CN110988076B

CN110988076B - 直接电子转移型氧化还原酶修饰分子识别元件

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Publication number: CN110988076B
Application number: CN201910948376.8A
Authority: CN
Inventors: 早出广司; 高桥由香; 岛崎顺子; 塚田理志; 村濑阳介
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2018-10-03
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2024-04-05
Anticipated expiration: 2039-10-08
Also published as: CN110988076A; EP3640344B1; EP3640344A1; US11293921B2; US20200110080A1; JP2020076747A; EP3640344C0; JP7339838B2

Abstract

本发明提供一种直接电子转移型氧化还原酶修饰分子识别元件，其包含靶分子识别部位以及与该靶分子识别部位连结的直接电子转移型氧化还原酶。

Description

直接电子转移型氧化还原酶修饰分子识别元件

技术领域

本发明涉及能够在免疫传感器等生物传感技术中使用的新的分子识别元件。

背景技术

在使用了利用现有的酶等标记的抗体的ELISA等免疫检测中，在使抗原与抗体反应后，为了除去非特异信号，需要进行侧向流(Lateral Flow)等清洗操作来对未与抗原结合的抗体进行分离(B/F分离)。但是，包括B/F分离的步骤会增加检测所耗费的工时、时间，此外分离清洗的效率还会对信号精度产生影响。

作为抗体的标记中使用的酶，广泛使用过氧化酶、碱性磷酸酶。另外，非专利文献1中公开了一种使用标记有葡萄糖氧化酶(GOD)的抗体的电化学式免疫测定法。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：FEBS LETTERS June 1977DOI:10.1016/0014-5793(77)80317-7

发明内容

发明所要解决的课题

在非专利文献1所公开的方法中，通过上述GOD与底物的反应而产生的电子被转换成过氧化氢，过氧化氢扩散到溶液中，在电极表面被还原，由此产生信号。因此，在反应体系中，由于非特异性吸附等，存在于电极附近的抗体-GOD所生成的信号会成为噪声，因此需要经历充分的清洗步骤。另外，在非特异性吸附牢固的情况下、或作为靶分子的抗原非特异性地吸附的情况下，难以完全去除非特异信号，此外，根据与抗体结合的GOD与电极间的环境，通过清洗去除噪声成分也存在极限。

本发明的课题在于提供能够用于免疫传感器等生物传感技术的新的分子识别元件。

用于解决课题的手段

根据本发明的一个方式，提供一种分子识别元件，其包含靶分子识别部位以及与该靶分子识别部位连结的直接电子转移型氧化还原酶。

根据本发明的另一方式，提供上述分子识别元件，其中，靶分子识别部位包含靶分子识别蛋白。

根据本发明的另一方式，提供上述分子识别元件，其中，靶分子为抗原，靶分子识别部位为针对该抗原的抗体。

根据本发明的另一方式，提供上述分子识别元件，其中，直接电子转移型氧化还原酶为包含电子传递部位或电子传递亚基的氧化还原酶。

根据本发明的另一方式，提供上述分子识别元件，其中，电子传递部位为包含血红素的结构域、或者电子传递亚基为包含血红素的亚基。

根据本发明的另一方式，提供上述分子识别元件，其中，氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。

根据本发明的另一方式，提供上述分子识别元件，其中，上述靶分子识别部位与上述直接电子转移型氧化还原酶通过交联剂进行连结。

根据本发明的另一方式，提供上述分子识别元件，其中，上述分子识别元件包含上述靶分子识别部位与上述直接电子转移型氧化还原酶的融合蛋白。

根据本发明的另一方式，提供一种传感器，其包含电极以及固定在电极上的上述分子识别元件。

根据本发明的另一方式，提供上述传感器，其中，分子识别元件藉由单分子膜形成分子被固定在电极上。

根据本发明的另一方式，提供一种靶分子的测定方法，其包括将包含靶分子的试样导入至上述传感器中的步骤、以及对基于靶分子而产生的信号进行检测的步骤。

根据本发明的另一方式，提供一种靶分子测定用试剂，其包含上述分子识别元件。

发明的效果

根据本发明的一个方式，通过将直接电子转移型氧化还原酶与抗体这样的分子识别元件连结，可构建出能够将电子直接传递至电极的分子识别元件。

根据有无抗原-抗体的结合，能够区分由直接电子转移型氧化还原酶产生的直接电子传递信号的变化，因此能够构建出不受非特异性结合的影响、不需要充分的清洗操作的测定系统。

由此，可期待构建出避免了非特异吸附的影响的电化学式免疫传感器。

附图说明

图1是示出抗CRPIgG与GDH的交联过程的图。

图2是示出用于确认IgG-GDH与CRP的相互作用的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的图(照片)。

图3是示出利用包含IgG-GDH固定化电极的传感器的葡萄糖氧化电流的测定结果的图。

图4-1是示出抗CRP半抗体(rIgG)的制备过程的图。

图4-2是示出抗CRP半抗体与GDH的交联过程的图。

图5是示出用于确认rIgG-GDH与CRP的相互作用的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的图(照片)。

图6是示出利用包含rIgG-GDH固定化电极的传感器得到的葡萄糖氧化电流的测定结果的图。

图7是示出抗CRP单链抗体与GDH的融合蛋白(GDH-scFv(GGGGS))的制作过程的图。

图8是示出用于确认GDH-scFv(GGGGS)与CRP的相互作用的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的图(照片)。

