ES2869625T3 - Sistemas y dispositivos de inmunoensayo combinado e inmunoensayo magnético para un intervalo extendido de sensibilidad - Google Patents

Sistemas y dispositivos de inmunoensayo combinado e inmunoensayo magnético para un intervalo extendido de sensibilidad Download PDF

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Antti Leo Oskari Virtanen
Cary James Miller
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Abstract

Un dispositivo para detectar un analito en una muestra biológica que comprende: un sustrato que incluye una superficie superior e inferior plana; un primer sensor electroquímico situado en la superficie superior del sustrato, en el que el primer sensor electroquímico es un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo que incluye una capa inmovilizada de anticuerpo configurada para unirse al analito; un segundo sensor electroquímico situado en la superficie superior del sustrato y adyacente al primer sensor electroquímico, en el que el segundo sensor electroquímico es un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto; una abertura en la superficie inferior del sustrato que se extiende hasta una región del sustrato debajo del segundo sensor electroquímico; y un material compuesto que incluye un aglutinante y un material magnético particulado, rellenando sustancialmente el material compuesto la abertura, en el que una conformación de la abertura incluye una sección transversal sustancialmente triangular, y una base de la sección transversal sustancialmente triangular es coplanar con la superficie inferior del sustrato y un vértice de la sección transversal sustancialmente triangular está debajo del segundo sensor electroquímico, en el que el material magnético particulado genera un campo magnético que se alinea con respecto al segundo sensor electroquímico y se configura para enfocar y atraer perlas magnéticas sobre una superficie del segundo sensor electroquímico, y en el que las perlas magnéticas incluyen un anticuerpo inmovilizado en una superficie de las perlas magnéticas para el analito.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistemas y dispositivos de inmunoensayo combinado e inmunoensayo magnético para un intervalo extendido de sensibilidad
CAMPO DE LA INVENCIÓN
1. La presente invención se refiere a sistemas y procedimientos para determinar analitos en pruebas de diagnóstico inmediato. En particular, la presente invención se refiere a sistemas y procedimientos que utilizan una combinación de técnicas de inmunoensayo e inmunoensayo magnético para detectar un analito dentro de un intervalo extendido de concentraciones especificadas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
2. Los sistemas de análisis de muestras de diagnóstico inmediato (point-of-care, POC) se basan en general en uno o más instrumentos de prueba reutilizables (por ejemplo, un aparato de lectura) que realizan pruebas de muestras usando un dispositivo de prueba desechable de un solo uso, por ejemplo, un cartucho o tira que contiene elementos analíticos, por ejemplo, electrodos u óptica para detectar analitos tales como pH, oxígeno y glucosa. El dispositivo de pruebas desechable puede incluir elementos fluídicos (por ejemplo, conductos para recibir y repartir la muestra a electrodos sensores u óptica), elementos calibrantes (por ejemplo, fluidos acuosos para estandarizar los electrodos con una concentración conocida de analito) y tintes con coeficientes de extinción conocidos para estandarizar la óptica. El instrumento o aparato de lectura contiene circuitos eléctricos y otros componentes para hacer funcionar los electrodos u óptica, realizar mediciones y realizar cálculos. El instrumento o aparato de lectura también tiene la capacidad de mostrar resultados y comunicar esos resultados a sistemas de información de laboratorio y hospital (LIS y HIS, respectivamente), por ejemplo, por medio de una estación de trabajo informática u otro sistema de gestión de datos. La comunicación entre el instrumento o aparato de lectura y una estación de trabajo, y entre la estación de trabajo y un LIS o HIS, puede ser por medio de, por ejemplo, un enlace de infrarrojo, una conexión por cable, comunicación inalámbrica o cualquier otra forma de comunicación de datos que pueda transmitir y recibir información eléctrica, o cualquier combinación de los mismos. Un sistema de diagnóstico inmediato notable (i-STAT® System, Abbott Point of Care Inc., Princeton, NJ) se divulga en la patente de EE. UU. n.° 5.096.669, que comprende un dispositivo desechable, que funciona junto con un analizador manual, para realizar una variedad de mediciones en sangre u otros fluidos.
3. Un beneficio de los sistemas de pruebas de muestras de diagnóstico inmediato es la eliminación de la necesidad que lleva mucho tiempo de enviar una muestra a un laboratorio central para someter a prueba. Los sistemas de pruebas de muestras de diagnóstico inmediato permiten que una enfermera o médico (usuario o técnico), a la cabecera de un paciente, obtenga un resultado analítico cuantitativo fiable, a veces comparable en calidad al que se obtendría en un laboratorio. En funcionamiento, la enfermera selecciona un dispositivo de pruebas con el panel de pruebas requerido, extrae una muestra biológica del paciente, la distribuye en el dispositivo de pruebas, opcionalmente sella el dispositivo de pruebas e inserta el dispositivo de pruebas en el instrumento o aparato de lectura. Aunque el orden particular en el que se producen las etapas puede variar entre diferentes sistemas de diagnóstico inmediato y proveedores, la intención de proporcionar resultados de pruebas de muestras rápidos cerca de la ubicación del paciente permanece. A continuación, el instrumento o aparato de lectura realiza un ciclo de prueba, es decir, todos las otras etapas requeridas para realizar las pruebas. Dicha simplicidad le da al médico una percepción más rápida del estado fisiológico de un paciente y, al reducir el tiempo de obtención para el diagnóstico o seguimiento, permite una decisión más rápida por el médico sobre el tratamiento apropiado, potenciando por tanto la probabilidad de un desenlace satisfactorio para el paciente.
4. Las pruebas de marcadores cardíacos, tales como las pruebas de troponina, es una de dicha prueba de diagnóstico que se beneficia del tiempo de obtención más rápido proporcionado por medio de los sistemas de análisis de muestras POC. Las pautas de cardiología nacionales e internacionales han recomendado un tiempo de obtención de una hora para informar de resultados de marcadores cardíacos tales como troponina al personal del departamento de urgencias, medido del momento de extracción de sangre al informe. El uso de sistemas de análisis de muestras POC reduce los tiempos de obtención para informar de resultados de marcadores cardíacos de los de los ensayos de laboratorio central, pero los sistemas de análisis de muestras POC actuales no son tan precisos o sensibles como los análisis de laboratorio central. De hecho, la diferencia en precisión y sensibilidad entre ensayos de laboratorio central y sistemas de análisis de muestras POC está creciendo ya que los fabricantes de ensayos de laboratorio central han liberado o liberarán ensayos de troponina que tienen un valor de corte de percentil 99 de aproximadamente 10 ng/L y un límite de detección de <1 ng/l, lo que actualmente no es posible para los ensayos de pruebas POC actuales. Estos ensayos de alta sensibilidad pueden detectar troponina en la mayoría de sujetos sanos, y clínicamente, esto permite la detección de más casos de lesión miocárdica.
5. Para competir analíticamente con estos ensayos de laboratorio central, los ensayos de pruebas POC de próxima generación necesitarán realizar avances tecnológicos. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de sistemas y procedimientos para ampliar el intervalo de sensibilidad para dispositivos de pruebas de muestras, por ejemplo, cartuchos de pruebas de sangre de un solo uso, usados con uno o más instrumentos de prueba en el POC en un hospital u otra localización para prestar atención médica. El documento US2012/034633 divulga un dispositivo inmunosensor magnético, que comprende un electrodo sensor en un chip sustancialmente plano.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
6. En un modo de realización, se proporciona un dispositivo para detectar un analito en una muestra biológica. El dispositivo incluye un sustrato que incluye una superficie superior e inferior planas y un primer sensor electroquímico situado en la superficie superior del sustrato. El primer sensor electroquímico es un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo e incluye una capa inmovilizada de anticuerpo configurada para unirse al analito. El dispositivo incluye además un segundo sensor electroquímico situado en la superficie superior del sustrato y adyacente al primer sensor electroquímico, en el que el segundo sensor electroquímico es un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto, una abertura en la superficie inferior del sustrato que se extiende a una región en el sustrato debajo del segundo sensor electroquímico, y un material compuesto que incluye un aglutinante y un material magnético particulado, rellenando el material compuesto sustancialmente la abertura. Una conformación de la abertura incluye una sección transversal sustancialmente triangular, y una base de la sección transversal sustancialmente triangular es coplanar con la superficie inferior del sustrato y un vértice de la sección transversal sustancialmente triangular está debajo del segundo sensor electroquímico. El material magnético particulado genera un campo magnético que se alinea con respecto al segundo sensor electroquímico y se configura para enfocar y atraer perlas magnéticas sobre una superficie del segundo sensor electroquímico. Las perlas magnéticas incluyen un anticuerpo inmovilizado en una superficie de las perlas magnéticas para el analito.
7. Opcionalmente, el dispositivo incluye además una primera región de reactivo recubierta con un conjugado anticuerpo-enzima para el analito, y una segunda región de reactivo recubierta con perlas magnéticas que incluyen un anticuerpo inmovilizado en una superficie de las perlas magnéticas para el analito. La primera región de reactivo y la segunda región de reactivo se localizan en el sustrato, y el campo magnético se configura para enfocar y atraer las perlas magnéticas sobre una superficie del segundo sensor electroquímico una vez que las perlas magnéticas se mezclan con la muestra biológica.
8. En algunos modos de realización, el analito es troponina cardíaca I (cTnI), la capa inmovilizada de anticuerpo del primer sensor electroquímico se configura para unirse a cTnI, y el anticuerpo inmovilizado a la superficie de las perlas magnéticas se configura para unirse a cTnI.
9. En otro modo de realización, se proporciona un dispositivo que incluye un conducto, un sustrato que incluye una superficie superior e inferior planas situadas dentro del conducto, y un primer sensor electroquímico situado en la superficie superior del sustrato. El primer sensor electroquímico es un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo e incluye una capa inmovilizada de anticuerpo configurada para unirse a un analito. El dispositivo incluye además un segundo sensor electroquímico situado en la superficie superior del sustrato, segundo sensor que es un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto, una abertura en la superficie inferior del sustrato que se extiende a una región en el sustrato debajo del segundo sensor electroquímico, un material compuesto que incluye un aglutinante y un material magnético particulado, y un primer reactivo seco situado con el conducto. El primer reactivo seco incluye perlas magnéticas que incluyen una capa inmovilizada de anticuerpo configurada para unirse al analito. El dispositivo incluye además un segundo reactivo seco situado con el conducto. El segundo reactivo seco incluye anticuerpos señal configurados para unirse al analito. El material magnético particulado genera un campo magnético que se alinea con respecto al segundo sensor electroquímico y se configura para enfocar y atraer perlas magnéticas sobre una superficie del segundo sensor electroquímico.
10. En algunos modos de realización, al menos uno del primer reactivo seco y el segundo reactivo seco se imprime en la superficie superior del sustrato. En modos de realización alternativos, al menos uno del primer reactivo seco y el segundo reactivo seco se imprime en una pared del conducto.
11. En algunos modos de realización, el dispositivo incluye además un sensor de conductividad configurado para determinar una posición de la muestra biológica en el conducto con respecto al primer sensor electroquímico y al segundo sensor electroquímico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS:
12. La presente invención se entenderá mejor a la vista de las siguientes figuras no limitantes, en las que:
13. La FIG. 1 ilustra la evolución de inmunoensayos de troponina de acuerdo con algunos aspectos de la invención; 14. La FIG. 2 ilustra el principio de un inmunoensayo combinado de acuerdo con algunos aspectos de la invención; 15. La FIG. 3 muestra un sistema de instrumentos de diagnóstico inmediato de acuerdo con algunos aspectos de la invención;
16. Las FIGS. 4 y 5A-5J muestran dispositivos sensores o cartuchos de acuerdo con algunos aspectos de la invención;
17. La FIG. 6A muestra una vista lateral de la fabricación de un chip sensor de acuerdo con algunos aspectos de la invención;
18. Las FIGS. 6B, 7, 8A y 8B muestran configuraciones de chip sensor de acuerdo con algunos aspectos de la invención;
19. Las FIGS. 9A-9C ilustran diversas configuraciones ejemplares para el posicionamiento de un imán debajo de un chip sensor dentro de un cartucho de acuerdo con algunos aspectos de la invención;
20. La FIG. 10 ilustra una configuración ejemplar para el posicionamiento de sensores en un chip sensor dentro de un cartucho de acuerdo con algunos aspectos de la invención;
21. Las FIGS. 11A y 11B muestran inmunosensores ejemplares parcialmente cubiertos con una capa magnética impresa que deja una parte del perímetro del inmunosensor expuesta de acuerdo con algunos aspectos de la invención;
22. La FIG. 12 ilustra un proceso de canal grabado de acuerdo con algunos aspectos de la invención;
23. La FIG. 13 ilustra una configuración ejemplar para el posicionamiento de sensores en un chip sensor dentro de un cartucho de acuerdo con algunos aspectos de la invención;
24. Las FIGS. 14-17 muestran procesos de acuerdo con algunos aspectos de la invención; y
25. La FIG. 18 muestra un gráfico que ilustra el impacto de poder determinar una concentración de un analito en una muestra sobre un intervalo de concentración extendido de acuerdo con algunos aspectos de la invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Introducción
26. La troponina cardíaca (cTn) es el biomarcador principal usado en el diagnóstico de infarto agudo de miocardio (IAM) y la estratificación de riesgo de futuros acontecimientos cardíacos adversos. Sin embargo, la diferencia de sensibilidad analítica entre ensayos de laboratorio central y sistemas de análisis de muestras POC para pruebas de troponina cardíaca ha crecido y puede obstaculizar la adopción de pruebas POC en algunos hospitales. También puede existir la necesidad de obtener sistemas de análisis de muestras POC que puedan detectar otros biomarcadores o múltiples biomarcadores. Por ejemplo, mientras que la troponina cardíaca es el analito principal para el diagnóstico de IAM, el péptido natriurético de tipo B (BNP) y NT-proBNP han demostrado ser útiles para la estratificación de riesgo a corto plazo. La detección de troponina cardíaca de alta sensibilidad (hs-cTn) también podría ser útil como marcador de estratificación de riesgo en atención primaria, es decir, para pacientes que son asintomáticos. Esto se basa en las observaciones de que un incremento en troponina cardíaca se asocia con un alto riesgo de desenlaces cardíacos adversos en ausencia de síndromes coronarios agudos. Si la detección de estos biomarcadores se adopta como parte de la atención médica habitual para pacientes de alto riesgo, a continuación las pruebas p Oc para hs-cTn pueden ser útiles y prácticas cuando se someten a prueba en consultorios médicos y clínicas.
27. Las troponinas en general son indetectables en pacientes sanos. El valor anómalo absoluto para troponinas varía dependiendo del entorno clínico en el que se evalúa al paciente y el ensayo usado. En un paciente que se presenta con dolor torácico y posible infarto de miocardio (IM), un valor anómalo es típicamente por encima del percentil 99 de la población sana como valor de corte usando un ensayo con una precisión aceptable. Los percentiles 99 para detección de cTnT y cTnI son bien conocidos como de 0,012 a 0,016 ng/ml y de 0,008 a 0,058 ng/ml, respectivamente. El intervalo más amplio de concentraciones en percentil 99 para el ensayo de cTnI se debe a los muchos ensayos de detección diferentes que usan diferentes anticuerpos y enfoques de ensayo. Los ensayos de cTn POC a menudo tienen valores de percentil 99 mayores debido en parte a un incremento en el ruido analítico y menor sensibilidad en comparación con los ensayos de cT n de laboratorio actuales. Por ejemplo, el punto de corte de percentil 99 para la detección de cTnT en ensayos de laboratorio central es bien conocido en 0,01 ng/ml. Por el contrario, el punto de corte de percentil 99 para la detección de cTnT en sistemas de análisis de muestras POC de troponina es típicamente de alrededor de 0,05 a 0,08 ng/ml.
28. Los sistemas de análisis de muestras de troponina POC se basan típicamente en la reacción del analito con anticuerpos. Dentro de los límites finitos de la zona de detección, la sensibilidad analítica es una función directa de la capacidad del ensayo para capturar tanto analito como sea posible con una precisión óptima. La precisión óptima, como se describe por el coeficiente de variación (CV) en el percentil 99 del límite de referencia superior para cada ensayo (como se muestra en la FIG. 1), se define en general como menos de o igual a un diez por ciento. La mejor precisión (CV de menos de o igual a un diez por ciento) permite ensayos más sensibles y facilita la detección de valores variables y reduce los límites de decisión de percentil 99 del ensayo. No obstante, el desarrollo de sistemas de análisis de muestras POC que cumplan estas necesidades y reduzcan los límites de decisión de percentil 99 del ensayo ha sido un reto.
