KR102496892B1 - 암의 합성치사 및 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 치료용 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 명세서에서 상술한 조성물, 화합물 및 방법들로 치료하기에 적합한 암에 걸린 대상을 식별하는 방법 및 용도를 제공한다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 NMT2-결손(deficient)인 암에 걸린 대상(subject)에게 NMT 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.

Description

암의 합성치사 및 치료{SYNTHETIC LETHALITY AND THE TREATMENT OF CANCER}
본 특허출원은 미국 특허청에 2012년 10월 30일에 제출된 미국 특허출원 제 61/720,218 호, 2013년 8월 27일에 제출된 미국 특허출원 제61/870,418호, 2013년 8월 27일에 제출된 미국 특허출원 제 61/870,435호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 암 치료용 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다.
캐나다에서 암은 사망의 주요 원인이다. 캐나다 암 협회는 2011년에 대략 170,000 건의 암 사례 중 대략 75000 건을 사망례로 추정하였다.
암의 치료를 위한 신규한 접근법은 합성 치사(synthetic lethality)의 개념에 관한 것이다. 두 개의 유전자(또는 두 유전자 산물들) 중 하나에만 돌연변이가 있는 경우 세포가 생존할 수 있지만, 두 개의 유전자 모두 돌연변이가 있는 경우 세포가 죽음에 이르게 되는 것을 합성치사라고 한다. 다시 말해, "합성치사"는 돌연변이 및 약물이 함께 작용하여 암세포의 죽음을 일으키는 상황(-돌연변이 또는 약물 중 어느 하나는 암세포의 죽음을 야기하지 않는다)에 대해 설명해준다. 암-관련 돌연변이에 합성 치사되는 유전자(또는 유전자 산물)를 타겟팅하면, 암세포만을 사멸시키고 정상적인 세포는 살아남게 된다. 따라서, 합성 치사는 항-암 특정 제제의 개발을 위한 프레임워크를 제공한다.
암의 치료에 대한 합성 치사적 접근법이 대두되고 있으나, 합성 치사 유전자들(및 유전자 산물들)의 확인 부재로 인하여 아직까지 크게 일반적인 방법은 아니다.
단백질의 N-미리스토일화(N-myristoylation)는 미리스테이트(myristate, 14-탄소 포화지방산)가 다양한 세포, 바이러스 및 발암단백질(예컨대, 발암 Src-관련 티로신 키나제, 헤테로트리메릭 G 알파 서브유니트, 등)의 NH2 말단 글리신에 공유결합으로 부착되는 변형이다.
세포 내 미리스토일화된 단백질은 신호 전달 및 발암과정에 있어 다양한 생물학적 기능을 한다. 진핵 세포에서 미리스토일화에 의한 단백질의 변형은 세포 성장에 중요한 신호 전달 및 조절 기능에 필요한 많은 중요한 단백질들의 세포 내 타겟팅, 단백질 구조 및 생물학적 활성에 필요하다. Src 패밀리(원발암 유전자)의 티로신 키나아제는 가장 광범위하게 연구되고 있는 미리스토일화된 단백질 중 하나이다.
단백질의 미리스토일화는 N-미리스토일트랜스퍼라제(N-myristoyltransferase, NMT)에 의해 촉매된다. NMT는 진핵 세포에서 이러한 활성을 초래하고, 메티오닐 아미노펩티다제에 의해 처음 시작인 메티오닌 잔기가 제거된 후 그의 폴리펩타이드 기질을 변형시킴으로써 작용한다. 비록 미리스토일화가 아폽토시스 동안 일반적으로 단백질의 단백질분해 절단(proteolytic cleavage) 후 포스트-번역(post-translation) 또한 발생시키기는 하나, 이러한 변형은 주로 동시-번역(cotranslation) 과정으로서 발생한다. 포유류 NMT 효소의 두 가지 아이소자임(isozyme)이 클로닝되었으며, 이들은 NMT1 및 NMT2으로 디자인되었다. NMTs는 세포에서 친-생존(pro-survival)하는 역할을 한다. 이러한 NMTs는 모두 정상 세포에 존재한다.
암 치료용 화합물, 조성물 및 방법에 대한 요구가 대두되고 있다.
이러한 배경 정보는 본 발명과 관련성이 있는 출원인에 의해 공지된 정보를 조성하기 위한 목적으로 제공된다. 허가가 반드시 필요한 것은 아니며, 어떠한 선행 정보도 본 발명에 대한 선행 기술을 구성하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 암에 걸린 대상의 치료를 위한 화합물 및 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법으로 치료가 적합한 암에 걸린 대상을 식별하는 방법을 제공하며, 이는 하기에서 설명된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 NMT2-결손(deficient)인 암에 걸린 대상에게 NMT 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 NMT 억제제는 NMT1 억제제를 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 NMT 억제제는 저분자, 항체, 펩티드 단편, 또는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 저분자는 Tris-DBA, HMA 또는 DDD85646, DDD86481, 또는 이들의 유도체를 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 핵산은 dsRNA 분자, RNAi 분자, miRNA 분자, 리보자임, shRNA 분자, 또는 siRNA 분자를 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 암이 생긴 대상 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상을 치료하는 방법을 제공한다: 분석 결과를 제공하는 검사를 요청하여 대상의 시료에서 NMT2가 발현하는 지의 여부를 결정하는 단계, 및 상기 시료가 NMT2-결손(deficient)인 경우 NMT1 억제제를 대상에게 투여하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 암이 생긴 대상 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상으로부터 시료를 획득하는 단계; 상기 시료를 처리하는 단계; 상기 처리된 시료를 NMT2에 대한 항체와 접촉시켜 상기 항체와 상기 처리된 시료 내에 존재하는 NMT2 단백질 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계로서, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하며; 상기 대상에게 상기 NMT1 억제제를 투여하는 단계는 선택적으로 대조군에 비해 상기 시료 내 NMT2 단백질의 양이 낮거나 없는 경우에 권고된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 암이 생긴 대상 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상으로부터 시료를 획득하는 단계; 상기 시료를 처리하는 단계; 상기 처리된 시료를 NMT2 단백질에 대한 항체와 접촉시켜 상기 항체와 상기 처리된 시료 내에 존재하는 NMT2 단백질 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계로서, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하며; 및 선택적으로 대조군에 비해 상기 시료 내 NMT2 단백질의 양이 낮거나 없는 경우 상기 대상에게 상기 NMT1 억제제를 투여하는 단계.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상의 상기 시료에서 NMT2가 발현하는 지의 여부를 결정하는 상기 분석은, 상기 처리된 시료를 NMT2에 대한 항체와 접촉시켜 상기 항체와 상기 처리된 시료 내에 존재하는 NMT2 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 결합 어세이는 FACS(fluorescence activated cell sorting), 효소결합 면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 정량적 면역조직화학(quantitative immunohistochemistry), 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer), FRET(Forster resonance energy transfer), 생체분자 형광 상보(biomolecular fluorescence complementation), 질량분석(mass spectrometry), 면역법(immunoblot assay) 또는 공동면역침전법(coimmunoprecipitation assay)을 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 항체와 상기 시료 내 상기 NMT2 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)는 기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용된다.
구체적인 양태에 있어, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 암이 생긴 대상 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상으로부터 시료를 획득하는 단계; 상기 시료를 처리하는 단계; 상기 처리된 시료를 NMT2 핵산에 결합하는 검출가능한 표지와 접촉시켜 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 NMT2 핵산 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계로서, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하며; 상기 대상에게 NMT1 억제제를 투여하는 단계는 선택적으로 대조군에 비해 상기 시료 내 NMT2 단백질의 양이 낮거나 없는 경우에 권고된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 암이 생긴 대상 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상으로부터 시료를 획득하는 단계; 상기 시료를 처리하는 단계; 상기 처리된 시료를 NMT2 핵산에 결합하는 검출가능한 표지와 접촉시켜 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 NMT2 핵산 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계로서, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하며; 및 선택적으로 대조군에 비해 상기 시료 내 NMT2 핵산의 양이 낮거나 없는 경우 상기 대상에게 NMT1 억제제를 투여하는 단계.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상의 상기 시료에서 NMT2가 발현하는 지의 여부를 결정하는 상기 분석은, 상기 처리된 시료를 NMT2 핵산에 결합하는 검출가능한 표지와 접촉시켜 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 NMT2 핵산 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 결합 어세이는 검출가능 표지-DNA 또는 RNA 프로브를 이용한 혼성화 어세이(hybridization assay)를 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 혼성화 어세이는 정량적 또는 반-정량적이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 혼성화 어세이는 RT-PCR, 인 시추 혼성화(in situ hybridization), RPA(RNA protection assay), cDNA 및 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이, RDA(representation difference analysis), 차별 표시법(differential display), EST 시퀀스 분석, SAGE(serial analysis of gene expression), 및 LMF(Luminex FlexMAP)를 갖는 다중 리게이션-매개 증폭(muiplex ligation-mediated amplification)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내 존재하는 NMT2 핵산 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)는 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용된다.
구체적인 양태에 있어, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 암이 생긴 대상 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상으로부터 시료를 획득하는 단계; 상기 시료를 처리하는 단계; 상기 처리된 시료를 상기 시료 내 미리스토일화된 단백질(myristoylated protein) 또는 아지도-비오틴 표지(azido-biotin labeled)된 미리스토일화된 단백질에 결합하는 항체와 접촉시켜 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 미리스토일화된 단백질 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계로서, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 미리스토일화(myristoylation) 프로파일을 생성하며; 상기 대상에게 NMT1 억제제를 투여하는 단계는 선택적으로 대조군에 비해 상기 미리스토일화 프로파일이 상기 암은 NMT2-결손(deficient)임을 가리키는 경우에 권고된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 암이 생긴 대상 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상으로부터 시료를 획득하는 단계; 상기 시료를 처리하는 단계; 상기 처리된 시료를 상기 시료 내 미리스토일화된 단백질(myristoylated protein) 또는 아지도-비오틴 표지(azido-biotin labeled)된 미리스토일화된 단백질에 결합하는 항체와 접촉시켜 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 미리스토일화된 단백질 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계로서, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 미리스토일화(myristoylation) 프로파일을 생성하며; 선택적으로 대조군에 비해 상기 미리스토일화 프로파일이 상기 암은 NMT2-결손(deficient)임을 가리키는 경우 상기 대상에게 NMT1 억제제를 투여하는 단계.
구체적인 양태에 있어, 상기 처리하는 단계는 상기 시료를 ω-알키닐-미리스테이트(ω-alkynyl-myristate) 및 데스티오비오틴 아지도-PEG 비오틴(desthiobiotin azido-PEG biotin)으로 처리하는 단계를 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 결합 어세이는 FACS(fluorescence activated cell sorting), 효소결합 면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 정량적 면역조직화학(quantitative immunohistochemistry), 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer), FRET(Forster resonance energy transfer), 생체분자 형광 상보(biomolecular fluorescence complementation), 질량분석(mass spectrometry), 면역법(immunoblot assay) 또는 공동면역침전법(coimmunoprecipitation assay)을 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 항체와 상기 시료 내 상기 NMT2 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)는 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용된다.
구체적인 양태에 있어, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 NMT2-결손(deficient)인 암에 걸린 대상(subject)을 치료하기 위한 NMT 억제제의 용도를 제공한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 NMT 억제제는 NMT1 억제제이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 NMT1 억제제는 저분자, 항체, 펩티드 단편, 또는 핵산, 또는 이들의 조합을 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 저분자는 Tris-DBA, HMA 또는 DDD85646, DDD86481, 또는 이들의 유도체를 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 저분자는 DDD86481을 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 핵산은 dsRNA 분자, RNAi 분자, miRNA 분자, 리보자임, shRNA 분자, 또는 siRNA 분자를 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 NMT2-결손(deficient)인 암이 생긴 대상(subject) 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상을 치료하기 위한 NMT1 억제제의 용도를 제공하고, 상기 NMT1 억제제는 선택적으로 대조군에 비해 상기 대상의 시료 내 NMT2 단백질의 양이 낮거나 없는 경우의 용도로 권고되며, 상기 대상으로부터의 처리된 시료를 NMT2에 대한 항체와 접촉시켜 상기 항체와 상기 처리된 시료 내에 존재하는 NMT2 단백질 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하고; 상기 어세이 결과는 상기 시료 내 NMT2 단백질의 상기 양을 나타낸다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상의 상기 시료에서 NMT2가 발현하는 지 여부를 결정하는 상기 분석은, 상기 처리된 시료를 NMT2에 대한 항체와 접촉시켜 상기 항체와 상기 처리된 시료 내에 존재하는 NMT2 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 결합 어세이는 FACS(fluorescence activated cell sorting), 효소결합 면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 정량적 면역조직화학(quantitative immunohistochemistry), 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer), FRET(Forster resonance energy transfer), 생체분자 형광 상보(biomolecular fluorescence complementation), 질량분석(mass spectrometry), 면역법(immunoblot assay) 또는 공동면역침전법(coimmunoprecipitation assay)을 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 항체와 상기 시료 내 상기 NMT2 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)는 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용된다.
구체적인 양태에 있어, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 암이 생긴 대상(subject) 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상을 치료하기 위한 NMT1 억제제의 용도를 제공하고, 상기 NMT1 억제제는 선택적으로 대조군에 비해 상기 대상의 시료 내 NMT2 단백질의 낮거나 없는 경우의 용도로 권고되며, 상기 대상으로부터의 처리된 시료를 NMT2 핵산에 결합하는 검출가능한 표지와 접촉시켜 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내 NMT2 핵산 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상의 상기 시료에서 NMT2가 발현하는 지의 여부를 결정하는 상기 분석은, 상기 처리된 시료를 NMT2 핵산에 결합하는 검출가능한 표지와 접촉시켜 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 NMT2 핵산 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 결합 어세이는 검출가능 표지-DNA 또는 RNA 프로브를 이용한 혼성화 어세이(hybridization assay)를 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 혼성화 어세이는 정량적 또는 반-정량적이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 혼성화 어세이는 RT-PCR, 인 시추 혼성화(in situ hybridization), RPA(RNA protection assay), cDNA 및 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이, RDA(representation difference analysis), 차별 표시법(differential display), EST 시퀀스 분석, SAGE(serial analysis of gene expression), 및 LMF(Luminex FlexMAP)를 갖는 다중 리게이션-매개 증폭(muiplex ligation-mediated amplification)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내 존재하는 NMT2 핵산 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)는 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용된다.
구체적인 양태에 있어, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 암이 생긴 대상(subject) 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상을 치료하기 위한 NMT1 억제제의 용도를 제공하고, 상기 NMT1 억제제는 선택적으로 대조군에 비해 상기 대상의 시료로부터의 상기 미리스토일화 프로파일이 상기 암은 NMT2-결손(deficient)임을 가리키는 경우의 용도로 권고되며, 처리된 시료를 상기 시료 내 미리스토일화된 단백질(myristoylated protein) 또는 아지도-비오틴 표지(azido-biotin labeled)된 미리스토일화된 단백질에 결합하는 항체와 접촉시켜 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 미리스토일화된 단백질 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하고, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 미리스토일화(myristoylation) 프로파일을 생성한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 처리하는 단계는 상기 시료를 알키닐-미리스테이트(alkynyl-myristate) 및 데스티오비오틴 아지도-PEG 비오틴(desthiobiotin azido-PEG biotin)으로 처리하는 단계를 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 결합 어세이는 FACS(fluorescence activated cell sorting), 효소결합 면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 정량적 면역조직화학(quantitative immunohistochemistry), 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer), FRET(Forster resonance energy transfer), 생체분자 형광 상보(biomolecular fluorescence complementation), 질량분석(mass spectrometry), 면역법(immunoblot assay) 또는 공동면역침전법(coimmunoprecipitation assay)을 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 항체와 상기 시료 내 상기 NMT2 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)는 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용된다.
구체적인 양태에 있어, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 다른 양태에 있어, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, NMT1 억제제로 치료하는데 적합한 대상을 식별하는 방법을 제공한다: 암이 생긴 대상 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상으로부터 시료를 획득하는 단계; 상기 시료를 처리하는 단계; 상기 처리된 시료를 NMT2에 대한 항체와 접촉시켜 상기 항체와 상기 처리된 시료 내에 존재하는 NMT2 단백질 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계로서, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하며; 상기 NMT1 억제제를 이용하는 치료는 선택적으로 대조군에 비해 상기 시료 내 NMT2 단백질의 양이 낮거나 없는 경우에 권고된다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상의 상기 시료에서 NMT2가 발현하는 지의 여부를 결정하는 상기 분석은, 상기 처리된 시료를 NMT2에 대한 항체와 접촉시켜 상기 항체와 상기 처리된 시료 내에 존재하는 NMT2 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 결합 어세이는 FACS(fluorescence activated cell sorting), 효소결합 면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 정량적 면역조직화학(quantitative immunohistochemistry), 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer), FRET(Forster resonance energy transfer), 생체분자 형광 상보(biomolecular fluorescence complementation), 질량분석(mass spectrometry), 면역법(immunoblot assay) 또는 공동면역침전법(coimmunoprecipitation assay)을 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 항체와 상기 시료 내 상기 NMT2 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)는 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용된다.
구체적인 양태에 있어, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, NMT1 억제제로 치료하는데 적합한 대상을 식별하는 방법을 제공한다: 암이 생긴 대상 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상으로부터 시료를 획득하는 단계; 상기 시료를 처리하는 단계; 상기 처리된 시료를 NMT2 핵산에 결합하는 검출가능한 표지와 접촉시켜상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 NMT2 핵산 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계로서, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하며; 상기 대상에게 NMT1 억제제를 투여하는 단계는 선택적으로 대조군에 비해 상기 시료 내 NMT2 단백질의 양이 낮거나 없는 경우에 권고된다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상의 상기 시료에서 NMT2가 발현하는 지의 여부를 결정하는 상기 분석은, 상기 처리된 시료를 NMT2 핵산에 결합하는 검출가능한 표지와 접촉시켜 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 NMT2 핵산 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 결합 어세이는 검출가능하게 표지된-DNA 또는 RNA 프로브를 이용한 혼성화 어세이(hybridization assay)를 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 혼성화 어세이는 정량적 또는 반-정량적이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 혼성화 어세이는 RT-PCR, 인 시추 혼성화(in situ hybridization), RPA(RNA protection assay), cDNA 및 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이, RDA(representation difference analysis), 차별 표시법(differential display), EST 시퀀스 분석, SAGE(serial analysis of gene expression), 및 LMF(Luminex FlexMAP)를 갖는 다중 리게이션-매개 증폭(muiplex ligation-mediated amplification)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내 존재하는 NMT2 핵산 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)는 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용된다.
구체적인 양태에 있어, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, NMT1 억제제로 치료하는데 적합한 대상을 식별하는 방법을 제공한다: 암이 생긴 대상 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상으로부터 시료를 획득하는 단계; 상기 시료를 처리하는 단계; 상기 처리된 시료를 상기 시료 내 미리스토일화된 단백질(myristoylated protein) 또는 아지도-비오틴 표지(azido-biotin labeled)된 미리스토일화된 단백질에 결합하는 항체와 접촉시켜 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 미리스토일화된 단백질 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계로서, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 미리스토일화(myristoylation) 프로파일을 생성하며; 상기 대상에게 상기 NMT1 억제제를 투여하는 단계는 선택적으로 대조군에 비해 상기 미리스토일화 프로파일이 상기 암은 NMT2-결손(deficient)임을 가리키는 경우에 권고된다.
구체적인 양태에 있어, 상기 처리하는 단계는 상기 시료를 알키닐-미리스테이트(ω-alkynyl-myristate) 및 데스티오비오틴 아지도-PEG 비오틴(desthiobiotin azido-PEG biotin)으로 처리하는 단계를 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 혼성화 어세이는 RT-PCR, 인 시추 혼성화(in situ hybridization), RPA(RNA protection assay), cDNA 및 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이, RDA(representation difference analysis), 차별 표시법(differential display), EST 시퀀스 분석, SAGE(serial analysis of gene expression), 및 LMF(Luminex FlexMAP)를 갖는 다중 리게이션-매개 증폭(muiplex ligation-mediated amplification)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내 존재하는 NMT2 핵산 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)를 이용하여 상기 시료 내 복합체의 양을 결정한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
구체적인 양태에 있어, 상기 대상은 인간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는, NMT1 억제제로 치료하는데 적합한 대상 식별용 키트를 제공한다: NMT2에 대한 항체; 제 68 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 상기 대상을 식별하기 위한 사용설명서.
구체적인 양태에 있어, 상기 키트는 추가적으로 대조군을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는, NMT1 억제제로 치료하는데 적합한 대상 식별용 키트를 제공한다: NMT2에 결합하는 핵산; 제 75 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 상기 대상을 식별하기 위한 사용설명서.
구체적인 양태에 있어, 상기 키트는 추가적으로 대조군을 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 핵산은 RNA 또는 DNA이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는, NMT1 억제제로 치료하는데 적합한 대상 식별용 키트를 제공한다: NeutrAvidinTM-HRP; 및 제 84 항 내지 제 90 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 상기 대상을 식별하기 위한 사용설명서.
구체적인 양태에 있어, 상기 키트는 추가적으로 대조군을 포함한다.
구체적인 양태에 있어, 상기 키트는 추가적으로 ω-알키닐-미리스테이트(ω-alkynyl-myristate) 및 데스티오비오틴 아지도-PEG 비오틴(desthiobiotin azido-PEG biotin)을 포함한다.
본 명세서에서 본 발명의 암에 걸린 대상(subject)의 치료를 위한 화합물, 조성물 및 방법은 하기와 같이 상세하게 설명된다. 또한, 본 명세서에서 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법으로 치료하기에 적합한 암에 걸린 대상을 식별하는 방법이 설명된다. 또한, 암에 걸린 대상을 식별하는 방법이 설명된다.
