.2%或小於約0.1%呈聚集體形式之具有活性之蛋白質。
64.　第1項至第63項之具體實例，其中培養後存在於該混合物中之蛋白質活性為該步驟(a)中所提供蛋白質活性之至少50%或該步驟(a)中所提供蛋白質活性之至少75%。
65.　第1項至第64項之具體實例，其中該流體進一步包含含有脂質層之病毒。
66.　第65項之具體實例，其中該含有脂質層之病毒為DNA病毒、RNA病毒或反轉錄病毒。
67.　第66項之具體實例，其中該DNA病毒為疱疹病毒科病毒、痘病毒科病毒或肝病毒科病毒。
68.　第66項之具體實例，其中該RNA病毒為黃病毒科病毒、披膜病毒科病毒、冠狀病毒科病毒、δ病毒科病毒、正黏病毒科病毒、副黏病毒科病毒、彈狀病毒科病毒、布尼亞病毒科病毒或絲狀病毒科病毒。
69.　第66項之具體實例，其中該反轉錄病毒為反轉錄病毒科病毒或肝病毒科病毒。
70.　第65項之具體實例，其中該含有脂質層之病毒為人類免疫缺乏病毒、辛德比病毒、疱疹單純型病毒、假性狂犬病毒、仙台病毒、水泡性口炎病毒、西尼羅河病毒、牛病毒性腹瀉病毒、冠狀病毒、馬關節炎病毒、嚴重急性呼吸道症候群病毒、莫洛尼鼠類白血病病毒或痘瘡病毒。
71.　第1項至第70項之具體實例，其中該方法進一步包含在步驟(c)後自該混合物移除該溶劑之步驟。
72.　第1項至第71項之具體實例，其中該方法進一步包含在步驟(c)後自該混合物移除該非離子性界面活性劑之步驟。
73.　第1項至第72項之具體實例，其中該方法進一步包含在步驟(c)後自該混合物移除該無活力病毒之步驟。
74.　一種含有脂質層之病毒之去活化方法，該方法包含以下步驟：a)提供包含具有活性之因子VIII之流體；b)混合三(正丁基)磷酸酯、聚氧乙烯辛基苯基及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇與該流體，從而產生混合物，其中該三(正丁基)磷酸酯之最終濃度為約0.1%(v/v)至約5.0%(v/v)，該聚氧乙烯辛基苯基之最終濃度為約0.5%(v/v)至約10.0%(v/v)且該聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇之最終濃度為約0.1%(v/v)至約5.0%(v/v)；及c)培養該混合物不超過約120分鐘；其中步驟(b)及(c)均在不高於約20℃之溫度下進行；其中該混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒；且其中該因子VIII在培養後之活性為步驟(a)中所提供活性之至少25%。
75.　一種基本上不含含有脂質層之病毒之因子VIII，其係自包含以下步驟之方法獲得：a)獲得包含具有活性之因子VIII之流體；b)混合三(正丁基)磷酸酯、聚氧乙烯辛基苯基及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇與該流體，從而產生混合物，其中該三(正丁基)磷酸酯之最終濃度為約0.1%(v/v)至約5.0%(v/v)，該聚氧乙烯辛基苯基之最終濃度為約0.5%(v/v)至約10.0%(v/v)且該聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇之最終濃度為約0.1%(v/v)至約5.0%(v/v)；及c)培養該混合物不超過約120分鐘；其中步驟(b)及(c)均在不高於約20℃之溫度下進行；其中該混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒；且其中該因子VIII在培養後之活性為步驟(a)中所提供活性之至少25%。
76.　第74項或第75項之具體實例，其中該三(正丁基)磷酸酯之濃度為約0.1%(v/v)至約0.7%，該聚氧乙烯辛基苯基之濃度為約0.6%(v/v)至約1.4%(v/v)且該聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇之濃度為約0.1%(v/v)至約0.7%。
77.　第74項或第75項之具體實例，其中該三(正丁基)磷酸酯之濃度為約0.1%(v/v)至約0.5%，該聚氧乙烯辛基苯基之濃度為約0.7%(v/v)至約1.3%(v/v)且該聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇之濃度為約0.1%(v/v)至約0.5%。