29. La potenciación del rendimiento de ensayo requiere un incremento en la resolución entre (i) el límite de blanco (LoB) y el límite de detección (LoD) y (ii) el LoD y el percentil 99. LoB es la mayor concentración de analito aparente que se espera encontrar cuando se someten a prueba réplicas de una muestra en blanco que no contiene ningún analito. LoD es la menor concentración de analito que probablemente se distinga de manera fiable del LoB y a la que la detección es factible. El LoD se determina utilizando tanto el LoB medido como las réplicas de prueba de una muestra conocida por contener una concentración baja de analito. El límite de cuantificación (LoQ) es la menor concentración a la que el analito no solo se puede detectar de forma fiable, sino a la que se cumplen algunos objetivos predefinidos de sesgo e imprecisión. El LoQ puede ser equivalente al LoD o podría estar a una concentración mucho mayor. Sensibilidad, sensibilidad analítica, límite inferior de detección, LoB, LoD y LoQ son todos términos usados para describir la menor concentración de un analito que se puede medir de forma fiable por el ensayo.
30. Una de las formas de mejorar la sensibilidad o incrementar la resolución entre (i) el LoB y el LoD y (ii) el LoD y el percentil 99 en un inmunoensayo es el de mejorar la proporción de señal con respecto a ruido. Por ejemplo, se puede lograr una mejora para la sensibilidad en un inmunoensayo incrementando la capacidad de generación de señal del sistema o disminuyendo la señal de fondo generada por el sistema. La capacidad de generación de señal se puede considerar en términos de la "pendiente de sensibilidad" o la cantidad de señal generada por unidad de analito: pendiente = (Corriente (nA))/(Concentración (ng/ml)), y por tanto la Concentración (ng/ml) = (Corriente (nA))/(pendiente (nA/ng/ml). En sistemas de análisis de muestras POC convencionales tales como los descritos en la patente de EE.UU. n° 7.419.821, un sensor se recubre con una biocapa que comprende un anticuerpo anti-troponina unido covalentemente, al que se une un complejo de troponina y conjugado enzima-anticuerpo. De este modo el conjugado enzima-anticuerpo se inmoviliza cerca del electrodo en proporción a la cantidad de troponina inicialmente presente en la muestra. Además de la unión específica, el conjugado enzima-anticuerpo se puede unir inespecíficamente al sensor. La unión inespecífica proporciona una señal de fondo del sensor que no es deseable y se debe minimizar. Para resolver este problema, la patente de EE. UU. n.° 7.419.821 divulga el uso de protocolos de enjuague, y en particular el uso de fluido segmentado para enjuagar el sensor, como medio para disminuir la señal de fondo. Los sistemas de análisis de muestras POC tales como los descritos en la patente de EE. UU. n.° 7.419.821 tienen una capacidad de generación de señal o "pendiente de sensibilidad" de aproximadamente 4 nA/ng/ml y son en particular eficaces para la detección de niveles altos de un biomarcador tal como troponina (es decir, sensibilidad en extremo alto).
31. Sin embargo, en base a un tamaño de muestra de 10 pl, que es típicamente de sistemas de análisis de muestras POC, y varias moléculas de analito que pueden estar presentes en un tamaño de muestra de este tipo, la pendiente máxima teórica es de aproximadamente 1200 nA/ng/ml. Se cree que los sistemas de análisis de muestras POC convencionales simplemente tienen una capacidad de generación de señal de aproximadamente 4 nA/ng/ml porque la biocapa que comprende el anticuerpo anti-troponina unido covalentemente se inmoviliza en, o cerca de, la superficie del sensor, y por tanto solo el analito que entra en contacto con la superficie del sensor está sujeto a captura y análisis (por ejemplo, un 0,3 % estimado de todo el analito en la muestra está sujeto a captura y análisis).
32. Para incrementar la capacidad de generación de señal o "pendiente de sensibilidad" más allá de 4 nA/ng/ml e incrementar la eficacia de un inmunoensayo para la detección de niveles bajos de un biomarcador tal como troponina (es decir, sensibilidad en extremo bajo), se desarrollaron sistemas de análisis de muestras POC convencionales tales como los descritos en la patente de EE. UU. n.° 9.233.370 con técnicas de captura de perlas magnéticamente susceptibles. Las técnicas de captura de perlas magnéticamente susceptibles permiten que el conjugado enzima-anticuerpo se localice en, o cerca de, la superficie del sensor y funcione para retener sustancialmente el conjugado enzima-anticuerpo en o cerca del sensor durante la retirada de la muestra no unida y el lavado del sensor para retirar la unión inespecífica. Los sistemas de análisis de muestras POC, tales como los descritos en la patente de EE. UU. n.° 9.233.370 tienen una capacidad de generación de señal o "pendiente de sensibilidad" de aproximadamente 40 nA/ng/ml (es decir, 10 veces la capacidad de generación de señal de inmunoensayos no magnéticos) y son en particular eficaces para la detección de niveles bajos de un biomarcador tal como troponina (es decir, sensibilidad en extremo bajo). No obstante, los sistemas de análisis de muestras POC convencionales están lejos de lograr la pendiente máxima teórica de aproximadamente 1200 nA/ng/ml.
33. Para mejorar la capacidad de generación de señal de sistemas de análisis de muestras POC convencionales e incrementar la eficacia de un inmunoensayo para la detección de niveles bajos de un biomarcador tal como troponina (es decir, sensibilidad en extremo bajo), un modo de realización de la presente invención se refiere a un dispositivo sensor magnético de intervalo extendido que tiene un sitio de captura de anticuerpo fijo situado sobre un primer sensor (por ejemplo, un sensor amperométrico) y otro sitio de captura de anticuerpo situado sobre un segundo sensor (por ejemplo, un sensor amperométrico) con un imán de campo alto situado debajo. Cada uno de los dos sensores tiene sensibilidad para un analito (por ejemplo, cTn) pero con sensibilidades diferentes debido a la diferencia en los reactivos de captura que se usan para cada sensor respectivo. El primer sensor es típicamente el sensor de sensibilidad menor (una pendiente de menos de 5 nA/ng/ml) y es en particular eficaz para la detección de niveles altos de un analito tal como troponina (es decir, sensibilidad en extremo alto). El segundo sensor es típicamente el sensor de sensibilidad mayor (una pendiente de más de 7 nA/ng/ml) y es en particular eficaz para la detección de niveles bajos de un analito tal como troponina (es decir, sensibilidad en extremo bajo). En consecuencia, la implementación tanto del sensor de sensibilidad menor como del sensor de sensibilidad alta en un único dispositivo amplía el intervalo de concentraciones de un analito que se puede detectar usando el dispositivo.
34. La diferencia en la localización del analito y la unión del reactivo marcador entre los dos sensores explica en gran medida su diferencia en las sensibilidades par el analito. Las diferencias de sensibilidad entre los dos sensores se pueden controlar además por la variación del tiempo entre la disolución del reactivo paramagnético en la muestra y el posicionamiento de la muestra sobre el primer sensor. Se puede lograr el control adicional de las sensibilidades entre los dos sensores alterando la concentración de las partículas recubiertas de anticuerpo paramagnéticas usadas en el ensayo. Otra técnica para controlar las sensibilidades del sensor puede ser a través del control de la concentración de anticuerpo, afinidades o avideces en el primer sensor y los reactivos paramagnéticos.
35. La ventaja de la solución técnica mencionada anteriormente para mejorar la capacidad de generación de señal de sistemas de análisis de muestras POC e incrementar la eficacia de un inmunoensayo para la detección de niveles bajos de un biomarcador tal como troponina (es decir, sensibilidad de bajo nivel) es que eliminará los problemas técnicos con el incremento en la resolución entre (i) el límite de blanco (LoB) y el límite de detección (LoD) y (ii) el LoD y el percentil 99. Por ejemplo, las implementaciones de la presente invención proporcionan una contribución técnica sobre sistemas y procedimientos de análisis de muestras POC convencionales porque los rasgos característicos técnicos de la presente invención interactúan para proporcionar tanto el sensor de sensibilidad menor como el sensor de sensibilidad alta en un único dispositivo, lo que extiende el intervalo de concentraciones de un analito que se puede detectar usando el dispositivo.
Inmunoensayos
36. La FIG. 2 ilustra el principio de un inmunoensayo combinado (por ejemplo, un inmunoensayo combinado de una sola etapa) 200 de acuerdo con modos de realización específicos de la presente invención que extiende el intervalo de concentraciones de un analito diana tal como troponina I (TnI) o troponina cardíaca I (cTnI), que se puede detectar usando un analizador. En diversos modos de realización, el inmunoensayo combinado 200 incluye una técnica de inmunoensayo no magnético 205 que utiliza un conjugado enzima-biomolécula 210 configurado para unirse al analito diana 215 y una biomolécula de captura 220 (por ejemplo, perlas o microesferas de látex recubiertas con biomolécula de captura) inmovilizada en o cerca de una superficie de un sensor no magnético (es decir, un inmunosensor de captura de superficie heterogénea). La biomolécula de captura 220 se configura para unirse al analito diana 215 que se une al conjugado enzima-biomolécula 210 de modo que el conjugado enzima-biomolécula 210 se captura y se inmoviliza en o cerca de una superficie del sensor no magnético. El sensor no magnético se puede fijar a un potencial electroquímico fijo suficiente para oxidar o reducir un producto de un sustrato hidrolizado pero no el sustrato directamente, o bien el potencial se puede barrer una o más veces a través de un intervalo apropiado. El inmunoensayo combinado 200 incluye además una técnica de inmunoensayo magnético 225 que utiliza el conjugado enzima-biomolécula 210 configurado para unirse al analito diana 215 y una biomolécula de captura 230 (por ejemplo, perlas o microesferas magnéticas recubiertas con biomolécula de captura). La biomolécula de captura 230 se configura para unirse al analito diana 215 que se une al conjugado enzima-biomolécula 210. La biomolécula de captura 230 unida al analito diana 215 que se une al conjugado enzima-biomolécula 210 se puede atraer por medio de un imán sobre o cerca de una superficie de un sensor magnético (es decir, un inmunosensor de captura de perlas magnéticas homogénea) de modo que el conjugado enzima-biomolécula 210 se captura y se inmoviliza en o cerca de una superficie del sensor magnético. El sensor magnético se puede fijar a un potencial electroquímico fijo suficiente para oxidar o reducir un producto de un sustrato hidrolizado pero no el sustrato directamente, o bien el potencial se puede barrer una o más veces a través de un intervalo apropiado.
37. El conjugado enzima-biomolécula 210 incluye una enzima conjugada con biomoléculas seleccionadas para unirse a un analito de interés. En algunos modos de realización, la enzima es fosfatasa alcalina (ALP), peroxidasa de rábano picante o glucosa oxidasa y las biomoléculas se eligen de entre ionóforos, cofactores, polipéptidos, proteínas, glucopéptidos, enzimas, inmunoglobulinas, anticuerpos, antígenos, lectinas, receptores neuroquímicos, oligonucleótidos, polinucleótidos, ADN, ARN o mezclas adecuadas. En algunos modos de realización, las biomoléculas se pueden seleccionar para unirse a uno o más de gonadotropina coriónica humana, troponina I, troponina T, troponina C, un complejo de troponina, creatina cinasa, subunidad M de creatina cinasa, subunidad B de creatina cinasa, mioglobina, cadena ligera de miosina, o fragmentos modificados de estos. Dichos fragmentos modificados se generan por oxidación, reducción, deleción, adición o modificación de al menos un aminoácido, incluyendo modificación química con un resto natural o con un resto sintético. Por ejemplo, las biomoléculas se pueden seleccionar como un anticuerpo anti-troponina I monoclonal o policlonal (por ejemplo, BiosPacific - Peptide 4 (G-130-C), HyTest - 560 (19C7, n.° cat. 4T21 - monoclonal Troponin I Ab) e International Point of Care - 817 (n.° cat. MA-1040). En determinados modos de realización, la biomolécula se une al analito específicamente y tiene una constante de afinidad para unirse al ligando de analito de aproximadamente 107 a 1015 M-1.
38. La biomolécula de captura 220 se puede proporcionar como una biocapa depositada sobre o cerca de al menos una parte del sensor no magnético. Una biocapa es una capa porosa que comprende en su superficie una cantidad suficiente de biomoléculas que se pueden unir a un analito de interés o bien responder a la presencia de dicho analito produciendo un cambio que se puede medir. Opcionalmente, se puede interponer una capa de cribado de permeabilidad selectiva entre el sensor no magnético y la biocapa para cribar los interferentes electroquímicos como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.200.051.
39. En algunos modos de realización, la biocapa se construye a partir de perlas de látex de diámetro específico en el intervalo de aproximadamente 0,001 a 50 micrómetros (por ejemplo, ThermoFisher OptiLink Carboxylate-Modifies Microparticles (n.° catálogo 83000591100351), 0,2 um de diámetro). Las perlas se pueden modificar por la unión covalente de cualquier biomolécula adecuada que se puede unir a un analito de interés o bien responder a la presencia de dicho analito produciendo un cambio que se puede medir. Existen muchos procedimientos de unión en la técnica, incluyendo proporcionar grupos éster de N-hidroxisuccinimida reactivos con amina para el acoplamiento fácil de lisina o grupos de amina N terminal de proteínas. En determinados modos de realización, las biomoléculas se eligen de entre ionóforos, cofactores, polipéptidos, proteínas, glucopéptidos, enzimas, inmunoglobulinas, anticuerpos, antígenos, lectinas, receptores neuroquímicos, oligonucleótidos, polinucleótidos, ADN, ARN o mezclas adecuadas. En algunos modos de realización, las biomoléculas se pueden seleccionar para unirse a uno o más de gonadotropina coriónica humana, troponina I, troponina T, troponina C, un complejo de troponina, creatina cinasa, subunidad M de creatina cinasa, subunidad B de creatina cinasa, mioglobina, cadena ligera de miosina, o fragmentos modificados de estos. Dichos fragmentos modificados se generan por oxidación, reducción, deleción, adición o modificación de al menos un aminoácido, incluyendo modificación química con un resto natural o con un resto sintético. Por ejemplo, se pueden seleccionar biomoléculas como anticuerpo anti-troponina I monoclonal o policlonal (por ejemplo, SDIX-M06 (n.° D2440MA06-MA) y HyTest- Capí (19C7, n.° cat. 4T21 - monoclonal Troponin I Ab). En determinados modos de realización, la biomolécula se une al analito específicamente y tiene una constante de afinidad para unirse al ligando de analito de aproximadamente 107 a 1015 M--11.
40. La biomolécula de captura 230 se puede proporcionar como biomoléculas unidas a perlas magnéticamente susceptibles. Las perlas magnéticamente susceptibles pueden estar compuestas de cualquier material conocido en la técnica que es susceptible a movimiento por un imán (por ejemplo, imán permanente o electroimán) utilizado en o junto con el dispositivo de la presente invención. Como tales, los términos "magnético" y "magnéticamente susceptible" con respecto a las perlas se pueden usar de manera intercambiable.
41. En algunos modos de realización, las perlas incluyen un núcleo magnético, que preferentemente se recubre total o parcialmente con un material de recubrimiento. El núcleo magnético puede comprender un material ferromagnético, paramagnético o superparamagnético. En modos de realización preferentes, las perlas magnéticamente susceptibles comprenden un núcleo y un recubrimiento polimérico externo. En otros modos de realización, las perlas magnéticas comprenden perlas de sustrato no magnéticas formadas, por ejemplo, de un material seleccionado del grupo que consiste en poliestireno, ácido poliacrílico y dextrano, sobre el que se dispone un recubrimiento magnético. En determinados modos de realización donde las perlas magnéticamente susceptibles comprenden un núcleo, el núcleo magnético puede comprender uno o más de ferrita, Fe, Co, Mn, Ni, metales que comprenden uno o más de estos elementos, aleaciones ordenadas de estos elementos, cristales compuestos de estos elementos, estructuras de óxido magnético, tales como ferritas, y combinaciones de los mismos. En otros modos de realización en los que las perlas magnéticamente susceptibles comprenden un núcleo, el núcleo magnético puede estar compuesto de magnetita (Fe3O4), maghemita (Y-Fe2O3), o ferritas de metales divalentes proporcionadas por la fórmula Mei-xOFe3+xO3 donde Me es, por ejemplo, Cu, Fe, Ni, Co, Mn, Mg, o Zn o combinaciones de estos materiales, y donde x varía de 0,01 a 99. Los materiales adecuados para el recubrimiento polimérico externo sobre el núcleo incluyen polímeros sintéticos y biológicos, combinaciones de polímeros y copolímeros, y materiales inorgánicos. Los materiales poliméricos pueden incluir diversas combinaciones de polímeros de acrilatos, siloxanos, estirenos, acetatos, alquilenglicoles, alquilenos, óxidos de alquileno, parilenos, ácido láctico y ácido glicólico. Los materiales biopoliméricos incluyen almidón o carbohidrato similar. Los materiales de recubrimiento inorgánicos pueden incluir cualquier combinación de un metal, una aleación metálica y una cerámica. Los ejemplos de materiales cerámicos pueden incluir hidroxiapatita, carburo de silicio, carboxilato, sulfonato, fosfato, ferrita, fosfonato y óxidos de elementos del grupo IV de la tabla periódica de elementos.