본 발명은 NMT-결손(deficient)인 암을 치료하는 방법 및 조성물을 제공한다. NMT-결손인 암은 NMT2-또는 NMT1-결손인 암을 포함한다. 구체적인 예로는, 상기 NMT-결손인 암은 NMT2-결손인 암이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "암"은 세포의 비정상적인 통제불가능한 성장에 기인한 다양한 조건들을 의미한다. 암을 유발할 수 있는 세포는, "암세포"로 불리며, 불멸성, 전이 가능성, 빠른 성장 및 증식 속도 및/또는 특정의 전형적인 형태학적 특징과 같은 특성들을 갖는다. 암세포는 종양의 형태일 수 있으나, 이러한 세포는 대상 내에서 단독으로 존재할 수 있거나, 비-종양형성 암세포 일 수도 있다. 암은 암을 검출할 수 있는 어떠한 방법으로도 검출될 수 있으며, 예컨대, 종양의 존재 또는 종양을 검출하는 방법(예컨대, 임상 또는 방사선적 수단에 의하여), 종양 내 또는 다른 생물학적 시료로부터 세포를 검사하는 방법(예컨대, 조직 생검), 암을 나타내는 혈액 마커를 측정하는 방법 및 암을 나타내는 유전자형을 검출하는 방법을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 상기 검출 방법 중 하나 이상에서의 음성인 결과가 반드시 암의 부재를 나타내는 것은 아니다. 예컨대, 차후 재발로 입증된 바와 같이, 암 치료에 완전한 반응을 보인 환자가 여전히 암을 가지고 있을 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 암은 림프종이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "림프종"은 림프계의 B 또는 T 세포의 악성 성장을 의미한다. "림프종"은 호지킨 림프종과 비호지킨 림프종을 비롯한 악성 성장의 다양한 유형을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "비-호지킨 림프종"은 호지킨 림프종을 제외한 림프계의 B 또는 T 세포의 악성 성장을 의미한다(암에 걸린 부위 내에서 발견되는 리드-스턴 버그 세포와 같은 특징을 나타낸다). 비-호지킨 림프종은 림프종의 29 종류 이상을 포함하며, 암 세포의 종류 에 근거하여 그 차이를 구별한다.
본 발명의 보다 구체적인 실시예에서, 상기 암은 B 세포 림프종(B cell lymphoma)이다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법은 B 세포 림프종에 걸린 대상의 치료에 적합하다.
B 세포 림프종은, 예컨대, 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 및 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma)과 같은 소아 림프종(pediatric lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 전구체(precursor) B-LBL, 전구체 T-LBL, 및 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma)의 치료에 고려된다.
다른 구현예에서, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상(subject)"은 동물을 의미하며, 예컨대, 고양이, 개 등과 같은 사육동물, 가축(예컨대, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 실험 동물(예컨대, 마우스, 토끼, 쥐, 기니피그 등), 포유 동물, 인간 이외의 포유 동물, 영장류, 인간 이외의 영장류, 설치류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 및 기타 동물을 포함할 수 있다. 구체적인 예에서, 상기 대상은 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 임상 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 결과를 얻는 것을 의미한다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는, 하나 이상의 증상이나 조건의 완화 또는 개선, 질환 정도의 감소, 질환의 안정상태(즉, 악화되지 않음), 질환의 확산, 질환 진행의 진연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 질환 재발의 감소, 및 질환의 차도(부분 또는 일부)를 감지하는지의 여부를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, "치료"는 치료를 받지 못하는 경우의 예상 생존율에 비해 생존율이 연장되는 것을 의미할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "치료"는 예방적 치료를 포함한다. 예를 들어, 암이 초기 림프종인 대상은, 더 이상의 진행을 방지하거나, 또는 재발을 방지하기 위하여 본 발명의 화합물 또는 조성물로 치료 받을 수 있다.
본 명세서에서, B 세포 림프종 세포들이 NMT1은 발현하나, NMT2는 발현하지 않는다는 것을 보여준다. 이것은 NMT1 및 NMT2을 모두 발현하는 백혈병 및 다른 세포들과는 대조적인 결과이다(도 1 및 도 4에 도시).
추가적으로, 이것은 B 림프종 세포들이 NMT 억제제에 의한 세포 생존율의 저해에 민감하다는 것을 보여준다.
일 실시예에서, NMT 억제제는 Tris-DBA이다(도 2).
다른 실시예에서, NMT-2 억제제인 2-HMA(hydroxymyristae)를 이용하여 B 림프종 세포를 억제하였다.
또 다른 실시예에서, T. brucie NMT [J.A.Frearson 등 (2010) Nature. 464.728-723)]의 피라졸 설포나미드(pyrazole sulphonamide) 저해제(DDD85646)를 이용하여 B 림프종 세포를 억제하였다(도 5).
또 다른 실시예에서, 상기 억제제는 DDD86481이다.
구체적인 실시예에서, B 림프종에 걸린 대상의 치료는 NMT 억제제를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하여 구성된다.
본 발명의 NMT 억제제 화합물 또는 이의 유도체는 NMT2-결손인 암의 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "결손(deficient)"은 광범위하게, 예컨대, NMT 단백질의 합성, 수준, 활성, 또는 기능(예컨대, NMT1 또는 NMT2)의 유도 또는 자극의 저해뿐 만 아니라, NMT 합성, 수준, 활성, 또는 기능의 억제, 감소 또는 소멸(야생형 또는 대조군 시료와 비교하여)를 의미한다. 또한, 상기 용어는 NMT의 합성, 수준, 활성, 또는 기능을 조절할 수 있는 모든 대사 또는 조절 기작을 의미한다. 또한, 상기 용어는 다른 분자와의 결합 및 복합체 형성으로 인한 억제, 감소 또는 소멸을 포함한다. 따라서, 용어 "NMT 결손"은 단백질 기능 또는 단백질 기작 기능의 억제, 감소, 또는 소멸을 초래하는 것을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 이러한 기능 각각이 동시에 억제되어야 하는 것을 의미하지는 않는다.
일부 실시예에서, 암은 NMT 유전자 상 돌연변이의 존재를 확인함으로써 NMT이 결손된 것으로 식별 될 수 있다. 이러한 핵산 검출 및 증폭 방법은 당업계의 숙련된 당업자에게 잘 알려져 있다.
예를 들면, 증폭시키고자 하는 핵산은 생물학적 시료로부터 획득될 수 있다. 다양한 추출 방법(예컨대, 페놀, 클로로포름 추출)은 DNA 또는 RNA를 분리 하기에 적합하다. 시료로부터 추출된 핵산은 당업계에 잘 알려진 핵산 증폭 기술을 이용하여 증폭 될 수 있다. 비 제한적인 예로는, PCR (polymerase chain reaction), RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction), 네스티드 PCR, 리가제 연쇄 반응, 엠플리피에이블 RNA 리포터(amplifiable RNA reporters), Q-베타 복제, 전사-기반 증폭, 부메랑 DNA 증폭, 가닥 치환 활성, 사이클링 프로브 기술, 아이소더말(isothermal) 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA)을 포함하거나, 또는 기타 서열 복제 방법 또는 시그널 증폭 방법을 이용할 수 있다.
증폭 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 방법은 cDNA에 대한 RNA의 역전사를 이용한다.
일 실시예에서, PCR을 이용하여 목적의 타겟 서열, 예컨대, NMT2 서열을 증폭시킨다.
핵산은 검출 이전에 증폭하거나, 또는 증폭 단계 동안 직접적으로 검출할 수 있다(예컨대, "실-시간"방법). 일부 실시예에서, 표지된 프라이머를 이용하여 타겟 서열을 증폭시켜서, 상기 결과물인 엠플리콘(amplicon)이 검출되도록 표지된다. 일부 실시예에서, 프라이머는 형광 표지된다. 일부 실시예에서, 타겟 서열을 증폭시키고, 상기 결과물인 앰플리콘을 전기 영동으로 검출한다.
유전자 발현 수준은 시료 내 NMT2 mRNA의 양을 평가함으로써 결정될 수 있다. 시료 내 mRNA를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. mRNA 수준을 측정하기 위해 시료 내 세포를 용해시킬 수 있으며, 용해물 내 mRNA 수준 또는 용해물로부터 정제된 RNA 또는 반-정제된 RNA의 수준은 당업자에게 알려진 어떠한 다양한 방법으로도 측정될 수 있다. 이러한 방법은 제한 없이, 검출가능하도록 표지된 DNA 또는 RNA 프로브를 이용하는 혼성화 방법, 예컨대, 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 노던 블롯팅, 또는 정량적 또는 반-정량적 RT-PCR 방법들을 포함한다. 택일적으로, 예컨대, 조직 절편 또는 용해시키지 않은 세포 현탁액, 및 검출 가능하도록 표지된 DNA 또는 RNA 프로브(예를 들어 형광, 또는 효소-표지)를 이용하여 정량적 또는 반-정량적 인 시추 혼성화 방법을 실시할 수 있다. mRNA의 정량화를 위한 추가적인 방법은 RPA(RNA protection assay), cDNA 및 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이, RDA(representation difference analysis), 차별 디스플레이(differential display), EST 서열 분석, SAGE (serial analysis of gene expression), 및 LMF(Luminex FlexMAP)를 이용한 다중 리게이션-매개 증폭을 포함한다.
또한, 증폭은 "실-시간" 방법을 이용하여 모니터링 할 수 있다. 실시간 PCR은 타겟 핵산의 검출 및 정량이 가능하다. 일반적으로, 이러한 정량적 PCR에 대한 접근법은 SYBR Green.RTM I와 같은 이중-가닥 특이 염료인 형광 염료를 이용한다. 그 대신에, 다른 형광 염료, 예를 들면, FAM 또는 HEX를 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머에 결합시킬 수 있다. 실시간 PCR을 수행할 수 있는 다양한 기기가 당업계에 공지되어 있다. 각 사이클에서 발생된 형광 신호는 PCR 산물의 양에 비례한다. 사이클 횟수 대비 형광의 플롯을 이용하여 증폭의 동역학을 설명하고, 형광 임계 수준을 이용하여 초기 주형 농도와 관련된 소수의 사이클 수를 정의한다. 열 사이클링 동안 형광을 판독할 수 있는 기기에서 증폭을 실시하여 검출하는 경우, 멜팅 분석을 이용하여 비-특이적 PCR 산물로부터 상기 의도된 PCR 산물을 구별할 수 있다. 증폭 및 시그널 발생 이후 점차 반응 온도가 증가하는 동안의 형광 차이를 측정하여, 비특이적 산물의 △ct 뿐만 아니라 의도된 산물의 △ct을 결정하는 것이 가능하다.
상기 방법은 시료 내 다수의 핵산을 증폭할 수 있는 것을 포함하며, 또한 이는 "다중 검출" 또는 "멀티플렉싱"으로 알려져 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "멀티플렉스 PCR"은 하나 이상의 타겟 유전자 마커들로부터 다수의 핵산을 포함한 다수의 핵산들을 검출 및 정량하기 위해 상기 반응물에 하나 이상의 프라이머 세트를 추가하는 것을 포함하는 PCR을 의미한다. 또한, 내부 대조군, (예컨대, 18s rRNA, GADPH, 또는 베타-액틴)을 이용하는 멀티플렉싱은 반응 없이 PCR에 대한 대조군을 제공한다.
일부 실시예들에서, NMT 유전자의 후성적인 불활성화 또는 단백질 기능의 상실을 결정함으로써, 암이 NMT-결손인 것으로 식별할 수 있다.
일부 실시예들에서, 대상의 세포 시료 내 NMT(NMT1 또는 NMT2 포함)의 활성을 결정함으로써, 암이 NMT-결손인 것으로 식별할 수 있다. 대조군에 대하여 상대적으로 활성을 결정할 수 있으며, 예컨대, 결손인 암 세포의 경우, 비-암세포에 상대적이고, 바람직하게는 동일한 조직이다. 따라서, NMT-결손인 암은 NMT 활성 및/또는 발현이 감소 또는 소멸되었을 수 있다. NMT의 활성은 당업계에 잘 알려진 기술을 이용하여 결정될 수 있다. 이러한 예들에서, NMT-결손인 암은 감소 또는 소멸된 활성을 갖는다.
일부 실시예들에서, NMT 단백질(들)의 양, 농도 및/또는 수준을 결정함으로써, 암이 NMT(예컨대, NMT1, NMT2 또는 둘다)-결손인 것으로 식별할 수 있다.
일부 실시예들에서, 암에 걸린 대상 또는 암에 걸린 것으로 추정되는 대상의 생물학적 시료 내 미리스토일화된 단백질의 양을 결정함으로써, 암이 NMT-결손인 것으로 식별할 수 있다. 이 실시예에서, 미리스토일화된 단백질의 존재 유무 또는 양은, 예컨대, 적합한 지방산 아날로그를 이용하는 클릭 화학을 이용함으로써, 결정할 수 있다. 비-제한적인 방법은 본 명세서의 실험물질 및 실험방법에 서술하였다. 미리스토일화된 단백질의 존재 유무 또는 양을 결정하는 택일적인 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 미리스토일화된 단백질 양이 감소된 시료(임의의 대조군에 비교하여)는 NMT-결손인 시료 또는 NMT-결손인 암을 나타낸다. 일부 실시예들에서, 미리스토일화된 단백질 양이 감소된 시료는 NMT2-결손인 시료 또는 NMT2-결손인 암을 나타낸다.
일부 실시예들에서, 암에 걸린 대상 또는 암에 걸린 것으로 추정되는 대상의 생물학적 시료 내 아실화된 단백질의 양을 결정함으로써, 암이 NMT-결손인 것으로 식별할 수 있다. 이 실시예에서, 아실화된 단백질의 존재 유무 또는 양은, 당업자에게 알려진 방법들을 이용함으로써, 결정할 수 있다. 아실화된 단백질 양이 감소된 시료(임의의 대조군에 비교하여)는 NMT-결손인 시료 또는 NMT-결손인 암을 나타낸다. 일부 실시예들에서, 아실화된 단백질 양이 감소된 시료는 NMT2-결손인 시료 또는 NMT2-결손인 암을 나타낸다.
일부 실시예들에서, 돌연변이 및 다형성과 같은 하나 이상의 서열 변이(variation)의 존재 유무를 결정함으로써, 암이 NMT-결손인 것으로 식별할 수 있다. 다형성은 야생형 뉴클레오티드 서열에 비해 상대적으로 하나 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 포함 할 수 있다. 하나 이상의 변이는 핵산 서열의 코딩 또는 비-코딩 부위일 수 있으며, 이는 NMT의 발현 또는 기능을 감소시키거나 폐지시킬 수 있다. 따라서, 변이체 핵산은 감소되거나 폐지된 활성을 갖는 변이체 폴리펩티드를 코딩할 수 있거나, 또는 예컨대, 조절 요소의 변형된 활성을 통해서 세포 내에서 거의 발현되지 않거나 아예 발현되지 않는 야생형 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
일부 실시예에서, 효과적으로 또는 음성적으로 NMT의 발현을 조절하는 유전자를 결정함으로써 암이 NMT-결손인 것으로 식별할 수 있다.
다양한 방법을 이용하여 대상으로부터 채집된 시료 내 특정 핵산서열의 존재 유무를 결정할 수 있다.
일부 실시예에서, NMT 기작의 구성요소의 NMT 양성 또는 음성 조절자의 발현 또는 활성 수준을 평가함으로써, 암이 NMT-결손인 것으로 식별할 수 있다. 발현 수준은 예컨대, 면역블롯팅 및 ELISA와 같은 면역분석법, 및 RT-PCR, 나노스트링 기술, RNA-서열, 핵산 혼성화 또는 핵형 분석과 같은 핵산 검출 방법들을 이용하여 결정할 수 있다.
일부 실시예들에서, 개별 세포 시료 내 하나 이상의 변이, 예컨대, NMT의 다형성 또는 돌연변이의 존재를 결정함으로써, 암이 NMT-결손인 것으로 식별할 수 있다.
또한, 암과 관련된 돌연변이 및 다형성은 변이체(즉, 돌연변이체 또는 대립유전자 변이체) 폴리펩티드의 존재를 결정함으로써, 단백질 수준에서 검출할 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 암에 걸린 대상을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 암은 NMT2-결손 암세포를 포함하며, 상기 대상에게 NMT 억제제 및/또는 NMT 1 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "억제" 또는 "억제제"는 목적의 단백질, 예컨대, NMT2 단백질의 합성, 수준, 활성, 또는 기능의 유도 또는 자극을 억제하는 방법뿐만 아니라 단백질 합성, 수준, 활성 또는 기능을 억제하는 모든 방법 또는 기술을 의미한다. 또한 상기 용어는 목적 단백질, 예를 들어 NMT2의 합성, 수준, 활성, 또는 기능을 조절할 수 있는 모든 대사 또는 조절 기작을 의미한다. 또한, 상기 용어는 다른 분자와의 결합 및 복합체 형성으로 인한 억제, 감소 또는 소멸을 포함한다. 따라서, 상기 용어 "억제"는 단백질 기능 또는 단백질 기작 기능의 억제를 초래하는 모든 시약 또는 화합물, 응용법을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 이러한 기능 각각이 동시에 억제되어야 하는 것을 의미하지는 않는다.
다른 실시예에서, 본 발명은 암에 걸린 대상을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 암은 NMT1-결손(deficient)인 암 세포를 포함하며, 상기 대상에게 NMT 억제제 및/또는 NMT 2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시예들에서, 치료 방법들은 대상에게 본 발명의 화합물의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 선택적으로 단일투여로 구성하거나, 또는 택일적으로 일련의 응용을 포함한다. 구체적인 실시예에서, 상기 화합물은 NMT 억제제인 NMT1 억제제 및/또는 NMT2 억제제이다.
보다 구체적인 실시예에서, NMT 억제제는 Tris-DBA, HMA, DDD85646, DDD86481, 또는 이들의 유도체이다.
다른 실시예들에서, 상기 화합물 및/또는 조성물은 대상에게 투여하기에 적합한 약학적 유효량을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적 유효량"은 연구자 또는 임상의에 의해 추구되는 조직, 체계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출하게 하는 약물 또는 약제의 양을 의미한다. 이 양은 치료적 유효량일 수 있다.
상기 화합물 및 조성물은 약학적으로 허용 가능한 형태로 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적 허용가능"은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 대상의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 포함한다. 또한, 각각 담체, 부형제 등은 제형의 다른 성분과 호환가능하다는 의미에서 "허용 가능"하다.
투여되는 실제 양, 투여 속도 및 시간은 처리되는 특성 및 정도에 따라 달라진다. 치료 처방, 예를 들면, 투여량에 대한 결정은 일반의 및 기타 의료 박사의 책임이며, 일반적으로 일반의에게 공지된 치료 가능 질환, 개별 환자의 상태, 전달 위치, 투여 방법 및 기타 요인들을 고려하여야 한다.
본 발명의 화합물 또는 조성물은 치료 조건에 따라 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여, 동시에 또는 순차적으로 투여 될 수 있다.
상기 제형은 편리하게 단위 투여 형태로 제공 될 수 있으며, 약학분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조 될 수 있다. 이러한 방법은 하나 이상의 부속 성분을 구성 할 수 있는 담체와 관련 있는 활성 화합물을 가져오는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 액체 담체 또는 미세하게 분할된 고체 담체 또는 둘 다와 관련 있는 활성 화합물을 포함하여 균일하고 상세하게 제조된 후, 필요에 따라 결과물을 성형한다.
상기 화합물 및 조성물은 체계적/국소적 또는 원하는 위치에 대상에게 편리한 투여 경로로 투여될 수 있으며, 경구(예를 들어 섭취); 국소(예를 들어, 경피, 비강, 안구, 구강 및 설하), 폐(예를 들어 입과 코를 통한 에어로졸과 같은 흡입 또는 통기 치료법); 직장; 질; 비경, 정맥, 동맥, 심장내, 경막내, 척수내, 관절내, 낭하, 안와, 복강, 기관내, 피내, 지주막하, 및 흉골, 저장소/ 예를 들어, 피하 또는 근육내이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여에 적합한 제제는 캡슐, 카켓 또는 정제; 분말 또는 과립; 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액; 또는 오일 또는 유화액; 알약; 연약; 또는 페이스트로서 활성 화합물의 소정의 양을 포함하는 개별 단위로서 제조 될 수 있다.
비경구투여(예컨대, 피부, 피하, 근육 내, 정맥 내 및 피내 주사)에 적합한 제형은 수성 및 비-수성 등장성, 발열원-제거, 산화 방지제, 완충제, 보존제, 안정화제, 정균제, 및 환자의 혈액으로 등장성제(formulation isotonic)를 녹인 용질을 포함하는 멸균 주사 용액; 그리고 현탁화제 및 증점제, 및 리포좀 또는 혈액이나 하나 또는 그 이상의 기관에 대한 화합물을 타겟하기 위하여 설계된 다른 마이크로 입자 시스템을 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균현탁제을 포함한다. 이러한 제제에 사용하기에 적합한 등장성 매개체의 예로는 염화나트륨 주사, 링거액 주사, 또는 락 테이트 링거액 주사를 포함한다.
제형은 단위 투여 또는 밀봉된 용기의 다중 투여, 예를 들어, 앰플 및 바이알로 제조 될 수 있으며, 예컨대, 주사를 사용하기 직전에 물과 같은 멸균 액체 담체의 첨가만을 요구하는 동결 건조(동결) 상태로 저장 될 수 있다. 즉석 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조 될 수 있다. 제제는 활성 화합물이 혈액 성분 또는 하나 이상의 장기를 타겟팅하도록 설계된 리포좀 또는 다른 미세입자 약물전달체 형태일 수 있다.
본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 조성물은 표준 화학 요법 체제 또는 방사선 요법과 함께 조합하여 본 명세서에 기재된 방법에 이용 될 수 있다.
