实施例
下面的具体实施例,其目的是使本领域的技术人员能更清楚地理解和实施本发明。它们不应该被认为是对本发明范围的限制,而只是本发明的示例性说明和典型代表。本领域技术人员应该理解:还有形成本申请的化合物的其它合成途径,下面提供的是非限制性的实施例。
凡涉及易氧化或易水解的原料的所有操作都在氮气保护下进行。除非另有说明,本申请使用的原料都是市场上直接买到未经进一步纯化直接使用的。
柱层析色谱采用青岛化工有限公司生产的硅胶(200-300目)。薄层色谱采用E.Merck公司生产的预制板(硅胶60PF
254,0.25毫米)。手性化合物分离和对映体过量值(ee)测定使用Agilent LC 1200series(柱子:CHIRALPAK AD-H,
毫米,5微米,30℃)。核磁共振色谱(NMR)使用Varian VNMRS-400核磁共振仪测定;液质连用(LC/MS)使用FINNIGAN Thermo LCQ Advantage MAX,Agilent LC 1200series(柱子:Waters SymmetryC18,
毫米,5微米,35℃),采用ESI(+)离子模式。
中间体1:(2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-氧代四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯
步骤1:2-(二苯甲基亚氨基)乙酸甲酯
甘氨酸甲酯盐酸盐(39.4g,0.314mol)溶于300mL二氯甲烷中,搅拌下一次性加入二苯甲酮亚胺(50.0g,0.276mol),反应液在室温下搅拌1天。过滤除掉生成的固体,滤液分别用水、碳酸钠溶液、饱和盐水洗,蒸发浓缩得油状产物2-(二苯甲基亚氨基)乙酸甲酯(64.2g),冷却后固化,直接用于下步反应,收率:92%。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.66(2H,m),7.45(4H,m),7.35(2H,m),7.17(2H,m),4.22(2H,s),3.74(3H,s)。
步骤2:2-(二苯甲基亚氨基)戊-4-炔酸甲酯
搅拌条件下,向2-(二苯甲基亚氨基)乙酸甲酯(64.2g,0.254mol)、炔丙基溴(27.8mL,0.322mol)和溴化四正丁胺(8.66g,26.9mmol)的甲基叔丁基醚溶液(600mL)中加入碳酸铯(175.4g,0.538mol)。加毕在50℃搅拌反应2天。滤去固体,滤饼用少量甲基叔丁基醚(MTBE)洗涤,滤液浓缩至300mL直接用于下步反应。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.66(2H,m),7.45(4H,m),7.35(2H,m),7.17(2H,m),4.32(1H,m),3.73(3H,s),2.83(2H,m),1.95(1H,s)。
步骤3:2-(叔丁氧羰基氨基)戊-4-炔酸
向上步所得浓缩溶液中加入1N盐酸280mL,室温搅拌直至TLC显示2-(二苯甲基亚氨基)戊-4-炔酸甲酯消失,大约需要12小时。分去有机相,水相用甲基叔丁基醚萃取,弃去有机相。水相加入50%氢氧化钠溶液(18.75N,0.712mol),搅拌2小时。加入50mL水,再加入Boc酸酐(61.0g,0.28mol)的甲基叔丁基醚溶液(200mL)。混合物室温搅拌6小时,冰浴冷却下用10%盐酸酸化至pH为3。分出有机相,水相用甲基叔丁基醚萃取,合并有机相,干燥浓缩得到产物2-(叔丁氧羰基氨基)戊-4-炔酸(38.8g),两步收率72%。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.65(1H,brs),5.36(1H,d,J=8.0Hz),4.52(1H,m),2.77(2H,m),2.08(1H,s),1.46(9H,s)。
步骤4:2-(叔丁氧羰基氨基)戊-4-炔酰-(N-甲氧基-N-甲基)胺
将2-(叔丁氧羰基氨基)戊-4-炔酸(20.22g,94.9mmol)溶于乙腈(200mL),再分别加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(43.27g,113.9mmol),N,O-二甲基羟胺盐酸盐(11.11g,113.9mmol)和三乙胺(46.2mL,332.2mmol),室温搅拌2小时。将反应液倾入1500mL水中,用乙酸乙酯萃取3次,合并有机相,依次用1N盐酸、水、饱和碳酸氢钠溶液和饱和盐水洗,干燥浓缩后用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯,5:1~4:1)得到产物2-(叔丁氧羰基氨基)戊-4-炔酰-(N-甲氧基-N-甲基)胺(19.6g),收率81%。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=5.45(1H,d,J=8.0Hz),4.82(1H,m),3.77(3H,s),3.24(3H,s),2.66(2H,m),2.04(1H,s),1.45(9H,s)。
步骤5:1-(2,5-二氟苯基)-1-氧代戊-4-炔-2-基氨基甲酸叔丁酯
2,5-二氟溴苯(11.58g,60mmol)溶于25mL甲苯中,冷至-10℃--5℃。加入溴化锂(2.61g,30mmol),在1.5小时内滴入异丙基氯化镁的四氢呋喃溶液(2M,33ml,66mmol),在低温下搅拌1小时。2-(叔丁氧羰基氨基)戊-4-炔酰-(N-甲氧基-N-甲基)胺(7.68g,30mmol)溶于35mL四氢呋喃中,在1小时内滴入反应体系中,缓慢升至室温,再于室温下搅拌1小时。向反应液中滴入3N盐酸22mL淬灭反应,有机相依次用水、饱和碳酸氢钠溶液和饱和盐水洗,干燥浓缩后用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯,10:1)得到产物1-(2,5-二氟苯基)-1-氧代戊-4-炔-2-基氨基甲酸叔丁酯(6.07g),收率65%。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.56(1H,m),7.26(1H,m),7.15(1H,m),5.68(1H,d,J=7.6Hz),5.24(1H,m),2.91(1H,m),2.68(1H,m),1.99(1H,s),1.45(9H,s)。
步骤6:(1R,2S)-1-(2,5-二氟苯基)-1-羟基戊-4-炔-2-基氨基甲酸叔丁酯
1-(2,5-二氟苯基)-1-氧代戊-4-炔-2-基氨基甲酸叔丁酯(6.07g,19.7mmol)和1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)(6.61g,59mmol)溶于70mL四氢呋喃中,通氮气30分钟。加入(对伞花烃)((1R,2R)-N-对甲苯磺酰基-1,2-二苯基乙二胺)氯化钌(I)(63mg,0.1mmol),通氮气/抽真空3次,氮气氛下向溶液中滴入甲酸(4.53g,98.5mmol),在40℃搅拌2天。加入二氯甲烷200mL,依次用5%柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和盐水洗,干燥浓缩后用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯,25:1-8:1)得到产物(1R,2S)-1-(2,5-二氟苯基)-1-羟基戊-4-炔-2-基氨基甲酸叔丁酯(6.11g),收率100%。