图9是示出利用包含GDH-scFv(GGGGS)固定化电极的传感器得到的葡萄糖氧化电流的测定结果的图。

具体实施方式

<分子识别元件>

分子识别元件包含靶分子识别部位以及与该靶分子识别部位连结的直接电子转移型氧化还原酶。下文中有时也称为本发明的分子识别元件。

<靶分子>

靶分子的种类没有特别限制，例如可以举出低分子化合物、肽、蛋白质、激素、糖、毒素、病毒颗粒、金属等。

<靶分子识别部位>

靶分子识别部位可以根据靶分子的种类进行选择，例如可以例示识别作为靶分子的抗原的抗体、识别作为靶分子的激素的受体蛋白等靶分子识别蛋白、识别作为靶分子的低分子化合物或肽的核酸适配体、识别作为靶分子的糖的凝集素等。识别靶分子包括与靶分子结合。

在靶分子识别部位为蛋白质的情况下，其长度优选为50个氨基酸以上，例如为100个氨基酸以上、250个氨基酸以上、50～500个氨基酸。

在靶分子识别部位为抗体的情况下，作为抗体，可以为IgG、IgE或IgA，可以为半抗体也可以为单链抗体(scFv)。此外，只要具有靶分子识别能力，还可以为这些抗体的部分片段。

<直接电子转移型氧化还原酶>

“直接电子转移型氧化还原酶”是指直接在酶与电极间进行电子授受的类型的氧化还原酶。在使用直接电子转移型氧化还原酶的情况下，由该氧化还原反应产生的电子在没有氧化还原分子这样的人工电子受体(电子传递介质)之类的氧化还原物质参与的情况下直接在酶与电极间进行授受。

直接电子转移型氧化还原酶可以包含电子传递亚基或电子传递结构域。作为电子传递亚基，例如可以举出含有血红素的亚基，作为电子传递结构域，可以举出含有血红素的结构域。作为该含有血红素的亚基或结构域，可以举出含有血红素c或血红素b的亚基或结构域，更具体地说，可以举出含有细胞色素c或细胞色素b等细胞色素的亚基或结构域。

作为具有含血红素c的结构域的氧化还原酶，例如可以使用国际公开WO2005/030807号公报中公开的PQQ葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)与细胞色素c的融合蛋白。

另外，还可以使用胆固醇氧化酶、醌血红素乙醇脱氢酶。

另一方面，具有含血红素的亚基的氧化还原酶优选使用至少包含催化亚基和含血红素的亚基的低聚物酶。

包含含血红素的亚基的低聚物型的氧化还原酶已知有很多，例如可以例示葡萄糖脱氢酶(GDH)、山梨糖醇脱氢酶(Sorbitol DH)、D-果糖脱氢酶(Fructose DH)、D-葡糖苷-3-脱氢酶(Glucoside-3-Dehydrogenase)、纤维二糖脱氢酶、乳酸脱氢酶。

其中，优选葡萄糖脱氢酶(GDH)，GDH的催化亚基可以包含黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。

作为具有包含FAD的催化亚基的GDH的一例，可以举出来源于洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)的GDH。该催化亚基(α亚基)的氨基酸序列的一例由序列号3表示。该催化亚基可以具有置换、缺失、插入等突变，作为来源于洋葱伯克氏菌的FAD依赖性GDH的催化亚基的突变体，可以举出：472位和475位氨基酸残基发生了置换的突变体(WO 2005/103248)；326位、365位和472位氨基酸残基发生了置换的突变体(日本特开2012-090563)；365位以及326、472、475和529位等发生了置换的突变体(WO 2006/137283)；等等。但是，突变体并不限于这些，在其他位置也可以包含突变。如实施例中所记载，GDH可以在催化亚基的463位具有氨基酸置换(置换为半胱氨酸)。关于GDH的催化亚基，只要不抑制其活性，可以在序列号3的氨基酸序列中具有1～10个、例如1、2、3、4或5个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。

含血红素的亚基的种类没有特别限制，例如可以举出来源于洋葱伯克氏菌的GDH的含细胞色素的亚基(β亚基)，该氨基酸序列的一例由序列号4表示。含细胞色素的亚基可以具有置换、缺失、插入等突变。关于GDH的含血红素的亚基，只要不抑制其功能，可以在序列号4的氨基酸序列中具有1～10个、例如1、2、3、4或5个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。

GDH可以为包含上述催化亚基和含细胞色素的亚基的低聚物，除了上述催化亚基和含细胞色素的亚基以外，还可以包含调节亚基。来源于洋葱伯克氏菌的GDH的调节亚基(γ亚基)的氨基酸序列的一例由序列号2表示。其中，γ亚基可以具有置换、缺失、插入等突变。关于GDH的调节亚基，只要不抑制其活性，可以在序列号2的氨基酸序列中具有1～10个、例如1、2、3、4或5个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。

需要说明的是，作为一例，在序列号1中示出了洋葱伯克氏菌KS1株的包含GDHγ亚基基因、α亚基基因以及β亚基基因的染色体DNA片段的碱基序列。该碱基序列中存在3个开放读码框(ORF)，从5’末端侧起的第1个ORF(碱基序号258-761)编码γ亚基(序列号2)，第2个ORF(碱基序号764-2380)编码α亚基(序列号3)，第3个ORF(碱基序号2386-3660)编码β亚基(序列号4)。

<靶分子识别部位与直接电子转移型氧化还原酶的连结>

关于靶分子识别部位与直接电子转移型氧化还原酶的连结方式，只要是不会显著抑制靶分子识别部位的靶分子识别能力和直接电子转移型氧化还原酶的酶活性的方法就没有特别限制，优选靶分子识别部位与直接电子转移型氧化还原酶通过共价键进行连结，在一个方式中，靶分子识别部位与直接电子转移型氧化还原酶通过交联剂进行连结。