림프종 환자의 경우, 공지된 치료법들은 치료하고자 하는 대상, 질환의 종류 및 상태에 따라 달라진다. 기존의 림프종 치료 방식은 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 공지된 치료법들을 본 명세서에 개시된 NMT 억제제들과 함께 이용할 수 있다.
림프종의 치료에 이용하기 위해 일반적인 약의 조합, 예컨대, CHOP (즉, 시클로포스파미드, 독소루비신, 프로카바진, 블레오마이신, 빈크리스틴 및 프레드니손), GAP-BOP(즉, 시클로포스파미드, 독소루비신, 프로카바진, 블레오마이신, 빈크리스틴 및 프레드니손), m-BACOD(즉, 메토트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 덱사메타손 및 류코보린), ProMACE-MOPP(즉, 프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에토포시드, 기준 MOPP와 류코보린), ProMACE-CytaBOM(프레드니손, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에토포시드, 시타라빈, 블레오마이신, 빈크리스틴, 메토트렉세이트, 및 류코보린), 및 MACOP-B(메토트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손, 블레오마이신, 및 류코보린)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 재발된 공격적인 비-호지킨 림프종에 대한 하기와 같은 화학 요법제와 본 발명의 화합물 및 조성물을 조합하여 이용할 수 있다: 1MVP-16(즉, 이포스파미드, 메토트렉세이트, 및 에토포시드), MIME(즉, 메틸-gag, 이포스파미드, 메토트렉세이트, 및 에토포시드), DHAP(즉, 덱사메타손, - 16 고용량 시타라빈, 및 시스플라틴), ESHAP(즉, 에토포시드, 메틸프레드니손, 고용량 시타라빈, 및 시스플라틴), CEFF(B)(즉, 시클로포스파미드, 에토포시드, 프로카바진, 프레드니손, 및 블레오마이신), 및 CAMP(즉, 로무스틴, 미톡산트론, 시타라빈, 및 프레드니손).
재발된 저항성 호지킨병과 같은 특정 림프종에 대한 구제 화학요법은, 예컨대, VABCD(즉, 빈블라스틴, 독소루비신, 다카바진, 로무스틴 및 블레오마이신), ABDIC (즉, 독소루비신, 블레오마이신, 다카바진, 로무스틴, 및 프레드니손), CBVD (즉, 로무스틴, 블레오마이신, 빈블라스틴, 덱사메타손), PCVP (즉, 빈블라스틴, 프로카바진, 시클로포스파미드, 및 프레드니손), CEP (즉, 로무스틴, 에토포시드, 및 프레드니무스틴), EVA (즉, 에토포시드, 빈블라스틴, 및 독소루비신), MOPLACE (즉, 시클로포스파미드, 에토포시드, 프레드니손, 메토트렉세이트, 시타라빈, 및 빈크리스틴), MIME (즉, 메틸-gag, 이포스파미드, 메토트렉세이트, 및 에토포시드), MINE (즉, mitoquazone, 이포스파미드, 비노렐빈, 및 에토포시드), MTX-CHOP (즉, 메토트렉세이트 및 CHOP), CEM (즉, 로무스틴, 에토포시드, 및 메토트렉세이트), CEVD (즉, 로무스틴, 에토포시드, vindesine, 및 덱사메타손), CAVP (즉, 로무스틴, melphalan, 에토포시드, 및 프레드니손), EVAP (즉, 에토포시드, 빈블라스틴, cytarabine, 및 cisplatin), 및 EPOCH (즉, 에토포시드, 빈크리스틴; 독소루비신, 시클로포스파미드, 및 프레드니손)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
암, 특히 B 세포 림프종의 치료를 위한 합성 치사 전략에 NMT1 또는 NMT2를 억제하는 다른 방법을 이용할 수 있다는 것은 자명하다. 예를 들어, NMTl 또는 NMT2의 발현은 안티센스 또는 RNAi의 기술을 이용하여 억제될 수 있다. 유전자 발현 및/또는 단백질 활성을 하향 조절하는 이러한 접근법의 사용은 숙련된 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명은 환자의 NMT2-억제제 및/또는 NMTl-억제제 치료 효과를 결정하는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명의 방법은, 암에 걸린 대상 또는 암에 걸린 것으로 추정되는 대상의 시료 내 NMTl 및/또는 NMT2의 존재 유무, 양 또는 농도를 분석 또는 측정하여 정성적 또는 정량적으로 결정하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법은, 암에 걸린 대상 또는 암에 걸린 것으로 추정되는 대상의 시료 내 미리스토일화된 단백질의 존재 유무, 양 또는 농도를 분석 또는 측정하여 정성적 또는 정량적으로 결정하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법은, 암에 걸린 대상 또는 암에 걸린 것으로 추정되는 대상의 시료 내 아실화된 단백질의 존재 유무, 양 또는 농도를 분석 또는 측정하여 정성적 또는 정량적으로 결정하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "시료"는 대상으로부터 획득되는 모든 시료를 의미하며, 암 세포를 포함하거나, 암 세포를 함유하고 있는 것으로 추정되는 유체, 세포 또는 조직 시료를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며, 이는 유전자 발현 수준, 단백질 수준, 효소 활성 수준 등을 분석하는데 이용된다. 시료는 예를 들어, 혈액 시료, 분별 혈액 시료, 골수 시료, 생검, 냉동 조직 시료, 신선한 조직 표본, 세포 시료 및/또는 파라핀 절편, 상대적인 mRNA 수준을 측정할 수 있을 정도로 충분한 양 및 질의 RNA를 추출할 수 있는 물질, 또는 상대적인 폴리펩티드 수준을 측정할 수 있을 정도로 충분한 양 및 질의 폴리펩티드를 추출할 수 있는 물질을 포함한다.
NMTl 또는 NMT2의 결정, 분석 또는 측정, 또는 NMTl 및/또는 NMT2의 존재 유무는 암 환자의 NMTl-억제제 또는 NMT2-억제제 치료의 효과와 연관 될 수 있다.
미리스토일화된 단백질의 결정, 분석 또는 측정, 또는 미리스토일화된 단백질의 존재 유무는 암 환자의 NMTl-억제제 또는 NMT2-억제제 치료의 효과와 연관 될 수 있다.
아실화된 단백질의 결정, 분석 또는 측정, 또는 미리스토일화된 단백질의 존재 유무는 암 환자의 NMTl-억제제 또는 NMT2-억제제 치료의 효과와 연관 될 수 있다.
구체적인 실시예에서, 본 발명의 항체는 면역반응 또는 면역특이적이며, 따라서, 특이 선택적으로 목적의 단백질, 예컨대, NMTl 또는 NMT2 단백질에 결합한다. 일 실시예에서, 인간 NMTl 또는 NMT2 단백질에 면역반응 및 면역특이적인 항체를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 인간 NMTl 또는 NMT2 단백질에 대한 항체는 면역특이적이다. 상기 용어 "항체" 및 "항체들"은 모노크로날 및 폴리크로날 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 실시예에서, 본 발명의 항체는 면역반응 또는 면역특이적이며, 따라서, 특이 선택적으로 NMTl 또는 NMT2 단백질 모두에 결합한다. 이러한 실시예에서, 인간 NMTl 및 NMT2 단백질 모두에 면역반응 및 면역특이적인 항체를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 인간 NMTl 또는 NMT2에 대한 항체는 면역특이적이다. 이러한 실시예에서, NMTl 및 NMT2의 상이한 분자량으로 인해, 예컨대, SDS-PAGE 및 면역 블롯팅과 같이 단일 항체를 이용하여 두 단백질의 존재 유무를 확인할 수 있다. 상기 용어 "항체" 및 "항체들"은 모노크로날 및 폴리크로날 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "특이적으로 결합"은 특정 폴리펩티드, 예를 들어, NMTl 또는 NMT2의 에피토프에 대한 항체의 높은 결합력 및/또는 친화력을 의미한다. 이러한 특정 폴리펩티드 상의, 특히 목적하고자 하는 특이적인 폴리펩티드로서 동일한 시료 내에서 결합하는 분자에 존재할 수 있는 에피토프에 대한 항체 결합은 다른 에피토프에 결합하는 것보다 강하다. 목적하고자 하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 약하게, 결합되지 않는 수준으로 다른 폴리펩티드와 결합할 가능성이 있다. 이러한 약한 결합 또는 백그라운드 결합은 당업자에게 알려져 있는 바와 같이 적합한 대조군을 이용하여 목적하고자 하는 화합물 또는 폴리펩티드에 대한 특이적 항체 결합과 쉽게 구별된다.
일 실시예에서, 암 세포를 함유한 시료 또는 암 세포를 함유한 것으로 추정되는 시료는 암에 걸린 대상로부터 얻어진다. 이러한 시료의 수집은 숙련된 당업자에게 잘 알려져 있다. 구체적인 실시예에서, 상기 시료는 혈액 시료이다. 또한, 시료 수집, 처리 및/또는 저장 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
구체적인 실시예에서, 시료 내 NMT1 또는 NMT2 단백질의 검출, 분석 또는 측정은 면역조직화학염색을 이용하여 실시한다. 보다 구체적인 실시예에서, 시료 내 NMT2의 검출, 분석 또는 측정은 면역조직화학염색을 이용하여 실시한다. 정성적 또는 정량적인 다른 면역 분석법을 본 발명에 이용할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
추가적인 실시예에서, 임의의 적합한 방법 또는 면역조직화학염색 시스템을 이용하여 면역조직화학염색(immunohistochemistry, IHC)을 달성할 수 있다. 비제한적인 예로는 자동화 시스템, 정량화 IHC, 반정량화 IHC, 및 수동적 방법을 포함한다.
용어 "정량화" 면역조직화학염색은 항원 또는 다른 단백질과 같은 특정 바이오 마커의 존재를 식별하고 정량화하기 위하여 면역조직화학염색을 진행한 시료를 스캐닝 및 수치화하는 자동화된 방법을 의미한다. 예를 들어, NMT1 및/또는 NMT2을 정량한다. 시료에 대해 주어진 점수는 시료의 면역조직화학염색 강도의 수치적 표현이고, 시료에 존재하는 타겟 바이오 마커(예를 들어 NMT1 또는 NMT2)의 양을 나타낸다. 본 명세서에 이용된 바와 같이, 광학 밀도(OD)는 염색 강도뿐만 아니라 염색된 세포의 비율을 나타내는 수치적 점수이다. 본 명세서에 이용된 바와 같이, 반-정량화 면역조직화학염색은 인간의 눈에 의한 면역조직화학염색 결과의 수치화를 의미하며, 숙련된 당업자가 숫자적으로 결과를 기록한다(예를 들면, 0 [약하거나 비염색], 1 또는 2 [강한 염색]).
면역조직화학염색에 사용하기에 적합한 자동화된 시료 처리, 스캐닝 및 분석 시스템은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 자동화된 염색 및 현미경 검사, 컴퓨터화된 영상 분석, 일련의 절편 비교(시료의 방위 및 크기에 있어 변경 조절용), 디지털 리포트 생성, 및 시료(예를 들어, 조직 절편이 배치된 슬라이드)의 보관 및 추적을 포함할 수 있다. 면역염색된 시료를 포함한 세포 및 조직 상에서의 정량적인 분석을 실시하기 위하여 세포 내 이미징 시스템은 종래 광학 현미경을 디지털 이미지 처리 시스템과 결합하여 상업적으로 이용가능하다.
실질적으로, 환자 시료가 낮은(예를 들면, 약하거나 없음) NMT2 종양 염색을 갖는 것으로 결정된 실시예에서, 상기 환자는 NMT1 억제제 치료에 대한 좋은 후보로 간주된다. 다른 구체적인 실시예에서, 높은(예를 들어, 강함) NMT2 종양 염색을 갖는 것으로 결정된 환자는 NMT1 억제제 치료에 대한 불량한 후보로 간주된다.
IHC 음성 vs 양성 결정에 대한 커트 포인트는 반-정량적 결정이고, 반-정량적 방법 및 광학 현미경을 사용하여 숙련된 병리학자에 의해 이루어진다는 것은 이해될 수 있을 것이다.
예를 들어, IHC는 다음과 같은 방법으로 수치화될 수 있다: 1. 임의의 염색 vs 염색 없음; 2. 강 vs 약 염색; 3. 없음 vs 약 vs 강; 4. 식 (% 없음 x 0) + (% 약 x 100); + (% 중간 x 200) + (% 강 x 300)으로 구성된 H 점수; 5. 정량적 점수를 보조하는 컴퓨터화된 이미지 분석 소프트웨어.
커트 포인트는 다양한 약물 감수성 인 비트로에 의해 초기에 정의된다. 약물이 임상적 시험에 부딪히면, 민감 vs 비민감 커트 포인트가 추가적으로 개선 및 검증될 것이다.
일 실시예에서, 높은(예를 들면, 강함) 또는 낮은(예를 들면, 약하거나 없음) NMT2 종양 염색이 있는지 여부를 결정하는 것에 있어서, 환자 시료들을 하나 이상의 대조균 시료와 비교할 수 있다. 일 실시예에서, 대조군 시료는 공지 및/또는 확립된 수준의 NMT2 종양 염색을 갖는다. 일 실시예에서, 대조군 시료는 공지 및/또는 확립된 수준의 NMT2 종양 염색 및/또는 공지된 임상적 결과를 갖는 환자 시료이다. 일 실시예에서, 대조군은 공지된 양의 NMT2 염색을 갖는 세포주이다.
NMT1 억제제 치료에 대하여 불량한 후보로 간주되는 환자에 대한 연속 치료 옵션은 당업자에게 공지되어있다.
일부 상황에서, 초기에 NMT1 억제제 치료제에 반응한 환자에게 재발할 수 있다는 것은 이해될 수 있을 것이다. 이러한 나타날 수 있는 재발은 여러가지 방법들, 예를 들어 일차 종양의 재발 및 전이의 발달을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이외에, 또는 대안적으로, 별개의 추가적인 종양이 발생할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다: a) 암이 생긴 대상 또는 암이 생긴 것으로 의심되는 대상으로부터 시료를 획득하는 단계; b) 상기 시료를 NMT2에 대한 항체와 접촉시켜서 상기 항체와 상기 처리된 시료 내에 존재하는 NMT2 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계; c) 상기 형성된 복합체를 측정하여 상기 시료 내 NMT2의 양 또는 농도를 결정하는 단계; 및 d) 상기 대상의 상기 암의 NMT1 억제제 치료 효과를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 NMT1 억제제 치료 효과 결정은 상기 시료 내 NMT2의 수준으로 결정한다.
구체적인 양태에서, 상기 대상에게 NMT1 억제제를 투여하는 단계는 선택적으로 대조군에 비해 상기 시료 내 NMT2에 대한 양이 낮거나 없는 경우에 권고된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 대상으로부터 시료를 획득하는 단계; 상기 시료를 처리하는 단계; 상기 처리된 시료를 NMT2에 대한 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하여 상기 항체와 상기 처리된 시료 내에 존재하는 NMT2 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계로서, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하며; 상기 대상에게 상기 NMT1 억제제를 투여하는 단계는 선택적으로 대조군에 비해 상기 시료 내 NMT2 단백질의 양이 낮거나 없는 경우에 권고된다.
구체적인 양태에 있어서, 상기 항체와 상기 시료 내 상기 NMT2 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)는 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용된다. 일부 실시예에서, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)이다. 일부 실시예에서, NMT2에 대한 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이다.
NMT1 또는 NMT2의 검출, 분석 또는 측정에 이용될 수 있는 다른 실시예는, 면역 블롯팅, ELISA, 간접 면역형광, 멀티플렉싱 비드 기술, 면역 침전 및 질량 분석을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 실제로, 환자 시료의 NMT2 염색이 옅거나 안된 경우, 상기 대상은 NMT-억제제 요법에 좋은 후보인 것으로 간주된다. 일 실시예에서, 상기 시료는 직접 검사 또는 이미지 캡쳐 및 분석에 의한 광학 현미경, 또는 직접 검사 또는 이미지 캡쳐 및 분석에 의한 형광 현미경에 의해 분석된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 NMT1 및/또는 NMT2 활성의 존재 유무 또는 양에 대한 암 환자의 생물학적 시료 내 NMT1 및/또는 NMT2 단백질 활성을 정성적 또는 정량적으로 결정, 분석 또는 측정하는 단계를 포함한다. 이 실시예에서, NMT1 또는 NMT2의 기질(천연 또는 합성)은 시료 내의 NMT1 또는 NMT2 활성의 존재 유무 또는 이들의 양을 확인하는 데 이용된다.
실제로, 대상 시료가 NMT2-결손인 것으로 확인된 경우, 그 대상은 NMT 억제제의 투여를 위한 좋은 후보로 간주된다.
실제로, 환자 시료가 NMT2 단백질 수준이 낮거나 없는 것으로 확인된 경우, 그 대상은 NMT1 억제제의 투여를 위한 좋은 후보로 간주된다.
실제로, 환자 시료가 NMT2 활성이 낮거나 없는 것으로 확인된 경우, 그 대상은 NMT1 억제제의 투여를 위한 좋은 후보로 간주된다.
실제로, 환자 시료가 미리스토일화된 단백질의 양이 낮거나 없는 것으로 확인된 경우, 그 대상은 NMT1 억제제의 투여를 위한 좋은 후보로 간주된다.
실제로, 환자 시료가 아실화된 단백질의 양이 낮거나 없는 것으로 확인된 경우, 그 대상은 NMT2 억제제의 투여를 위한 좋은 후보로 간주된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 암에 걸린 대상 또는 암에 결린 것으로 추정되는 대상의 시료 내 NMTl 또는 NMT2 유전자의 돌연변이, 결실, 등을 식별하는 단계를 포함한다. 상기 NMTl 또는 NMT2 유전자의 돌연변이, 결실, 등은 상기 시료 내 암 세포의 NMTl 또는 NMT2 단백질 활성을 감소의 손실을 초래한다. NMTl 또는 NMT2의 돌연변이, 결실, 등을 식별하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예컨대, RFLP, RT-PCT, 마이크로 어레이 분석 및/또는 DNA 시퀀싱의 임의의 적절한 유형을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 실제로, 낮거나 없는 NMT2 단백질 활성을 초래하는 NMT2의 돌연변이, 결실, 등을 갖는 것으로 환자 시료가 확인된 경우, 그 대상은 NMT 억제제 치료에 대한 좋은 후보로 간주된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 암에 걸린 대상 또는 암에 걸린 것으로 추정되는 대상의 시료 내 NMTl 또는 NMT2 mRNA의 돌연변이, 결실, 등을 식별하는 단계를 포함한다. 상기 NMTl 또는 NMT2 mRNA의 돌연변이, 결실 등은 상기 시료 내 암 세포의 NMTl 또는 NMT2 단백질 활성의 감소의 손실을 초래한다. NMTl 또는 NMT2 mRNA의 돌연변이, 결실, 등을 식별하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예컨대, 노던 블롯팅, RT-PCR, 마이크로어레이 분석, 및/또는 DNA 시퀀싱의 임의의 적절한 유형을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 실제로, 낮거나 없는 NMT2 단백질 활성을 초래하는 NMT2 mRNA의 돌연변이, 결실, 등을 갖는 것으로 환자 시료가 확인된 경우, 그 대상은 NMT 억제제 치료에 대한 좋은 후보로 간주된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 NMT1 또는 NMT2의 결손과 관련된 암에 걸린 대상에게 NMT 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다. 구체 실시예에서, 상기 암은 NMT2 결손과 관련된 암이고, 상기 악제제는 NMT1 억제제이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 NMT2-결손인 암을 치료하기 위한 NMT1 억제제의 용도를 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 암을 치료하기 위한 NMT1 억제제의 용도를 제공하며, 상기 암은 림프종(lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다. 구체적인 실시예에서, 상기 암은 NMT2-결손(deficient)인 것으로 결정된다.
억제제의 예로는, 저분자, 항체, 펩티드 단편, 및/또는 핵산 분자들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
저분자의 구체적인 예로는 Tris-DBA, HMA, DDD85646, DDD86481, 또는 이들의 유도체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "유도체"는 염, 배위 착염, 인 비보 가수분해성 에스테르와 같은 에스테르, 유리 산 또는 염기, 수화물, 전구약물 또는 지질, 커플링 파트너를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
NMT1의 활성 부위를 화학 합성에 의해 전체 또는 일부 펩티드 단편을 제조 할 수 있다. 펩티드 단편을 확립된 표준 액체 또는 고체-상태 펩티드 합성 방법에 따라 제조할 수 있으며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다.
핵산 억제제 또는 이의 컴플리먼트는 활성 폴리펩티드의 하향-조절 생산에 의하여 활성 또는 기능을 저해한다. 이는 상술한 바와 같이, 실시간 PCR을 이용한 스크리닝과 같이 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법을 이용하여 모니터링 할 수 있다.
핵산 억제제의 예로는 유전자 발현을 하향-조절하는 안티센스 또는 RNAi 기술을 포함하며, 이는 당업계에 잘 확립되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 핵산, 전-mRNA 또는 성숙 mRNA의 상보적인 서열에 혼성화되도록 설계하여, 염기 삭제 복구 경로 요소의 생산을 방해함으로서, 그것의 발현을 감소시키거나 완전히 또는 실질적으로 완전히 방지할 수 있다. 코딩 서열의 타겟팅 이외에, 안티센스 기술을 이용하여 유전자의 대조 서열, 예컨대, 5' 플랭킹 서열을 타겟팅할 수 있으며, 이에 의해 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 발현 대조 서열을 방해할 수 있다.
안티센스에 대한 대안은 타겟 유전자와 동일 방향으로 삽입된 타겟 유전자의 전체 또는 일부의 카피복제(copy)를 이용하는 것으로, 공동-저해시킴으로서 타겟 유전자 발현의 감소를 달성한다.
