KR101921036B1 - 개선된 용매-세제법을 이용한 바이러스 불활성화 - Google Patents

개선된 용매-세제법을 이용한 바이러스 불활성화 Download PDF

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Abstract

본 명세서는 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법 및 이러한 방법으로부터 수득한 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 단백질을 개시한다.

Description

개선된 용매-세제법을 이용한 바이러스 불활성화{VIRAL INACTIVATION USING IMPROVED SOLVENT-DETERGENT METHOD}
본 특허출원은 35 U.S.C. §119(e)에 의하여 2010년 12월 15일에 출원된 미국 가출원 제61/423,512호를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 삽입된다.
본 명세서는 단백질의 제조 중에 바이러스 오염물을 불활성화하는 방법에 관한 것이다.
치료용 단백질을 포함하는 제약 조성물의 사용은 개인 건강에 영향을 미치는 다수의 질환, 장애 또는 상태를 치료하는 방법으로서 그 중요성이 계속 증가하고 있다. 제약 조성물에 사용되는 다수의 단백질은 전형적으로 포유동물 세포주를 이용한 재조합 생산을 통해서 또는 생물학적 유체로부터의 정제에 의해 수득하고 있다. 그러나, 이러한 방법으로 제조한 치료용 단백질은 개인의 건강에 유해한 전염성의 병원성 바이러스로 오염될 수가 있다. 따라서, 임의의 오염성 바이러스 활성을 제거하도록 치료용 단백질을 처리하는 것이 중요하며, 그에 따라 생성되는 제약 조성물이 개인에 투여하기에 안전한 것을 보장한다.
현재 전염성의 병원성 바이러스를 불활성화하는 다수의 상이한 방법이 존재하는데, 예를 들어, 열-불활성화, 용매/세제(S/D) 불활성화, pH 불활성화, 화학적 불활성화, 및/또는 자외선 조사 불활성화가 여기에 포함된다. 이들 중에서 S/D 불활성화가 아마도 가장 널리 용인되고 있는 살바이러스 방법인데, 그 이유는 중요한 인간 병원체의 거의 전부가 용매와 세제에 의한 막 파괴를 받기 쉬운 엔벨로프형 바이러스이기 때문이다. 덧붙이면, S/D 방법은 다른 살바이러스 방법과 비교하면 처리되는 유체의 내용물 및 생물학적 활성을 좀더 양호하게 보존한다. 예를 들어, 열, 산성 pH, 화학물질 및 조사를 이용한 불활성화 방법은 이들 제제가 거칠고 및/또는 침습성이며, 정제되는 치료용 단백질을 변성시키거나 또는 그렇지 않으면 불활성화시키는 경향이 있기 때문에 문제의 소지가 있다.
S/D 불활성화 방법에서는, 유기 용매 및 세제를 정제되는 단백질을 포함하는 유체와 혼합한 다음 인큐베이션한다. 용매는 바이러스를 캡슐로 감싸는 지질막과 세제간의 응집을 촉진하는 환경을 생성하고, 세제는 이 지질막에서의 분자간 상호작용을 파괴한다. 일단 파괴되고 나면, 무손상 지질막이 이러한 활성에 필수적이기 때문에 엔벨로프형 바이러스는 더 이상 세포에 결합하여 감염시킬 수 없고 증식할 수 없다. 이러한 불활성화는 일반적으로 20℃ 이상의 온도에서 수행되는데, 좀더 높은 온도가 엔벨로프의 파괴를 조장하기 때문이다. 예를 들어, 세계보건기구(WHO) 지침에 따라 사용되는 전형적인 조건은 24℃에서 최소 6시간 동안 인큐베이션한 0.3% 트리(n-부틸) 포스페이트(TNBP)와 1% 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈(TWEEN)® 80)이거나, 또는 24℃에서 최소 4시간 동안 인큐베이션한 0.3% TNBP와 1% 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤(TRITON)® X-100)이다. 예를 들어 문헌[인간 혈장 제품의 바이러스에 대한 안전성 확보를 목적하는 바이러스 불활성화 및 제거 절차에 관한 WHO 기술 보고서, 별지 4 지침, 시리즈 No. 924, p 151-224, (2004)]을 참조한다.
용매/세제 혼합물을 20℃ 이상의 온도로 인큐베이션하면 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 20℃ 초과의 온도로 혼합물의 예열은 전체 공정시간에 약 2 내지 약 6시간을 가산하게 되므로 좀더 높은 온도에서의 불활성화는 시간을 낭비하게 된다. 둘째, 균일한 가열을 조성하는 데 필요한 교반과 공동으로, 이러한 좀더 높은 온도에서의 인큐베이션은 단백질 응집체 형성을 증진시키고 그에 따라 활성 및/또는 유용 단백질의 수율 감소가 초래된다. 20℃ 초과의 온도에의 노출은 또한 단백질의 분해 감수성을 증가시킨다. 본 명세서는, 이들 결점을 다루는, 샘플로부터 전염성의 병원성 바이러스를 불활성화하는 신규 S/D 방법을 개시한다. 본원에 개시된 방법은 2시간 미만의 인큐베이션 시간 및 20℃ 미만의 인큐베이션 온도를 사용한다. 인큐베이션 시간을 줄이면 재조합 생산 또는 생물학적 유체 정제를 통해 수득한 단백질의 가공 및/또는 제조에 필요한 전체 시간이 단축된다. 또한, 시간과 온도 둘 모두를 감소시키면 단백질의 응집 및 분해에 대한 감수성을 줄임으로써 단백질 수율의 향상을 가져온다.
따라서, 본 명세서의 측면은 a) 활성을 보유한 단백질을 포함하는 유체를 제공하는 단계; b) 유기 용매 및 계면활성제를 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계; 및 c) 혼합물을 약 120분 이하 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하고; 여기에서 단계 (b)와 (c) 둘 모두는 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되며; 인큐베이션 후의 혼합물은 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않으며; 인큐베이션 후의 단백질은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는, 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법을 개시한다. 유체는 세포 용해물, 세포 상등액, 선행 정제 단계로부터의 용출액, 또는 생물학적 유체일 수 있다. 단백질은 세포주를 이용한 재조합 생산을 통해서 또는 생물학적 유체로부터의 정제에 의해 수득할 수 있다. 유기 용매는 에테르, 알콜, 또는 디알킬포스페이트 또는 트리알킬포스페이트와 같은 알킬포스페이트일 수 있다. 계면활성제는 음이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제, 쯔비터이온성 (양쪽성) 계면활성제와 같은 이온성 계면활성제, 또는 비이온성 계면활성제일 수 있다. 방법은 단계 (c) 후에 혼합물로부터 용매, 계면활성제 및/또는 비-생존성 바이러스를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수도 있다.
본 명세서의 다른 측면은 a) 활성을 보유한 단백질을 포함하는 유체를 제공하는 단계; b) 유기 용매 및 계면활성제를 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계; 및 c) 혼합물을 약 120분 이하 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하고; 여기에서 단계 (b)와 (c) 둘 모두는 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되며; 인큐베이션 후의 혼합물은 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않으며; 인큐베이션 후의 단백질은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는 방법으로부터 수득한 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 단백질을 개시한다.
본 명세서의 또 다른 측면은 a) 활성을 보유한 인자 VIII을 포함하는 유체를 제공하는 단계; b) 유기 용매 및 계면활성제를 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계; 및 c) 혼합물을 약 120분 이하 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하고; 여기에서 단계 (b)와 (c) 둘 모두는 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되며; 인큐베이션 후의 혼합물은 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않으며; 인큐베이션 후의 인자 VIII은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는, 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법을 개시한다.
본 명세서의 또 다른 측면은 a) 활성을 보유한 인자 VIII을 포함하는 유체를 수득하는 단계; b) 유기 용매 및 계면활성제를 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계; 및 c) 혼합물을 약 120분 이하 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하고; 여기에서 단계 (b)와 (c) 둘 모두는 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되며; 인큐베이션 후의 혼합물은 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않으며; 인큐베이션 후의 인자 VIII은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는 방법으로부터 수득한 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 인자 VIII를 개시한다.
본 명세서의 측면은 부분적으로는 지질 코트 함유 바이러스를 개시한다. 비리온으로 알려져 있는 완전한 바이러스 입자는 캡시드라고 불리는 단백질의 보호 코트로 둘러싸인 핵산인 DNA 또는 RNA로 이루어져 있다. 바이러스는 비-엔벨로프형 및 엔벨로프형 바이러스로 분류될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "지질 코트 함유 바이러스"란 지질을 포함하는 막 또는 엔벨로프를 포함하는 임의의 바이러스, 예컨대, 예를 들어 엔벨로프 바이러스를 말한다. 엔벨로프형 바이러스는 지질단백질막, 즉 엔벨로프로 둘러싸인 자체의 캡시드를 구비하고 있다. 이러한 엔벨로프는 바이러스가 숙주 세포의 표면으로부터 "출아(bud)"함에 따라 숙주 세포로부터 유래하며, 바이러스 게놈에 의해 인코딩되지 않은 지질로 대부분 이루어져 있다. 비록 엔벨로프는 표적 세포에의 부착과 침입을 위한 분자 결정기를 운반하며 엔벨로프형 바이러스의 감염성에 필수적이기는 하지만, 내약품성 또는 항원성 변화(antigenic shift)를 받지 않는다. 엔벨로프형 바이러스는 크기가 약 45-55 nm 내지 약 120-200 nm 범위에 있다. 포유동물 세포을 감염시킬 수 있는 지질 코트 함유 바이러스에는 헤르페스바이러스과(herpesviridae) 바이러스, 폭스바이러스과(poxviridae) 바이러스, 또는 헤파드나바이러스과(hepadnaviridae) 바이러스와 같은 DNA 바이러스; 플라비바이러스과(flaviviridae) 바이러스, 토가바이러스과(togaviridae) 바이러스, 코로나바이러스과(coronaviridae) 바이러스, 델타바이러스(deltavirus) 바이러스, 오르토믹소바이러스과(orthomyxoviridae) 바이러스, 파라믹소바이러스과(paramyxoviridae) 바이러스, 랩도바이러스과(rhabdoviridae) 바이러스, 부니아바이러스과(bunyaviridae) 바이러스, 또는 필로바이러스과(filoviridae) 바이러스와 같은 RNA 바이러스; 및 레트로바이러스과(retroviridae) 바이러스 또는 헤파드나바이러스과(hepadnaviridae) 바이러스와 같은 역전사 바이러스가 포함된다. 지질 코트 함유 바이러스의 비-제한적인 예로는 인간 면역결핍 바이러스, 신드비스 바이러스, 단순 포진 바이러스, 가성광견병 바이러스, 센다이 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 코로나 바이러스, 말 관절염 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 또는 우두 바이러스가 포함된다.
비-엔벨로프형 바이러스는 그 자신의 캡시드에 지질단백질막, 즉 엔벨로프가 결여되어 있는 바이러스를 말한다. 비-엔벨로프형 바이러스의 경우에는, 캡시드가 숙주 세포에로의 부착과 침투를 매개한다. 캡시드는 일반적으로 나선형 또는 20면체중 하나이다. 비-엔벨로프형 바이러스는 약 18-26 nm 내지 약 70-90 nm 크기의 범위에 있다. 포유동물 세포를 감염시킬 수 있는 비-엔벨로프형 바이러스에는 예를 들어, 파르보바이러스과(parvoviridae) 바이러스, 아데노바이러스과(adenoviridae) 바이러스, 비르나바이러스과(birnaviridae) 바이러스, 파필로마바이러스과(papillomaviridae) 바이러스, 폴리오마바이러스과(polyomaviridae) 바이러스, 피코르나바이러스과(picornaviridae) 바이러스, 레오바이러스과(reoviridae) 바이러스, 및 캘시바이러스과(calciviridae) 바이러스가 포함된다.
본 명세서의 측면은 부분적으로는 활성을 보유한 단백질을 포함하는 유체를 개시한다. 유체는 바이러스에 의해 오염될 가능성이 있는 임의 유체일 수 있다. 유체의 비-제한적인 예로는 예를 들어 선행 정제 단계로부터의 용출액을 비롯한 예를 들어 임의의 정제 액체, 부분 정제 액체 또는 조(粗) 액체 또는 콜로이드; 세포 용해물, 세포 상등액, 태반 추출물, 또는 복수액과 같은 조직 및 세포 배양 추출물; 혈액, 혈장, 혈청, 모유, 타액, 정액과 같은 생물학적 유체; 또는 활성을 보유한 단백질을 포함하는 임의의 기타 유체가 포함된다.
활성을 보유한 단백질은 임의의 오염성 바이러스 활성의 제거가 요망되는 관심의 대상이 되는 임의 단백질일 수 있다. 본원에 개시된 단백질은 혈액 단백질, 예컨대, 혈액응고 단백질, 알부민, 및/또는 면역글로불린일 수 있다. 혈액 단백질의 비-제한적인 예로는 ADAMTS-13, α1-항플라즈민, α2-항플라즈민, 항트롬빈, 항트롬빈 III, 암 응고촉진제, 에리트로포이에틴, 인자 II, 인자 V, 인자 VI, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 피브로넥틴, 피브리노겐, 헤파린 보조인자 II, 고분자량 키니노겐, 근육내 면역글로불린, 정맥내 면역글로불린, 플라즈미노겐, 플라즈미노겐 활성화인자 억제제-1, 플라즈미노겐 활성화인자 억제제-2, 프리칼리크레인, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 억제제, 조직 인자, 조직 플라즈미노겐 활성화인자, 우로키나제, 또는 폰 빌레브란트 인자가 포함된다.
본원에 개시된 단백질은 그 단백질을 선천적으로 발현하는 유기체로부터, 그 단백질을 발현하도록 유전공학 처리된 트랜스제닉 유기체로부터, 또는 그 단백질을 재조합적으로 생산하는 세포주로부터 수득할 수 있다. 유기체의 비-제한적인 예로는 조류 및 포유동물, 예컨대, 마우스, 래트, 염소, 양, 말, 당나귀, 소, 영장류 및 인간을 포함한다. 트랜스제닉 유기체의 비-제한적인 예로는 관심의 대상이 되는 단백질을 발현하도록 유전공학 처리한 본원에 개시된 유기체를 포함한다. 유기체 또는 트랜스제닉 유기체로부터 유래한 본원에 개시된 단백질은 당업계에 공지된 일상적인 방법을 이용하여 생물학적 유체, 조직 또는 장기 추출물, 또는 유기체로부터의 타 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 혈액 단백질을 수득하기 위해서는, 유기체 또는 트랜스제닉 유기체로부터의 전혈을 혈청 분리기 튜브에 채혈할 수 있다. 혈액을 응고시킨 다음, 응고된 혈액을 원심분리하여 잔해물을 펠렛화시킨다. 생성되는 혈청 샘플(즉, 상등액)은 이어서 분취되고/되거나 필요시까지 -20℃에서 보관될 수 있다. 채혈 및 혈청 조제를 위한 구체적인 프로토콜의 비-제한적인 예는 예를 들어 문헌[Di Lorenzo and Strasinger, Blood Collection in Healthcare (F.A. Davis Company, 2001); 및 Diana Garza & Kathleen Becan-McBride, Phlebotomy Handbook: Blood Collection Essentials (Prentice Hall, 6th ed., 2002)]에 기재되어 있다.