42. En principio, se puede utilizar cualquier perla magnéticamente susceptible de tamaño correcto que se pueda situar con el imán de la presente invención, teniendo en cuenta los requisitos de dispersabilidad para las perlas magnéticamente susceptibles. En modos de realización preferentes, al menos un 50 % en peso, por ejemplo, al menos un 75 % en peso, de las perlas magnéticamente susceptibles se retienen en o cerca de la superficie del sensor. En algunos modos de realización ejemplares, el tamaño de partícula promedio de las perlas magnéticamente susceptibles puede variar de 0,01 pm a 20 pm, por ejemplo, de 0,1 pm a 10 pm, de 0,1 pm a 5 pm o de 0,2 pm a 1,5 pm. Como se usa en el presente documento, el término "tamaño de partícula promedio" se refiere a la dimensión más larga promedio de las partículas, por ejemplo, perlas, por ejemplo, el diámetro para partículas esféricas, como se determina por procedimientos bien conocidos en la técnica. La distribución del tamaño de partícula de las perlas magnéticamente susceptibles es preferentemente unimodal, aunque también se pueden usar distribuciones polimodales de acuerdo con la presente invención. Aunque es preferente el uso de una perla magnéticamente susceptible esférica, en otros modos de realización, otras conformaciones y estructuras de perlas, por ejemplo, partículas ovaladas, subesféricas, cilíndricas y otras conformaciones irregulares, están dentro del significado del término "perlas" y "micropartículas" como se usa en el presente documento.
43. Las fuentes comerciales de preparaciones de perlas magnéticamente sensibles incluyen Invitrogen™ (Carlsbad, California, EE. UU.) por Life Technologies™, Ademtech (Pessac, Francia), Chemicell GmbH (Berlín, Alemania), Bangs Laboratories, Inc.™ (Fishers, IN) y Seradyn, Inc. (Indianapolis, IN) (por ejemplo, Invitrogen™ por Life Technologies™ - Dynabeads ® MyOne™ Streptavidin T1 (n.° catálogo 65601/65602), 1 um de diámetro). Muchos de los productos disponibles comercialmente incorporan funcionalización de superficie que se puede emplear para inmovilizar biomoléculas tales como anticuerpos (por ejemplo, IgG) en las superficies de perlas. Las funcionalizaciones ejemplares incluyen perlas magnéticamente susceptibles modificadas con carboxilo, amino o estreptavidina.
44. En algunos modos de realización, las perlas magnéticamente susceptibles se recubren con cualquier biomolécula adecuada que se puede unir a un analito de interés o bien responder a la presencia de dicho analito produciendo un cambio que se puede medir. Existen muchos procedimientos de unión en la técnica, incluyendo proporcionar grupos éster de N-hidroxisuccinimida reactivos con amina para el acoplamiento fácil de lisina o grupos de amina N terminal de proteínas. En el caso de perlas magnéticamente susceptibles modificadas con estreptavidina, las biomoléculas se pueden modificar para incluir un aglutinante tal como biotina para unir las biomoléculas en las superficies de perlas. Por ejemplo, las biomoléculas se pueden unir a biotina (por ejemplo, Thermo Scientific - EZ-link Sulfo-NHS-LC-LC-biotin (n.° producto 21338) o EZ-link Sulfo-NHS-Lc-biotin (n.° producto 21335)). En determinados modos de realización, las biomoléculas se eligen de entre ionóforos, cofactores, polipéptidos, proteínas, glucopéptidos, enzimas, inmunoglobulinas, anticuerpos, antígenos, lectinas, receptores neuroquímicos, oligonucleótidos, polinucleótidos, ADN, ARN o mezclas adecuadas. Las biomoléculas se pueden seleccionar para unirse a uno o más de gonadotropina coriónica humana, troponina I, troponina T, troponina C, un complejo de troponina, creatina cinasa, subunidad M de creatina cinasa, subunidad B de creatina cinasa, mioglobina, cadena ligera de miosina, o fragmentos modificados de estos. Dichos fragmentos modificados se generan por oxidación, reducción, deleción, adición o modificación de al menos un aminoácido, incluyendo modificación química con un resto natural o con un resto sintético. Por ejemplo, las biomoléculas se pueden seleccionar como un anticuerpo anti-troponina I monoclonal o policlonal (por ejemplo, BiosPacific - Peptide 3 (G-129-C) y HyTest - Capí (19C7, n.° cat. 4T21- monoclonal Troponin I Ab). En determinados modos de realización, la biomolécula se une al analito específicamente y tiene una constante de afinidad para unirse al ligando de analito de aproximadamente 107 a 1015 M--11.
45. Como se debe entender, los modos de realización de la presente invención se pueden implementar en una variedad de diferentes sistemas y contextos. Determinados modos de realización son en particular aplicables a inmunoensayos que detectan una especie electroactiva producida enzimáticamente (por ejemplo, 4-aminofenol) a partir de la reacción de un sustrato (por ejemplo, 4-aminofenilfosfato) con el conjugado anticuerpo-enzima (por ejemplo, uno o más anticuerpos unidos a fosfatasa alcalina (ALP). Sin embargo, los sistemas y técnicas descritos en el presente documento se pueden usar para detectar un analito usando biomoléculas distintas de anticuerpos marcados con diversos marcadores más allá de enzimas. Por ejemplo, las biomoléculas descritas en el presente documento se pueden unir a marcadores incluyendo un radiomarcador, cromóforo, fluoróforo, especie quimioluminiscente, ionóforo, especie electroactiva y otros conocidos en la técnica sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención.
46. Como se debe entender además, los modos de realización de la presente invención se pueden implementar en una variedad de diferentes sistemas y configuraciones, y el término en o cerca de una superficie del sensor se usa en el presente documento para describir la relación entre un complejo de biomolécula y la superficie de un sensor particular. En o cerca de una superficie de un sensor define una distancia de trabajo entre el complejo de biomolécula y la superficie del sensor particular que necesita mantenerse de modo que una señal generada por una reacción del complejo de biomolécula con un sustrato se pueda medir en la superficie del sensor particular. En algunos modos de realización, la distancia de trabajo es menos de 800 pm, por ejemplo, menos de 600 pm o menos de 500 pm.
Sistema de prueba de muestras biológicas para realizar inmunoensayos
47. La presente invención se refiere a un sistema de instrumentos POC portátil que incluye un cartucho o dispositivo (dispositivo(s)) sensor desechable autónomo y un lector o analizador (instrumento(s)) configurado para su uso a la cabecera de un paciente. Una muestra de fluido que se va a medir se introduce en un orificio o puerto de entrada de muestra en el cartucho y el cartucho se inserta en el analizador a través de una abertura o puerto ranurado. Las mediciones realizadas por el analizador se envían a una pantalla u otro dispositivo de salida, tal como una impresora o un sistema de gestión de datos por medio de un puerto en el analizador a un puerto informático. La transmisión puede ser por medio de Wi-Fi, enlace Bluetooth, infrarrojo y similares. Por ejemplo, el sistema de instrumentos IVD portátil puede ser de diseño similar a los sistemas divulgados en la patente de EE. UU. n.° 5.096.669 y la patente de EE. UU. n.° 7.419.821.
48. La FIG. 3 muestra las partes componentes e interacciones de un sistema de instrumentos POC portátil típico. El sistema 300 puede incluir un analizador 305, un dispositivo sensor desechable 310 y una estación central de datos o gestor de datos 315. El analizador 305 puede incluir, por ejemplo, una pantalla 320 para referencia visual y uno o más dispositivos de entrada 325 para la entrada de datos. El uno o más dispositivos de entrada 325 pueden incluir uno o más mecanismos que permiten a un operador introducir información al analizador 305, tales como, pero sin limitarse a, un panel táctil, dial, rueda pulsable, rueda de desplazamiento, pantalla táctil, uno o más botones (por ejemplo, un teclado), ratón, controlador de juego, bola de desplazamiento, micrófono, cámara, sensor de proximidad, detector de luz, sensores de movimiento, sensor biométrico y combinaciones de los mismos. El dispositivo sensor 310 puede incluir, por ejemplo, un puerto 330 para recibir una muestra del paciente y una matriz de sensores 335 para detectar un analito en una muestra biológica. Por ejemplo, el dispositivo sensor 310 se puede configurar para realizar análisis en una gama de tipos de muestra biológica. Estos tipos de muestra pueden incluir, por ejemplo, sangre, plasma, suero, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, orina, tejido corporal, heces y similares. El dispositivo sensor 310 se puede insertar en el analizador 305 a través de una abertura 340 de modo que el analizador 305 está en contacto eléctrico con el dispositivo sensor 310 para implementar la funcionalidad, etapas y/o rendimiento de la presente invención.
49. El analizador 305 se puede comunicar con el gestor de datos 315 usando, por ejemplo, una conexión inalámbrica, un enlace infrarrojo, un enlace óptico, una conexión de red 345, 350 o cualquier otra forma de enlace de comunicación que use cualquier forma de protocolo de comunicación para transferir información. El gestor de datos 315 puede residir en una infraestructura de red, tal como dentro de un entorno de nube, o puede ser un dispositivo informático independiente separado (por ejemplo, un dispositivo informático de un proveedor de servicios). El gestor de datos 315 puede incluir un bus, un procesador, un dispositivo de almacenamiento, una memoria del sistema (dispositivo de hardware), uno o más dispositivos de entrada, uno o más dispositivos de salida y una interfaz de comunicación. El gestor de datos 315 se puede configurar para proporcionar conectividad entre el analizador 305 y localizaciones centrales, tales como, por ejemplo, un LIS o HIS (sistema de información de laboratorio u hospital) y el dispositivo sensor 305. El gestor de datos 315 se puede conectar con los diversos componentes del sistema usando cualquier tipo de conexión de comunicaciones que pueda transmitir y recibir información electrónica, tal como, por ejemplo, una conexión Ethernet u otra conexión de red informática. El gestor de datos 315 también puede proporcionar opcionalmente un enlace directo al sistema de información de un vendedor (fabricante del producto), por ejemplo, por medio de Internet, una conexión de acceso telefónico u otro enlace de comunicación directo o indirecto, o a través del LIS o HIS. Un modo de realización ejemplar de este tipo puede proporcionar el reordenamiento automático de los dispositivos sensores 305 para mantener niveles predeterminados de inventario en un hospital y permitir al vendedor pronosticar la demanda y planificar adecuadamente la fabricación de los dispositivos 305. También puede proporcionar un medio para actualizar información del dispositivo, por ejemplo, atributos y perfiles de cartuchos, y controlar la información del fluido, por ejemplo, intervalos de prueba de analitos esperados.
50. El analizador 305 puede incluir además un procesador, un dispositivo de almacenamiento y una memoria del sistema. El procesador puede ser uno o más procesadores convencionales, microprocesadores o procesadores dedicados especializados que incluyen circuitos de procesamiento operativos para interpretar y ejecutar instrucciones de programa legibles por ordenador, tales como instrucciones de programa para controlar la operación y rendimiento de uno o más de los diversos otros componentes del analizador 305 y/o el dispositivo sensor 310 para implementar la funcionalidad, etapas y/o rendimiento de la presente invención. En determinados modos de realización, el procesador interpreta y ejecuta los procesos, etapas, funciones y/o operaciones de la presente invención, que se pueden implementar de manera funcional por las instrucciones del programa legibles por ordenador. Por ejemplo, el procesador puede medir una señal generada en un sensor del dispositivo sensor 310 (por ejemplo, una señal indicativa de la presencia y/o concentración de un analito en una muestra biológica), determinar una concentración del analito en la muestra biológica en base a la señal medida, e informar de la concentración determinada (por ejemplo, mostrar la concentración determinada en la pantalla 320). En algunos modos de realización, la información obtenida o generada por el procesador, por ejemplo, la identidad del dispositivo sensor 310, la vida útil del dispositivo sensor 310, la concentración determinada, etc., se puede almacenar en el dispositivo de almacenamiento.
51. El dispositivo de almacenamiento puede incluir medios legibles por ordenador extraíbles/no extraíbles, volátiles/no volátiles, tales como, pero sin limitarse a, medios de almacenamiento legibles por máquina no transitorios tales como medios de grabación magnéticos y/u ópticos y sus correspondientes unidades. Las unidades y sus medios legibles por ordenador asociados proporcionan el almacenamiento de instrucciones de programa, estructuras de datos, módulos de programa y otros datos legibles por ordenador para el funcionamiento del analizador 305 de acuerdo con los diferentes aspectos de la presente invención. En modos de realización, el dispositivo de almacenamiento puede almacenar un sistema operativo, programas de aplicación y datos de programas de acuerdo con aspectos de la presente invención.
52. La memoria del sistema puede incluir uno o más medios de almacenamiento, incluyendo, por ejemplo, medio de almacenamiento legible por máquina no transitorio, tal como memoria flash, memoria permanente tal como memoria de solo lectura ("ROM"), memoria semipermanente tal como memoria de acceso aleatorio ("RAM"), cualquier otro tipo adecuado de componente de almacenamiento no transitorio, o cualquier combinación de los mismos. En algunos modos de realización, un sistema de entrada/salida (BIOS) que incluye las rutinas básicas que ayudan a transferir información entre los diversos otros componentes del analizador 305 y el sistema 300, tal como durante el inicio, se puede almacenar en la ROM. Adicionalmente, los módulos de datos y/o programa, tales como al menos una parte del sistema operativo, módulos de programa, programas de aplicación y/o datos de programa, que son accesibles para y/o que actualmente se operan por el procesador, pueden estar contenidos en el RAM. En modos de realización, los módulos de programa y/o programas de aplicación pueden comprender una tabla de búsqueda, un algoritmo tal como un algoritmo para identificar para determinar una concentración de un analito en un intervalo de concentración extendido y una herramienta de comparación, que proporciona las instrucciones para la ejecución del procesador.
53. El analizador 305 puede incluir además un lector de código de barras para leer información de la pulsera con código de barras de un paciente, de un código de barras en un dispositivo sensor 310 o de cualquier otro elemento (por ejemplo, una caja de dispositivos sensores, una caja de fluidos de control, etc.) usado junto con el analizador 305. Se pueden usar otras de dichas disposiciones de codificación. Por ejemplo, el analizador 305 también puede incluir (de forma alternativa o bien además del lector de código de barras) un dispositivo de identificación por radiofrecuencia (RF) que puede identificar una etiqueta de RF que está contenida sobre o en cada dispositivo sensor individual o cada caja de dispositivos. De acuerdo con otro modo de realización ejemplar de la presente invención, una o más de las disposiciones de codificación se pueden basar en una matriz de clavijas de codificación binaria del tipo divulgado, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.954.087. Las diversas disposiciones de codificación pueden transmitir información pertinente tal como, por ejemplo, la identidad de un tipo de dispositivo específico, fecha y localización de fabricación, número de lote de fabricación, fecha de vencimiento, un número único asociado con un dispositivo, coeficientes para su uso por el analizador 305 asociado con el cálculo de sangre u otros parámetros de muestra, y similares.
Dispositivo sensor o cartucho
54. En un modo de realización, como se muestra en la FIG. 4, un dispositivo sensor o cartucho 400 comprende una parte superior 405 (por ejemplo, una cubierta) y una parte inferior 410 (por ejemplo, una base) en las que se montan al menos un chip sensor microfabricado 415 con contactos eléctricos y una bolsa 420 que contiene un fluido, por ejemplo, un fluido de lavado. El al menos un chip sensor 415 se puede situar en la región rebajada 418 y configurarse para generar señales eléctricas en base a una concentración de especie química específica en una muestra de fluido, por ejemplo, una muestra de sangre de un paciente. En algunos modos de realización, la composición del fluido en la bolsa 420 se selecciona del grupo que consiste en agua, fluido calibrante, fluido reactivo, fluido de control, fluido de lavado y combinaciones de los mismos. Una junta 425 se sitúa entre la parte superior 405 y la parte inferior 410 para unirlas conjuntamente y definir y sellar varias cavidades y conductos dentro del cartucho 400. La junta 425 puede cubrir sustancialmente toda el área entre la parte superior 405 y la parte inferior 410 del cartucho 400, como se muestra en la FIG. 4, o se puede localizar sobre y entre solo rasgos característicos estructurales predeterminados, por ejemplo, el al menos un chip sensor 415, del cartucho 400 (no mostrado). La junta 425 puede incluir aberturas 430 para permitir la comunicación física, fluídica y/o gaseosa entre los rasgos característicos estructurales de la parte superior 405 y la parte inferior 410. La junta 425 puede tener o no una superficie adhesiva, y puede tener una superficie adhesiva en ambos lados de la misma, es decir, formando una capa adhesiva de doble cara.