추가적으로, 이중 가닥 RNA(ds RNA) 사일런싱을 이용할 수 있다. ds RNA 매개 사이런싱은 유전자 특이적이며, 보통 RNAi로 불린다.
다른 실시예에서, 리보자임은 특정 위치에서 핵산을 자를 수 있으므로, NMT에 영향을 미치는 데 유용하다.
또 다른 실시예에서, small RNA 분자들은 유전자 발현을 조절하는데 이용 될 수 있다. 이것들은 siRNA, PTGs(post transcriptional gene silencing), miRNA(micro-RNA)에 의하여 mRNA가 단계적으로 조절되는 서열-특이 번역 억압 및 타겟팅된 전사 유전자 사일런싱을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 세포 내 shRNA(short hairpin RNA) 분자의 발현을 이용할 수 있다. shRNA는 작은 루프 서열로 구분된 짧은 반전 반복 서열로 구성되어 있다. 하나의 반전 반복은 타겟 유전자에 대하여 상보적이다. 세포 내에서 shRNA는 DICER에 의해 siRNA로 프로세싱되어 타겟 NMT 유전자 mRNA를 감소시키고 발현을 억제한다. 바람직한 구현예에서, shRNA는 벡터에서의 전사에 의해 (세포 내에서) 내생적으로 생산된다.
NMT1 또는 NMT2-결손은 NMT1 또는 NMT2 매개 기작의 구성 요소에 결손으로 인해 NMT1 또는 NMT2-결손 표현형으로 나타날 수 있으며, 예컨대, 암에서 상기 기작 구성요소의 활성 발현이 대조군 세포에 비해 감소되거나 소멸될 수 있다. 일부 구현예에서, 암세포는 NMT1 또는 NMT2-결손일 수 있으며, 즉, NMT1 또는 NMT2의 활성의 발현이 대조군 세포에 비해 감소되거나 소멸될 수 있다.
따라서, 본 발명은 대상의 암을 진단, 예측, 분류 또는 모니터링하는 것 중 하나 이상에 대한 마커로서의 NMT2의 용도를 제공한다. 일부 실시예에서, 면역분석법 또는 핵산 검출, 또는 단백질 활성으로부터 선택된 분석을 이용하여 NMT2가 측정된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예후"는 유방암과 같은 신생 질환의 재발, 전이 확산 및 약물 내성을 포함하여 암으로 인한 사망 또는 진행의 가능성 예측을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예후 마커"는 시스템 치료의 부재하에서 환자의 결과에 대해 정보를 주거나 경험적 시스템 치료(마커에 대하여 타겟팅되지 않음) 대신, 마커없는 환자와 상이한 결과를 예고하는 마커를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예측 마커"는 마커 상태에 기반한 특정 치료의 상이한 효능(이점)을 예측하는 마커를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "진단"은, 예컨대 유방암, 또는 다른 유형의 암의 식별과 같은 분자적 및/또는 병리학적 상태, 질환 또는 상태의 식별을 지칭한다.
또한, 본 발명은 대상의 암을 진단, 예측, 분류 또는 모니터링하는 것 중 하나 이상에 대한 마커로서의 단백질 미리스토일화(protein myristoylation)의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 대상의 암을 진단, 예측, 분류 또는 모니터링하는 것 중 하나 이상에 대한 마커로서의 아실화(protein acylation)의 용도를 제공한다.
일부 실시예에서, 상기 암은 림프종이다. 보다 구체적인 실시예에서, 상기 림프종은 B 세포 림프종이다. 보다 구체적인 실시예에서, B 세포 림프종은 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma)이다.
일부 실시예에서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), B 세포 림프종, 모세포 단계 만성 골수성 백혈병(Blast Phase Chronic Myeloid Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt’s Lymphoma), 형질세포 골수종(Plasma Cell Myeloma), 장 선암(Intestinal Adenocarcinoma), 폐 혼합 선편평상피 암(Lung mixed Adenosquamous Carcinoma), 폐 소세포암(Lung Small Cell Carcinoma), 폐(Lung), 식도 편평상피세포암(Oesophagus Squamous Cell Carcinoma), 뼈(Bone), 유관암(Breast Ductal Carcinoma), 위암 미만성 선암(Stomach Diffuse Adenocarcinoma), 갑상선 수질 암(Thyroid Medullary Carcinoma), 요로 이행 세포 암(urinary Tract Transitional Cell Carcinoma)이다.
일부 실시예에서, 상기 암은 B 세포 림프종, 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 골수종(myeloma), 난소 투명 세포 암종(ovarian clear cell carcinoma,), 이행 세포암(transition cell carcinoma)(요관암 및 방광암), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 림프종-CLL(lymphoma-CLL), 유방암(breast carcinoma), 결장 직장 선암(colorectal adenocarcinoma), 췌장 선암(pancreas adenocarcinoma), 난소암(ovarian carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung carcinoma), 골육종(osteosarcoma), 흑색종(melanoma), 위암(gastric adenocarcinoma), 자궁 내막 선암(endometrial adenocarcinoma), 식도 편평상피암(esophageal squamous carcinoma)이다.
본 발명의 방법은 키트의 형태로 이러한 방법에 이용된 상기 화합물 및/또는 조성물을 제공함으로서 용이하게 실시된다. 바람직하게는, 이러한 키트는,상기 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 키트는, 이들의 이용을 위한 사용설명서를 포함한다.
하기 도면들을 참조로 하여 본 발명의 실시예들을 설명할 수 있다:
도 1은 정상 B 세포(L0), 다양한 B 세포 림프종 및 T 세포 백혈병에서의 NMTl 및 NMT2 발현을 확인한 면역블롯팅 분석 결과를 보여준다.
도 2는 NMT 억제제인 Tris-DBA(tris-dibenzylideneacetone-dipalladium)에 대한 다양한 정상 B 세포, 다양한 B 세포 림프종 및 T 세포 백혈병의 민감도를 보여주는 그래프이다.
도 3은 Tris-DBA에 의한 NMT(N-myristoyltransferase)의 억제를 보여주는 막대 그래프이다.
도 4는 NMT1 및 NMT2에 대한 항체로 림프종 세포주들을 프로빙한 면역블롯팅 결과를 보여준다.
도 5는 버킷 림프종 세포주에서의 NMT 억제제의 민감도를 불멸화된 정상 림프구 B 세포주와 비교한 결과를 보여주는 선 그래프이다.
도 6는 pcDNA3.1-V5-NMT2로 형질주입된 라모스 B 림프종 세포들의 TrisDBA (5 ㎍/㎕)에 대한 생존율이 공 플라스미드 벡터로 형질주입된 대조군 세포들에 비해 2.5 배 증가한 것을 보여주는 세포 생존율(패널 A) 및 면역블롯팅(패널 B) 결과이다.
도 7은 다양한 림프구 세포주 및 고형 림프종에 존재하는 NMT2 단백질 수준의 차이를 보여준다.
도 8A 및 B는 면역 조직 화학에 의해 분석된 다양한 고형 림프종에 존재하는 NMT2 단백질 수준의 차이를 보여준다. 정상 림프절, 버킷 림프종(BL) 및 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL)의 NMT 면역 조직 화학적 염색. 패널 C에서 NMT1 및 NMT2에 대한 log2(마이크로-어레이 형광 강도 NMT)는 CCLE 데이터베이스의 모든 세포주에 대하여 플롯팅되며, 패널 D에서 NMT1 및 NMT2에 대한 log2(마이크로-어레이 형광 강도 NMT)는 CCLE 데이 NMT1 및 NMT2에 대한 log2(마이크로-어레이 형광 강도 NMT)는 CCLE 데이터베이스의 모든 세포주에 대하여 플롯팅되며, 데이터베이스의 가장 낮은 NMT2 발현 수준을 갖는 100 개 세포주에 대하여 플롯팅되고, 패널 E는 버킷, 미만성 거대 B-세포 및 여포성 림프종에서의 NMT2의 발현을 면역 조직 화학으로 분석하고 이미지 J를 이용하여 퍼옥시다제 염색으로 정량하였다. NMT2에서의 정상 림프절 함량은 0.392 +/- 0.3(상대적인 유닛, 데이터는 표시하지 않음)이다.
도 9는 72 시간 동안 DDD85646 (패널 A), DDD86481 (패널 B), 및 DDD73226 (패널 C)로 처리한 다양한 B 림프구 세포주의 잔여 생존율을 보여준다. 패널 D는IM9(i) 및 BL2(ii) 림프구에서의 DDD86481에 의한 미리스토일화의 억제 확인을 보여준다. 패널 E는 IM-9, BL2 및 라모스 세포주에서 미리스토일화를 억제하는 데 필요한 필요한 최소한의 DDD86481의 용량을 보여준다.
도 10(패널 A)은 24 시간 동안 NMT 억제제 TrisDBA를 처리한 다양한 불멸화 정상 L0 B 림프구, 악성 B 림프종 세포 (라모스 및 BL2), 및 T 세포 백혈병 (CEM)의 민감도를 보여준다. 패널 B는 TrisDBA (5 ug/㎖)에 대하여 pcDNA3.1-V5-NMT2로 형질전환된 라모스 B 림프종 세포(증가된 생존율 2.5 배) vs 공 플라스미드 벡터로 형질전환된 대조군 세포를 보여준다.
도 11은 967 CCLE(cancer cell lines encyclopedia) 데이터베이스에서의 NMT 발현 수준(패널 A), 박스 및 휘스커 플롯를 이용하여 선별된 암에서의 NMT2 발현(패널 B)을 보여준다. 가장 낮은 NMT2 발현을 갖는 50 CCLE 세포주를 나열하고 암 유형으로 분류한다.
도 12는 아폽토시스 동안 NMTs가 절단되어도 활성을 유지하는 것을 보여준다.
도 13은 재조합 GST- 및 His6-태깅 hNMT1과 hNMT2의 정제를 보여준다.
도 14는 정제된 재조합 전장 His6-NMT1 및 재조합 "카스파제-절두" CT- His6-NMT1 간의 효소적 활성 비교를 보여준다.
도 15는 다양한 NMT 억제제 및 상이한 세포주의 EC50 및 IC50의 비교를 보여준다.
도 16은 아폽토시스의 DDD86481 유도를 보여준다.
도 17은 (패널 A) 표시된 림프구 세포주에서 NMT2의 존재에 대하여 탐지한 면역블롯, 및 (패널 B) CCLE 데이터의 표시된 세포주에서 log2(마이크로-어레이 형광 강도 NMT2)로 나타낸 MT2 mRNA의 발현 수준을 보여준다.
도 18은 스트렙타비딘-세파로즈 비드를 이용하여 백혈병 주르카트 T 세포에서 후-번역(post-translationally) ω-알키닐-미리스토일화된 단백질을 풀-다운하는 데스티오비오틴(desthiobiotin)-PEG-아지드 프로브의 사용을 보여준다.
도 19는 스트렙타비딘-자성 비드를 이용하여 백혈병 주르카트 T 세포에서 후-번역 ω-알키닐-미리스토일화된 단백질을 풀 다운하는 데스티오비오틴-PEG-아지드 프로브의 확장된 규모의 이용을 보여준다.
도 20은 알키닐-미리스테이트로 표지된 "정상" 불멸화된 B 세포(IM9) 및 BL 세포(BL2 및 라모스)의 미리스토일화 프로파일을 나타낸다.
도 21은 DDD86481 및 독소루비신(doxorubixin)의 조합으로부터의 시간 및 용량 의존적 세포 독성 그래프를 나타낸다.
도 22는 DMSO, 스타우로스포린, αFAS, 또는 캐리어 단독으로 인큐베이션한 세포에서 실시한 면역블롯팅을 나타낸다.
도 23은 카스파제 절두된 NMT2가 전장 NMT2보다 3-4 배 이상 활성화된다는 것을 보여준다.
도 24는 24 시간 동안 1 μm SAHA (HDAC 클래스 I/II 억제제)로 처리된 "정상" B 세포 (IM9) 및 악성 BL 세포(라모스, BL2)의 면역블롯팅을 나타낸다.
도 25은 NMT2 단백질 수준이 다양한 BL 세포주에서 감소되는 것을 나타낸다.
도 26은 프로테오소말(proteosomal) 분해가 BL 세포에서 NMT2 결손의 원인이 아니라는 것을 보여주고; 도 27은 NMT1이 카스파제-8에 의해 절단되지만, NMT2는 그렇지 않다는 것을 보여준다.
도 28은 NMT1 및 NMT2 모두가 카스파제-3에 의해 절단되었다는 것을 보여준다.
도 29는 굵은 글씨체로 나타낸 에드만 분해에 의해 식별된 NMT1 및 NMT2의 카스파제 절단 부위를 나타내고 양전하 리신(K) 박스는 NMT1 및 NMT2 아미노산 서열상에서 강조된다(아미노산 1 내지 80).
도 30은 부위-직접 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)에 의한 NMT 절단 부위의 확인을 나타낸다.
도 31은 굵은 글씨체로 나타낸 에드만 분해에 의해 식별된 NMT1 및 NMT2의 카스파제 절단 부위를 나타내고 양전하 리신(K) 박스는 NMT1 및 NMT2 아미노산 서열상에서 강조된다(아미노산 1 내지 80).
도 32는 세포가 아폽토시스를 겪었을 때의 NMT 수준의 변화를 나타낸다.
도 33은 일시적으로 형질전환된 COS7 세포의 용해물에서의 초기 NMT 활성을 나타낸다.
도 34은 일시적으로 형질전환된 COS7 세포의 용해물에서의 초기 NMT 활성을 나타낸다.
도 35는 스타우로스포린(2.5 μM) 및 사이클로헥시미드(5 μg/㎖)로 인큐베이션한 일시적으로 V5-NMT1 및 V5-NMT2를 발현하는 COS7 세포들에서의 NMT 활성을 나타낸다.
도 36은 재조합 헥사히스티딘(His)-태깅 전장 및 카스파제-절단 hNMT1의 정제를 나타낸다.
도 37은 재조합 헥사히스티딘(His)-태깅 전장 및 카스파제-절단 hNMT2의 정제를 나타낸다.
도 38은 펩티드 미리스토일화 분석을 이용하여 분석한 정제된 전장 및 카스파제-절단 헥사히스티딘(His)-NMT의 NMT 활성을 나타낸다.
도 39는 아폽토시스 동안 HeLa 세포에서의 내인성 NMTs의 세포내 분획법(subcellular fractionation)을 나타낸다.
도 40은 아폽토시스 동안 HeLa 세포에서의 외인성 NMTs의 세포내 분획법 후 다양한 분획에서의 NMTs 양의 정량을 나타낸다.
도 41은 알키닐-미리스테이트로 표지된 아폽토시스를 겪은 HeLa 세포의 세포내 분획법을 나타낸다.
도 42는 아폽토시스 유도에 대한 2-HMA(hydroxymyristic acid)의 효과를 보여준다. 주르카트 T 세포에 HMA(1 mM)를 처리 또는 미처리하고, 아폽토시스를 항-Fas(150 ng/㎖) 및 사이클로헥시미드(5 μg/㎖)로 유도하였다.
본 명세서의 상세한 설명에서, 굵은 분류 번호는 본 발명의 다양한 실시예를 묘사한 도면과 관련하여 기술 및 언급되는 구성 부분들을 식별하는 역할을 한다. 본 발명의 다양한 실시예를 설명하는데 있어, 동일한 도면 부호는 유사한 요소를 동일하게 식별하기 위해 사용되었다. 또한, 간략화를 위해 특정 도면 중 일부는 도면에서 생략되었다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 더 나은 이해를 얻기 위해, 하기 실시예에서 설명된다. 이는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
하기 실시예들은 표준 방법들을 이용하였고, 이는 당업자들에게 자명할 것이다.
실험물질 및 실험 방법
항체 및 시약
TrisDBA (Tris dibutylbenzinylidene acetone paladium)는 Arbiser 박사(미국)로부터 제공받았다. DDD85646를 [J.A.Frearson 등 (2010) Nature. 464.728-723)]에 서술된 바대로 합성하여 David Gray 박사 및 Paul Wyatt 박사(Dundee University)로부터 얻었다.
마우스 항-NMT1(클론 14, 1:1000) 및 마우스 항-NMT2(클론 30, 1:2000) 항체들은 BD 바이오사이언스(San Jose, CA, USA)로부터, 래빗 항-NMT1(폴리클로날, 1:3000)는 프로테인테크(Chicago, IL, USA)에서 구입하였다. 항-GFP(1:20,000), 항-PARP-1(1:5000), 항-GAPDH (1:5000) 및 항-c-터미널 PAK2(1:2000) 항체들은 이유세라(www.eusera.com, Edmonton, AB, 캐나다)에서 구입하였다. 마우스 항-α-튜블린(1:15,000) 및 래빗-항-V5(1:10,000) 항체들은 시그마 알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 마우스 항-His(1:2000)는 퀴아젠(독일)에서 구입하였다. 래빗 항-절단된 카스파제(cleaved caspase)-8(1:1000) 및 항-절단된 카스파제(cleaved caspase)-3(1:1000) 항체들은 셀 시그널링(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. ECL(Enhanced chemiluminesce) 플러스 및 ECL 프라임 웨스턴 블롯팅 검출 키트는 GE 헬스케어(Pittsburgh, PA, USA)에서 구입하였다. 별도의 언급이 없는 한, 사용된 모든 화학물질들은 최고 순도 제품으로 시그마-알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
DNA 구조체(constructs). V5 - 및 His -태깅 NMTl 및 NMT2 구조체 의 구성.
게이트웨이 클로닝 시스템(Life Technologies, Grand Island, N.Y., USA)와 호환되는 NMTl 및 NMT2 엔트리 벡터를 제네코포에이아(Genecopoeia, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 제조사의 지침에 따라 LR 클로나제 효소(Life Technologies)를 이용하여 NMTl 및 NMT2 유전자들을 벡터 pcDNA3.1/nV5 DEST(Life Technologies)내로 주입하여 플라스미드 N-터미널-태깅 NMTs(His-NMT1, His-NMT2, V5-NMT1 및 V5-NMT2)들을 제조하였다. V5-태깅 NMT 구조체들을 포유류 세포 발현에 이용하였고, His-NMT 구조체들을 박테리아 발현에 이용하였다. 클로닝 산물들을 DNA 시퀀싱(유로핀스 MWG 오페론, Huntsville, AL, USA)으로 확인하였다.
세포 배양
B 세포들은 Jim Stone 박사로부터 제공받거나 ATCC에서 구입하였다. 세포 배양용 모든 시약들은 인비트로젠에서 구입하였다. B 세포들을 37℃, 5% C02 농도의 항습 배양기에서 10% 소 태아 혈청(FBS), 100 U/ml 페니실린 및 0.1 mg/ml스트렙토마이신이 함유된 RPMI 배지로 배양하였다.
세포용해
세포들을 차가운 PBS로 세척하고, 0.1 % SDS-RIPA 버퍼[50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 0.5% NaDC, 2 mM MgCl2, 및 lx 컴플리트 단백질분해효소 저해제(Roche Diagnostics); pH 8.0]로 용해시킨 후, 4℃에서 15 분 동안 교반시켰다. 상기 세포 용해물을 4℃에서 15 분 동안 16,000g로 원심분리하여 상층액을 획득하였다.
아폽토시스의 유도
별도의 언급이 없는 한, 단백질 번역을 억제하고 아폽토시스 유도를 향상시키기 위해 2.5 μM 스타우로스포린(STS) (시그마 알드리치, St. Louise, MO, USA) 및 5 μg/ml 사이클로헥시미드(ICN 바이오케미칼, Aurora, OH, USA)를 이용하여 아폽토시스를 유발하였다.
NMT 저해제로 배양
TrisDBA (Tris dibutylbenzinylidene acetone paladium)는 Arbiser 박사로부터 제공받았다. TrisDBA(또는 대조군인 DMSO) 농도별로 24 시간 및 48 시간 동안 세포들을 배양하였다. DDD85646으로 24 시간 및 48 시간 동안 세포들을 배양하였다.
B 세포 형질주입
B 세포들을, 제조사의 지침에 따른 네온 형질주입시스템(Neon® transfection system, 라이프 테크놀로지)을 이용하여 형질주입하고, 100 ㎕ 팁용 라모스 B 세포 형질전환(펄스전압 1,300V; 펄스폭 20 ms, 2 펄스 및 7.7.106 cells/mL) 프로토콜로 최적화하였다. 관행적으로, 두 번의 형질주입을 실시하여 세포 생존율 분석을 하기에 충분한 양의 살아있는 세포들을 획득하였다.
세포 생존율 분석( Cell viability assay )
트립판 블루 배제 방법을 이용하여 B 및 T 세포의 생존율을 측정하였다. 최소한의 기본적인 아폽토시스를 위하여 세포들을 포화 상태(2 x 106 세포/mL 최대)까지 배양한다. NMT 저해제로 배양한 후, 약 20,000 세포들(10 ㎕)들을 10 ㎕의 TC 10TM 트립판 블루 염료(바이오라드)로 15 분 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율을 TC 1OTM 자동세포계수기(바이오라드)를 이용하여 정량하였다.