例如，可以向靶分子识别部位导入交联剂(交联性反应基团)，使直接电子转移型氧化还原酶所具有的巯基、氨基、羧基等反应性官能团与交联剂发生反应而使两者交联，由此将靶分子识别部位与直接电子转移型氧化还原酶连结。

另外，例如可以利用交联剂向直接电子转移型氧化还原酶中导入交联性反应基团，使靶分子识别部位所具有的巯基、氨基、羧基等反应性官能团与交联剂发生反应而使两者交联，由此将靶分子识别部位与直接电子转移型氧化还原酶连结。

上述反应性官能团可以是靶分子识别部位、直接电子转移型氧化还原酶本来所具有的官能团，也可以是通过氨基酸置换、氨基酸导入等人为地导入的官能团。另外，上述反应性官能团可以是蛋白质中存在的氨基那样的2个以上的非特定的官能团，也可以是蛋白质中存在的巯基那样的1～数个程度的特定的官能团。

例如，在靶分子识别部位为抗体(IgG)的情况下，可以例示将抗体(IgG)还原而生成的半抗体(rIgG)的巯基等，关于直接电子转移型氧化还原酶，可以例示在直接电子转移型氧化还原酶的氨基酸序列中存在的半胱氨酸残基的巯基等。

作为交联剂，可以使用公知的交联剂，例如，作为与巯基反应的交联剂，可以举出马来酰亚胺化合物、卤代乙酸化合物、吡啶基二硫醚化合物、硫代砜化合物、乙烯砜化合物等。另外，作为与氨基反应的交联剂，可以举出NHS酯化合物、酰亚胺酯化合物、五氟苯基酯化合物、羟基甲基膦化合物等。另外，作为与羧基反应的交联剂，可以举出噁唑啉化合物等。

在其他方式中，通过将靶分子识别部位与直接电子转移型氧化还原酶制成融合蛋白而将两者连结。

融合蛋白例如可以如下得到：将编码靶分子识别部位的碱基序列与编码直接电子转移型氧化还原酶的碱基序列按照使两者的密码子读码框一致来进行翻译、作为靶分子识别部位与直接电子转移型氧化还原酶的融合蛋白进行表达的方式连结而制作基因构建体，使该基因构建体在适当的宿主中进行表达，由此得到该融合蛋白。靶分子识别部位和直接电子转移型氧化还原酶中的任一者可以配置在融合蛋白的N末端侧。另外，可以藉由适当的肽连接子将两者连结。此外，融合蛋白还可以附加有检测用或纯化用的标签序列等。

编码直接电子转移型氧化还原酶的碱基序列根据直接电子转移型氧化还原酶的种类适当地选择，可以使用公知的序列，例如可以举出编码上述来源于洋葱伯克氏菌的GDH的碱基序列。

另外，编码靶分子识别部位的碱基序列根据靶分子识别部位的种类适当地选择，可以使用编码抗体的碱基序列等公知的序列，例如，作为编码抗CRP单链抗体的碱基序列，可以举出Journal of Bioscience and Bioengineering Volume 105,Issue 3,March2008,Pages 261-272中记载的序列。

编码融合蛋白的DNA的制作、在宿主中的表达、纯化等可以利用公知的基因重组技术来进行。

<传感器>

本发明的一个方式的传感器包含电极以及固定在电极上的分子识别元件。由于使用直接电子转移型氧化还原酶，因而可以成为不包含上述的电子传递介质的构成。

作为电极，可以举出由公知的电极材料构成的电极，例如可以举出金电极、铂电极、碳电极。

传感器包含固定有本发明的分子识别元件的电极作为工作电极，可以进一步包含对电极(铂等)和/或参比电极(Ag/AgCl等)。

传感器可以进一步包含用于放入被检试样的恒温池、对工作电极施加电压的电源、电流计、记录仪等。

这样的酶传感器的结构在该技术领域中是熟知的，例如记载于Biosensors-Fundamental and Applications-Anthony,P.F.Turner,Isao Karube and GerogeS.Wilson,Oxford University Press,1987中。

在本发明的分子识别元件向电极上的固定中，为了使分子识别元件中包含的氧化还原酶可作为直接电子转移型氧化还原酶发挥功能，需要以氧化还原酶靠近电极进行配置的状态将分子识别元件固定于电极上。需要说明的是，据称，在生理学反应体系中发生直接电子转移的极限距离为1～2nm。因此，为了无损于从氧化还原酶到电极的电子转移，优选按照氧化还原酶分子与电极的距离为1～2nm以下的方式进行配置。

作为用于此的方法没有特别限制，例如可以举出：利用交联剂等将包含氧化还原酶的分子识别元件化学固定于电极上的方法；使用粘结剂等将包含氧化还原酶的分子识别元件间接地固定于电极上的方法；使包含氧化还原酶的分子识别元件物理吸附于电极上的方法；等等。

作为利用交联剂等将包含氧化还原酶的分子识别元件化学固定于电极上的方法，可以是将包含酶的分子识别元件直接固定于电极上的方法，可以例示日本特开2017-211383所公开的方法。即为下述方法：在电极上固定单分子膜(SAM)形成分子，藉由该SAM形成分子来固定包含酶的分子识别元件。

单分子膜形成分子是与电极结合且能够结合包含酶分子的分子识别元件的化合物，其是能够通过按一定方向在电极表面结合多个而形成单分子膜的化合物。通过使用单分子膜形成分子，能够控制电极与酶分子间的距离。