78.　第74項或第75項之具體實例，其中該三(正丁基)磷酸酯之濃度為約0.2%(v/v)至約0.4%，該聚氧乙烯辛基苯基之濃度為約0.8%(v/v)至約1.2%(v/v)且該聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇之濃度為約0.2%(v/v)至約0.4%。
79.　第74項或第75項之具體實例，其中該三(正丁基)磷酸酯之濃度為約0.3%(v/v)，該聚氧乙烯辛基苯基之濃度為約1.0%(v/v)且該聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇之濃度為約0.3%(v/v)。
80.　第74項至第79項之具體實例，其中該混合物在培養後具有小於約小於約1%、小於約0.9%、小於約0.8%、小於約0.7%、小於約0.6%、小於約0.5%、小於約0.4%、小於約0.3%、小於約0.2%或小於約0.1%呈聚集體形式之具有活性之蛋白質。
81.　第74項至第80項之具體實例，其中培養後存在於該混合物中之蛋白質活性為該步驟(a)中所提供蛋白質活性之至少50%或該步驟(a)中所提供蛋白質活性之至少75%。
82.　如本文中所描述之第1項至第81項之具體實例。
83.　一種含有脂質層之病毒之去活化方法，其係如本文中所描述。
84.　一種基本上不含含有脂質層之病毒之因子VIII，其係由本文中所描述之方法獲得。
85.　一種基本上不含含有脂質層之病毒之蛋白質，其係由本文中所描述之方法獲得。
實施例
以下非限制性實施例係僅出於說明性目的提供以促進對本發明涵蓋之代表性具體實例之更全面理解。該等實施例不應視為限制本說明書中描述之任何具體實例，包括關於本文中揭示之含有脂質層之病毒之去活化方法及使用該等方法處理之產物之具體實例。
實施例1 病毒去活化評估
此實施例說明本文中揭示之含有脂質層之病毒之去活化方法導致混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒。
由分泌蛋白質進入細胞培養基中之CHO細胞株產生之重組型因子VIII藉由收集培養基且對其進行離心以移除細胞碎片來收集。在保持在10℃或低於10℃之冷室中稀釋收集之上清液且經0.2 μm過濾器過濾，且藉由穿過包含固定α-因子VIII小鼠單株抗體之免疫親和層析管柱且收集洗提物來捕獲因子VIII。藉由使免疫親和層析洗出液穿過包含帶負電之磺化基團之陽離子交換層析管柱來進一步處理因子VIII。接著冷卻自此交換管柱收集之洗出液至約2℃或約10℃。
冷卻之洗出液接著分為三等份且以1:13比率添加脂質層型病毒假性狂犬病毒(例如24 mL處理進料加2 mL病毒原料)。接著混合等分試樣與溶劑/清潔劑溶液且冷卻至相同溫度，如下：等分試樣1、0.21%(v/v)三(正丁基)磷酸酯(TNBP)、0.7%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及0.21%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)；等分試樣2、0.06%(v/v)三(正丁基)磷酸酯(TNBP)、0.2%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)及0.06%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)；及等分試樣3、0.03%(v/v)三(正丁基)磷酸酯(TNBP)、0.1%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及0.03%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)。溶劑/清潔劑溶液之組分濃度分別等於常規製備期間該等組分之標稱濃度之70%、20%及10%。使用該等次最佳濃度以使用最不利於病毒去活化的條件評估方法穩健性以及評估去活化動力學。
為評估S/D處理之有效性，測定脂質層病毒之log10縮減。收集來自外加病毒之起始物質及S/D處理期間之樣品；在病毒滴定前藉由用冷的細胞培養基直接稀釋來終止樣品中溶劑/清潔劑組分之病毒去活化作用。藉由自加料之起始物質之(log)效價減去最終樣品之(log)效價來計算對數縮減因子；其中未觀測到最終樣品中之感染性，獲得此計算之偵測極限。
