CN110974967B - 合成致死与癌症的治疗 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于治疗癌症的化合物、组合物和方法。还描述了用于鉴别患有适合用本文描述的化合物、组合物和方法治疗的癌症的受试者的方法和用途。在本发明的一个方面，提供了治疗患有NMT2缺陷的癌症的受试者的方法，其包括：向所述受试者施用NMT抑制剂。

Description

合成致死与癌症的治疗
本申请是国际申请日为2013年10月30日，中国国家申请号为201380056950.X，发明名称为“合成致死与癌症的治疗”的发明专利申请的分案申请。
相关专利申请的交叉引用本申请要求2012年10月30日提交的美国专利申请第61/720,218号、2013年8月27日提交的美国专利申请第61/870,418号、2013年8月27日提交的美国专利申请第61/870,435号的优先权，其全部内容通过引用全文并入本文。
技术领域
本发明的领域总体涉及用于癌症治疗的化合物、组合物和方法。
背景技术
在加拿大，癌症是死亡的首要原因。加拿大癌症协会估计2011年将有约170000个癌症新案例，并且将有约75000人由于癌症死亡。
一种用于癌症治疗的新兴方法涉及合成致死的概念。两个基因(或者两个基因产物)如果任何一个单独突变不影响生存但是两者的突变导致死亡，那么为合成致死。换句话说，“合成致死”描述突变和药物(例如)一起引起癌细胞死亡的状况——所述突变或者所述药物均不导致细胞死亡。将合成致死基因(或基因产物)靶向癌症相关的突变应该仅仅杀伤癌细胞并使正常细胞幸免。合成致死因此提供了抗癌特异剂的开发框架。
合成致死以治疗癌症的方法正在形成，但还不是常规方法，主要归因于对合成致死基因(和基因产物)缺乏识别。
蛋白的N-豆蔻酰化为其中豆蔻酸(14碳饱和脂肪酸)共价连接于各种各样的细胞、病毒和致癌蛋白(例如，致癌的Src相关的酪氨酸激酶、异源三聚体的Gα亚基等)的NH2末端甘氨酸的修饰。
细胞豆蔻酰化蛋白在信号传导和肿瘤形成中具有不同的生物学功能。通过豆蔻酰化修饰蛋白对于真核细胞中许多重要蛋白(包括对于细胞生长中重要的信号传导和调节功能所必需的那些)的亚细胞靶向、蛋白构象和生物学活性是必须的。Src家族(原癌基因)的酪氨酸激酶为其中最广泛研究的豆蔻酰化蛋白。
蛋白的豆蔻酰化由N-豆蔻酰基转移酶(NMT)催化。在真核细胞中NMT负责此活性，并且在通过甲硫氨酰氨基肽酶去除起始甲硫氨酸残基后通过修饰其多肽底物而起作用。这种修饰主要作为共翻译过程而发生，尽管豆蔻酰化也可在蛋白水解切割后翻译后发生，通常在凋亡期间。已经克隆了哺乳动物NMT酶的两种同工酶，并命名为NMT1和NMT2。NMT在细胞中起促生存的作用。所述两种NMT存在于所有正常细胞中。
仍然存在对用于癌症治疗的化合物、组合物和方法的需要。
提供该背景技术信息是为了展示申请人认为的可能与本发明相关的信息。并非预期承认，也不应当解释为前面的任何信息构成对抗本发明的现有技术。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了用于治疗患有癌症的受试者的化合物和组合物。还提供了用于鉴别患有适合于用本文所述化合物、组合物和方法治疗的癌症的受试者的方法。
根据一个方面，提供了治疗患有NMT2缺陷的癌症的受试者的方法，包括：向所述受试者施用NMT抑制剂。
在具体的方面，所述NMT抑制剂包括NMT1抑制剂。
在具体的方面，所述NMT1抑制剂包括小分子、抗体、肽片段、核酸或其组合。
在具体的方面，所述小分子包括Tris-DBA、HMA或DDD85646、DDD86481或其衍生物。
在具体的方面，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在具体的方面，所述核酸包括dsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、核酶、shRNA分子或者siRNA分子。
在具体的方面，所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。
在具体的方面，所述受试者为人类受试者。
根据另一个方面，提供了治疗患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的方法，包括：进行测试以提供分析结果用于确定来自所述受试者的样品是否表达NMT2，以及当所述样品为NMT2缺陷时给予所述受试者NMT1抑制剂。
根据另一个方面，提供了一种方法，包括：从患有癌症或者疑似患有癌症的受试者获取样品；处理所述样品；进行结合测定，包括使所述处理的样品与NMT2抗体接触以形成所述抗体与处理的样品中存在的NMT2蛋白之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果；其中当所述样品中NMT2蛋白含量低或者缺乏时(可选地相对于对照)，指示给予所述受试者NMT1抑制剂。
根据另一个方面，提供了一种方法，包括：从患有癌症或者疑似患有癌症的受试者获取样品；处理所述样品；进行结合测定，包括使所述处理的样品与NMT2蛋白的抗体接触以形成所述抗体与处理的样品中存在的NMT2蛋白之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果；并且当所述样品中NMT2蛋白含量低或者缺乏时(可选地相对于对照)，将NMT1抑制剂给予所述受试者。
在具体的方面，用于确定来自受试者的所述样品中是否表达NMT2的所述分析包括进行结合测定，所述结合测定包括使处理的样品与NMT2的抗体接触以形成所述抗体与处理的样品中存在的NMT2之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果。
在具体的方面，所述结合测定包括荧光激活细胞分选术、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学法、定量免疫组织化学法、荧光共振能量转移、福斯特共振能量转移、双分子荧光互补、质谱法、免疫印迹测定或者免疫共沉淀测定。
在具体的方面，具有检测所述抗体与所述样品中的NMT2之间形成的复合体的检测器的装置用于确定所述样品中复合体的量。
在具体的方面，所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。
在具体的方面，所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。
在具体的方面，所述受试者是人类。
另一方面，提供了一种方法，包括：从患有癌症或者疑似患有癌症的受试者获取样品；处理所述样品；进行结合测定，包括使所述处理的样品与可结合到NMT2核酸的可检测标志物接触以形成所述可检测标志物与所述样品中存在的NMT2核酸之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果；其中当所述样品中NMT2核酸含量低或者缺乏时(可选地相对于对照)，指示给予所述受试者NMT1抑制剂。
另一方面，提供了一种方法，包括：从患有癌症或者疑似患有癌症的受试者获取样品；处理所述样品；进行结合测定，包括使所述处理的样品与可结合到NMT2核酸的可检测标志物接触以形成所述可检测标志物与所述样品中存在的NMT2核酸之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果；并且当所述样品中NMT2核酸含量低或者缺乏时(可选地相对于对照)，将NMT1抑制剂给予所述受试者。
在具体的方面，用于确定来自受试者的样品中是否表达NMT2的所述分析包括进行结合测定，所述结合测定包括使处理的样品与结合到NMT2核酸的可检测标志物接触以形成所述可检测标志物与所述样品中存在的NMT2之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果。
在具体的方面，所述结合测定包括使用可检测标记的DNA或RNA探针的杂交测定。
在具体的方面，所述杂交测定是定量的或者半定量的。
在具体的方面，所述杂交测定是RT-PCR、原位杂交、RNA保护测定(“RPA”)、cDNA和寡核苷酸微阵列、代表性差异分析(“RDA”)、差异显示、EST序列分析、基因表达的系列分析(“SAGE”)和用Luminex FlexMAP的多重连接介导的扩增("LMF")。
在具体的方面，具有检测所述可检测标志物与所述样品中存在的NMT2核酸之间的复合体的检测器的装置用于确定所述样品中复合体的量。
在具体的方面，所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。
在具体的方面，所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。
在具体的方面，所述受试者是人类。
另一方面，提供了一种方法，包括：从患有癌症或者疑似患有癌症的受试者获取样品；处理所述样品；进行结合测定，包括使所述处理的样品与可结合所述样品中豆蔻酰化蛋白或叠氮基-生物素标记的豆蔻酰化蛋白的抗体接触以形成所述可检测标志物与所述样品中存在的豆蔻酰化蛋白之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的豆蔻酰化模式(profile)；其中当所述豆蔻酰化模式指示所述癌症为NMT2缺陷时(可选地相对于对照)，指示给予所述受试者NMT1抑制剂。
另一方面，提供了一种方法，包括：从患有癌症或者疑似患有癌症的受试者获取样品；处理所述样品；进行结合测定，包括使所述处理的样品与可结合所述样品中豆蔻酰化蛋白或叠氮基-生物素标记的豆蔻酰化蛋白的抗体接触以形成所述可检测标志物与所述样品中存在的豆蔻酰化蛋白之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的豆蔻酰化模式；并且当所述豆蔻酰化模式指示所述癌症为NMT2缺陷时(可选地相对于对照)，指示给予所述受试者NMT1抑制剂。
在具体的方面，所述处理包括使用炔基豆蔻酸和脱硫生物素叠氮基-PEG生物素处理所述样品。
在具体的方面，所述结合测定包括荧光激活细胞分选术、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学法、定量免疫组织化学法、荧光共振能量转移、福斯特共振能量转移、双分子荧光互补、质谱法、免疫印迹测定或者免疫共沉淀测定。
在具体的方面，具有检测所述抗体与所述样品中存在的NMT2之间的复合体的检测器的装置用于确定所述样品中复合体的量。
在具体的方面，所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。
在具体的方面，所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。
在具体的方面，所述受试者是人类。
另一个方面，提供了NMT抑制剂用于治疗具有NMT2缺陷的癌症的受试者的用途。
在具体的方面，所述NMT抑制剂包含NMT1抑制剂。
在具体的方面，所述NMT1抑制剂包含小分子、抗体、肽片段、核酸，或其组合。
在具体的方面，所述小分子包含Tris-DBA、HMA或DDD85646、DDD86481，或其衍生物。
在具体的方面，所述小分子包含DDD86481。
在具体的方面，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在具体的方面，所述核酸包含dsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、核酶、shRNA分子或者siRNA分子。
在具体的方面，所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。
在具体的方面，所述受试者是人类受试者。
另一个方面，提供了NMT1抑制剂用于治疗患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的用途，其中当来自所述受试者的样品中NMT2蛋白含量低或者缺乏(可选地相对于对照)时，指示使用所述NMT1抑制剂，其中结合测定包括使来自所述受试者的处理的样品与NMT2抗体接触形成所述抗体与所述处理的样品中存在的NMT2蛋白之间的复合体，其可产生至少1种指示所述复合体的测定结果；其中所述测定结果指示所述样品中NMT2蛋白量。
在具体的方面，可确定来自所述受试者的样品是否表达NMT2的所述分析包括进行结合测定，所述结合测定包括使所述处理的样品与NMT2抗体接触形成所述抗体与所述处理的样品中存在的NMT2之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果。
在具体的方面，所述结合测定包括荧光激活细胞分选术、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学法、定量免疫组织化学法、荧光共振能量转移、福斯特共振能量转移、双分子荧光互补、质谱法、免疫印迹测定或者免疫共沉淀测定。
在具体的方面，具有检测所述抗体与所述样品中的NMT2之间的复合体的检测器的装置用于确定所述样品中复合体的量。
在具体的方面，所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。
在具体的方面，所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。
在具体的方面，所述受试者是人类。
另一个方面，提供了NMT1抑制剂用于治疗患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的用途，其中当来自所述受试者的样品中NMT2核酸含量低或者缺乏(可选地相对于对照)时，指示使用所述NMT1抑制剂，其中结合测定包括使来自所述受试者的处理的样品与可结合NMT2核酸的可检测标志物接触形成所述可检测标志物与所述样品中NMT2核酸之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果。
在具体的方面，可确定来自所述受试者的样品是否表达NMT2的所述分析包括进行结合测定，所述结合测定包括使所述处理的样品与可结合NMT2核酸的可检测标志物接触形成所述可检测标志物与所述样品中存在的NMT2核酸之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果。
在具体的方面，所述结合测定包括使用可检测标记的DNA或RNA探针的杂交测定。
在具体的方面，所述杂交测定是定量的或者半定量的。
在具体的方面，所述杂交测定是RT-PCR、原位杂交、RNA保护测定(“RPA”)、cDNA和寡核苷酸微阵列、代表性差异分析(“RDA”)、差异显示、EST序列分析、基因表达的系列分析(“SAGE”)和用Luminex FlexMAP的多重连接介导的扩增("LMF")。
在具体的方面，具有可检测所述可检测标志物与所述样品中存在的NMT2核酸之间的复合体的检测器的装置用于确定所述样品中复合体的量。
在具体的方面，所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。
在具体的方面，所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。
在具体的方面，所述受试者是人类。
一方面，提供了NMT1抑制剂用于治疗患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的用途，其中当来自所述受试者的样品中豆蔻酰化模式指示所述癌症为NMT2缺陷(可选地相对于对照)时，指示给予所述受试者NMT1抑制剂，其中进行结合测定，包括使所述处理的样品与可结合所述样品中豆蔻酰化蛋白或叠氮基-生物素标记的豆蔻酰化蛋白的抗体接触以形成所述可检测标志物与所述样品中存在的豆蔻酰化蛋白之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的豆蔻酰化模式。
在具体的方面，所述处理包括使用炔基豆蔻酸和脱硫生物素叠氮基-PEG生物素处理所述样品。
在具体的方面，所述结合测定包括荧光激活细胞分选术、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学法、定量免疫组织化学法、荧光共振能量转移、福斯特共振能量转移、双分子荧光互补、质谱法、免疫印迹测定或者免疫共沉淀测定。
在具体的方面，具有可检测所述抗体与所述样品中存在的NMT2之间的复合体的检测器的装置用于确定所述样品中复合体的量。
在具体的方面，所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。
在具体的方面，所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。
在具体的方面，所述受试者是人类。
另一方面，提供了用于鉴定适于使用NMT1抑制剂治疗的受试者的方法，包括：从患有癌症或者疑似患有癌症的受试者获取样品；处理所述样品；进行结合测定，包括使所述处理的样品与NMT2抗体接触以形成所述抗体与所述处理的样品中存在的NMT2蛋白之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果；其中当所述样品中NMT2蛋白含量低或者缺乏时(可选地相对于对照)，指示所述受试者可用NMT1抑制剂治疗。
在具体的方面，可确定来自受试者的样品中是否表达NMT2的所述分析包括进行结合测定，所述结合测定包括使处理的样品与NMT2的抗体接触以形成所述抗体与处理的样品中存在的NMT2之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果。
在具体的方面，所述结合测定包括荧光激活细胞分选术、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学法、定量免疫组织化学法、荧光共振能量转移、福斯特共振能量转移、双分子荧光互补、质谱法、免疫印迹测定或者免疫共沉淀测定。
在具体的方面，具有可检测所述抗体与所述样品中的NMT2之间形成的复合体的检测器的装置用于确定所述样品中复合体的量。
在具体的方面，所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。
在具体的方面，所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。
在具体的方面，所述受试者是人类。
另一方面，提供了用于鉴定适于使用NMT1抑制剂治疗的受试者的方法，包括：从患有癌症或者疑似患有癌症的受试者获取样品；处理所述样品；进行结合测定，包括使所述处理的样品与可结合NMT2核酸的可检测标志物接触形成所述可检测标志物与所述样品中存在的NMT2核酸之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果；其中当所述样品中NMT2核酸含量低或者缺乏时(可选地相对于对照)，指示给予所述受试者NMT1抑制剂。