单分子膜形成分子优选具有与电极具有亲和性的第一官能团、间隔部位、以及可与包含酶分子的分子识别元件所具有的官能团发生反应的第二官能团。更优选具有下述结构：与电极具有亲和性的第一官能团结合在间隔部位的第一端，可与包含酶分子的分子识别元件所具有的官能团发生反应的第二官能团结合在间隔部位的第二端。此处，作为与电极具有亲和性的第一官能团，在电极为金属的情况下，可以举出巯基或二硫基，在电极为碳的情况下，可以举出芘、卟啉。

作为可与酶分子所具有的官能团发生反应的第二官能团，例如在与包含酶分子的分子识别元件所具有的氨基(包括末端氨基和侧链氨基)发生反应的情况下，可以举出琥珀酰亚胺基，在与包含酶分子的分子识别元件所具有的羧基(包括末端羧基和侧链羧基)发生反应的情况下，可以举出噁唑啉基。

例如，作为具有巯基或二硫基的单分子膜形成分子，可以例示具有以下结构的化合物。

需要说明的是，L为间隔子，X为可与酶分子所具有的官能团发生反应的官能团、例如琥珀酰亚胺基或巯基。作为间隔子的种类，例如可以举出碳原子数为1～20(例如3～7)的亚烷基、碳原子数为1～20(例如3～7)的亚烯基、碳原子数为1～20(例如3～7)的亚炔基、聚合度为2～50的聚乙二醇、氨基酸残基为1～20的低聚肽等。碳原子数为1～20的亚烷基、碳原子数为1～20的亚烯基、碳原子数为1～20的亚炔基中的若干个-CH₂-可以被置换为-O-。

SH-L-X···(1)

X-L-S-S-L-X···(2)

作为这样的化合物，可以例示以下的DSH等。

[化1]

例如，作为具有芘或卟啉的单分子膜形成分子，可以例示具有下述结构的化合物。

需要说明的是，Py为芘，Po为卟啉，L为间隔子，X为可与酶分子所具有的官能团发生反应的官能团。作为间隔子的种类，例如可以举出碳原子数为1～20的亚烷基、碳原子数为1～20的亚烯基、碳原子数为1～20的亚炔基、聚合度为2～50的聚乙二醇、氨基酸残基为1～20的低聚肽等。

Py-L-X···(3)

Po-L-X···(3’)

例如，作为具有芘的单分子层形成分子，可以例示具有下述结构的化合物。

[化2]

[化3]

<靶分子的测定方法>

本发明的一个方式的靶分子的测定方法包括将包含靶分子的试样导入至传感器中的步骤、以及对基于靶分子而产生的信号进行检测的步骤。

试样只要是包含靶分子的试样就没有特别限制，优选来源于生物体的试样，可以举出由血液得到的试样、由尿得到的试样、细胞提取试样、细胞培养液等。

将试样导入至传感器中的步骤没有特别限制，例如可以举出将试样液添加至传感器上的步骤、将传感器浸渍在试样液中的步骤等。

本发明的分子识别元件中，在靶分子与靶分子识别部位结合之前和之后，通过在电极附近发生酶反应时的底物的氧化还原反应而产生的直接电子转移反应所伴随的电流值、电压信号值(开路电位；Open circuit potential：OCP)、电阻值(阻抗)等发生很大变化。因此，可以通过以该电流值、电压信号值(开路电位；Open circuit potential：OCP)或电阻值(阻抗)等的变化作为信号进行检测而对靶分子进行检测和定量。

例如，在本发明的分子识别元件为抗体与CyGDH的复合物、使用将该复合物固定于电极上而成的传感器的情况下，向传感器中添加包含抗原的试样时，抗原与抗体结合，由此，CyGDH的直接电子转移能力发生变动。向其中添加作为CyGDH的底物的葡萄糖时，发生酶反应，由此产生的电子藉由血红素被传递至电极，流通与抗原的量相应的电流，因此通过测定该电流值，能够对抗原的量进行测定。

本发明的测定方法中，利用基于直接电子转移而产生的电流值来检测靶分子的浓度，因此具有能够抑制非特异性信号、能够省略清洗步骤这样的B/F分离的优点。

<靶分子测定用试剂>

本发明的靶分子测定用试剂包含本发明的分子识别元件。

靶分子测定用试剂可以进一步包含反应底物、反应缓冲液等。

另外，在对夹心法抗原等靶分子进行分析的情况下，可以包含与本发明的分子识别元件中包含的靶分子结合部位不同的靶分子结合物质。

例如，准备与靶分子(抗原)结合的抗体，将其固定在电极上。

向该固定有抗体的电极上添加含有靶分子的试样，使靶分子与电极上的抗体(第一抗体)结合。

向其中添加针对该抗原的抗体(第二抗体)以及连结有直接电子转移型氧化还原酶的本发明的靶分子，由此在电极上形成第一抗体-抗原-第二抗体-氧化还原酶的复合物。即，与抗原的存在量相应地在电极附近募集氧化还原酶。通过在此处使氧化还原酶的底物反应而发生氧化还原反应，由此产生的电子在氧化还原酶的电子传递部位或电子传递亚基与电极间进行授受，流通与抗原的存在量相应的电流。