이와 달리, 다양한 원핵생물 및/또는 진핵생물 발현 시스템이 또한 본원에 개시된 단백질을 재조합적으로 발현시키는 데에 이용될 수 있다. 발현 시스템은 제한 없이 유도 발현, 비-유도 발현, 구성적 발현, 조직-특이적 발현, 세포-특이적 발현, 바이러스-매개 발현, 안정-통합형 발현 및 일시적 발현을 비롯한 임의의 각종 특징을 포함할 수 있다. 이러한 발현 시스템의 제조 및 사용법에 대해서는 당업계에 공지되어 있다.
일반적으로, 관심의 대상이 되는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터로 클로닝시킨다. 원핵생물 발현 벡터는 전형적으로 복제의 기원, 적합한 프로모터 및/또는 인핸서 요소와, 또한 리보솜 결합, 폴리아데닐화, 전사 종결에 필요한 부위, 및 5' 플랭킹 비-전사 서열과 기타 비-전사 유전 요소를 포함한다. 예시적인 원핵생물 벡터는 예를 들어 박테리오파지 T7 프로모터와 같은 프로모터를 사용하는 pET 및 pRSET을 포함한다. 진핵생물 발현 벡터는 전형적으로 복제의 기원, 적합한 프로모터 및/또는 인핸서 요소와, 또한 리보솜 결합, 폴리아데닐화, 스플라이싱, 전사 종결에 필요한 부위, 및 5' 플랭킹 비-전사 서열과 기타 비-전사 유전 요소를 포함한다. 예시적인 효모 벡터는 예를 들어 AOX1, AUG1, GAP 및 GAL1와 같은 프로모터를 사용하는 pAO, pMET, pPIC, pPICZ 및 pYES를 포함한다. 예시적인 곤충 벡터는 예를 들어 PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 및 polh와 같은 프로모터를 사용하는 pAc5, pBAC, pIB, pMIB, pMT를 포함한다. 예시적인 포유동물 벡터는 예를 들어 베타-카세인, 베타-락토글로불린, 유장산(whey acid) 프로모터, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 시미언 바이러스 40(SV40), 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-1와 같은 프로모터를 사용하는 pBPV, pCMV, pCMVTNT, pDNA, pDisplay, pMSG, pOG44, pQBI25, pRc/RSV, pSECTag, pSECTag2, pSG, pSV2cat, pSVK3, pSVL, pUCIG-MET, pVAX1, pWLneo, 및 pXT1을 포함한다. 선별 마커로는 암피실린, 클로람페니콜 트랜스페라제, 카나마이신, 네오마이신, 및 테트라사이클린이 포함된다. 적합한 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있으며 시판되고 있다.
적합성(compatible) 벡터를 발현할 수 있는 세포로는 원핵생물 세포, 진핵생물 세포와, 원핵생물 및 진핵생물 세포에서 유래하는 세포주가 포함된다. 원핵생물 균주의 비-제한적인 예로는 예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 박테로이즈 프라질리스(Bacteroides fragilis), 클로스트리디아 퍼프린겐스(Clostridia perfringens), 클로스트리디아 디피클(Clostridia difficle), 콜로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 메틸로박테리움 엑스토르켄스(Methylobacterium extorquens), 나이세리아 메닌지룰스(Neisseria meningirulls), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)으로부터 유래하는 것들이 포함된다. 효모 균주의 비-제한적인 예로는 예를 들어 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피키아 앙구스타(Pichia angusta), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 유래하는 것들이 포함된다. 식물 세포 및 식물로부터 유래하는 세포주로는 예를 들어, 예를 들어 지아 메이스(Zea mays)와 같은 단자엽 식물종 및 예를 들어 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 트리티쿰 에스티붐(Triticum aestivum), 렘나 기바(Lemna gibba) 및 렘나 마이너(Lemna minor)와 같은 쌍자엽 식물종으로부터의 세포가 포함된다. 곤충 세포 및 곤충으로부터 유래하는 세포주로는 예를 들어 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda), 트리코플루시아 나이(Trichoplusia ni), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 및 맨두카 섹타(Manduca sexta)로부터의 세포가 포함된다. 곤충 세포주의 비-제한적인 예로는 하이-파이브(High-Five), KC, 쉬나이더(Schneider) 드로소필라 라인 2(S2), SF9, 및 SF21 세포주가 포함된다. 포유동물 세포 및 포유동물 세포로부터 유래하는 세포주로는 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 소, 말, 영장류 및 인간으로부터의 세포가 포함된다. 포유동물 세포주의 비-제한적인 예로는 1A3, 3T3, 6E6, 10T1/2, APRT, BALB/3T3, BE (2)-C, BHK, BT, C6, C127, CHO, CHP3, COS-1, COS-7, CPAE, ESK-4, FB2, GH1, GH3, HeLa, HEK-293, HepG2, HL-60, IMR-32, L2, LLC-PK1, L-M, MCF-7, NB4, NBL-6, NCTC, Neuro 2A, NIE-115, NG108-15, NIH3T3, PC12, PK15, SBAC, SH-SY5Y, SK-Hep, SK-N-DZ, SK-N-F1, SK-N-SH, ST, SW-13, 및 VV-1 세포주가 포함된다. 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection), 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐즈(European Collection of Cell Cultures) 및/또는 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐즈(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)로부터 입수할 수 있다.
유기체, 트랜스제닉 유기체 또는 세포 배양 시스템으로부터 초기 채취 후, 본원에 개시된 단백질은 단백질 정제 공정을 거칠 수 있다. 일반적으로, 단백질 정제는 좀더 농축된 형태로의 단백질의 포획, 불순물 제거를 위한 중간 정제 단계, 가외의 불순물 및 단백질 이형체 제거를 위한 폴리싱을 포함한다. 예를 들어 문헌[Current Protocols in Protein Science, "Conventional chromatographic Separations," Ch. 8-9, (John Wiley & Sons Inc., Hoboken, N.J., 1995)] 참조. 통상적인 포획 방법으로는 친화성 크로마토그래피, 겔 여과, 침전, 및/또는 크기 배제 크로마토그래피가 포함된다. 중간 또는 폴리싱 단계로서 유용한 공정으로는 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 여과, 침전, 투석여과, 친화성 크로마토그래피, 또는 크로마토포커싱이 포함된다.
본원에 개시된 방법은 이러한 정제 공정 도중에 임의 시점에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 본원에 개시된 방법이 제조공정의 후기보다는 제조공정의 초기에 수행될 경우에는 좀더 많은 시약량 및 좀더 긴 인큐베이션 시간이 필요하다. 이러한 이유는 공정 용적이 더 크고 생성물은 전형적으로 초기에 순도가 덜 하지만, 나중에 불순물이 감소되며 생성물은 용적의 감소에 따라 대부분의 경우에 좀더 명확해지고 순도와 효능이 더 커지거나, 또는 바이러스 부하가 선행 정제 절차에 의해 축소/감소하기 때문이다.
본 명세서의 측면은 부분적으로는 본원에 개시된 유체를 유기 용매 및 계면활성제와 혼합하여 혼합물을 생성하는 것을 제공한다. 유체를 유기 용매 및 계면활성제와 혼합하는 과정은 사용되는 혼합시간이 유기 용매 및 계면활성제를 유체와 충분히 혼입하는 혼합물을 생성한다는 조건부로 임의의 시간 길이 동안 수행될 수 있다. 그에 따라, 혼합은 1) 유기 용매가 계면활성제와 지질 코트 함유 바이러스를 캡슐로 감싸는 지질단백질 엔벨로프간의 접촉을 촉진하고, 2) 계면활성제가 지질 코트 함유 바이러스의 지질단백질막에서의 분자간 상호작용을 파괴하도록 보장하여야 한다. 본 실시양태의 측면에서, 유기 용매와 계면활성제의 혼합은 예를 들어 1분 이하, 5분 이하, 또는 10분 이하의 시간 동안 수행된다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 유기 용매와 계면활성제의 혼합은 예를 들어 약 1분 내지 약 5분, 약 2분 내지 약 5분, 약 3분 내지 약 5분, 약 1분 내지 약 10분, 약 2분 내지 약 10분, 약 3분 내지 약 10분, 약 4분 내지 약 10분, 또는 약 5분 내지 약 10분의 시간 동안 수행된다. 본원에서 개시하는 바와 같이, 유기 용매와 계면활성제의 혼합은 약 20℃ 이하의 온도에서 수행된다.
단일 유기 용매를 본원에 개시된 유체와 혼합할 수 있거나, 또는 복수 종의 유기 용매를 본원에 개시된 유체와 혼합할 수 있다. 본 실시양태의 측면에서, 유체를 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 또는 적어도 5종의 유기 용매와 혼합할 수 있다. 유용한 유기 용매는 계면활성제와 바이러스를 캡슐로 감싸는 지질단백질 엔벨로프간의 접촉을 촉진하는 환경을 생성한다. 그에 따라, 이러한 접촉을 촉진하는 임의의 유기 용매가 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있으며, 여기에는 제한 없이 에테르, 알콜, 디알킬포스페이트 또는 트리알킬포스페이트와 같은 알킬포스페이트, 또는 이들의 임의 조합이 포함된다.
본원에 개시된 방법에 유용한 에테르로는 화학식 R1-O-R2(여기에서, R1 및 R2는 독립적으로 산소 또는 황 원자를 함유할 수 있는 C1-C18 알킬 또는 C1-C18 알케닐, 바람직하게는 C1-C18 알킬 또는 C1-C18 알케닐이다)으로 표시되는 것들이 포함된다. 에테르의 비-제한적인 예로는 디메틸 에테르, 디에틸 에테르, 에틸 프로필 에테르, 메틸-부틸 에테르, 메틸 이소프로필 에테르 및 메틸 이소부틸 에테르가 포함된다. 본원에 개시된 방법에 유용한 알콜은 C1-C8 알킬기 또는 C1-C8 알케닐기를 갖는 것들을 포함한다. 알콜의 비-제한적인 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, n-펜탄올 및 이소펜탄올이 포함된다. 본원에 개시된 방법에 유용한 알킬포스페이트는 C1-C18 알킬기 또는 C1-C18 알케닐기를 갖는 것들을 포함하며, 이들 중 어느 하나는 산소 또는 황 원자를 함유할 수 있다. 알킬포스페이트의 비-제한적인 예로는 디-(n-부틸)포스페이트, 디-(t-부틸)포스페이트, 디-(n-헥실)포스페이트, 디-(2-에틸헥실)포스페이트, 디-(n-데실)포스페이트, 또는 에틸 디(n-부틸) 포스페이트와 같은 디알킬포스페이트; 및 트리-(n-부틸)포스페이트, 트리-(t-부틸)포스페이트, 트리-(n-헥실)포스페이트, 트리-(2-에틸헥실)포스페이트, 또는 트리-(n-데실)포스페이트와 같은 트리알킬포스페이트가 포함된다. 본원에 개시된 방법에 유용한 유기 용매의 다른 비-제한적인 예는 예를 들어 문헌[Winslow, et al., Methods and Compositions for Simultaneously Isolating Hemoglobin from Red Blood Cells and Inactivating Viruses, U.S. 2008/0138790]에서 찾아볼 수 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 삽입된다.
임의 농도의 유기 용매가 사용될 수 있되, 단 사용 농도가 계면활성제와 지질 코트 함유 바이러스의 지질단백질막간의 응집을 촉진하기에 충분하다. 본 실시양태의 측면에서, 계면활성제는 예를 들어 약 0.01%(v/v), 약 0.05%(v/v), 약 0.075%(v/v), 약 0.1%(v/v), 약 0.2%(v/v), 약 0.3%(v/v), 약 0.4%(v/v), 약 0.5%(v/v), 약 0.6%(v/v), 약 0.7%(v/v), 약 0.8%(v/v), 약 0.9%(v/v), 또는 약 1.0%(v/v)의 최종 농도로 사용된다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 계면활성제는 예를 들어 적어도 0.01%(v/v), 적어도 0.05%(v/v), 적어도 0.075%(v/v), 적어도 0.1%(v/v), 적어도 0.25%(v/v), 적어도 0.5%(v/v), 적어도 0.75%(v/v), 또는 적어도 1.0%(v/v)의 최종 농도로 사용된다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 계면활성제는 예를 들어 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v), 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.75%(v/v), 약 0.1%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v), 약 0.2%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v), 약 0.2%(v/v) 내지 약 0.75%(v/v), 약 0.2%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v), 약 0.5%(v/v) 내지 약 0.75%(v/v), 또는 약 0.5%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v)의 최종 농도로 사용된다.
계면활성제는 액체의 표면장력을 낮추어 더 용이하게 퍼지도록 해주고, 두 액체간, 또는 액체와 고체간 계면장력을 낮추어 주는 화합물이다. 단일 계면활성제를 본원에 개시된 유체와 혼합할 수 있거나, 또는 복수 종의 계면활성제를 본원에 개시된 유체와 혼합할 수 있다. 본 실시양태의 측면에서, 유체는 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 또는 적어도 5종의 계면활성제와 혼합할 수 있다. 유용한 계면활성제는 지질 코트 함유 바이러스의 지질단백질막에서의 분자간 상호작용을 파괴한다. 그에 따라, 이러한 파괴를 촉진하는 임의의 계면활성제가 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있으며, 여기에는 제한 없이 이온성 계면활성제, 쯔비터이온성 (양쪽성) 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 또는 그들의 임의 조합이 포함된다.
이온성 계면활성제는 영구적 (술페이트, 술포네이트, 포스페이트) 또는 pH-의존성 (카르복실레이트) 음이온에 기반한 음이온성 계면활성제를 포함한다. 음이온성 계면활성제는 제한 없이, 암모늄 라우릴 술페이트 및 나트륨 라우릴 술페이트(SDS)와 같은 알킬 술페이트; 나트륨 라우레트 술페이트 및 나트륨 마이레스 술페이트와 같은 알킬 에테르 술페이트; 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트와 같은 도큐세이트; 퍼플루오로옥탄술포네이트(PFOS) 및 퍼플루오로부탄술포네이트와 같은 술포네이트 플루오로계면활성제; 알킬 벤젠 술포네이트; 알킬 아릴 에테르 포스페이트; 알킬 에테르 포스페이트; 지방산 염 및 나트륨 스테아레이트와 같은 알킬 카르복실레이트; 나트륨 라우로일 사르코시네이트; 및 퍼플루오로노나노에이트 및 퍼플루오로옥타노에이트와 같은 카르복실레이트 플루오로계면활성제를 포함한다.