인 비트로 NMT 활성분석
N-미리스토일트랜스퍼라제(myristoyltransferase) 활성 분석 프로토콜은Raju, R. V., 및 Sharma, R. K. (1999, Preparation and assay of myristoyl-CoA:protein N-myristoyltransferase. Methods Mol Biol 116, 193-211)을 응용하였다. [3H] 미리스토일-CoA는, 공지된 Towler, D., 및 Glaser, L. (1986, Protein fatty acid acylation: enzymatic synthesis of an N-myristoylglycyl peptide. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 2812-2816)에 따라, 매 실험마다 새롭게 합성하였다. 간략하게 설명하자면, 세포들을 0.25 M 수크로오스 버퍼(50 mM NaH2P04, pH 7.4)에 재현탁하고 브랜슨 초음파분쇄기를 이용하여 6.0 수준의 초음파 처리를 2 회 실시하였다. 반응 혼합물은, NMT 활성 버퍼(0.26M Tris-HCl, 3.25 mM EGTA, 2.92 mM EDTA 및 29.25 mM 2-머캅토에탄올, 1 % 트리톤 X- 100, pH 7.4)에 배양된 10 ㎕의 세포 추출물(약 20 ㎍의 단백질) 및 t비드(truncated-Bid)(물에 0.1 mM로 용해)의 N-말단 서열에 해당하는 미리스토일화가능한 데카펩티드(decapeptide myristoylable) 또는 미리스토일화불가능한 데카펩티드(decapeptide non-myristoylable)로 구성된다. 새롭게 합성된 [3H] 미리스토일-CoA(최종 혼합 용량= 25 ㎕) 7.4 ㎕(
Figure 112015052706347-pct00001
1O pMol)을 첨가하여 반응을 시작시키고, 15 분 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 15 ㎕의 반응 혼합물을 P81 포스포셀룰로오즈 페이퍼 디스크(와트만, 영국) 상에 스팟팅(spotting)하여 상기 반응을 정지시키고 30 초 동안 건조시켰다. 디스크들을 세척하여(세척 버퍼: 25 mM 트리스 버퍼, pH 7.4), 잔류 방사능([3H]-미리스테이트 및 [3H]-미리스토일-CoA)은 제거되고, [3H]-미리스토일-펩티드들은 포스포셀룰로오즈 페이퍼 디스크 상에 잔존하게 된다. 액체 섬광 계수로 방사능을 정량하고 미리스토일화된 펩티드를 pMol로 변환하였다(Raju, R. V., and Sharma, R. K. (1999) Preparation and assay of myristoyl-CoA:protein N-myristoyltransferase. Methods Mol Biol 116, 193-21 1).
RT - PCR
대조군으로 18S 프로브를 이용하고, 택맨(Taqman) NMTl 및 NMT2 프로브들을 이용하여 qRT-PCR을 실시하였다. 사이클 수에 따른 차이(△ct)는, NMT 사이클 시간으로부터 각 세포 유형에 대한 18S 대조군의 발현이 기하급수적인 증가를 나타내는 사이클 시간(ct)을 감산하여 계산하였고, 다시 시그널의 기하급수적인 증가 지점을 확인하였다.
부위-직접 돌연변이유발( site - directed mutagenesis )에 의한 V5 - NMT 에서의 카스파제 절단 부위의 돌연변이
에드만 분해 및 시퀀싱(Alphalyse)에 의해 식별된 NMT1 및 NMT2 카스파제 절단 부위는 부위-직접 돌연변이유발에 의해 돌연변이화되었다. 따라서, 본 발명자들은 사전에 클론 V5-NMT1 및 V5-NMT2 게이트웨이 벡터를 이용하여 식별된 카스파제 절단 부위를 돌연변이시켰다. 따라서, V5-NMT1의 Asp-72 잔기 및 V5-NMT2의 Asp-25, Asp-67 및 Asp-25, 67 양 잔기(이중 돌연변이)들을 제조사의 지시에 따라 Quickchange® 부위-직접 돌연변이유발 키트(Agilent Technologies)를 이용하여 돌연변이시켰다.
간략히, dsDNA(벡터)의 5 내지 50 ng, 10X 반응 완충액 5 μL, 무-뉴클레아제 용액(nuclease-free water)에 용해시킨 프라이머 125 ng을 이용하여 부위-직접 돌연변이유발을 실시하고, 무-뉴클레아제 용액으로 최종 반응 부피를 50 μL으로 맞췄다. 반응 시작전에 2.5 U의 PfuTurbo DNA 중합 효소(Agilent Technologies)를 첨가하여 혼합하고, 에펜 도르프 Mastercycler 1 열순환기에서 18 사이클을 실시하였다. 이어서, 각 반응에 대하여 10 U의 Dpn I 제한 효소를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 배양하여 모(parental) dsDNA를 절단하였다. 추가적으로, PrimerX 프로그램 (http://www.bioinformatics.org/primerx/)를 이용하여 부위-직접 돌연변이유발용 프라이머를 설계하였다(표 2.6에 열거). 중요하게, 카스파제 절단 부위의 아스파테이트(D) 잔기를 글루타메이트(E)로 돌연변이시켜서 하기 벡터를 제작하였다: V5-NMT1 (D72E), V5-NMT2 (D25E), V5-NMT2 (D67E) 및 V5-NMT2 (D25,67E). 돌연변이는 자동화 된 DNA 시퀀싱(Eurofins MWG 오페론)에 의해 확인되었다.
His -태깅 카스파제 -절단, 절두 NMT 벡터( His - tagged caspase - cleaved , truncated NMT vectors )의 제작
하기 카스파제 절단, 절두 NMTs들을 분자 클로닝에 의해 제작하였다; His-73NMT1, His-26NMT2 및 His-68NMT2. N-말단 헥사 히스티딘(His)-태그 서열을 갖는 pET-19b (Novagen®) 벡터 내로 절두된 DNA 서열을 클로닝하였다.
사전에 클로닝된 게이트웨이 벡터인 GFP-NMT1 및 GFP-NMT2를 이러한 PCR 반응에 대한 주형으로 이용하였다. PCR 반응은 백금 Pfx® DNA 중합 효소(Life Technologies)을 이용하여 실시하고, PCR 반응은 제조사의 지침에 따라 설정하였다. 다음과 같이 각각의 PCR 반응을 제조하였다; 200 ng의 DNA 주형, 5 μL 10X Pfx 증폭 완충액, 5 μL 10X PCR 증강제 용액, 1mM MgSO4, 0.3mM dNTP 혼합물, 각 정방향 및 역방향 프라이머 0.5 μM(표 2.6에 열거), 1 U 백금 Pfx® DNA 중합 효소 및 50 μL 무-뉴클레아제 용액. 상기 반응은 백금 Pfx® DNA 중합효소 키트에 제공된 지침에 따라, 에펜도르프 Mastercycler 1 열순환기에서 설정하고, 상기 반응을 30 회 수행하였다.
카스파제의 억제
세포는 아폽토시스 유도 1시간 전에 EMD 케미칼로부터 구입한 정립된 카스파 제 억제제 10 μM로 전-처리하였다. 사용된 카스파제 억제제는 일반적인 카스파제 억제제(z-VAD-FMK), 카스파제-3(z-DEVD-FMK), 카스파제-8(z-IETD-FMK), 카스파제-9(z-LEHD-FMK) 및 음성 대조군(z-FA-FMK)이었다. 대조군 세포는 DMSO(1:1000)으로 처리하였다.
MG -132로 처리한 세포
IM9, KMH2, BL2 및 라모스 세포(6-웰 플레이트에 웰 당 3x106 세포)를 플레이팅하고 10 μm MG-132로 5 시간 동안 처리하였다. 동량의 DMSO를 대조군 시료에 첨가하였다. 이후 세포를 용해시키고 SDS-PAGE/웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.
SAHA ( suberoylanilide hydroxamic acid )로 처리한 세포
IM9, KMH2, BL2 및 라모스 세포(6-웰 플레이트에 웰 당 3x106 세포)를 플레이팅하고 클래스 I 및 클래스 II HDACs(histone deacetylases)의 가역적 억제제인 1 μm SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)로 24 시간 동안 처리하였다. 동량의 DMSO를 대조군으로서 세포에 첨가하였다. 이후 세포를 용해시키고 SDS-PAGE/웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.
아폽토시스 ( Apoptosis ) 유도
150 또는 300 ng/㎖ 마우스 항-Fas 항체를 이용하여 외인성 경로를 통한 아폽토시스를 자극하였고, 2.5 μM STS(staurosporine)를 이용하여 내인성 경로를 통한 아폽토시스를 자극하였다. 별도로 표시하는 경우, 사이클로헥시미드(5 μg/mL)을 이용하여 단백질 번역을 억제하였고, 추가적으로 세포 사멸(cell death)을 촉진시켰다.
NMT 억제제인 2- HMA ( hydroxymyristic acid )로 처리한 세포
상술한 바와 같이, HMA는 세포에 첨가되기 전에 비누화(saponified)시키고 BSA(bovine serum albumin)와 콘쥬게이션시켜 그것의 세포내 흡수를 촉진시켰다(Yap et al., 2010). 간단히, HMA는 15 분 동안 65℃에서 수산화 칼륨(KOH)의 20% 몰 과량과 함께 배양하였다. 이어서, 37℃에서 20% 무-지방산(fatty acid-free) BSA를 함유하는 무-혈청 RPMI 배지에 KOH 비누화된 HMA를 용해하여 20X 용액을 제조하고, 추가적으로 15 분 동안 37℃에서 배양하였다. 소디윰 미리스테이트를 대조군으로 이용하였기 때문에, 이것 또한 세포에 첨가하기 전에 37℃에서 20% 무-지방산(fatty acid-free) BSA를 함유하는 무-혈청 RPMI 배지에서 배양하였다. 이어서, 주르카트(Jurkat) T 세포(1 X 107 세포)를 무-지방산 BSA에 콘쥬게이션된 1mM HMA 또는 1mM 소디윰 미리스테이트(세포 배양물 1%의 최종 농도)로 1 시간 동안 37℃에서 RPMI 배지(FBS, 보충제 또는 항생제 무첨가)로 인큐베이션하였다.
배양 후, 사이클로헥시미드(5 μg/㎖) 또는 비히클 단독(DMSO)으로 항-Fas(150 ng/㎖) 또는 STS(2.5 μM)을 이용하여 아폽토시스를 유도하였다. 시료를 매 2 기간 마다 8 시간 동안 수집하여, 차가운 PBS로 세척하고 1% SDS(sodium dodecyl sulfate)-RIPA(radio-immuno-precipitation assay) 완충액 0.3 ㎖로 용해시켜서, Branson Sonifier의 5.5-6.5의 출력으로 15 초 동안 2 라운드의 초음파 처리를 실시하고, 각 사이클 사이에 2 분 동안 얼음에 배치하였다.
NMT 억제제인 Tris DBA 로 처리한 림프구 세포주
2 X 106 세포(CEM, L0, BL2 및 라모스)를 6-웰 플레이트에서 배양시키고 일련의 양(0, 1, 2, 5 μg/㎖)의 Tris DBA(dibenzylideneacetone) 디팔라디윰(dipalladium)으로 인큐베이션하였다(Bhandarkar et al., 2008). Tris DBA로 처리된 세포의 생존율은 트리판 블루 배제 분석법으로 측정하였다(Hudson, 1976).
NMT 억제제인 DDD85646 및 DDD73226 로 처리한 림프구 세포주
1 X 105 세포[KMH2(호지킨 림프종), IM9 ("정상" EBV 불멸화된 B 세포), BL2, 라모스](100 μL/웰)를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 피라졸 술폰아미드(pyrazole sulfonamide)-기반 NMT 억제제 DDD85646[분자량(MW) 495.43] 및 덜 강력한 피라졸 술폰아미드-기반 유사체 DDD73228(MW=362.5)를 일련의 양으로 24, 48 및 72 시간 동안 처리하였다(Frearson 등., 2010). 상기 약물들을 DMSO에 용해하여 각 테스트된 농축액에 대한 100X 모액(stock solution)을 제조하여, 각각의 웰 내 DMSO의 최종 부피는 1 %가 되도록 하였다. 이러한 억제제로 처리된 세포의 생존율은 트리판 블루 배제 분석법으로 측정하였다(Hudson, 1976).
NMT 억제제 DDD86481 으로 처리한 림프구 세포주
1 X 105 세포[KMH2(호지킨 림프종), IM9("정상" EBV 불멸화된 B 세포), BL2, 라모스](100 μL/웰)를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 일련의 DDD86481[MW 610.5]로 처리하였다. 상기 약물들을 DMSO에 용해하여 각 테스트된 농축액에 대한 100X 모액을 제조하여, 각각의 웰 내 DMSO의 최종 부피는 1 %가 되도록 하였다. MTS [(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)] 분석을 이용하여 약물의 세포 독성을 측정하였다(Cory et al., 1991).
세포 용해
(세포를 알킨-지방산으로 표지한 경우) 일반적으로, 세포를 차가운 PBS로 세척하고 수집하고, 1X 완전한 프로테아제 억제제가 보충된 0.1% SDS-RIPA 완충액 또는 0.1% SDS-RIPA-HEPES 완충액으로 용해시켰다. 세포 현탁액을 4℃에서 15 분 동안 교반하였다. 이후 세포 용해물을 4℃에서 10 분 동안 16,000 g에서 원심분리한 후 핵-상등액을 수집하였다. 단백질 농도를 PierceTM BCA(bicinchoninic acid) 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 이용하여 측정하였다.
림프종 조직 시료의 용해
인간 DLBCL(diffuse large B-cell lymphoma) 및 FL(follicular lymphoma) 조직들은 Raymond Lai 박사(Cross Cancer Institute, Alberta, Canada)로부터 기증받았다. 동결된 종양 조직을 작은 조각(~ 1mm3)으로 절단하고 완전한 1X 프로테아제 억제제와 1% SDS-RIPA로 혼합하였다. 시료들을 작은 다운스 균질기를 이용하여 균질화한 후 종양 조직이 용해 완충액에서 분해될 때까지 6.0(Branson Sonifier 450)의 출력으로 1 분 간격으로 (얼음위에서) 2 분 동안 반복하여 초음파 처리하였다. 상기 시료들을 4℃에서 10 분 동안 16,000 g에서 원심분리한 후 웨스턴 블롯 분석을 위한 핵-상등액을 수집하였다.
오디세이 스캐너를 이용한 웨스턴 블롯
이 방법은 제공된 절단 카스파제-3 블롯에만 이용되었고, 모든 다른 웨스턴 블롯은 표준 절차를 사용하여 수행하였다. 전기 영동 후, 겔을 니트로셀룰로오스 막으로 트랜스퍼시키고, 1 시간 동안 0.1 % 트윈 20(PBS-T)의 PBS 중 5% NFM로 블록킹하였다. 또한, 1 차 항체(래빗 항-절단 카스파제-3; Cell Signaling)를 PBS-T 중 5% NFM에 1:2000로 희석하고, 막에 첨가하여 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 막을 5 분 동안 각각 6 세척 주기(PBS로 2회, PBS-T로 2 회, PBS로 마지막으로 2 회)로 세척하였다. 2 차 항체(알렉스 플루오르 680 고트-항-래빗; Life Technologies)를 PBS-T(1: 5000)으로 희석하여 첨가하고, 블롯들을 알루미늄 호일로 덮어서 1 시간 동안 2 차 항체로 인큐베이션한 후 이전과 같이 PBS와 PBS-T로 동일한 6 세척 주기로 세척하였다. 블롯들을 (래빗용) 채널 700 상에서 84 ㎛의 스캔 해상도(강도: 5 내지 7)를 갖는 LI-COR 사의 오디세이 ® 형광 이미징 시스템으로 스캐닝하였다.
초원심세포분획법( Subcellular fractionation )
HeLa 세포를 150 mm 플레이트에서 컨플루언시까지 배양시키고, 5 시간 동안 항-Fas(300 ng/㎖)(외인성) 또는 STS(내인성)으로 아폽토시스를 거치도록 유도하였다. 이어서, 세포들을 신진 대사 작용으로 알킨-C14로 표지하고 저장성 용해를 실시하였다(하기 섹션에서 상세히 설명)(Yap et al., 2010).
요약하면, 세포들을 차가운 PBS 완충액으로 세척하고, 셀 리프터를 이용하여 플레이트를 스크래핑 및 수집하였다. 이후 시료들을 5 분간 2000 g에서 원심 분리하여 상등액을 흡입하고, 세포 팽윤을 유발하는 저장성 완충액(Mg 재현탁 완충액) 600 μL에 세포들을 재현탁시키고, 20 분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 세포 현탁액을 다운스 균질기로 옮기고 타이트 페스틀을 이용하여 45 스트로크로 균질화하였다. 그 결과, 무-EDTA 2.5X 균질화 완충액(HB) 400 μL을 균질화액에 첨가하고, 루즈 페스틀을 이용하여 다운스 균질기에서 15 스트로크로 세포들을 균질화하였다. 균질화액을 5 분 동안 1000 g에서 원심 분리하여, 후-핵 상등액(post-nuclear supernatant, PNS)를 수집하였다. 다음으로, PNS 200 μL를 저장하고 나머지(~ 750 μL)는 Beckman TLA 120.2 로터로 45 분 동안 100,000g에서 원심 분리하여, 세포질 분획(S100) 및 광 막 펠렛(P100)을 얻었다.
P100 펠릿을 1X HB로 1회 세척하고, P100 분획을 1X HB를 이용하여 S100 분획과 동일한 부피로 조정하였다. 이 후, 얻어진 상등액 후-핵 상등액(PNS), 세포질 분획(S100)과 막 분획(P100) 분획들이 1 % SDS를 포함하도록 조정하였다. 따라서, 동일한 분획 부피로 웨스턴 블롯 분석을 실시하여, 이미지 J 소프트웨어(http://rsbweb.nih.gov/ij/)를 이용하여 단백질 수준을 정량화하였다.
생물-직교 ω- 알키닐 미리스틱 산( bio - orthogonal ω- alkynyl myristic acid ) 클릭 화학( click chemistry )을 이용한 세포의 신진 대사 표지
ω-알키닐 미리스틱 산을 이용한 세포의 신진 대사 표지
수집하기 전에 세포들을 100 내지 25 μM의 ω-알키닐 미리스틱 산으로 30 분 동안 표지하고, 0.1 % SDS-RIPA-HEPES 완충액으로 세정하였다. 상기 결과물인 세포 용해물로부터 단백질(50 내지 30 μg)을 클릭 화학을 이용하여 100 μM 아지도-비오틴으로 반응시키고, 상술한 바와 같이 처리하였다(Yap et al., 2010). 간략하게, 표지 전에 세포들을 1 시간 동안 5% 덱스트란-코팅 목탄-처리 FBS(DCC-FBS)로 보충된 배지(RPMI 또는 DMEM)에서 배양하여 지방산을 고갈시켰다. 다음으로, ω-알키닐-미리스틱 산을 DMSO에 용해시켜서 25 또는 100 mM의 모액을 제조하였다. 일반적으로 ω-알키닐 미리스틱 산의 세포 내 흡수는 전형적으로 비누화 및 BSA와의 콘쥬게이션으로 향상되었다. 따라서, 표지 전에, ω-알키닐 미리스틱 산을 15 분 동안 65℃에서 수산화 칼륨의 20 % 몰 과량으로 비누화하였다. 다음으로, 37℃에서 20 %무-지방산 BSA를 함유하는 무-혈청 배지(예열)를 비누화된 ω-알키닐 미리스틱 산에 첨가하고, 37℃에서 추가로 15 분 동안 인큐베이션하였다.
이어서, 지방산이 제거된 세포를 따뜻한 PBS로 1 회 세척하고, 임의의 보충제가 없는 신선한 RPMI 또는 DMEM에서 배양하였다. 다음으로, 무-혈청 배지에서 적절한 부피의 20 X 지방산-BSA 컨쥬게이트를 상기 세포들에 첨가하여 BSA의 최종 농도가 1%가 되도록 하고, 알키닐 미리스틱 산은 각 실험에 대해 표시한 농도(25 μM 또는 100 μM)이다. DMSO 또는 BSA에 콘쥬게이션된 비표지 지방산을 실험 대조군으로 이용하였다. 수집전에, 세포들을 5% CO2 가습된 배양기에서 37℃에서 30 분 동안 ω-알키닐 미리스틱 산으로 표지하였다. 세포는 1X 완전한 프로테아제 억제제(EDTA 무첨가)가 보충된 0.1% SDS-RIPA-HEPES로 수집하였다.
클릭 화학( Click chemistry )
ω알키닐 미리스틱 산으로 세포를 표지한 후, 결과물인 용해물은 상술한 바와 같이, ECL에 의해 미리스토일화된 단백질의 검출이 가능하도록 아지도-비오틴으로 클릭 화학을 실시하였다(Yap et al., 2010). 전형적으로, 세포 용해물(30-50 μg의 단백질)을 1% SDS를 포함하도록 조정하고, 100 μM TBTA(Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine), 1 mM CuSO4, 1 mM TCEP(Tris-carboxyethylphosphine) 및 100 μM 아지도-비오틴을 어둠 속에서 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하여 클릭 반응을 진행하였다. 이어서, 10 배의 얼음처럼 차가운 아세톤을 첨가하여 클릭 반응을 정지시키고 단백질을 밤새 -20℃에서 침전시켰다. 이어서, 아세톤 침전된 단백질을 10 분 동안 16,000g에서 원심 분리하고, 20 mM DTT를 포함하는 1X SDS-PAGE 시료 완충액에 재현탁하였다. 시료들을 5 분 동안 95℃에서 가열하여 SDS-PAGE를 실시하고, 웨스턴 블롯 분석을 위하여 PVDF 막에 트랜스퍼하였다.
중성 Tris - HCl 또는 KOH 로 처리한 PVDF 막
PVDF 멤브레인을 KOH 또는 Tris-HCl로 처리한 경우 실험에 대한 중복(duplicate) SDS-PAGE 젤에 단백질 시료들을 로딩하였다. 전기 영동 후, 상온에서 45 분 동안 부드러운 진탕기로 KOH 처리- PVDF 막을 메탄올 중 0.1 N 100 ml[H2O 중 1 N KOH: 메탄올 1:9 (v/v)]에 인큐베이션한 반면, 나머지는 메탄올 중 0.1 N Tris-HCl pH 7.0 [1 N Tris-HCl, pH 7.0:메탄올 1:9 (v/v)]에 인큐베이션하였다. 이어서, 처리 된 멤브레인을 PBS로 충분히 세척하고, 스트렙타비딘-HRP 또는 뉴트라비딘-HRP와 프로빙하여 ECL로 검출하였다.