因此，可以通过测定该电流值、电压信号值(开路电位；Open circuit potential：OCP)、电阻值(阻抗)等来对靶分子进行检测、定量。即，与现有已知的使用酶作为标记剂的免疫测量相比，其检测原理为基于直接电子转移反应进行测量，因此，由于在电极附近不存在不与抗原结合而游离在溶液中的该分子，因而不产生信号，只有与抗原结合的该分子产生信号。因此，与现有方法相比，能够大幅降低清洗操作等排除非特异性吸附的处理。

[实施例]

接着举出实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。

[实施例1]

作为包含含细胞色素C亚基的GDH，使用来源于洋葱伯克氏菌(B.cepacia)的CyGDH。来源于洋葱伯克氏菌的CyGDH是由γ、α、β这3个亚基构成的低聚物酶，在具有序列号1的碱基序列的基因上编码这3个亚基。

本实施例中，利用与IgG的结合，因此使用将α亚基的463位氨基酸残基置换成半胱氨酸残基的突变体。具体地说，使用在日本特开2012-090563中记载的GDH表达用质粒pTrc99Aγαβ中对α亚基导入了突变的pTrc99Aγα(463C)β，使其表达突变型GDH，并用于以下的实验中。

使用交联剂GMBS(同仁化学)将抗人CRP(C反应蛋白)单克隆抗体(小鼠CRP-MCA(Oriental Yeast)、以下称为IgG)的NH₂基与上述制作的含细胞色素C的GDH的α亚基中所导入的半胱氨酸残基的SH基进行交联，由此制作IgG-GDH复合物。将具体过程示于图1。

对于所得到的IgG-GDH复合物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和活性染色确认CRP结合能力。将结果示于图2。将泳道7(无CRP)与泳道8(添加CRP)比较时，泳道8的800KDa附近的条带变浅。认为这是由于通过CRP与IgG结合而使IgG-GDH复合物的分子量向大分子量侧偏移所致的，可确认到IgG-GDH复合物能够结合CRP。

接着，将上述IgG-GDH复合物固定于表面修饰有SAM形成分子(DSH)的金线电极上。

过程如下。

[表1]

使用所得到的IgG-GDH复合物固定化电极，在不含介质的溶液中添加葡萄糖使其反应，由此研究通过IgG-GDH复合物中的GDH的葡萄糖氧化反应是否产生了从GDH的含细胞色素C的亚基向电极的直接电子转移。

实验过程如下。

[表2]

将结果示于图3。

IgG-GDH固定化电极显示出与作为对照的IgG未标记GDH(463Cys)固定化电极同等水平的葡萄糖浓度依赖性氧化电流(右)。

由此暗示出，被募集到电极附近的IgG-GDH复合物能够将通过GDH的催化活性产生的电子传递至电极。

[实施例2]

作为包含含细胞色素C亚基的GDH，使用来源于洋葱伯克氏菌的野生型GDH。使用日本特开2012-090563中记载的GDH表达用质粒pTrc99Aγαβ表达野生型GDH，并用于以下的实验中。

使用交联剂GMBS(同仁化学)将对抗人CRP单克隆抗体(小鼠CRP-MCA(OrientalYeast))进行还原处理而得到的半抗体(以下称为rIgG)的SH基与上述野生型GDH的各亚基蛋白中包含的氨基进行交联，制作出CRP半抗体-GDH复合物(rIgG-GDH)。

将半抗体制作过程示于图4-1，将半抗体-GDH复合物制作过程示于图4-2。

对于所得到的rIgG-GDH复合物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和活性染色确认CRP结合能力。将结果示于图5。将泳道18(无CRP)与泳道21(添加CRP)比较时，泳道18的800KDa附近的条带变浅。认为这是由于通过CRP与半抗体结合而使rIgG-GDH复合物的分子量向大分子量侧偏移所致的，可确认到rIgG-GDH复合物能够结合CRP。

使用Fortebio公司的蛋白质间相互作用分析装置Blitz调查rIgG-GDH对CRP的亲和性。其结果，如表中所示，确认到rIgG-GDH对CRP具有与CRP-MCA同等的亲和性。

[表3]

接着，将上述rIgG-GDH复合物固定于表面修饰有SAM形成分子1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PyNHS)的碳印刷电极(DEP芯片)上。

过程如下。

[表4]

使用所得到的rIgG-GDH复合物固定化电极，在不含介质的溶液中添加葡萄糖使其反应，由此研究通过rIgG-GDH复合物中的GDH的葡萄糖氧化反应是否产生了从GDH的含细胞色素C的亚基向电极的直接电子转移。

需要说明的是，作为对照，制作并使用浇注了rIgG和GDH的等量混合液(非复合物)的传感器。实验分别以n＝2进行。

实验过程如下。

[表5]

将结果示于图6。

与rIgG和GDH未经交联而固定化的电极相比，rIgG-GDH固定化电极的电流值低，但显示出葡萄糖浓度依赖性氧化电流。由此暗示出，募集到电极附近的rIgG-GDH复合物能够将通过GDH的催化活性产生的电子传递至电极。

[实施例3]

制作将与人CRP具有亲和性的scFv(现有技术文献2)导入至来源于洋葱伯克氏菌的野生型GDH的电子传递亚基(β亚基)的C末端而成的融合蛋白(GDH-scFv)。图7中示出了GDH-scFv融合蛋白的制作过程。GDH的β亚基与scFv由GGGGS连接子(序列号5)连结，将GDH-scFv融合蛋白记为GDH-scFv(GGGGS)。

对于所得到的GDH-scFv(GGGGS)，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和活性染色确认CRP结合能力。将结果示于图8。将泳道15(无CRP)与泳道16(添加CRP)比较时，泳道18的GDH-scFv的条带向大分子量侧偏移+100kDa的程度(存在多条条带被认为是由于形成了多聚体)。认为这是由于通过CRP与scFv结合而使GDH-scFv(GGGGS)的分子量向大分子量侧偏移所致的，可确认到GDH-scFv融合蛋白能够结合CRP。