이온성 계면활성제는 또한 영구적 또는 pH-의존성 양이온에 기반한 양이온성 계면활성제를 포함한다. 양이온성 계면활성제는 제한 없이, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 및 세틸 트리메틸암모늄 클로라이드(CTAC)와 같은 알킬트리메틸암모늄 염; 세틸피리디늄 클로라이드(CPC); 폴리에톡실화 탤로우 아민(POEA); 벤즈알코늄 클로라이드(BAC); 벤즈에토늄 클로라이드(BZT); 5-브로모-5-니트로-1,3-디옥산; 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드; 그리고 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DODAB), 및 옥테니딘 디히드로클로라이드와 같이, 1급 아민이 pH < 10에서 양전하를 띠거나, 또는 2급 아민이 pH < 4에서 하전되는 계면활성제와 같은 pH-의존성 1급, 2급 또는 3급 아민을 포함한다.
쯔비터이온성 계면활성제는 1급, 2급 또는 3급 아민 또는 4급 암모늄 양이온과 술포네이트, 카르복실레이트 또는 포스페이트를 기반으로 한다. 쯔비터이온성 계면활성제는 제한 없이, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS); 코카미도프로필 히드록시술타인과 같은 술타인; 코카미도프로필 베타인과 같은 베타인; 또는 레시틴을 포함한다.
비이온성 계면활성제는 덜 변성적이고, 그에 따라 단백질-단백질 상호작용을 존속시키면서 막 단백질과 지질을 가용화하는 데 유용하다. 계면활성제의 비-제한적인 예로는 폴리소르베이트 20 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 20), 폴리소르베이트 40 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 40), 폴리소르베이트 60 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 60), 폴리소르베이트 61 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 61), 폴리소르베이트 65 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 65), 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80), 및 폴리소르베이트 81 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 81)와 같은 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르; 폴록사머 124(플루로닉(PLURONIC)® L44), 폴록사머 181(플루로닉® L61), 폴록사머 182(플루로닉® L62), 폴록사머 184(플루로닉® L64), 폴록사머 188(플루로닉® F68), 폴록사머 237(플루로닉® F87), 폴록사머 338(플루로닉® L108), 폴록사머 407(플루로닉® F127)와 같은 폴록사머(폴리에틸렌-폴리프로필렌 공중합체); 알킬 페놀 폴리글리콜 에테르; 폴리에틸렌 글리콜 알킬 아릴 에테르; 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, BRIJ® 30, 및 BRIJ® 35와 같은 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬 에테르; 2-도데콕시에탄올(루브롤(LUBROL)®-PX); 폴리옥시에틸렌 (4-5) p-t-옥틸 페놀(트리톤(TRITON)® X-45) 및 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100)와 같은 폴리옥시에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르; 노녹시놀-9와 같은 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬페놀 에테르; 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올 및 옥틸 페녹시폴리에톡실에탄올과 같은 페녹시폴리에톡실에탄올; 옥틸 글루코피라노시드와 같은 글루코시드 알킬 에테르; 도데실 말토피라노시드와 같은 말토시드 알킬 에테르; 헵틸 티오글루코피라노시드와 같은 티오글루코시드 알킬 에테르; 디지토닌; 글리세릴 라우레이트와 같은 글리세롤 알킬 에스테르; 알킬 아릴 폴리에테르 술페이트; 알콜 술포네이트; 소르비탄 알킬 에스테르; 코카미드 모노에탄올아민 및 코카미드 디에탄올아민과 같은 코카미드 에탄올아민; 수크로스 모노라우레이트; 도데실 디메틸아민 옥시드, 및 나트륨 콜레이트가 포함된다. 본원에 개시된 방법에 유용한 계면활성제의 다른 비-제한적인 예는 예를 들어 문헌[Winslow, et al., Methods and Compositions for Simultaneously Isolating Hemoglobin from Red Blood Cells and Inactivating Viruses, U.S. 2008/0138790; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. 1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000); Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10th ed. 2001); 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4th edition 2003)]에서 찾아볼 수 있으며, 상기 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참고로 삽입된다.
임의 농도의 계면활성제가 사용될 수 있되, 단 사용 농도가 지질 코트 함유 바이러스의 지질단백질막에서의 분자간 상호작용을 파괴하기에 충분하여 바이러스의 불활성화를 초래한다. 본 실시양태의 측면에서, 계면활성제는 예를 들어 약 0.01%(v/v), 약 0.05%(v/v), 약 0.075%(v/v), 약 0.1%(v/v), 약 0.2%(v/v), 약 0.3%(v/v), 약 0.4%(v/v), 약 0.5%(v/v), 약 0.6%(v/v), 약 0.7%(v/v), 약 0.8%(v/v), 약 0.9%(v/v), 약 1.0%(v/v), 약 2.0%(v/v), 약 3.0%(v/v), 약 4.0%(v/v), 약 5.0%(v/v), 약 6.0%(v/v), 약 7.0%(v/v), 약 8.0%(v/v), 약 9.0%(v/v), 또는 약 10.0%(v/v)의 농도로 사용된다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 계면활성제는 예를 들어 적어도 0.01%(v/v), 적어도 0.05%(v/v), 적어도 0.075%(v/v), 적어도 0.1%(v/v), 적어도 0.25%(v/v), 적어도 0.5%(v/v), 적어도 0.75%(v/v), 적어도 1.0%(v/v), 적어도 2.5%(v/v), 적어도 5.0%(v/v), 적어도 7.5%(v/v), 또는 적어도 10.0%(v/v)의 농도로 사용된다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 계면활성제는 예를 들어 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v), 약 0.1%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v), 약 0.2%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v), 약 0.2%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v), 약 0.2%(v/v) 내지 약 2.0%(v/v), 약 0.5%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v), 약 0.5%(v/v) 내지 약 5.0%(v/v), 또는 약 1.0%(v/v) 내지 약 10.0%(v/v)의 농도로 사용된다.
본원에 개시된 유체는 단일 유기 용매 및 복수 종의 계면활성제와, 복수 종의 유기 용매 및 단일 계면활성제와, 또는 복수 종의 유기 용매 및 복수 종의 계면활성제와 혼합할 수 있다. 전형적으로, 유체중 유기 용매와 단일 계면활성제의 최종 농도는 유기 용매 약 0.1%(v/v) 내지 약 5%(v/v) 및 계면활성제 약 0.1%(v/v) 내지 약 10%(v/v)이다. 복수 종의 계면활성제가 유체와 혼합되는 경우, 유기 용매의 최종 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 약 5%(v/v)이고, 1종 계면활성제의 최종 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 약 10%(v/v), 약 0.5%(v/v) 내지 약 5%(v/v), 또는 약 0.5%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v)이며, 계면활성제의 나머지의 최종 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 약 5%(v/v), 약 0.1%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v), 또는 약 0.2%(v/v) 내지 약 4%(v/v)이다.
본 실시양태의 일 측면에서, 유체는 최종 농도가 예를 들어 약 0.1%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v) 트리(n-부틸) 포스페이트 및 약 1.0%(v/v) 내지 약 10.0%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100)가 되도록 트리(n-부틸) 포스페이트 및 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100)와 혼합된다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 유체는 최종 농도가 예를 들어 약 0.1%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v) 트리(n-부틸) 포스페이트 및 약 1.0%(v/v) 내지 약 10.0%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)가 되도록 트리(n-부틸) 포스페이트 및 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)와 혼합된다.
본 실시양태의 또 다른 측면에서, 유체는 최종 농도가 예를 들어 약 0.1%(v/v) 내지 약 5.0%(v/v) 트리(n-부틸) 포스페이트, 약 0.5%(v/v) 내지 약 10.0%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 약 0.1%(v/v) 내지 약 5.0%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)가 되도록 트리(n-부틸) 포스페이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)와 혼합된다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 유체는 최종 농도가 예를 들어 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.7%(v/v) 트리(n-부틸) 포스페이트, 약 0.6%(v/v) 내지 약 1.4%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.7%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)가 되도록 트리(n-부틸) 포스페이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)와 혼합된다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 유체는 최종 농도가 예를 들어 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v) 트리(n-부틸) 포스페이트, 약 0.7%(v/v) 내지 약 1.3%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)가 되도록 트리(n-부틸) 포스페이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)와 혼합된다.
본 실시양태의 또 다른 측면에서, 유체는 최종 농도가 예를 들어, 약 0.2%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v) 트리(n-부틸) 포스페이트, 약 0.7%(v/v) 내지 약 1.3%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 약 0.2%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)가 되도록 트리(n-부틸) 포스페이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)와 혼합된다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 유체는 최종 농도가 예를 들어 약 0.2%(v/v) 내지 약 0.4%(v/v) 트리(n-부틸) 포스페이트, 약 0.8%(v/v) 내지 약 1.2%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 약 0.2%(v/v) 내지 약 0.4%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)가 되도록 트리(n-부틸) 포스페이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)와 혼합된다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 유체는 최종 농도가 예를 들어 약 0.3%(v/v) 트리(n-부틸) 포스페이트, 약 1.0%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 약 0.3%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)가 되도록 트리(n-부틸) 포스페이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)와 혼합된다.
유체를 유기 용매 및 계면활성제와 혼합 후, 생성되는 혼합물을 규정 시간 동안 규정 온도에서 인큐베이션한다. 사용 시간이 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 인큐베이션 후의 혼합물을 도출한다는 조건부로 임의의 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 본 실시양태의 측면에서, 유체는 예를 들어 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 60분, 약 70분, 약 80분, 약 90분, 약 100분, 약 110분, 또는 약 120분의 시간 동안 인큐베이션된다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 유체는 예를 들어 약 10분 이하, 약 20분 이하, 약 30분 이하, 약 40분 이하, 약 50분 이하, 약 60분 이하, 약 70분 이하, 약 80분 이하, 약 90분 이하, 약 100분 이하, 약 110분 이하, 또는 약 120분 이하의 시간 동안 인큐베이션된다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 유체는 예를 들어 약 10분 내지 약 60분, 약 10분 내지 약 90분, 약 10분 내지 약 120분, 약 30분 내지 약 60분, 약 30분 내지 약 90분, 약 30분 내지 약 120분, 약 60분 내지 약 90분, 약 60분 내지 약 120분, 또는 약 90분 내지 약 120분의 시간 동안 인큐베이션된다.
본 명세서의 측면은 부분적으로는, 유체는 유기 용매 및 계면활성제와 약 20℃ 이하의 온도에서 혼합되고, 혼합물은 약 20℃ 이하의 온도에서 인큐베이션되는 혼합물을 제공한다. 사용 온도가 약 20℃ 이하의 온도이고 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 인큐베이션 후의 혼합물을 도출하며, 활성을 보유한 단백질은 인큐베이션 후에 회수된다는 조건부로 임의의 인큐베이션 온도가 사용될 수 있다. 비록 전형적으로는 동일한 온도에서 인큐베이션되지만, 유체는 유기 용매 및 계면활성제와 한 온도에서 혼합될 수 있고, 혼합물은 상이한 온도에서 인큐베이션된다.
본 실시양태의 측면에서, 예를 들어 약 2℃, 약 4℃, 약 6℃, 약 8℃, 약 10℃, 약 12℃, 약 14℃, 약 16℃, 약 18℃, 또는 약 20℃의 온도에서 유체를 혼합하고 혼합물을 인큐베이션한다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 예를 들어 2℃ 이하, 4℃ 이하, 6℃ 이하, 8℃ 이하, 10℃ 이하, 12℃ 이하, 14℃ 이하, 16℃ 이하, 18℃ 이하, 또는 20℃ 이하의 온도에서 유체를 혼합하고 인큐베이션한다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 예를 들어 약 0℃ 내지 약 2℃, 약 0℃ 내지 약 4℃, 약 0℃ 내지 약 6℃, 약 0℃ 내지 약 8℃, 약 0℃ 내지 약 10℃, 약 0℃ 내지 약 12℃, 약 0℃ 내지 약 14℃, 약 0℃ 내지 약 16℃, 약 0℃ 내지 약 18℃, 약 0℃ 내지 약 20℃, 약 2℃ 내지 약 4℃, 약 2℃ 내지 약 6℃, 약 2℃ 내지 약 8℃, 약 2℃ 내지 약 10℃, 약 2℃ 내지 약 12℃, 약 2℃ 내지 약 14℃, 약 2℃ 내지 약 16℃, 약 2℃ 내지 약 18℃, 약 2℃ 내지 약 20℃, 약 4℃ 내지 약 6℃, 약 4℃ 내지 약 8℃, 약 4℃ 내지 약 10℃, 약 4℃ 내지 약 12℃, 약 4℃ 내지 약 14℃, 약 4℃ 내지 약 16℃, 약 4℃ 내지 약 18℃, 또는 약 4℃ 내지 약 20℃의 온도에서 유체를 혼합하고 혼합물을 인큐베이션한다.
일 실시양태에서, 사용되는 인큐베이션 시간 및 온도가 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않고 활성을 보유한 단백질을 포함하는 인큐베이션 후의 혼합물을 도출한다는 조건부로, 본원에 개시된 혼합물은 임의의 시간 길이 동안 및 약 20℃보다 높지 않은 임의의 온도에서 인큐베이션될 수 있다. 본 실시양태의 측면에서, 혼합물은 120분 이하 동안 약 20℃ 이하의 온도에서, 예컨대, 예를 들어, 90분 이하 동안 약 20℃ 이하의 온도에서, 60분 이하 동안 약 20℃ 이하의 온도에서, 또는 30분 이하 동안 약 20℃ 이하의 온도에서 인큐베이션된다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 혼합물은 120분 이하 동안 약 16℃ 이하의 온도에서, 120분 이하 동안 약 12℃ 이하의 온도에서, 또는 120분 이하 동안 약 8℃ 이하의 온도에서 인큐베이션된다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 혼합물은 약 10분 내지 약 120분 동안 약 0℃ 내지 약 20℃의 온도에서, 약 30분 내지 약 120분 동안 약 0℃ 내지 약 16℃의 온도에서, 약 30분 내지 약 120분 동안 약 0℃ 내지 약 12℃의 온도에서, 또는 약 30분 내지 약 120분 동안 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 인큐베이션된다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 혼합물은 약 45분 내지 약 75분 동안 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서, 약 60분 동안 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서, 약 45분 내지 약 75분 동안 약 4℃의 온도에서, 또는 약 60분 동안 약 4℃의 온도에서 인큐베이션된다.