步骤7:(2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯
(1R,2S)-1-(2,5-二氟苯基)-1-羟基戊-4-炔-2-基氨基甲酸叔丁酯(6.11g,19.6mmol)溶于60mL DMF中,通氮气30分钟。加入三(三(3-氟苯基)膦)氯化铑催化剂(427mg,0.393mmol),通氮气/抽真空3次,氮气氛下在80℃搅拌16小时。冷却后加入水和饱和碳酸氢钠溶液各150mL,用甲苯萃取,合并有机相,用水洗几次,干燥浓缩后用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯,30:1-25:1)得到产物(2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯(4.89g),收率80%。
步骤8:(2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羟基四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯
(2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯(2.81g,9.04mmol)溶于50ml四氢呋喃中,冷至-10℃,滴入硼烷-二甲硫醚络合物(2.26mL,22.6mmol),低温下搅拌2小时,升温至15℃。向溶液中滴入1N氢氧化钠溶液(27.1mL,27.1mmol),加入高硼酸钠(4.17g,27.1mmol),搅拌过夜。加入100mL水,分出有机相,水相用二氯甲烷萃取。合并有机相,水洗,干燥浓缩后用硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇,30:1-12:1)得到产物(2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羟基四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯(2.33g)白色固体,收率78%。
步骤9:(2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-氧代四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯
(2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羟基四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯(2.33g,7.08mmol)溶于24mL乙腈、4mL水和4mL醋酸的混合溶液中,加入水合氯化钌(3.7mg,0.0142mmol)的水溶液(4mL),冷至0℃,加入溴酸钠(535mg,3.54mmol),低温下搅拌约1.5小时至原料反应完毕。向溶液中滴入120mL水,0℃搅拌过夜,用二氯甲烷萃取。有机相水洗、干燥浓缩后用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯,10:1)得到中间体1(2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-氧代四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯(1.71g)白色固体,收率74%。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.22(1H,m),7.00(1H,m),4.82(1H,m),4.63(1H,m),4.29(1H,d,J=16.2Hz),4.11(1H,d,J=16.4Hz),4.05(1H,m),3.05(1H,m),2.85(1H,m),1.30(9H,s)。
中间体2:2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物对甲苯磺酸盐
步骤1:3-碘-4,6-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-5(2H)-羧酸叔丁酯
把4,6-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-5(2H)-羧酸叔丁酯(9.41g,45mmol)溶于200mL1,2-二氯乙烷中,加入N-碘代丁二酰亚胺(13.16g,58.5mmol),回流过夜。蒸去溶剂后用硅胶柱层析得3-碘-4,6-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-5(2H)-羧酸叔丁酯(4.66g),收率:31%。MSm/z[ESI]:336.0[M+1]。
步骤2:2-(3-氯丙磺酰基)-3-碘-4,6-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-5(2H)-羧酸叔丁酯
把3-碘-4,6-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-5(2H)-羧酸叔丁酯(2.80g,8.36mmol)和三乙胺(1.69g,16.7mmol)溶于四氢呋喃(80mL)中,冷至-10℃,滴入3-氯丙磺酰氯(1.77g,10mmol),低温下搅拌过夜。加入水(100mL),用二氯甲烷萃取。有机相依次用柠檬酸溶液、水、盐水洗,干燥蒸发浓缩后用硅胶柱层析得2-(3-氯丙磺酰基)-3-碘-4,6-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-5(2H)-羧酸叔丁酯(2.70g),收率:68%。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=4.675(2H,m),4.35(2H,m),3.68(4H,m),2.26(2H,m),1.51(9H,s)。
步骤3:6-叔丁氧羰基-2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物
将2-(3-氯丙磺酰基)-3-碘-4,6-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-5(2H)-羧酸叔丁酯(230mg,0.48mmol)、锌粉(126mg,1.93mmol)、氯化锌的四氢呋喃溶液(0.5M,1.93mL,0.97mmol)和四氢呋喃(20mL)加入微波反应管中,通入氮气5分钟。氮气氛下100℃微波加热反应1.5小时。冷却后加入四(三苯基膦)钯(56mg,0.048mmol),通入氮气5分钟。氮气氛下100℃微波加热反应2小时。过滤,滤液蒸发浓缩后硅胶柱色谱分离得到产物6-叔丁氧羰基-2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物(23mg),收率15%。MS m/z[ESI]:314.1[M+1]。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=4.36(2H,m),4.11(2H,m),3.70(2H,m),3.35(2H,m),2.26(2H,m),1.47(9H,s)。