結果表明假性狂犬病毒去活化在約2℃或約10℃下在約1至約2分鐘內發生(表1)。由於在溶劑/清潔劑組分濃度之下限或低於下限且低於S/D處理持續時間之下限情況下進行實驗，因此所得縮減因子為大規模處理之病毒去活化能力之穩健估計值。該等結果表明約10℃及約2℃下之S/D處理為穩健的且極有效且使脂質包膜病毒快速去活化。
實施例2 病毒去活化評估
此實施例說明本文中揭示之含有脂質層之病毒之去活化方法導致混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒。
基本上如實施例1中描述表現及純化重組型因子VIII。接著冷卻自陽離子交換管柱收集之洗出液至約2℃。
冷卻之洗出液接著分為6等份且脂質包膜病毒亦以比率1:13添加至等分試樣中(例如24 mL處理進料加2 mL病毒原料)，如下：等分試樣1及2，添加假性狂犬病毒(PRV)；等分試樣3及4，添加莫洛尼鼠類白血病病毒(X-MuLV)；及等分試樣5及6，添加牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)。接著混合等分試樣與溶劑/清潔劑溶液且冷卻至約2℃，如下：等分試樣1、3及5；0.21%(v/v)三(正丁基)磷酸酯(TNBP)、0.7%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及0.21%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)；及等分試樣2、4及6；0.03%(v/v)三(正丁基)磷酸酯(TNBP)、0.1%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及0.03%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)。溶劑/清潔劑溶液之組分濃度分別等於常規製備下該等組分之標稱濃度之70%及10%。使用該等次最佳濃度以使用最不利於病毒去活化的條件評估方法穩健性以及評估去活化動力學。
為評估S/D處理之有效性，測定三種脂質層病毒中之每一者之log10縮減。收集來自外加病毒之起始物質及S/D處理期間之樣品；在病毒滴定前藉由用冷的細胞培養基直接稀釋來終止樣品中溶劑/清潔劑組分之病毒去活化作用。藉由自加料之起始物質之(log)效價減去最終樣品之(log)效價來計算對數縮減因子；其中未觀測到最終樣品中之感染性，獲得此計算之偵測極限。
結果表明當與70%溶劑/清潔劑溶液一起培養時，PRV、X-MuLV及BVDV去活化均在約2℃下在約1-2分鐘內發生(表2)。由於在溶劑/清潔劑組分濃度之下限或低於下限且低於S/D處理持續時間之下限情況下進行實驗，因此所得縮減因子為大規模處理之病毒去活化能力之穩健估計。該等結果表明約2℃下之S/D處理為穩健的且極有效且使脂質包膜病毒快速去活化。
實施例3 混合時間、過濾及蛋白質產率評估
此實施例說明本文中揭示之含有脂質層之病毒之去活化方法對溶劑/清潔劑組分之混合時間、過濾期間溶劑/清潔劑組分之滯留及蛋白質過濾量無不利影響。
為評估較低溫度對溶劑/清潔劑組分之混合時間之影響，藉由添加0.3%(v/v)TNBP、1.0%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及0.3%(v/v)聚山梨醇酯30脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)且在4±2℃下攪拌10、20或30分鐘來製備50 mL溶劑/清潔劑溶液：由於溶劑/清潔劑溶液已含有0.1%聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)，因此該化合物之最終濃度為0.4%。使用具有折射率偵測器(RID)之C18 RP-HPLC同時測定TNBP及聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)之濃度。使用蒸發光散射偵測器(ELSD)藉由C1 RP-HPLC測定聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)之濃度。對於TNBP及聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)之HPLC分析，使用等度洗提(使用含68%甲醇之水)。在聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)之分析法中，使用含60%甲醇之水至100%甲醇之梯度洗提。