55. Como se muestra en las FIGS. 5A-5J, en algunos modos de realización, el dispositivo sensor o cartucho 500 (por ejemplo, el cartucho 400 como se describe con respecto a la FIG. 4) tiene una carcasa que comprende una parte superior 502 (por ejemplo, una cubierta) y una parte inferior 504 (por ejemplo, una base) formada de zonas rígidas y flexibles de material. Como se muestra en las FIGS. 5A-5J, las zonas rígidas (partes no sombreadas) de la cubierta 502 y la base 504 respectivamente son preferentemente cada una una única zona contigua; sin embargo, el proceso de moldeo puede proporcionar una pluralidad de zonas sustancialmente rígidas no contiguas. Las zonas flexibles (partes sombreadas) de la cubierta 502 y la base 504 respectivamente son preferentemente un conjunto de varias zonas no contiguas. Por ejemplo, la zona flexible alrededor de una membrana desplazable se puede separar y ser distinta de la zona flexible en un miembro de sellado cerrable. De forma alternativa, las zonas flexibles pueden comprender una única zona contigua.
56. El dispositivo sensor o cartucho 500 comprende además un puerto de entrada de muestra sellable 506 y un miembro de sellado cerrable 508 para cerrar el puerto de entrada de muestra 502, una cámara de retención de muestra 510 localizada corriente abajo del puerto de entrada de muestra 506, un tope capilar 512, una región de sensor 514, y una cámara de residuos 516 localizada corriente abajo de la región del sensor 508. Preferentemente, el área de sección transversal de una parte de la cámara de retención de muestra 510 disminuye distalmente con respecto al puerto de entrada de muestra 506, como se muestra por la rampa 518 en la FIG. 5h . Una bolsa (por ejemplo, la bolsa 420 descrita con respecto a la FIG. 4) puede estar dispuesta en una región rebajada 520 y en comunicación fluida con un conducto 522 que conduce a la región de sensor 514, opcionalmente por medio del conducto 524. La bolsa puede ser del diseño descrito en la patente de EE. UU. n.° 5.096.669 o, más preferentemente, en la patente de EE. UU. n.° 8.216.529. La región rebajada 520 incluye preferentemente una punta 525 configurada para romper la bolsa, tras la aplicación de una fuerza sobre la bolsa, por ejemplo, por un lector o analizador (por ejemplo, el analizador 305 como se describe con respecto a la FIG. 3). Una vez que se rompe la bolsa, el sistema se configura para repartir el contenido de fluido de la bolsa al conducto 522. El movimiento del fluido hacia el conducto 522 y a la región de sensor 514 y/o dentro del conducto 524 se puede efectuar por una bomba, por ejemplo, una bomba neumática conectada al/a los conducto(s) 522 o 524. Preferentemente, la bomba neumática comprende una membrana desplazable 526 formada por una parte de una zona flexible 527 de la carcasa formada sobre una región rebajada o vejiga de aire 528. En el modo de realización mostrado en las FIGS. 5A-5J, tras presionar repetidamente la membrana desplazable 526, el dispositivo bombea por medio de los conductos 524, 529, 530 y 531 provocando que el fluido de la bolsa rota 206 fluya a través del conducto 270, hacia el conducto 275 y sobre la región de sensor 230.
57. El miembro de sellado cerrable 508, en algunos modos de realización, incluye una parte de la zona rígida que forma un miembro de sellado 532, y una parte de la zona flexible que forma un sello 533. El miembro de sellado 508 puede girar alrededor de la bisagra 534 y acoplar el sello 533 con el puerto de entrada de muestra 506 cuando está en una posición cerrada, proporcionando por tanto un sello hermético. De forma alternativa, se puede formar un sello hermético por contacto de dos materiales flexibles, por ejemplo, un elastómero termoplástico (TPE) sobre TPE. Opcionalmente, el puerto de entrada de muestra sellable 506 también incluye un orificio de ventilación (no mostrado). En un modo de realización alternativo, una parte de la zona rígida forma un elemento de sellado, y una parte de la zona flexible forma un sello perimetral alrededor del puerto de entrada de muestra, con lo que el elemento de sellado puede girar alrededor de una bisagra y acoplar el sello perimetral cuando está en una posición cerrada, proporcionando por tanto un sello hermético. De forma alternativa, el sello perimetral se puede formar por contacto de dos materiales flexibles. Aún en otro modo de realización, el miembro de sellado puede incluir un elemento de cierre deslizable como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7.682.833.
58. El rebajo de sensor 514, en algunos modos de realización, contiene una matriz de sensor que comprende uno 0 más sensores para uno o más analitos (o análisis de sangre) diferentes. Por ejemplo, la matriz de sensores puede incluir un inmunosensor y/o un inmunosensor magnético para uno o más analitos (o análisis de sangre) diferentes. El inmunosensor puede incluir un sensor de base o un electrodo sensor en un chip sustancialmente plano (por ejemplo, un chip sensor microfabricado tal como el al menos un chip sensor 415 descrito con respecto a la FIG. 4) donde el electrodo sensor se sitúa en el conducto 524 para recibir una muestra mezclada con un reactivo. El inmunosensor magnético puede incluir un sensor de base o electrodo sensor en un chip sustancialmente plano (preferentemente el mismo chip sensor que incluye el inmunosensor) donde el electrodo sensor se sitúa en el conducto 524 para recibir una muestra mezclada con reactivo que incluye perlas que se pueden atraer a un imán, o responder a un campo magnético que se sitúa cerca del inmunosensor magnético. En modos de realización alternativos, la matriz de sensores comprende una pluralidad de sensores para una pluralidad de analitos (o análisis de sangre) diferentes. En consecuencia, el cartucho 500 puede tener uno o más rebajos de sensor 514 cada uno con al menos un sensor.
59. Los analitos/propiedades a los que responden los sensores se pueden seleccionar de entre pH, pCO2, pO2, glucosa, lactato, creatinina, urea, sodio, potasio, cloruro, calcio, magnesio, fosfato, hematocrito, tiempo de protrombina (PT), tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT), tiempo de coagulación activado (ACT), dímero D, antígeno prostático específico (PSA), creatina cinasa-MB (CKMB), péptido natriurético cerebral (BNP), troponina 1 (Tnl), troponina cardíaca (cTnl), gonadotropina coriónica humana, troponina T, troponina C, mioglobina y similares, y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el analito se somete a prueba en una muestra líquida que es sangre completa, sin embargo, se pueden usar otras muestras incluyendo sangre, suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva y formas modificadas de las mismas. Las modificaciones pueden incluir dilución, concentración, adición de reactivos tales como anticoagulantes y similares. Cualquiera que sea el tipo de muestra, se puede acomodar por el puerto de entrada de muestra 502 del cartucho 500.
60. El cartucho 500 puede comprender además una parte de la zona flexible 536 situada sobre la región rebajada 520 que se configura para accionarse como una bomba para aplicar presión dentro de la región rebajada 520. En algunos modos de realización, la zona flexible 536 puede incluir una descripción de símbolo genérico para indicar al usuario que no se debe aplicar presión a la zona flexible 536 por el usuario. Por ejemplo, el símbolo puede comprender un círculo en relieve con una barra transversal. La parte de la zona flexible 536 proporciona una superficie que puede acomodar un rasgo característico de activador del analizador (por ejemplo, el analizador 305 como se describe con respecto a la FIG. 3) para aplicar una fuerza y reventar la bolsa subyacente en la región rebajada 520. El grosor del plástico en la zona flexible 536 puede ser preferentemente de aproximadamente 200 a aproximadamente 800 pm, por ejemplo, aproximadamente 400 pm. Esencialmente, la zona flexible 536 debe ser lo suficientemente fina para flexionarse fácilmente, pero lo suficientemente gruesa para mantener la integridad física y no romperse.
Diseños de sensor y chip
61. En un modo de realización, un chip sensor microfabricado (por ejemplo, el al menos un chip sensor 415 descrito con respecto a la figura 4) comprende al menos un sensor o transductor (por ejemplo, un electrodo de trabajo o detector óptico). Por ejemplo, el chip sensor microfabricado puede comprender un par de sensores que comprenden un primer sensor (por ejemplo, un sensor de sensibilidad en extremo bajo) y opcionalmente un segundo sensor (por ejemplo, un sensor de sensibilidad en extremo alto). En algunos modos de realización, los sensores se pueden fabricar como estructuras adyacentes, respectivamente, en un chip de silicio.
62. En diversos modos de realización, los sensores se pueden formar como electrodos con superficies de oro recubiertas con una capa de poliimida fotodefinida que incluye aberturas para definir una rejilla de pequeños electrodos de oro (por ejemplo, un electrodo de micromatriz de oro) en la que se puede oxidar una especie electroactiva. Por ejemplo, la microfabricación a nivel de oblea de un modo de realización preferente del chip sensor se puede lograr como se muestra en la FIG. 6A. Un sustrato no conductor 600 que tiene una superficie superior e inferior planas se puede usar como base para el chip sensor. Una capa conductora 602 se puede depositar sobre el sustrato 600 por medios convencionales, por ejemplo, impresión conductora o técnica de microfabricación conocida por los expertos en la técnica para formar al menos un transistor. La capa conductora 602 puede comprender un metal noble tal como oro, platino, plata, paladio, iridio o aleaciones de los mismos, aunque también se pueden usar otros metales no reactivos tales como titanio y wolframio o aleaciones de los mismos, ya que también se pueden usar muchos electrodos no metálicos de grafito, polímero conductor u otros materiales. El chip sensor microfabricado también puede comprender una conexión eléctrica 603 que conecta el electrodo a una clavija conductora tal como un conector eléctrico temporal.
63. En algunos modos de realización, los sensores pueden comprender una matriz de discos de metal noble de 5-10 |jm, por ejemplo, discos de metal noble de 7 jm , en centros de 15 jm . La matriz de discos o electrodos de metal noble puede cubrir una región, por ejemplo, una región circular, de aproximadamente 300 a 900 jm de diámetro, opcionalmente 400-800 jm o aproximadamente 600 jm de diámetro, y se puede formar fotomodelando una capa fina de poliimida o fotorresistente de grosor de hasta 1,5 jm sobre un sustrato hecho de una serie de capas que comprenden Si, SiO2, TiW y/o Au, o combinaciones de los mismos. En algunos modos de realización, los electrodos tienen un área de trabajo de aproximadamente 130.000 a 300.000 jm cuadrados (es decir, un microelectrodo), el volumen de muestra directamente sobre los electrodos puede ser de aproximadamente 0,1-0,3 j l y el volumen de la muestra sobre el chip sensor puede ser de 1-3 jl. De acuerdo con estos aspectos de la presente invención, el conducto (por ejemplo, el conducto 524 descrito con respecto a la FIG. 5A) en una región de los electrodos (por ejemplo, el uno o más rebajos de sensor 514 descritos con respecto a las FIGS. 5A-5J) tiene una proporción de volumen con respecto a área de sensor de menos de aproximadamente 6 jE a aproximadamente 1 mm cuadrado, preferentemente de menos de aproximadamente 50 mm a aproximadamente 2 mm cuadrados, más preferentemente de menos de aproximadamente 100 jm a aproximadamente 500 jm cuadrados. En consecuencia, la matriz de electrodos proporciona una alta eficacia de recogida de un resto detectable que es una especie electroactiva con una contribución reducida de cualquier corriente de fondo electroquímica asociada con la capacitancia del metal expuesto. En particular, las aberturas en la capa de poliimida o fotorresistente aislante definen una región de los electrodos de metal noble en la que la especie electroactiva, por ejemplo, 4-aminofenol, se puede oxidar tal como en una reacción de dos electrones por molécula.
64. Se pueden utilizar técnicas de microfabricación (por ejemplo, fotolitografía y depósito de plasma) para la construcción de estructuras de sensores de múltiples capas en espacios confinados. Por ejemplo, los procedimientos para la microfabricación de inmunosensores electroquímicos sobre sustratos de silicio se divulgan en la patente de EE. UU. n.° 5.200.051 e incluyen, por ejemplo, procedimientos de distribución, procedimientos para unir sustratos y reactivos a superficies incluyendo capas fotoformadas y procedimientos para realizar ensayos electroquímicos.
65. Como se muestra en la FIG. 6B, en algunos modos de realización, un chip sensor de intervalo extendido microfabricado 604 incluye un primer sensor 605 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo) y opcionalmente un segundo sensor 610 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto). El primer y segundo sensores 605, 610 se pueden fabricar como estructuras adyacentes, respectivamente, en el chip sensor 604. Sin embargo, para que el chip sensor 604 determine concentraciones de analito exactas, el sensor de sensibilidad en extremo bajo 605 se puede espaciar suficientemente del sensor de sensibilidad en extremo alto 610. Por ejemplo, a concentraciones bajas a medias de analito, el sensor de sensibilidad en extremo alto 610 puede generar una señal amperométrica alta debido a la alta concentración de reactivo marcador que se une a perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo. En modos de realización en los que el reactivo marcador usa una enzima para escindir un sustrato generando una especie electroactiva, la alta concentración de la especie electroactiva en el sensor de sensibilidad en extremo alto 610 se puede mover a lo largo del chip sensor 604 y generar una señal amperométrica en el sensor de sensibilidad en extremo alto 605. De forma alternativa, la baja concentración de la especie electroactiva en el sensor de sensibilidad en extremo bajo también se podría mover a lo largo del chip sensor y generar una señal amperométrica en el sensor de sensibilidad en extremo alto. La magnitud de esta interferencia entre los sensores depende de muchos factores y puede mostrar variabilidad entre las ejecuciones del dispositivo sensor, provocando un incremento en la imprecisión en la lectura amperométrica del sensor de sensibilidad en extremo bajo y/o el sensor de sensibilidad en extremo alto. En consecuencia, para reducir la interferencia entre sensores, puede ser beneficioso en determinados modos de realización espaciar los dos sensores entre sí en una distancia predeterminada.
66. El primer sensor 605 y el segundo sensor 610 están espaciados entre sí a una distancia "x" predeterminada. Por ejemplo, el primer sensor 605 se puede espaciar al menos 0,03 mm, preferentemente al menos 0,06 mm del segundo sensor 610. El primer sensor 605 se puede conectar por medio del cableado 615 a una primera clavija conductora 620 (por ejemplo, un conector eléctrico temporal) y el segundo sensor 610 se puede conectar por medio del cableado 625 a una segunda clavija conductora 630 (por ejemplo, un conector eléctrico temporal). En algunos modos de realización, el primer sensor 605 se puede configurar como un inmunosensor (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo) y el segundo sensor 610 se puede configurar como un inmunosensor magnético (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto) de los que ambos se forman en el único chip sensor 604 y se sitúan dentro de uno o más conductos del cartucho de prueba de diagnóstico inmediato. Aunque se muestra en la FIG. 6B que el segundo sensor 610 se dispone corriente arriba del primer sensor 605, se debe entender que los modos de realización alternativas de la presente invención contemplan tener el segundo sensor 610 dispuesto corriente abajo del primer sensor 605.
67. Como se ilustra en la FIG. 6B, el primer sensor 605 se puede construir con una matriz de electrodos o discos metálicos que cubren una región circular en una primera área del chip sensor 604 y el segundo sensor 610 se puede construir con una matriz de electrodos o discos metálicos que cubren una región circular en una segunda área del chip sensor 604. El diseño y disposición del primer y segundo sensores 605 y 610 en el chip sensor 604 se seleccionan preferentemente en base a las características de impresión y rendimiento (por ejemplo, minimizar la interferencia entre los sensores) para cada uno del primer y segundo sensores 605 y 610. Sin embargo, se debe entender para los expertos en la técnica que cualquier diseño o disposición para los sensores se contempla sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención. Además, aunque el primer y segundo sensores 605 y 610 en el ejemplo en la FIG. 6B se describen en el presente documento como sensores amperométricos, se pueden usar otros procesos electroquímicos o procesos ópticos que usan otros sensores electroquímicos u ópticos, por ejemplo, guías de ondas ópticas y chips de cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD). Por ejemplo, se puede usar un sensor potenciométrico para detectar especies de iones tales como Na+ o K+.
68. Como se describe en el presente documento, el primer y segundo sensores 605 y 610 se pueden formar como electrodos con superficies de oro que se exponen (por ejemplo, sin recubrimiento de poliimida o fotorresistente) al entorno interior del conducto y se configuran para estar en contacto directamente con una muestra biológica dispuesta dentro del conducto. Los cableados 615 y 620 se pueden formar con superficies de oro que se recubren con una capa de poliimida fotodefinida o fotorresistente de modo que los cableados 615 y 620 están aislados de la exposición a la muestra biológica dispuesta dentro del conducto. Los cableados 615 y 620 se pueden formar comprendiendo las estructuras de anillo de contención 635 y 640. En algunos modos de realización, la estructura de anillo de contención 635 para el primer sensor 605 se puede configurar para contener anticuerpos de captura inmovilizados en o cerca de la superficie de los electrodos. Por ejemplo, los anticuerpos de captura (como se analiza en el presente documento) se pueden depositar sobre al menos una parte del primer sensor 605 dentro de la estructura del anillo de contención 635. Los cableados 615 y 620 terminan en la primera clavija conductora 620 y la segunda clavija conductora 630 respectivamente, que se usan para hacer contacto con un conector en un analizador o lector de cartucho (por ejemplo, un lector de cartucho i-STAT® como se describe en la patente de EE. UU. N° 4.954.087).