步骤4:2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1-二氧化物对甲苯磺酸盐
将6-叔丁氧羰基-2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1-二氧化物(46mg,0.15mmol)溶于1.5mL乙酸乙酯中,加入对甲苯磺酸(47mg,0.30mmol),室温搅拌过夜。过滤收集生成的固体,用乙酸乙酯洗,干燥后得到产物2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1-二氧化物对甲苯磺酸盐(48mg),收率83%。MS m/z[ESI]:214.1[M+1]。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=9.40(2H,brs),7.48(2H,d,J=8.0Hz),7.12(2H,d,J=8.0Hz),4.27(2H,s),4.08(2H,s),3.77(2H,t,J=6.6Hz),3.45(2H,t,J=7.4Hz),2.29(3H,s),2.16(2H,m)。
中间体3:3-甲基-2,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑
步骤1:3-甲基-2-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-4,6-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-5(2H)-羧酸叔丁酯
把2-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-4,6-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-5(2H)-羧酸叔丁酯(3.0g,8.85mmol)溶于干燥的四氢呋喃(60mL)中,冷至-78℃,滴入丁基锂的四氢呋喃溶液(2.4M,5.5mL,13.2mmol),低温下搅拌1.5小时。滴入碘甲烷(1.90g,13.2mmol),低温下搅拌5小时。升至室温,加入水(50mL),用乙酸乙酯萃取。有机相干燥蒸发浓缩后用硅胶柱层析得3-甲基-2-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-4,6-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-5(2H)-羧酸叔丁酯(1.5g),收率:48%。MS m/z[ESI]:354.2[M+1]。
步骤2:3-甲基-2,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑
将3-甲基-2-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-4,6-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-5(2H)-羧酸叔丁酯(1.1g,3.12mmol)溶于20mL乙醇中,加入1N盐酸(40mL),封管中90℃反应3小时。冷却后用氢氧化钠溶液调pH至13。浓缩后用硅胶柱层析得到产物3-甲基-2,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑(280mg),收率:73%。MS m/z[ESI]:124.1[M+1]。
中间体4:5-甲磺酰基异吲哚啉盐酸盐
步骤1:5-溴异吲哚啉
把4-溴邻苯二甲酰亚胺(22.6g,100mmol)加入干燥的四氢呋喃(250mL)中,滴入硼烷-二甲硫醚络合物(51mL,500mmol),室温下搅拌2小时,再回流过夜。冷却后小心滴入甲醇破坏过量的硼烷。蒸发浓缩后用硅胶柱层析得5-溴异吲哚啉(10.36g),收率:52%。MS m/z[ESI]:198.0[M+1]。
步骤2:5-溴-2-叔丁氧羰基异吲哚啉
将5-溴异吲哚啉(10.36g,52.3mmol)溶于80mL二氯甲烷中,冰浴冷却。滴加Boc酸酐(22.8g,104.6mmol),再加入碳酸钠(16.6g,156.9mmol)和水(150mL),冰浴下搅拌4小时。分出有机相,盐水洗。浓缩后用硅胶柱层析得到产物5-溴-2-叔丁氧羰基异吲哚啉(13.3g),收率:85%。MS m/z[ESI]:298.0[M+1]。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.37(2H,m),7.11(1H,m),4.62(4H,m),1.51(9H,s)
步骤3:5-甲磺酰基-2-叔丁氧羰基异吲哚啉
把5-溴-2-叔丁氧羰基异吲哚啉(5.96g,20mmol)、甲基亚磺酸钠(90%,2.94g,26mmol)、碘化亚铜(762mg,4mmol)和L-脯氨酸(920mg,8mmol)加入二甲亚砜(80mL)中,通入氮气排除空气,于120℃下搅拌2天。冷却后倾入水中,用乙酸乙酯萃取。有机相干燥蒸发浓缩后用硅胶柱层析得5-甲磺酰基-2-叔丁氧羰基异吲哚啉(5.46g),收率:92%。MS m/z[ESI]:298.1[M+1]。
步骤4:5-甲磺酰基异吲哚啉盐酸盐
将5-甲磺酰基-2-叔丁氧羰基异吲哚啉(5.46g,18.4mmol)溶于甲醇/二氯甲烷(1:1,80mL)中,通入氯化氢气体至饱和,室温搅拌1小时。倾入800mL乙醚中,过滤收集沉淀,乙醚洗,干燥,得到产物5-甲磺酰基异吲哚啉盐酸盐(3.44g),收率:80%。MS m/z[ESI]:198.0[M+1]。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.82(1H,s),7.81(1H,d,J=8.0Hz),7.43(1H,d,J=8.0Hz),4.31(4H,s),3.05(3H,s),2.30(2H,brs)
中间体5:5-甲磺酰胺基异吲哚啉
步骤1:1-氧代-5-甲磺酰胺基异吲哚啉
把5-氨基异吲哚啉-1-酮(444mg,3mmol)溶于15mL吡啶中,加入甲基磺酰氯(378mg,3.3mmol),室温搅拌4小时。蒸去溶剂后用硅胶柱层析得1-氧代-5-甲磺酰胺基异吲哚啉(610mg),收率:90%。MS m/z[ESI]:227.0[M+1]。
步骤2:5-甲磺酰胺基异吲哚啉
把1-氧代-5-甲磺酰胺基异吲哚啉(610mg,2.7mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中,加入硼烷的四氢呋喃溶液(1M,8.1mL,8.1mmol),室温下搅拌2小时,再回流过夜。冷却后小心滴入甲醇破坏过量的硼烷。蒸发浓缩后用硅胶柱层析得5-甲磺酰胺基异吲哚啉(315mg),收率:55%。MS m/z[ESI]:213.1[M+1]。
中间体6:4-氯-5-甲磺酰基异吲哚啉
步骤1:4-氯-5-氨基异吲哚啉-1-酮