接着，将上述GDH-scFv(GGGGS)固定于表面修饰有SAM形成分子1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PyNHS)的碳电极(SPCE)上。

过程如下。

[表6]

使用所得到的GDH-scFv(GGGGS)固定化电极，在不含介质的溶液中添加葡萄糖和CRP(0、0.1、0.5或2mg/ml)使其反应，由此研究通过GDH-scFv(GGGGS)中的GDH的葡萄糖氧化反应是否产生了从GDH的含细胞色素C的亚基向电极的直接电子转移。

实验过程如下。

[表7]

将结果示于图9。

GDH-scFv(GGGGS)固定化电极显示出葡萄糖浓度依赖性氧化电流。由此暗示出，募集到电极附近的GDH-scFv(GGGGS)能够将通过GDH的催化活性产生的电子传递至电极。但是，未观察到CRP浓度依赖性。

序列表

<110> 爱科来株式会社(Arkray, Inc.)

究极酵素国际股份有限公司(Ultizyme International Ltd.)

<120> 直接电子转移型氧化还原酶修饰分子识别元件(Molecular recognitionelement modified with a direct electron transfer

type oxidoreductase)

<130> OP-19277

<150> JP2018-188675

<151> 2018-10-03

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3706

<212> DNA

<213> 洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)

<220>

<221> CDS

<222> (258)..(761)

<220>

<221> CDS

<222> (764)..(2380)

<220>

<221> CDS

<222> (2386)..(3660)

<400> 1

aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60

gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120

tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180

tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240

gttcgagaga aggaaacatg cacaacgac aacactccc cactcgcgtc gc 290

Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg

1 5 10

cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa 338

His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln

15 20 25

ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg 386

Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu

30 35 40

cgggcgctt gcagacaac cccggcact gcgccgctc gatacgttc atg 434

Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met

45 50 55

acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc 482

Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile

60 65 70 75

ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc 530

Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala

80 85 90

gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg 578

Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr

95 100 105

cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc 626

Pro Glu Gln Glu Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu

110 115 120

ggc atc gtc gac aac gtc gtg att acg tac gag gaa gca tta atg ttc 674

Gly Ile Val Asp Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe

125 130 135

ggc gtc gtg tcc gat acg ctc gtg atc cgt tcg tat tgc ccc aac aaa 722

Gly Val Val Ser Asp Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys

140 145 150 155

ccc ggc ttc tgg gcc gac aaa ccg atc gag agg caa gcc tg atg gcc 769

Pro Gly Phe Trp Ala Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala Met Ala