본 명세서의 측면은 부분적으로는 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 인큐베이션 후의 혼합물을 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는"이란 단지 미량의 생존성 지질 코트 함유 바이러스만이 생존성 지질 코트 함유 바이러스의 존재 또는 활성을 검출 또는 확인하는 데 사용되는 기기 또는 공정에 의해 검출되거나 확인될 수 있으며, 이러한 미량의 생존성 지질 코트 함유 바이러스는 인간의 건강에 유해하기에는 불충분하다는 것을 의미한다. 본 실시양태의 일 측면에서, 인큐베이션 후의 혼합물은 지질 코트 함유 바이러스를 완전히 함유하지 않는다. 본원에서 사용된 용어 "지질 코트 함유 바이러스를 완전히 함유하지 않는"이란 생존성 지질 코트 함유 바이러스의 존재가 생존성 지질 코트 함유 바이러스의 존재 또는 활성을 검출 또는 확인하는 데 사용되는 기기 또는 공정의 검출 범위내에서 검출되거나 확인될 수 없다는 것을 의미한다. 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않거나 또는 전혀 함유하지 않는 유체내에 함유된 단백질은 그 바이러스가 인간의 건강에 유해하기에는 불충분하기 때문에 인간에 투여하기에 안전한 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
본 실시양태의 또 다른 측면에서, 인큐베이션 후의 혼합물은 1 x 101 PFU/mL 미만의 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 포함한다. 플라크-형성 단위(PFU)는 단위 용적당 플라크를 형성할 수 있는 바이러스 입자수의 척도이다. 불활성이거나, 결함이 있거나, 또는 그들의 표적 세포에 감염하지 못하는 바이러스 입자는 플라크를 생성하지 못할 것이고 따라서 계수되지 않을 것이기 때문에, PFU는 입자의 절대량 측정이라기보다는 기능적 측정이다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 인큐베이션 후의 혼합물은 예를 들어 1 x 100 PFU/mL 미만의 생존성 지질 코트 함유 바이러스, 1 x 10-1 PFU/mL 미만의 생존성 지질 코트 함유 바이러스, 1 x 10-2 PFU/mL의 생존성 지질 코트 함유 바이러스, 또는 1 x 10-3 PFU/mL의 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 포함한다.
본 실시양태의 또 다른 측면에서, 인큐베이션 후의 혼합물은 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대하여 인큐베이션 전보다 적은 ID50을 포함한다. ID50은 세포의 표적 집단의 50%를 감염시키는 바이러스의 양이다. 불활성이거나 또는 결함이 있는 바이러스 입자는 그들의 표적 세포에 감염하지 않을 것이고 따라서 계수되지 않을 것이기 때문에, ID50은 기능적 측정이다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 인큐베이션 후의 혼합물은 인큐베이션 전보다, 예를 들어 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대한 적어도 10배 더 적은 ID50, 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대한 적어도 100배 더 적은 ID50, 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대한 적어도 200배 더 적은 ID50, 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대한 적어도 300배 더 적은 ID50, 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대한 적어도 400배 더 적은 ID50, 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대한 적어도 500배 더 적은 ID50, 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대한 적어도 600배 더 적은 ID50, 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대한 적어도 700배 더 적은 ID50, 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대한 적어도 800배 더 적은 ID50, 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대한 적어도 900배 더 적은 ID50, 또는 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대한 적어도 1000배 더 적은 ID50을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "바이러스를 불활성화하는" 또는 "바이러스 불활성화"란 바이러스가 더 이상 세포 감염, 복제 및 증식할 수 없는 공정, 및 그 자체로 바이러스 제거를 말한다. 그에 따라, 용어 "바이러스 불활성화"는 일반적으로 본원에 개시된 유체를 감염성 바이러스 오염물을 완전히 함유하지 않도록 만드는 공정을 말한다. 본원에 개시된 방법을 이용하는 어떠한 정도의 바이러스 불활성화도 바람직하다. 그러나, 제약상의 엄격한 안전 지침을 충족하는 데 필요한 정도의 바이러스 불활성화를 달성하는 것이 바람직하다. 이들 지침은 WHO에서 마련하며 당업자에게 주지이다.
생존성 지질 코트 함유 바이러스의 검출은 생존성 지질 코트 함유 바이러스의 존재 또는 활성을 정성적으로 또는 정량적으로 측정할 수 있는 임의 기술로 달성될 수 있다. 전형적으로, 세포 배양-기반 검정을 이용하여 바이러스의 역가 수준을 측정하지만, 생체내 감염성 검정 역시도 채용될 수 있다. 바이러스 증폭의 검출은 예를 들어 현미경 검사(명백하게 가시적인 세포변성효과의 경우), PCR-기반 검출 검정, 또는 항체-기반 검출 검정에 의해 행해질 수 있다. 하나의 비-제한적인 예는 조직 배양 감염량 50(TCID50) 검정이라 불리는 시험관내 감염성 검정이다. 이러한 검정에서는, 유체 샘플 및 그의 연속 희석액을 검정되는 지질 코트 함유 바이러스에 대한 숙주로서 작용할 수 있는 세포로 시딩한(seeded) 96-웰 플레이트에 분배한다. 접종 후, 플레이트를 바이러스가 숙주 세포에서 복제하도록 허용하기에 충분한 시간 및 온도에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 세포를 감염의 징후, 예컨대, 예를 들어 용해 세포, 세포변성효과를 보이는 세포, 또는 바이러스 감염을 나타내는 여타의 기준에 대하여 현미경으로 검사한다. 양성 (바이러스 감염) 및 음성 (바이러스 비-감염) 웰의 패턴으로부터 바이러스 역가를 계산해낸다. 감염의 양성 징후를 나타내는 어떠한 웰도 부재하면 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 유체를 나타내는 것이다.
또 다른 세포 배양-기반 검정으로는 플라크 검정이 있으며, 여기에서는 세포 배양층에서의 바이러스-유발 효과는 플라크로서 가시성이거나 또는 거시적으로 가시성이 되도록 만든다. 어떠한 플라크도 부재하면 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 유체를 나타내는 것이다.
본 명세서는 부분적으로는 본원에 개시된 유기 용매 및 계면활성제와의 인큐베이션 전에 제공된 단백질 활성의 적어도 25%의 단백질 활성을 갖는 인큐베이션 후의 혼합물을 제공한다. 본 실시양태의 측면에서, 예를 들어 인큐베이션 전에 제공된 단백질 활성의 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%의 단백질 활성을 갖는 인큐베이션 후의 혼합물이 제공된다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 예를 들어 인큐베이션 전에 제공된 단백질 활성의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 단백질 활성을 갖는 인큐베이션 후의 혼합물이 제공된다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 예를 들어 인큐베이션 전에 제공된 단백질 활성의 약 25% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 85% 내지 약 90%의 단백질 활성을 갖는 인큐베이션 후의 혼합물이 제공된다.
본 명세서는 부분적으로는 인큐베이션 후의 혼합물에 존재하는 단백질 활성이 예를 들어 본원에 개시된 유기 용매 및 계면활성제와의 인큐베이션 전에 제공된 단백질 활성의 적어도 25%인 인큐베이션 후의 혼합물을 제공한다. 본 실시양태의 측면에서, 인큐베이션 후의 혼합물에 존재하는 단백질 활성은 예를 들어 인큐베이션 전에 제공된 단백질 활성의 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%이다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 인큐베이션 후의 혼합물에 존재하는 단백질 활성은 예를 들어 인큐베이션 전에 제공된 단백질 활성의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%이다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 인큐베이션 후의 혼합물에 존재하는 단백질 활성은 예를 들어 인큐베이션 전에 제공된 단백질 활성의 약 25% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 85% 내지 약 90%이다.
단백질 활성의 검출은 제한 없이 비-특이적 단백질 검정, 예컨대, 예를 들어 UV 흡수 또는 브래드포드(Bradford) 검정과 같은 화학물질-기반 검정; 또는 특이적 단백질 검정, 예컨대, 예를 들어 시험관내 검정, 세포-기반 검정, 또는 생체내 검정을 비롯하여, 모니터링되는 단백질과 관련된 활성을 나타내는 특징을 정성적으로 또는 정량적으로 측정할 수 있는 임의의 검정에 의해 달성될 수 있다. 본원에 개시된 단백질의 활성 검출에 사용되는 실제 검정은 제한 없이, 검정되는 단백질, 인큐베이션 후의 혼합물에 존재하는 단백질의 양, 검정되는 특징, 및 당업자의 선호도를 비롯한 인자를 고려하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
예를 들어, 혈액 응고 캐스케이드에 기반한 발색 검정을 이용하여 인자 VIII 활성을 검출할 수 있다. 이 검정에서, 트롬빈-활성화된 인자 VIII은 인자 IXa와의 복합체를 형성하고, 이 복합체는 이어서 인자 X를 활성화시킨다. 활성화된 인자 X 활성은 p-니트로-아닐린(pNA)과 같은 발색 그룹을 유리시키는 발색 기질의 가수분해에 의해 접근될 수 있다. pNA 방출의 초기 속도는, dOD으로 표현되는 405 nm에서 측정한 분당 흡광도의 변화로 측정하는데, 샘플중의 인자 Xa 활성 및 이어서 인자 VIII 활성에 비례한다. 과량의 인자 IXa, 및 인자 X를 사용함으로써, 인자 X의 활성화 속도는 오로지 샘플에 존재하는 트롬빈-절단 인자 VIII의 양에 비례한다. 이와 달리, 인자 IXa 활성은 인자 VIII 및 인자 X가 과량으로 존재하도록 조건을 변경함으로써 결정될 수 있으며, 그에 따라 인자 IXa는 속도 제한성이다. 마찬가지로, 인자 X 활성은 인자 VIII 및 인자 IXa가 과량으로 존재하도록 조건을 변경함으로써 결정될 수 있으며, 그에 따라 인자 X는 속도 제한성이다. 따라서, 인자 VIII 활성, 및 인자 IXa와 인자 X는 혈액 응고 캐스케이드에 기반한 발색 검정을 이용하여 검출될 수 있다.
또 다른 예로서, 부분 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)을 적용하는 1단계 응고 검정을 이용하여 인자 VIII 활성을 검출해낼 수 있다. 당해 검정에서, 인자 VIII을 CaCl2와 함께 포함하는 샘플을 인자 VIII-결손 혈장에 가하여 응고를 촉진시키며, 혈장의 APTT 응고시간에 미치는 당해 샘플의 효과가 인자 VIII 활성의 척도이다. 미지 샘플의 활성은 관찰된 인자 VIII 활성을 기지의 인자 VIII 활성 샘플로부터 생성된 표준 곡선과 비교함으로써 계산해낼 수 있다. 당해 혈액 응고 검정은 또한 검정되는 단백질이 결손된 혈장을 사용함으로써 혈액 응고 캐스케이드에 관여된 여타 단백질에 대해서도 사용될 수 있다.
본 명세서는 부분적으로는, 활성을 보유한 단백질의 단백질 응집체를 본질적으로 함유하지 않는 인큐베이션 후의 혼합물을 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "단백질 응집체를 본질적으로 함유하지 않는"이란 단지 미량의 활성을 보유한 단백질(관심의 대상이 되는 단백질)의 단백질 응집체가 단백질 응집체의 존재 또는 활성을 검출 또는 확인하는 데 사용되는 기기 또는 공정에 의해 검출되거나 확인될 수 있으며, 이러한 미량의 단백질 응집체는, 예를 들어 개체에서 면역반응을 일으키는 것과 같이, 인간의 건강에 유해하기에는 불충분하다는 것을 의미한다. 본 실시양태의 일 측면에서, 인큐베이션 후의 혼합물은 활성을 보유한 단백질의 단백질 응집체를 완전히 함유하지 않는다. 본원에서 사용된 용어 "단백질 응집체를 완전히 함유하지 않는"이란 활성을 보유한 단백질(관심의 대상이 되는 단백질)의 단백질 응집체의 존재가 단백질 응집체의 존재 또는 활성을 검출 또는 확인하는 데 사용되는 기기 또는 공정의 검출 범위내에서 검출되거나 확인될 수 없다는 것을 의미한다. 활성을 보유한 단백질(관심의 대상이 되는 단백질)의 단백질 응집체를 본질적으로 함유하지 않거나 또는 전혀 함유하지 않는 유체는, 그 단백질 응집체가 인간의 건강에 유해하기에는 불충분하기 때문에, 인간에 투여하기에 안전한 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
본 실시양태의 측면에서, 인큐베이션 후의 혼합물은 응집체 형태의 활성을 보유한 단백질을 예를 들어 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 약 0.1%, 약 0.09%, 약 0.08%, 약 0.07%, 약 0.06%, 약 0.05%, 약 0.04%, 약 0.03%, 약 0.02%, 또는 약 0.01% 미만으로 갖는다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 인큐베이션 후의 혼합물은 응집체 형태의 활성을 보유한 단백질을 예를 들어 약 1% 내지 약 0.01%, 0.9% 내지 약 0.01%, 0.8% 내지 약 0.01%, 0.7% 내지 약 0.01%, 0.6% 내지 약 0.01%, 0.5% 내지 약 0.01%, 0.4% 내지 약 0.01%, 0.3% 내지 약 0.01%, 0.2% 내지 약 0.01%, 또는 0.1% 내지 약 0.01%로 갖는다.
단백질 응집체 형성의 검출은 제한 없이, 본원에 개시된 비-특이적 및/또는 특이적 단백질 검정과 병행하는 크기 배제 크로마토그래피를 비롯하여, 모니터링되는 관심의 대상이 되는 단백질과 관련된 단백질 응집체의 존재 또는 활성을 정성적으로 또는 정량적으로 측정할 수 있는 임의 검정에 의해 달성될 수 있다. 본원에 개시된 단백질 응집체 검출에 사용되는 실제 검정은 제한 없이, 검정되는 단백질, 인큐베이션 후의 혼합물에 존재하는 단백질의 양, 검정되는 특징, 및 당업자의 선호도를 비롯한 인자를 고려하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 방법에 사용된 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분을 인큐베이션 후의 혼합물로부터 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 개시된 방법 완료 후, 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분이 제거될 수 있다. 세제의 제거에 통용되는 방법으로는 추출, 여과, 투석여과, 완충제 교환, 친화성 또는 이온-교환 크로마토그래피, 침전, 또는 동결건조가 포함된다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌[Current Protocols in Protein Science, "Conventional Chromatographic Separations," Ch. 8-9, (John Wiley & Sons Inc., Hoboken, N.J.)] 참조. 제거 후, 잔류하는 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분의 양은 인간에 투여시 실질적으로 장기적인 또는 영구적인 유해 효과가 없는 양이다.