5-氨基异吲哚啉-1-酮(2.96g,20mmol)加入氯仿(50mL)中,再加入N-氯代丁二酰亚胺(2.67g,20mmol),回流搅拌2小时。蒸发浓缩后用硅胶柱层析得4-氯-5-氨基异吲哚啉-1-酮(2.58g),收率:70%。MS m/z[ESI]:183.0[M+1]。
步骤2:4-氯-5-碘异吲哚啉-1-酮
将4-氯-5-氨基异吲哚啉-1-酮(2.58g,14mmol)加入15mL 2M硫酸中,冰浴冷却。滴加亚硝酸钠(0.97g,28mmol)和水(1.5mL)配成的溶液,低温下搅拌30分钟。再加入碘化钾(11.62g,70mmol),冰浴下搅拌2小时,室温搅拌2小时。用二氯甲烷萃取,有机相水洗,盐水洗。浓缩后用硅胶柱层析得到产物4-氯-5-碘异吲哚啉-1-酮(2.48g),收率:60%。MS m/z[ESI]:293.9[M+1]。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=8.01(1H,d,J=8.0Hz),7.49(1H,d,J=8.0Hz),4.44(4H,m)。
步骤3:4-氯-5-甲磺酰基异吲哚啉-1-酮
4-氯-5-碘异吲哚啉-1-酮(1.76g,6mmol)、甲基亚磺酸钠(90%,0.884g,7.8mmol)、碘化亚铜(229mg,1.2mmol)和L-脯氨酸(276mg,2.4mmol)加入二甲亚砜(25mL)中,通入氮气排除空气,于110℃下搅拌2天。冷却后倾入水中,用乙酸乙酯萃取。有机相干燥蒸发浓缩后用硅胶柱层析得4-氯-5-甲磺酰基异吲哚啉-1-酮(1.03g),收率:70%。MS m/z[ESI]:246.0[M+1]。
步骤4:4-氯-5-甲磺酰基异吲哚啉
将4-氯-5-甲磺酰基异吲哚啉-1-酮(249mg,1mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中,加入硼烷的四氢呋喃溶液(1M,4mL,4mmol),室温下搅拌2小时,再回流过夜。冷却后小心滴入甲醇破坏过量的硼烷。蒸发浓缩后用硅胶柱层析得4-氯-5-甲磺酰基异吲哚啉(170mg),收率:73%。MS m/z[ESI]:232.0[M+1]。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ=8.08(1H,d,J=8.0Hz),7.32(1H,d,J=8.0Hz),4.30(4H,m),3.32(3H,s),2.80(1H,brs)。
中间体7:异吲哚啉-5-磺酰胺
步骤1:1-氧代异吲哚啉-5-磺酰氯
把5-氨基异吲哚啉-1-酮(5.92g,40mmol)加入浓盐酸/冰醋酸(13.3/4.0mL)混合溶剂中,冰浴冷却。滴加亚硝酸钠(3.04g,28mmol)和水(4.4mL)配成的溶液,低温下搅拌30分钟。同时在另一烧瓶中加入冰醋酸,通二氧化硫至饱和,加入氯化亚铜(0.99g,10mmol),搅拌下继续通二氧化硫至固体基本全溶。慢慢滴入上面制得的重氮盐溶液,低温搅拌半小时,室温搅拌1小时。二氯甲烷萃取,水洗,干燥,旋干得1-氧代异吲哚啉-5-磺酰氯(8.33g),收率:90%。MS m/z[ESI]:232.0[M+1]。
步骤2:1-氧代异吲哚啉-5-磺酰胺
将1-氧代异吲哚啉-5-磺酰氯(463mg,2mmol)加入20mL乙腈中。滴加浓氨水(1mL,12mmol)搅拌3小时。用6N盐酸中和至中性。旋蒸除去乙腈,残留物加水过滤,滤饼用水、乙酸乙酯洗,干燥,得到产物1-氧代异吲哚啉-5-磺酰胺(288mg),收率:68%。MS m/z[ESI]:213.0[M+1]。
步骤3:异吲哚啉-5-磺酰胺
将1-氧代异吲哚啉-5-磺酰胺(288mg,1.36mmol)溶于四氢呋喃(15mL)中,加入硼烷的四氢呋喃溶液(1M,6.8mL,6.8mmol),室温下搅拌2小时,再回流过夜。冷却后小心滴入甲醇破坏过量的硼烷。蒸发浓缩后用硅胶柱层析得异吲哚啉-5-磺酰胺(162mg),收率:60%。MS m/z[ESI]:199.0[M+1]。
中间体8:5-环丙磺酰基异吲哚啉盐酸盐
步骤1:5-环丙磺酰基-2-叔丁氧羰基异吲哚啉
把5-溴-2-叔丁氧羰基异吲哚啉(2.98g,10mmol)、环丙基亚磺酸钠(90%,1.85g,13mmol)、碘化亚铜(381mg,2mmol)和L-脯氨酸(460mg,4mmol)加入二甲亚砜(40mL)中,通入氮气排除空气,于110℃下搅拌2天。冷却后倾入水中,用乙酸乙酯萃取。有机相干燥蒸发浓缩后用硅胶柱层析得5-环丙磺酰基-2-叔丁氧羰基异吲哚啉(2.30g),收率:71%。MS m/z[ESI]:324.1[M+1]。
步骤4:5-环丙磺酰基异吲哚啉盐酸盐
将5-环丙磺酰基-2-叔丁氧羰基异吲哚啉(2.30g,7.1mmol)溶于甲醇/二氯甲烷(1:1,40mL)中,通入氯化氢气体至饱和,室温搅拌2小时。倾入250mL乙醚中,过滤收集沉淀,乙醚洗,干燥,得到产物5-环丙磺酰基异吲哚啉盐酸盐(1.85g),收率:100%。MS m/z[ESI]:224.1[M+1]。
实施例1:(2R,3S,5R)-5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1-二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺
步骤1:(2R,3S,5R)-5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1-二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯
将(2R,3S)-2-(2,5-二-氟苯基)-5-氧代四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯(48mg,0.146mmol)、2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物对甲苯磺酸盐(48mg,0.13mmol)和三乙胺(10mg,0.1mmol)加入N,N-二甲基乙酰胺(2mL)中,室温搅拌3小时。冰浴冷却,加入三乙酰氧基硼氢化钠(87mg,0.39mmol),缓慢升至室温,搅拌过夜。加入饱和碳酸氢钠溶液,用二氯甲烷萃取,饱和盐水洗,干燥,浓缩,柱层析纯化,得到(2R,3S,5R)-5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯(48mg),收率:71%。MS m/z[ESI]:525.2[M+1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.20(1H,m),6.98(2H,m)4.53(1H,m),4.16(4H,m),4.02(2H,m),3.64(2H,m),3.32(3H,m),2.80(2H,m),2.56(2H,m),2.39(1H,m),1.45(1H,m),1.26(9H,s)。
步骤2:(2R,3S,5R)-5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1-二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺
将5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯((45mg,0.086mmol)、一水对甲苯磺酸(75mg,0.43mmol)加入二氯甲烷(1mL)中,室温下搅拌过夜。加入饱和碳酸氢钠溶液,用二氯甲烷萃取,旋干溶剂,柱层析纯化,得到(2R,3S,5R)-5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1-二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺(15mg),收率42%,MS m/z[ESI]:425.1[M+1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.14(1H,m),7.01(2H,m),4.18(4H,m),4.03(2H,m),3.66(2H,m),3.32(3H,m),2.80(2H,m),2.56(2H,m),2.35(1H,m),1.38(1H,m),1.26(2H,brs)。
实施例2:5-((3R,5S,6R)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-3-甲基-1-甲磺酰基-1,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑
步骤1:5-((3R,5S,6R)-5-叔丁氧羰基氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-3-甲基-1,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑
将(2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-氧代四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯(327mg,1mmol)、3-甲基-2,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑(123mg,1mmol)和冰醋酸(30mg,0.5mmol)加入1,2-二氯乙烷(10mL)中,室温搅拌2小时。冰浴冷却,加入三乙酰氧基硼氢化钠(672mg,3mmol),缓慢升至室温,搅拌过夜。加入饱和碳酸氢钠溶液,用二氯甲烷萃取,饱和盐水洗,干燥,浓缩,柱层析纯化,得到5-((3R,5S,6R)-5-叔丁氧羰基氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-3-甲基-1,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑(145mg),收率:33%。MS m/z[ESI]:435.2[M+1]。
步骤2:5-((3R,5S,6R)-5-叔丁氧羰基氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-3-甲基-1-甲磺酰基-1,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑
将5-((3R,5S,6R)-5-叔丁氧羰基氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-3-甲基-1,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑((145mg,0.33mmol)、三乙胺(53mg,0.53mmol)加入四氢呋喃(10mL)中,冰浴冷却,加入甲基磺酰氯(49mg,0.43mmol),搅拌反应2小时。倾入水中,加入二氯甲烷萃取,有机相干燥,柱层析纯化,得到5-((3R,5S,6R)-5-叔丁氧羰基氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-3-甲基-1-甲磺酰基-1,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑(16mg),收率:9.5%。MS m/z[ESI]:513.2[M+1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.21(1H,m),6.96(2H,m),4.52(1H,m),4.37-4.20(2H,m),4.08(2H,m),3.75(3H,m),3.39(1H,m),3.28(3H,s),3.07(1H,m),2.48(1H,m),2.26(3H,s),1.53(1H,m),1.27(9H,s)。
步骤3:5-((3R,5S,6R)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-3-甲基-1-甲磺酰基-1,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑
将5-((3R,5S,6R)-5-叔丁氧羰基氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-3-甲基-1-甲磺酰基-1,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑((16mg,0.031mmol)、苯磺酸(20mg,0.125mmol)加入二氯甲烷(0.7mL)中,室温下搅拌过夜。加入三乙胺(23mg,0.228mmol),旋干溶剂,柱层析纯化,得到5-((3R,5S,6R)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-3-甲基-1-甲磺酰基-1,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑(1.7mg),收率13%,MS m/z[ESI]:413.2[M+1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.16(1H,m),7.01(2H,m),4.30(1H,m),4.22(1H,m),4.10(1H,m),3.90-3.70(3H,m),3.42(1H,m),3.27(3H,s),3.02(2H,m),2.48(2H,m),2.26(3H,s),2.00(1H,m),1.60(1H,m)。
实施例3:5-((3R,5S,6R)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-5,6-二氢-4H-噻吩并[3,2-c]吡咯-2-羧酸
步骤1:5-((3R,5S,6R)-5-叔丁氧羰基氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-5,6-二氢-4H-噻吩并[3,2-c]吡咯-2-羧酸
参照实施例1中步骤1的方法,用5,6-二氢-4H-噻吩并[3,2-c]吡咯-2-羧酸盐酸盐(市售)代替2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物对甲苯磺酸盐,得到目标化合物,收率:44%。MS m/z[ESI]:481.1[M+1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=9.22(1H,s),7.56(1H,s),7.11(1H,m),6.96(2H,m),4.55(1H,m),4.30(2H,m),4.12(2H,m),3.96(2H,m),3.80(1H,m),3.47(1H,m),3.05(1H,m),2.52(1H,m),1.58(1H,m),1.26(9H,s)。