在具体的方面，可确定来自所述受试者的样品是否表达NMT2的所述分析包括进行结合测定，所述结合测定包括使所述处理的样品与可结合NMT2核酸的可检测标志物接触形成所述可检测标志物与所述样品中存在的NMT2核酸之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果。
在具体的方面，所述结合测定包括使用可检测标记的DNA或RNA探针的杂交测定。
在具体的方面，所述杂交测定是定量的或者半定量的。
在具体的方面，所述杂交测定是RT-PCR、原位杂交、RNA保护测定(“RPA”)、cDNA和寡核苷酸微阵列、代表性差异分析(“RDA”)、差异显示、EST序列分析、基因表达的系列分析(“SAGE”)和用Luminex FlexMAP的多重连接介导的扩增("LMF")。
在具体的方面，其中具有可检测所述可检测标志物与所述样品中存在的NMT2核酸之间的复合体的检测器的装置用于确定所述样品中复合体的量。
在具体的方面，其中所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。
在具体的方面，所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。
在具体的方面，所述受试者是人类。
另一方面，提供了用于鉴定适于使用NMT1抑制剂治疗的受试者的方法，包括：从患有癌症或者疑似患有癌症的受试者获取样品；处理所述样品；进行结合测定，包括使所述处理的样品与可结合到所述样品中豆蔻酰化蛋白或叠氮基-生物素标记的豆蔻酰化蛋白的抗体接触以形成所述可检测标志物与所述样品中存在的豆蔻酰化蛋白之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的豆蔻酰化模式；其中当所述豆蔻酰化模式指示所述癌症为NMT2缺陷时(可选地相对于对照)，指示给予所述受试者NMT1抑制剂。
在具体的方面，所述处理包括使用炔基豆蔻酸和脱硫生物素叠氮基-PEG生物素处理所述样品。
在具体的方面，所述结合测定包括荧光激活细胞分选术、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学法、定量免疫组织化学法、荧光共振能量转移、福斯特共振能量转移、双分子荧光互补、质谱法、免疫印迹测定或者免疫共沉淀测定。
在具体的方面，具有可检测所述抗体与所述样品中存在的NMT2之间的复合体的检测器的装置用于确定所述样品中复合体的量。
在具体的方面，所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。
在具体的方面，所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。
在具体的方面，其中所述受试者是人类。
另一方面，提供了用于鉴定适于使用NMT1抑制剂治疗的受试者的试剂盒，包括：NMT2抗体、用于依据权利要求68-74任一项的方法鉴定受试者的说明书。
在具体的方面，所述试剂盒还包括对照。
另一方面，提供了用于鉴定适于使用NMT1抑制剂治疗的受试者的试剂盒，包括：用于结合NMT2的核酸、用于依据权利要求75-83任一项的方法鉴定受试者的说明书。
在具体的方面，所述试剂盒还包括对照。
权利要求93的试剂盒，其中所述核酸是RNA或DNA。
另一方面，提供了用于鉴定适于使用NMT1抑制剂治疗的受试者的试剂盒，包括：NeutrAvidinTM-HRP和用于依据权利要求84-90任一项的方法鉴定受试者的说明书。
在具体的方面，所述试剂盒还包括对照。
在具体的方面，所述试剂盒还包含炔基豆蔻酸或脱硫生物素叠氮基-PEG生物素。
附图说明
现在将参考附图仅以示例的方式描述本发明的实施方案，其中：
图1描绘了对一种类型的正常B细胞(L0)和多种B细胞淋巴瘤和T细胞白血病中NMT1和NMT2表达的免疫印迹分析；
图2为图示说明多种正常细胞和多种B细胞淋巴瘤和T细胞白血病对NMT抑制剂三(二亚苄基丙酮)二钯(Tris-DBA)的敏感性的曲线图；
图3为图示说明通过三(二亚苄基丙酮)二钯(Tris-DBA)抑制N-豆蔻酰基转移酶(NMT)的柱状图；以及
图4为描绘用抗NMT1和NMT2的抗体探测淋巴瘤细胞系的免疫印迹；
图5为显示与永生化的正常B淋巴细胞系相比，NMT抑制剂对伯基特淋巴瘤细胞系的敏感性的线形图；
图6描绘了用pcDNA3.1-V5-NMT2转染拉莫斯(Ramos)B淋巴瘤细胞的结果，显示其对TrisDBA(5ug/ml)的存活率相对于用空质粒载体转染的对照细胞呈2.5倍的增加，(图A)显示细胞存活率而(图B)显示免疫印迹；
图7描绘了多种淋巴细胞系和实体淋巴瘤中存在的NMT2蛋白水平的差异；
图8A和B描绘了通过免疫组织化学法测定的多种实体淋巴瘤中存在的NMT2蛋白水平的差异：NMT免疫组织化学染色正常淋巴结、伯基特淋巴瘤(BL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，图C中绘制了CCLE数据库的所有细胞系的NMT1和NMT2的log2(NMT微阵列荧光强度)，图D中绘制了CCLE数据库中具有最低NMT2表达水平的100个细胞系的NMT1和NMT2的log2(NMT微阵列荧光强度)，(图E)通过免疫组织化学法测定伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤中的NMT2表达，过氧化物酶染色使用Image J定量。正常淋巴结的NMT2含量为0.392+/-0.3(相对单位，数据未示出)；
图9描绘了使用DDD85646(图A)、DDD86481(图B)和DDD73226(图C)处理72小时的多种B淋巴细胞系的存活力，图D描绘了DDD86481在IM9(i)和BL2(ii)淋巴细胞中可抑制豆蔻酰化的证实，图E描绘了在IM-9、BL2和拉莫斯细胞系中抑制豆蔻酰化所需DDD86481的最小剂量；
图10(图A)描绘了多种永生化的正常L0 B淋巴细胞、恶性B淋巴细胞(拉莫斯和BL2)和T细胞白血病(CEM)对NMT抑制剂TrisDBA的24小时敏感性，(图B)描绘了用pcDNA3.1-V5-NMT2转染拉莫斯B淋巴瘤细胞，其对TrisDBA(5ug/ml)的存活率相对于用空质粒载体转染的对照细胞呈2.5倍的增加；
图11描绘了癌细胞系百科全书(CCLE)数据库中的967种癌细胞系的NMT表达水平(图A)、使用盒须图表示选择的癌细胞中的NMT2表达(图B)，列出了具有最低NMT2表达的50种CCLE细胞系并依据肿瘤类型分类；
图12描绘了NMT在细胞凋亡过程被裂解但仍保留活性；
图13描绘了重组的GST-和His6-标记的hNMT1和hNMT2的纯化；
图14描绘了纯化的重组全长His6-NMT1和重组“胱天蛋白酶截短的”ct-His6-NMT1的酶活性比较；
图15描绘了多种NMT抑制剂和不同细胞系的EC50和IC50比较；
图16描绘了DDD86481诱导细胞凋亡；
图17描绘了(图A)用所指示淋巴细胞系探测NMT2存在的免疫印迹，以及(图B)CCLE数据库的所指示细胞系的以log2(NMT2微阵列荧光强度)表示的NMT2 mRNA表达水平；
图18描绘了使用链霉亲和素-琼脂糖珠，通过脱硫生物素-PEG-叠氮探针拉下(pull-down)白血病Jurkat T细胞中翻译后的ω-炔基-豆蔻酰化蛋白；
图19描绘了按比例增加的使用链霉亲和素-磁珠通过脱硫生物素-PEG-叠氮探针拉下白血病Jurkat T细胞中翻译后的ω-炔基-豆蔻酰化蛋白；
图20描绘了使用炔基-豆蔻酸标记的“正常”永生化的B细胞(IM9)和BL细胞(BL2和拉莫斯)的豆蔻酰化模式；
图21描绘了DDD86481和阿霉素组合的时间和剂量依赖的细胞毒性曲线图；
图22描绘了使用用DMSO、十字孢碱、αFAS或单独的载体培养的细胞进行的免疫印迹；
图23描绘了胱天蛋白酶截短的NMT2的活性比全长NMT2的活性高3-4倍；
图24描绘了使用1μM SAHA(I/II类HDAC抑制剂)处理24h的“正常”B细胞(IM9)和恶性BL细胞(拉莫斯，BL2)的免疫印迹；
图25描绘了多种BL细胞系中NMT2蛋白水平的下降；
图26描绘了蛋白酶体降解不是BL细胞中NMT2损耗的原因；图27描绘了NMT1被胱天蛋白酶-8裂解，但NMT2没有；
图28描绘了NMT1和NMT2都被胱天蛋白酶-3裂解；
图29描绘了通过Edman降解鉴定的NMT1和NMT2的胱天蛋白酶裂解位点，以粗体示出；并且NMT1和NMT2氨基酸序列(氨基酸1到80)中带正电荷的赖氨酸(K)盒突出显示；
图30描绘了通过定向突变确认NMT裂解位点；
图31描绘了通过Edman降解鉴定的NMT1和NMT2的胱天蛋白酶裂解位点，以粗体示出；并且NMT1和NMT2氨基酸序列(氨基酸1到80)中带正电荷的赖氨酸(K)盒突出显示；
图32描绘了细胞经历凋亡时NMT水平的改变；
图33描绘了瞬时转染的COS7细胞裂解物中的起始NMT活性；
图34描绘了瞬时转染的COS7细胞裂解物中的起始NMT活性；
图35描绘了用十字孢碱(2.5μM)和环己酰亚胺(5μg/mL)培养的瞬时表达V5-NMT1和V5-NMT2的COS7细胞中的NMT活性；
图36描绘了重组6×组氨酸(His)-标记的全长hNMT1和胱天蛋白酶裂解的hNMT1的纯化；
图37描绘了重组6×组氨酸(His)-标记的全长hNMT2和胱天蛋白酶裂解的hNMT2的纯化；
图38描绘了通过肽豆蔻酰化试验测定的纯化的全长6×组氨酸(His)-NMT和胱天蛋白酶裂解的6×组氨酸(His)-NMT的NMT活性；
图39描绘了HeLa细胞凋亡过程中内源NMT的亚细胞分级；
图40描绘了HeLa细胞凋亡过程中内源NMT的亚细胞分级后不同组分的NMT定量；以及
图41描绘了用炔基-豆蔻酸标记的细胞凋亡过程中HeLa细胞的亚细胞分级；以及
图42描绘了2-羟基豆蔻酸(HMA)对诱导细胞凋亡的影响。使用或不用HMA(1mM)处理Jurkat T细胞并且用anti-Fas(150ng/ml)和环己酰亚胺(5μg/ml)诱导细胞凋亡。
在下面的详细描述中，粗体样式的数字用于标识相对于描绘本发明各种实施方案的附图所描述和提及的组成部件。应该注意的是，在描述本发明的各种实施方案中，相同的参考标号已被用于标识相同或相似的元件。而且，为了简便起见，部件已从所述附图的一些图中删掉。
具体实施方式
如将在下文更详细描述的，有本文所述的用于治疗患有癌症的受试者的化合物、组合物和方法。也有本文所述的用于鉴别患有适合于用本文所述化合物、组合物和方法治疗的癌症的受试者的方法。也有本文所述的用于鉴别患有癌症的受试者的方法。
本申请提供用于在受试者中治疗NMT缺陷癌症的方法和组合物。NMT缺陷癌症包括NMT2或NMT1缺陷癌症。在一个具体的实例中，所述NMT缺陷癌症为NMT2缺陷癌症。
如本文使用的，术语“癌症”指的是由细胞的不正常的、不受控制的生长引起的各种各样的病况。能够引起癌症的细胞(被称为“癌细胞”)具备表征性能诸如不受控制的增殖、永生化、转移潜能、快速的生长和增殖速率和/或某些典型的形态特征。癌细胞可以肿瘤的形式，但这样的细胞也可在受试者中单独存在，或可为非致瘤性癌细胞。癌症可以许多方式中的任一种进行检测，包括但不限于检测一种或多种肿瘤的存在(例如通过临床或放射学手段)、检查肿瘤中的或来自另一种生物样品(例如来自组织活检)的细胞、测量指示癌症的血液标志物以及检测指示癌症的基因型。然而，一种或多种上文检测方法中的阴性结果不一定表明癌症的不存在，例如，已经显示对癌症治疗的完全响应的患者可仍然具有癌症，如由后来的复发所证明的。
在本公开的一个具体实例中，所述癌症为淋巴瘤。
如本文使用的术语“淋巴瘤”指的是B或T细胞在淋巴系统中的恶性生长。“淋巴瘤”包括许多类型的恶性生长，包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。如本文使用的术语“非霍奇金氏淋巴瘤”是指不是霍奇金氏淋巴瘤(其由例如癌区域中Reed-Sternberg细胞的存在所表征)的、B或T细胞在淋巴系统中的恶性生长。非霍奇金氏淋巴瘤包含超过29种类型的淋巴瘤，它们之间的区别基于癌细胞的类型。
在本公开的一个更具体的实例中，所述癌症为B-淋巴瘤。
因此，在一个实施方案中，本公开的化合物、组合物和方法适合于治疗患有B细胞淋巴瘤的受试者。
B细胞淋巴瘤的实例包括但不限于，例如，滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症和MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤。同样预期儿科淋巴瘤诸如伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、前体B-LBL、前体T-LBL和间变性大细胞淋巴瘤的治疗。
其他实施方案中，所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌或食管鳞状细胞癌。
如本文使用的，术语“受试者”指的是动物，并且可包括例如家养动物诸如猫、犬等，牲畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)，实验性动物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠等)，哺乳动物，非人哺乳动物，灵长类，非人灵长类，啮齿动物，鸟类，爬行动物，两栖动物，鱼类和其它任何动物。在具体的实例中，所述受试者为人类。
如本文使用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”，指的是获得有益的或所期望的结果，包括临床结果。有益的或所期望的临床结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病况、减轻疾病的程度、稳定(即不恶化)疾病的状态、预防疾病的扩散、延迟或减慢疾病进程、改善或缓和疾病状态、减少疾病的复发以及痊愈(部分或全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”也可意指与不接受治疗时的预期存活期相比延长的存活。如本文使用的“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”还包括预防性治疗。例如，患有早期癌症例如早期淋巴瘤的受试者可被治疗以阻止进程，或者可选地痊愈中的受试者可用本文描述的化合物或组合物治疗以预防复发。
本文显示，B细胞淋巴瘤细胞表达NMT1，但不表达NMT2。这与测试的表达NMT1和NMT2两者的白血病和其它细胞相反。(如图1和图4所示)
本文进一步显示，B淋巴瘤细胞对于通过NMT抑制剂抑制细胞存活率敏感。
在一个实例中，所述NMT抑制剂为三(二亚苄基丙酮)二钯(Tris-DBA)(图2)。
在其它实例中，所述NMT抑制剂2-羟基豆蔻酸(HMA)被用于抑制B淋巴瘤细胞。
在另一个实例中，T.brucie NMT的吡唑磺胺抑制剂[J.A.Frearson et al(2010)Nature.464.728-723)](DDD85646)被用于抑制B淋巴瘤细胞(图5)。
在另一个实例中，所述抑制剂是DDD86481。
在一个具体的实例中，患有B淋巴瘤的受试者的治疗包括给予所述受试者NMT抑制剂。
NMT抑制剂化合物或衍生物可在本发明中用于治疗NMT2缺陷癌症。
如本文使用的术语“缺陷”广泛地指例如NMT合成、水平、活性或功能的抑制、减少或消除(相对于野生型或对照样品)，以及NMT蛋白(例如NMT1或NMT2)的合成、水平、活性或功能的诱导或刺激的抑制。该术语也指可调节NMT的合成、水平、活性或功能的任何代谢或调节通路。该术语也包括由与其它分子结合和复合物形成造成的抑制、减少或消除。因此，术语“NMT缺陷”指的是其导致蛋白功能或蛋白通路功能的抑制、减少或消除。然而，该术语并不意味着这些功能的每一个必须同时被抑制。
在一些实例中，癌症可通过测定NMT基因中突变的存在而被鉴别为NMT缺陷。这样的核酸检测和扩增的方法为本领域技术人员所熟知。
例如，有待扩增的所述核酸可来自生物样品。多种提取方法(诸如酚和氯仿提取)适合于分离DNA或RNA。从样品中提取的核酸可使用本领域中众所周知的核酸扩增技术进行扩增。非限制性的实例包括链反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、巢式PCR、连接酶链反应、可扩增的RNA报告子、Q-β复制、基于转录的扩增、反向DNA扩增(boomerangDNAamplification)、链置换激活、循环探针技术、等温的基于核酸序列的扩增(NASBA)或者其它序列复制测定，或者也可使用信号扩增测定。
扩增方法在本领域中是众所周知的。一些方法利用RNA向cDNA的反转录。
在一个实例中，使用PCR扩增感兴趣的靶序列，例如NMT2序列。
核酸可在检测前扩增或者可在扩增步骤期间直接检测，例如“实时的”方法。在一些实施方案中，使用标记引物扩增所述靶序列以便可检测地标记所产生的扩增子。在一些实施方案中，所述引物被荧光标记。在一些实施方案中，扩增所述靶序列并通过电泳检测所产生的扩增子。
基因表达的水平可通过评估样品中NMT2 mRNA的量来确定。测量样品中mRNA的方法在本领域是已知的。为了测量mRNA水平，可裂解所述样品中的细胞并且所述裂解物中的或者从裂解物中纯化或半纯化的RNA中的mRNA水平可通过本领域技术人员所熟悉的任何一种方法测量。这样的方法包括但不限于使用可检测标记的DNA或RNA探针的杂交测定，例如RNA印迹法，或者使用合适的寡核苷酸引物的定量或半定量RT-PCR法。可选地，定量或半定量的原位杂交测定可使用例如组织切片或者未裂解的细胞悬浮液和可检测标记的例如荧光或酶标记的DNA或RNA探针进行。用于定量mRNA的另外的方法包括RNA保护测定(“RPA”)、cDNA和寡核苷酸微阵列、代表性差异分析(“RDA”)、差异显示、EST序列分析、基因表达的系列分析(“SAGE”)和用Luminex FlexMAP的多重连接介导的扩增(“LMF”)。
扩增也可使用“实时的”方法进行监测。实时PCR允许对核酸靶标的检测和定量。通常，这种定量PCR的方法利用荧光染料，其可为双链特异的染料，诸如SYBR Green.RTM.I。可选地，其它荧光染料例如FAM或HEX可结合到寡核苷酸探针或引物。能够进行实时PCR的各种装置在本领域中是已知的。在PCR的每个循环产生的荧光信号与PCR产物的量成正比。荧光对循环数的绘图(plot)用于描述扩增的动力学，并且荧光阈值水平用于定义与初始模板浓度有关的分数阶(fractional)循环数。当进行扩增并在热循环期间在能够读出荧光的装置上进行检测时，可使用熔点分析将预期的PCR产物从非特异PCR产物中区分开。通过测量荧光的变化同时逐渐增加扩增和信号产生之后的反应温度，有可能测定预期产物的(ΔCt)和非特异产物的ΔCt。