160 165 170

gat acc gat acg caa aag gcc gac gtc gtc gtc gtt gga tcg ggt gtc 817

Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser Gly Val

175 180 185

gcg ggc gcg atc gtc gcg cat cag ctc gcg atg gcg ggc aag gcg gtg 865

Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys Ala Val

190 195 200

atc ctg ctc gaa gcg ggc ccg cgc atg ccg cgc tgg gaa atc gtc gag 913

Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile Val Glu

205 210 215

cgc ttc cgc aat cag ccc gac aag atg gac ttc atg gcg ccg tac ccg 961

Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro Tyr Pro

220 225 230

tcg agc ccc tgg gcg ccg cat ccc gag tac ggc ccg ccg aac gac tac 1009

Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn Asp Tyr

235 240 245 250

ctgatcctg aagggcgag cacaagttc aactcgcag tacatccgc gcg 1057

Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile Arg Ala

255 260 265

gtg ggc ggc acg acg tgg cac tgg gcc gcg tcg gcg tgg cgc ttc att 1105

Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg Phe Ile

270 275 280

ccg aac gac ttc aag atg aag agc gtg tac ggc gtc ggc cgc gac tgg 1153

Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg Asp Trp

285 290 295

ccg atc cag tac gac gat ctc gag ccg tac tat cag cgc gcg gag gaa 1201

Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Glu

300 305 310

gag ctc ggc gtg tgg ggc ccg ggc ccc gag gaa gat ctg tac tcg ccg 1249

Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr Ser Pro

315 320 325 330

cgc aag cag ccg tat ccg atg ccg ccg ctg ccg ttg tcg ttc aac gag 1297

Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe Asn Glu

335 340 345

cag acc atc aag acg gcg ctg aac aac tac gat ccg aag ttc cat gtc 1345

Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe His Val

350 355 360

gtg acc gag ccg gtc gcg cgc aac agc cgc ccg tac gac ggc cgc ccg 1393

Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly Arg Pro

365 370 375

act tgt tgc ggc aac aac aac tgc atg ccg atc tgc ccg atc ggc gcg 1441

Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile Gly Ala

380 385 390

atg tac aac ggc atc gtg cac gtc gag aag gcc gaa cgc gcc ggc gcg 1489

Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala Gly Ala

395 400 405 410

aag ctg atc gag aac gcg gtc gtc tac aag ctc gag acg ggc ccg gac 1537

Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly Pro Asp

415 420 425

aag cgc atc gtc gcg gcg ctc tac aag gac aag acg ggc gcc gag cat 1585

Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala Glu His

430 435 440

cgc gtc gaa ggc aag tat ttc gtg ctc gcc gcg aac ggc atc gag acg 1633

Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile Glu Thr

445 450 455

ccgaagatc ctgctgatg tccgcgaac cgcgatttc ccgaacggt gtc 1681

Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn Gly Val

460 465 470

gcg aac agc tcg gac atg gtc ggc cgc aac ctg atg gac cat ccg ggc 1729

Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly

475 480 485 490

acc ggc gtg tcg ttc tat gcg agc gag aag ctg tgg ccg ggc cgc ggc 1777

Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly Arg Gly

495 500 505

ccg cag gag atg acg tcg ctg atc ggt ttc cgc gac ggt ccg ttc cgc 1825

Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro Phe Arg

510 515 520

gcg acc gaa gcg gcg aag aag atc cac ctg tcg aac ctg tcg cgc atc 1873

Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ile

525 530 535

gac cag gag acg cag aag atc ttc aag gcc ggc aag ctg atg aag ccc 1921

Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met Lys Pro

540 545 550

gac gag ctc gac gcg cag atc cgc gac cgt tcc gca cgc tac gtg cag 1969

Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr Val Gln

555 560 565 570

ttc gac tgc ttc cac gaa atc ctg ccg caa ccc gag aac cgc atc gtg 2017

Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg Ile Val

575 580 585

ccg agc aag acg gcg acc gat gcg atc ggc att ccg cgc ccc gag atc 2065

Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu Ile

590 595 600

acg tat gcg atc gac gac tac gtg aag cgc ggc gcc gcg cat acg cgc 2113

Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His Thr Arg

605 610 615

gag gtc tac gcg acc gcc gcg aag gtg ctc ggc ggc acg gac gtc gtg 2161

Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp Val Val

620 625 630

ttc aac gac gaa ttc gcg ccg aac aat cac atc acg ggc tcg acg atc 2209

Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile

635 640 645 650

atg ggc gcc gat gcg cgc gac tcc gtc gtc gac aag gac tgc cgc acg 2257

Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr

655 660 665

ttcgaccat ccgaacctg ttcatttcg agcagcgcg acgatgccg acc 2305

Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met Pro Thr

670 675 680

gtc ggt acc gta aac gtg acg ctg acg atc gcc gcg ctc gcg ctg cgg 2353

Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala Leu Arg

685 690 695

atg tcg gac acg ctg aag aag gaa gtc tgacc gtg cgg aaa tct act ctc 2403

Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val Met Arg Lys Ser Thr Leu

700 705 710

act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg ccg ggc ttc gcg cgc gcg 2451

Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu Pro Gly Phe Ala Arg Ala

715 720 725

gcc gat gcg gcc gat ccg gcg ctg gtc aag cgc ggc gaa tac ctc gcg 2499

Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala

730 735 740 745

acc gcc ggc gac tgc atg gcc tgc cac acc gtg aag ggc ggc aag ccg 2547

Thr Ala Gly Asp Cys Met Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro

750 755 760

tac gcg ggc ggc ctt ggc atg ccg gta ccg atg ctc ggc aag atc tac 2595

Tyr Ala Gly Gly Leu Gly Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys Ile Tyr

765 770 775

acg agc aac atc acg ccc gat ccc gat acg ggc atc ggc aaa tgg acg 2643

Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Ile Gly Lys Trp Thr

780 785 790

ttc gag gac ttc gag cgc gcg gtg cgg cac ggc gtg tcg aag aac ggc 2691

Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His Gly Val Ser Lys Asn Gly

795 800 805

gac aac ctg tat ccg gcg atg ccg tac gtg tcg tac gcg aag atc acg 2739

Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val Ser Tyr Ala Lys Ile Thr

810 815 820 825

gac gac gac gta cgc gcg ctg tac gcc tac ttc atg cac ggc gtc gag 2787

Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr Phe Met His Gly Val Glu

830 835 840

ccg gtc aag cag gcg ccg ccg aag aac gag att ccc gcg ctg ctc agc 2835

Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu Ile Pro Ala Leu Leu Ser

845 850 855

atg cgc tgg ccg ctg aag atc tgg aac tgg ctg ttc ctg aag gac ggc 2883

Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp Leu Phe Leu Lys Asp Gly

860 865 870

ccg tac cag ccg aag ccg tcg cag agc gcc gaa tgg aat cgc ggc gcg 2931

Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala Glu Trp Asn Arg Gly Ala

875 880 885

tat ctg gtg cag ggt ctc gcg cac tgc agc acg tgc cac acg ccg cgc 2979

Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser Thr Cys His Thr Pro Arg

890 895 900 905

ggc atc gcg atg cag gag aag tcg ctc gac gaa acc ggc ggc agc ttc 3027

Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp Glu Thr Gly Gly Ser Phe

910 915 920

ctc gcg ggg tcg gtg ctc gcc ggc tgg gac ggc tac aac atc acg tcg 3075

Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp Gly Tyr Asn Ile Thr Ser

925 930 935

gac ccg aat gcg ggg atc ggc agc tgg acg cag cag cag ctc gtg cag 3123

Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr Gln Gln Gln Leu Val Gln

940 945 950

tat ttg cgc acc ggc agc gtg ccg ggc gtc gcg cag gcg gcc ggg ccg 3171

Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val Ala Gln Ala Ala Gly Pro

955 960 965

atg gcc gag gcg gtc gag cac agc ttc tcg aag atg acc gaa gcg gac 3219

Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp

970 975 980 985

atc ggt gcg atc gcc acg tac gtc cgc acg gtg ccg gcc gtt gcc gac 3267

Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr Val Pro Ala Val Ala Asp

990 995 1000

agc aac gcg aag cag ccg cgg tcg tcg tgg ggc aag ccg gcc gag 3312

Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp Gly Lys Pro Ala Glu

1005 1010 1015

gac ggg ctg aag ctg cgc ggt gtc gcg ctc gcg tcg tcg ggc atc 3357

Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala Ser Ser Gly Ile

1020 1025 1030

gat ccg gcg cgg ctg tat ctc ggc aac tgc gcg acg tgc cac cag 3402

Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr Cys His Gln

1035 1040 1045

atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggc tat tac ccg tcg ctg ttc 3447

Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser Leu Phe

1050 1055 1060

cac aac tcc acc gtc ggc gcg tcg aat ccg tcg aac ctc gtg cag 3492

His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val Gln

1065 1070 1075

gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag atc ggc agc gag gat atc 3537

Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile

1080 1085 1090

ggg atg ccc gct ttc cgc tac gat ctg aac gac gcg cag atc gcc 3582

Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala

1095 1100 1105

gcg ctg acg aac tac gtg acc gcg cag ttc ggc aat ccg gcg gcg 3627

Ala Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala

1110 1115 1120

aag gtg acg gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tgacatagtc 3670

Lys Val Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg

1125 1130

gggcgcgccg acacggcgca accgatagga caggag 3706

<210> 2

<211> 168

<212> PRT

<213> 洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)

<400> 2

Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln Gly Ala Leu Ala Leu

20 25 30

Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu Arg Ala Leu Ala Asp

35 40 45

Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met Thr Leu Ser Glu Ser

50 55 60

Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile Gly Glu Arg Leu Leu

65 70 75 80

Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala Asp Ser Leu Pro Gln

85 90 95

Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr Pro Glu Gln Glu Ser

100 105 110

Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu Gly Ile Val Asp Asn

115 120 125

Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe Gly Val Val Ser Asp

130 135 140

Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys Pro Gly Phe Trp Ala

145 150 155 160

Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala

165

<210> 3

<211> 539

<212> PRT

<213> 洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)

<400> 3

Met Ala Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser

1 5 10 15

Gly Val Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys

20 25 30

Ala Val Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile

35 40 45

Val Glu Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro

50 55 60

Tyr Pro Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn

65 70 75 80

Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile

85 90 95

Arg Ala Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg

100 105 110

Phe Ile Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg

115 120 125

Asp Trp Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala

130 135 140

Glu Glu Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr

145 150 155 160

Ser Pro Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe

165 170 175

Asn Glu Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe

180 185 190

His Val Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly

195 200 205

Arg Pro Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile

210 215 220

Gly Ala Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala

225 230 235 240

Gly Ala Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly

245 250 255

Pro Asp Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala

260 265 270

Glu His Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile

275 280 285

Glu Thr Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn

290 295 300

Gly Val Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His

305 310 315 320

Pro Gly Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly

325 330 335

Arg Gly Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro

340 345 350

Phe Arg Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser

355 360 365

Arg Ile Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met

370 375 380

Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr

385 390 395 400

Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg

405 410 415

Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro

420 425 430

Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His

435 440 445

Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp

450 455 460

Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser

465 470 475 480

Thr Ile Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys

485 490 495

Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met

500 505 510

Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala

515 520 525

Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val

530 535

<210> 4

<211> 425

<212> PRT

<213> 洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)

<400> 4

Met Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu

1 5 10 15

Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys

20 25 30

Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Gly Asp Cys Met Ala Cys His Thr

35 40 45

Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly Met Pro Val Pro

50 55 60

Met Leu Gly Lys Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr

65 70 75 80

Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His

85 90 95

Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val

100 105 110

Ser Tyr Ala Lys Ile Thr Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr

115 120 125

Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu

130 135 140

Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp

145 150 155 160

Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala

165 170 175

Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser

180 185 190

Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp

195 200 205

Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp

210 215 220

Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr

225 230 235 240

Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val

245 250 255

Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser

260 265 270

Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr

275 280 285

Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp

290 295 300

Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala

305 310 315 320

Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr

325 330 335

Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser

340 345 350

Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val

355 360 365

Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile

370 375 380

Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala

385 390 395 400

Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val

405 410 415

Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg

420 425

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 连接子(linker)

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims

1.一种分子识别元件，其是固定在电极上的、包含靶分子识别部位以及与该靶分子识别部位连结的直接电子转移型氧化还原酶的分子识别元件，其中，靶分子为抗原，靶分子识别部位为针对该抗原的抗体，所述直接电子转移型氧化还原酶为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成的含细胞色素的亚基的葡萄糖脱氢酶。

2.如权利要求1所述的分子识别元件，其中，所述靶分子识别部位与所述直接电子转移型氧化还原酶通过交联剂进行连结。

3.如权利要求1所述的分子识别元件，其中，所述分子识别元件包含所述靶分子识别部位与所述直接电子转移型氧化还原酶的融合蛋白，所述融合蛋白通过将编码所述靶分子识别部位的碱基序列与编码所述直接电子转移型氧化还原酶的碱基序列按照使两者的密码子读码框一致来进行翻译、作为所述靶分子识别部位与所述直接电子转移型氧化还原酶的融合蛋白进行表达的方式连结而制作基因构建体，使该基因构建体在适当的宿主中进行表达而得到。

4.一种传感器，其包含电极以及固定在电极上的权利要求1～3中任一项所述的分子识别元件。

5.如权利要求4所述的传感器，其中，分子识别元件藉由单分子膜形成分子被固定在电极上。

6.一种靶分子的测定方法，其包括将包含靶分子的试样导入至权利要求4或5所述的传感器中的步骤、以及对基于靶分子而产生的信号进行检测的步骤。

7.一种靶分子测定用试剂，其包含权利要求1～3中任一项所述的分子识别元件。