該等結果證實TNBP、聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)之濃度快速地在10分鐘內穩定且4℃±2℃之低溫對溶劑/清潔劑組分之混合時間無不利影響(表3)。
為評估過濾步驟期間溫度對溶劑/清潔劑組分之滯留可能性之影響，藉由添加0.3%(v/v)TNBP、1.0%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及0.3%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)，在4±2℃下攪拌30分鐘來製備50 mL溶劑/清潔劑溶液且如上文所描述量測各組分之濃度。接著在三種不同溫度條件下處理溶劑/清潔劑溶液：22.5℃及約8小時升溫時間；22.5℃及約2小時升溫時間；以及4℃且無任何升溫或預加熱步驟。在培養期結束時，樣品經0.2 μm過濾器過濾且藉由HPLC量測TNBP、聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)濃度。
結果表明0.2 μm過濾器上未殘留任何溶劑/清潔劑組分(表4)。此外，較低培養溫度(4℃±2℃)對溶劑/清潔劑組分之過濾性無不利影響。
為評估較低溫度對回收之蛋白質活性之影響，藉由添加0.3%(v/v)TNBP、1.0%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及0.3%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)，在4±2℃下攪拌30分鐘來製備50 mL溶劑/清潔劑溶液。接著在三種不同溫度條件下處理溶劑/清潔劑溶液：22.5℃及約8小時升溫時間；22.5℃及約2小時升溫時間；以及4℃且無任何升溫或預加熱步驟。在培養期結束時，樣品經0.2 μm過濾器過濾且在過濾前及過濾後使用顯色底物分析法量測因子VIII活性。
為進行因子VIII活性之顯色分析法，經溶劑/清潔劑處理之溶液之等分試樣於樣品稀釋緩衝液(50 mM Tris、5 mM CaCl2、225 mM NaCl、0.1%聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)，pH 6.7±0.2)中預稀釋至約25 IU/mL且接著於去除因子VIII之血漿中進一步稀釋至1 IU/mL。接著混合100 μL預稀釋之樣品與0.03 M CaCl2、0.06 mM磷脂質、100 μL 0.3 μM因子IXa、100 μL 1 μM因子X及500 μL 3.4 μM顯色底物CH3OCO-D-環己基甘胺醯基-甘胺醯基-精胺醯基-對-硝基苯胺以確保因子VIII為反應之速率限制組分。混合物在37℃下培養90秒且接著獲取在405 nm下得到之分光光度計讀數以測定顯色底物水解及對-硝基苯胺釋放速率。
在0.2 μm過濾步驟之前及之後量測之因子VIII活性相等。此結果證實在不存在S/D組分下，較低溫度對0.2 μm過濾步驟後之因子VIII回收無不利影響。
結果表明在所有評估溫度條件下因子VIII回收率均為約100%且儘管存在溶劑/清潔劑組分，但過濾步驟之前及之後之蛋白質活性相等(表5)。
實施例4 使包含具有活性之蛋白質之流體中含有脂質層之病毒去活化
此實施例說明本文中揭示之用於使包含具有活性之蛋白質之流體中含有脂質層之病毒去活化的方法。
為評估本文中揭示之含有脂質層之病毒之去活化方法對回收之蛋白質活性之整體有效性，藉由添加0.3%(v/v)TNBP、1.0%(v/v)聚氧化乙烯辛基苯基醚( X-100)及0.3%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)，在4±2℃下攪拌30分鐘來製備50 mL溶劑/清潔劑溶液。接著在三種不同溫度條件下處理溶劑/清潔劑溶液：22.5℃及約8小時升溫時間；22.5℃及約2小時升溫時間；以及4℃且無任何升溫或預加熱步驟。在培養期結束時，使用離子交換管柱層析純化樣品且基本上如實施例3中所描述在過濾之前及之後使用顯色底物分析法量測因子VIII活性。