所述方法可包括在样品中扩增多个核酸，也称为“多重检测”或“多重化(multiplexing)”。如本文使用的，术语“多重PCR”是指涉及为了检测和定量多个核酸(包括来自一种或多种靶基因标志物的核酸)而向所述反应加入多于一套的PCR引物的PCR。此外，用内部对照例如18s rRNA、GADPH或β-actin的多重化提供无反应的PCR的对照。
在一些实例中，癌症可通过测定NMT基因的表观失活而被鉴别为NMT缺陷。
在一些实例中，癌症可通过测定来自受试者的细胞样品中的NMT(包括NMT1或NMT2)的活性而被鉴别为NMT缺陷。活性可相对于对照测定，例如在癌细胞缺陷的情况下，相对于非癌性细胞(优选来自相同组织)进行测定。因此，NMT缺陷的癌症可具有降低的或消除的NMT活性和/或表达。NMT的活性可使用本领域中所熟知的技术和/或本文所述技术进行测定。在这些实例中，NMT缺陷的癌症具有降低的或消除的活性。
在一些实例中，癌症可通过测定NMT蛋白的量、浓度和/或水平而被鉴别为NMT(NMT1、NMT2，或二者都有)缺陷。
在一些实例中，癌症可通过测定来自患癌或者疑似患癌受试者的生物样品中的豆蔻酰化蛋白的量而被鉴别为NMT缺陷。在本实例中,豆蔻酰化蛋白的存在、不存在或量可例如使用合适的脂肪酸类似物通过点击化学测定。本文描述了非限制性的方法。测定豆蔻酰化蛋白的存在、不存在或量的替代性方法将为本领域技术人员所已知。样品中有减少量的豆蔻酰化蛋白(可选地相对于参照)的样品指示为NMT缺陷样品，或者NMT缺陷癌症。在一些实例中，样品中有减少量的豆蔻酰化蛋白的样品指示为NMT2缺陷样品，或者NMT2缺陷癌症。
在一些实例中，癌症可通过测定来自患癌或疑似患癌的受试者的生物样品中的蛋白酰化的量的量而被鉴定为NMT缺陷。在本实例中，蛋白酰化的存在、不存在或量可被测定。这样的方法将为本领域技术人员所已知。样品中有减少量的蛋白酰化(可选地相对于参照)的样品指示NMT缺陷样品，或者NMT缺陷癌症。在一些实例中，样品中有减少量的蛋白酰化的样品指示为NMT2缺陷样品，或者NMT2缺陷癌症。
在一些实例中，癌症可通过测定一种或多种序列变异诸如可包括相对于野生型核苷酸序列的一种或多种核苷酸的缺失、插入或取代的突变和多态性的存在而被鉴别为NMT缺陷。所述一种或多种变异可在核酸序列的编码或非编码区中并且可减少或消除NMT的表达或功能。因此，变体核酸可编码具有减小的或消除的活性的变体多肽，或者可编码例如因调节元件的改变的活性在细胞内很少或没有表达的野生型多肽。
在一些实例中，癌症可通过测定影响或者负调节NMT表达的基因而被鉴别为NMT缺陷。
多种方法可用于在从受试者获得的样品中测定具体核酸序列的存在或不存在。
在一些实例中，癌症可通过评估所述NMT通路的组成部分的NMT的正的或负的调节子的表达或活性水平而被鉴别为NMT缺陷。表达水平例如可通过免疫测定(诸如免疫印迹和ELISA)以及核酸检测方法(诸如RT-PCR、nanostring技术、RNA测序、核酸杂交或者核型分析)进行测定。
在一些实例中，癌症可通过测定来自所述个体的细胞样品中的一个或多个变异例如NMT1和/或NMT2的多态性或突变的存在而被鉴别为NMT1和/或NMT2缺陷。
与癌症相关的突变和多态性也可通过检测变体(即突变体或等位基因变体)多肽的存在而在蛋白水平进行检测。
在另一个实例中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌症包括NMT2缺陷的癌细胞，所述方法包括给予所述受试者NMT抑制剂和/或NMT1抑制剂。
如本文使用的术语“抑制”或“抑制剂”指的是抑制蛋白合成、水平、活性或功能的任何方法或技术，以及抑制感兴趣蛋白例如NMT2的合成、水平、活性或功能的诱导或刺激的方法。该术语也指可调节感兴趣蛋白的合成、水平、活性或功能的任何代谢或调节通路。该术语包括与其它分子结合和复合物形成。因此，术语“抑制剂”指的是其应用导致对蛋白功能或蛋白通路功能的抑制的任何剂或化合物。然而，该术语并不意味着这些功能的每一个必须同时被抑制。
在另一个实例中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌症包括NMT1缺陷的癌细胞，所述方法包括给予所述受试者NMT抑制剂和/或NMT2抑制剂。
在一些实例中，治疗方法包括给予受试者治疗有效量的本文所述化合物并且可选地由单次给予或施用组成，或者可选地包括一系列给予或施用。在具体的实例中，所述化合物为NMT抑制剂、NMT1抑制剂和/或NMT2抑制剂。
更具体的实例中，所述NMT抑制剂为Tris-DBA、HMA、DDD85646、DDD86481或他们的衍生物。
在其他的实例中，所述化合物和/或组合物以适于给予受试者的药学上有效的量提供。
如本文使用的术语“药学上有效的量”是指由研究者或临床医生所探索的将引起组织、全身、动物或人的生物学或医学响应的药物或药剂的量。这个量可为治疗上有效的量。
所述化合物和组合物以药学上可接受的形式提供。
如本文使用的术语“药学上可接受的”包括适于与受试者的组织接触使用而无过量毒性、刺激、变态反应或其它问题或并发症的、与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型(例如单位剂量)。从与所述制剂的其它成分相容的意义上说，各个载体、赋形剂等也为“可接受的”。
所给予的实际量，以及给予的速率和时程将取决于被治疗的疾病性质和严重程度。治疗的药方(例如剂量的决定等)在全科医生和其它医生的职责之内，并且通常考虑到有待治疗的病症、具体患者的病况、递送的位置、给予的方法和从业者已知的其他因素。
化合物或组合物可单独给予或与其它治疗同时或相继组合给予，取决于有待治疗的病况。
所述制剂可方便地以单位剂型存在并可由药剂学领域中所熟知的任何方法制备。这样的方法包括使活性化合物与载体结合的步骤，其可构成一个或多个助剂成分。通常，所述制剂通过使所述活性化合物与液体载体或者细碎的固体载体或两者均匀且密切地结合来制备，并且之后如果必要的话使产品成形。
所述化合物和组合物可通过任何方便的给予途径给予受试者，无论是全身地/外围地还是在期望作用的部位，包括但不限于口服给予(例如通过摄食)；局部给予(包括例如经皮、鼻内、眼睛、口腔和舌下)；肺部给予(例如通过使用例如喷雾，例如通过口或鼻子，的吸入或吹入疗法，)；直肠给予；阴道给予；肠胃外给予，例如通过注射，包括皮下、皮内、肌肉内、静脉内、动脉内、心脏内、鞘内、脊柱内、囊内、囊下、眼眶内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内；通过储库植入物/例如皮下或肌内。
适合于口服给予(例如，通过摄食)的制剂可以以离散单元诸如胶囊、扁囊剂或片剂存在，每个包含预定量的活性化合物；以粉末或颗粒剂存在；以水性或非水性液体中的溶液或悬浮液存在；或者以水包油液体乳剂或油包水液体乳剂存在；以大丸剂存在；以药糖剂存在；或者以糊剂存在。
适合于肠胃外给予(例如，通过注射，包括皮肤、皮下、肌肉内、静脉内和皮内)的制剂，包括水性和非水性等渗的、无热原的、无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲液、防腐剂、稳定剂、抑菌剂和致使所述制剂与预定接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂，以及设计用来将所述化合物靶向血液组分或一个或多个器官的脂质体或其它微粒系统。用于这样的制剂的合适的等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或者乳酸盐林格氏溶液。
所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量的密闭容器(例如安瓶和小瓶)中，并且可在冷冻干燥(冻干)条件储存，仅需要在使用前即时加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒和片剂制备。制剂可为设计用来将所述活性化合物靶向血液组分或者一个或多个器官的脂质体或其它微粒系统的形式。
包含本文公开的化合物的组合物可与标准化疗方案组合或与放射疗法结合用于本文所述方法中。
在患者为淋巴瘤的情况下，已知治疗取决于所治疗的受试者、疾病的类型和其阶段。对于淋巴瘤的现有治疗模式为本领域技术人员所已知。因此，已知治疗可与本文公开的NMT抑制剂一起使用。
用于治疗淋巴瘤的一般的药物组合包括但不限于CHOP(即，环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)、GAP-BOP(即，环磷酰胺、阿霉素、甲基苄肼、博来霉素、长春新碱和强的松)、m-BACOD(即，甲氨蝶呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸)、ProMACE-MOPP(即，强的松、甲氨蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸以及标准MOPP)、ProMACE-CytaBOM(强的松、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷、阿糖孢苷、博来霉素、长春新碱、甲氨蝶呤和亚叶酸)和MACOP-B(甲氨蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、强的松、博来霉素和亚叶酸)。对于复发性侵袭性非霍奇金淋巴瘤，以下化疗药物组合可与本文所述化合物和组合物一起使用：IMVP-16(即，异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)、MIME(即，甲基-gag、异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)、DHAP(即，地塞米松、-16高剂量阿糖孢苷和顺铂)、ESHAP(即，依托泊苷、甲泼尼松、高剂量阿糖孢苷和顺铂)、CEFF(B)(即，环磷酰胺、依托泊苷、甲基苄肼、强的松和博来霉素)和CAMP(即，环己亚硝脲、米托蒽醌、阿糖孢苷和强的松)。
用于某些淋巴瘤诸如用于复发性、耐药性霍奇金氏病的补救性化疗的治疗包括但不限于VABCD(即，长春花碱、阿霉素、达卡巴嗪、环己亚硝脲和博来霉素)、ABDIC(即，阿霉素、博来霉素、达卡巴嗪、环己亚硝脲和强的松)、CBVD(即，环己亚硝脲、博来霉素、长春花碱、地塞米松)、PCVP(即，长春花碱、甲基苄肼、环磷酰胺和强的松)、CEP(即，环己亚硝脲、依托泊苷和泼尼莫司汀)、EVA(即，依托泊苷、长春花碱和阿霉素)、MOPLACE(即，环磷酰胺、依托泊苷、强的松、甲氨蝶呤、cytaravine和长春新碱)、MIME(即，甲基-gag、异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)、MINE(即，丙脒腙、异环磷酰胺、长春瑞滨和依托泊苷)、MTX-CHOP(即，甲氨蝶呤和CHOP)、CEM(即，环己亚硝脲、依托泊苷和甲氨蝶呤)、CEVD(即，环己亚硝脲、依托泊苷、长春地辛和地塞米松)、CAVP(即，环己亚硝脲、美法仑、依托泊苷和强的松)、EVAP(即，依托泊苷、长春花碱、阿糖孢苷和顺铂)和EPOCH(即，依托泊苷、长春新碱、阿霉素、环磷酰胺和强的松)。
可以理解的是，抑制NMT1或NMT2的替代方法可在用于癌症治疗特别是B细胞淋巴瘤治疗的合成致死策略中使用。例如，NMT1或NMT2的表达可使用反义或RNAi技术抑制。下调基因表达和/或蛋白活性的这些方法的使用对于本领域技术人员来说是已知的。
在本公开内容的另一个实施方案中，提供了用于测定患者的NMT2抑制剂和/或NMT1抑制剂治疗的益处的方法。
在一个实例中，本公开内容的方法包括定性或定量测定、分析或测量来自患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的样品的NMT1和/或NMT2的存在或不存在、或量或浓度。
在另一个实例中，本公开内容的方法包括定性或定量测定、分析或测量来自患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的样品的豆蔻酰化蛋白的存在或不存在、或量或浓度。
在另一个实施例中，本公开内容的方法包括定性或定量测定、分析或测量来自患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的样品的酰化蛋白的存在或不存在、或量或浓度。
如本文使用的术语“样品”指的是来自受试者的任何样品，包括但不限于包含癌细胞或者疑似含有癌细胞的流体、细胞或组织样品，其可用于基因表达水平、蛋白水平、酶活性水平等的测定。所述样品例如可包括血液样品、分级的血液样品、骨髓样品、活检、冷冻的组织样品、新鲜的组织样品、细胞样品和/或石蜡包埋的切片、可从中提取足够数量和足够质量的RNA以满足测量相对mRNA水平的材料，或可从中提取足够数量和足够质量的多肽以满足测量相对多肽水平的材料。
测定、分析或测量NMT1或NMT2，或者NMT1和/或NMT2的存在或不存在可与NMT1抑制剂或NMT2抑制剂治疗患者癌症的益处相关联。
测定、分析或测量豆蔻酰化蛋白，或者豆蔻酰化蛋白的存在或不存在可与NMT1抑制剂或NMT2抑制剂治疗患者癌症的益处相关联。
测定、分析或测量酰化蛋白，或者豆蔻酰化蛋白的存在或不存在可与NMT1抑制剂或NMT2抑制剂治疗患者癌症的益处相关联。
在具体的实例中，本发明的抗体对于感兴趣的蛋白具有免疫反应性或免疫特异性，并因此可特异性地或选择性地结合感兴趣的蛋白，例如蛋白NMT1或NMT2。在一个实例中，可使用对人NMT1或NMT2具有免疫反应性和免疫特异性的抗体。人NMT1或NMT2的抗体优选免疫特异性的。术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”包括但不限于单克隆抗体和多克隆抗体。
在另一个实例中，本发明的抗体对于NMT1蛋白或NMT2蛋白两者为免疫反应性或免疫特异性的，并因此特异性地和选择性地结合NM1蛋白或NMT2蛋白两者。在该实例中，可使用对人NMT1蛋白或NMT2蛋白两者为免疫反应性和免疫特异性的抗体。人NMT1或NMT2的抗体优选免疫特异性的。在该实例中，由于NMT1和NMT2的分子量不同，因此能够通过例如SDS-PAGE和免疫印迹使用单个抗体鉴别两种蛋白的存在或不存在。术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”包括但不限于单克隆抗体和多克隆抗体。
术语“特异性结合”指的是抗体对于具体多肽例如NMT1或NMT2的表位的高亲和力和/或高亲和性结合。抗体与该具体多肽上的其表位的结合比相同抗体与其他任何表位(尤其是可在与感兴趣的具体多肽相关联的分子中或者与感兴趣的具体多肽相同的样品中存在的那些)的结合更强。可特异性结合感兴趣的多肽的抗体可能能够以弱的但是可检测的水平结合其它多肽。这种弱的结合或者本底结合可容易地从与所述化合物或感兴趣的多肽的抗体结合辨别，例如通过使用适当的参照，如本领域技术人员应当知道的。
在一个实例中，包含癌性细胞或者疑似包含癌性细胞的样品从患有癌症的受试者获得。这样的样品的收集为本领域技术人员所熟知。在具体的实例中，所述样品为血液样品。获得样品、加工和/或储存这样的样品的方法也是本领域技术人员所熟知的。
在具体的实例中，样品中的NMT1或NMT2蛋白的检测、分析或测量使用免疫组织化学法进行。在一个更具体的实例中，样品中的NMT2的检测、分析或测量使用免疫组织化学法进行。本领域技术人员应当清楚，其它免疫测定，定性或定量的，均可用于本发明。
另外的实例中，免疫组织化学法(IHC)可通过任意合适的免疫组织化学法的方法或系统实现。非限制性的实例包括自动化系统、定量IHC、半定量IHC和手动方法。
术语“定量的”免疫组织化学法是指自动化的扫描并评价经过免疫组织化学法的样品以鉴定和定量具体生物标记(例如抗原或其他蛋白)的存在的方法。例如，可定量NMT1和/或NMT2。给予样品的得分是样品的免疫组织化学染色强度的数值表征，并且代表样品中存在的目标生物标记(例如NMT1或NMT2)的量。本文中，光密度(OD)是代表染色强度和染色细胞百分比的数值得分。本文中，半定量免疫组织化学法是指通过人目测评价免疫组织化学的结果，其中经过训练的技术人员将结果数值化(例如，0[弱或无染色]、1或2[强染色])。
适合用于免疫组织化学法的自动化样品处理、扫描和分析系统是本领域已知的，并且可用于本发明。该类系统可包括自动化染色和显微扫描、计算机化图像分析、连续切片比较(与对照比较以获得样品取向和大小的差异)、数字化报告产生以及存档和跟踪样品(例如其上置有组织切片的玻片)。细胞成像系统是可商购的，其组合了常规的光学显微镜和数字化图像处理系统以实现定量分析细胞和组织，包括免疫染色的样品。
实践中，患者样品经测定具有低(例如弱或无)NMT2肿瘤染色的实例中，所述患者被认为是可使用NMT1抑制剂治疗的良好的候选者。另一个具体的实例中，经测定具有高(例如强)NMT2肿瘤染色的患者被认为是使用NMT1抑制剂治疗的差的候选者。
应理解，确定IHC阴性与阳性的截点(cut point)是半定量测定，并且由有经验的病理学家通过半定量方法和光学显微镜完成。
例如，IHC可以下述任意方式赋值：1.任意染色对无染色；2.强对弱染色；3.无对弱对强；4.H得分包括公式(无％×0)+(弱％×100)；+(中度％×200)+(强％×300)；5.计算机化图像分析软件用于辅助定量赋值。
截点是通过体外可变的药物敏感度进行初始定义的。一旦药物进入临床试验，敏感对不敏感的截点将被进一步完善并验证。
在一个实例中，在确定是否具有高(例如强)或低(例如弱或无)NMT2肿瘤染色过程中，可将患者的样品与一种或多种对照样品比较。在一个实例中，对照样品具有已知的和/或确定水平的NMT2肿瘤染色。在一个实例中，对照样品是具有已知的和/或确定水平的NMT2肿瘤染色和/或已知临床结果的患者样品。在一个实例中，对照是具有已知量的NMT2染色的细胞系。
对于被认为是NMT1抑制剂治疗的差候选者的患者的持续治疗选项是本领域技术人员已知的。
应理解，在某些情况下，初始对NMT1抑制剂治疗响应的患者可能会复发。所述复发可以多种途径表征，包括但不限于重新出现原发性肿瘤和转移的发展。此外或可选择地，可能产生另外不同的肿瘤。
根据本发明的一个方面，提供了一种方法，其包括：a)从患有或疑似患有癌症的受试者获取样品；b)使所述样品与NMT2的抗体接触以形成所述抗体与所述样品中存在的NMT2之间的复合体；c)测量所形成的复合体以确定所述样品中NMT2的含量或浓度；以及d)确定NMT1抑制剂治疗对于所述受试者中所述癌症的益处，其中确定NMT1抑制剂治疗的益处是通过所述样品中NMT2的水平确定的。
在具体的方面，当所述样品中NMT2含量低或无(可选地相对于对照)时，指示给予所述受试者NMT1抑制剂。