步骤2:5-((3R,5S,6R)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-5,6-二氢-4H-噻吩并[3,2-c]吡咯-2-羧酸
参照实施例1中步骤2的方法,用5-((3R,5S,6R)-5-叔丁氧羰基氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)-5,6-二氢-4H-噻吩并[3,2-c]吡咯-2-羧酸代替5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯,得到目标化合物,收率61%,MS m/z[ESI]:381.1[M+1]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ=7.35-7.10(3H,m),7.06(1H,s),4.12(2H,m),3.90(2H,m),3.76(2H,m),3.23(1H,m),2.82(2H,m),2.28(1H,m),1.37(1H,m)。
实施例4:(2R,3S,5R)-5-(5-甲磺酰基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺
步骤1:(2R,3S,5R)-5-(5-甲磺酰基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯
参照实施例1中步骤1的方法,用5-甲磺酰基异吲哚啉盐酸盐代替2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物对甲苯磺酸盐,得到目标化合物,收率:54%。MS m/z[ESI]:509.2[M+1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.83(1H,d,J=8.0Hz),7.82(1H,s),7.42(1H,d,J=8.0Hz),7.24(1H,m),6.97(2H,m),4.50(1H,m),4.32(2H,m),4.08(4H,m),3.80(1H,m),3.43(1H,t,J=10.6Hz),3.04(3H,s),2.95(1H,m),2.54(1H,m),1.54(1H,m),1.28(9H,s)。
步骤2:(2R,3S,5R)-5-(5-甲磺酰基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺
参照实施例1中步骤2的方法,用(2R,3S,5R)-5-(5-甲磺酰基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯代替5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯,得到目标化合物,收率68%,MS m/z[ESI]:409.1[M+1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.83(1H,d,J=8.0Hz),7.82(1H,s),7.42(1H,d,J=8.0Hz),7.17(1H,m),7.02(2H,m),4.28(1H,m),4.24(2H,d,J=9.6Hz),4.09(4H,m),3.45(1H,m),3.04(3H,s),2.92(2H,m),2.49(1H,m),1.47(1H,m),1.30(2H,brs)。
实施例5:(2R,3S,5R)-5-(5-甲磺酰胺基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺
步骤1:(2R,3S,5R)-5-(5-甲磺酰胺基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯
参照实施例1中步骤1的方法,用5-甲磺酰胺基异吲哚啉代替2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物对甲苯磺酸盐,收率:50%。MS m/z[ESI]:524.2[M+1]。
步骤2:(2R,3S,5R)-5-(5-甲磺酰胺基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺
参照实施例1中步骤2的方法,用(2R,3S,5R)-5-(5-甲磺酰胺基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯代替5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯,得到目标化合物,收率57%,MS m/z[ESI]:424.1[M+1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.24(1H,m),7.17(1H,m),7.07-6.90(4H,m),5.35(1H,s),4.35-4.20(2H,m),4.08(4H,m),3.65(2H,m),3.00(3H,s),2.82(1H,m),2.32(1H,m),1.47(1H,m),1.25(2H,brs)。
实施例6:(2R,3S,5R)-5-(5-溴异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺
步骤1:(2R,3S,5R)-5-(5-溴异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯
参照实施例1中步骤1的方法,用5-溴异吲哚啉代替2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物对甲苯磺酸盐,得到目标化合物,收率:62%。MS m/z[ESI]:509.1[M+1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.36(1H,s),7.34(1H,d,J=8.0Hz),7.23(1H,m),7.09(1H,d,J=8.0Hz),6.97(2H,m),4.49(1H,m),4.30(2H,m),3.94(4H,m),3.79(1H,m),3.42(1H,t,J=10.8Hz),2.92(1H,m),2.52(1H,d,J=10.8Hz),1.54(1H,m),1.27(9H,s)。
步骤2:(2R,3S,5R)-5-(5-溴异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺
参照实施例1中步骤2的方法,用(2R,3S,5R)-5-(5-溴异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯代替5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯,得到目标化合物,收率69%,MS m/z[ESI]:409.1[M+1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.37(1H,s),7.34(1H,d,J=8.0Hz),7.15(1H,m),7.10(1H,d,J=8.0Hz),7.02(2H,m),4.27(1H,m),4.22(1H,d,J=9.2Hz),3.99(4H,m),3.79(1H,m),3.42(1H,t,J=10.8Hz),2.87(2H,m),2.47(1H,d,J=10.8Hz),1.48(1H,m),1.32(2H,brs)。
实施例7:(2R,3S,5R)-5-(4-氯-5-甲磺酰基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺
步骤1:(2R,3S,5R)-5-(4-氯-5-甲磺酰基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯
参照实施例1中步骤1的方法,用4-氯-5-甲磺酰基异吲哚啉代替2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物对甲苯磺酸盐,得到目标化合物,收率:56%。MS m/z[ESI]:543.1[M+1]。
步骤2:(2R,3S,5R)-5-(4-氯-5-甲磺酰基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺
参照实施例1中步骤2的方法,用(2R,3S,5R)-5-(4-氯-5-甲磺酰基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯代替5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯,得到目标化合物,收率47%,MS m/z[ESI]:443.1[M+1]。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ=8.06(1H,d,J=7.6Hz),7.33(1H,d,J=7.6Hz),7.19(1H,m),6.99(2H,m),4.69(1H,m),4.22(4H,m),3.71(1H,m),3.33(1H,m),3.27(3H,s),2.91(1H,m),2.61(2H,m),1.52(1H,m),1.32(2H,brs)。
实施例8:2-((3R,5S,6R)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)异吲哚啉-5-磺酰胺
步骤1:2-((3R,5S,6R)-5-叔丁氧羰基氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)异吲哚啉-5-磺酰胺
参照实施例1中步骤1的方法,用异吲哚啉-5-磺酰胺盐酸盐代替2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物对甲苯磺酸盐,得到目标化合物,收率:46%。MS m/z[ESI]:510.2[M+1]。
步骤2:2-((3R,5S,6R)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)异吲哚啉-5-磺酰胺
参照实施例1中步骤2的方法,用2-((3R,5S,6R)-5-叔丁氧羰基氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基)异吲哚啉-5-磺酰胺代替5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯,得到目标化合物,收率37%,MS m/z[ESI]:410.1[M+1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.81(1H,d,J=7.6Hz),7.80(1H,s),7.37(1H,d,J=7.6Hz),7.17(1H,m),7.02(2H,m),4.79(2H,brs),4.28(1H,d,J=9.6Hz),4.23(1H,d,J=9.6Hz),4.07(4H,m),3.43(1H,t,J=10.8Hz),2.90(2H,m),2.49(1H,m),1.49(1H,m),1.31(2H,brs)。
实施例9:(2R,3S,5R)-5-(5-环丙磺酰基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺
步骤1:(2R,3S,5R)-5-(5-环丙磺酰基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯
参照实施例1中步骤1的方法,用5-环丙磺酰基异吲哚啉盐酸盐代替2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物对甲苯磺酸盐,得到目标化合物,收率:53%。MS m/z[ESI]:535.2[M+1]。
步骤2:(2R,3S,5R)-5-(5-环丙磺酰基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-胺
参照实施例1中步骤2的方法,用(2R,3S,5R)-5-(5-环丙磺酰基异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯代替5-(2,3,4,5,6,7-六氢吡咯并[3′,4′:3,4]吡唑并[1,5-b][1,2]噻嗪-1,1二氧化物-6-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯,得到目标化合物,收率80%,MS m/z[ESI]:435.2[M+1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.77(1H,d,J=8.0Hz),7.76(1H,s),7.42(1H,d,J=8.0Hz),7.17(1H,m),7.02(2H,m),4.30(2H,m),4.10(4H,m),3.54(1H,t,J=10.8Hz),3.24(1H,m),2.95(2H,m),2.45(1H,m),1.52(1H,m),1.28(2H,brs),1.05(2H,m),0.87(2H,m)。
生物实验例1:DPP-IV抑制活性的测定
采用以下方法来测定本申请的化合物对血浆中DPP-IV的抑制活性,该抑制活性以IC50值来表示,IC50即DPP-IV的活性被抑制50%时的化合物的浓度。
材料和方法:
材料:
a.白色384孔板(Perkin Elmer,Catalog No.607290/99)
b.HEPES缓冲液:用1M HEPES缓冲液(Invitrogen,Catalog No.15630-080)配制50mL 0.5M HEPES缓冲液:取1M HEPES缓冲液25mL,加适量ddH2O(重蒸水),用NaOH调节pH至7.8,最后加ddH2O至50ml。
c.大鼠血浆:大鼠眼眶取血,加肝素抗凝,4000rpm离心10分钟,取上清血浆作为DPP-IV的酶源。
d.DPP-IV酶反应底物H-Gly-Pro-AMC(甘氨酸-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素),由本申请的发明人合成,溶解于DMSO形成100mM母液。