실시양태에서, 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분의 제거 후의 혼합물은 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분을 본질적으로 함유하지 않는다. 본원에서 사용된 용어 "유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분을 본질적으로 함유하지 않는"이란 단지 미량의 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분이 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분의 존재 또는 활성을 검출 또는 확인하는 데 사용되는 기기 또는 공정에 의해 검출되거나 확인될 수 있으며, 이러한 미량의 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분은 인간에 투여시 장기적인 또는 영구적인 유해 효과가 없다는 것을 의미한다. 본 실시양태의 일 측면에서, 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분의 제거 후의 혼합물은 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분을 완전히 함유하지 않는다. 본원에서 사용된 용어 "유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분을 완전히 함유하지 않는"이란 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분의 존재가 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분의 존재 또는 활성을 검출 또는 확인하는 데 사용되는 기기 또는 공정의 검출 범위내에서 검출되거나 확인될 수 없다는 것을 의미한다. 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분을 본질적으로 함유하지 않거나 또는 전혀 함유하지 않는 혼합물에 함유된 단백질은, 유기 용매, 계면활성제, 및/또는 다른 시약 또는 성분의 양이 인간의 건강에 유해하기에는 불충분하기 때문에, 인간에 투여하기에 안전한 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
본 실시양태의 측면에서, 혼합물에 잔류하는 유기 용매의 양은 예를 들어, 약 1 ppm, 약 3 ppm, 약 5 ppm, 약 10 ppm, 약 15 ppm, 약 20 ppm, 약 25 ppm, 약 30 ppm, 또는 약 35 ppm이다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 혼합물에 잔류하는 유기 용매의 양은 예를 들어, 1 ppm 이하, 3 ppm 이하, 5 ppm 이하, 10 ppm 이하, 15 ppm 이하, 20 ppm 이하, 25 ppm 이하, 30 ppm 이하, 또는 35 ppm 이하이다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 혼합물에 잔류하는 유기 용매의 양은 예를 들어, 약 1 ppm 내지 약 20 ppm, 약 1 ppm 내지 약 25 ppm, 약 1 ppm 내지 약 30 ppm, 약 1 ppm 내지 약 35 ppm, 약 3 ppm 내지 약 20 ppm, 약 3 ppm 내지 약 25 ppm, 약 3 ppm 내지 약 30 ppm, 또는 약 3 ppm 내지 약 35 ppm이다.
본 실시양태의 측면에서, 혼합물에 잔류하는 계면활성제의 양은 예를 들어 약 1 ppm, 약 3 ppm, 약 5 ppm, 약 10 ppm, 약 15 ppm, 약 20 ppm, 약 25 ppm, 약 30 ppm, 약 35 ppm, 약 40 ppm, 약 45 ppm, 약 50 ppm, 약 55 ppm, 약 60 ppm, 약 65 ppm, 약 70 ppm, 약 75 ppm, 약 80 ppm, 약 85 ppm, 약 90 ppm, 또는 약 100 ppm이다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 혼합물에 잔류하는 계면활성제의 양은 예를 들어 1 ppm 이하, 10 ppm 이하, 20 ppm 이하, 30 ppm 이하, 40 ppm 이하, 50 ppm 이하, 60 ppm 이하, 70 ppm 이하, 80 ppm 이하, 90 ppm 이하, 또는 100 ppm 이하이다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 혼합물에 잔류하는 계면활성제의 양은 예를 들어 약 1 ppm 내지 약 25 ppm, 약 1 ppm 내지 약 50 ppm, 약 1 ppm 내지 약 75 ppm, 약 1 ppm 내지 약 100 ppm, 약 5 ppm 내지 약 25 ppm, 약 5 ppm 내지 약 50 ppm, 약 5 ppm 내지 약 75 ppm, 약 5 ppm 내지 약 100 ppm, 약 10 ppm 내지 약 25 ppm, 약 10 ppm 내지 약 50 ppm, 약 10 ppm 내지 약 75 ppm, 또는 약 10 ppm 내지 약 100 ppm이다.
본 실시양태의 일 측면에서, 혼합물에 잔류하는 유기 용매의 양은 35 ppm 이하이고 혼합물에 잔류하는 계면활성제의 양은 100 ppm 이하이다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 혼합물에 잔류하는 유기 용매의 양은 3 ppm 이하이고 혼합물에 잔류하는 계면활성제의 양은 10 ppm 이하이다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 혼합물에 잔류하는 유기 용매의 양은 약 1 ppm 내지 약 35 ppm이고 혼합물에 잔류하는 계면활성제의 양은 약 1 ppm 내지 약 100 ppm이다.
본 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 인큐베이션 후의 혼합물로부터 유기 용매를 제거하는 단계를 포함하지 않는다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 인큐베이션 후의 혼합물로부터 계면활성제를 제거하는 단계를 포함하지 않는다.
본원에 개시된 방법은 인큐베이션 후의 혼합물로부터 바이러스를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "바이러스를 제거하는" 또는 "바이러스 제거"란 본원에 개시된 혼합물로부터 바이러스를 고갈시켜, 그 혼합물로부터 바이러스 입자가 효과적으로 추출되도록 하는 공정을 말한다. 바이러스는 생존성 바이러스 또는 불활성화 바이러스일 수 있다. 제거는 전형적으로 크기 배제 크로마토그래피 또는 관심의 대상이 되는 단백질이 크로마토그래피 수지에 결합하는 양성 흡착 크로마토그래피에 의해 달성된다. 제거 후, 잔류하는 바이러스의 양은 인간에 투여시 실질적으로 장기적인 또는 영구적인 유해 효과가 없는 양이다.
일 실시양태에서, 바이러스 제거 후의 혼합물은 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는다. 본원에서 사용된 용어 "바이러스를 본질적으로 함유하지 않는"이란 단지 미량의 바이러스가 바이러스의 존재 또는 활성을 검출 또는 확인하는 데 사용되는 기기 또는 공정에 의해 검출되거나 확인될 수 있고, 이러한 미량의 바이러스는 인간의 건강에 유해하기에는 불충분하다는 것을 의미한다. 본 실시양태의 일 측면에서, 바이러스 제거 후의 혼합물은 바이러스를 완전히 함유하지 않는다. 본원에서 사용된 용어 "바이러스를 완전히 함유하지 않는"이란 바이러스의 존재가 바이러스의 존재 또는 활성을 검출 또는 확인하는 데 사용되는 기기 또는 공정의 검출 범위내에서 검출되거나 확인될 수 없다는 것을 의미한다. 바이러스를 본질적으로 함유하지 않거나 또는 전혀 함유하지 않는 혼합물에 함유된 단백질은, 그 바이러스가 인간의 건강에 유해하기에는 불충분하기 때문에, 인간에 투여하기에 안전한 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
본 실시양태의 다른 측면에서, 바이러스 제거 후의 혼합물은 1 x 101 PFU/mL 미만의 바이러스, 예컨대, 예를 들어 1 x 100 PFU/mL 미만의 바이러스, 1 x 10-1 PFU/mL 미만의 바이러스, 1 x 10-2 PFU/mL의 바이러스, 또는 1 x 10-3 PFU/mL의 바이러스를 포함한다.
본 실시양태의 또 다른 측면에서, 바이러스 제거 후의 혼합물은 바이러스에 대한 더 적은 ID50, 예컨대, 예를 들어 바이러스에 대한 적어도 10배 더 적은 ID50, 바이러스에 대한 적어도 100배 더 적은 ID50, 바이러스에 대한 적어도 200배 더 적은 ID50, 바이러스에 대한 적어도 300배 더 적은 ID50, 바이러스에 대한 적어도 400배 더 적은 ID50, 바이러스에 대한 적어도 500배 더 적은 ID50, 바이러스에 대한 적어도 600배 더 적은 ID50, 바이러스에 대한 적어도 700배 더 적은 ID50, 바이러스에 대한 적어도 800배 더 적은 ID50, 바이러스에 대한 적어도 900배 더 적은 ID50, 또는 바이러스에 대한 적어도 1000배 더 적은 ID50를 포함한다.
본 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 인큐베이션 후의 혼합물로부터 바이러스를 제거하는 단계를 포함하지 않는다.
본 명세서의 측면은 또한 하기와 같이 기재될 수 있다:
1. a) 활성을 보유한 단백질을 포함하는 유체를 제공하는 단계; b) 유기 용매 및 계면활성제를 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계; 및 c) 혼합물을 약 120분 이하 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하고; 여기에서 단계 (b)와 (c) 둘 모두는 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되며; 인큐베이션 후의 혼합물은 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않으며; 인큐베이션 후의 단백질은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는, 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법.
2. a) 활성을 보유한 단백질을 포함하는 유체를 제공하는 단계; b) 유기 용매 및 계면활성제를 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계; 및 c) 혼합물을 약 120분 이하 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하고; 여기에서 단계 (b)와 (c) 둘 모두는 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되며; 인큐베이션 후의 혼합물은 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않으며; 인큐베이션 후의 단백질은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는 방법으로부터 수득한 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 단백질.
3. a) 활성을 보유한 인자 VIII을 포함하는 유체를 제공하는 단계; b) 유기 용매 및 계면활성제를 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계; 및 c) 혼합물을 약 120분 이하 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하고; 여기에서 단계 (b)와 (c) 둘 모두는 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되며; 인큐베이션 후의 혼합물은 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않으며; 인큐베이션 후의 인자 VIII은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는, 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법.
4. a) 활성을 보유한 인자 VIII을 포함하는 유체를 수득하는 단계; b) 유기 용매 및 계면활성제를 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계; 및 c) 혼합물을 약 120분 이하 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하고; 여기에서 단계 (b)와 (c) 둘 모두는 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되며; 인큐베이션 후의 혼합물은 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않으며; 인큐베이션 후의 인자 VIII은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는 방법으로부터 수득한 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 인자 VIII.
5. 유체가 세포 용해물, 세포 상등액, 선행 정제 단계로부터의 용출액, 또는 생물학적 유체인 1 내지 4의 실시양태.
6. 세포 용해물이 포유동물 세포주로부터 수득된 것인 5의 실시양태.
7. 세포 포유동물 세포주가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주인 6의 실시양태.
8. 단백질이 재조합 단백질인 1 내지 4의 실시양태.
9. 단백질이 유기체 또는 트랜스제닉 유기체로부터 유래한 것인 1 내지 4의 실시양태.
10. 단백질이 혈액 단백질인 8 내지 9의 실시양태.
11. 혈액 단백질이 혈액 응고 단백질인 10의 실시양태.
12. 혈액 단백질이 ADAMTS-13, α1-항플라즈민, α2-항플라즈민, 항트롬빈, 항트롬빈 III, 암 응고촉진제, 에리트로포이에틴, 인자 II, 인자 V, 인자 VI, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 피브로넥틴, 피브리노겐, 헤파린 보조인자 II, 고분자량 키니노겐, 근육내 면역글로불린, 정맥내 면역글로불린, 플라즈미노겐, 플라즈미노겐 활성화인자 억제제-1, 플라즈미노겐 활성화인자 억제제-2, 프리칼리크레인, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 억제제, 조직 인자, 조직 플라즈미노겐 활성화인자, 우로키나제, 또는 폰 빌레브란트 인자인 8 내지 10의 실시양태.
13. 유기 용매가 에테르, 알콜, 디알킬포스페이트 또는 트리알킬포스페이트인 1 내지 12의 실시양태.
14. 에테르가 디메틸 에테르, 디에틸 에테르, 에틸 프로필 에테르, 메틸-부틸 에테르, 메틸 이소프로필 에테르, 또는 메틸 이소부틸 에테르인 13의 실시양태.
15. 알콜이 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, n-펜탄올, 또는 이소펜탄올인 13의 실시양태.
16. 디알킬포스페이트가 디-(n-부틸)포스페이트, 디-(t-부틸)포스페이트, 디-(n-헥실)포스페이트, 디-(2-에틸헥실)포스페이트, 디-(n-데실)포스페이트, 또는 에틸 디(n-부틸) 포스페이트인 13의 실시양태.
17. 트리알킬포스페이트가 트리-(n-부틸)포스페이트, 트리-(t-부틸)포스페이트, 트리-(n-헥실)포스페이트, 트리-(2-에틸헥실)포스페이트, 또는 트리-(n-데실)포스페이트인 13의 실시양태.
18. 유기 용매의 최종 농도가 약 0.1%(v/v) 내지 약 5.0%(v/v), 약 0.1%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v), 약 0.2%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v), 또는 약 0.2%(v/v) 내지 약 0.4%(v/v), 약 0.3%(v/v)인 1 내지 17의 실시양태.
19. 계면활성제가 이온성 계면활성제, 쯔비터이온성 (양쪽성) 계면활성제, 또는 비이온성 계면활성제인 1 내지 18의 실시양태.
20. 이온성 계면활성제가 음이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제인 19의 실시양태.
21. 음이온성 계면활성제가 알킬 술페이트, 알킬 에테르 술페이트, 도큐세이트, 술포네이트 플루오로계면활성제, 알킬 벤젠 술포네이트, 알킬 아릴 에테르 포스페이트, 알킬 에테르 포스페이트, 알킬 카르복실레이트, 나트륨 라우로일 사르코시네이트, 또는 카르복실레이트 플루오로계면활성제인 20의 실시양태.
22. 알킬 술페이트가 암모늄 라우릴 술페이트 또는 나트륨 라우릴 술페이트(SDS)인 21의 실시양태.
23. 알킬 에테르 술페이트가 나트륨 라우레트 술페이트 또는 나트륨 마이레스 술페이트인 21의 실시양태.
24. 도큐세이트가 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트인 21의 실시양태.
25. 술포네이트 플루오로계면활성제가 퍼플루오로옥탄술포네이트(PFOS) 또는 퍼플루오로부탄술포네이트인 21의 실시양태.
26. 알킬 카르복실레이트가 지방산 염 또는 나트륨 스테아레이트인 21의 실시양태.
27. 카르복실레이트 플루오로계면활성제가 퍼플루오로노나노에이트 및 퍼플루오로옥타노에이트인 21의 실시양태.
28. 양이온성 계면활성제가 알킬트리메틸암모늄 염, 세틸피리디늄 클로라이드(CPC), 폴리에톡실화 탤로우 아민(POEA), 벤즈알코늄 클로라이드(BAC), 벤즈에토늄 클로라이드(BZT), 5-브로모-5-니트로-1,3-디옥산, 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드, 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DODAB), pH-의존성 1급 아민, pH-의존성 2급 아민, 또는 pH-의존성 3급 아민인 20의 실시양태.
29. 알킬트리메틸암모늄 염이 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 또는 세틸 트리메틸암모늄 클로라이드(CTAC)인 28의 실시양태.
30. 1급 아민이 pH < 10에서 양으로 하전되거나 또는 2급 아민이 pH < 4에서 하전되는 28의 실시양태.
31. 양이온성 계면활성제가 옥테니딘 디히드로클로라이드인 20의 실시양태.