根据本发明的一个方面，提供了一种方法，其包括：从受试者获取样品；处理所述样品；进行结合测定，包括使所述处理的样品与NMT2抗体接触以形成所述抗体与处理的样品中存在的NMT2之间的复合体，所述结合测定可产生至少1种指示所述复合体的测定结果；并且当所述样品中NMT2含量低或者缺乏时(可选地相对于对照)，指示给予所述受试者NMT1抑制剂。
在一些方面，具有可检测所述抗体与所述样品中的NMT2之间形成的复合体的检测器的装置用于确定所述样品中复合体的量。在一些实例中，所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。在一些实例中，NMT2抗体是单克隆抗体或者多克隆抗体。
可在NMT1或NMT2的检测、分析或测量中使用的其它实例包括但不限于对获自所述受试者的样品的免疫印迹、ELISA、间接免疫荧光、多重微珠技术、免疫沉淀和质谱法。在实践中，在其中患者样品被测定为具有低的或者缺乏的NMT2染色的实例中，所述受试者被认为是NMT抑制剂治疗的良好的候选者。
在一个实例中，所述样品是使用光学显微镜通过直接检测或通过图像捕获并分析测定的，或者使用荧光显微镜通过图像捕获并分析直接检测来测定的。
在另一个实例中，本发明的方法包括定性或定量测定、分析或测量来自患有癌症的受试者的生物样品中的NMT1和/或NMT2蛋白的活性，以确定NMT1和/或NMT2活性的存在或不存在或量。在该实例中，使用NMT1或NMT2的底物(天然的或合成的)被用于鉴别样品中NMT1或NMT2活性存在、不存在或其量。
在实践中，在其中受试者样品被测定为NMT2缺陷的实例中，所述受试者被认为是给予NMT1抑制剂的良好的候选者。
在实践中，在其中患者样品被测定为具有低的或缺乏的NMT2蛋白水平的实例中，所述受试者被认为是给予NMT1抑制剂的良好的候选者。
在实践中，在其中患者样品被测定为具有低的或缺乏的NMT2活性的实例中，所述受试者被认为是给予NMT1抑制剂的良好的候选者。
在实践中，在其中患者样品被测定为具有低的或缺乏量的豆蔻酰化蛋白的实例中，所述受试者被认为是给予NMT1抑制剂的良好的候选者。
在实践中，在其中受试者样品被测定为具有低的或缺乏量的酰化蛋白的实例中，所述受试者被认为是给予NMT2抑制剂的良好的候选者。
在另一个实例中，本发明的方法包括在来自患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的样品中鉴别NMT1或NMT2基因的突变、缺失等。其中，所述NMT1或NMT2基因的突变、缺失等导致所述样品中的癌细胞中NMT1或NMT2蛋白活性的损失减少。鉴别这样的NMT1或NMT2突变、缺失等的方法是本领域技术人员所已知的，并且包括但不限于RFLP、RT-PCT、微阵列分析和/或任何合适类型的DNA测序。在实践中，在其中患者样品被测定为具有可导致低的或缺乏的NMT2蛋白活性的NMT2突变、缺失等的实例中，所述受试者被认为是NMT抑制剂治疗的良好的候选者。
在另一个实例中，本发明的方法包括在来自患有癌症或疑似患有癌症的受试者的样品中鉴别NMT1或NMT2 mRNA的突变、缺失等。其中，所述的NMT1或NMT2 mRNA的突变、缺失等导致所述样品中的癌细胞中NMT1或NMT2蛋白活性的损失减少。鉴别NMT1或NMT2 mRNA中这样的突变、缺失等的方法是本领域技术人员所已知的，并且包括但不限于RNA印迹法、RT-PCR、微阵列分析和/或任何合适类型的mRNA测序。在实践中，在其中患者样品被测定为具有导致低的或缺乏的NMT2蛋白活性的NMT2 mRNA突变、缺失等的实例中，所述受试者被认为是NMT抑制剂治疗的良好的候选者。
在另一个实例中，本发明的方法，提供了用于治疗患有与NMT1或NMT2缺陷有关的癌症的受试者的方法，包括给予所述受试者NMT抑制剂。在一个具体的实例中，所述癌症是NMT2缺陷相关的，并且所述抑制剂是NMT1抑制剂。
另一个实例中，提供了NMT1抑制剂用于治疗NMT2缺陷癌症的用途。
另一个实例中，提供了NMT1抑制剂用于治疗癌症的用途，其中所述癌症是淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。在一个更具体的实例中，所述癌症被确定为NMT2缺陷癌症。
抑制剂的实例包括但不限于小分子、抗体、肽片段和/或核酸分子。
小分子的具体实例包括Tris-DBA、HMA、DDD85646、DDD86481和它们的衍生物。如本文使用的术语“衍生物”包括但不限于盐类、配合物、酯类诸如体内可水解的酯类、游离酸或碱、水合物、前药或脂类、偶联伴侣(coupling partners)。
肽片段可全部或部分地通过化学合成NMT1的活性位点来制备。肽片段可根据已建立的、标准的液相或固相肽合成方法制备，其为本领域技术人员所已知。
核酸抑制剂或其互补体通过下调活性多肽的产生来抑制活性或功能。这可使用本领域技术人员所熟知的常规方法来监测，例如通过使用如实例中所述实时PCR的筛选。
核酸抑制剂的实例包括反义或RNAi技术，其下调基因表达的用途在本领域中是得到确认的。可以设计反义寡核苷酸以与核酸、前体mRNA(pre-mRNA)或成熟mRNA的互补序列杂交，干扰碱基切除修复途径组分的产生，从而降低或完全或基本完全阻止其表达。除了靶向编码序列，反义技术还可用于靶向基因的控制序列，例如5’侧翼序列，由此所述反义寡核苷酸可以干扰表达控制序列。
反义的可替代的选择是使用有义(也就是与靶基因相同的方向)插入的靶基因的全部或部分的拷贝，以通过共抑制实现靶基因表达的降低。
此外，可使用双链RNA(dsRNA)沉默。dsRNA介导的沉默为基因特异性的，并且常被称为RNA干扰(RNAi)。
在另一个实例中，使用在转录中产生核酶的核酸，所述核酶能够在特异性位点切割核酸，并因此也可用于影响NMT。
还有另一个实例中，可利用小RNA分子调控基因表达。这些包括通过小分子干扰RNA(siRNA)的mRNA的靶向降解、转录后基因沉默(PTG)、通过微小RNA(miRNA)的mRNA的发育调控的序列特异性转录抑制以及靶向转录基因沉默。
还有另一个实例中，可使用细胞中的短发卡RNA分子(shRNA)的表达。shRNA由通过小环序列隔开的短的反向重复序列组成。一个反向重复序列与所述基因靶标互补。在细胞中，所述shRNA通过DICER加工为siRNA，其降解靶基因NMT的mRNA并抑制表达。在优选的实施方案中，所述shRNA通过转录由载体内源(在细胞内)产生。
NMT1或NMT2的缺陷分别为NMT1或NMT2缺陷表型，其可为NMT1或NMT2介导的通路的组分的缺陷，即相对于参照细胞，所述通路的组分活性的表达可在癌细胞中降低或消失。在一些实施方案中，所述癌细胞可为NMT1或NMT2缺陷，即相对于参照细胞，NMT1或NMT2在癌细胞中的活性表达可降低或消失。
因此，提供了NMT2作为标志物用于受试者中癌症的诊断、预后、分级或监测中的一种或多种的用途。在一些实例中，使用选自免疫测定或核酸检测或蛋白活性的测定进行NMT2测量。
本文中，术语“预后”是指预测癌症引起的死亡或进展(包括肿瘤病例如乳腺癌的复发、转移扩散和药物抗性)的可能性。
本文中，术语“预后标志物”是指可指示患者不经过系统性治疗的结果的标志物或者可预知与不含所述标志物的患者(尽管经过经验性(未靶向所述标志物)系统治疗)的结果差异的标志物。
本文中，术语“预测性标志物”是指可基于标志物状态预测具体治疗的差异效力(益处)的标志物。
本文中，术语“诊断”是指鉴定分子和/或病理状态、疾病或病况，例如鉴定乳腺癌或其他类型的癌症。
还提供了蛋白豆蔻酰化作为标志物用于受试者中癌症的诊断、预后、分级或监测中的一种或多种的用途。
还提供了蛋白酰化作为标志物用于受试者中癌症的诊断、预后、分级或监测中的一种或多种的用途。
在一些实例中，所述癌症为淋巴瘤。在更具体的实例中，所述淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。在更具体的实例中，所述B细胞淋巴瘤为滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B-CLL/SLL、免疫细胞瘤/巨球蛋白血症、MALT型/单核细胞样B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
在一些实例中，所述癌症为急性髓性白血病、B细胞淋巴瘤、急变期慢性髓性白血病、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、肠腺癌、肺混合腺鳞癌、肺小细胞癌、肺、食道鳞状细胞癌、骨、乳腺导管癌、胃弥漫性腺癌、甲状腺髓样癌、尿路移行细胞癌。
在一些实例中，所述癌症为B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、急性髓性白血病、骨髓瘤、卵巢透明细胞癌、过渡细胞癌(输尿管和膀胱癌)、慢性髓细胞性白血病(CML)、淋巴瘤-CLL、小细胞肺癌、乳腺癌、结肠直肠腺癌、胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃腺癌、子宫内膜腺癌、食管鳞状细胞癌。
本发明的方法通过以试剂盒的形式提供在该方法中使用的化合物和/或组合物而方便地实行。这样的试剂盒优选包含所述组合物。这样的试剂盒优选包含使用其的说明书。
为了更好地理解本文所描述的本发明，提出以下实施例。应当理解，这些实施例仅用于说明目的。因此，它们不应以任何方式限制本发明的范围。
实施例
在以下实施例中，采用标准的方法，如本领域技术人员可以理解的。
材料和方法
抗体和试剂
三(二亚苄基丙酮)二钯(Tris dibutylbenzinylidene acetone paladium)(TrisDBA)为Arbiser博士(U.Alabama)所惠赠。DDD85646按[J.A.Frearson et al(2010)Nature.464.728-723)]描述的进行合成和/或DDD86481获自David Gray和Paul Wyatt博士(Dundee University)。
小鼠抗NMT1抗体(克隆14；1:1000)和小鼠抗NMT2抗体(克隆30；1:2000)购自BD生物科学公司，圣何塞，CA，USA。兔抗NMT l(多克隆，1:3000)购自Proteintech,芝加哥,IL,USA。兔抗GFP抗体(1:20,000)、抗PARP-1抗体(1:5000)、抗GAPDH抗体(1:5000)和抗C末端PAK2抗体(1:2000)来自Eusera(www.eusera.com)，埃德蒙顿，AB，加拿大。小鼠抗α-微管蛋白抗体(1:15,000)和兔抗V5抗体(1:10,000)购自Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA。小鼠抗His抗体(1:2000)来自Qiagen，德国。兔抗剪切的胱天蛋白酶-8抗体(1:1000)和抗剪切的胱天蛋白酶-3抗体(1:1000)均来自Cell Signaling，丹佛斯，MA，USA。增强化学发光(ECL)Plus和ECL Prime蛋白免疫印迹检测试剂盒购自GE医疗，匹兹堡，PA，USA。除非另有说明，所使用的所有化学品均购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,MO,USA)，并且为可获得的最高纯度。
DNA构建体。V5-和His-标记的NMT1和NMT2构建体的工程化。与Gateway克隆系统(Life Technologies，格兰德岛，N.Y.，USA)相容的NMT1和NMT2入门载体购自Genecopoeia(罗克维尔市,MD,USA)。根据制造商的说明，使用LR clonase酶(Life Technologies)将所述NMT1和NMT2基因并入目标载体pcDNA3.1/nV5 DEST(Life Technologies)以产生N末端标记的NMT质粒(His-NMT1、His-NMT2、V5-NMT1和V5-NMT2)。V5标记的NMT构建体用于哺乳动物细胞表达，而His-NMT构建体用于细菌表达。克隆产物通过DNA测序(Eurofins MWG Operon，亨茨维尔，AL，USA)进行证实。
细胞培养。B细胞的来源为Jim Stone博士所惠赠或者获自ATCC。细胞培养的所有试剂均购自Invitrogen。将B细胞在潮湿的培养箱中于37℃和5％CO2下进行培养并在补充10％胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的RPMI培养基中维持。
细胞裂解。将细胞在冷PBS中洗涤，在0.1％SDS-RIPA缓冲液[50mM Tris、150mMNaCl、1％Igepal CA-630、0.5％NaDC、2mM MgCl2和l×完全蛋白酶抑制剂(RocheDiagnostics)；pH 8.0]中裂解并在4℃震动15min。在4℃、16,000g离心15min后，获得细胞裂解物上清液。
凋亡的诱导。除非另有提及，为了抑制蛋白翻译并增强凋亡诱导，使用2.5μΜ十字孢碱(STS)(Sigma Aldrich,圣路易斯,MO,USA)和5μg/mL环己酰亚胺(ICN BiochemicalsInc.奥罗拉,OH,USA)诱导凋亡。
与NMT抑制剂的孵育。三(二亚苄基丙酮)二钯(TrisDBA)为Arbiser博士所惠赠。将细胞以渐增的浓度与TrisDBA(或者DMSO用于对照)孵育24小时或者与DDD85646孵育24小时和48小时。
B细胞转染。按照制造商的说明以及优化适于100tips的Ramos B细胞转染的方案(脉冲电压1,300V；脉冲宽度20ms，2个脉冲以及7.7.106个细胞/mL)，使用Neon转染系统(Life technologies)转染B细胞。经典地，进行两种转染以获得足以进行活性测定的活细胞。
细胞活力测定。B细胞和T细胞活力使用台盼蓝排除法进行测量。细胞在保证最小基础凋亡的融合状态(最多2×106个细胞/mL)下生长。在与NMT抑制剂一起孵育后，将大约20 000个细胞(10μl)与10μl的TC 10TM台盼蓝染料(Biorad)一起孵育15分钟。使用TC 10TM自动细胞计数器(Biorad)定量细胞活力。
体外NMT活性测定。N-豆蔻酰基转移酶活性测定程序改自Raju,R.V.,and Sharma,R.K.(1999)Preparation and assay of myristoyl-CoA:protein N-myristoyltransferase.Methods Mol Biol 116,193-211。如先前由Towler,D.,andGlaser,L.(1986)Protein fatty acid acylation:enzymatic synthesis of an N-myristoylglycyl peptide.Proc Natl Acad Sci U S A 83,2812-2816所描述的，为每一次实验新鲜合成[3H]豆蔻酰-CoA。简单地说，将细胞重悬在0.25M的蔗糖缓冲液(50mMNaH2P04,pH 7.4)中，并使其在布兰森超声波发生器(Branson Sonicator)上经历2个循环6.0级的超声。反应混合物由在NMT活性缓冲液(0.26M Tris-HCl、3.25mM EGTA、2.92mMEDTA和29.25mM 2-巯基乙醇、1％Triton X-100,pH 7.4)中孵育的10μl细胞提取物(约20μg的蛋白)和与截短的Bid的N末端序列一致的可豆蔻酰化或不可豆蔻酰化的十肽(0.1mM溶于水中)组成。反应通过加入7.4μl(≈10pMol)新鲜合成的[3H]豆蔻酰-CoA(最终的混合物体积＝25μl)而起始，并在30℃孵育15min。所述反应通过将15μl反应混合物点在P81磷酸纤维素纸盘(Whatman,Kent,UK)上并干燥30秒而停止。洗涤纸盘(洗涤缓冲液：25mM Tris缓冲液，pH 7.4)以去除残余的放射性([3H]-豆蔻酸和[3H]-豆蔻酰-CoA)而将[3H]-豆蔻酰-肽留在了所述磷酸纤维素纸上。通过液体闪烁计数定量放射性并将其转换为pMol的豆蔻酰肽(Raju,R.V.,and Sharma,R.K.(1999)Preparation and assay of myristoyl-CoA:protein N-myristoyltransferase.Methods Mol Biol 116,193-211)。
RT-PCR。使用18S探针作为内部对照，用Taqman NMTl和NMT2探针进行qRT-PCR。循环次数的差异(Δct)通过从NMT循环次数(在再一次看到信号指数增长的点)减去我们看到各种细胞类型的18S内部对照表达呈指数增长的循环次数(ct)来计算。
通过定点诱变产生V5-NMT中胱天蛋白酶剪切位点的突变
通过定点诱变产生通过Edman降解测序(Alphalyse)鉴定的NMT1和NMT2的胱天蛋白酶剪切位点的突变。因此，使用此前克隆的V5-NMT1和V5-NMT2gateway载体来突变经鉴定的胱天蛋白酶剪切位点。因此，使用定点诱变试剂盒(AgilentTechnologies)依据其操作说明产生V5-NMT1的Asp-72残基和V5-NMT2的Asp-25、Asp-67残基和Asp-25,67二者(双突变)。
简言之，使用5到50ng dsDNA(载体)、5μL 10×反应缓冲液、溶解于不含核酸酶的水中的125ng引物，加入不含核酸酶的水至最终的反应体积为50μL，进行定点诱变。反应起始前将2.5U的PfuTurbo DNA聚合酶(Agilent Technologies)加入混合物中，在EppendorfMastercycler 1thermocycler中进行18个循环的反应。随后，每个反应中加入10U的Dpn I限制性酶并在37℃孵育1h以消化亲本dsDNA。此外，使用PrimerX程序(http://www.bioinformatics.org/primerx/)设计定点诱变的引物(见表2.6)。重要地，胱天蛋白酶剪切位点的天冬氨酸(D)残基突变为谷氨酸(E)残基，产生以下载体：V5-NMT1(D72E)、V5-NMT2(D25E)、V5-NMT2(D67E)和V5-NMT2(D25,67E)。通过自动化DNA测序(Eurofins MWGOperon)验证所述突变。
产生His-标记的胱天蛋白酶剪切的、截短的NMT载体
通过分子克隆产生以下胱天蛋白酶剪切的、截短的NMT：His-73NMT1、His-26NMT2和His-68NMT2。将所述截短的DNA序列克隆进入pET-19b载体中，其具有N-末端6×组氨酸(His)标签序列。