69. En diversos modos de realización, el primer sensor 605 es un inmunosensor situado en el conducto para recibir una muestra biológica mezclada con un conjugado anticuerpo-enzima que se configura para unirse a un analito diana dentro de la muestra biológica. El primer sensor 605 se puede configurar para detectar una especie electroactiva producida enzimáticamente (por ejemplo, 4-aminofenol) a partir de la reacción de un sustrato (por ejemplo, 4-aminofenilfosfato) con el conjugado anticuerpo-enzima (por ejemplo, uno o más anticuerpos unidos a fosfatasa alcalina (ALP)). De acuerdo con estos aspectos, el primer sensor 605 contiene una región o regiones de captura recubiertas con anticuerpos de captura 645 que se configuran para unirse a un analito diana unido a un conjugado anticuerpo-enzima. La región de captura 645 se puede definir por la estructura de anillo de contención 635. En algunos modos de realización, la estructura de anillo de contención 635 es un anillo hidrófobo de poliimida u otra capa producida fotolitográficamente. Una microgotita o varias microgotitas (de aproximadamente 5-40 nl de tamaño) que contienen anticuerpos de captura de alguna forma, por ejemplo, unidos a perlas o microesferas, se pueden distribuir sobre la superficie del primer sensor 605. La estructura anular fotodefinida 635 contiene esta gotita acuosa permitiendo que la región de captura 645 se localice con una precisión de unos pocos micrómetros. La región de captura 645 se puede fabricar de 0,03 a aproximadamente 2 mm2 de tamaño. El extremo superior de este tamaño se limita por el tamaño del conducto y chip sensor 604 en los presentes modos de realización, y no es una limitación de la invención.
70. En algunos modos de realización, una parte del chip sensor 604 (por ejemplo, una superficie superior del sustrato), una pared del conducto (por ejemplo, el conducto 524 descrito con respecto a la FlG. 5A) y/o una pared de la cámara de muestra (por ejemplo, la cámara de muestra 510 descrita con respecto a las FIGS. 5G y 5H) se puede recubrir con uno o más reactivos secos para modificar la muestra biológica. Por ejemplo, el chip sensor 604 puede incluir una región de reactivo 650 recubierta con un conjugado anticuerpo-enzima para un analito de interés. La región de reactivo 650 se puede definir por una estructura de anillo de contención 655. En algunos modos de realización, la estructura de anillo de contención 655 es un anillo hidrófobo de poliimida u otra capa producida fotolitográficamente. Una microgotita o varias microgotitas (de aproximadamente de 5- 40 nl de tamaño) o una serie de aproximadamente 100 nanogotas (aproximadamente de 50 a 1000 pl de tamaño) que contienen el conjugado anticuerpo-enzima de alguna forma se pueden distribuir o imprimir en la superficie del chip sensor 604. La estructura anular fotodefinida 655 contiene esta gotita acuosa permitiendo que la región de reactivo 650 se localice con una precisión de unos pocos micrómetros. La región de reactivo 650 se puede fabricar de 0,03 a aproximadamente 2 mm2 de tamaño. El extremo superior de este tamaño se limita por el tamaño del conducto y chip sensor 604 en los presentes modos de realización, y no es una limitación de la invención.
71. La muestra biológica o un fluido se puede pasar al menos una vez sobre el reactivo seco, por ejemplo, la región de reactivo 650 para disolver el reactivo dentro de la muestra biológica o fluido. Los reactivos usados para modificar muestras biológicas o fluido dentro del cartucho pueden incluir el conjugado anticuerpo-enzima, perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos de captura o agentes bloqueantes que evitan reacciones de unión específicas o inespecíficas entre los compuestos de ensayo. Dentro de un segmento de la muestra biológica o fluido, el reactivo se puede disolver y concentrar preferentemente dentro de una región predeterminada del segmento. Esto se logra a través del control de la posición y movimiento del segmento. Por tanto, por ejemplo, si solo una parte de un segmento, tal como el borde frontal, se mueve alternativamente sobre el reactivo, a continuación se puede lograr una concentración local alta del reactivo cerca del borde frontal. De forma alternativa, si se desea una distribución homogénea del reactivo, por ejemplo, si se requiere una concentración conocida de un reactivo para un análisis cuantitativo, a continuación otro movimiento alternativo de la muestra o fluido dará como resultado una mezcla y una distribución uniforme.
72. En los modos de realización preferentes de la presente invención, el analizador aplica un potencial por medio de la primera clavija conductora 620 al primer sensor 605 y un electrodo de referencia, y mide los cambios de corriente generados por la corriente de oxidación del sustrato como una señal electroquímica. Siendo la señal electroquímica proporcional a la concentración del analito en la muestra biológica. El primer sensor 605 tiene un potencial aplicado de aproximadamente 0 mV a 90 mV, por ejemplo, 60 mV frente al electrodo de referencia y, en otro modo de realización preferente, el primer sensor 605 tiene un potencial aplicado de aproximadamente 40 mV frente al electrodo de referencia. La señal generada por el producto de reacción enzimática a aproximadamente 10 mV se distingue de la señal generada por el sustrato sin reaccionar a aproximadamente 200 mV. Cabe señalar que los voltajes exactos usados para detectar amperométricamente el sustrato y el analito variarán dependiendo de la estructura química del sustrato. Es importante que la diferencia en los voltajes usados para detectar el sustrato sea lo suficientemente grande para evitar interferencias entre las lecturas.
73. En diversos modos de realización, el segundo sensor 610 es un inmunosensor magnético situado en el conducto para recibir una muestra biológica mezclada con perlas que se pueden atraer por un imán o responder a un campo magnético. Las perlas se recubren con anticuerpos de captura que se configuran para unirse al analito diana unido al conjugado anticuerpo-enzima, por ejemplo, el conjugado anticuerpo-enzima dispuesto en la región de reactivo 650 y posteriormente disuelto en la muestra biológica. El segundo sensor 610 se puede configurar para detectar una especie electroactiva producida enzimáticamente (por ejemplo, 4-aminofenol) a partir de la reacción de un sustrato (por ejemplo, 4-aminofenilfosfato) con el conjugado anticuerpo-enzima (por ejemplo, uno o más anticuerpos unidos a fosfatasa alcalina (ALP)). De acuerdo con estos aspectos, un imán de campo alto, por ejemplo, un imán permanente o un electroimán, se puede situar próximo al chip sensor 604 (por ejemplo, debajo) o incorporarse en el chip sensor 604, para generar un campo magnético para atraer las perlas mezcladas con la muestra biológica en el conducto hasta una localización sustancialmente próxima al segundo sensor 610. El campo magnético se localiza alrededor del segundo sensor 610 en base a la distancia predeterminada "x" entre el primer sensor 605 y el segundo sensor 610, y funciona para retener sustancialmente las perlas en o cerca de la superficie del segundo sensor 610 durante la retirada de muestra no unida y el lavado de los electrodos.
74. El imán de campo alto de la presente invención puede incluir cualquier material que proporcione un campo magnético alto (por ejemplo, mayor de aproximadamente 0,1 Tesla, mayor de 0,4 Tesla o mayor de 1 Tesla). El campo magnético se puede medir, por ejemplo, como un campo remanente en un área de superficie sustancialmente plana del imán. En algunos modos de realización, el imán de campo alto está compuesto de un material tal como aleación de neodimio, hierro y boro (NdFeB) (por ejemplo, Nd2Fe14B), o ferrita o níquel, aluminio y cobalto (AlNiCo), que típicamente presentan campos de más de 0,1 Tesla, por ejemplo, más de 0,5 Tesla o de 0,1 a 1 Tesla. En otros modos de realización, el imán de campo alto está compuesto de aleaciones de elementos de tierras raras (por ejemplo, aleaciones de neodimio y aleaciones de samario y cobalto (SmCo)), que presentan campos de más de 0,1 Tesla, por ejemplo, más de 1,2 Tesla o más de 1,4 Tesla. En modos de realización alternativos, el imán de campo alto comprende un electroimán en el que el campo magnético se produce por el flujo de corriente eléctrica. La corriente eléctrica se puede proporcionar por un analizador, en el que el dispositivo sensor se inserta y con el que el dispositivo sensor está en contacto eléctrico.
75. El imán de campo alto se puede proporcionar próximo al chip sensor 604 (por ejemplo, a continuación) o incorporarse en el chip sensor 604 usando varias técnicas como se describe en detalle en el presente documento. En algunos modos de realización, el segundo sensor 610 comprende un electrodo sensor sobre un sustrato sustancialmente plano y un imán de campo alto permanente a granel situado próximo al electrodo (por ejemplo, debajo o en el lado opuesto del chip sensor 604). En determinados modos de realización preferentes, el imán de campo alto permanente a granel se sitúa en la carcasa (por ejemplo, corte o canal en la zona rígida del cartucho) del dispositivo sensor. Por ejemplo, el imán de campo alto permanente a granel se puede situar dentro de la base de la carcasa del cartucho (por ejemplo, no coplanar con el chip sensor). En otros modos de realización, el imán de campo alto se sitúa adyacente a o dentro del analizador, en el que se inserta el dispositivo sensor. El imán de campo alto permanente a granel puede ser sustancialmente cilíndrico, teniendo un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 5 mm y una longitud de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 5 mm, y se sitúa para proporcionar un "horizonte de sucesos" (como se define en el presente documento) en el conducto adecuado para la captura de perlas dentro de un período de tiempo corto (por ejemplo, 1-5 minutos). El conducto tiene en general una altura de aproximadamente 0,2 mm a aproximadamente 5 mm y una anchura de aproximadamente 0,2 mm a aproximadamente 5 mm, y un área de sección transversal uniforme o bien no uniforme. De forma alternativa, la conformación del imán a granel puede tener la forma de un cuadrado, rectángulo, óvalo, escamas, pirámide, esfera, subesfera u otra forma conformada.
76. En modos de realización alternativos, el segundo sensor 610 comprende un electrodo sensor sobre un sustrato sustancialmente plano y una capa magnetizada (por ejemplo, una capa magnética microfabricada). La capa magnetizada se puede incluir en (por ejemplo, situarse sobre, unirse directamente, recubrirse o modelarse sobre cualquier superficie del chip sensor 604) o incrustarse en el chip (por ejemplo, situarse dentro del chip, integral al chip). Esta configuración atrae las perlas magnéticamente susceptibles sustancialmente próximas a o sobre el electrodo sensor y las retiene sustancialmente en el electrodo sensor durante la retirada de muestra no unida y el lavado del electrodo sensor.
77. La capa magnetizada puede ser un material compuesto formado a partir de un material magnético particulado que puede sostener un campo magnético permanente de campo alto, por ejemplo, una aleación de NdFeB, en un aglutinante o matriz de soporte (por ejemplo, una tinta termoendurecible, una poliimida, poli(alcohol vinílico) (PVA) o termoplástico equivalente). Además de la tinta termoendurecible, poliimida, PVA y equivalentes termoplásticos, se pueden usar resinas epoxi curadas químicamente de dos componentes, Kapton y similares como aglutinante para fijar el material magnético particulado al chip sensor. En algunos modos de realización, el aglutinante está compuesto de una tinta termoendurecible tal como una tinta de serigrafía encapsulante a base de disolvente o un polímero de ácido acrílico en un disolvente. En modos de realización alternativos, el aglutinante está compuesto de otros materiales de matriz fotoformados. Los procedimientos de curado del material compuesto se pueden basar en un proceso fotoiniciado, iniciado térmicamente o iniciado químicamente. El material compuesto no se limita por la viscosidad y puede incluir cualquier viscosidad adecuada para su aplicación. En algunos modos de realización, el material compuesto tiene una viscosidad que varía de 0,3 a 300.000 cP, por ejemplo, de 100 a 100.000 cP o de 1.000 a 10.000 cP. Las partículas magnéticas en el material compuesto de determinados modos de realización tienen un tamaño de partícula promedio de 0,01 pm a 100 pm, por ejemplo, de 0,1 pm a 10 pm o de 3 pm a 7 pm.
78. El material compuesto se puede aplicar en una variedad de localizaciones en o sobre el dispositivo sensor (por ejemplo, en el lado frontal o lado posterior de una oblea o chip, electrodo, carcasa, lector, etc.). Por ejemplo, en algunos modos de realización, el material compuesto se aplica al chip sensor en forma de patrón (por ejemplo, usando una máscara). En otros modos de realización, el material compuesto se aplica al electrodo sensor. En otros modos de realización, el material compuesto se aplica en una capa magnetizada debajo del electrodo sensor. Antes de la aplicación de la capa magnetizada, la capa magnetizada se puede magnetizar o no. Sin embargo, después de la aplicación, la capa magnética preferentemente se magnetiza para proporcionar direccionalidad al campo magnético generado por la capa magnetizada.
79. En algunos modos de realización, una parte del chip sensor 604 (por ejemplo, una superficie superior del sustrato), una pared del conducto (por ejemplo, el conducto 524 descrito con respecto a la FIG. 5A) y/o una pared de la cámara de muestra (por ejemplo, la cámara de muestra 510 descrita con respecto a las FIGS. 5G y 5H) se puede recubrir con uno o más reactivos secos para modificar la muestra biológica. Por ejemplo, el chip sensor 604 puede incluir una región de reactivo 660 recubierta con perlas magnéticas que tienen anticuerpos de captura para un analito de interés. La región de reactivo 660 se puede definir por una estructura de anillo de contención 665. En algunos modos de realización, la estructura de anillo de contención 665 es un anillo hidrófobo de poliimida u otra capa producida fotolitográficamente. Una microgotita o varias microgotitas (de aproximadamente 5-40 nl de tamaño) que contienen el conjugado anticuerpo-enzima de alguna forma se pueden distribuir o imprimir en la superficie del chip sensor 604. La estructura anular fotodefinida 665 contiene esta gotita acuosa permitiendo que la región de reactivo 660 se localice con una precisión de unos pocos micrómetros. La región de reactivo 665 se puede fabricar de 0,03 a aproximadamente 2 mm2 de tamaño. El extremo superior de este tamaño se limita por el tamaño del conducto y chip sensor 604 en los presentes modos de realización, y no es una limitación de la invención. Aunque se muestra en la FIG. 6B que la región de reactivo 660 se dispone corriente arriba de la región de reactivo 650, se debe entender que los modos de realización alternativos de la presente invención contemplan tener la región de reactivo 660 dispuesta corriente abajo de la región de reactivo 650.
80. La muestra biológica o un fluido se puede pasar al menos una vez sobre el reactivo seco, por ejemplo, la región de reactivo 660 para disolver el reactivo dentro de la muestra biológica o fluido. Los reactivos usados para modificar muestras biológicas o fluido dentro del cartucho pueden incluir el conjugado anticuerpo-enzima, perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos de captura o agentes bloqueantes que evitan reacciones de unión específicas o inespecíficas entre los compuestos de ensayo. Dentro de un segmento de la muestra biológica o fluido, el reactivo se puede disolver y concentrar preferentemente dentro de una región predeterminada del segmento. Esto se logra a través del control de la posición y movimiento del segmento. Por tanto, por ejemplo, si solo una parte de un segmento, tal como el borde frontal, se mueve alternativamente sobre el reactivo, a continuación se puede lograr una concentración local alta del reactivo cerca del borde frontal. De forma alternativa, si se desea una distribución homogénea del reactivo, por ejemplo, si se requiere una concentración conocida de un reactivo para un análisis cuantitativo, a continuación otro movimiento alternativo de la muestra o fluido dará como resultado una mezcla y una distribución uniforme.
81. En los modos de realización preferentes de la presente invención, el analizador aplica un potencial por medio de la segunda clavija conductora 630 al segundo sensor 610 y un electrodo de referencia, y mide cambios de corriente generados por la corriente de oxidación del sustrato como una señal electroquímica. Siendo la señal electroquímica proporcional a la concentración del analito en la muestra biológica. El segundo sensor 610 tiene un potencial aplicado de aproximadamente 0 mV a 90 mV, por ejemplo, 60 mV frente al electrodo de referencia y, en otro modo de realización preferente, el primer sensor 605 tiene un potencial aplicado de aproximadamente 40 mV frente al electrodo de referencia. La señal generada por el producto de reacción enzimática a aproximadamente 10 mV se distingue de la señal generada por el sustrato sin reaccionar a aproximadamente 200 mV. Cabe señalar que los voltajes exactos usados para detectar amperométricamente el sustrato y el analito variarán dependiendo de la estructura química del sustrato. Es importante que la diferencia en los voltajes usados para detectar el sustrato sea lo suficientemente grande para evitar interferencias entre las lecturas.
82. En algunos modos de realización, el chip sensor 604 puede incluir además un sensor conductimétrico 670 (por ejemplo, sensores de hematocrito). El sensor conductimétrico 670 se configura para determinar la llegada y/o salida de muestra biológica en las regiones de reactivo 650 y 660 y la llegada y/o salida de muestra biológica en el primer y segundo sensores 605 y 610. Más específicamente, el sensor conductimétrico 670 se encuentra perpendicular a una longitud del conducto o conducto de sensor, y se puede usar una resistencia eléctrica entre pares de electrodos para el sensor para realizar el seguimiento de una posición relativa de un frente de fluido de la muestra biológica. En los extremos, una lectura de circuito abierto indica que la muestra biológica se ha expulsado de las regiones de reactivo 650 y 660 y una lectura de circuito cerrado indica que las regiones de reactivo 650 y 660 se cubren con la muestra biológica.