아폽토시스를 겪은 세포에서의 방사성 NMT 활성 분석
샤르마 연구소에 의해 개발된 프로토콜을 적용하여 NMT 활성을 측정하였다(King and Sharma, 1991; Raju and Sharma, 1999). [3H]-미리스토일-CoA의 모액을 새로 제조하고 이전에 설명된 바와 같이 합성하였다(Towler and Glaser, 1986). [3H]-미리스토일-CoA의 200 μL 모액을 제조하기 위하여, 미리스토일-CoA 생성 완충액 97 μL을 50 mM ATP 20 L, 20 mM LiCoA 10 L, 슈도모나스 아실-CoA 합성 효소 60 μL및 [9,10-3H]-미리스틱 산 13 μL와 조합하였다. 상기 용액을 부드럽게 혼합하고 30 분 동안 37℃에서 배양하였다.
이러한 분석을 위해, V5-NMT1 및 V5-NMT2를 코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질전환된 COS-7 세포를 STS(2.5 μM) 및 사이클로헥시미드(5 μg/㎖) 또는 부재로 아폽토시스를 거치도록 유도하고 0, 1, 2, 4 및 8 시간 시점에 수집하였다. 세포들을 Branson sonifier 450을 이용하여 초음파 처리하고 용해물 20 μg(50 mM NaH2PO4 pH 7.4, 0.25M 수크로오스 완충액에 용해)을 각 반응에 이용하였다. 각 NMT 분석 반응, 3.85 μL NMT 분석 완충액, 1.25 μL 20% 트리톤 X-100 및 ct-Bid (에탄올 중 1mM 스톡)의 N-말단 서열에 해당하는 2.5 μL(0.1 mM) 미리스토일화가능한(myristoylatable)(BID_G: GNRSSHSRLG) 또는 비-미리스토일화가능한(BID_A: ANRSSHSRLG) 데카펩티드(펩티드 2.0 Inc로부터 구입)를 마이크로원심 튜브에 첨가하고, 반응을 개시하기 전에 얼음에 보관하였다. 반응 개시시, 새로 합성된 [3H]-미리스토일-CoA 7.4 μL(10 pmol)를 NMT 분석 혼합물을 함유하고 있는 각 마이크로원심 튜브에 15초 간격으로 첨가하고 25 μL 반응물을 15 분 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 15 초 간격으로 p81 포스포셀룰로오즈 페이퍼 디스크 (Whatman) 상에 반응 혼합물 15 μL을 스폿팅하여 상기 반응물을 종료시키고 30 초 동안 헤어 드라이어로 건조시켰다.
다음으로, p81 포스포셀룰로오즈 페이퍼 디스크를 세척 유닛으로 트랜스퍼하고 3 회, 각 30 분, 총 90 분 동안 NMT 분석 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, 포스포셀룰로오즈 상에 남은 방사능(미리스토일화된 펩티드에 해당)을 Beckman Coulter LS6500 섬광 계수기를 사용하여 액체 섬광 혼합물 5 ml로 정량하였다. NMT 활성을 단백질 fmol/분/μg으로 산출하였다.
정제된 His -태깅 NMTs 에서 NMT 활성을 측정하기 위한 방사능 분석의 이용
상술한 바와 같이 동일한 프로토콜을 이용하여 전체 길이의 NMT 활성 및 절두 His-태깅 NMT을 측정하였다. 그러나, 1 μg의 정제된 단백질(부피는 NMT 분석 완충액으로 10 μL로 맞췄다)만을 본 분석에 이용하였다(볼륨 분석 버퍼에 오게됐다).
인 비트로 NMT 절단 분석( In vitro NMT cleavage assay )
37℃에서 1 시간 동안 정제 His-NMT1 및 His-NMT2 10 g와 100 μL 반응물 중 카스파제 절단 분석 완충액 중 1 μg의 재조합 인간 활성 카스파제-3 또는 8을 인큐베이션하여 본 인 비트로 NMT 절단 분석을 실시하였다. 10 μm 일반 카스파제 억제제 z-VAD-FMK를 첨가하여 반응을 종료시키고 이어서 5X 시료 로딩 완충액을 추가하였다. 반응된 시료를 10% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, PVDF 막으로 트랜스퍼하였다. 밴드들을 쿠마시 블루 염색으로 시각화하고, 절단 단편들은 막에서 잘라내어 에드만 분해(Edman degradation)를 위해 Alphalyse(Palo Alto, CA)에 보냈다.
재조합 His - NMTs 단백질 정제
제조사의 프로토콜에 따라 His-NMT1 및 His-NMT2 벡터로 Lemo21 (DE3) pLysS 컴피턴트(competent) 세포(New England Biolabs)을 형질전환시켰다. NMT1 및 NMT2 단백질을 다음과 같이 제작하였다: 3 ㎖ 종자 배양을 37℃에서 4 시간 동안 LB 액체 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 100 μg/㎖ 암피실린 및 34 μg/㎖ 클로람페니콜)에서 225 rpm으로 진탕하면서 배양하였다. 전체 배양물을 50㎖ 배양물에 접종하고 16 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서, 박테리아 세포를 실온에서 10 분 동안 6,000 xg에서 원심분리하여 펠렛화하였다. 박테리아 펠릿은 10 ㎖ LB에 재현탁시키고, 5 ㎖의 재현탁액을 500㎖ LB에 접종하고 0.5-0.6의 OD600가 될 때까지 격렬히 진탕(225 RPM)하면서 37℃에서 배양하였다.
다음으로, 0.5 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 첨가하여 30℃에서 격렬히 4 시간 동안 진탕(225 RPM)하면서 단백질 발현을 유도하였다. 현탁액을 20 분 동안 4℃에서 6,000 xg로 원심분리하고, 박테리아 펠렛을 밤새 동결시켰다. 이어서, 해동한 박테리아 펠렛을 로슈의 완전한 프로테아제 억제제(CPI)가 보충된 25 ㎖ 박테리아 용해 완충액에 재현탁시키고, 30 분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 시료들은 5.0(Branson Sonfier 450)의 출력으로 1 분 간격으로 1 분 동안 3 회 초음 처리하고, 4℃에서 1 시간 동안 15,000 xg로 원심 분리하기 전에 30 분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
한편, Ni-NTA 아가로오스 비즈(His-Pure Ni-NTA 레진, Thermo Fisher Scientific) 를 제조업체의 지침에 따라 컬럼 내로 팩킹하고 컬럼 완충액으로 3 회 세척하였다. 이전 원심분리로부터 얻은 맑은 상청액을 컬럼에 로딩한 후 부드럽게 1 시간 동안 4℃에서 진탕 배양하였다. 시료들을 중력 흐름에 의해 컬럼으로부터 용출시키고, 상기 컬럼을 5 ㎖ 세척 완충액(20 mM 이미다졸을 포함하는 컬럼 완충액, pH 8.0)로 으로 2 회 세척하였다. 이어서, 2 X 5 mL의 용출 완충액 1(75 mM 이미다졸을 포함하는 컬럼 완충액, pH 8.0)을 이용하여 처음 두 분획을 용출하고 2 X 5 mL의 용출 완충액 2(150 mM 이미다졸을 포함하는 컬럼 완충액, pH 8.0)을 이용하여 다음 두 분획을 용출하였다. 마지막 분획을 용출 완충액 3(250 mM 이미다졸을 포함하는 용출 완충액, pH 8.0)으로 용출하였다. 마지막으로, -80℃에서 동결 전에, 20% 글리세롤을 수집된 각각의 분획에 첨가하였다. 어떤 분획(들)이 가장 높은 농도의 단백질을 갖는지를 결정하기 위하여, 단백질 정제 과정의 각 단계에서의 시료들을 수집하여, 12.5% SDS-PAGE 겔상에서 실행하고 쿠마시 블루로 염색하였다.
처음 네 용출물로부터의 시료들이 가장 높은 단백질 농도를 가지고 있기 때문에, 이것들을 풀링하고 투석하여 임의의 이미다졸을 제거하였다. 이에, 풀링된 시료들을 12-14 kDa의 MWCO(molecular weight cut off)가 있는 Spectra/Por 2 (Spectrum Laboratories) 투석 튜빙에 로딩하여 임의의 작은 분해된 단백질 조각을 제거하였다. 단백질 시료를 부드럽게 교반하면서 4℃에서 2 시간 동안 차가운 투석 완충액 4 L으로 투석한 후, 4 L의 새로운 차가운 완충액으로 4℃에서 동일한 완충액과 함께 밤새 투석하였다. 투석된 단백질 시료들을 원하는 부피가 될 때까지 5,000g에서 MWCO 30 kDa(Millipore)로 4℃에서 아미콘 울트라-15 원심 필터를 회전시켜 농축시켰다.
B 세포 림프종 세포주의 qRT - PCR
제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol® 시약을 사용하여 IM9, KMH2, 라모스 ㅁ및 BL2 세포로부터 RNA를 분리하였다. 다음으로, 제조사의 지시에 따라 어플라이드 바이오 사이언스의 랜덤 프라이머 방식을 갖는 고용량 cDNA 역전사 키트를 이용하여 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. TaqMan® 유니버설 마스터 믹스 II를 이용하여 정량 실시간 PCR (qRT PCR) 반응을 설정하고, 공급업체의 지침에 따라 NMT1, NMT2 및 Life Technologies (Carlsbad, CA)로부터 구입한 18 Taqman® 프로브 및 각 반응의 세 복제물(replicates)을 설정하였다. qRT PCR을 Mastercycler® ep realplex 열 순환기(Eppendorf)를 사용하여 실시하고, 결과들을 Realplex 소프트웨어(Eppendorf)를 사용하여 분석하였다.
트리판 블루 배제 분석
Tris DBA, DDD73228 및 DDD85646로 처리된 세포의 생존율을 제조업체의 지시에 따라, TC10TM 트립판 블루 염료(Biorad) (Hudson, 1976)로 세포를 배양하여 측정하였다. 세포 생존율을 TC10TM 자동 세포 계수기(Biorad)를 이용하여 정량하였다.
MTS[(3-(4,5- dimethylthiazol -2- yl )-5-(3- carboxymethoxyphenyl )-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)] 분석
제조업체의 지시에 따라 DDD86481로 처리된 세포의 생존율을 프로메가사의 CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive cell proliferation assay (MTS) 를 사용하여 측정 하였다(Cory et al., 1991).
면역 조직 화학
B 세포 림프종을 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 봉입하여 원하는 두께(~ 5 마이크론 또는μm)로 마이크로톰에서 절단한 후 Superfrost® 플러스 양전하 슬라이드(Fisher Scientific) 상에 부착하였다. 염색전에 종양 조직을 포함하는 슬라이드를 자일렌에 10 분 동안 3 회 침지하여 탈파라핀시킨 후, 일련의 에탄올[100% 에탄올에 20 딥(4회 반복), 80% 에탄올에 20 딥, 및 50% 에탄올에 20 딥]에 세척하고 10 분 동안 차가운 흐르는 물로 최종 세척하였다.
항원의 회복(retrieval)을 위해, 슬라이드를 슬라이드 홀더에 장착하고, Nordicware® 마이크로웨이브 프레서 쿠커에 넣고, 800 mL의 10 mM 시트레이트 완충액 pH 6.0를 첨가하였다. 프레서 쿠커를 단단히 폐쇄하여 마이크로웨이브에 넣고 20 분 동안 마이크로웨이브처리하였다. 다음으로, 슬라이드드을 10 분 동안 차가운 흐르는 물에 세척하였다. 10 분 동안 메탄올 중 3% H2O2에 슬라이드를 담그고 3 분 동안 PBS에 세척하기 전에 10 분 동안 따뜻한 흐르는 물로 세척하여 퍼옥시다제 블록킹을 실시하였다.
다음으로, 여분의 PBS를 제거하고 시료 주변에 소수성 원을 PAP 펜(Sigma-Aldrich)으로 그렸다. 래빗 항-NMT1(Proteintech) 또는 래빗 항-NMT2(Origene)을 다코 항체 희석 버퍼(Dako, Agilent Technologies)로 1:50으로 희석하고 파스퇴르 피펫으로 추가(슬라이드 당 ~400 L)하여 4℃의 습도 챔버에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 슬라이드를 PBS로 2 회 각 5 분 동안 세척하고 DAKO EnVision+System-HRP labeled polymer (anti-Rabbit) (Dako, Agilent Technologies) 4 방울을 각 슬라이드에 첨가하여 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 다시 PBS로 2 회 각 5 분 동안 세척하고 Liquid DAB (diaminobenzidine) + substrate chromogen (제조사의 지침에 따라 제조; Dako, Agilent Technologies) 4 방울을 첨가하여 5 분 동안 발색시킨 후 차가운 물에서 10 분 동안 세정하였다.
슬라이드들을 5 분 동안 1% CuSO4에 담근 후, 차가운 흐르는 물로 짧게 세정하고, 60 초 동안 헤마토실린으로 카운터염색한 후 맑은 물이 나올 때까지 차가운 흐르는 물로 세정하였다. 다음으로, 슬라이드들을 리튬 카보네이트에 3 회 침지하고 흐르는 수돗물로 짧게 세정하였다. 슬라이드들을 일련의 단계에서 탈수시켰다; 50% 에탄올에서 20 딥, 80% 에탄올에서 20 딥, 및 100% 에탄올에서 20 딥(4 회 반복) 및 최종적으로 크실렌(3 회 각 10 분). 커버슬립을 슬라이드에 첨가한 후 니콘 이클립스 80i microscop를 이용하여 종양 시료의 현미경 관찰을 실시하였다. QImaging 과학 카메라(Qimaging)를 이용하여 이미지를 생성하였다.
실시예 1
도 1은 정상 세포, 다양한 B 세포 림프종 및 T 세포 백혈병에서의 NMTl 및 NMT2 발현 결과를 보여준다. 도 1은 B 림프종 세포주(BL-2, 라모스)에서 NMT2가 정상 B 세포(EBV 변형 인간 B 림프구, L0)와 인간 백혈병 T 세포주(주르카트, MOLT-4, CEM)에 비해 거의 발현되지 않는다는 것을 보여준다.
반면, 이론에 한정하고자 하는 것은 아니나, 하나의 NMT 아이소자임(isozyme)만을 발현하는 이러한 세포들은, 예컨대, 버킷 림프종 세포들과 같이 NMT2를 거의 발현하지 않는 세포들은 미리스토일화된 단백질 프로필이 변경되었을 가능성이 높다.
미리스토일화된 단백질 양(대조군과 비교하여)이 감소된 시료는 NMT-결손인 시료를 NMT-결손인 암을 나타낸다. 이러한 NMT-결손인 암은 본 발명의 저해제 또는 NMTl으로 치료가능하다.
실시예 2
도 2는 NMT 억제제인 Tris-DBA(tris-dibenzylideneacetone-dipalladium)에 대한 다양한 B 세포 림프종 및 T 세포 백혈병의 민감도를 보여준다. 다양한 B 및 T 세포들을 Tris-DBA의 농도별로 24 시간 동안 배양하였다. 트립판 블루 배제법을 이용하여 세포 생존율을 측정하고 대조군을 100%로 적용하였다. 트립판 블루 배제법에 의해 측정된 세포 생존 곡선은 B 세포 림프종이 NMT 억제제인 Tris-DBA에 더욱 민감하다는 것을 보여준다.
실시예 3
도 3은 NMT 억제제인 Tris-DBA에 의한 NMT(N-myristoyltransferase)의 억제를 보여준다.
NMT 활성은 정제된 재조합 NMT1 및 NMT2를 이용한 펩티드 미리스토일화 분석으로 측정하였다. 생성된 방사성-표지 미리스토일펩티드(myristoylpeptide)의 양으로부터 NMT 활성을 계산하여 포스포셀룰로오스 페이퍼 상에서 검출하였다(King 등. 1991, Anal Biochem 응용).
도 3는 Tris-DBA가 인 비트로 상에서 정제된 재조합 NMT 효소들을 이용하여 NMT를 억제한다는 것을 보여준다.
실시예 4
도 4는 NMT 1(도 4A) 및 NMT 2(도 4B)에 대한 항체로 림프종 세포주 들을 프로빙한 면역블롯팅 결과를 보여준다. 도 4에서 개시된 세포주들은 다음과 같다: IM9: B 림프아세포; BL2: 버킷 림프종; CEM: T 세포 백혈병; Karpas 299: T 세포 림프종; Sup-M2: ALCL; UCONN: ALCL (Anaplastic large-cell lymphoma); DAUDI: 버킷 림프종; Ramos: 버킷 림프종 BJAB: 버킷 림프종; HD-MYZ: 호지킨 림프종; KM-H2: 호지킨 림프종; L428: 호지킨 림프종; 주르카트: T 세포 백혈병.
실시예 5
도 5는 상이한 농도에서 48 시간 후, 버킷 림프종 세포주인 라모스에서의 NMT 억제제의 효능을 불멸화된 정상 림프구 B 세포주인 IM9와 비교한 결과를 보여준다.
실시예 6
본 실험에서, pcDNA3.1-V5-NMT2로 형질주입된 Ramos B 림프종 세포들의 TrisDBA (5 ㎍/㎕)에 대한 생존율이 공 플라스미드 벡터로 형질주입된 대조군 세포들에 비해 2.5 배 증가하였다. 도 6에서, 라모스 세포주용 권장 프로토콜에 따라 네온 형질주입 시스템(인비트로젠)(1,350 Volt, 30 ms)을 이용하여, DNA (pcDNA3.1-V5-empty 또는 pcDNA3.1-V5-NMT2) 32 ㎍을 20 X 106 Ramos B 림프종 세포들에 형질주입시켰다. 형질주입된 세포들을 5 분 동안 1200rpm에서 원심분리하여 죽은 세포들과 세포 파편들을 제거하였다. 상층액 내 세포들이 회복되도록 6 시간 동안 RPMI에 두었다. PBS로 세척한 후, 세포들을 재현탁하여 TrisDBA (5ug/ ml)를 함유한 RPMI에 24 시간 동안 배양하고, 트립판 블루 배제법를 이용하여 계산하였다(패널 A). 세포들을 용해하고, NMT2에 대한 항체 및 대조군인 GAPDH에 대한 항체로 웨스턴 블롯팅(ECL)을 실시하여 NMT2의 발현을 확인하였다(패널 B).
실시예 7
본 실험에서, 대조군으로 18S 프로브를 이용하고, 택맨(Taqman) NMTl 및 NMT2 프로브들을 이용하여 qRT-PCR을 실시하였다. 사이클 수에 따른 차이(△ct)는, NMT 사이클 시간으로부터 각 세포 유형에 대한 18S 대조군의 발현이 기하급수적인 증가를 나타내는 사이클 시간(ct)을 감산하여 계산하였고, 다시 시그널의 기하급수적인 증가 지점을 확인하였다. 표 1에 도시된 바와 같이, B 림프종 세포주에서, NMT1 발현 대비 NMT2 발현은 감소하였다(최대 60 배). 반면, 이론에 한정하고자 하는 것은 아니나, 이러한 결과들은 NMT2를 코딩하는 mRNA의 감소가 웨스턴 블롯팅에 의해 확인된 NMT2 단백질 수준의 감소를 초래할 수 있다는 것을 제시한다.
Figure 112015052706347-pct00002
qRT-PCR에 의한 NMT mRNA 발현의 분석
실시예 8
본 실시예에서, 도 7은 다양한 림프구 세포주 및 고형 림프종에 존재하는 NMT2 단백질 수준의 차이를 나타낸다. (A) NMT1과 NMT2의 수준은 다양한 유형의 인간 고형 림프종 DLBCL(Diffuse Large B Cell Lymphoma) 및 FL(Follicular Lymhoma) 종양 용해물에서 웨스턴 블롯팅에 의해 평가되었다. 하기와 같은 양 패널에 대하여 동일한 항체 농도를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 NMTs를 검출하였다: 래빗 항-NMT1 (1:2500), 마우스 단일클론 항-NMT2(1:2500). 각 유형의 수많은 종양 시료들은 NMT2 발현 수준의 평균 아래로 떨어졌음을 보여준다 (0.392 +/_ 0.30).
패널 A에서, 버킷 림프종 세포주 BL-2, 다우디(Daudi), 라모스 및 BJAB는 NMT2가 없는 것을 나타낸다.
패널 B에서, 5 개 DLBCL 중 4 개, 6 개 FL 중 4 개 인간 종양 용해물이 NMT2의 현저한 감소를 나타낸다.
실시예 9
이 실시예의 도 8 패널 A 및 B에서, 다양한 고형 림프종에 존재하는 NMT2 단백질 수준의 차이는 면역 조직 화학에 의해 결정되었다:
B 세포 림프종을 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 봉입하여 원하는 두께(~ 5 마이크론 또는μm)로 마이크로톰에서 절단한 후 Superfrost® 플러스 양전하 슬라이드(Fisher Scientific) 상에 부착하였다. 염색전에 종양 조직을 포함하는 슬라이드를 자일렌에 10 분 동안 3 회 침지하여 탈파라핀시킨 후, 일련의 에탄올[100% 에탄올에 20 딥(4회 반복), 80% 에탄올에 20 딥, 및 50% 에탄올에 20 딥]에 세척하고 10 분 동안 차가운 흐르는 물로 최종 세척하였다.