結果表明溶劑/清潔劑處理在4℃下進行2小時的情況下因子VIII之平均回收率為83.02%；溶劑/清潔劑處理在22.5℃下進行2小時的情況下回收率為82.83%；且溶劑/清潔劑處理在22.5℃下進行8小時的情況下回收率為80.93%(表6)。
該等結果證實4℃下歷時2小時之溶劑/清潔劑處理不顯著影響活性因子VIII之回收。此外，當在4℃下而非22.5℃下進行培養時，因子VIII之比活性看似保持得更好。當在22.5℃下進行溶劑/清潔劑處理時，損失約6%比活性，而當在4℃下進行處理時，觀測到因子VIII比活性僅略微降低約1%。因此，在低溫下進行溶劑/清潔劑處理時觀測到因子VIII平均回收率意外增加。
實施例5 蛋白質聚集評估
此實施例說明本文中揭示之含有脂質層之病毒之去活化方法阻止蛋白質聚集。
為評估低溫下病毒去活化步驟對蛋白質聚集體形成之影響，在三種不同溫度條件下進行溶劑/清潔劑處理：22.5℃及約8小時升溫時間；22.5℃及約2小時升溫時間；以及4℃且無任何升溫或預加熱步驟。在所有條件下，在達到目標溫度時添加溶劑/清潔劑試劑。在培養期後，靜置1小時(所有溫度條件)，藉由離子交換層析移除溶劑/清潔劑組分且量測最終主體中之聚集體量。重複所有溶劑/清潔劑條件3次。
在配備有Bio-Sep-SEC-S4000管柱之HPLC系統上藉由尺寸排阻層析(SEC)測定聚集體(以百分比表示)。固定相含有結合於適用於分離分子量在15至2,000 kDa範圍內之蛋白質之二氧化矽支撐物的親水基團。自經溶劑/清潔劑處理之溶液獲得之樣品稀釋至50 μg/mL且11 μL注射至管柱上。洗提緩衝液為20 mM Tris、250 mM NaCl、3 mM二水合氯化鈣、0.05%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)、7.5%(v/v)乙二醇，pH值調節至7.0±0.2。在等度移動相緩衝液下進行分離。使用螢光偵測器在285 nm激發波長及335 nm發射波長下進行偵測。反應與所得層析圖之不同峰中所存在之蛋白質量成比例。聚集體百分比計算為洗提份峰面積與總峰面積之比(表7)。
意外的是，在4℃下進行之實驗產生在最終主體洗出液中不可偵測(<0.25%)之聚集體量，而對於在22.5℃下進行之處理，偵測到形成大得多的聚集體(0.7%及0.6%)。最終主體中聚集體之減少顯著，因為通常認為聚集體增強針對單體形式蛋白質之免疫反應。
實施例6 使包含具有活性之蛋白質之流體中含有脂質層之病毒去活化
此實施例說明本文中揭示之使包含具有活性之蛋白質之流體中含有脂質層之病毒去活化的方法。
由分泌蛋白質進入細胞培養基中之CHO細胞株產生之重組型因子VIII於2,500公升生物反應器中生長且藉由以下步驟收集：冷卻至10℃，收集培養基且對其進行離心以移除細胞碎片。在保持在10℃或低於10℃之冷室中，稀釋收集之上清液且經0.2 μm過濾器過濾，且藉由穿過包含固定α-因子VIII小鼠單株抗體之免疫親和層析管柱且收集洗提物來捕獲因子VIII。藉由使免疫親和層析洗出液穿過包含帶負電之磺化基團之陽離子交換層析管柱來進一步處理因子VIII。接著約8公升自此交換管柱收集之洗出液冷卻至約4℃且與冷卻至相同溫度之溶劑/清潔劑溶液混合約10分鐘(每公斤陽離子交換劑洗提物16.6公克溶劑/清潔劑溶液之量)。溶劑/清潔劑溶液包含18.3:66.3:20.2重量比之三(正丁基)磷酸酯(TNBP)、聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)。此等於約0.3%(v/v)三(正丁基)磷酸酯(TNBP)、約1.0%(v/v)聚氧乙烯辛基苯基醚( X-100)及約0.3%(v/v)聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)之最終濃度。在約4℃下連續混合不超過約120分鐘後，接著經0.2 μm過濾器過濾經溶劑/清潔劑處理之洗提物以移除病毒碎片。濾過之經溶劑/清潔劑處理之溶液用陰離子交換層析平衡緩衝液稀釋且藉由穿過陰離子交換層析管柱進一步處理以移除溶劑/清潔劑組分。自陰離子交換層析洗提份收集包含因子VIII之最終純化溶液。接著量測包含因子VIII之最終純化溶液中含有脂質層之病毒之存在、因子VIII活性、聚集體量及微量溶劑/清潔劑組分。