83. Como se muestra en la FIG. 6B, el sensor conductimétrico 670 puede comprender al menos dos electrodos 675 y 680 (es decir, par de electrodos) situados corriente abajo del primer y segundo sensores 605 y 610. Los electrodos 675 y 680 se pueden conectar por medio de los cableados 685 y 690 a una clavija conductimétrica baja 692 y una fuente de CA o clavija conductimétrica alta 695, respectivamente (por ejemplo, conectores eléctricos temporales). Los cableados 685 y 690 se pueden formar con una superficie de oro que se recubre con una capa de poliimida fotodefinida o fotorresistente de modo que los cableados 685 y 690 están aislados de la exposición a la muestra biológica dispuesta dentro de los conductos. Como tal, en algunos modos de realización, la muestra biológica o fluido alcanza el par de electrodos en un conducto (por ejemplo, antes de llegar al primer y segundo sensores 605 y 610), a continuación llega posteriormente al primer y segundo sensores 605 y 610 (por ejemplo, después de salir de las regiones de reactivo 650 y 660).
84. Como se muestra en la FIG. 7, en modos de realización alternativos, un chip sensor microfabricado 700 incluye un primer sensor 705 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo) y opcionalmente un segundo sensor 710 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto), como se describe de forma similar con respecto a la FIG. 6B. Sin embargo, como se ilustra en la FIG. 7, el primer sensor 705 se puede construir con una matriz de discos metálicos o electrodos que cubren una región circular en una primera área del chip sensor 700 y el segundo sensor 710 se puede construir con una matriz de discos metálicos o electrodos que cubren un región cuadrada o alargada 715 en una segunda área del chip sensor 700. La región cuadrada o alargada 715 en una segunda área del chip sensor 700 proporciona un área de superficie más grande para que el imán o campo magnético capture las perlas recubiertas con anticuerpos de captura dispersados con la muestra biológica, a medida que la muestra biológica pasa a través del conducto sobre el sensores. Como se debe entender, el chip sensor microfabricado 700 puede incluir uno o más de los mismos rasgos característicos adicionales tales como las regiones de reactivo y el sensor conductimétrico como se describe con respecto al chip sensor 604 y la FIG. 6B.
85. Como se muestra en las FIGS. 8A y 8B, en otros modos de realización diseñados para reducir la interferencia entre los dos sensores, se proporciona un chip sensor de intervalo extendido microfabricado 800 (por ejemplo, el al menos un chip sensor 415 descrito con respecto a la FIG.4) que comprende un par de sensores que comprenden un primer sensor (por ejemplo, un sensor de sensibilidad en extremo bajo) y un segundo sensor (por ejemplo, un sensor de sensibilidad en extremo alto) con un electrodo de barrido provisto entre los sensores. En algunos modos de realización, el primer y segundo sensores se pueden fabricar como estructuras adyacentes, respectivamente, en un chip de silicio. Sin embargo, para que el chip sensor de intervalo extendido determine concentraciones de analito exactas, el sensor de sensibilidad en extremo bajo se puede aislar suficientemente del sensor de sensibilidad en extremo alto. Por ejemplo, a concentraciones bajas a medias de analito, el sensor de sensibilidad en extremo alto puede generar una señal amperométrica alta debido a la alta concentración del reactivo marcador que se une a las perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo. En modos de realización en los que el reactivo marcador usa una enzima para escindir un sustrato generando una especie electroactiva, la alta concentración de la especie electroactiva en el sensor de sensibilidad en extremo alto se puede mover a lo largo del chip sensor y generar una señal amperométrica en el sensor de sensibilidad en extremo alto. De forma alternativa, la baja concentración de la especie electroactiva en el sensor de sensibilidad en extremo bajo también se podría mover a lo largo del chip sensor y generar una señal amperométrica en el sensor de sensibilidad en extremo alto. La magnitud de esta interferencia entre los sensores depende de muchos factores y puede mostrar variabilidad entre las ejecuciones del dispositivo sensor, provocando un incremento en la imprecisión en la lectura amperométrica del sensor de sensibilidad en extremo bajo y/o el sensor de sensibilidad en extremo alto. En consecuencia, puede ser beneficioso en determinadas circunstancias reducir la interferencia entre los dos sensores en el chip sensor de intervalo extendido usando un electrodo de barrido.
86. El chip sensor microfabricado 800 incluye un primer sensor 805 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo) y un segundo sensor 810 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto), como se describe de forma similar con respecto a la FIG. 6B. Sin embargo, el primer sensor 805 y el segundo sensor 810 se espacian entre sí a una distancia incrementada "y" en comparación con el chip sensor 604 mostrado en la FIG. 6b . Por ejemplo, el primer sensor 805 se puede espaciar al menos 0,2 mm, preferentemente al menos 0,5 mm del segundo sensor 810. El primer sensor 805 se puede conectar por medio del cableado 815 a una primera clavija conductora 820 (por ejemplo, un conector eléctrico temporal) y el segundo sensor 810 se puede conectar por medio del cableado 825 a una segunda clavija conductora 830 (por ejemplo, un conector eléctrico temporal). En algunos modos de realización, el primer sensor 805 se puede configurar como un inmunosensor (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo) y el segundo sensor 810 se puede configurar como un inmunosensor magnético (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto) de los que ambos se forman en el único chip sensor 800 y se sitúan dentro de uno o más conductos del cartucho de prueba de diagnóstico inmediato.
87. Como se muestra en las FIGS. 8A y 8B, el espaciado incrementado "y" entre el primer sensor 805 y el segundo sensor 810 permite situar un electrodo de barrido 835 entre el primer sensor 805 y el segundo sensor 810. Específicamente, el diseño y disposición del primer y segundo sensores 805 y 810 en el chip sensor 800 se seleccionan para permitir la adición del electrodo de barrido 835 entre el primer sensor 805 y el segundo sensor 810. El electrodo de barrido 835 se configura para oxidar las especies electroactivas generadas en el segundo sensor 810 de modo que las señales altas en el segundo sensor 810 no dan como resultado una interferencia significativa en el primer sensor 805 y/o señales bajas en el primer sensor 805 no dan como resultado una interferencia significativa en el segundo sensor 810. Por ejemplo, el electrodo de barrido se configura para (i) evitar que las especies electroactivas generadas en una región del segundo sensor se difundan al primer sensor, (ii) evitar que las especies electroactivas generadas en una región del segundo sensor se transporten al primero sensor, (iii) evitar que las especies electroactivas generadas en una región del segundo sensor se detecten en el primer sensor, (iv) evitar que las especies electroactivas generadas en una región del primer sensor se difundan al segundo sensor, (v) evitar que las especies electroactivas generadas en una región del primer sensor se transporten al segundo sensor, y/o (vi) evitar que las especies electroactivas generadas en una región del primer sensor se detecten en el segundo sensor.
88. En algunos modos de realización, como se muestra en la FIG. 8A, el electrodo de barrido 835 se conecta por medio del cableado 840 al segundo sensor 810. En modos de realización alternativos, como se muestra en la FIG.
8B, el electrodo de barrido 1735 se conecta por medio del cableado 845 a una clavija conductimétrica baja 850 (por ejemplo, conector eléctrico temporal para el sensor de conductividad). Ambas configuraciones del electrodo de barrido 835 se diseñan para minimizar la interferencia mientras dan como resultado un bajo impacto en la señal generada en el segundo sensor 810 y la señal generada en el primer sensor 805. Como se debe entender, el chip sensor microfabricado 800 puede incluir uno o más de los mismos rasgos característicos adicionales tales como las regiones de reactivo y el sensor conductimétrico como se describe con respecto al chip sensor 604 y la FIG.
6B.
Configuraciones de inmunosensor magnético
89. Las FIGS. 9A-9C muestran tres modos de realización ejemplares de un inmunosensor magnético (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto 610 como se describe con respecto a la FIG. 6B) donde el componente magnético se integra directamente en la base o carcasa del cartucho del dispositivo sensor. En cada modo de realización mostrado en las FIGS. 9A-9C, el chip sensor 900 incluye un inmunosensor 905 dispuesto en un conducto 910 y situado sobre una superficie de un sustrato 915 encima de un imán de campo alto 920. El imán de campo alto 920 puede ser cilíndrico con una longitud de desde 1 mm a 10 mm, por ejemplo, de 2 mm a 5 mm, preferentemente aproximadamente 3 mm, y un diámetro de desde 0,1 mm a 5 mm, por ejemplo, de 0,5 mm a 2 mm. En las FIGS. 9A-9C, el imán de campo alto 920 tiene diámetros de aproximadamente 1 mm, aproximadamente 0,5 mm y aproximadamente 0,3 mm, respectivamente. El imán de campo alto 920 está dentro de la base o carcasa del cartucho 925 (por ejemplo, una parte inferior o base 504 como se describe con respecto a las FIGS. 5A-5J) del dispositivo sensor y opcionalmente se apoya en el lado inferior del chip sensor 900, que preferentemente tiene un grosor de desde aproximadamente 0,2 mm a 5 mm, por ejemplo, de 0,5 mm a 2 mm o preferentemente de aproximadamente 1 mm. De acuerdo con estos aspectos, un imán de campo alto, por ejemplo, un imán permanente o un electroimán, se puede situar próximo al chip sensor 900 (por ejemplo, debajo), para atraer perlas magnéticamente susceptibles en el conducto sustancialmente próximo a o sobre el sensor 905.
90. Como se muestra en la FIG. 10, un dispositivo 1000 para detectar un analito en una muestra biológica de acuerdo con algunos aspectos de la presente invención comprende un sustrato 1005 que incluye una superficie superior e inferior plana 1010, 1015, un primer sensor electroquímico 1020 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto) situado en la superficie superior 1010 del sustrato 1005, y un segundo sensor electroquímico 1025 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto) situado en la superficie superior 1010 del sustrato 1005 y adyacente al primer sensor electroquímico 1020. En algunos modos de realización, el sustrato 1005 se dispone dentro de un conducto 1027 del dispositivo 1000. El sustrato 1005 puede estar compuesto por un material base seleccionado del grupo que consiste en silicio, vidrio y plástico. El primer sensor electroquímico 1020 puede incluir una capa inmovilizada de anticuerpo 1030 configurada para unirse a un analito tal como cTnI. El primer sensor electroquímico 1020 y el segundo sensor electroquímico 1025 pueden comprender un electrodo de micromatriz de oro y tener un diámetro de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 500 pm o de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 1500 pm.
91. El dispositivo 1000 incluye además (i) una primera región de reactivo 1035 en el sustrato 1005 recubierta con un conjugado anticuerpo-enzima para el analito, y/o (ii) una segunda región de reactivo 1040 en el sustrato 1005 recubierta con perlas magnéticas que tienen anticuerpos de captura para el analito. Las regiones de reactivo 1035, 1040 se pueden definir por una estructura de anillo de contención 1045, 1050, respectivamente. En otros modos de realización, las regiones reactivas 1035, 1040 se pueden situar en el conducto 1027 (por ejemplo, el conducto 524 descrito con respecto a la FIG. 5A), y/o en la cámara de muestra (por ejemplo, la cámara de muestra 510 descrita con respecto a FIGS. 5G y 5H).
92. El dispositivo 1000 incluye además una carcasa 1055 que soporta el sustrato 1005. Teniendo la carcasa 1055 una abertura o canal 1060 que se extiende hasta una región 1065 en la carcasa debajo del segundo sensor electroquímico 1025. La abertura o canal 1060 comprende un imán de campo alto 1070 (por ejemplo, un imán de campo alto permanente a granel) que opcionalmente se apoya en la superficie inferior plana 1015 del sustrato 1005. El imán de campo alto 1070 tiene una conformación (por ejemplo, una conformación que es sustancialmente triangular, trapezoidal, de columna, rectángulo, cuadrada, circular, piramidal, etc. (sustancialmente en este contexto se entendería por los expertos en la técnica que quiere decir que visualmente la conformación es por lo general triangular, trapezoidal, de columna, rectángulo, cuadrada, circular, piramidal, etc.)) que encaja dentro de la abertura o canal 1060. Además, el imán de campo alto 1070 genera un campo magnético 1075 que se alinea (por ejemplo, en un mismo plano vertical) con respecto al segundo sensor electroquímico 1025 y/o ortogonal a un plano horizontal de la superficie superior 1010 del sustrato 1005. El campo magnético 1075 se configura para enfocar y atraer las perlas magnéticas sobre una superficie del segundo sensor electroquímico 1025 una vez que las perlas magnéticas se mezclan con la muestra biológica.
93. En modos de realización alternativos, se proporciona un inmunosensor magnético (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto 610 como se describe con respecto a la FlG. 6B) donde el componente magnético se integra directamente en la fabricación del sensor, en lugar de ser un componente separado (por ejemplo, imán de campo alto permanente a granel) que requiere ensamblaje en la base o carcasa del cartucho del dispositivo sensor. La capa magnetizada se puede formar a partir de un material compuesto, por ejemplo, suspensión, que comprende un material magnético particulado que puede sostener un campo magnético permanente de campo alto, por ejemplo, una aleación de NdFeB, en un aglutinante o matriz de soporte (por ejemplo, una poliimida, poli(alcohol vinílico) (PVA) o termoplástico equivalente). En un modo de realización, una mezcla de poli(alcohol vinílico) (PVA) fotoformable mezclado con Nd2Fe14B en polvo molido sobre una oblea usando un aparato microdistribuidor del tipo descrito en la patente de EE. UU. n.° 5.554.339. El área impresa puede ser de un diámetro de aproximadamente 400 pm, o de 200 a 600 pm. Las FIGS. 11A y 11B muestran inmunosensores ejemplares 1100 cubiertos parcialmente con una matriz de partículas de poliimida y NdFeB impresas 1105 dejando expuesta una parte 1110 del perímetro de los inmunosensores magnéticos.
94. En otro modo de realización, la suspensión de partículas magnetizables (por ejemplo, Nd2Fe14B en polvo molido) se deposita en un canal dentro del sustrato no conductor u oblea del chip sensor microfabricado. La FIG.
12 ilustra el proceso de formación de canales que comprende inicialmente grabar un sustrato no conductor 1200 (por ejemplo, una oblea de silicio) que tiene un recubrimiento de superficie de material fotorresistente 1205 con ácido fluorhídrico (HF) y a continuación grabar el sustrato con hidróxido de potasio (KOH) caliente o hidróxido de trimetilamonio (TMAH) para dejar un canal 1210 de perfil controlado (por ejemplo, una conformación que es sustancialmente triangular, trapezoidal, de columna, rectángulo, cuadrada, circular, piradimal, etc. (sustancialmente en este contexto se entendería por los expertos en la técnica que quiere decir que visualmente la conformación es por lo general triangular, trapezoidal, de columna, rectángulo, cuadrada, circular, piramidal, etc.)) y dimensiones (por ejemplo, una profundidad y anchura de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 600 pm). Una suspensión de partículas magnetizables (por ejemplo, aleación de NdFeB en polvo) en una matriz termoplástica (por ejemplo, poliimida) a continuación se microdistribuye 1215 o se recubre por rotación 1220 en el canal 1210 para formar una capa magnetizada 1225 que tiene una superficie sustancialmente plana coplanar con el sustrato 1200. El sustrato 1200 se puede procesar además, como se describe en las patentes de EE. UU. n.os de propiedad conjunta 7.419.821 y 7.723.099 para proporcionar una matriz de inmunosensores 1230 sobre cada canal grabado 1210 en el sustrato 1200. La matriz de inmunosensores 1230 se puede depositar directamente sobre la capa magnetizada 1225 como se muestra en (a) o sobre la capa magnetizada 1225 como se muestra en (b).
95. Como se muestra en la FIG. 13, un dispositivo 1300 para detectar un analito en una muestra biológica de acuerdo con algunos aspectos de la presente invención comprende un sustrato 1305 que incluye una superficie superior e inferior plana 1310, 1315, un primer sensor electroquímico 1320 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto) situado en la superficie superior 1310 del sustrato 1305, y un segundo sensor electroquímico 1325 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto) situado en la superficie superior 1310 del sustrato 1305 y adyacente al primer sensor electroquímico 1320. En algunos modos de realización, el sustrato 1305 se dispone dentro de un conducto 1327 del dispositivo 1000. El sustrato 1305 puede estar compuesto por un material base seleccionado del grupo que consiste en silicio, vidrio y plástico. El primer sensor electroquímico 1320 puede incluir una capa inmovilizada de anticuerpo 1330 configurada para unirse a un anticuerpo tal como cTnI. El primer sensor electroquímico 1320 y el segundo sensor electroquímico 1325 pueden comprender un electrodo de micromatriz de oro y tener un diámetro de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 500 pm o de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 1500 pm.