항원의 회복(retrieval)을 위해, 슬라이드를 슬라이드 홀더에 장착하고, Nordicware® 마이크로웨이브 프레서 쿠커에 넣고, 800 mL의 10 mM 시트레이트 완충액 pH 6.0를 첨가하였다. 프레서 쿠커를 단단히 폐쇄하여 마이크로웨이브에 넣고 20 분 동안 마이크로웨이브처리하였다. 다음으로, 슬라이드드을 10 분 동안 차가운 흐르는 물에 세척하였다. 10 분 동안 메탄올 중 3% H2O2에 슬라이드를 담그고 3 분 동안 PBS에 세척하기 전에 10 분 동안 따뜻한 흐르는 물로 세척하여 퍼옥시다제 블록킹을 실시하였다.
다음으로, 여분의 PBS를 제거하고 시료 주변에 소수성 원을 PAP 펜(Sigma-Aldrich)으로 그렸다. 래빗 항-NMT1(Proteintech) 또는 래빗 항-NMT2(Origene)을 다코 항체 희석 버퍼(Dako, Agilent Technologies)로 1:50으로 희석하고 파스퇴르 피펫으로 추가(슬라이드 당 ~400 L)하여 4℃의 습도 챔버에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 슬라이드를 PBS로 2 회 각 5 분 동안 세척하고 DAKO EnVision+System-HRP labeled polymer (anti-Rabbit) (Dako, Agilent Technologies) 4 방울을 각 슬라이드에 첨가하여 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 다시 PBS로 2 회 각 5 분 동안 세척하고 Liquid DAB (diaminobenzidine) + substrate chromogen (제조사의 지침에 따라 제조; Dako, Agilent Technologies) 4 방울을 첨가하여 5 분 동안 발색시킨 후 차가운 물에서 10 분 동안 세정하였다.
슬라이드들을 5 분 동안 1% CuSO4에 담근 후, 차가운 흐르는 물로 짧게 세정하고, 60 초 동안 헤마토실린으로 카운터염색한 후 맑은 물이 나올 때까지 차가운 흐르는 물로 세정하였다. 다음으로, 슬라이드들을 리튬 카보네이트에 3 회 침지하고 흐르는 수돗물로 짧게 세정하였다. 슬라이드들을 일련의 단계에서 탈수시켰다; 50% 에탄올에서 20 딥, 80% 에탄올에서 20 딥, 및 100% 에탄올에서 20 딥(4 회 반복) 및 최종적으로 크실렌(3 회 각 10 분). 커버슬립을 슬라이드에 첨가한 후 니콘 이클립스 80i microscop를 이용하여 종양 시료의 현미경 관찰을 실시하였다. QImaging 과학 카메라(Qimaging)를 이용하여 이미지를 생성하였다.
정상 림프절, 버킷 림프종(BL) 및 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL 또는 LCL)의 NMT 면역 조직 화학적 염색. A) NMT1 염색: 양 정상 림프절 모두, 및 비치료된 버킷 림프종(BL1-3)과 DLBCL(LCL1-3)의 세 독립적인 예들 각각은 NMT1 단백질에 대해서 한결같이 강하게 양성으로 염색되었다(갈색 퍼록시다제 반응 산물 색깔[어두운 회색으로 표시]). 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 음성 대조군은 일차 항체를 생략함으로써 얻어졌다. 윗줄: N1, N2 정상 림프절, Neg 음성 대조군. 중간줄: 세 버킷 림프종(BL1-3) 예들. 밑줄: 세 DLBCL(LCL1-3) 예들. 두 정상 림프절 및 림프종은 강한 염색을 보여준다. B) NMT2 염색: 양 정상 림프절 모두는 NMT2 단백질에 대해서 한결같이 강하게 양성으로 염색되었다(갈색 색깔, 어두운 회색으로 표시). 표시된 반면, 비치료된 버킷 림프종과 DLBCL의 세 독립적인 예들의 각각은 NMT2에 대하여 매우 약한 염색만을 보여준다(하늘색 또는 밝은 회색으로 표시). 음성 대조군은 일차 항체를 생략함으로써 얻어졌다. 윗줄: N1, N2 정상 림프절, Neg 음성 대조군. 중간줄: 세 버킷 림프종(BL1-3); 밑줄: 세 DLBCL(LCL1-3).
도 8의 패널 C 및 패널 D는 NMT2 발현이 부족한 세포주에서 NMT1의 발현이 현저하게 증가하지 않는다는 것을 보여준다. 패널 C에서, NMT1 및 NMT2에 대한 log2(마이크로-어레이 형광 강도 NMT)를 CCLE 데이터베이스의 모든 세포주에 대해 플롯팅하였다. 패널 D에서, NMT1 및 NMT2에 대한 log2(마이크로-어레이 형광 강도 NMT)를 가장 낮은 NMT2 발현 수준을 나타내는 CCLE 데이터베이스의 100 개 세포주에 대해 플롯팅하였다.
도 8의 패널 E는 농도계 측정이 지원되는 광학 현미경 컴퓨터를 이용하여NMT2 결정을 정량화한 예를 보여준다. 시각적으로, 이러한 숫자들은 악성 림프구의 염색 강도와 매우 관련되었다. 선택된 컷 포인트는 강 vs no/약 염색으로 선택되었다.
실시예 10
이 실시예의 도 9은 72 시간 동안 DDD85646로 처리한 다양한 B 림프구 세포주의 잔여 생존율을 나타낸다(도 9a). 도 9a의 곡선은 Leatherbarrow, RJ(2009)에 기재된 4 파라미터 방정식에 따라 플롯팅되었다. 방정식을 이용한 GraFit 분석에 대한 GraFit 버전 6(Erithacus Software Ltd., Horley, U.K):
Figure 112015052706347-pct00003
상기 범위(Range)는 일치하는 비억제된 값(fitted uninhibited value)에서 백그라운드를 뺀 것이고, s는 기울기 인자이다. 방정식은 Y가 X가 증가함에 따라 떨어질 것으로 가정한다. A 및 B. 결합된 플롯(n=4).
도 9의 A 패널에서, 관련 대조군[NMTs 모두를 발현하는 IM9("정상" B 림프구) 및 KMH2(HL 세포주)]를 따라 DDD85646의 증가하는 농도를 이용하여 BL 세포주(BL-2 및 라모스)에 처리하였다. 트리판 블루 분석을 이용하여 24, 48, 및 72 시간 째에 DDD85646의 세포 독성을 측정하였다. 데이터는 24 시간 및 48 시간 지점에서 수집되었지만(데이터 미도시), DDD85646의 가장 눈에 띄는 효과는 72 시간의 시점에서 관찰되었다.
DDD85646 농도 의존적으로 사용된 B 림프종 세포주(라모스: DDD85646 EC50=0.37+/- 0.05 μM 및 BL2: DDD85646 EC50=0.43+/-0.2 μM) 에서 생존율이 감소하였다. 대조군 세포주 IM-9 (DDD85646 EC50=7.08+/-2.32 μM) 및 KMH2 (DDD85646 EC50=29.6+/-10.6 μM)의 생존율이 높았다. EC50 데이터를 하기에 요약하였다.
Figure 112015052706347-pct00004
BL 세포에서 DDD85646은 낮은 EC50(암 세포의 50%를 죽이는 농도)을 나타냈고, HL(KMH2) 세포에서 높은 EC50을 나타냈다. 따라서, DDD85646는 암세포에 대한 높은 선택적 사멸 지수(killing index)를 나타내었다. 본 명세서에 이용된 바와 같이, 본 발명자들은 불멸화된 B 세포의 EC50/악성 체포의 EC50 비율로 선택적 사멸 지수를 정의한다. DDD85646에 대한 선택적 사멸 지수는 각각 BL-2에서는 16.4, 라모스 세포에서는 19.1이었다.
도 9의 패널 B에서, DDD86481를 이용하여 BL 세포 및 대조군 세포주[NMTs 모두를 발현하는 IM9("정상" B 림프구) 및 KMH2(HL 세포주)]에 처리하였다. 세포 생존율을 48 시간 및 72 시간에 MTS 분석을 이용하여 측정하였고, 본 발명자들은 48 시간에서 세포 생존율에 대한 중요한 변화를 관찰하지 못했으나(데이터 미도시), 테스트된 BL 세포주의 생존율이 DDD86481 농도 의존적으로 72 시간 지점(라모스: DDD86481 EC50=42 nM 및 BL2: DDD86481 EC50=58 nM)에서 유의하게 감소된 것을 발견하였다. 대조군 세포주 IM-9 (DDD86481 EC50=2.2 μM) 및 KMH2 (DDD86481 EC50=12.6 μM)의 생존율은 높았다. DDD86481에 대한 계산된 선택적 사멸 지수는 각각 BL-2은 37.9, 라모스 세포는 52.3이었다. EC50 데이터를 하기에 요약하였다.
Figure 112015052706347-pct00005
세포 유형 설명과 DDD85646 및 DDD864841에 대한 EC50을 나타내는 하기 표에서, 하나의 NMT(NMT1)만을 발현하는 B 림프종 세포(BL-2 및 라모스)가, NMTs 모두를 발현하는 불멸화된 "정상" B 세포 또는 비-호지킨 림프종 세포주보다 DDD85646 또는 DDD86481에 대하여 15-72 배 더욱 민감하다.
Figure 112015052706347-pct00006
하기 표는 버킷 림프종 세포주(BL-2 및 라모스)과 "정상" 불멸화된 B 세포에서 DDD86481에 대한 약학적 EC50 및 EC90의 데이터의 요약을 제공한다(도 9B에서 계산된 데이터).
선택 지수는 EC50 및 EC90의 비율을 보여주고 이는 DDD86481가 인자(factor)> 300 배에 의해 우선적으로 암 세포를 죽인다는 것을 가리킨다(정상 B 세포주를 죽이는 데 필요한 농도가 더 높기 때문에).
Figure 112015052706347-pct00007
도 9C에서 DDD73226를 이용하여 관련 대조군[NMTs 모두를 발현하는 IM9("정상" B 림프구) 및 KMH2(HL 세포주)]에 따라 BL 세포주에 처리하였다. DDD73226의 세포 독성을 72 시간 째에 트리판 블루 배제 분석을 이용하여 측정하였다. 세포 생존율에 대한 유의한 변화가 24 시간 및 48 시간에서 관찰되지 않았다(데이터 미도시). 또한, 세포에 72 시간 시점에서 100 μM의 높은 농도로 DDD73226를 처리했을 때, IM9, KMH2 및 라모스 세포의 생존력에 유의한 변화가 없었다. 그러나, 다른 세포들에 비해, 72 시간에 100 μM DDD73226로 처리한 BL2 세포에서 세포 생존율의 약간의 감소가 관찰되었다. 이론에 얽매이고자하는 것은 아니지만, 라모스 및 다른 세포주에 비교한 경우 이것은 심하게 감소된 NMT2 수준을 갖는 것외에 BL2 또한 낮은 NMT1 수준을 갖는 것 때문에 수 있고, 따라서, 심지어 덜 강력한 NMT 억제제의 작용에 더욱 민감할 수 있다 .
도 9D(패널 i 및 ii)에서, IM-9 및 BL2 세포를 DDD86481(0, 1, 및 10 μM)로 0, 1, 또는 4 시간 동안 처리한 후 1 시간 동안 100 μM ω-알키닐-미리스테이트로 표지한 경우의 시간-경과 실험을 나타낸다. 단백질 시료들을 클릭 화학을 이용하여 아지도-비오틴과 반응시키고 NeutrAvidinTM-HRP로 웨스턴 블로팅하여 가시화시켰다. DDD86481의 억제 작용은 처리 1 시간 후 1 μM DDD86481로 처리한 세포주(IM-9 및 BL2 모두)에서 미리스토일화의 거의 완전한 억제와 함께 신속하였다.
도 9E에서, IM-9, BL2 및 라모스 세포주에서의 미리스토일화를 억제하기 위해 필요한 최소한의 DDD86481의 투여량을 결정하였다. 마지막 처리 1 시간 동안 알키닐-미리스테이트로 표지한 신진 대사 세포와 함께 2 시간 동안 0, 10, 50, 100, 500 및 1000 nM 농도의 DDD86481로 세포를 처리하였다. DDD86481은 테스트한 모든 세포주에서 농도 의존적으로 미리스토일화를 억제하였다. 알키닐-미리스테이트 표지의 알키닐-미리스토일화된 단백질 내로의 혼입(incorporation)의 감소는, 알키닐-미리스테이트 표지의 혼입이 100 nM 농도에서 감소되기 시작하는 IM-9에 비교하여 BL 세포주 모두 50 nM에서 명백히 시작하므로, BL-2 및 라모스 세포주는 DDD86481의 억제 작용에 더 민감하였다.
표 6은 DDD85646 또는 DDD86481의 예비 전임상 특성을 보여준다.
Figure 112015052706347-pct00008
실시예 11
본 실시예에서, 도 10은 다양한 불멸화된 정상 L0 B 림프구(Riabowol 박사, 캘거리 U.로부터 획득), 악성 B 림프종 세포 (라모스 및 BL2), 및 T 세포 백혈병(CEM)의 민감도를 24시간 동안 NMT 억제제 TrisDBA에 대하여 나타낸다. (A) 24 시간 동안 TrisDBA로 처리한 다양한 세포주들의 잔여 생존율(n=9) (B) 24 시간 동안 TrisDBA로 인큐베이션한, NMT1 또는 NMT2를 일시적으로 발현하는 COS7 세포에서의 N-미리스토일트랜스퍼라제(myristoyltransferase) 활성에 대한 TrisDBA의 효과. TrisDBA에 대한 인 비트로 IC50은 NMT1에 대해서는 약 2 μM 및 NMT2에 대해서는 약 5 μM이다. 버킷 림프종 세포주 라모스 및 BL-2는 NMT 억제제 TrisDBA에 더욱 민감하다.
실시예 12
본 실시예의 도 11에서, 967 CCLE(cancer cell lines encyclopedia) 데이터베이스에서의 NMT 발현 수준을 결정하였다. 패널 A) CCLE 데이터베이스를 NMT1 및 NMT2 발현에 대해 조사하고 각 NMT 수준을 플롯팅하였다. NMT2는 NMT1(~ 6-9)에 비해 넓은 범위의 발현(~ 3-11)를 나타낸다. 패널 B) 여러 암 유형으로부터 암 세포주의 박스 및 위스커 플롯을 플롯팅하고 모든 967 암 세포주의 플롯과 비교하였다. 모든 종양에 대한 각 그룹을 비교하는 Student-T 테스트를 실시하였다. **는 P 값 <0.001을 나타낸다. 패널 C) CCLE 데이터베이스를 가장 낮은 NMT2 수준을 발현하는50 개의 세포주에 대해 조사하고, 표 형식으로 나타내었다. 다양한 조혈 및 림프 조직으로부터 유래된 종양 세포주들은 가장 낮게 NMT2를 발현하는 세포주의 76%(5 0 개 중 38 개)를 나타내고, 다양한 색상으로 표시된다.
실시예 13
본 실시예의 도 12에서, NMTs는 아폽토시스 동안 분해되지만 활성 상태로 유지된다. 패널 A 및 B. 항-Fas 또는 스타우로스포린 매개 아폽토시스를 겪도록 유도된 주르카트 세포의 용해물을 웨스턴 블롯팅에 의하여 항-NMT1 및 항-NMT2로 탐침하였고, 양 효소의 시간 의존적 분해를 보여준다. PAK2 및 GAPDH에 대한 항체를 사용하여 시료에 대하여 웨스턴 블롯팅을 동일한 실시하였다. 패널 C 및 D. 세포가 죽기 시작하므로 항-Fas 또는 스타우로스포린 매개 아폽토시스를 겪도록 유도된 주르카트 세포의 ω-알키닐-미리스테이트의 혼입은 미리스토일화 프로파일의 변화를 나타내고 이는 NMTs가 절단되어 있지만 그들은 여전히 활성화되어 있다는 것을 제시한다. 주르카트 세포를 항-FAS(100 ng/ml)와 사이클로헥시미드 (5 μg/㎖)(C) 또는 스타우로스포린(2.5 μM)과 사이클로헥시미드(5 μg/㎖)(D)로 아폽토시스 유도 후 25 μM 알키닐-미리스테이트로 신진 대사적으로 표지하였다. 단백질 시료들을 클릭 화학을 이용하여 아지도-비오틴과 반응시키고 NeutrAvidinTM-HRP로 웨스턴 블롯팅하여 가시화하였다. 웨스턴 블롯팅 막에 의한 표지 혼입의 평가 전에 0.1 M KOH(B 및 D)에 인큐베이션하였다. 다양한 지정된 시간에서의 패널 (E)에서, ct-비드 N-말단 데카펩티드 및 [3H]-미리스토일-CoA을 이용하여 NMT 활성을 측정하였다. NMT 효소 모두를 절단하여도 모두 촉매 반응적으로 활성 상태를 유지하고, NMT1만이 활성의 상당한 손실을 나타낸다. (F) 인 비트로 카스파제-8 및 -3에 의한 NMT1 절단 및 카스파제-3에 의한 NMT1 절단의 재구성(쿠마시 염색된 겔). 정제된 His-NMT1 및 His-NMT2(각 5 ug)을 37℃에서 1 시간 동안 활성화된 카스파제 3 및 8(각 500 ng)와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 말미에 추가적으로 일반적인 카스파제 억제제(z-VAD-FMK)를 첨가하여 상기 진행으로부터의 반응을 정지시켰다. 상기 시료들을 즉시 베타-머캅토에탄올이 있는 5 x 샘플 로딩 완충액으로 끓여서 10% 아크릴아미드 겔 상에 로딩하고 PVDF 막 상에 트랜스퍼하였다. 이어서 단백질을 가시화하기 위해 쿠마시 블루로 막을 염색하였다. 에드만 분해를 위해 보냈던 절단 조각을 사각형으로 표시하고 D25 및 D67 후 D72 및 NMT2 후 NMT1에서 카스파제 절단 부위를 식별하도록 하였다.
실시예 14
본 실시예의 도 13은 재조합 GST- 및 His6-태킹 hNMT1 및 hNMT2의 정제를 나타낸다. 글루타티온 아가로스 상에서의 정제 패널 (A) 글루타티온 아가로스 상에서의 GST-NMT1 정제 및 (B) 글루타티온 아가로스 상에서의 GST-NMT2 정제, (C) Ni-킬레이팅 크로마토그래피 및 리소스 S 이온 교환 크로마토그래피에 의한 His6-NMT1 정제 및 (D) Ni-킬레이팅 크로마토그래피 및 리소스 S 이온 교환 크로마토그래피에 의한 His6-NMT2. 도 13의 패널 C 및 D에서, 래인들은 다음과 같다. 패널 (C) GelA: NMT1의 정제: 1) 모든 블루 마커, 2) Ni-NTA 컬럼 풀, 3) 겔 여과 풀, 4) 리소스 S의 FT, 5) 분획 8(f8), 6) f16, 7) f18, 8) f19, 9) f20, 10) f21, 11) f22, 12) f41, 13) f42, 14) f66, 15) f67. 패널 (D) Gel B: NMT2의 정제: 1) 모든 블루 마커, 2) Ni-NTA 컬럼 풀, 3) 겔 여과 풀, 4) 리소스 S의 FT, 5) 분획 21(f21), 6) f28, 7) f38, 8) f39, 9) f40, 10) f41, 11) f42, 12) f44.
실시예 15
본 실시예의 도 14는 정제된 재조합 전장(full-length) His6-NMT1 및 재조합 "카스파제-절두" ct-His6-NMT1 간의 효소적 활성 비교를 나타낸다. 전장 His6-NMT1(aa 73-496). NMT 활성은 King et al. 1999, Anal Biochem에 적용된 펩티드 미리 스토일화 분석법을 이용하여 분석하였다. 중복 실험.
실시예 16
본 실시예의 도 15은 다양한 NMT 억제제 및 상이한 세포주의 IC50 및 EC50의 비교를 나타낸다. 그래프는 생화학적 효소 분석에 있어 8 NMT 억제제의 생화학적 효능(IC50) 및 7 개의 세포주를 이용한 아라마르(alamar) 블루 세포 생존율 분석에 있어 그들의 효능(EC50) 사이의 상관 관계를 나타낸다. 회귀 분석을 각 세포주에서 실시하였고 0.9(범위 0.82-0.96)의 평균 R2 값을 나타내었다. 다양한 IC50 및 EC50 사이의 상관 관계의 높은 수준은, 세포 생존율 분석에서 분자의 활성은 NMT에서의 그들의 저해 활성에 기인한다는 강력한 증거이다. 분자 2 쌍은 생화학적 분석에서 유사한 효능을 갖는다는 것을 주목해야 한다.
실시예 17
본 실시예의 도 16은 BL 세포에서의 아폽토시스의 DDD86481 유도를 나타낸다.
"정상" 불멸화된 B 림프구(IM9), KMH2(호지킨 림프종) 및 BL(BL2 및 라모스) 세포들을 증가되는 농도(nM)의 DDD86481로 인큐베이션하고 72 시간 시점 이후 PARP-1(poly-ADP-ribose polymerase-1) 및 카스파제-3의 절단을 모니터링하였다. 세포 용해물에 대하여 웨스턴 블롯팅을 실시하여 절단 또는 PARP-1 및 카스파제-3 뿐만 아니라 로딩 대조군(복합 겔)인 GAPDH의 존재를 모니터링하였다. BL 세포주를 억제제로 처리한 경우, PARP-1 및 카스파제-3 모두의 절단은 용량-의존적으로 일어났으며, 이는 이들 세포가 아폽토시스를 겪는다는 것을 나타낸다. 어떠한 PARP-1 또는 카스파제-3의 절단도 억제제를 처리한 "정상" IM9 세포에서 관찰되지 않았다. 그것은 BL 세포에서 관찰된 PARP-1 절단에 비해 최소였으나, KMH2(HL) 세포에서의 PARP-1 절단은 더 높은 농도에서 관찰되었다. 따라서, 본 발명자들은 DDD86481로 처리한 경우 BL 세포가 "정상" B 세포보다 아폽토시스를 겪는 경향인 것을 발견하였다.