32. 쯔비터이온성 계면활성제가 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS), 술타인, 베타인, 또는 레시틴인 20의 실시양태.
33. 술타인이 코카미도프로필 히드록시술타인인 32의 실시양태.
34. 베타인이 코카미도프로필 베타인인 32의 실시양태.
35. 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르, 폴록사머, 알킬 페놀 폴리글리콜 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬 에테르, 2-도데콕시에탄올(루브롤®-PX), 폴리옥시에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르, 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬페놀 에테르, 페녹시폴리에톡실에탄올, 글루코시드 알킬 에테르, 말토시드 알킬 에테르, 티오글루코시드 알킬 에테르, 디지토닌, 글리세롤 알킬 에스테르, 알킬 아릴 폴리에테르 술페이트, 알콜 술포네이트, 소르비탄 알킬 에스테르, 코카미드 에탄올아민, 수크로스 모노라우레이트, 도데실 디메틸아민 옥시드, 또는 나트륨 콜레이트인 20의 실시양태.
36. 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르가 폴리소르베이트 20 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 20), 폴리소르베이트 40 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 40), 폴리소르베이트 60 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 60), 폴리소르베이트 61 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 61), 폴리소르베이트 65 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 65), 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80), 또는 폴리소르베이트 81 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 81)인 35의 실시양태.
37. 폴록사머가 폴록사머 124(플루로닉® L44), 폴록사머 181(플루로닉® L61), 폴록사머 182(플루로닉® L62), 폴록사머 184(플루로닉® L64), 폴록사머 188(플루로닉® F68), 폴록사머 237(플루로닉® F87), 폴록사머 338(플루로닉® L108), 또는 폴록사머 407(플루로닉® F127)인 35의 실시양태.
38. 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬 에테르가 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, BRIJ® 30, 또는 BRIJ® 35인 35의 실시양태.
39. 폴리옥시에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르가 폴리옥시에틸렌 (4-5) p-t-옥틸 페놀(트리톤® X-45) 또는 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100)인 35의 실시양태.
40. 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬페놀 에테르가 노녹시놀-9인 35의 실시양태.
41. 페녹시폴리에톡실에탄올이 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올 또는 옥틸 페녹시폴리에톡실에탄올인 35의 실시양태.
42. 글루코시드 알킬 에테르가 옥틸 글루코피라노시드인 35의 실시양태.
43. 말토시드 알킬 에테르가 도데실 말토피라노시드인 35의 실시양태.
44. 티오글루코시드 알킬 에테르가 헵틸 티오글루코피라노시드인 35의 실시양태.
45. 글리세롤 알킬 에스테르가 글리세릴 라우레이트인 35의 실시양태.
46. 코카미드 에탄올아민이 코카미드 모노에탄올아민 또는 코카미드 디에탄올아민인 35의 실시양태.
47. 계면활성제의 최종 농도가 약 0.1%(v/v) 내지 약 10.0%(v/v), 또는 약 0.5%(v/v) 내지 약 5.0%(v/v)인 1 내지 46의 실시양태.
48. 계면활성제가 복수 종의 계면활성제인 1 내지 47의 실시양태.
49. 복수 종의 계면활성제가 제19항 내지 제46항에 기재된 것인 1 내지 48의 실시양태.
50. 1종 계면활성제의 최종 농도가 약 0.1%(v/v) 내지 약 10.0%(v/v), 약 0.5%(v/v) 내지 약 5.0%(v/v), 또는 약 0.5%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v)이고, 나머지의 계면활성제의 최종 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 약 5%(v/v), 약 0.1%(v/v) 내지 약 1.0%(v/v), 또는 약 0.2%(v/v) 내지 약 4%(v/v)인 48 또는 49의 실시양태.
51. 단계 (c)에서 혼합물을 약 10분 내지 약 90분 인큐베이션하는 1 내지 50의 실시양태.
52. 단계 (c)에서 혼합물을 약 30분 내지 약 60분 인큐베이션하는 1 내지 50의 실시양태.
53. 단계 (b)와 (c) 둘 모두를 약 0℃ 내지 약 16℃의 온도에서 수행하는 1 내지 52의 실시양태.
54. 단계 (b)와 (c) 둘 모두를 약 2℃ 내지 약 12℃의 온도에서 수행하는 1 내지 52의 실시양태.
55. 단계 (b)와 (c) 둘 모두를 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 수행하는 1 내지 52의 실시양태.
56. 단계 (b)와 (c) 둘 모두를 약 2℃ 내지 약 4℃의 온도에서 수행하는 1 내지 52의 실시양태.
57. 인큐베이션 후의 혼합물이 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 1 내지 56의 실시양태.
58. 인큐베이션 후의 혼합물이 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 전혀 함유하지 않는 1 내지 57의 실시양태.
59. 인큐베이션 후의 혼합물이 1 x 101 PFU/mL 미만의 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 포함하는 1 내지 58의 실시양태.
60. 인큐베이션 후의 혼합물이 인큐베이션 전보다 생존성 지질 코트 함유 바이러스에 대하여 적어도 100배 더 적은 ID50을 포함하는 1 내지 59의 실시양태.
61. 인큐베이션 후의 혼합물이 단백질 응집체를 본질적으로 함유하지 않는 1 내지 60의 실시양태.
62. 인큐베이션 후의 혼합물이 단백질 응집체를 전혀 함유하지 않는 1 내지 61의 실시양태.
63. 인큐베이션 후의 혼합물이 응집체 형태의 활성을 보유한 단백질을 약 1% 미만, 약 0.9% 미만, 약 0.8% 미만, 약 0.7% 미만, 약 0.6% 미만, 약 0.5% 미만, 약 0.4% 미만, 약 0.3% 미만, 약 0.2% 미만, 또는 약 0.1% 미만으로 가지는 1 내지 62의 실시양태.
64. 인큐베이션 후의 혼합물에 존재하는 단백질 활성이 단계 (a)에서 제공된 단백질 활성의 적어도 50% 또는 단계 (a)에서 제공된 단백질 활성의 적어도 75%인 1 내지 63의 실시양태.
65. 유체가 지질 코트 함유 바이러스를 추가로 포함하는 1 내지 64의 실시양태.
66. 지질 코트 함유 바이러스가 DNA 바이러스, RNA 바이러스, 또는 역전사 바이러스인 65의 실시양태.
67. DNA 바이러스가 헤르페스바이러스과 바이러스, 폭스바이러스과 바이러스, 또는 헤파드나바이러스과 바이러스인 66의 실시양태.
68. RNA 바이러스가 플라비바이러스과 바이러스, 토가바이러스과 바이러스, 코로나바이러스과 바이러스, 델타바이러스 바이러스, 오르토믹소바이러스과 바이러스, 파라믹소바이러스과 바이러스, 랩도바이러스과 바이러스, 부니아바이러스과 바이러스, 또는 필로바이러스과 바이러스인 66의 실시양태.
69. 역전사 바이러스가 레트로바이러스과 바이러스 또는 헤파드나바이러스과 바이러스인 66의 실시양태.
70. 지질 코트 함유 바이러스가 인간 면역결핍 바이러스, 신드비스 바이러스, 단순 포진 바이러스, 가성광견병 바이러스, 센다이 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 코로나 바이러스, 말 관절염 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 또는 우두 바이러스인 65의 실시양태.
71. 상기 방법이 단계 (c) 후에 혼합물로부터 용매를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 1 내지 70의 실시양태.
72. 상기 방법이 단계 (c) 후에 혼합물로부터 비이온성 계면활성제를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 1 내지 71의 실시양태.
73. 상기 방법이 단계 (c) 후에 혼합물로부터 비-생존성 바이러스를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 1 내지 72의 실시양태.
74. a) 활성을 보유한 인자 VIII을 포함하는 유체를 제공하는 단계; b) 트리(n-부틸) 포스페이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐, 및 폴리소르베이트 80 소르비탄을 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계(여기에서, 트리(n-부틸) 포스페이트의 최종 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 약 5.0%(v/v)이고, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐의 최종 농도는 약 0.5%(v/v) 내지 약 10.0%(v/v)이며, 폴리소르베이트 80 소르비탄의 최종 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 약 5.0%(v/v)이다); 및 c) 혼합물을 약 120분 이하 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하고; 여기에서 단계 (b)와 (c) 둘 모두는 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되며; 인큐베이션 후의 혼합물은 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않으며; 인큐베이션 후의 인자 VIII은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는, 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법.
75. a) 활성을 보유한 인자 VIII을 포함하는 유체를 수득하는 단계; b) 트리(n-부틸) 포스페이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐, 및 폴리소르베이트 80 소르비탄을 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계(여기에서, 트리(n-부틸) 포스페이트의 최종 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 약 5.0%(v/v)이고, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐의 최종 농도는 약 0.5%(v/v) 내지 약 10.0%(v/v)이며, 폴리소르베이트 80 소르비탄의 최종 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 약 5.0%(v/v)이다); 및 c) 혼합물을 약 120분 이하 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하고; 여기에서 단계 (b)와 (c) 둘 모두는 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되며; 인큐베이션 후의 혼합물은 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않으며; 인큐베이션 후의 인자 VIII은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는 방법으로부터 수득한 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 인자 VIII.
76. 트리(n-부틸) 포스페이트의 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.7%이고, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐의 농도는 약 0.6%(v/v) 내지 약 1.4%(v/v)이며, 폴리소르베이트 80 소르비탄의 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.7%인 74 또는 75의 실시양태.
77. 트리(n-부틸) 포스페이트의 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.5%이고, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐의 농도는 약 0.7%(v/v) 내지 약 1.3%(v/v)이며, 폴리소르베이트 80 소르비탄의 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.5%인 74 또는 75의 실시양태.
78. 트리(n-부틸) 포스페이트의 농도는 약 0.2%(v/v) 내지 약 0.4%이고, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐의 농도는 약 0.8%(v/v) 내지 약 1.2%(v/v)이며, 폴리소르베이트 80 소르비탄의 농도는 약 0.2%(v/v) 내지 약 0.4%인 74 또는 75의 실시양태.
79. 트리(n-부틸) 포스페이트의 농도는 약 0.3%(v/v)이고, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐의 농도는 약 1.0%(v/v)이며, 폴리소르베이트 80 소르비탄의 농도는 약 0.3%(v/v)인 74 또는 75의 실시양태.
80. 인큐베이션 후의 혼합물이 응집체 형태의 활성을 보유한 단백질을 약 1% 미만, 약 0.9% 미만, 약 0.8% 미만, 약 0.7% 미만, 약 0.6% 미만, 약 0.5% 미만, 약 0.4% 미만, 약 0.3% 미만, 약 0.2% 미만, 또는 약 0.1% 미만으로 가지는 74 내지 79의 실시양태.
81. 인큐베이션 후의 혼합물에 존재하는 단백질 활성이 단계 (a)에서 제공된 단백질 활성의 적어도 50% 또는 단계 (a)에서 제공된 단백질 활성의 적어도 75%인 74 내지 80의 실시양태.
82. 본원에 기재된 1 내지 81의 실시양태.
83. 본원에 기재된 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법.
84. 본원에 기재된 방법으로부터 수득한 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 인자 VIII.
85. 본원에 기재된 방법으로부터 수득한 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 단백질.
실시예
하기 비-제한적인 실시예는 현재 고려되는 대표적인 실시양태의 좀더 완전한 이해를 돕고자 단지 예시의 목적으로 제공될 뿐이다. 이들 실시예는 본원에 개시된 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법 및 이들 방법을 이용하여 처리된 생성물에 관계되는 것들을 포함하여, 본 명세서에 기재된 실시양태의 어느 것도 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시예 1
바이러스 불활성화의 평가
본 실시예는 본원에 개시된 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법이 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 인큐베이션 후의 혼합물을 생성함을 설명한다.
재조합 인자 VIII은, 그 단백질을 세포 배양 배지중으로 분비하는 CHO 세포주에 의해 생성되는데, 배지를 수집한 다음 이를 원심분리하여 세포 파편을 제거함으로써 수확하였다. 10℃ 이하로 유지시킨 냉실에서, 수확한 상등액을 희석하고 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 다음, 고정화 α-인자 VIII 마우스 모노클로날 항체를 포함하는 면역친화성 크로마토그래피 칼럼에 통과시키고 용출액을 수집함으로써 인자 VIII을 포획하였다. 인자 VIII은 면역친화성 크로마토그래피 용출액을 음전하를 띠는 술폰화 그룹을 포함하는 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 통과시킴으로써 추가 처리하였다. 이 교환 칼럼으로부터의 수집된 용출액을 이어서 약 2℃ 또는 약 10℃로 냉각하였다.
냉각된 용출액을 이어서 3개 분취량으로 나누고, 지질-코트 모델 바이러스인 가성광견병 바이러스를 1:13(예를 들어, 24 mL 공정 공급물 + 2 mL 바이러스 스톡)의 비로 가하였다. 분취량을 이어서 다음과 같이 용매/세제 용액과 혼합한 다음, 동일한 온도로 냉각하였다: 분취량 1, 0.21%(v/v) 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP), 0.7%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100) 및 0.21%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80); 분취량 2, 0.06%(v/v) 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP), 0.2%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100) 및 0.06%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80); 및 분취량 3, 0.03%(v/v) 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP), 0.1%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100) 및 0.03%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80). 용매/세제 용액의 성분 농도는 일상적인 제조 동안의 이들 성분의 공칭 농도 70%, 20% 및 10%와 각각 일치한다. 이들 준-최적(sub-optimal) 농도를 바이러스 불활성화에 최소한으로 호적한 조건의 이용에 의한 방법의 견고성(robustness) 평가, 및 불활성화 동역학 평가에 사용하였다.
S/D 처리의 유효성에 접근하기 위하여, 지질-코트 바이러스의 log10 감소를 측정하였다. 바이러스-스파이크(spiked) 출발물질로부터 및 S/D 처리 중에 샘플을 채취하였다; 바이러스 적정 전에 냉온 세포 배양 배지로의 즉석 희석에 의하여 샘플에서 용매/세제 성분의 바이러스 불활성화 효과를 정지시켰다. log 감소 계수는 스파이크 출발물질의 (log) 역가로부터 최종 샘플의 (log) 역가를 공제함으로써 계산해내었으며; 최종 샘플에서 어떠한 감염성도 관찰될 수 없었던 경우에, 이 계산에 대하여 검출의 한계를 취하였다.
결과는 약 2℃ 또는 약 10℃에서 약 1 내지 약 2분 안에 가성광견병 바이러스 불활성화가 일어났음을 나타낸다(표 1). 실험 실행을 용매/세제 성분 농도의 하한 이하에서 및 S/D 처리 지속기간의 하한 아래에서 행하였으므로, 수득된 감소 계수는 대규모 공정의 바이러스 불활성화능의 견고성 평가이다. 이들 결과는 약 10℃에서 및 약 2℃에서의 S/D 처리가 견고하였고 지질-엔벨로프형 바이러스를 매우 효과적으로 및 신속하게 불활성화시켰음을 증명해 보인다.