1. El dispositivo 1300 incluye además (i) una primera región de reactivo 1335 en el sustrato 1305 recubierta con un conjugado anticuerpo-enzima para el analito, y/o (ii) una segunda región de reactivo 1340 en el sustrato 1005 recubierta con perlas magnéticas que tienen anticuerpos de captura para el analito. Las regiones de reactivo 1335, 1340 se pueden definir por una estructura de anillo de contención 1345, 1350, respectivamente. En otros modos de realización, las regiones reactivas 1335, 1340 se pueden situar en el conducto 1327 (por ejemplo, el conducto 524 descrito con respecto a la FIG. 5A), y/o en la cámara de muestra (por ejemplo, la cámara de muestra 510 descrita con respecto a FIGS. 5G y 5H).
2. El dispositivo 1300 incluye además una abertura o canal 1355 en la superficie inferior 1315 del sustrato que se extiende a una región 1360 en el sustrato 1305 debajo del segundo sensor electroquímico 1325. La abertura o canal 1355 comprende un material compuesto 1365 que incluye un aglutinante (por ejemplo, el aglutinante está compuesto de poliimida o poli(alcohol vinílico)) y un material magnético particulado (por ejemplo, el material magnético particulado está compuesto de aleación de neodimio, hierro y boro (NdFeB) o aleación de aluminio, níquel y cobalto (AlNiCo)) que opcionalmente rellena la abertura o canal 1355. El material compuesto 1365 se configura para tomar la conformación de la abertura o canal 1355 (por ejemplo, una conformación que es sustancialmente triangular, trapezoidal, de columna, rectángulo, cuadrada, circular, piramidal, etc. (sustancialmente en este contexto se entendería por los expertos en la técnica que quiere decir que visualmente la conformación es por lo general triangular, trapezoidal, de columna, rectángulo, cuadrada, circular, piramidal, etc.)).
3. En algunos modos de realización, una conformación de la abertura o canal 1355 incluye una sección transversal sustancialmente triangular, una base 1370 de la sección transversal sustancialmente triangular es coplanar con la superficie inferior 1315 del sustrato 1305, y un vértice 1375 de la sección transversal sustancialmente triangular está por debajo del segundo sensor electroquímico 1325. La abertura o canal 1355 puede tener un diámetro de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 1500 pm, por ejemplo, de 500 pm a 1000 pm. La conformación de sección transversal sustancialmente triangular de la abertura se puede seleccionar del grupo que consiste en: un cono, una pirámide, un tetraedro, un polígono de forma cónica y un canal en forma de V. La sección transversal sustancialmente triangular se puede extender a través de al menos un 75 %, 90 % o 95 % de una distancia de la superficie inferior 1315 a la superficie superior 1310 del sustrato 1305. El material compuesto 1365 genera un campo magnético 1380 que se alinea (por ejemplo, en un mismo plano vertical) con respecto al segundo sensor electroquímico 1325 y/o es ortogonal a un plano horizontal de la superficie superior 1310 del sustrato 1305. El campo magnético 1380 se configura para enfocar y atraer las perlas magnéticas sobre una superficie del segundo sensor electroquímico 1325 una vez que las perlas magnéticas se mezclan con la muestra biológica.
Procedimientos de inmunoensayo combinado
4. Las FIGS. 14-17 muestran diagramas de flujo ejemplares para realizar las etapas del proceso de la presente invención. Las etapas de las FIGS. 14-17 se pueden implementar usando los dispositivos y sistemas informáticos descritos anteriormente con respecto a las FIGS. 1-13. Específicamente, los diagramas de flujo de las FIGS. 14-17 ilustran la arquitectura, funcionalidad y funcionamiento de posibles implementaciones de los sistemas, procedimientos y productos de programas informáticos de acuerdo con varios modos de realización de la presente invención. A este respecto, cada bloque en los diagramas de flujo puede representar un módulo, segmento o parte de código, que comprende una o más instrucciones ejecutables almacenadas en un medio de almacenamiento legible por máquina no transitorio que cuando se ejecuta por uno o más procesadores (por ejemplo, un procesador del analizador) provoca que el uno o más procesadores realicen la(s) función/funciones lógica(s) especificada(s) dentro de la una o más instrucciones ejecutables. También se debe tener en cuenta que, en algunas implementaciones alternativas, las funciones indicadas en los bloques se pueden producir fuera del orden indicado en la figura. Por ejemplo, dos bloques mostrados en sucesión se pueden ejecutar, de hecho, sustancialmente al mismo tiempo, o los bloques se pueden ejecutar a veces en orden inverso, dependiendo de la funcionalidad implicada. También se tendrá en cuenta que cada bloque de las ilustraciones del diagrama de flujo y combinaciones de bloques en las ilustraciones del diagrama de flujo se pueden implementar por sistemas basados en hardware de propósito especial que realizan las funciones o actos especificados, o combinaciones de instrucciones de informáticas y de hardware de propósito especial.
100. La FIG. 14 ilustra un procedimiento 1400 (con referencia al dispositivo sensor 500 como se ilustra en las FIGS.
5A-5J) de uso de un dispositivo sensor de acuerdo con un modo de realización de la invención. En la etapa 1405, se puede introducir una muestra biológica no medida en una cámara de muestra (por ejemplo, la cámara de muestra 510 descrita con respecto a las FIGS. 5G y 5H) de un dispositivo sensor, a través de un puerto de entrada de muestra (por ejemplo, un puerto de entrada de muestra sellable 506 descrito con respecto a las FIGS. 5B y 5C). En la etapa 1410, un tope capilar (por ejemplo, el tope capilar 512 descrito con respecto a las FIGS. 5G y 5H) puede evitar el paso de la muestra a un primer conducto (por ejemplo, el conducto 531 descrito con respecto a la FIG. 5A) en esta fase, y la cámara de muestra se rellena con la muestra. El tope capilar en el extremo de la cámara de muestra delimita una porción dosificada de la muestra biológica. En la etapa 1415, se puede cerrar una tapa (por ejemplo, el elemento de sellado cerrable 508 descrito con respecto a las FIGS. 5A y 5B) para evitar la fuga de la muestra biológica fuera del dispositivo sensor. Aunque la muestra biológica está dentro de la cámara de muestra, la muestra biológica se puede modificar opcionalmente en la etapa 1420 con un compuesto o compuestos (por ejemplo, reactivos tales como perlas magnéticamente susceptibles recubiertas de anticuerpo y conjugado enzima-anticuerpo marcado) presentes inicialmente como un recubrimiento seco en la superficie interna de la cámara.
101. En la etapa 1425, el dispositivo sensor se puede insertar en un analizador (por ejemplo, el analizador 305 descrito con respecto a la FIG. 3) de acuerdo con algunos aspectos de la presente invención. En la etapa 1430, la inserción del dispositivo sensor en el analizador puede activar una primera bomba (por ejemplo, la parte de la zona flexible 536 como se describe con respecto a las FIGS. 5A y 5B) o un mecanismo que perfora un envase que contiene fluido cuando el envase se presiona contra una punta (por ejemplo, la punta 525 como se describe con respecto a las FIGS. 5G y 5H). El fluido (por ejemplo, un sustrato) puede expulsar de ese modo en un segundo conducto (por ejemplo, el conducto 522 como se describe con respecto a las FIGS. 5G y 5H) que está en comunicación fluídica con el primer conducto. Un estrechamiento en el segundo conducto impide un movimiento adicional del fluido. En la etapa 1435, el funcionamiento de una segunda bomba (por ejemplo, membrana desplazable 526 como se describe con respecto a las FIGS. 5A, 5B, 5G y 5H) por el analizador aplica presión a una vejiga de aire del dispositivo sensor, forzando el aire a través de un tercer conducto (por ejemplo, el conducto 529 como se describe con respecto a las FIGS. 5G y 5H) y dentro de la cámara de muestra en una localización predeterminada.
102. En la etapa 1440, la parte dosificada de la muestra biológica se expulsa a través del tope capilar por presión de aire producida dentro de la vejiga de aire en la etapa 1435 hacia el primer conducto. En la etapa 1445, la muestra biológica se mueve hacia adelante dentro del primer conducto a una parte del primer conducto (por ejemplo, el conducto 524 como se describe con respecto a la FIG. 5A) que se expone a un chip sensor (por ejemplo, el chip sensor 604 como se describe con respecto a la FIG. 6B) por presión de aire producida dentro de la vejiga de aire. Opcionalmente, en la etapa 1450, la muestra biológica se modifica con un compuesto o compuestos (por ejemplo, reactivos tales como perlas magnéticamente susceptibles recubiertas de anticuerpo y conjugado enzima-anticuerpo marcado) presentes inicialmente como un recubrimiento seco en una parte del chip sensor (es decir, una o más regiones reactivas). Para facilitar la disolución del compuesto o compuestos en la muestra biológica y/o promover la formación de sándwich eficaz en las perlas magnéticamente susceptibles, la muestra biológica puede oscilar sobre la una o más regiones reactivas por presión de aire producida dentro de la vejiga de aire. En un modo de realización, se usa una frecuencia de oscilación de entre aproximadamente 0,2 Hz y aproximadamente 5 Hz, lo más preferentemente de aproximadamente 0,7 Hz. En la etapa 1455, la muestra biológica modificada se mueve hacia adelante dentro del primer conducto a una posición sobre un primer sensor (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo) y opcionalmente un segundo sensor (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto) por presión de aire producida dentro de la vejiga de aire. Opcionalmente, en la etapa 1460, para facilitar la captura de las perlas magnéticamente susceptibles dentro de un campo magnético en o cerca de una superficie del segundo sensor y/o promover la formación de sándwich eficaz en o cerca de la superficie del primer sensor que comprende una biocapa, la muestra biológica se puede oscilar sobre el primer y segundo sensores por presión de aire producida dentro de la vejiga de aire. En un modo de realización, se usa una frecuencia de oscilación de entre aproximadamente 0,2 Hz y aproximadamente 5 Hz, lo más preferentemente aproximadamente 0,7 Hz.
103. En la etapa 1465, la muestra biológica se desplaza del primer conducto por presión adicional aplicada a la vejiga de aire, y la muestra biológica pasa a una cámara de residuos (por ejemplo, la cámara de residuos 516 como se describe con respecto a las FIGS. 5A y 5G). En la etapa opcional 1470, se pueden producir uno o más segmentos de aire (menisco) dentro del primer conducto por cualquier medio adecuado, incluyendo un medio pasivo, un modo de realización del que se describe en detalle en la patente de EE. UU. n.° 7.682.833, o un medio activo que incluye una disminución transitoria de la presión dentro del primer conducto usando la segunda bomba con lo que se aspira aire en el primer conducto a través de una trampilla o válvula. El uno o más segmentos de aire son extremadamente eficaces para aclarar o enjuagar el fluido contaminado con muestra biológica del primer conducto. Por ejemplo, un borde frontal y/o posterior del uno o más segmentos de aire se puede pasar varias veces sobre el primer y segundo sensores para enjuagar y resuspender material exógeno que se puede haber depositado de la muestra biológica. El material exógeno incluye cualquier material distinto del analito específicamente unido o complejo analito/conjugado anticuerpo-enzima. Sin embargo, de acuerdo con diversos modos de realización, la etapa de aclarado o enjuague 1470 usando el uno o más segmentos de aire no es lo suficientemente prolongada o enérgica para promover la resuspensión sustancial de las perlas magnéticamente susceptibles o la disociación del analito o complejo analito/conjugado anticuerpo-enzima unido específicamente de las perlas o la biocapa.
104. En la etapa 1475, el fluido en el segundo conducto se mueve más allá del estrechamiento en el primer conducto y está en contacto con el primer y segundo sensores por presión de aire producida por la primera bomba. El fluido puede incluir un sustrato o agente de señal y la enzima que permanece dentro del primer conducto e inmovilizada en o cerca del primer y segundo sensores produce una especie electroactiva de un sustrato electroinactivo o bien destruye un sustrato electroactivo. En algunos modos de realización, el fluido se puede aplicar al primer inmunosensor y al segundo inmunosensor para lavar la muestra biológica de los primeros segundos sensores. Un cambio en la corriente o potencial generado por la producción o destrucción de la especie electroactiva en el primer y segundo sensores, según sea apropiado para el modo de funcionamiento del dispositivo sensor, se registra en función del tiempo y es determinativo de la presencia de un analito objetivo en la muestra biológica.
105. La FIG. 15 ilustra un procedimiento 1500 para realizar un inmunoensayo para determinar la concentración de un analito en una muestra biológica (por ejemplo, sangre completa) de acuerdo con un modo de realización de la invención. En la etapa 1505, se disuelve un primer reactivo seco en la muestra biológica. El primer reactivo seco puede comprender un conjugado enzima-biomolécula (por ejemplo, anticuerpos señal) configurado para unirse al analito tal como troponina I (TnI) o troponina cardíaca I (cTnI). El conjugado enzima-biomolécula incluye una enzima conjugada con biomoléculas seleccionadas para unirse al analito de interés. En la etapa 1510, se forma un primer complejo de los anticuerpos señal y el analito en una primera fase líquida que comprende la muestra biológica. En la etapa 1515, se disuelve un segundo reactivo seco en la muestra biológica. El segundo reactivo seco puede comprender perlas magnéticas o microesferas recubiertas con biomoléculas de captura (por ejemplo, anticuerpos de captura inmovilizados en perlas magnéticas) configuradas para unirse al analito. En la etapa 1520, se forma un segundo complejo del primer complejo (por ejemplo, anticuerpos señal unidos al analito) y los anticuerpos de captura inmovilizados en las perlas magnéticas en una segunda fase líquida que comprende la muestra biológica.
106. En la etapa 1525, la muestra biológica que comprende el primer complejo y el segundo complejo se pone en contacto con un primer inmunosensor. El primer inmunosensor comprende una biomolécula de captura (por ejemplo, perlas de látex o microesferas recubiertas con anticuerpos de captura) inmovilizada en o cerca de una superficie del primer inmunosensor. Los anticuerpos de captura se configuran para unirse al analito, para formar un tercer complejo localizado en o cerca de un límite de fase sólida (por ejemplo, una superficie) del primer inmunosensor. El tercer complejo comprende el primer complejo (por ejemplo, anticuerpos señal unidos al analito) y los anticuerpos de captura inmovilizados del primer inmunosensor. La localización o captura del analito en o cerca de una superficie del primer inmunosensor es el resultado de una reacción heterogénea que comprende la formación del primer complejo en la primera fase líquida y la formación del tercer complejo en o cerca del límite de la fase sólida. Por tanto, el primer inmunosensor se puede reconocer como un inmunosensor de captura de superficie heterogénea.
107. En la etapa 1530, la muestra biológica que comprende el primer complejo y el segundo complejo se pone en contacto con un campo magnético localizado alrededor de un segundo inmunosensor. El campo magnético se configura para atraer las perlas magnéticas en la muestra biológica de modo que el segundo complejo del primer complejo (por ejemplo, anticuerpos señal unidos al analito) y los anticuerpos de captura inmovilizados en perlas magnéticas se localice en o cerca de una superficie del segundo inmunosensor. La localización o captura del analito en o cerca de una superficie del segundo inmunosensor es el resultado de una reacción homogénea que comprende la formación del primer complejo en la primera fase líquida y la formación del segundo complejo en la segunda fase líquida. Por tanto, el segundo inmunosensor se puede reconocer como un inmunosensor de captura de perlas magnéticas homogénea.
108. En la etapa 1535, se puede aplicar un fluido (por ejemplo, un fluido de lavado) al primer inmunosensor y al segundo inmunosensor para lavar la muestra biológica del primer inmunosensor y del segundo inmunosensor. El fluido de lavado puede comprender un sustrato o un agente de señal (por ejemplo, una molécula fosforilada tal como 4-aminofenilfosfato). En la etapa 1540, se detecta y se mide una primera señal en el primer inmunosensor a partir de una reacción del sustrato con el tercer complejo localizado en o cerca del primer inmunosensor. Por ejemplo, se detecta y se mide una primera señal electroquímica a partir de la oxidación de una especie electroactiva producida enzimáticamente (por ejemplo, 4-aminofenol) en una superficie del primer inmunosensor. La especie electroactiva se produce enzimáticamente a partir de la reacción del sustrato con el conjugado enzima-biomolécula en el tercer complejo. En diversos modos de realización, el sustrato es una molécula fosforilada (por ejemplo, 4-aminofenilfosfato) configurada de modo que cuando se retira un resto fosfato por el conjugado enzima-biomolécula (por ejemplo, uno o más anticuerpos unidos a fosfatasa alcalina), la molécula se vuelve electroactiva. En la etapa 1545, se detecta y se mide una segunda señal en el segundo inmunosensor a partir de una reacción del sustrato con el segundo complejo localizado en o cerca del segundo inmunosensor. Por ejemplo, se detecta y se mide una segunda señal electroquímica a partir de la oxidación de una especie electroactiva producida enzimáticamente (por ejemplo, 4-aminofenol) en una superficie del segundo inmunosensor. La especie electroactiva se produce enzimáticamente a partir de la reacción del sustrato (por ejemplo, 4-aminofenilfosfato) con el conjugado enzima-biomolécula (por ejemplo, uno o más anticuerpos unidos a la fosfatasa alcalina) en el segundo complejo.