為分析包含因子VIII之最終純化溶液中含有脂質層之活病毒之存在或活性，進行TCID50分析法。收集濾過之經溶劑/清潔劑處理之溶液樣品且用維羅細胞培養基(Vero cell culture medium)以1:00或1:10稀釋。於維羅細胞培養基中製備樣品之連續0.5 log10稀釋物且100 μL各稀釋物添加至用維羅細胞(Vero cell)接種之微量滴定培養盤管柱之8個孔中之每一孔中。微量滴定培養盤於濕潤及CO2調節之培養箱中在36±2℃下培養7天。培養後，藉由顯微鏡檢查細胞之感染跡象，諸如溶解細胞、呈現致細胞病變作用之細胞或任何其他指示病毒感染之準則。由陽性(病毒感染)及陰性(無病毒感染)孔之型態，根據泊松分佈(Poisson distribution)計算病毒效價且表示為PFU/mL及log10[TCID50/mL]。任何孔中均不存在陽性感染跡象表明經處理之溶液基本上不含含有脂質層之病毒。
為分析存在於最終純化溶液中之因子VIII活性量，進行因子VIII活性之顯色分析法。濾過之經溶劑/清潔劑處理之溶液之等分試樣預先於樣品稀釋緩衝液(50 mM Tris、5 mM CaCl2、225 mM NaCl、0.1%聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)，pH 6.7±0.2)中稀釋至約25 IU/mL且接著於去除因子VIII之血漿中進一步稀釋至1 IU/mL。接著混合100 μL預先稀釋之樣品與0.03 M CaCl2、0.06 mM磷脂質、100 μL 0.3 μM因子IXa、100 μL 1 μM因子X及500 μL 3.4 μM顯色底物CH3OCO-D-環己基甘胺醯基-甘胺醯基-精胺醯基-對-硝基苯胺以確保因子VIII為反應之速率限制組分。混合物在37℃下培養90秒且接著獲取405 nm下得到之分光光度計讀數以測定顯色底物水解及對-硝基苯胺釋放速率。
為分析存在於最終純化溶液中之因子VIII活性量，進行因子VIII活性之單階段凝結分析法。濾過之經溶劑/清潔劑處理之溶液之等分試樣預先於樣品稀釋緩衝液(50 mM Tris、5 mM CaCl2、225 mM NaCl、0.1%聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯( 80)，pH 6.7±0.2)中稀釋至約25 IU/mL且接著於缺乏因子VIII之血漿中進一步稀釋至1 IU/mL。接著混合100 μL預先稀釋之樣品與100 μL缺乏因子VIII之血漿。混合物在37℃下培養3分鐘且添加100 μL 25 mM CaCl2以開始凝結過程。藉由比較APTT凝血時間值與藉由運行計算程序(其產生凝血時間與因子VIII濃度之雙對數座標圖)之器具計算得到之標準曲線來測定存在之因子VIII量。設計用於凝結分析法之凝結分析器及適當試劑以量測生理範圍內凝結參數之活性。結果表明因子VIII之平均比活性為約6,120 UI/mg。此平均比活性高於5,809 UI/mg(使用在約20℃至約25℃下於有機溶劑/界面活性劑混合物中培養流體之病毒去活化方法處理之因子VIII之平均比活性)。
為分析存在於包含因子VIII之最終純化溶液中之蛋白質聚集體量，基本上如實施例5中所描述進行尺寸排阻層析及UV吸收實驗。
為分析存在於包含因子VIII之最終純化溶液中之微量溶劑/清潔劑組分，基本上如實施例3中所描述進行RP-HPLC實驗。
最後，應理解，儘管參考特定具體實例強調本說明書之態樣，但熟習此項技術者將容易瞭解該等揭示之具體實例僅為本文中揭示之標的物之原理之說明。因此，應理解，揭示之標的物不以任何方式限於本文中所描述之特定方法、方案及/或試劑等。因此，可在不偏離本說明書精神的情況下根據本文中之教示對所揭示之標的物作出各種修改或變化或產生其替代性組態。最後，本文中所用術語係僅出於描述特定具體實例目的且不意欲限制僅由申請專利範圍界定之本發明之範疇。因此，本發明不限於明確展示及描述之內容。
本文中描述本發明之某些具體實例，包括發明者已知用於執行本發明之最佳方式。當然，在閱讀先前描述後，關於所描述具體實例之變化將變得對一般熟習此項技術者顯而易見。發明者預期熟習此項技術者可適當使用該等變化且發明者意欲可以與本文中所特定描述不同的方式實踐本發明。因此，如適用法律允許，本發明包括隨附申請專利範圍中所述標的物之所有修改及等效物。此外，除非本文中另有說明或以其他方式與上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述具體實例之所有可能變化之任何組合。