Figure 112018041238966-pat00001
실시예 2
바이러스 불활성화의 평가
본 실시예는 본원에 개시된 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법이 생존성 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않는 인큐베이션 후의 혼합물을 도출함을 설명한다.
재조합 인자 VIII을 본질적으로 실시예 1에서 기재한 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 양이온 교환 칼럼으로부터의 수집 용출액을 이어서 약 2℃로 냉각하였다.
냉각된 용출액을 이어서 다음과 같이 6개 분취량으로 나눈 다음 지질-엔벨로프형 바이러스를 분취량에 1:13(예를 들어, 24 mL 공정 공급물 + 2 mL 바이러스 스톡)의 비로 가하였다: 분취량 1 및 2, 가성광견병 바이러스(PRV) 첨가; 분취량 3 및 4, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(X-MuLV) 첨가; 및 분취량 5 및 6, 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 첨가. 분취량을 이어서 다음과 같이 용매/세제 용액과 혼합한 다음, 약 2℃로 냉각하였다: 분취량 1, 3 및 5; 0.21%(v/v) 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP), 0.7%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100) 및 0.21%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80); 및 분취량 2, 4, 및 6; 0.03%(v/v) 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP), 0.1%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100) 및 0.03%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80). 용매/세제 용액의 성분 농도는 일상적인 제조시에서의 이들 성분의 공칭 농도 70% 및 10%와 일치한다. 이들 준-최적 농도를 바이러스 불활성화에 최소한으로 호적한 조건의 이용에 의한 방법의 견고성 평가, 및 불활성화 동역학 평가에 사용하였다.
S/D 처리의 유효성에 접근하기 위하여, 3개 지질-코트 바이러스 각각의 log10 감소를 측정하였다. 바이러스-스파이크 출발물질로부터 및 S/D 처리 중에 샘플을 채취하였다; 바이러스 적정 전에 냉온 세포 배양 배지로의 즉석 희석에 의하여 샘플에서 용매/세제 성분의 바이러스 불활성화 효과를 정지시켰다. log 감소 계수는 스파이크 출발물질의 (log) 역가로부터 최종 샘플의 (log) 역가를 공제함으로써 계산해내었으며; 최종 샘플에서 어떠한 감염성도 관찰될 수 없었던 경우에, 이 계산에 대하여 검출의 한계를 취하였다.
결과는 70% 용매/세제 용액과 인큐베이션하였을 때 약 2℃에서 약 1-2분 안에 PRV, X-MuLV, 및 BVDV 불활성화 전부가 일어났음을 나타낸다(표 2). 실험 실행을 용매/세제 성분 농도의 하한 이하에서 및 S/D 처리 지속기간의 하한 미만에서 행하였으므로, 수득된 감소 계수는 대규모 공정의 바이러스 불활성화능의 견고한 평가이다. 이들 결과는 약 2℃에서의 S/D 처리가 견고하였고 지질-엔벨로프형 바이러스를 매우 효과적으로 및 신속하게 불활성화시켰음을 증명해보인다.
Figure 112018041238966-pat00002
실시예 3
혼합시간, 여과, 및 단백질 수율의 평가
본 실시예는 본원에 개시된 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법이 용매/세제 성분의 혼합시간, 여과중 용매/세제 성분의 보유, 및 단백질 여과 수율에 악영향을 미치지 않음을 설명한다.
좀더 낮은 온도가 용매/세제 성분의 혼합시간에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 0.3%(v/v) TNBP, 1.0%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100) 및 0.3%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)를 가하고 4±2℃에서 10, 20, 또는 30분 동안 교반함으로써 50 mL 용매/세제 용액을 제조하였다. 용매/세제 용액이 0.1% 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)를 이미 함유하고 있으므로, 이 화합물에 대한 최종 농도는 0.4%이었다. 굴절률 검출기(RID)를 구비한 C18 RP-HPLC를 이용하여 TNBP 및 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100)의 농도를 동시에 측정하였다. 증발 광산란 검출기(ELSD)를 사용하는 C1 RP-HPLC로 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)의 농도를 측정하였다. TNBP 및 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100)의 HPLC 분석을 위해, 수중 68% 메탄올을 사용하여 등용매 용출을 채용한다. 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)의 검정의 경우에는, 수중 60% 메탄올→100% 메탄올로의 구배 용출을 이용한다.
Figure 112018041238966-pat00003
이들 결과는 TNBP, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100) 및 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)의 농도가 신속하게 그리고 10분 안에 안정화되었으며, 4℃±2℃의 저온은 용매/세제 성분의 혼합시간에 악영향을 미치지 않았음을 확인시켜준다(표 3).
여과 단계 동안의 용매/세제 성분의 잠재적 보유에 대한 온도의 영향을 평가하기 위하여, 0.3%(v/v) TNBP, 1.0%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100) 및 0.3%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)를 가하고, 4±2℃에서 30분 동안 교반함으로써 50 mL 용매/세제 용액을 제조하였으며, 각 성분의 농도를 전술한 바와 같이 측정하였다. 용매/세제 용액을 이어서 3가지 상이한 온도 조건하에서 처리하였다: 22.5℃, 약 8 시간의 워밍업 기간; 22.5℃, 약 2 시간의 워밍업 기간; 및 4℃, 워밍업 또는 예열 단계 없음. 인큐베이션 기간의 말기에, 샘플을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 다음, TNBP, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100) 및 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80) 농도를 HPLC로 측정하였다.
Figure 112018041238966-pat00004
결과는 용매/세제 성분의 어느 것도 0.2 ㎛ 필터상에 보유되지 않았음을 나타낸다(표 4). 또한, 좀더 낮은 인큐베이션 온도(4℃±2℃)는 용매/세제 성분의 여과성에 악영향을 미치지 않았다.
좀더 낮은 온도가 회수된 단백질 활성에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 0.3%(v/v) TNBP, 1.0%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100) 및 0.3%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)를 가하고, 4±2℃에서 30분 동안 교반함으로써 50 mL 용매/세제 용액을 제조하였다. 용매/세제 용액을 이어서 3가지 상이한 온도 조건하에서 처리하였다: 22.5℃, 약 8 시간의 워밍업 기간; 22.5℃, 약 2 시간의 워밍업 기간; 및 4℃, 워밍업 또는 예열 단계 없음. 인큐베이션 기간의 말기에, 샘플을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고 인자 VIII 활성을 여과 전후에 발색 기질 검정을 이용하여 측정하였다.
인자 VIII 활성의 발색 검정을 수행하기 위하여, 용매/세제-처리 용액의 분취량을 샘플 희석 완충제(50 mM 트리스(Tris), 5 mM CaCl2, 225 mM NaCl, 0.1% 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80), pH 6.7±0.2)에서 대략 25 IU/mL가 되도록 사전희석하고(pre-diluted), 이어서 인자 VIII-결손 혈장에서 1 IU/mL가 되도록 추가 희석하였다. 100 ㎕ 사전희석 샘플을 이어서 0.03 M CaCl2, 0.06 mM 인지질, 100 ㎕의 0.3 μM 인자 IXa, 100 ㎕의 1 μM 인자 X, 및 500 ㎕의 3.4 μM 발색 기질 CH3OCO-D-시클로헥실글리실-글리실-아르기닐-p-니트로아닐리드와 혼합하여 인자 VIII가 반응의 속도 제한 성분이 되도록 보장하였다. 혼합물을 37℃에서 90초 동안 인큐베이션하고 이어서 405 nm에서 행한 분광광도계 판독을 취하여 발색 기질 가수분해 속도 및 p-니트로-아닐린의 방출 속도를 측정하였다.
측정된 인자 VIII 활성은 0.2 ㎛ 여과 단계 전후에 동등하였다. 이러한 결과는 좀더 낮은 온도가, S/D 성분의 부재하에서, 0.2 ㎛ 여과 단계 후의 인자 VIII 회수율에 악영향을 미치지 않음을 확인시켜 준다.
Figure 112018041238966-pat00005
결과는 인자 VIII 회수율은 평가된 모든 온도 조건에 대하여 약 100%이었으며 단백질 활성은 용매/세제 성분의 존재에도 불구하고 여과 단계 전후에 동등하였음을 나타낸다(표 5).
실시예 4
활성을 보유한 단백질을 포함하는 유체내 지질 코트 함유 바이러스의 불활성화
본 실시예는 활성을 보유한 단백질을 포함하는 유체내 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 본원에 개시된 방법을 설명한다.
회수된 단백질 활성에 대한 본원에 개시된 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법의 전반적 유효성을 평가하기 위하여, 0.3%(v/v) TNBP, 1.0%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100) 및 0.3%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)를 가하고, 4±2℃에서 30분 동안 교반함으로써 50 mL 용매/세제 용액을 제조하였다. 용매/세제 용액을 이어서 3가지 상이한 온도 조건하에서 처리하였다: 22.5℃, 약 8 시간의 워밍업 기간; 22.5℃, 약 2 시간의 워밍업 기간; 및 4℃, 워밍업 또는 예열 단계 없음. 인큐베이션 기간의 말기에, 샘플을 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였고, 인자 VIII 활성을 본질적으로 실시예 3에서 기재한 바와 같이 여과 전후에 발색 기질 검정을 이용하여 측정하였다.
결과는 인자 VIII에 대한 평균 회수 수율이 4℃에서 2시간 동안 수행된 용매/세제 처리의 경우에는 83.02%; 22.5℃에서 2시간 동안 수행된 처리의 경우에는 82.83%; 및 22.5℃에서 8시간 동안 수행된 처리의 경우에는 80.93%이었음을 나타낸다(표 6).
이들 결과는 4℃에서 2시간 동안 수행된 용매/세제 처리는 활성을 띠는 인자 VIII의 회수율에 유의미하게 영향을 미치지 않음을 확인시켜 준다. 더욱이, 인자 VIII의 비(比)활성은 인큐베이션을 22.5℃에서가 아니라 4℃에서 수행하였을 때 좀더 양호하게 보존되는 것으로 보인다. 용매/세제 처리를 22.5℃에서 행하였을 때는 약 6%의 비활성이 손실된 반면에, 처리를 4℃에서 행하였을 때에는 비활성에 있어 약 1%의 경미한 감소만이 인자 VIII에서 관찰되었다. 따라서, 저온에서 수행된 용매/세제 처리로 인자 VIII 평균 회수율의 예기치 않은 증가가 관찰되었다.
Figure 112018041238966-pat00006
실시예 5
단백질 응집의 평가
본 실시예는 본원에 개시된 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 방법이 단백질 응집을 방지하였음을 설명한다.
저온에서의 바이러스 불활성화 단계가 단백질 응집체 형성에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 용매/세제 처리를 3가지 상이한 온도 조건하에서 수행하였다: 22.5℃, 약 8 시간의 워밍업 기간; 22.5℃, 약 2 시간의 워밍업 기간; 및 4℃, 워밍업 또는 예열 단계 없음. 모든 조건에서, 표적 온도에 도달하였을 때 용매/세제 시약을 가하였다. 모든 온도 조건에 대하여 1 시간으로 설정한 인큐베이션 기간 후, 용매/세제 성분을 이온 교환 크로마토그래피로 제거하고 응집체의 양을 최종 벌크에서 측정하였다. 모든 용매/세제 조건을 3회 반복하였다.
응집체의 측정(%로 표현)은 Bio-Sep-SEC-S4000 칼럼을 구비한 HPLC 시스템상에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 수행하였다. 고정상은 15 내지 2,000 kDa 분자량 범위의 단백질 분리에 적합한 실리카 지지체에 결합된 친수성 그룹을 함유한다. 용매/세제-처리 용액으로부터 취한 샘플을 50 ㎍/mL가 되도록 희석하고 11 ㎕를 칼럼에 주입하였다. 용출 완충제는 20 mM 트리스, 250 mM NaCl, 3 mM CaCl2 2수화물, 0.05%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80), 7.5 %(v/v) 에틸렌 글리콜이었다(pH는 7.0±0.2로 조정). 분리는 등용매 이동상 완충제하에서 행하였다. 검출은 형광 검출기를 이용하여 285 nm의 여기 파장 및 335 nm의 방출 파장에서 행하였다. 반응은 수득한 크로마토그램의 상이한 피크에 존재하는 단백질의 양에 비례한다. 응집체의 %는 분획 피크 면적:총 피크 면적의 비로서 산정된다(표 7).
Figure 112018041238966-pat00007
뜻밖에도, 4℃에서 수행된 실험은　최종 벌크 용출액에서 비검출성(< 0.25%) 응집체량을 유도하고, 반면에 22.5℃에서 수행된 공정하에서는 훨씬 더 많은 응집체 형성이 검출되었다(0.7% 및 0.6%). 응집체는 보통 단량체 형태의 단백질에 대하여 면역반응을 증진하는 것으로 인식되고 있으므로 최종 벌크 중 응집체의 감소는 유의미하다.
실시예 6
활성을 보유한 단백질을 포함하는 유체중 지질 코트 함유 바이러스의 불활성화
본 실시예는 활성을 보유한 단백질을 포함하는 유체중 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화하는 본원에 개시된 방법을 설명한다.
재조합 인자 VIII을, 그 단백질을 세포 배양 배지중으로 분비하는 CHO 세포주에 의해 생성되는데, 2,500 리터 생물반응기에서 증식시킨 다음, 10℃로 냉각하여 배지를 수집하고 이를 원심분리하여 세포 파편을 제거함으로써 수확하였다. 10℃ 이하로 유지시킨 냉실에서, 수확한 상등액을 희석하고 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 다음, 고정화 α-인자 VIII 마우스 모노클로날 항체를 포함하는 면역친화성 크로마토그래피 칼럼에 통과시키고 용출액을 수집함으로써 인자 VIII을 포획하였다. 인자 VIII은 면역친화성 크로마토그래피 용출액을 음전하를 띠는 술폰화 그룹을 포함하는 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 통과시킴으로써 추가 처리하였다. 이 교환 칼럼으로부터의 수집 용출액 약 8 리터를 이어서 약 4℃로 냉각한 다음, 양이온 교환기 용출액 kg당 용매/세제 용액 16.6 g의 양으로 동일한 온도로 냉각한 용매/세제 용액과 약 10분 동안 혼합하였다. 용매/세제 용액은 트리(n-부틸) 포스페이트(TNBP), 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100), 및 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)를 18.3:66.3:20.2의 중량비로 포함한다. 이는 약 0.3%(v/v) 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP), 약 1.0%(v/v) 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(트리톤® X-100) 및 약 0.3%(v/v) 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80)의 최종 농도와 일치한다. 약 4℃에서 약 120분 이하 동안 연속 혼합 후, 용매/세제-처리 용출액을 이어서 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하여 바이러스 파편을 제거하였다. 여과된 용매/세제-처리 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 평형 완충제로 희석한 다음, 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 통과시킴으로써 추가 처리하여 용매/세제 성분을 제거하였다. 인자 VIII을 포함하는 최종 정제 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 용출 분획으로부터 수집하였다. 지질 코트 함유 바이러스의 존재, 인자 VIII 활성, 응집체의 양, 및 미량의 용매/세제 성분을 이어서 인자 VIII을 포함하는 최종 정제 용액에서 측정하였다.