此前克隆的gateway载体GFP-NMT1和GFP-NMT2用作所述PCR反应的模板。使用Platinum DNA聚合酶(Life Technologies)进行PCR反应，并依据制作商的操作手册设定PCR反应。每个PCR反应按如下制备：200ng DNA模板、5μL 10×Pfx扩增缓冲液、5μL10×PCR增强溶液、1mM MgSO4、0.3mM dNTP混合物、正向和反向引物各0.5μM(见表2.6)、1UPlatinum /> DNA聚合酶和不含核酸酶的水补足至50μL。在Eppendorf Mastercycler1Thermocycler中依据Platinum /> DNA聚合酶试剂盒的操作手册进行30个循环的反应。
抑制胱天蛋白酶
诱导细胞凋亡之前1小时，使用从EMD Chemicals购买的10μM既定的胱天蛋白酶抑制剂预处理细胞。所用的胱天蛋白酶抑制剂是通用胱天蛋白酶抑制剂(z-VAD-FMK)、胱天蛋白酶-3(z-DEVD-FMK)、胱天蛋白酶-8(z-IETD-FMK)、胱天蛋白酶-9(z-LEHD-FMK)和负对照(z-FA-FMK)。对照细胞用DMSO(1:1000)处理。
使用MG-132处理细胞
将IM9、KMH2、BL2和拉莫斯细胞铺板(3×106个细胞于6孔盘中的每孔)并用10μMMG-132处理5小时。对照样品中加入等量的DMSO。然后将细胞裂解，并进行SDS-PAGE/Western印迹分析。
使用辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)处理细胞
将IM9、BL2和拉莫斯细胞以3×106个细胞每孔铺板于6孔盘中并用1μM辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)处理24小时，SAHA是I类和II类组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)的可逆抑制剂。等量的DMSO加入细胞中作为对照。将细胞裂解，并进行SDS-PAGE/Western印迹分析。
细胞凋亡诱导
150ng/mL或300ng/mL小鼠抗Fas抗体用于通过外源性途径激发细胞凋亡，并且2.5μM十字孢碱(STS)用于通过内源性途径激发细胞凋亡。如所示，环己酰亚胺(5μg/mL)用于抑制蛋白翻译并进一步促进细胞死亡。
使用NMT抑制剂，2-羟基豆蔻酸(HMA)处理细胞
加入到细胞之前将HMA皂化并共轭到牛血清白蛋白(BSA)以利于其吸收，如前所示(Yap et al.,2010)。简言之，将HMA与20％摩尔过量的氢氧化钾(KOH)在65℃孵育15min。之后，通过将所述KOH皂化的HMA在含20％无脂肪酸BSA的无血清RPMI介质中37℃溶解，然后在37℃继续孵育15min形成20×溶液。由于豆蔻酸钠用作对照，也在将其加入细胞前在含20％无脂肪酸BSA的无血清RPMI介质中37℃孵育。其后，将Jurkat T细胞(1×107个细胞)与共轭到无脂肪酸BSA的1mM HMA或1mM豆蔻酸钠(在细胞培养物中的终浓度为1％)在RPMI介质(不含FBS、添加物或抗生素)中37℃孵育1h。孵育后，使用抗Fas(150ng/mL)或STS(2.5μM)与环己酰亚胺(5μg/mL)或者单独赋形剂(DMSO)处理诱导细胞凋亡。8h周期内每2h收集样品，用冷的PBS洗涤并用0.3mL 1％十二烷基硫酸钠(SDS)放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液裂解，使用Branson Sonifier超声仪以5.5-6.5输出进行2个15秒循环的超声，循环之间置于冰上2min。
使用NMT抑制剂，Tris DBA处理淋巴细胞系
将2×106个细胞(CEM、L0、BL2和拉莫斯)置于6孔板中生长，并与逐渐增加量(0、1、2和5μg/ml)的三(二亚苄基丙酮)二钯(Tris-DBA)孵育(Bhandarkar et al.,2008)。通过台盼蓝排除法测量Tris DBA处理细胞的活力(Hudson,1976)。
使用NMT抑制剂，DDD85646和DDD73226处理淋巴细胞系
将1×105个细胞[KMH2(霍奇金淋巴瘤)、IM9(“正常”EBV永生化的B细胞)、BL2、拉莫斯](100μL/孔)接种于96孔板中，并用增加量的基于吡唑磺胺的NMT抑制剂DDD85646[分子量(MW)495.43](Frearson et al.,2010)和效力较弱的基于吡唑磺胺的类似物DDD73228(MW＝362.5)处理24、48和72小时。所述药物溶解于DMSO中制成每种测试浓度的100×储存液，以使得每个孔中的DMSO终体积为1％。通过台盼蓝排除法测量所述抑制剂处理细胞的活力(Hudson,1976)。
使用NMT抑制剂，DDD86481处理淋巴细胞系
将1×105个细胞[KMH2(霍奇金淋巴瘤)、IM9(“正常”EBV永生化的B细胞)、BL2、拉莫斯](100μL/孔)接种于96孔板中，并用增加量的基于吡唑磺胺的NMT抑制剂DDD86481[MW610.5]处理。所述药物溶解于DMSO中制成每种测试浓度的100×储存液，以使得每个孔中的DMSO终体积为1％。MTS[(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)]测定用于测量所述药物的细胞毒性(Cory et al.,1991)。
细胞裂解
典型地，将细胞用冷PBS洗涤、收获、在添加了1×完全蛋白酶抑制剂的0.1％SDS-RIPA缓冲液或0.1％SDS-RIPA-HEPES缓冲液(当用炔脂肪酸标记细胞时)中裂解。将细胞悬液在4℃摇动15min。然后将细胞裂解物在4℃、16,000g离心10min，并收集核后上清。使用PierceTM二辛可宁酸(BCA)蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)测定蛋白浓度。
淋巴瘤组织样品的裂解
人弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡性淋巴瘤(FL)组织由Raymond Lai博士(Cross Cancer Institute,Alberta,Canada)惠赠。将冷冻肿瘤组织切成小片(～1mm3)并与1％SDS-RIPA和1×完全蛋白酶抑制剂混合。使用小的杜恩斯匀浆器将样品匀浆，然后重复超声2min、间隔为1min(置于冰上)、输出为6.0(Branson Sonifier 450)直至肿瘤组织溶入裂解缓冲液中。然后将样品在4℃、16,000g离心10min，并收集核后上清用于Western印迹分析。
使用Odyssey扫描仪进行Western印迹
该方法仅用于剪切的胱天蛋白酶-3的印迹，所有其他的Western印迹都使用标准步骤进行。电泳后，将凝胶转移到硝酸纤维素膜上并在含5％NFM的含0.1％Tween 20的PBS(PBS-T)中封闭1小时。一抗(兔抗-剪切的胱天蛋白酶-3；Cell Signaling)也在含5％NFM的PBS-T中以1:2000稀释，加入膜并孵育24小时。然后，将膜洗涤6次，每次5min；PBS洗涤2次，PBS-T洗涤2次，最后用PBS洗涤2次。将二抗(Alex Fluor 680山羊抗兔；LifeTechnologies)用PBS-T稀释(1:5000)后加入，用铝箔覆盖所述印迹并与二抗孵育1小时，然后使用PBS和PBS-T按如上步骤进行6次洗涤。使用LI-COR Inc.公司的荧光成像系统扫描印迹，扫描分辨率为84μm(强度：5至7)在700频道(用于兔)。
亚细胞分级
使HeLa细胞在150mm盘中生长至融合，并使用抗Fas(300ng/mL)(外源性)或STS(内源性)处理5h诱导细胞凋亡。然后使用炔-C14将细胞代谢性标记(以下详述)(Yap et al.,2010)，并进行低渗裂解。
简言之，将细胞用冷PBS缓冲液洗涤，使用细胞铲刮离平板并收集。然后将样品以2000g离心5min，将上清吸走并用600μL低渗缓冲液重悬细胞使细胞吸胀(Mg重悬缓冲液)，并在冰上孵育20min。将细胞悬液转移到杜恩斯匀浆器中并使用紧杵匀浆45次(stroke)。其后，将400μL不含EDTA的2.5×匀浆缓冲液(HB)加入匀浆物中，并使用松杵在杜恩斯匀浆器中将细胞匀浆15次。然后将匀浆物1000g离心5min，并收集核后上清(PNS)。然后，将200μLPNS保存并将剩余部分(～750μL)在Beckman TLA120.2转子中100,000g离心45min，得到细胞质部分(S100)和轻的膜沉淀(P100)。
使用1×HB洗涤P100沉淀1次，并使用1×HB将P100部分的体积调整到同源的S100部分的体积。其后，将所得的核后上清部分(PNS)、细胞质部分(S100)和膜部分(P100)调整到含1％SDS。其后，相同的部分体积用于Western印迹分析，并使用Image J软件定量(http://rsbweb.nih.gov/ij/)。
使用生物正交的ω-炔基豆蔻酸和点击化学代谢标记细胞
使用ω-炔基豆蔻酸代谢标记细胞
收获细胞前使用100到25μMω-炔基豆蔻酸标记细胞30min，并在0.1％SDS-RIPA-HEPES缓冲液中裂解。使用点击化学使细胞裂解物中的蛋白(50-30μg)与100μM叠氮基-生物素反应，如前述方法进行(Yap et al.,2010)。简言之，标记前1h将细胞在添加5％葡聚糖包被的炭处理的FBS(DCC-FBS)的介质(RPMI或DMEM)中孵育使其缺乏脂肪酸。然后，将ω-炔基豆蔻酸溶解于DMSO中产生25或100mM储存液。典型地，细胞对ω-炔基豆蔻酸的吸收通常会通过皂化并共轭至BSA而改善。因此，标记之前，将ω-炔基豆蔻酸与20％摩尔过量的氢氧化钾(KOH)在65℃孵育15min进行皂化。然后，在37℃将含20％无脂肪酸BSA的无血清培养介质(经预热的)加入所述皂化的ω-炔基豆蔻酸中并在37℃继续孵育15min。
其后，将缺乏脂肪酸的细胞使用温的PBS洗涤1次并在不含任何添加物的新鲜RPMI或DMEM中孵育。然后，将适当体积无血清介质中的20×脂肪酸-BSA共轭物加入细胞中，确保BSA的终浓度为1％并且各实验中ω-炔基豆蔻酸是指示的浓度(25μM或100μM)。DMSO或共轭到BSA的未标记的脂肪酸用作实验的对照。收获前，在5％CO2增湿孵育器中37℃使用ω-炔基豆蔻酸将细胞标记30min。将细胞收获至添加1×完全蛋白酶抑制剂的0.1％SDS-RIPA-HEPES缓冲液(不含EDTA)中。
点击化学
使用ω-炔基豆蔻酸标记细胞后，使用叠氮基-生物素将所得的裂解物进行点击化学以确保通过ECL检测豆蔻酰化蛋白，如前所述(Yap et al.,2010)。典型地，将细胞裂解物(30–50μg蛋白)调整到含1％SDS，并在黑暗下与100μM三(苄三唑甲基)胺(TBTA)、1mMCuSO4、1mM三羧乙基膦(TCEP)和100μM叠氮基-生物素在37℃孵育30min，以进行点击反应。然后，加入10倍体积冰冷的丙酮以终止所述点击反应并在-20℃将蛋白沉淀过夜。然后，将所述丙酮沉淀的蛋白在16,000g离心10min，重悬于含20mM DTT的1×SDS-PAGE样品缓冲液中。然后将样品加热至95℃5min用于SDS-PAGE，并转移到PVDF膜上用于Western印迹分析。
用中性Tris-HCl或KOH处理PVDF膜
将蛋白样品点样至2个重复的SDS-PAGE胶上进行实验，其中PVDF膜用KOH或中性Tris-HCl处理。电泳后，KOH处理的PVDF膜在100ml含0.1N KOH的甲醇[1N KOH水溶液:甲醇1:9(v/v)]中、另外的在含0.1N Tris-HCl pH 7.0的甲醇[1N Tris-HCl,pH 7.0:甲醇1:9(v/v)]中室温下轻轻摇动孵育45min。其后，使用PBS彻底地洗涤处理的膜，使用Streptavidin-HRP或Neutravidin-HRP探测并使用ECL检测。
在细胞经历凋亡中进行放射性NMT活性测定
通过调整Sharma实验室发明的方法(King and Sharma,1991；Raju and Sharma,1999)测量NMT活性。新鲜制备并合成[3H]-豆蔻酰-CoA储存液，如上所述(Towler andGlaser,1986)。为制备200μL[3H]-豆蔻酰-CoA储存液，将97μL豆蔻酰-CoA产生缓冲液与20L50mM ATP、10L 20mM LiCoA、60μL假单胞菌酰基-CoA合成酶和13μL[9,10–3H]-豆蔻酸组合。将所述溶液轻柔地混合并在37℃孵育30min。
为该测定，将编码V5-NMT1和V5-NMT2的质粒瞬时转染的COS-7细胞使用STS(2.5μM)和环己酰亚胺(5μg/ml)诱导凋亡或不诱导凋亡，并在0、1、2、4和8h时间点收获细胞。使用Branson sonifier 450超声细胞，并将～20μg裂解物(在50mM NaH2PO4 pH 7.4,0.25M蔗糖缓冲液中裂解)用于每个反应。对于每个NMT测定反应，将3.85μL NMT测定缓冲液、1.25μL20％Triton X-100和2.5μL(0.1mM)可豆蔻酰化(BID_G:GNRSSHSRLG)或不可豆蔻酰化(BID_A:ANRSSHSRLG)十肽菌素(购自Peptide 2.0Inc.)相应于ct-Bid的N-末端序列(1mM储存液于乙醇中)加入到微量离心管中并保存于冰上至反应起始。反应起始时，将7.4μL(10pMol)新合成的[3H]豆蔻酰-CoA以15秒间隔加入含NMT测定混合物的每个微量离心管中，并将25μL反应物在30℃孵育15min。将15μL反应混合物以15秒间隔滴到P81磷酸纤维素纸盘(Whatman)上终止反应，并用电吹风吹干30秒。
然后，将所述p81磷酸纤维素纸盘转至洗涤单元使用NMT测定洗涤缓冲液洗涤3次，每次30min，共90min。其后，将留在磷酸纤维素上的放射性(其对应于豆蔻酰化的肽)在5mL液态闪烁混合物中使用Beckman Coulter LS6500闪烁计数器定量。将NMT活性计为fmol/min/μg蛋白。
通过放射性测定检测经纯化的His-标记的NMT中的NMT活性
使用与上述相同的方法测量全长和截短的His-标记的NMT的NMT活性。但是，该测定中只使用1μg纯化的蛋白(使用NMT测定缓冲液将体积扩大至10μL)。
体外NMT剪切测定
体外NMT剪切测定是通过将10g纯化的His-NMT1和His-NMT2与1μg重组人活性胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-8在胱天蛋白酶剪切测定缓冲液中在100μL反应体系中37℃孵育1小时进行的。加入10μM通用胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-FMK终止反应，随后加入5×样品上样缓冲液。将反应的样品在10％SDS-PAGE胶上分离并转移至PVDF膜上。条带用考马斯亮蓝显色，将剪切的片段从膜上分离并送至Palo Alto,CA的Alphalyse进行Edman降解。
重组His-NMT的蛋白纯化
依据制造商的操作说明，用His-NMT1和His-NMT2载体转化Lemo21(DE3)pLysS感受态细胞(New England Biolabs)。NMT1和NMT2蛋白按如下方式制备：3mL起始培养物在LB培养液(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素)中37℃225rpm摇动生长4h。将全部培养物接种到50mL培养基中，在37℃生长16h。然后，6000×g室温离心10min使所述细菌细胞沉淀。将细菌沉淀重悬于10mL LB中，并将5mL重悬液接种到500mL LB中，37℃剧烈(225rpm)摇动至OD600达到0.5-0.6。
然后，加入0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)在30℃剧烈(225rpm)摇动4h诱导蛋白表达。将悬液在4℃6000×g离心20min，并将细菌沉淀冷冻过夜。其后，将解冻的细菌沉淀重悬于25mL添加完全蛋白酶抑制剂(CPI)(购自Roche)的细菌裂解缓冲液中，并在冰上孵育30min。然后将样品超声3次，每次1min间隔1min，输出5.0(Branson Sonfier 450)，37℃孵育30min，然后4℃15,000×g离心1h。
同时，依据制造商的操作说明将Ni-NTA琼脂糖珠(His-Pure Ni-NTA树脂购自Thermo Fisher Scientific)包装至柱中，并用柱缓冲液洗涤3次。然后将由上述离心所得的上清上样至柱中，并在4℃轻轻摇晃孵育1h。然后通过重力流动将样品从柱洗脱，用5mL洗涤缓冲液(含20mM咪唑的柱缓冲液，pH 8.0)将柱洗涤2次。然后，用2×5mL洗脱缓冲液1(含75mM咪唑的柱缓冲液，pH 8.0)洗脱首先的两部分，并用2×5mL洗脱缓冲液2(含150mM咪唑的柱缓冲液，pH 8.0)洗脱接下来的两部分。最后的部分用洗脱缓冲液3(含250mM咪唑的柱缓冲液，pH 8.0)洗脱。最后，-80℃冷冻前将20％甘油加入所收集的每个部分中。从所述蛋白纯化过程的每一步收集样品，在12.5％SDS-PAGE凝胶上进行电泳并用考马斯亮蓝染色以确定哪个(些)部分具有最高的蛋白浓度。
由于来自首先的4次洗脱的样品具有最高的蛋白浓度，将其收集并透析以除去剩余的任何咪唑。因此，将收集的样品上样至截留分子量(MWCO)为12–14kDa的Spectra/Por 2(Spectrum Laboratories)透析管上以移除所有小的降解的蛋白片段。将蛋白样品在4L冷冻的透析缓冲液中在4℃轻轻搅拌下透析2h，然后使用另外4L相同的新鲜、冷冻缓冲液4℃透析过夜。将透析的蛋白样品在MWCO 30kDa的Amicon Ultra-15离心过滤机(Millipore)中4℃5,000g离心浓缩直至达到需要的体积。
B细胞淋巴瘤细胞系的qRT-PCR
依据制造商的操作说明，使用试剂提取IM9、KMH2、拉莫斯和BL2细胞中的RNA。然后，依据制造商的操作说明，使用购自Applied Biosciences的带有随机引物设计的高容量cDNA反转录试剂盒由分离的RNA合成cDNA。依据供应商的指导，使用购自LifeTechnologies(Carlsbad,CA)的/> Universal Master Mix II和NMT1、NMT2及18探针进行定量实时PCR(qRT PCR)反应，每个反应设置3次重复。使用 ep realplex热循环仪(Eppendorf)进行qRT PCR，使用Realplex软件(Eppendorf)分析结果。
台盼蓝排除测定
将细胞与TC10TM台盼蓝燃料(Biorad)孵育测定Tris DBA、DDD73228和DDD85646处理的细胞的活力(Hudson,1976)。然后使用TC10TM自动化细胞计数器(Biorad)定量细胞活力。
MTS[(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)]测定
依据制造商的操作说明，使用Promega的CellTiter 96Aqueous非放射性细胞增殖测定(MTS)(Cory et al.,1991)检测DDD86481处理的细胞的活力。
免疫组织化学