本發明之替代性具體實例、要素或步驟之群不應視為限制。各群成員可個別地參考及主張或與本文中揭示之其他群成員以任何組合參考及主張。可預期出於便利性及/或專利性原因，一或多個群成員可包括於群中或自群刪除。當存在任何該包含或刪除時，認為說明書包含所修改之群組，因此滿足隨附申請專利範圍中使用之所有馬庫西群組(Markush group)之書面描述。
除非另有說明，否則本說明書及申請專利範圍中使用之所有表示特性、項目、量、參數、性質、術語等之數字均應理解為在一切情況下均由術語「約」修飾。如本文中所用，術語「約」意謂所修飾之特性、項目、量、參數、性質或術語涵蓋所述特性、項目、量、參數、性質或術語之值加上或減去該值之10%之範圍。因此，除非相反地指出，否則說明書及隨附申請專利範圍中闡述之數值參數為近似值且該等近似值可變化。最低限度且並非嘗試限制申請專利範圍之範疇之等效物之原理之應用，應至少根據所報導之有效數字之數目且藉由應用一般捨入技術來解釋各數值指示。儘管闡述本發明之廣泛範疇的數值範圍及值為近似值，但已儘可能精確地報導特定實例中所述之數值範圍及值。然而，任何數值範圍或值均固有地含有某些由其各別測試量測中發現之標準差所必然引起的誤差。本文中值之數值範圍之敍述僅意欲充當個別地參考該範圍內各獨立數值的簡寫方法。除非本文中另有說明，否則數值範圍之各個值併入本說明書中，如同本文中個別敍述一般。
除非本文中另有說明或與上下文明顯矛盾，否則本發明之描述之上下文中(尤其以下申請專利範圍之上下文中)使用之術語「一」、「該」及類似指示物應視為涵蓋單數及複數。除非本文中另有說明或以其他方式與上下文明顯矛盾，否則可以任何適當次序進行本文中所描述之所有方法。本文中提供之任何及所有實施例或例示性語言(例如「諸如」)之使用僅意欲更好地說明本發明且不對所主張之本發明之範疇造成限制。不應將本說明書中之任何語言視為指示任何未主張之實踐本發明所必需之要素。
申請專利範圍中可使用語言由...組成或基本上由...組成來進一步限制本文中揭示之特定具體實例。當用於申請專利範圍中時(無論申請或根據修正添加)，過渡術語「由...組成」排除申請專利範圍中未指定的任何要素、步驟或成分。過渡術語「基本上由...組成」使申請專利範圍之範疇限於指定物質或步驟及不會本質上影響基本及新穎特性之物質或步驟。本文中固有地或明確地描述及允用所主張之本發明之具體實例。
本說明書中參考及鑑別之所有專利案、專利公開案及其他公開案均以全文引用的方式個別地及明確地併入本文中以用於描述及揭示目的，例如該等公開案中所描述之可與本發明結合使用之組成物及方法。僅提供該等公開案在本申請案之申請日期前之揭示內容。在此方面不應視為承認發明者無權借助於先前發明或出於任何其他原因而先於該揭示內容。關於此等文獻之日期之所有聲明或關於此等文獻之內容之表示係基於申請人可獲得之資訊，且並不表示承認此等文獻之日期或內容之正確性。

Claims (14)

  1. 一種去活化含有脂質層之病毒之方法，該方法包含以下步驟：a)提供包含具有活性之因子VIII之流體；b)混合三(正丁基)磷酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯與該流體，從而產生混合物，其中該三(正丁基)磷酸酯之最終濃度為約0.1%(v/v)至約5.0%(v/v)，該聚氧乙烯辛基苯基醚之最終濃度為約0.5%(v/v)至約10.0%(v/v)，且該聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯之最終濃度為約0.1%(v/v)至約5.0%(v/v)；及c)培養該混合物不超過約120分鐘；其中步驟(b)及(c)均在約2℃至約8℃之間的溫度下進行；其中該混合物在培養後基本上不含含有脂質層之活病毒；且其中該因子VIII在培養後之活性為在步驟(a)中所提供活性之至少25%。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該三(正丁基)磷酸酯之濃度為約0.3%(v/v)，該聚氧乙烯辛基苯基醚之濃度為約1.0%(v/v)，且該聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯之濃度為約0.3%(v/v)。