인자 VIII을 포함하는 최종 정제 용액중 생존성 지질 코트 함유 바이러스의 존재 또는 활성을 검정하기 위하여, TCID50 검정을 수행하였다. 여과된 용매/세제-처리 용액의 샘플을 뽑아내어 베로(Vero) 세포 배양 배지로 1:00 또는 1:10 희석하였다. 샘플의 연속 0.5 log10 희석액을 베로 세포 배양 배지에서 제조하여 각각의 희석액 100 ㎕를 베로 세포로 시딩한 마이크로역가 플레이트 칼럼의 8개 웰 각각에 가하였다. 마이크로역가 플레이트를 가습 CO2-조절 인큐베이터중 36±2℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 감염의 징후, 예컨대, 예를 들어 용해 세포, 세포변성효과를 보이는 세포, 또는 바이러스 감염을 나타내는 여타의 기준에 대하여 현미경으로 검사하였다. 양성 (바이러스 감염) 및 음성 (바이러스 비-감염) 웰의 패턴으로부터, 바이러스 역가를 포아송 분포에 따라 계산해내고 PFU/mL 및 log10 [TCID50/mL]로서 표현하였다. 어떠한 웰에서도 감염의 양성 징후가 부재한다는 것은 처리된 용액이 지질 코트 함유 바이러스를 본질적으로 함유하지 않음을 나타내는 것이다.
최종 정제 용액에 존재하는 인자 VIII 활성의 양을 검정하기 위하여, 인자 VIII 활성의 발색 검정을 수행하였다. 여과된 용매/세제-처리 용액의 분취량을 샘플 희석 완충제(50 mM 트리스, 5 mM CaCl2, 225 mM NaCl, 0.1% 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80), pH 6.7±0.2)에서 사전희석하여 대략 25 IU/mL이 되도록 하고, 이어서 인자 VIII-결손 혈장에서 1 IU/mL이 되도록 추가 희석하였다. 100 ㎕ 사전희석 샘플을 이어서 0.03 M CaCl2, 0.06 mM 인지질, 100 ㎕의 0.3 μM 인자 IXa, 100 ㎕의 1 μM 인자 X, 및 500 ㎕의 3.4 μM 발색 기질 CH3OCO-D-시클로헥실글리실-글리실-아르기닐-p-니트로아닐리드와 혼합하여 인자 VIII가 반응의 속도 제한 성분이 되도록 보장하였다. 혼합물을 37℃에서 90초 동안 인큐베이션하고 이어서 405 nm에서 행한 분광광도계 판독을 취하여 발색 기질 가수분해 속도 및 p-니트로-아닐린의 방출 속도를 측정하였다.
최종 정제 용액에 존재하는 인자 VIII 활성의 양을 검정하기 위하여, 인자 VIII 활성의 1단계 응고 검정을 수행하였다. 여과된 용매/세제-처리 용액의 분취량을 샘플 희석 완충제(50 mM 트리스, 5 mM CaCl2, 225 mM NaCl, 0.1% 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80), pH 6.7±0.2)에서 대략 25 IU/mL이 되도록 사전희석하고 이어서 인자 VIII-결손 혈장에서 1 IU/mL이 되도록 추가 희석하였다. 100 ㎕의 사전희석 샘플을 이어서 100 ㎕의 인자 VIII-결손 혈장과 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 3분 동안 인큐베이션한 다음 100 ㎕의 25 mM CaCl2를 가하여 응고 공정을 개시시켰다. 존재하는 인자 VIII의 양은 APTT 응고시간 값을 응고시간 대 인자 VIII 농도의 이중 로그 플롯을 작성하는 계산 프로그램을 실행하는 기기로 산정한 표준 곡선과 비교함으로써 측정되었다. 응고 분석기 및 응고 검정용 적정 시약을 설계하여 응고 파라미터의 활성을 생리학적 범위에서 측정하였다. 결과는 인자 VIII에 대한 평균 비활성이 약 6,120 UI/mg이었음을 나타낸다. 이러한 평균 비활성은 유체를 유기 용매/계면활성제 혼합물중 약 20℃ 내지 약 25℃에서 인큐베이션하는 바이러스 불활성화 방법을 사용하여 처리된 인자 VIII에 대한 평균 비활성인 5,809 UI/mg보다 높은 것이다.
인자 VIII을 포함하는 최종 정제 용액에 존재하는 단백질 응집체의 양을 검정하기 위하여, 크기 배제 크로마토그래피 및 UV 흡수 실험을 본질적으로 실시예 5에서 기재한 바와 같이 행하였다.
인자 VIII을 포함하는 최종 정제 용액에 존재하는 미량의 용매/세제 성분을 검정하기 위하여, RP-HPLC 실험을 본질적으로 실시예 3에서 기재한 바와 같이 행하였다.
끝으로, 비록 본 명세서의 측면이 구체적 실시양태를 참조로 하여 강조되고 있지만, 당업자라면 이들 개시된 실시양태가 단지 본원에 개시된 요지의 원리를 설명하는 것에 불과하다는 것을 쉽사리 인지할 것으로 이해될 것이다. 따라서, 개시된 요지는 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및/또는 시약 등에 절대로 제한되지 않음이 당연하다. 그에 따라, 개시된 요지에 대한 다양한 변형이나 변화 또는 개시된 요지의 대안적인 구성이 본 명세서의 취지로부터 일탈함이 없이 본원에서의 교시에 따라 행해질 수 있다. 마지막으로, 본원에서 사용되는 전문 용어는 단지 특정 실시양태의 기재 목적을 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니며, 본 발명의 범위는 오로지 특허청구범위에 의해서만 규정된다. 따라서, 본 발명은 명확히 예시되고 기재된 것에 제한되지 않는다.
발명의 실시를 위해 발명자들에게 알려진 최상의 양태를 비롯하여 본 발명의 특정 실시양태가 본원에 기재되어 있다. 물론, 이들 기재된 실시양태에 대한 변동은 전술한 상세한 설명을 정독하면 당업자에게 자명해질 것이다. 본 발명자들은 숙련된 기술자들이 경우에 따라 이러한 변동을 채용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것 이외의 방법으로도 실시될 것을 지향한다. 따라서, 본 발명은 적용 법률에 의해 허용되는 바의 본원에 첨부된 특허청구범위에 열거된 요지의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 아울러, 본원에서 달리 표시하지 않는 한 또는 문맥상 달리 명백하게 모순되지 않는 한, 전술한 실시양태의 모든 가능한 변동내에서의 이러한 실시양태의 어떠한 조합도 본 발명에 의해 포함된다.
본 발명의 대안적인 실시양태, 요소, 또는 단계의 그룹화는 제한의 의미로 해석되어서는 아니된다. 각 그룹 멤버는 개별적으로 또는 본원에 개시된 다른 그룹 멤버와 병용하여 언급될 수 있고 권리주장될 수 있다. 그룹의 1종 이상의 멤버를 편의상 및/또는 특허성의 이유로 해서 그룹에 포함시킬 수도 있거나 또는 그룹에서 삭제시킬 수도 있음이 예상된다. 임의의 이러한 포함 또는 삭제가 일어나는 경우에, 명세서는 변형되고 그에 따라 첨부 특허청구범위에 사용되고 있는 모든 마쿠시(Markush) 그룹의 서지적 설명을 충족하는 것으로서 그 그룹을 포함하는 것으로 간주한다.
달리 표시하지 않는 한, 본 명세서와 특허청구범위에 사용되고 있는 특징, 항목, 양, 파라미터, 성질, 기간 등을 표현하는 모든 수치는 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 용어 "약"은 그와 같이 자격을 획득한 특징, 항목, 양, 파라미터, 성질, 또는 기간이 진술된 특징, 항목, 양, 파라미터, 특성, 또는 기간의 값의 상하로 ±10%의 범위를 포함함을 의미한다. 따라서, 그와 반대로 표시하지 않는 한, 명세서와 첨부 특허청구범위에 서술된 수치 파라미터는 변동될 수 있는 근사치이다. 최소한, 및 특허청구범위의 범위에의 균등론의 적용을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각각의 수치 표시는 적어도 보고된 유의미한 아라비아 숫자의 개수에 비추어 및 보통의 어림셈(rounding) 기술을 적용함으로써 해석되어야 한다. 발명의 넓은 범위를 서술하는 수치 범위 및 값이 근사치임에도 불구하고, 구체적 실시예에 서술된 수치 범위 및 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 어떠한 수치 범위 또는 값도 본질적으로 그들의 개개 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 특정 오차가 있게 마련이다. 본원에서 값의 수치 범위의 열거는 단지 그 범위 안에 들어오는 각각의 독립된 수치를 개별적으로 언급하는 편법으로서의 역할을 하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 표시하지 않는 한, 수치 범위의 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 열거되는 것처럼 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 기재에 관련하여 (특히 하기 특허청구범위에 관련하여) 사용되는 용어 "a", "an", "the" 및 유사 지시대상은, 본원에서 달리 표시하지 않는 한 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 모두를 망라하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 표시하지 않는 한 또는 문맥상 달리 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적당한 순서로 실행될 수 있다. 본원에 제공되는 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대/~와 같은(such as)")의 사용은 단지 본 발명을 보다 분명히 하기 위한 것일 뿐 권리주장되는 발명의 범위에 대한 제한을 제기하는 것은 아니다. 본 명세서중의 어떠한 언어도 발명의 실시에 필수적인 임의의 비-권리주장된 요소를 표시하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본원에 개시된 구체적 실시양태는 "~로 이루어지는(consisting of)" 또는 "~로 본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)"이라는 언어를 사용하여 특허청구범위에서 좀더 세세하게 한정될 수 있다. 특허청구범위에서 사용되는 경우, 출원 당시에 제출되었든 아니면 보정을 통하여 추가되었든, 전이 용어(transition term)"~로 이루어지는"은 특허청구범위에서 특정되지 않은 임의 요소, 단계, 또는 성분을 배제한다. 전이 용어 "~로 본질적으로 이루어지는"은 특허청구범위의 범위를 특정된 물질 또는 단계와, 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한시킨다. 그렇게 권리주장되는 본 발명의 실시양태는 본원에서 본질적으로 또는 명백하게 기재되고 실시가능하게 된다.
본 명세서에서 참조되고 확인되는 모든 특허, 특허 공보, 및 기타 공보는 예를 들어, 본 발명에 관련되어 사용될 수 있는 이러한 공보에 기재된 조성물 및 방법론의 기재 및 개시 목적상 개별적으로 및 명백하게 그 전문이 본원에 참고로 삽입된다. 이들 공보는 단지 본 출원의 출원일 전의 그들의 개시내용을 위해 제공되는 것에 불과하다. 이와 관련하여 어떠한 것도 선행 발명에 의하여 또는 여타의 이유로 이러한 개시내용에 시간적으로 앞서도록 본 발명자들에게 자격이 부여되지 않음을 허용하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 일자에 관한 모든 진술 또는 이들 문서의 내용에 관한 진술은 출원인들에게 이용가능한 정보에 기초하고 있으며, 이들 문서의 일자 또는 내용의 정확성에 관하여 어떠한 시인도 구성하지 않는다.

Claims (12)

  1. 헤르페스바이러스과(herpesviridae) 바이러스의 감염성이 감소된 재조합 인자 VIII을 포함하는 유체를 제공하는 방법으로서,
    a) 활성을 보유한 인자 VIII을 포함하는 유체를 제공하는 단계;
    b) 트리(n-부틸) 포스페이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르, 및 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트를 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계 - 트리(n-부틸) 포스페이트의 최종 농도는 0.3%(v/v)이고, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르의 최종 농도는 1.0%(v/v)이고, 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트의 최종 농도는 0.3%(v/v)임 -; 및
    c) 혼합물을 120분 이하 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하고;
    여기에서 단계 (b)와 (c) 둘 모두는 2℃ 내지 8℃의 온도에서 수행되며;
    인큐베이션 후의 인자 VIII은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖고,
    유체 중 헤르페스바이러스과 바이러스의 감염성을 적어도 4 log 감소시킬 수 있는, 헤르페스바이러스과(herpesviridae) 바이러스의 감염성이 감소된 재조합 인자 VIII을 포함하는 유체를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 인큐베이션 후의 인자 VIII은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 50%의 활성을 갖는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 인큐베이션 후의 인자 VIII은 단계 (a)에서 제공된 활성의 적어도 75%의 활성을 갖는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유체가 세포 용해물, 세포 상등액, 선행 정제 단계로부터의 용출액, 또는 생물학적 유체인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 헤르페스바이러스과 바이러스가 가성광견병 바이러스(PRV)인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 플라비바이러스과(flaviviridae) 바이러스의 감염성을 적어도 4 log 감소시킬 수 있는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 플라비바이러스과 바이러스가 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 혼합물을 10분 내지 90분 인큐베이션하는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 혼합물을 30분 내지 60분 인큐베이션하는 방법
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)와 (c) 둘 모두를 2℃ 내지 4℃의 온도에서 수행하는 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 바이러스, RNA 바이러스, 역전사 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 신드비스 바이러스, 단순 포진 바이러스, 가성광견병 바이러스, 센다이 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 코로나 바이러스, 말 관절염 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 우두 바이러스, 헤르페스바이러스과 바이러스, 폭스바이러스과 바이러스, 헤파드나바이러스과 바이러스, 플라비바이러스과 바이러스, 토가바이러스과 바이러스, 코로나바이러스과 바이러스, 델타바이러스 바이러스, 오르토믹소바이러스과 바이러스, 파라믹소바이러스과 바이러스, 랩도바이러스과 바이러스, 부니아바이러스과 바이러스, 필로바이러스과 바이러스, 레트로바이러스과 바이러스, 및 헤파드나바이러스과 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 코트 함유 바이러스를 불활성화시킬 수 있는 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 후에 혼합물로부터 트리(n-부틸) 포스페이트를 제거하는 단계; 혼합물로부터 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르 및 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트를 제거하는 단계; 및 혼합물로부터 비-생존성 바이러스를 제거하는 단계로부터 선택되는 하나 이상의 단계를 추가로 포함하는 방법.
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