e.1M MgCl2
f.1.5M NaCl
g.10%BAS
h.DMSO
i.ddH2O
j.待测化合物:阳性对照化合物Omarigliptin和部分本申请实施例化合物
按以下操作顺序进行:
1.配制DPP-IV酶反应缓冲液:50mM HEPES(pH=7.8),80mM MgCl2,150mM NaCl,1%BSA,放置于冰上备用;
2.用DMSO将待测化合物从10mM稀释至1mM(最终浓度的100倍),然后在96孔板上进行3倍梯度稀释,共11个浓度,第12孔加入DMSO作为空白对照,然后用酶反应缓冲液稀释25倍至最终浓度的4倍待用;
3.解冻DPP-IV酶反应底物H-Gly-Pro-AMC,用酶反应缓冲液稀释至160μM(4倍的最终浓度),并置于冰上备用;
4.解冻大鼠血浆,用酶反应缓冲液稀释100倍(2倍的最终浓度)并置于冰上备用;
5.在384孔板中加入5μL的待测化合物(4倍的最终浓度),然后加入10μL的大鼠血浆(2倍的最终浓度),离心混匀;
6.加入5μL酶反应底物H-Gly-Pro-AMC(4倍的最终浓度),离心混匀,用封膜封住384孔板;
7.在孵育箱(22-23℃)中孵育1小时;
8.使用FlexStationI3(Molecular devices)酶标仪读取反应的荧光信号:380nm激发,读取460nm波长的发射光谱;
9.化合物对DPP-IV抑制IC50的生成:使用GraFit6软件计算化合物的IC50值。
表1实施例化合物的DPP-IV抑制活性
生物实验例2:药代动力学参数的测定
采用以下方法测定本申请化合物的药代动力学参数。
研究使用7-9周龄健康雄性成年大鼠。每组动物(3雄性只大鼠)单次灌胃给药,剂量为5mg/kg,灌胃给药组的动物在实验前禁食过夜,禁食时间从给药前10小时至给药后4小时。
在给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小时采血。使用小动物麻醉机经异氟烷麻醉后通过眼底静脉丛采集0.3mL全血,放于肝素抗凝管中,样品于4℃、4000rpm离心5min,血浆转移至离心管中,并放于-80℃保存直到分析。
血浆样品分析使用已确证的液相色谱-串联质谱联用方法(LC-MS/MS)。个体动物的血浆浓度-时间数据用WinNonlin(专业版,版本6.3;Pharsight公司)软件进行分析。非房室模型被用于浓度分析。计算化合物的药代动力学参数,数据如下表2所示:
表2药代动力学参数
生物实验例3:CYP酶系的抑制IC50的测定
采用以下方法来测定本申请的化合物对CYP酶系的抑制IC50的测定。
将-80℃冰箱冻存的人肝微粒体置于冰上融化,刚刚融化后立即取100μL至60℃、100rpm的恒温振荡箱中孵育(1小时),剩余肝微粒体立即放入-80℃冰箱冻存。1小时后,取出100μL灭活的肝微粒体,加入400μL磷酸盐缓冲液混匀成4mg/mL灭活的肝微粒体溶液;另将-80℃冰箱冻存的人肝微粒体置于冰上融解,刚刚融解后取出100μL加入400μL磷酸盐缓冲液混匀成4mg/mL肝微粒体溶液,按照下表3平行配制阳性对照及测试品和阴性对照组孵育混合液:
表3阳性对照及测试品和阴性对照组孵育混合液
将混合液置于37℃、100rpm的恒温振荡箱中孵育5分钟。
取2.5μL测试品或阳性对照工作液(阴性对照组加入测试品工作液),加入91.5μL孵育混合液、6μLNADPH溶液并涡旋启动反应,将溶液置于37℃、100rpm的恒温振荡箱中孵育,孵育时间如下表4所示:
表4孵育时间
孵育相应时间后,加入200μL内标液(CYP2C19的内标液为100ng/mL氯霉素的乙腈溶液、其余内标液为250ng/mL华法林、500ng/mL普萘洛尔的乙腈溶液)终止反应,终止反应的样品于12000rpm离心10分钟,取上清液进样检测。
处理数据用Analyst1.4.2或等同软件。检测积分来确保所有的峰适当积分并且必要时调整积分参数。
分析物的定量被定义为分析物的峰面积与内标的峰面积之比。分析使用液相色谱-串联质谱联用方法(LC-MS/MS)。使用Graphpad Prism(版本5.03)软件计算IC50等参数,结果如下表5所示:
表5实施例4化合物对CYP酶系的抑制IC50(μM)
生物实验例4:肝微粒体代谢稳定性
采用以下方法来测定本申请的化合物的肝微粒体代谢稳定性。
取8μL人肝微粒体(20mg/mL)、20μL的NADPH、368μL 0.1M的磷酸盐缓冲液混合,在37℃中预孵育5分钟。分别加入4μL分析工作液(测试品或阳性对照),在37℃预孵育0、10、20、30、45和60分钟时,取50μL的孵育液加入150μL含内标(0.25M华法林)的乙腈;取4μL大鼠肝微粒体(20mg/mL)、10μL的NADPH、184μL 0.1M的磷酸盐缓冲液混合,在37℃中预孵育5分钟。分别加入2μL分析工作液(测试品或阳性对照),在37℃预孵育0、10、20、30、45和60分钟时,取20μL的孵育液加入180μL含内标(0.25M华法林)的乙腈。所有样品涡旋后于4000rpm离心15min,然后取150μL上清液加入96孔进样板。取5μL进LC/MS/MS系统检测。分析色谱柱为C18 1.7μm 2.1×50mm(Waters)。检测使用三重四极杆质谱(API4000,AB公司)。在正离子模式下检测CT-1225的峰面积与内标峰面积的比值。半衰期值为测试品/内标的峰面积与时间比值。结果数据如下表6所示:
表6实施例4化合物及参考化合物肝微粒体代谢稳定性
生物实验例5:单次给药对ob/ob小鼠血清DPP-IV活性的抑制作用
36只雌性ob/ob小鼠,随机分为6组,每组6只,分别为模型对照组、1mg/kg实施例4化合物组、3mg/kg实施例4化合物组、10mg/kg实施例4化合物组、30mg/kg实施例4化合物组和阳性对照30mg/kg Omarigliptin组。各组小鼠口服给予不同剂量的实施例4化合物或Omarigliptin,模型对照组口服给予0.25%CMC-Na,于给药前及给药后2、4、10、24、34、48、58、72和96h时取血,分离血清,测定血清DPP-IV的活性。
血清DPP-IV活性测定方法:取5μL血清样品,加入80mM MgCl2缓冲液45μL,混匀,室温中预孵浴5分钟,加入10μL 0.1mM反应底物Gly-Pro-7-AMC及40μL缓冲液,避光,混匀后每间隔3分钟进行一次荧光测定(激发波380nm/发射波460nm),直到18分钟,共测6次,根据测定结果减去空白本底后做时间—荧光值曲线,得斜率为活力值,以给药前0h时血清DPP-IV活力值为100%,按下列公式计算给药后各时间点血清DPP-IV的比活力值,比活力值(%)=给药后活力值/给药前活力值×100%。
试验结果:ob/ob小鼠单次口服给予不同剂量的实施例4化合物后,血清DPP-IV活性受到显著抑制,并呈剂量和时间依赖性。1mg/kg实施例4化合物给药后10h内小鼠血清DPP-IV活性抑制率高于70%,3mg/kg实施例4化合物给药后24h内血清DPP-IV活性抑制率高于70%,10mg/kg实施例4化合物给药后34h内血清DPP-IV活性抑制率高于70%,而30mg/kg实施例4化合物给药后72h内血清DPP-IV活性抑制率均维持在70%以上。阳性对照30mg/kgOmarigliptin组小鼠给药后34h内血清DPP-IV活性抑制率高于70%。