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該因子VIII在培養後之活性為在步驟(a)中所提供活性之至少50%。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該因子VIII在培養後之活性為在步驟(a)中所提供活性之至少75%。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該流體為細胞溶解產物、細胞上清液、來自先前純化步驟之洗提物或生物流體。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該因子VIII為重組因子VIII。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在步驟(c)中，混合物被培養約10分鐘至約90分鐘之間。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在步驟(c)中，混合物被培養約30分鐘至約60分鐘之間。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟(b)及(c)兩者皆在約2℃至約4℃之間的溫度下進行。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該混合物在培養後包含的含有脂質層之活病毒之ID50與培養前相較至少小了100倍；包含小於1×101PFU/mL含有脂質層之活病毒；基本上不含含有脂質層之活病毒；或完全不含含有脂質層之活病毒。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該含有脂質層之病毒為DNA病毒、RNA病毒或反轉錄病毒。
  12. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該含有脂質層之病毒為疱疹病毒科病毒(herpesviridae virus)、痘病毒科病毒(poxviridae virus)、肝病毒科病毒(hepadnaviridae virus)、黃病毒科病毒(flaviviridae virus)、披膜病毒科病毒(togaviridae virus)、冠狀病毒科病毒(coronaviridae virus)、δ病毒科病毒(deltavirus virus)、正黏病毒科病毒(orthomyxoviridae virus)、副黏病毒科病毒(paramyxoviridae virus)、彈狀病毒科病毒(rhabdoviridae virus)、布尼亞病毒科病毒(bunyaviridae virus)、絲狀病毒 科病毒(filoviridae virus)或反轉錄病毒科病毒(retroviridae virus)。
  13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該含有脂質層之病毒為人類免疫缺乏病毒、辛德比病毒(sindbis virus)、疱疹單純型病毒(herpes simplex virus)、假性狂犬病毒(pseudorabies virus)、仙台病毒(sendai virus)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、西尼羅河病毒(West Nile virus)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus)、冠狀病毒(corona virus)、馬關節炎病毒(equine arthritis virus)、嚴重急性呼吸道症候群病毒、莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)或痘瘡病毒(vaccinia virus)。
  14. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法在步驟(c)之後進一步包含一或多個步驟，包含從混合物中移除該三(正丁基)磷酸酯；從混合物中移除該聚氧乙烯辛基苯基醚及聚山梨醇酯80脫水山梨糖醇單油酸酯；及/或從混合物中移除無活力病毒。
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