将B细胞淋巴瘤在福尔马林中固定并包埋至石蜡中，用切片机切至适当的厚度(～5微米或μm)并附着至 plus正电荷玻片(Fisher Scientific)。染色前，将带有肿瘤组织的玻片脱蜡，通过浸入二甲苯中3次，每次10分钟，在乙醇中一系列洗涤[100％乙醇中浸20下(重复4次)，80％乙醇中浸20下，50％乙醇中浸20下]，最后在流动的冷水中洗涤10min。
为抗原恢复，将玻片放在玻片架中，并置于微波加压蒸煮器中，并加入800mL 10mM pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液。将所述加压蒸煮器紧闭，置于微波炉中并大火微波20min。然后，将玻片用冷的流水洗涤10min。将玻片浸入含3％H2O2的甲醇中10min进行过氧化物酶封闭，并用温的流水洗涤10min，然后用PBS洗涤3min。
然后，去除过量的PBS并在样品周围用PAP笔(Sigma-Aldrich)划出忌水区。用Dako抗体稀释缓冲液(Dako,Agilent Technologies)以1:50稀释兔抗-NMT1(Proteintech)或兔抗-NMT2(Origene)并使用巴斯德移液器加入(每玻片～400L)，并在湿度箱中4℃孵育过夜。其后，将玻片用PBS洗涤2次，每次5min，并将～4滴DAKO EnVision+System-HRP标记的聚合物(抗兔)(Dako,Agilent Technologies)加到每个玻片，室温孵育30min。将玻片再用PBS洗涤2次，每次5min，并加入4滴液态DAB(二氨基联苯胺)+发色底物(依据制造商的操作说明制备；Dako,Agilent Technologies)，显色5min并用流动的冷水漂洗10min。
然后将玻片浸入1％CuSO4中5min，使用流动的冷水短暂漂洗，用苏木精复染60秒，并用流动的冷水漂洗直至水清澈。然后，将玻片浸入碳酸锂中3次，并用流动的自来水短暂漂洗。然后，通过系列步骤将玻片脱水：50％乙醇中浸20下、80％乙醇中浸20下、100％乙醇中浸20下(重复4次)，最后在二甲苯中脱水(3次，每次10min)。然后将玻片盖上盖玻片，并使用Nikon eclipse 80i显微镜进行所述肿瘤样品的显微检测。使用QImaging科学相机(Qimaging)形成图像。
实施例1
图1描绘了在正常细胞和多种B细胞淋巴瘤和T细胞白血病中的NMT1和NMT2表达的分析。该图显示了B淋巴瘤细胞系(BL-2,Ramos)中NMT2表达几乎完全不存在，与正常B细胞(EBV转化的人B淋巴细胞，L0)和人白血病T细胞系(Jurkat,MOLT-4,CEM)相比，所述B淋巴瘤细胞系(BL-2,Ramos)仅表达NMT1。
尽管不希望被理论所束缚，仍认为仅表达一种NMT同工酶的那些细胞，例如显示NMT2几乎完全不存在的伯基特淋巴瘤细胞，有可能具有改变了的豆蔻酰化蛋白模式。
样品中有减少量的豆蔻酰化蛋白(可选地相对于对照)的样品指示NMT缺陷样品或者NMT缺陷癌症。这种NMT缺陷的癌症适合于用NMT1的抑制剂进行治疗。
实施例2
图2描绘了多种B细胞淋巴瘤和T细胞白血病对NMT抑制剂三(二亚苄基丙酮)二钯(Tris-DBA)的敏感性。多种B细胞和T细胞与越来越高浓度的Tris DBA孵育24h。使用台盼蓝排除法测量细胞活力并将对照的细胞活力调整至100％。通过台盼蓝排除法测量的细胞生存曲线显示，B细胞淋巴瘤对于所述NMT抑制剂三(二亚苄基丙酮)二钯(Tris-DBA)更敏感。
实施例3
图3描绘了通过三(二亚苄基丙酮)二钯(Tris-DBA)的N-豆蔻酰基转移酶(NMT)的抑制。
NMT活性使用用纯化的重组NMT1和NMT2的肽豆蔻酰化测定进行测定。NMT活性由在磷酸纤维素纸上产生和检测的放射性标记的豆蔻酰化肽的量计算出(改自King etal.1991,Anal Biochem.)。
该图显示，使用纯化的重组NMT酶，三(二亚苄基丙酮)二钯(Tris-DBA)可体外抑制NMT。
实施例4
图4描绘了其中淋巴瘤细胞系用抗NMT 1(图A)和NMT 2(图B)的抗体进行探测的免疫印迹结果。图4的说明对应如下：IM9:B淋巴母细胞；BL2:伯基特淋巴瘤；CEM:T细胞白血病；Karpas 299:T细胞淋巴瘤；Sup-M2:ALCL；UCONN:ALCL(ALCL:间变性大细胞淋巴瘤)；DAUDI:伯基特淋巴瘤；Ramos:伯基特淋巴瘤BJAB:伯基特淋巴瘤；HD-MYZ:霍奇金淋巴瘤；KM-H2:霍奇金淋巴瘤；L428:霍奇金淋巴瘤；Jurkat:T细胞白血病。
实施例5
图5描绘了与永生化的正常B淋巴细胞系(IM9)相比，在不同的浓度，在48小时后，NMT抑制剂对伯基特淋巴瘤细胞系拉莫斯的效力。
实施例6
在该实施例中，用pcDNA3.1-V5-NMT2转染的拉莫斯B淋巴瘤细胞(其如本文所示，表达NMT1)使得对TrisDBA(5ug/ml)的存活率相对于用空的质粒载体转染的对照细胞增加了2.5倍。在图6中，使用Neon转染系统(Invitrogen)，按照对于拉莫斯细胞系所推荐的程序(1,350Volt,30ms)，将20×106个拉莫斯B淋巴瘤细胞用32μg的DNA(pcDNA3.1-V5-空白或pcDNA3.1-V5-NMT2)进行转染。将转染细胞在1200rpm离心5分钟以去除死细胞和细胞碎片。允许上清液中的细胞在完全RPMI中恢复6小时。PBS洗涤后，细胞重悬并在含TrisDBA(5ug/ml)的RPMI中生长24小时，然后使用所述台盼蓝排除法进行计数(图A)。将细胞裂解并用抗NMT2的抗体以及作为上样对照的GAPDH的抗体进行蛋白免疫印迹(ECL)以证实表达NMT2(图组B)。
实施例7
在该实施例中，使用18S探针作为内部对照，用Taqman NMT1和NMT2探针进行qRT-PCR。循环次数的差异(Δct)通过从NMT循环次数(在再一次看到信号指数增长的点)减去我们看到各种细胞类型的18S内部对照表达呈指数增长的循环次数(ct)计算出。如下文的表1所示，在B淋巴瘤细胞系中NMT2表达与NMT1表达的比值下降(多达60倍)。尽管不希望被理论所束缚，仍认为这些结果可表明，编码NMT2的mRNA的减少可能是由蛋白免疫印迹所评估的NMT2蛋白水平下降的原因。
表1通过qRT-PCR分析NMT mRNA表达
实施例8
本实施例中，图7中，示出了多种淋巴细胞系和实体淋巴瘤中NMT2蛋白水平的差异。(A)通过Western印迹评价多种类型的人实体淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡性淋巴瘤(FL))肿瘤裂解物中的NMT1和NMT2水平。所示两幅图中使用相同的抗体浓度：兔抗-NMT1(1:2500)、鼠单克隆抗-NMT2(1:2500)通过Western印迹检测NMT。结果显示，每种类型的多个肿瘤样品属于平均NMT2表达水平(0.392+/_0.30)。
图A中，示出了伯基特淋巴瘤细胞系BL-2、Daudi、Ramos和BJAB缺乏NMT2。
图B中，示出了5种DLBCL中的4种和6种FL中的1种人肿瘤裂解物的NMT2显著减少。
实施例9
本实施例中，图8的图A和图B中，通过免疫组织化学法测定了多种实体淋巴瘤中NMT2蛋白水平的差异。
将B细胞淋巴瘤在福尔马林中固定并包埋至石蜡中，用切片机切至适当的厚度(～5微米或μm)并附着至 plus正电荷玻片(Fisher Scientific)。染色前，将带有肿瘤组织的玻片脱蜡，通过浸入二甲苯中3次，每次10分钟，在乙醇中一系列洗涤[100％乙醇中浸20下(重复4次)，80％乙醇中浸20下，50％乙醇中浸20下]，最后在流动的冷水中洗涤10min。
为抗原恢复，将玻片放在玻片架中，并置于微波加压蒸煮器中，并加入800mL 10mM pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液。将所述加压蒸煮器紧闭，置于微波炉中并大火微波20min。然后，将玻片用冷的流水洗涤10min。将玻片浸入含3％H2O2的甲醇中10min进行过氧化物酶封闭，并用温的流水洗涤10min，然后用PBS洗涤3min。
然后，去除过量的PBS并在样品周围用PAP笔(Sigma-Aldrich)划出忌水区。用Dako抗体稀释缓冲液(Dako,Agilent Technologies)以1:50稀释兔抗-NMT1(Proteintech)或兔抗-NMT2(Origene)并使用巴斯德移液器加入(每玻片～400μL)，并在湿度箱中4℃孵育过夜。其后，将玻片用PBS洗涤2次，每次5min，并将～4滴DAKO EnVision+System-HRP标记的聚合物(抗兔)(Dako,Agilent Technologies)加到每个玻片，室温孵育30min。将玻片再用PBS洗涤2次，每次5min，并加入4滴液态DAB(二氨基联苯胺)+发色底物(依据制造商的操作说明制备；Dako,Agilent Technologies)，显色5min并用流动的冷水漂洗10min。
然后将玻片浸入1％CuSO4中5min，使用流动的冷水短暂漂洗，用苏木精复染60秒，并用流动的冷水漂洗直至水清澈。然后，将玻片浸入碳酸锂中3次，并用流动的自来水短暂漂洗。然后，通过系列步骤将玻片脱水：50％乙醇中浸20下、80％乙醇中浸20下、100％乙醇中浸20下(重复4次)，最后在二甲苯中脱水(3次，每次10min)。然后将玻片盖上盖玻片，并使用Nikon eclipse 80i显微镜进行所述肿瘤样品的显微检测。使用QImaging科学相机(Qimaging)形成图像。
NMT免疫组织化学染色正常淋巴结、伯基特淋巴瘤(BL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL或LCL)。A)NMT1染色：两个正常淋巴结和未处理的伯基特淋巴瘤(BL1-3)和DLBCL(LCL1-3)的3个独立案例的每一个都均一地、强阳性地(过氧化物酶反应产物为褐色[以深灰色表示])染色NMT1蛋白。没有发现差异。阴性对照是通过省略一抗产生的。上排：N1、N2正常淋巴结，Neg阴性对照。中排：3个伯基特淋巴瘤(BL1-3)案例。下排：3个DLBCL(LCL1-3)案例。两个正常淋巴结和淋巴瘤都显示出强染色。B)NMT2染色：两个正常淋巴结都均一地、强阳性地(褐色，以深灰色表示)染色NMT2蛋白。显著相反地，未处理的伯基特淋巴瘤和DLBCL的3个独立案例仅非常弱地染色NMT2(以浅蓝或浅灰色显示)。阴性对照是通过省略一抗产生的。上排：N1、N2正常淋巴结，Neg阴性对照。中排：3个伯基特淋巴瘤(BL1-3)案例。下排：3个DLBCL(LCL1-3)案例。
图8的图C和图D示出了在缺乏NMT2表达的细胞系中NMT1表达未显著增加。图C中，绘制了CCLE数据库所有细胞系中NMT1和NMT2的log2(微阵列荧光强度NMT)。在图D中，绘制了CCLE数据库中具有最低NMT2表达水平的100个细胞系中NMT1和NMT2的log2(微阵列荧光强度NMT)。
图8中图E描绘了一个实例，其中NMT2测定是使用光学显微镜计算机辅助光密度法定量的。可视地，这些数值与恶性淋巴细胞的染色强度很好地相关。截点选择强对无/弱染色。
实施例10
本实施例中，图9中，示出了使用DDD85646处理多种B淋巴细胞系72小时剩余的活力(图9A)。图9A中的曲线是依据Leatherbarrow,R.J.(2009)GraFit Version 6,ErithacusSoftware Ltd.,Horley,U.K.中所述用于GraFit测定的4参数等式绘制，使用如下等式：
其中，范围(Range)是拟合的未抑制的值减去背景(Background)，s是坡度因子。所述等式假定y随x的增加而降低。A和B。组合的绘图(n＝4)。
图9中，图A，增加浓度的DDD85646用于处理BL细胞系(BL-2和Ramos)以及相关的对照[表达两种NMT的IM9(“正常”B淋巴细胞)和KMH2(HL细胞系)]。台盼蓝测定用于测量DDD85646处理24、48和72小时的细胞毒性。虽然在第24h和48h收集数据(数据未显示)，然而仍观测到DDD85646的最显著效应出现在72h时间点。
所用的B淋巴瘤细胞系中存活率的下降(Ramos:DDD85646 EC50＝0.37+/-0.05μM和BL2:DDD85646 EC50＝0.43+/-0.2μM)具有DDD85646浓度依赖的方式。对照细胞系IM-9(DDD85646 EC50＝7.08+/-2.32μM)和KMH2(DDD85646EC50＝29.6+/-10.6μM)的存活率较高。EC50数据总结如下。
表2
DDD85646在BL细胞中显示出低EC50(杀伤50％癌细胞的浓度)，在HL(KMH2)细胞中显示出高EC50。因此，DDD85646显示出高选择性的癌细胞杀伤指数。本文中，将选择性杀伤指数定义为“正常”永生化的B细胞的EC50/恶性细胞EC50的比值。DDD85646对于BL-2和Ramos的选择性杀伤指数分别为16.4和19.1。
图9中，图B，将DDD86481用于处理BL细胞和对照细胞系[可表达2种NMT的IM9(“正常”B淋巴细胞)和KMH2(HL细胞系)]。第48h和72h，通过MTS测定检测细胞活力，虽然第48h的细胞活力未发现显著改变(数据未示出)，但是我们发现第72h时间点测试的BL细胞系的存活率显著下降(Ramos:DDD86481 EC50＝42nM和BL2:DDD86481 EC50＝58nM)，以DDD86481浓度依赖方式。对照细胞系IM-9(DDD86481 EC50＝2.2μM)和KMH2(DDD86481EC50＝12.6μM)的存活率较高。经计算得出，DDD86481对BL-2和Ramos细胞的选择性杀伤指数分别为37.9和52.3。EC50数据总结如下。
表3
下表中，示出了细胞类型说明及DDD85646和DDD864841的EC50，只表达1种NMT(NMT1)的B淋巴瘤细胞(BL-2和Ramos)对DDD85646或DDD86481的敏感度超过可表达2种NMT的永生化的“正常”B细胞或非霍奇金淋巴瘤细胞系的敏感度～15-72倍。
表4
下表提供了DDD86481在伯基特淋巴瘤细胞系(BL-2和Ramos)和“正常”永生化的B细胞中的药理学EC50和EC90数据总结(数据由图9B计算得出)。
选择性指数显示EC50和EC90的比率，显示出DDD86481优选杀伤癌细胞，其因子>300倍(由于杀伤正常B细胞系所需的浓度高很多)。
表5
图9C中，将DDD73226用于处理BL细胞系(BL-2和Ramos)和相关对照[可表达2种NMT的IM9(“正常”B淋巴细胞)和KMH2(HL细胞系)]。通过台盼蓝排除测定检测第72h的DDD73226细胞毒性。第24和48h，未发现细胞活力的显著改变(数据未示出)。同样地，当细胞用DDD73226以高达100μM浓度处理时在72h时间点IM9、KMH2和Ramos细胞的活力也没有显著改变。但是，用100μM DDD73226处理BL2细胞时在72h时间点检测到细胞活力与其他细胞相比略微降低。尽管不希望被理论所束缚，仍认为这可能是因为除NMT2水平显著下降以外，与Ramos和其他细胞系相比BL2还具有较低的NMT1水平，因此对于甚至更低效的NMT抑制剂活性都可能更敏感。
图9D(图i和ii)中，示出了时间进程实验，其中将IM-9和BL2细胞用DDD86481(0、1和10μM)处理0、1或4h后使用100μMω-炔基豆蔻酸标记1h。蛋白样品通过点击化学与叠氮基-生物素反应，并通过使用NeutrAvidinTM-HRP进行Western印迹来显示。DDD86481的抑制作用是快速的，使用1μM DDD86481处理1小时后细胞(IM-9和BL2)中的豆蔻酰化几乎完全抑制。
图9E中，确定了抑制IM-9、BL2和Ramos细胞系中豆蔻酰化所需DDD86481的最小剂量。将细胞用0、10、50、100、500和1000nM的DDD86481处理2h，处理的最后1h用炔基豆蔻酸进行代谢细胞标记。DDD86481在所测试的细胞中可以浓度依赖方式抑制豆蔻酰化。BL-2和Ramos细胞系对DDD86481的抑制活性更敏感，因为在2种BL细胞系中炔基豆蔻酸标记掺入豆蔻酰化蛋白从50nM起开始显著下降，而IM-9掺入炔基豆蔻酸标记从100nM浓度开始下降。
表6示出了DDD85646或DDD86481的初步临床前特征
实施例11
本实施例中，图10中，示出了多种永生化的正常L0 B淋巴细胞(从Calgary的Riabowol博士处获得)、恶性B淋巴瘤细胞(Ramos和BL2)以及T细胞白血病(CEM)对NMT抑制剂TrisDBA的24小时敏感度，(A)使用TrisDBA处理24小时的多种细胞系的剩余活力(n＝9)，(B)与TrisDBA共孵育24h的瞬时表达NMT1或NMT2的COS7细胞中TrisDBA对N-豆蔻酰基转移酶活性的影响。TrisDBA对于NMT1的体外IC50是约2μM和对于NMT2是约5μM。伯基特淋巴瘤细胞系Ramos和BL-2对NMT抑制剂TrisDBA更敏感。
实施例12
本实施例中，图11中，确定了967种癌细胞系百科全书(CCLE)数据库中的NMT表达水平。图A)检测了CCLE数据库中的NMT1和NMT2表达，并将相应的NMT水平绘制曲线。NMT2显示出大范围的表达(～3-11)，与NMT1(～6-9)相比。图B)数种癌症亚型的癌症细胞系的盒形和虚线图，并与所有967癌症细胞系的绘图比较。通过学生T-检验将每组与所有肿瘤进行比较。**表示P值<0.001。图C)检测了CCLE数据库中最低水平表达NMT2的50种细胞系，以表格形式示出。来自多种造血组织和淋巴组织的肿瘤细胞系占最低表达NMT2细胞系的76％(50种细胞系中的38种)，以不同颜色突出显示。
实施例13
本实施例中，图12中，NMT在细胞凋亡过程中被剪切但保留活性。图A和B。将通过抗Fas或十字孢碱诱导细胞凋亡的Jurkat细胞裂解物用抗-NMT1和抗-NMT2通过Western印迹探测，显示出被2种酶时间依赖地剪切。使用抗PAK2和抗GAPDH抗体在相同的样品上进行Western印迹。图C和D。通过抗Fas或十字孢碱诱导细胞凋亡的Jurkat细胞中纳入ω-炔基豆蔻酸显示出由细胞开始死亡引起的豆蔻酰化模式的改变，表明虽然NMT被剪切但其仍具有活性。将Jurkat细胞使用抗FAS(100ng/ml)和环己酰亚胺(5μg/ml)(C)或十字孢碱(2.5μM)和环己酰亚胺(5μg/ml)(D)诱导凋亡后通过25μM-炔基豆蔻酸代谢标记。蛋白样品通过点击化学与叠氮基-生物素反应，并通过使用NeutrAvidinTM-HRP进行Western印迹来显示。通过Western印迹评估标记纳入之前，将膜在0.1M KOH中孵育(B和D)。图(E)在多个指示的时间，使用ct-Bid N-末端十肽菌素和[3H]-豆蔻酰-CoA测定NMT活性。尽管2种NMT酶被剪切后都保留了催化活性，但只有NMT1显示出活性显著下降。(F)体外重构由胱天蛋白酶-8和-3剪切的NMT1及由胱天蛋白酶-3剪切的NMT2(考马斯染色胶)。将纯化的His-NMT1和His-NMT2(每种5μg)与活性胱天蛋白酶3和8(每种500ng)在37℃孵育1小时。孵育结束时，加入通用的胱天蛋白酶抑制剂(z-VAD-fmk)终止反应的继续进行。迅速将样品与含β-巯基乙醇的5×上样缓冲液煮沸，并点样至10％丙烯酰胺凝胶上，以及转移到PVDF膜上。然后使用考马斯亮蓝将膜染色以显示蛋白。将送至Edman降解的剪切的片段封装并可用于鉴定NMT1中D72之后和NMT2中D25和D67之后的胱天蛋白酶剪切位点。