109. En la etapa 1550, se determina una concentración del analito en la muestra biológica a partir de al menos una de la primera señal y la segunda señal. En algunos modos de realización, el primer inmunosensor se configura para generar la primera señal como indicativa de una concentración del analito en un primer intervalo (por ejemplo, un intervalo de concentración superior que es mayor que un intervalo de concentración menor) a partir de una reacción del sustrato con el tercer complejo, mientras que el segundo inmunosensor se configura para generar la segunda señal como indicativa de una concentración del analito en un segundo intervalo (por ejemplo, un intervalo de concentración inferior que es menor que un intervalo de concentración superior) a partir de una reacción del sustrato con el segundo complejo.
110. En otros modos de realización en los que el analito es troponina cardíaca, el primer inmunosensor se configura para generar la primera señal como indicativa de una concentración de la concentración de troponina cardíaca en un primer intervalo por encima de aproximadamente 1000 pg/ml a partir de una reacción del sustrato con el tercer complejo, mientras que el segundo inmunosensor se configura para generar la segunda señal como indicativa de una concentración de la concentración de troponina cardíaca en un segundo intervalo de aproximadamente 0 a aproximadamente 1000 pg/ml a partir de una reacción del sustrato con el segundo complejo (donde aproximadamente es /- 10 pg/ml alrededor del valor extremo de cada intervalo). Como tal, el primer inmunosensor determina la concentración de la troponina cardíaca en un primer intervalo por encima de aproximadamente 1000 pg/ml en base a la primera señal, y el segundo inmunosensor determina la concentración de la troponina cardíaca en un segundo intervalo de aproximadamente 0 a aproximadamente 1000 pg/ml en base a la segunda señal. En modos de realización alternativos, el primer intervalo está por encima de 2000 pg/ml, el segundo intervalo es de 0 a 250 pg/ml, y la primera señal y la segunda señal en combinación (por ejemplo, un promedio ponderado) son indicativas de la concentración de la concentración de troponina cardíaca en un intervalo de 250 a 2000 pg/ml (donde aproximadamente es /- 10 pg/ml alrededor del valor extremo de cada intervalo). El promedio se puede ponderar en base a uno o más factores incluyendo la proximidad de los resultados calculados a los puntos de cruce inferior y superior definidos, la idealidad de la conformación del gráfico de corriente del sensor frente al tiempo y la detección de una condición de error en uno de los sensores. Como tal, el primer inmunosensor determina la concentración de la troponina cardíaca en un primer intervalo por encima de aproximadamente 2000 pg/ml en base a la primera señal, el segundo inmunosensor determina la concentración de la troponina cardíaca en un segundo intervalo de aproximadamente 0 a aproximadamente 250 pg/ml en base a la segunda señal, y una combinación del primer inmunosensor y el segundo inmunosensor determina la concentración de la troponina cardíaca en un tercer intervalo de aproximadamente 250 a aproximadamente 2000 pg/ml en base a la primera señal y la segunda señal.
111. El intervalo de concentración menor (por ejemplo., de aproximadamente 0 a aproximadamente 250 pg/ml) se puede controlar por una duración de tiempo entre la disolución de las perlas magnéticas en la muestra y la captura magnética de las perlas magnéticas en o cerca del inmunosensor de captura de perlas magnéticas homogénea. En diversos de realización, la duración de tiempo es de entre 1 y 20 minutos, preferentemente entre 5 y 10 minutos. El intervalo de concentración menor se puede controlar además por una concentración disuelta de las perlas magnéticas en la muestra. En algunos modos de realización, la concentración disuelta de las perlas magnéticas en la muestra está en un intervalo de aproximadamente 10000 a 200000 perlas por microlitro, preferentemente entre 10000 y 40000 perlas por microlitro. El intervalo de concentración menor se puede controlar además por una afinidad de cada uno de los anticuerpos señal, una avidez de cada uno de los anticuerpos señal, una afinidad de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie de las perlas magnéticas y/o una avidez de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie de las perlas magnéticas. En algunos modos de realización, la afinidad de cada uno de los anticuerpos señal está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. En algunos modos de realización, la avidez de cada uno de los anticuerpos señal está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. En algunos modos de realización, la afinidad de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie de las perlas magnéticas está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. En algunos modos de realización, la avidez de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie de las perlas magnéticas está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. Como se debe entender, el intervalo de concentración menor (por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 250 pg/ml) se puede controlar por cualquier número de los factores mencionados anteriormente solos o en combinación, por ejemplo, el intervalo de concentración menor se puede controlar por al menos uno de duración del tiempo entre la disolución de las perlas magnéticas en la muestra y la captura magnética de las perlas magnéticas en o cerca del inmunosensor de captura de perlas magnéticas homogénea, una afinidad de cada uno de los anticuerpos señal, una avidez de cada uno de los anticuerpos señal, una concentración disuelta de las perlas magnéticas en la muestra, una afinidad de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie de las perlas magnéticas y una avidez de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie de las perlas magnéticas.
112. El intervalo de concentración superior (por ejemplo, por encima de aproximadamente 2000 pg/ml) se puede controlar por una duración de tiempo en que la muestra se sitúa sobre el inmunosensor de captura de superficie heterogénea. En diversos modos de realización, la duración de tiempo es de entre 1 y 20 minutos, preferentemente entre 5 y 10 minutos. El intervalo de concentración superior se puede controlar además por una afinidad de cada uno de los anticuerpos señal, una avidez de cada uno de los anticuerpos señal, una afinidad de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en o cerca del inmunosensor de captura de superficie heterogénea y/o una avidez de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en o cerca del inmunosensor de captura de superficie heterogénea. En algunos modos de realización, la afinidad de cada uno de los anticuerpos señal está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. En algunos modos de realización, la avidez de cada uno de los anticuerpos señal está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. En algunos modos de realización, la afinidad de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en o cerca del inmunosensor de captura de superficie heterogénea está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. En algunos modos de realización, la avidez de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en o cerca del inmunosensor de captura de superficie heterogénea está en un intervalo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1013 M-1, preferentemente en un intervalo de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 M-1. Como se debe entender, el intervalo de concentración superior (por ejemplo, por encima de aproximadamente 2000 pg/ml) se puede controlar por cualquier número de los factores mencionados anteriormente solos o en combinación, por ejemplo, el intervalo de concentración superior se puede controlar por al menos uno de duración de tiempo en que la muestra se sitúa sobre el inmunosensor de captura de superficie heterogénea, la afinidad de cada uno de los anticuerpos señal, una avidez de cada uno de los anticuerpos señal, una afinidad de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en o cerca del inmunosensor de captura de superficie heterogénea, y una avidez de cada uno de los anticuerpos de captura inmovilizados en o cerca del inmunosensor de captura de superficie heterogénea.
113. La FIG. 16 ilustra un procedimiento 1600 para determinar una concentración de un analito en una muestra en un intervalo de concentración extendido de acuerdo con un modo de realización de la invención. En la etapa 1605, se detecta y se mide una primera señal en un primer inmunosensor a partir de una reacción de un sustrato con un tercer complejo localizado en o cerca del primer inmunosensor de acuerdo con las etapas 1505-1540 del procedimiento 1500. En la etapa 1610, se detecta y se mide una segunda señal en un segundo inmunosensor a partir de una reacción de un sustrato con un segundo complejo localizado en o cerca del segundo inmunosensor de acuerdo con las etapas 1505-1545 del procedimiento 1500. En la etapa 1615, se determina una primera concentración del analito en la muestra biológica a partir de la primera señal y se determina una segunda concentración del analito en la muestra biológica a partir de la segunda señal. En la etapa opcional 1620, se calcula un promedio ponderado de la primera concentración y la segunda concentración. El promedio se puede ponderar en base a uno o más factores incluyendo la proximidad de los resultados calculados a los puntos de cruce inferior y superior definidos, la idealidad de la conformación del gráfico de corriente del sensor frente al tiempo y la detección de una condición de error en uno de los sensores. En la etapa 1625, la primera concentración y la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado, se comparan con un punto de concentración de cruce predeterminado. En diversos modos de realización, el punto de concentración de cruce predeterminado es de 1000 pg/ml, 1200 pg/ml, 1400 pg/ml, 1600 pg/ml, 1800 pg/ml o 2000 pg/ml. En la etapa 1630, cuando una o ambas de la primera concentración y la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado son mayores que el punto de concentración de cruce predeterminado, se informa de la primera concentración del analito determinada a partir de la primera señal a un usuario del dispositivo como la concentración final del analito en la muestra biológica. En la etapa 1635, cuando una o ambas de la primera concentración y la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado son menores que el punto de concentración de cruce predeterminado, se informa de la segunda concentración del analito determinada a partir de la segunda señal a un usuario del dispositivo como la concentración final del analito en la muestra biológica.
114. La FIG. 17 ilustra un procedimiento 1700 para determinar una concentración de un analito en una muestra en un intervalo de concentración extendido de acuerdo con un modo de realización de la invención. En la etapa 1705, se detecta y se mide una primera señal en un primer inmunosensor a partir de una reacción de un sustrato con un tercer complejo localizado en o cerca del primer inmunosensor de acuerdo con las etapas 1705-1745 del procedimiento 1700. En la etapa 1710, se detecta y se mide una segunda señal en un segundo inmunosensor a partir de una reacción de un sustrato con un segundo complejo localizado en o cerca del segundo inmunosensor de acuerdo con las etapas 1705-1750 del procedimiento 1700. En la etapa 1715, se determina una primera concentración del analito en la muestra biológica a partir de la primera señal y se determina una segunda concentración del analito en la muestra biológica a partir de la segunda señal. En la etapa opcional 1720, se calcula un promedio ponderado de la primera concentración y la segunda concentración. El promedio se puede ponderar en base a uno o más factores incluyendo la proximidad de los resultados calculados a los puntos de cruce inferior y superior definidos, la idealidad de la conformación del gráfico de corriente del sensor frente al tiempo y la detección de una condición de error en uno de los sensores. En la etapa 1725, la primera concentración y la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado, se comparan con una zona de concentración de cruce predeterminada. En diversos modos de realización, la zona de concentración de cruce predeterminada es de 400 a 2000 pg/ml, de 600 a 1800 pg/ml, de 400 a 1800 pg/ml, de 800 a 1600 pg/ml o de 250 a 2000 pg/ml.
115. En la etapa 1730, cuando una o ambas de la primera concentración y la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado son mayores que la zona de concentración de cruce predeterminada, se informa de la primera concentración del analito determinada a partir de la primera señal a un usuario del dispositivo como la concentración final del analito en la muestra biológica. En la etapa 1735, cuando una o ambas de la primera concentración y la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado son menores que la zona de concentración de cruce predeterminada, se informa de la segunda concentración del analito determinada a partir de la segunda señal a un usuario del dispositivo como la concentración final del analito en la muestra biológica. En la etapa 1740, cuando tanto la primera concentración como la segunda concentración, u opcionalmente el promedio ponderado están dentro de la zona de concentración de cruce predeterminada, se informa del promedio ponderado de la primera concentración y la segunda concentración a un usuario del dispositivo como la concentración final del analito en la muestra biológica.
116. La FIG. 18 muestra un gráfico 1800 que ilustra el impacto de poder determinar una concentración de un analito en una muestra sobre un intervalo de concentración extendido de acuerdo con diversos modos de realización de la invención. Un chip sensor de intervalo extendido microfabricado puede incluir el primer inmunosensor 1805 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo con una capa inmovilizada de anticuerpos de captura) y el segundo inmunosensor 1810 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto con un campo magnético para atraer perlas magnéticas con una capa inmovilizada de anticuerpos de captura), como se describe en el presente documento. El gráfico 1800 muestra que el primer inmunosensor 1805 es en particular adecuado para detectar analitos que tienen una concentración mayor, por ejemplo, de más de 400 pg/ml, mientras que el segundo inmunosensor 1810 es en particular adecuado para detectar analitos que tienen una concentración menor, por ejemplo, de menos de 2000 pg/ml. En consecuencia, usando un sistema que tiene un chip sensor como se describe en el presente documento con el primer inmunosensor 1805 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo con una capa inmovilizada de anticuerpos de captura) y el segundo inmunosensor 1810 (por ejemplo, un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto con un campo magnético para atraer perlas magnéticas con una capa inmovilizada de anticuerpos de captura), es posible extender el intervalo de concentraciones a las que se puede detectar un analito usando la primera y segunda señales generadas en los respectivos inmunosensores como se describe anteriormente con respecto a los procedimientos 1500, 1600 y 1700.
117. Se pretende que el alcance de la presente invención esté limitado únicamente por el alcance de las siguientes reivindicaciones. Además, se debe apreciar por los expertos en la técnica que una pluralidad de los diversos modos de realización de la invención, como se describe anteriormente, se pueden acoplar entre sí e incorporarse en un único dispositivo lector.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo para detectar un analito en una muestra biológica que comprende:
un sustrato que incluye una superficie superior e inferior plana;
un primer sensor electroquímico situado en la superficie superior del sustrato, en el que el primer sensor electroquímico es un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo que incluye una capa inmovilizada de anticuerpo configurada para unirse al analito;
un segundo sensor electroquímico situado en la superficie superior del sustrato y adyacente al primer sensor electroquímico, en el que el segundo sensor electroquímico es un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto;
una abertura en la superficie inferior del sustrato que se extiende hasta una región del sustrato debajo del segundo sensor electroquímico; y
un material compuesto que incluye un aglutinante y un material magnético particulado, rellenando sustancialmente el material compuesto la abertura,
en el que una conformación de la abertura incluye una sección transversal sustancialmente triangular, y una base de la sección transversal sustancialmente triangular es coplanar con la superficie inferior del sustrato y un vértice de la sección transversal sustancialmente triangular está debajo del segundo sensor electroquímico,
en el que el material magnético particulado genera un campo magnético que se alinea con respecto al segundo sensor electroquímico y se configura para enfocar y atraer perlas magnéticas sobre una superficie del segundo sensor electroquímico, y
en el que las perlas magnéticas incluyen un anticuerpo inmovilizado en una superficie de las perlas magnéticas para el analito.
2. El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende además una primera región de reactivo recubierta con un conjugado anticuerpo-enzima para el analito.
3. El dispositivo de la reivindicación 2, que comprende además una segunda región de reactivo recubierta con las perlas magnéticas.
4. El dispositivo de la reivindicación 3, en el que la primera región de reactivo y la segunda región de reactivo se sitúan en el sustrato, y el campo magnético se configura para enfocar y atraer las perlas magnéticas sobre la superficie del segundo sensor electroquímico una vez que las perlas magnéticas se mezclan con la muestra biológica.
5. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que el aglutinante es una tinta termoendurecible, una poliimida o poli(alcohol vinílico) (PVA).
6. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que el material magnético particulado está compuesto de una aleación de neodimio, hierro y boro (NdFeB) o aleación de aluminio, níquel y cobalto (AINiCo).
7. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que el primer sensor electroquímico y el segundo sensor electroquímico comprenden un electrodo de micromatriz de oro.
8. El dispositivo de la reivindicación 4, en el que el analito es troponina cardíaca I (cTnI).
9. El dispositivo de la reivindicación 8, en el que la capa inmovilizada de anticuerpo del primer sensor electroquímico se configura para unirse a cTnI.
10. El dispositivo de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo inmovilizado en la superficie de las perlas magnéticas se configura para unirse a cTnI.
11. Un dispositivo que comprende:
un conducto;
un sustrato que incluye una superficie superior e inferior plana situada dentro del conducto;
un primer sensor electroquímico situado en la superficie superior del sustrato, siendo el primer sensor electroquímico un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo bajo que incluye una capa inmovilizada de anticuerpo configurada para unirse a un analito;
siendo un segundo sensor electroquímico un sensor amperométrico de sensibilidad en extremo alto situado en la superficie superior del sustrato;
una abertura en la superficie inferior del sustrato que se extiende hasta una región del sustrato debajo del segundo sensor electroquímico;
un material compuesto que incluye un aglutinante y un material magnético particulado;
un primer reactivo seco situado con el conducto, comprendiendo el primer reactivo seco perlas magnéticas que incluyen una capa inmovilizada de anticuerpo configurada para unirse al analito; y
un segundo reactivo seco situado con el conducto, comprendiendo el segundo reactivo seco anticuerpos señal configurados para unirse al analito,
en el que el material magnético particulado genera un campo magnético que se alinea con respecto al segundo sensor electroquímico y se configura para enfocar y atraer perlas magnéticas sobre una superficie del segundo sensor electroquímico.
12. El dispositivo de la reivindicación 11, en el que al menos uno del primer reactivo seco y el segundo reactivo seco se imprime en la superficie superior del sustrato.
13. El dispositivo de la reivindicación 11, en el que al menos uno del primer reactivo seco y el segundo reactivo seco se imprime en una pared del conducto.
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