实施例14
本实施例中，图13中，示出了重组GST-标记和His6-标记的hNMT1和hNMT2的纯化。图(A)GST-NMT1和(B)GST-NMT2通过谷胱甘肽琼脂糖纯化，(C)His6-NMT1和(D)His6-NMT2通过Ni-螯合层析和Resource S离子交换层析纯化。图13中，图C和D，泳道如下。图(C)凝胶A:NMT1的纯化:1)所有蓝色标志，2)Ni-NTA柱集合(pool)，3)凝胶过滤集合，4)Resource S的FT,5)组分(f8),6)f16,7)f18,8)f19,9)f20,10)f21,11)f22,12)f41,13)f42,14)f66,15)f67。图(D)凝胶B:NMT2的纯化:1)所有蓝色标志,2)Ni-NTA柱集合,3)凝胶过滤集合,4)Resource S的FT,5)组分(f21),6)f28,7)f38,8)f39,9)f40,10)f41,11)f42,12)f44。
实施例15
本实施例中，图14中，示出了纯化的重组全长His6-NMT1和重组“胱天蛋白酶截短的”ct-His6-NMT1的酶活性比较。全长His6-NMT1(aa 73-496)。NMT活性是通过由King etal.1999,Anal Biochem调整的肽豆蔻酰化测定检测的。实验包括2个重复。
实施例16
本实施例中，图15中，示出了多种NMT抑制剂和不同细胞系的EC50和IC50比较。该图示出了生化酶法测定(IC50)中8种NMT抑制剂的生化效力和他们在使用7种细胞系的阿尔玛蓝细胞活力测定(EC50)中的效力之间的相关性。对每种细胞系进行回归分析，得到R2平均值为0.9(范围0.82-0.96)。多种IC50和EC50之间的高度相关强有力地证明了细胞活力测定中分子的活性是由于其对NMT的抑制能力。需要说明的是，2对分子在生化测定中具有相似的效力。
实施例17
本实施例中，图16中，示出了DDD86481在BL细胞中诱导凋亡。
将“正常”永生化的B淋巴细胞(IM9)、KMH2(霍奇金氏淋巴瘤)和BL(BL2和Ramos)细胞与渐增浓度(nM)的DDD86481孵育，并检测聚ADP-核糖聚合酶-1(PARP-1)和胱天蛋白酶-3在第72h时间点后的剪切。使用细胞裂解物进行Western印迹以检测PARP-1和胱天蛋白酶-3的剪切，以及GAPDH作为上样对照的存在(复合胶)。将BL细胞系用抑制剂处理时，PARP-1和胱天蛋白酶-3的剪切以剂量依赖形式发生，表明这些细胞发生了凋亡。用所述抑制剂处理的“正常”IM9细胞中未发生PARP-1或胱天蛋白酶-3剪切。在KMH2(HL)细胞中发现较高浓度的PARP-1剪切，虽然其相对于在BL细胞中发现的PARP-1剪切是很小的。因此，我们发现，当用DDD86481处理时BL细胞比“正常”B细胞更倾向于发生凋亡。
实施例18
本实施例中，图17中，提供了评估人类肿瘤中NMT2损失的阈值。表7中，NMT2 mRNA的表达水平以log2(微阵列荧光强度NMT2)表示，用于指示可获得的CCLE数据组的细胞系。
表7
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图17中，图A，通过Western印迹探测所示淋巴细胞系中NMT2的存在。图17中，图B，通过比较图A和表7显示，在Toledo细胞中log2(微阵列荧光强度NMT2)＝5.64时，通过Western印迹未检测到NMT2。虽然NMT2表达损失的实际阈值可能高于5.64，但本实施例中使用该数字作为阈值用于确立人类群体中近乎普遍的NMT2损失(图B)。所述数据表明，NMT2损失不仅在伯基特和弥漫性大B细胞淋巴瘤是普遍的，而且在许多其他肿瘤类型中也是普遍的(也可见图11C中所列的表达最少的NMT2的50种细胞系和见表中多种肿瘤类型中普遍的NMT2损失)。
相应地，本发明提供了鉴定适于使用一种或多种NMT1抑制剂治疗的NMT2-缺陷癌症的方法。在一个实例中，患者样品中mRNA水平或浓度低于约阈值，表明所述患者是使用NMT1抑制剂治疗的良好的候选者。在一些实例中，mRNA水平低于约阈值是指低表达。在一个实例中，患者样品中mRNA水平或浓度高于约阈值，表明所述患者是使用NMT1抑制剂治疗的差的候选者。在一些实例中，mRNA水平高于约阈值是指高表达。
应理解，除关于Toledo细胞设置的阈值以外或可替代地，其他来源的也可作为适合的阈值。在一些实例中，可用于获得阈值的来源或对照是与被测试的癌症相同的细胞类型。在一些实例中，所述来源或阈值可储存于数据库中或从其中查到。
实施例19
本实施例中，图18中，示出了使用链霉亲和素琼脂糖珠通过脱硫生物素-PEG-叠氮探针拉下白血病Jurkat T细胞中翻译后的ω-炔基-豆蔻酰化蛋白。
脱硫生物素(I中所示)是可逆地结合到亲和素和亲和素类蛋白的生物素类似物。我们设计并购买了合成的脱硫生物素-PEG-叠氮(I)和生物素-PEG-叠氮(II)。
(B)中，使Jurkat T细胞在存在ω-炔基豆蔻酸的条件下生长，并在存在环己酰亚胺的条件下诱导产生抗Fas介导的细胞凋亡。细胞裂解后，使裂解物与脱硫生物素-PEG-叠氮使用点击化学进行反应或不反应，与中性链亲和素琼脂糖珠混合，使用10mM生物素洗涤并洗脱。图B(i)示出了脱硫生物素化的翻译后豆蔻酰化蛋白可被拉下并从中性链亲和素珠有效地回收，第5、6、7泳道和B(iii)。图B(ii)中，示出了点击反应缺乏脱硫生物素-PEG-叠氮的对照。该情况下，很少蛋白结合到中性链亲和素珠并被洗脱(只在75kDa处可见很弱的带)。所述结果表明，开发的方法可确保蛋白质组学测定并评估共翻译和翻译后豆蔻酰化的蛋白或豆蔻酰化蛋白质组(myristoylome)的细胞含量。
实施例20
本实施例中，图19中，描述了按比例增加的使用链霉亲和素-磁珠通过脱硫生物素-PEG-叠氮探针拉下白血病Jurkat T细胞中翻译后ω-炔基豆蔻酰化蛋白。使用2.5μM十字孢碱处理3h诱导Jurkat细胞发生凋亡，然后使用共轭到BSA的100μM豆蔻酸(C14)(图A)或炔基-豆蔻酸(Alk C14)(图B)在37℃标记1h。将细胞收集、裂解并通过点击化学与叠氮基-脱硫生物素反应。脱硫生物素-炔基-豆蔻酰化蛋白结合到链霉亲和素磁珠，使用含2％SDS的50mM生物素在37℃15min洗涤并洗脱。洗脱液1(B图)含有大部分脱硫生物素-豆蔻酰化蛋白，尽管豆蔻酸标记的细胞的洗脱液1中只发现了很少(A图)。曝光时间：5秒。
实施例21
本实施例中，图20中，示出了用炔基-豆蔻酸标记的“正常”永生化的B细胞(IM9)和BL细胞(BL2和Ramos)的豆蔻酰化模式。将细胞用100μM炔基-豆蔻酸代谢标记1小时，然后收获。蛋白样品与叠氮基-生物素进行点击化学反应，来自每种细胞裂解物的25μg蛋白通过SDS-PAGE分离，并使用NeutrAvidinTM-HRP通过Western印迹显示。箭头指示生物素化-炔基-豆蔻酰化蛋白，其存在于“正常”永生化的B淋巴细胞IM9中，但未见于BL细胞(BL2和Ramos)中。
实施例22
本实施例中，图21中，示出了DDD86481和阿霉素组合的时间和剂量依赖的细胞毒性曲线图。将B淋巴细胞系IM-9(A)和BL-2(B)用渐增浓度的DDD86481(0、0.001、0.01、0.1、1.0、10和100μM)在0(蓝色)、17(红色)和86nM(绿色)羟基阿霉素处理24、48或72小时(从上到下)。MTS测定显示通过不同浓度的阿霉素和DDD86481诱导的细胞杀伤，其单独毒性小得多，该效应符合协同作用。其特征在于，第24小时和48小时时间点，两种化合物同时使用时的EC50比单独使用DDD86481的EC50低6倍。
实施例23
本实施例中，以下表8中，评估了北美的多种人类癌症中近乎普遍的NMT2损失。我们设定log2(微阵列荧光强度)的最小截留值为5.64，其对应于无NMT2的细胞(Toledo，见实施例18)，并且发现967种细胞系的114种落入该阈值范围(～12％)。还示出了北美每种类型肿瘤的发生率、受益于NMT抑制剂治疗的患者数(低于所述阈值的发生率X％)和对选择的癌症的医疗需要的解释。
表8
实施例24
本实施例中，图22中，使用与DMSO、十字孢碱、αFAS或单独的载体共孵育的细胞进行的免疫印迹。将得到的免疫印迹通过抗-NMT1抗体、抗-NMT2抗体、抗-PARP-1抗体和抗-GAPDH抗体探测。所述数据包括诱导细胞凋亡后NMT被剪切。
具体地，本实施例中，图22A中，研究了NMT在活细胞和将死的细胞中的作用。测定了抗Fas或STS诱导产生程序性细胞死亡的Jurkat T细胞中的NMT含量。将Jurkat T细胞用DMSO、十字孢碱(2.5μM)或抗Fas(300ng/ml)和环己酰亚胺(5μg/mL)处理，并在第0、2、4、6和8h时间点收集样品。将细胞裂解，并使用ECL通过Western印迹检测NMT1、NMT2、PARP-1和GAPDH的存在。使用抗Fas或STS处理Jurkat T细胞产生时间依赖的NMT1和NMT2剪切(图22A)。诱导细胞死亡后2h开始NMT1剪切，但是细胞凋亡4h后才可检测到NMT2剪切。
以可见的67kDa蛋白(预测M.W.＝56.8kDa)迁移的NMT1的剪切，得到可见的～46kDa的片段(图3.1)。以可见的65kDa蛋白(预测M.W.＝56.9)迁移的NMT2的剪切，在早的时间点产生可见的～55kDa的片段，其在较晚的时间点(4和8h)被转变为以～46kDa或以下迁移的更短的片段。所述更短的NMT2片段可见与非特异的蛋白带重叠。但是，其在图3.2(8h)和3.4A(4h和8h)的Fas-处理的Jurkat细胞裂解物中更明显。因此，NMT1和NMT2的剪切最初、主要地分别可丢失～11kDa和～10kDa片段。NMT可见的迁移和预测的分子量之间差异的原因尚不清楚。NMT剪切的时间与细胞凋亡标志物PARP-1的时间平行，表明其是由于胱天蛋白酶的作用。
NMT1是胱天蛋白酶-3或-8的底物，NMT2是胱天蛋白酶-3的底物。
图22图B的实验中，为研究胱天蛋白酶是否参与NMT的剪切，在存在或不存在已知的胱天蛋白酶-3、-8和-9的不可逆抑制剂和胱天蛋白酶通用抑制剂的条件下，我们在Jurkat T细胞中诱导了抗Fas介导的凋亡，并测定了2种NMT的细胞含量。将Jurkat T细胞用10μM胱天蛋白酶抑制剂处理1小时，然后用抗Fas(300ng/mL)和环己酰亚胺(5μg/mL)处理诱导细胞凋亡。第0、4和8h时间点收集样品。将细胞裂解，并使用ECL通过Western印迹检测NMT1、NMT2和PARP-1的存在。然后将所述印迹剥离并用抗tubulin抗体(上样对照)再次探测(复合胶)。
NMT1剪切可被通用抑制剂或胱天蛋白酶-8特异的抑制剂消除，但是其只能部分地被胱天蛋白酶-3特异的抑制剂阻断(图22B)，这表明NMT1是胱天蛋白酶-3或-8的底物。相反地，NMT2剪切可显著地被所有使用的胱天蛋白酶抑制剂抑制(图22B)。这表明，NMT2可能是胱天蛋白酶-3的底物，由于抑制引发剂(initiator)胱天蛋白酶-8或-9反过来可抑制效应物胱天蛋白酶-3的剪切和活化。通过使用抗-PARP-1抗体的Western印迹验证了抗Fas诱导的细胞凋亡的进程(图22B)。PARP-1剪切的程度与NMT1和NMT2的剪切程度是伴随且等量的。
实施例25
本实施例中，图23中，示出了胱天蛋白酶截短的NMT2的活性超过全长NMT2的3-4倍。纯化的全长和胱天蛋白酶剪切的6×组氨酸(His)-NMT的NMT活性是通过肽豆蔻酰化测定检测的。N-豆蔻酰基转移酶活性是由在磷酸纤维素纸上产生并检测到的放射性标记的豆蔻酰化肽的量计算得出的(改自King et al.1991,Anal Biochem)。每个NMT测定进行3次。所用的对照是来自His-NMT1纯化的洗脱液5。胱天蛋白酶截短的NMT2的活性比全长NMT2的活性高3-4倍
实施例26
本实施例中，图24中，示出了BL细胞中的NMT2水平下降参与了组蛋白脱乙酰基酶的作用。
图24的实验中，我们探索了评估NMT2位点基因沉默参与的可能。通过组蛋白乙酰化酶(HAT)使组蛋白上的赖氨酸残基的ε-氨基乙酰化，导致带正电的组蛋白减少，这使染色质构象松弛并且使得转录装置更好地到达DNA(Barneda-Zahonero,B.,andM.Parra.2012.Histone deacetylases and cancer.Mol Oncol.6:579-589.)。因此，组蛋白乙酰化典型地与基因活化相关。相反地，通过组蛋白去乙酰化酶(HDAC)从组蛋白移除乙酰基团可引起染色质凝聚并导致转录抑制或基因沉默。
为测试mRNA NMT2的减少是否是由于染色质沉默，我们使用I类和II类组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺羟肟酸(SAHA)(也称为伏立诺他)处理“正常”B细胞(IM9)和恶性BL细胞24小时，并通过Western印迹检测NMT1和NMT2水平。具体地，使用1μM SAHA(I/II类HDAC抑制剂)处理“正常”B细胞(IM9)和恶性BL细胞(Ramos，BL2)24h。然后将细胞裂解，经过SDS-PAGE并使用NMT1、NMT2、p21/WAF1和GAPDH抗体进行Western印迹。
我们发现，使用SAHA可提高其中NMT2水平通常被损耗的BL细胞中的NMT2水平，但是NMT1水平保持相对不变。p21/WAF1是一种可结合到细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)或CDK2复合体并抑制其活性的蛋白，将其用作对照以验证SAHA的有效性，已知其可增加细胞中p21/WAF1基因的表达。所有SAHA处理的细胞都含有增加的p21/WAF1水平。尽管不希望被理论所束缚，仍认为所述数据表明I类或II类HDAC可通过使组蛋白去乙酰化并以此压缩BL细胞中的NMT2位点来沉默NMT2基因。
在一个实例中，HDAC抑制剂用于治疗NTM2缺陷癌症。
实施例27
本实施例中，图25中，示出了多种BL细胞系中NMT2蛋白水平下降。从地方研究人员处收集了多种淋巴细胞系的裂解物，并测定了其NMT含量。结果显示，与“正常”永生化的B淋巴细胞系IM9、L0和VDS相比，所有测试的伯基特淋巴瘤细胞系(BL2、Daudi、Ramos和BJAB)中NMT2蛋白水平都下降。
实施例28
本实施例中，图26中，示出了蛋白酶体降解不是BL细胞中NMT2损耗的原因。在这些实验中，将“正常”永生化的B淋巴细胞(IM9)和恶性B淋巴瘤细胞[霍奇金淋巴瘤(KMH2)和BL(Ramos、BL2)]用10μM蛋白酶体抑制剂(MG-132)处理5h。对细胞裂解物进行Western印迹，以检测NMT1、NMT2、Mcl-1和GAPDH水平。
为研究NMT2降解增加是否是失稳突变的结果或是因为存在未知的可使癌细胞中NMT2失稳的因子，我们使用蛋白酶体降解抑制剂MG-132处理正常淋巴细胞和恶性淋巴细胞5h。将细胞裂解物进行Western印迹，以测定NMT1、NMT2和髓细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)的存在，Mcl-1用作对照检测MG-132的有效性因为其易受蛋白酶体降解。结果显示，用MG-132处理后BL细胞中NMT2水平未增加，表明恶性淋巴细胞中不存在可导致NMT2降解的失稳突变或者失稳因子。使用MG-132处理细胞，可导致所有类型的细胞中Mcl-1水平增加。
实施例29
本实施例中，图27中，示出了NMT1可被胱天蛋白酶-8剪切但NMT2没有被其剪切。将Jurkat T细胞(A)和表达胱天蛋白酶-8显性失活突变体的Jurkat T细胞(B)用DMSO或抗Fas(150ng/mL)处理，并在第0、4和8h时间点收集样品。将细胞裂解，并使用ECL通过Western印迹检测NMT1、PARP-1和剪切的胱天蛋白酶-8的存在。*代表非特异性条带。
研究了野生型Jurkat T细胞和表达胱天蛋白酶-8显性失活突变体的Jurkat T细胞(C8DN)(Juo et al.,1998)中NMT1的剪切。与野生型Jurkat T中的水平相比，凋亡的Jurkat T细胞中C8DN的表达可消除NMT1的剪切(图27A和B)。诱导凋亡8后，Jurkat-C8DN细胞中可检测到很少量的NMT2剪切(图27B)。Jurkat T-C8DN细胞中，PARP-1和胱天蛋白酶-8的剪切也受到抑制。
实施例30
本实施例中，图28中，NMT1和NMT2都被胱天蛋白酶-3剪切。MCF7(A)和表达胱天蛋白酶3的MCF7(MCF7/胱天蛋白酶3)(B)用DMSO或STS(2.5μM)和环己酰亚胺(5μg/mL)处理，并在第0、4和8h时间点收集样品。将细胞裂解，并使用ECL通过Western印迹检测NMT2、PARP-1和剪切的胱天蛋白酶3的存在。
结果发现，在第8h时间点，凋亡的MCF-7细胞中NMT1和NMT2都未被剪切(图28A)。相反地，在稳定表达胱天蛋白酶-3的凋亡的MCF-7细胞中2种酶都易被剪切(Kagawa et al.,2001)(图28B)。在诱导细胞凋亡的2种MCF-7细胞系中，也证实了已知的胱天蛋白酶-3/-7的底物PARP-1的剪切(图27A和B)(Walsh et al.,2008)。因此，两种NMT似乎都是胱天蛋白酶-3的底物。
实施例31
本实施例中，图29中，通过Edman降解鉴定的NMT1和NMT2的胱天蛋白酶剪切位点以粗体示出并且NMT1和NMT2氨基酸序列(氨基酸1到80)中带正电荷的赖氨酸(K)盒突出显示。
N-末端测序显示NMT2在D-25和D-67位点都被剪切(图29)。NMT1和NMT2的剪切位点都位于酶的N-末端，不在C-末端的催化区，这表明在细胞凋亡过程中所述剪切酶可能仍有活性。
实施例32
本实施例中，图30中，描绘了通过定点诱变确认的NMT剪切位点。将瞬时表达野生型和突变的V5-NMT构建体的HeLa细胞与STS(2.5μM)共孵育。在第4h和第5h时间点，分别将用V5-NMT1或V5-NMT2构建体转染的细胞裂解。使用V5和α-tubulin(上样对照)抗体进行所述样品的Western印迹。
为验证通过N-末端测序鉴定的NMT剪切位点，我们构建了N-末端标记的V5-NMT载体，并使用定点诱变试剂盒(Stratagene)在所述NMT剪切位点产生点突变。V5-NMT1中的工程化D72E突变可消除使用STS诱导凋亡4h的适当转染的HeLa细胞中V5-NMT1的胱天蛋白酶剪切，而这些细胞中WT V5-NMT1水平严重降低(图30)。这可确定D72是NMT1中的胱天蛋白酶剪切位点。
由于N-末端测序显示NMT2具有两个胱天蛋白酶剪切位点(D25和D67)(图30)，我们分别[V5-NMT2(D25E)、V5-NMT2(D67E)]和同时[V5-NMT2(D25,67E)]将D25和D67两个残基突变为谷氨酸(E)残基。结果发现，诱导细胞凋亡5h后，在适当转染的凋亡的HeLa细胞中双突变V5-NMT2(D25,67E)的剪切严重消除，但是单突变[V5-NMT2(D25E),V5-NMT2(D67E)]具有不同的结果(图30)，野生型V5-NMT2大多被剪切(图3.8)。当比较细胞凋亡过程中单突变的完整度时，发现V5-NMT2(D25E)的剪切可重复地略少于V5-NMT2(D67E)(图30)，表明D25可能是NMT2的主要剪切位点，而D67可能是次要剪切位点。
实施例33
本实施例中，图31中，描绘了当细胞经历凋亡时豆蔻酰化模式的改变。用抗Fas(150ng/mL)和环己酰亚胺(5μg/mL)诱导细胞凋亡后，使用25μM炔基豆蔻酸代谢标记Jurkat细胞。通过点击化学使蛋白样品与叠氮基-生物素反应，并使用NeutrAvidinTM-HRP通过Western印迹显示。通过Western印迹测定标记纳入之前，将膜在0.1M Tris-HCl或0.1M KOH中孵育。
使用抗Fas诱导Jurkat T细胞发生凋亡，并使用ω-炔基豆蔻酸代谢标记30min，然后在不同时间点(0、1、2、4和8h)收获细胞。将环己酰亚胺加入细胞中以抑制蛋白翻译作为细胞凋亡刺激的部分，以此阻断细胞凋亡过程中共翻译豆蔻酰化。通过点击化学使细胞裂解物与叠氮基-生物素反应，并使用NeutrAvidinTM-HRP通过Western印迹显示生物素化-豆蔻酰化的蛋白，如前所述(Yap et al.,2010)。
第0h的豆蔻酰化模式与此前在非凋亡细胞中发现的共翻译豆蔻酰化模式相关(图31)(Martin et al.,2008；Yap et al.,2010)。有意地低曝光显示细胞裂解物中只有少数豆蔻酰化蛋白。用0.1M KOH处理膜证实ω-炔基豆蔻酸通过耐碱的酰胺键被纳入蛋白中，由于碱处理只能从少数蛋白带中去除标志物。所述碱处理可水解棕榈酰化蛋白中的硫酯键(Armah and Mensa-Wilmot,1999；Zhao et al.,2000；Vilas et al.,2006)。使用抗Fas和环己酰亚胺诱导凋亡1h后，共翻译豆蔻酰化减少，可能是由于蛋白翻译被环己酰亚胺抑制。这继而发生豆蔻酰化蛋白的细胞含量的改变，如通过诱导凋亡后2h开始并在实验过程中持续的电泳豆蔻酰化蛋白谱中的主要差异所显示的(图31)。
实施例34
本实施例中，图32中，描绘了细胞经历凋亡时NMT水平的改变。使用抗Fas(150ng/mL)和环己酰亚胺(5μg/mL)诱导细胞凋亡后，使用25μMω-炔基豆蔻酸代谢标记Jurkat T细胞。使用针对NMT1、NMT2和GAPDH的抗体，对与图31相同的样品进行Western印迹。(*)代表非特异条带。
所述结果显示，虽然细胞凋亡过程中NMT被不同程度的剪切，然而豆蔻酰化活性似乎可在细胞中保持到诱导细胞凋亡后8h。
实施例35
本实施例中，图33中，描绘了使用十字孢碱和环己酰亚胺诱导瞬时表达V5-NMT1和V5-NMT2的COS7细胞发生细胞凋亡。通过肽豆蔻酰化测定检测NMT活性，并使用v5的抗体和α-tubulin的抗体(上样对照)对样品进行Western印迹。
图34描绘了瞬时转染的COS7细胞裂解物中的起始NMT活性。将瞬时表达V5-NMT1和V5-NMT2的COS7细胞与STS(2.5μM)和环己酰亚胺(5μg/mL)共孵育。通过肽豆蔻酰化测定检测NMT活性，如材料和方法中所述。N-豆蔻酰基转移酶活性是由在磷酸纤维素纸上产生并检测到的放射性标记的豆蔻酰化肽的量计算得出的(改自King et al.1991,Anal Biochem)。将活性水平相对于t＝0h时的NMT1活性进行标准化。NMT1代表2个重复的3次独立的实验的平均值。NMT2代表2个重复的4次独立的实验的平均值。
图35描绘了与十字孢碱(2.5μM)和环己酰亚胺(5μg/mL)共孵育的瞬时表达V5-NMT1和V5-NMT2的COS7细胞中的NMT活性。NMT活性是通过肽豆蔻酰化测定检测的，如材料和方法中所述。N-豆蔻酰基转移酶活性是由在磷酸纤维素纸上产生并检测到的放射性标记的豆蔻酰化肽的量计算得出的(改自King et al.1991,Anal Biochem)。将每种NMT的NMT活性基于t＝0h时为100％进行标准化。NMT1代表2个重复的3次独立的实验的平均值。NMT2代表2个重复的4次独立的实验的平均值。差异通过(*)表示，并且示出了两种NMT与0h时间点相比的统计学显著性(*<p＝0.05,**<p＝0.005)。
为评价被剪切的NMT是否仍具有催化活性，使用基于过滤器的肽测定(King andSharma,1991；Raju and Sharma,1999)检测了细胞凋亡发生过程中表达每一种V5-NMT的瞬时转染细胞中的V5-NMT酶活性。将V5-NMT1、V5-NMT2或空载体瞬时转染的COS-7细胞诱导产生STS/环己酰亚胺-介导的细胞凋亡并用作酶的来源。使用[3H]-豆蔻酰-CoA在不同的细胞凋亡时间测定NMT活性，并且可豆蔻酰化或不可豆蔻酰化(G->A)的截短的Bid十肽菌素用作底物(King and Sharma,1991；Raju and Sharma,1999)。NMT活性是由保持结合到磷酸纤维素纸上并且通过闪烁计数器检测的放射性标记的肽的量计算得出。
虽然所述转染的COS-7细胞表达相似水平的嵌合体NMT(图32)，然而表达V5-NMT1的细胞在t＝0h时的NMT活性显示出比表达V5-NMT2的细胞的NMT活性高将近5倍(图34)。随着细胞凋亡诱导的时间进程，细胞裂解物中存在的完整V5–NMT的量减少(图33)，并且与内源NMT具有相似的趋势(图32)，虽然几乎全部的过表达NMT1在细胞凋亡4h和8h后被剪切并且全部过表达的NMT2在8h后被剪切(图3.33)。尽管在诱导凋亡后4h超过90％的V5-NMT1被剪切(图3.33)，但是这些细胞中NMT活性保持相对不变直到细胞凋亡起始后8h。与t＝0h时的活性相比，t＝2h和4h时过表达NMT1的COS-7细胞的裂解物中NMT的催化活性有略微增加的趋势(虽然不显著)(图3.35)。这表明，翻译后豆蔻酰化起始时，经过剪切的V5-NMT1在细胞凋亡过程中具有催化活性。但是，我们在V5-NMT1转染的细胞观察到，与0h时间点相比，诱导细胞凋亡后8h时NMT活性显著降低(20％,p<0.05)(图35)。
第0h到第4h，表达V5-NMT2的细胞的NMT活性未受到显著影响，直到诱导细胞凋亡8h后V5-NMT2的胱天蛋白酶剪切导致酶活性的统计学显著(p<0.005)的降低(与t＝0h的活性相比降低33％)(图35)。令人感兴趣的是，虽然由于细胞凋亡过程中胱天蛋白酶的剪切导致NMT2水平显著降低(图33)，但是诱导细胞凋亡8h后依然保留了66％的NMT2活性(图33)，这表明：细胞凋亡过程中，NMT2也在蛋白的翻译后豆蔻酰化中起作用。
实施例36
本实施例中，图36中，描绘了重组6×组氨酸(His)-标记的全长hNMT1和胱天蛋白酶剪切的hNMT1的纯化。通过Ni-NTA层析进行纯化(见材料和方法)。使用考马斯亮蓝凝胶染料进行凝胶染色以显示纯化的蛋白(FT:流出组分，W:洗涤和E:洗脱组分)。
图37描绘了重组6×组氨酸(His)-标记的全长hNMT2和胱天蛋白酶剪切的hNMT2的纯化。通过Ni-NTA层析进行纯化(见材料和方法)。使用考马斯亮蓝凝胶染料进行凝胶染色以显示纯化的蛋白(FT:流出组分，W:洗涤和E:洗脱组分)。
图38描绘了通过肽豆蔻酰化测定检测的纯化的全长6×组氨酸(His)-NMT和胱天蛋白酶剪切的6×组氨酸(His)-NMT的NMT活性。N-豆蔻酰基转移酶活性是由在磷酸纤维素纸上产生并检测到的放射性标记的豆蔻酰化肽的量计算得出的(改自King et al.1991,Anal Biochem)。每个NMT测定进行3次重复。所用的对照是来自His-NMT1纯化的洗脱液5。
构建了His-标记的全长人NMT(His-NMT1和His-NMT2)和胱天蛋白酶截短的人NMT(His-73NMT1、His-26NMT2和His-68NMT2)的载体，并将所述载体用于细菌表达和蛋白纯化(图36和37)。通过基于过滤器的肽NMT测定(King and Sharma,1991；Raju and Sharma,1999)，发现当在体外与对照比较时全长的和胱天蛋白酶截短的NMT1和NMT2都具有催化活性(图37)。NMT2的剪切似乎可增强其活性，由于胱天蛋白酶剪切截短的NMT2似乎具有与全长NMT2相比高～3倍(His-26NMT2)和～4倍(His-68NMT2)的活性(图38)。
实施例37
本实施例中，图39中，描绘了HeLa细胞凋亡过程中内源NMT的亚细胞分级。将HeLa细胞用DMSO、STS(2.5μM)或抗Fas(300ng/mL)和环己酰亚胺(5μg/mL)处理，在第5h时间点收集样品，并如材料和方法所述将样品进行亚细胞分级。将相同体积的P100和S100组分使用NMT1和NMT2抗体进行Western印迹。
图40描绘了HeLa细胞凋亡过程中内源NMT的亚细胞分级后不同组分中的NMT定量。将HeLa细胞用DMSO、STS(2.5μM)或抗Fas(300ng/mL)和环己酰亚胺(5μg/mL)处理，在第5h时间点收集样品，并进行亚细胞分级(图39)。P100(P)和S100(S)组分之间的全长(Full)和剪切的NMT1(A)和NMT2(B)的水平通过Image J(http://rsbweb.nih.gov/ij/)定量。所示百分数用每条条带的水平占2种组分(P100+S100)的总水平计算出来。该图代表3次独立实验的平均值。
图41描绘了用炔基-豆蔻酸标记的经历凋亡的HeLa细胞的亚细胞分级。亚细胞分级前(图39和40)，将HeLa细胞在诱导凋亡后使用25μM炔基豆蔻酸代谢标记。分级后，通过点击化学使蛋白样品与叠氮基-生物素反应，并使用NeutrAvidinTM-HRP通过Western印迹显示。通过Western印迹评估标记纳入之前，将膜在0.1M中性Tris-HCl(A)或0.1M KOH(B)中孵育。
许多蛋白的胱天蛋白酶剪切通常导致细胞定位的改变(Enari et al.,1998；Zhaet al.,2000；Jakobi,2004；Vilas et al.,2006)，因此为描述细胞凋亡过程中剪切的NMT的定位，进行了正常细胞和凋亡细胞的亚细胞分级实验(图39)。结果发现，NMT1在未处理的HeLa细胞中主要定位于核糖体/膜组分(沉淀中占63.9％)(图40)。使用STS或抗Fas与环己酰亚胺一起诱导凋亡的HeLa细胞的细胞质组分中，经剪切的胱天蛋白酶截短的NMT1明显地增加(抗Fas处理的细胞的细胞质中占54％，STS处理的细胞的细胞质中占60％)(图39和40)。相反地，诱导细胞凋亡前，大部分NMT2(61.7％)定位于细胞质(图39和40)。但是，凋亡细胞中胱天蛋白酶剪切的较大的NMT2片段(～55kDa)主要定位于膜沉淀(Fas处理的细胞中占94.7％，STS处理的细胞中占80％)(图39和40)。我们的分级过程中未检测到较小的NMT2剪切片段(～46kDa)，可能是因为细胞被诱导发生细胞凋亡长达5h。
当细胞在诱导细胞凋亡之前使用炔基豆蔻酸代谢进行标记或不进行此操作并进行亚细胞分级时，检测到诱导细胞凋亡后豆蔻酰化模式改变，如图31所示，并且发现与细胞质(S100)相比，翻译后豆蔻酰化的蛋白主要定位于膜(P100)(图40)。这表明，向所述翻译后豆蔻酰化蛋白加入豆蔻酰基似乎足以提供稳定的膜锚定。
实施例38
本实施例中，图42描绘了2-羟基豆蔻酸(HMA)对诱导细胞凋亡的影响。使用或不用HMA(1mM)处理Jurkat T细胞并且用抗Fas(150ng/ml)和环己酰亚胺(5μg/ml)诱导细胞凋亡。对照细胞用DMSO处理。第0、2、4、6和8h时间点收集样品。将细胞裂解并通过SDS-PAGE分离样品，并使用抗PARP-1、PAK2、NMT1和NMT2抗体进行免疫印迹(复合胶)。
与使用1mM豆蔻酸钠和抗Fas处理的细胞相比，使用1mM HMA和抗Fas处理的细胞中PARP-1的剪切早发生2h。暴露至HMA/STS的细胞中可见类似的趋势，但与在HMA/STS细胞存在下用抗Fas处理的结果相比程度较小，所述HMA/STS细胞在诱导细胞凋亡后2h显示出比使用STS和1mM豆蔻酸钠处理的细胞更强的PARP-1和PAK2剪切(图42)。也检测到类似的激发NMT1和NMT2的剪切。这表明，抑制NMT可加速诱导细胞的凋亡。由于抑制NMT可能发生细胞凋亡，NMT似乎在细胞中整体上起到促存活的作用。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请表示本发明所属技术领域的技术人员的技术水平，并且通过引用以相同的程度并入本文，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入。
本发明进行了这样的描述，很明显本发明可以在许多方面进行改变。这些改变不被视为脱离本发明的精神和范围，并且所有这些本领域技术人员看来显而易见的修改都包含在下列权利要求书的范围之内。

Claims (23)

1.DDD86481和阿霉素的组合在制备用于治疗患有伯基特淋巴瘤的受试者的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述受试者是人类受试者。
3.如权利要求1所述的用途，其包括：在来自所述受试者的样品为NMT2缺陷时将所述组合施用给所述受试者，所述NMT2缺陷通过NMT2合成、水平、活性或功能的抑制、降低或消除以及NMT2蛋白的合成、水平、活性或功能的诱导或刺激的抑制来定义，并且通过用以确定所述样品是否表达NMT2的分析的结果来定义。
4.如权利要求1所述的用途，其包括：处理来自患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的样品；进行结合测定，其包括使经处理的样品与NMT2蛋白的抗体接触以形成所述抗体与经处理的样品中存在的NMT2蛋白之间的复合体，所述结合测定产生至少一种指示所述复合体的测定结果；
其中，当与对照相比，所述样品中NMT2蛋白含量低或者缺乏时，指示向所述受试者施用所述组合。
5.如权利要求3所述的用途，其中，用以确定来自受试者的所述样品是否表达NMT2的所述分析包括：进行结合测定，其包括使经处理的样品与NMT2的抗体接触以形成所述抗体与经处理的样品中存在的NMT2蛋白之间的复合体，所述结合测定产生至少一种指示所述复合体的测定结果。
6.如权利要求4或5所述的用途，其中，所述结合测定包括荧光激活细胞分选术、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学法、定量免疫组织化学法、荧光共振能量转移、福斯特共振能量转移、双分子荧光互补、质谱法、免疫印迹测定或者免疫共沉淀测定。
7.如权利要求4-6任一项所述的用途，其中，使用具有被设为检测所述抗体与所述样品中的所述NMT2之间形成的复合体的检测器的装置，来确定所述样品中复合体的量。
8.如权利要求7所述的用途，其中，所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。
9.如权利要求3-8任一项所述的用途，其中，所述受试者是人类。
10.如权利要求1所述的用途，其包括：处理来自患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的样品；进行结合测定，其包括使经处理的样品与结合NMT2核酸的可检测标记物接触以形成所述可检测标记物与样品中存在的NMT2核酸之间的复合体，所述结合测定产生至少一种指示所述复合体的测定结果；
其中，当与对照相比，所述样品中NMT2核酸含量低或者缺乏时，指示向所述受试者施用所述组合。
11.如权利要求3所述的用途，其中，用以确定来自受试者的所述样品是否表达NMT2的所述分析包括：进行结合测定，其包括使经处理的样品与结合NMT2核酸的可检测标记物接触以形成所述可检测标记物与样品中存在的NMT2核酸之间的复合体，所述结合测定产生至少一种指示所述复合体的测定结果。
12.如权利要求10或11所述的用途，其中，所述结合测定包括使用可检测标记的DNA或RNA探针的杂交测定。
13.如权利要求12所述的用途，其中，所述杂交测定是定量的或者半定量的。
14.如权利要求13所述的用途，其中，所述杂交测定是RT-PCR、原位杂交、RNA保护测定(“RPA”)、cDNA和寡核苷酸微阵列、代表性差异分析(“RDA”)、差异显示、EST序列分析、基因表达的系列分析(“SAGE”)和用Luminex FlexMAP的多重连接介导的扩增("LMF")。
15.如权利要求14所述的用途，其中，使用具有被设为检测所述可检测标记物与所述样品中存在的NMT2核酸之间的复合体的检测器的装置，来确定所述样品中复合体的量。
16.如权利要求15所述的用途，其中，所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。
17.如权利要求10-16任一项所述的用途，其中，所述受试者是人类。
18.如权利要求1所述的用途，其包括：处理来自患有癌症或者疑似患有癌症的受试者的样品；进行结合测定，其包括使经处理的样品与结合所述样品中豆蔻酰化蛋白或叠氮基-生物素标记的豆蔻酰化蛋白的抗体接触以形成可检测标记物与所述样品中存在的豆蔻酰化蛋白之间的复合体，所述结合测定产生至少一种指示所述复合体的豆蔻酰化模式；其中，当所述豆蔻酰化模式指示所述癌症为NMT2缺陷时，指示向所述受试者施用所述组合，所述NMT2缺陷通过与对照相比NMT2合成、水平、活性或功能的抑制、降低或消除以及NMT2蛋白的合成、水平、活性或功能的诱导或刺激的抑制来定义。
19.如权利要求18所述的用途，其中，所述处理包括使用ω-炔基-豆蔻酸和脱硫生物素叠氮基-PEG生物素处理所述样品。
20.如权利要求18或19所述的用途，其中，所述结合测定包括荧光激活细胞分选术、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学法、定量免疫组织化学法、荧光共振能量转移、福斯特共振能量转移、双分子荧光互补、质谱法、免疫印迹测定或者免疫共沉淀测定。
21.如权利要求20所述的用途，其中，使用具有被设为检测所述抗体与所述样品中的所述NMT2之间形成的复合体的检测器的装置，来确定所述样品中复合体的量。
22.如权利要求21所述的用途，其中，所述装置是分光光度计、荧光分光光度计、光学装置或者电化学装置。
23.如权利要求20-22任一项所述的用途，其中，所述受试者是人类。
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