실시예 18
본 실시예의 도 17에서, 인간 종양에서의 NMT2 손실에 대한 임계값의 추정이 제공된다. 표 7에, 가능한 경우 NMT2 mRNA의 발현 수준을 CCLE 데이터 세트의 표시된 세포주에 대한 log2(마이크로-어레이 형광 강도 NMT2)로 나타낸다.
Figure 112015052706347-pct00009
도 17의 패널 A에서, 지정된 림프성 세포주를 웨스턴 블롯팅에 의해 NMT2의 존재에 대하여 탐지하였다. 도 17의 패널 B는, 패널 A 및 표 7과 비교하여, 본 발명자들은 톨레도 세포에서 관찰된 log2(마이크로-어레이 형광 강도 NMT2) = 5.64에서 확인하였고, 웨스턴 블롯에 의해 어떠한 NMT2도 검출되지 않았다. NMT2 발현의 손실에 대한 실제 임계값이 5.64보다 높을 수 있지만, 본 발명자들은, 예를 들어, 임계값으로 이러한 숫자를 이용하여 인간 집단(패널 B)에서의 NMT2 손실의 대략적인 유병률을 설정하였다. 상기 데이터는 NMT2의 손실이 버킷 및 미만성 거대 B-세포 림프종에서 뿐만 아니라 많은 다양한 기타 종양 유형에서도 나타난다는 것을 의미한다(또한, 최소한 NMT2를 발현하는 50 개 세포주를 나타낸 도 11C 및 다양한 암 유형에서의 NMT2 손실의 유병률에 대한 표를 참조).
따라서, 본 명세서에는 하나 이상의 NMT1 억제제로 치료하기에 적합한 NMT2-결손(deficient)인 암을 식별하는 방법이 제공된다. 일 실시예에서, 임계값 이하의 mRNA 수준 또는 농도를 갖는 환자 시료는, 상기 환자가 NMT1 억제제로 치료하기에 좋은 후보인 것을 나타낸다. 일부 실시예에서, 상기 임계값 이하의 mRNA 수준은 저발현으로 지칭한다. 일 실시예에서, 임계값 이상의 mRNA 수준 또는 농도를 갖는 환자 시료는, 상기 환자가 NMT1 억제제로 치료하기에 나쁜 후보인 것을 나타낸다. 일부 실시예에서, 상기 임계값 이상의 mRNA 수준은 고발현으로 지칭한다.
톨레도 세포에 대하여 설정된 임계값 이외 또는 대신, 대체 소스가 적절한 임계값이 될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시예에서, 임계값을 얻는데 이용된 상기 소스 또는 대조군은 테스트된 암과 동일한 세포 유형이다. 일부 실시예에서, 상기 소스 또는 대조군 임계값은 데이터베이스에 저장되거나 발견된다.
실시예 19
본 실시예의 도 18은 스트렙타비딘-세파로즈 비드를 이용하여 백혈병 주르카트 T 세포에서 후-번역(post-translationally) ω-알키닐-미리스토일화된 단백질을 풀-다운하는 데스티오비오틴(desthiobiotin)-PEG-아지드 프로브의 사용을 보여준다.
데스티오비오틴(I에 도시)은 가역적으로 아비딘 및 아비딘-유사 단백질에 결합하는 비오틴의 유사체이다. 본 발명자들은 데스티오비오틴-PEG-아지드(I.) 및 비오틴-PEG-아지드(II.)의 합성을 설계 및 주문하였다.
(B)에서 주르카트 T 세포는 ω-알키닐-미리스테이트의 존재 하에서 배양시키고 사이클로헥시미드의 존재하에서 항-Fas 매개 아폽토시스를 거치도록 유도하였다. 세포 용해 후, 용해물을 클릭 화학을 이용하여 데스티오비오틴-PEG-아지드와 반응 여부, 뉴트라비딘-세파로스 비드와 혼합하여, 세척하고, 10 mM이 비오틴으로 용출하였다. 패널 B(i)는 데스티오비오틴화-후-번역 미리스토일화된 단백질(desthiobiotinylated-post-translationally myristoylated protein)이 풀 다운되고 뉴트라비딘 비드 래인 5,6,7 및 B (III)로부터 효율적으로 복구될 수 있음을 보여준다. 패널 B(II)는 데스티오비오틴-PEG-아지드가 클릭 반응으로부터 제거된 대조군을 나타낸다. 이 경우, 극소수 단백질이 뉴트라비딘-비드에 결합하여 용출되었다(희미한 밴드로만 75kDa에서 볼 수 있다). 이러한 결과들은 프로테옴 분석을 가능하게 하고 공동- 및 후-번역 미리스토일화된 단백질 또는 미리스토일옴(myristoylomes)의 세포 내 함량(content)을 평가하는 방법의 개발을 나타낸다.
실시예 20
본 실시예의 도 19는 스트렙타비딘-자성 비드를 이용하여 백혈병 주르카트 T 세포에서 후-번역 ω-알키닐-미리스토일화된 단백질을 풀 다운하는 데스티오비오틴-PEG-아지드 프로브의 확장된 규모의 이용을 보여준다. 3 시간 동안 스타우로스포린 2.5 μM로 아폽토시스를 거치도록 주르카트 세포를 유도한 후, 37℃에서 1 시간 동안 BSA에 컨쥬게이션된 100 μM 미리스테이트(C14)(패널 A) 또는 알키닐-미리스테이트(Alk C14)(패널 B) 모두로 표지하였다. 세포를 수집하여, 용해하고 클릭 화학을 이용하여 아지도-데스티오비오틴과 반응시켰다. 데스티오비오틴-알키닐-미리스토일화된 단백질을 스트렙타비딘 자성 비드와 결합시키고, 세척하여, 15 분 동안 37℃에서 2% SDS를 포함하는 50 mM 비오틴으로 용출하였다. 용출 1(B 패널)은 대부분의 데스티오비오틴-미리스토일화된 단백질을 포함하는 반면, 미리스테이트(A 패널)로 표지된 세포로부터의 용출 1에서는 약간만이 발견되었다. 노출 시간: 5 초.
실시예 21
본 실시예의 도 20은 알키닐-미리스테이트로 표지된 "정상" 불멸화된 B 세포(IM9) 및 BL 세포(BL2 및 라모스)의 미리스토일화 프로파일을 나타낸다. 수집전에 1 시간 동안 100 μm 알키닐-미리스테이트로 세포들을 신진 대사적으로 표지하였다. 단백질 시료들을 클릭 화학을 이용하여 아지도-비오틴과 반응시키고, 각 세포 용해물로부터의 25 μg의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하여 NeutrAvidinTM-HRP를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 가시화시켰다. 화살표는 "정상" 불멸화된 B 림프구 IM9에는 존재하나 BL 세포(BL2 및 라모스)에서는 나타나지 않는 비오틴화-알키닐-미리스토일화된 단백질을 나타낸다.
실시예 22
본 실시예의 도 21은 DDD86481 및 독소루비신(doxorubixin)의 조합으로부터의 시간 및 용량 의존적 세포 독성 그래프를 나타낸다. B 림프구 세포주 IM-9(A) 및 BL-2(B)에 24, 48 또는 72 시간(위에서 아래로) 동안 0 (파란색) , 17 (빨간색) 및 86 nM (녹색) 히드록시독소루비신과 증가하는 농도의 DDD86481(0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 10 및 100 μM)을 함께 처리하였다. MTS 분석은 독소루비신과 개별적으로 독성이 덜한 DDD86481의 농도에 의해 유도된 세포사(cell kill)를 보여주며; 이러한 효과는 시너지 작용과 일치한다. 24, 48 시간 시점에서 단독으로 사용한 DDD86481에 대한 EC50에 비하여 두 화합물을 함께 이용하는 경우 EC50가 6 배나 낮은 것을 특징으로 한다.
실시예 23
본 실시예의 하기 표 8은 북미의 여러 인간 암에서의 NMT2 손실의 대략적인 유병률의 평가를 제공한다. 본 발명자들은 어떠한 NMT2도 없는 세포(톨레도, 실시예 18 참조)에 해당하는 log2(마이크로어레이 형광 강도)에 대한 5.64의 최소 컷-오프 값을 설정하였고, 967 개 세포주 중 114 개가 이 임계값(~ 12 %)에 속하는 것을 발견하였다. 각각의 종양 유형에 대한 북미 발생률인 환자의 수는 NMT 억제제 치료법으로부터의 이점(임계값에서 발생률 X%) 및 선택된 암의 의료 요구에 대한 근거를 나타낸다.
Figure 112015052706347-pct00010
실시예 24
본 실시예의 도 22에서, DMSO, 스타우로스포린, FAS α 또는 담체 단독으로 인큐베이션한 세포로 면역블롯팅을 실시하였다. 얻어진 면역블롯들을 항-NMT1 항체, 항-NMT2 항체, 항 PARP-1 항체 및 항 GAPDH 항체로 탐지하였다. 아폽토시스의 유도에 따라 절단된 NMT에서 이러한 데이터들은 포함한다.
특히, 본 실시예의 도 22A에서, 살아있는 세포 및 죽어가는 세포들에서 NMTs의 역할(들)을 조사하였다. 항-Fas 또는 STS로 프로그래밍된 세포사를 거치도록 유도된 주르카트 T 세포들을 NMTs에서 그들의 함량에 대하여 분석하였다. 주르카트 T 세포에 사이클로헥시미드와 함께 DMSO, 스타우로스포린(2.5 μM) 또는 항-Fas(300 ng/ml)을 처리하고, 시료들을 0, 2, 4, 6 및 8 시간 시점에서 수집하였다. 세포들을 용해하고 NMT1, NMT2, PARP-1 및 GAPDH의 존재하에 ECL을 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다. 항-Fas 또는 STS로 처리된 주르카트 T 세포는 NMT1 및 NMT2 모두의 시간 의존적 절단을 초래하였다(도 22A). 세포사(cell death) 유도 2 시간 후 NMT1의 절단이 시작된 반면, NMT2는 아폽토시스 유도 4 시간 후 검출되었다.
명백한 67 kDa 단백질에서 이동된 NMT1의 절단(예상 M.W. = 56.8 kDa)은 명백한 ~46 kDa 단편을 초래하였다(도 3.1). 명백한 65 kDa 단백질에서 이동된 NMT2의 절단(예상 M.W. = 56.9)은 초기 시점에서 명백한 ~55 kDa 단편을 생성하였고, 이는 후기 시점(4 및 8 시간)에서 ~46 kDa의 짧은 단편 또는 이하의 단편으로 전환된다. 이 짧은 NMT2 단편은 비-특이적 단백질 밴드와 오버랩핑되는 것으로 보였다. 그러나, 도 3.2(8H) 및 3.4 A(4 시간 및 8 시간)에서의 Fas-처리된 주르카트 세포 용해물이 더욱 가시화되었다. 따라서, NMT1 및 NMT2의 분열은 주요하게 초기에 각각 ~11 kDa 및 ~ 10kDa 단편의 손실을 초래한다. 명백한 이동 및 NMTs의 예측 분자량 간의 불일치에 대한 이유는 알려져 있지 않다. NMTs 절단의 타이밍은 아폽토시스 마커 PARP-1의 그것과 대응하며, 이는 카스파제의 작용에 기인한다는 것을 제시한다.
NMT1은 카스파제-3 또는 -8의 기질이며, NMT2은 카스파제-3의 기질이다.
도 22 패널 B의 실험에서, 카스파제가 NMTs의 절단에 관여되는지 여부를 조사하기 위해 본 발명자들은 주르카트 T 세포에서 카스파제의 일반적인 억제제와 함께 카스파제-3, -8 및 -9의 고-특성화된 비가역적 억제제의 존재 또는 부재하에서 항-Fas 매개 아폽토시스를 유도하여, 두 NMTs의 세포 내 함량을 분석하였다. 주르케트 T 세포에 1 시간 동안 10 μM의 카스파제 억제제를 처리한 후 항-Fas(300 ng/㎖) 및 사이클로헥시미드(5 μg/mL)로 처리하여 아폽토시스를 유도하였다. 시료들을 0, 4, 및 8 시간 시점에서 수집하였다. 세포들을 용해시키고, NMT1, NMT2 및 PARP-1의 존재를 ECL을 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다. 블롯들을 제거하고 항-튜불린(로딩 대조군)(복합 젤)으로 재탐지하였다.
NMT1의 절단은 일반적 및 카스파제-8-특이적 억제제들에 의해 폐지된 반면, 카스파제-3-특이적 억제제에 의해 부분적으로만 블록킹되고(도 22B), 이는 NMT1이 카스파제-3 또는 -8의 기질이라는 것을 의미한다. 대조적으로, NMT2 절단은 이용된 모든 카스파제 억제제에 의해 현저하게 억제되었다(도 22B). 개시제 카스파제-8 또는 -9의 억제가 차례로 효과기 카스파제-3의 절단 및 활성을 억제할 수 있으므로, 이것은 NMT2가 카스파제-3의 기질일 가능성을 제시한다. 항-Fas에 의해 유도된 아폽토시스의 진행은 항-PARP-1 항체와 웨스턴 블롯팅에 의해 확인되었다(도 22B). PARP-1 절단의 정도는 NMT1 및 NMT2의 그것을 수반하고 비례하였다.
실시예 25
본 실시예의 도 23에서, 카스파제 절두된 NMT2는 전장 NMT2보다 3-4 배 이상 활성화된다는 것을 보여준다. 정제된 전장 및 카스파제-절단 헥사히스티딘(His) -NMTs의 NMT 활성을 펩티드 미리스토일화 분석을 이용하여 분석하였다. N-미리스토일트랜스퍼라제 활성을 포스포셀룰로오스 페이퍼 상에 생성 및 검출된 방사성 동위 원소 표지 미리스토일펩티드(myristoylpeptide)의 양으로 계산하였다(King et al.1991, Anal Biochem을 적용). 각 NMT 분석을 세번 실시하였다. 이용된 대조군은 His-NMT1 정제로부터에서 용출 5이다. 카스파제 절두된 NMT2는 전장 NMT2보다 3-4 배 이상 활성화된다.
실시예 26
본 실시예의 도 24에서, BL 세포의 NMT2 수준의 감소는 히스톤 데아세틸라제의 작용과 관련있는 것으로 나타난다.
도 24의 실험에서, 본 발명자들은 NMT2 좌(locus)에서의 유전자 침묵의 관련 가능성을 평가하기 위해 노력하였다. HAT(histone acetylases)에 의한 히스톤의 리신 잔기의 ε-아미노 기(group)의 아세틸화가 히스톤의 양전하 감소를 초래하고, 이는 염색질 형태를 이완시켜서 전사 장치들이 DNA에 보다 접근할 수 있도록 한다 (Barneda-Zahonero, B., and M. Parra. 2012. Histone deacetylases and cancer. Mol Oncol. 6:579-589.). 따라서, 히스톤 아세틸화는 통상적으로 유전자 활성화와 관련된다. 반면, HDAC(histone deacetylases)에 의한 히스톤으로부터 아세틸 기의 제거는 염색질 응축을 유도하여 전사 억제 또는 유전자 침묵을 초래한다.
mRNA NMT2의 감소가 염색질 침묵 때문인지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 "정상" B 세포(IM9) 및 악성 BL 세포주에 SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)(보리노스타트(vorinostat)로도 명명), 클래스 I 및 클래스 II 히스톤 데아세틸라제 억제제를 24 시간 동안 처리하고, 웨스턴 블롯으로 NMT1 및 NMT2의 수준을 모니터링하였다. 특히, "정상" B 세포(IM9) 및 악성 BL 세포(라모스, BL2)는 24 시간 동안 1 μm SAHA(HDAC 클래스 I/II 억제제)로 처리하였다. 세포들을 용해한 후 SDS-PAGE를 실시하고, 웨스턴 블롯팅을 NMT1, NMT2, p21/WAF1 및 GAPDH 항체로 실시하였다.
본 발명자들은, NMT2 수준이 일반적으로 고갈된 경우 SAHA의 이용이 BL 세포의 NMT2 수준을 증가시킨 반면, NMT1 수준은 상대적으로 변화가 없다는 것을 발견하였다. CDK1(cyclin dependent kinase 1) 또는 CDK2 복합체에 결합하여 활성을 억제하는 단백질인 p21/WAF1를 대조군으로 이용하여 SAHA의 효과를 확인하였고, 이는 세포의 p21/WAF1 유전자 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다. SAHA를 처리한 aheems 세포들은 증가된 p21/WAF1 수준을 포함하였다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이러한 데이터들은 클래스 I 또는 클래스 II HDAC가 히스톤을 탈아세틸화함으로써 NMT2 유전자를 침묵시키고, 이에 의해 BL 세포의 NMT2 좌가 응축된다는 시사한다.
일 실시예에서, HDAC 억제제는 NTM2-결손인 암을 치료하는 데 이용된다.
실시예 27
본 실시예의 도 25에서, NMT2 단백질 수준은 다양한 BL 세포주에서 감소된다는 것을 보여준다. 다양한 림프구 세포주로부터의 용해물을 로컬 연구자로부터 수집하고 그들의 NMT 함량에 대하여 분석하였다. 상기 결과들은, NMT2 단백질 수준이테스트된 모든 버킷 림프종(BL2, 다우디, 라모스 및 BJAB)에서 "정상", 불멸화된 림프아구성 B 세포주, IM9, L0 및 VDS에서 감소되었다는 것을 증명한다.
실시예 28
본 실시예의 도 26에서, 프로테오소말(proteosomal) 분해가 BL 세포에서 NMT2 결손의 원인이 아니라는 것을 보여준다. 이 실험에서, "정상" 불멸화된 B 림프구(IM9) 및 악성 B 림프종 세포들[호지킨 림프종(KMH2) 및 BL(라모스, BL2)]에 5 시간 동안 프로테오소말 억제제(MG-132) 10 μM을 처리하였다. 웨스턴 블롯팅을 세포 용해물에 대하여 실시하여 NMT1, NMT2, Mcl-1 및 GAPDH 수준을 모니터링하였다.
NMT2의 분해가 암 세포의 NMT2를 불안정하게 하는 돌연변이 또는 불안정하게 할 수 있는 미지의 인자의 존재의 결과로서 증가하는 지의 여부를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 5 시간 동안 프로테오소말 분해 억제제 MG-132를 정상 및 악성 림프구에 처리하였다. 세포 용해물에 웨스턴 블롯팅을 실시하여 NMT1, NMT2 및 골수 세포 백혈병-1 단백질(Mcl-1)의 존재를 분석하였고, 프로테오소말 분해되므로 이를 대조군으로 이용하여 MG-132의 효과를 확인하였다.
상기 결과들은 MG-132 처리에 따라 BL 세포에서 NMT2 수준이 증가되지 않으며, 이는 악성 림프구에 존재하며 NMT2의 분해로 이어지는 불안정화 돌연변이 또는 불안정화 요인이 존재하지 않는다는 것을 시사한다. MG-132로 처리된 세포들은 모든 세포 유형에서 Mcl-1의 수준의 증가로 이어졌다.
실시예 29
본 실시예의 도 27에서, NMT1은 카스파제-8에 의해 절단되지만, NMT2는 그렇지 않은 것으로 나타났다. 주르카트 T 세포(A) 및 카스파제-8 우성 음성 돌연변이체(dominant negative mutant)를 발현하는 주르카트 T 세포(B)를 DMSO 또는 항-Fas(150 ng/㎖)으로 처리하고, 시료들을 0, 4, 및 8 시간 시점에서 수집하였다. 세포들을 용해시키고 NMT1, PARP-1 및 절단된 카스파제-8의 존재를 ECL을 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다. *는 비-특이 밴드를 나타낸다.
야생형 주르카트 T 세포 및 카스파제-8 우성 음성 돌연변이체(C8DN)를 발현하는 주르카트 T 세포에서 NMT1의 절단을 조사하였다(Juo et al., 1998). 야생형 주르카트 T 세포에서 나타난 수준과 비교한 경우 아폽토틱 주르카트 T 세포에서의 C8DN 발현은 NMT1의 절단을 폐기시켰다(도 27A 및 B). 아폽토시스 유도 8 시간 후 주르카트-C8DN 세포에서 NMT2 절단의 최소량을 관찰하였다(도 27B). 또한, 상기 주르카트 T-C8DN 세포에서 PARP-1 및 카스파제-8의 절단이 억제되었다.
실시예 30
본 실시예의 도 28에서, NMT1 및 NMT2 모두는 카스파제-3에 의해 절단되었다. MCF7(A) 및 카스파제 3를 발현하는 MCF7(MCF7/caspase 3)(B)을 사이클로헥시미드(5 μg/㎖)와 함께 DMSO 또는 STS(2.5 μM)로 처리하고, 시료들을 0, 4, 및 8 시간의 시점에서 수집하였다. 세포들을 용해시키고 NMT2, PARP-1 및 절단된 카스파제 3의 존재를 ECL을 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다.
NMT1 및 NMT2 모두는 8 시간 시점의 세포 사멸성 MCF-7 세포에서 절단되지 않은 것으로 발견되었다(도 28A). 반면, 두 효소 모두는 카스파제-3을 안정적으로 발현하는 세포 사멸성 MCF-7 세포에서 용이하게 절단되었다(Kagawa et al., 2001) (도 28B). 또한, 아폽토시스를 유도한 경우 공지된 카스파제-3/-7 기질인 PARP-1의 절단이 MCF-7 세포주 모두에서 확인되었다(Walsh et al., 2008). 따라서, 두 NMTs은 카스파제-3의 기질인 것으로 나타난다(도 27A 및 B).
실시예 31
본 실시예의 도 29에서, 에드만 분해에 의해 식별된 NMT1 및 NMT2의 카스파제 절단 부위는 굵은 글씨체로 나타내고, 양전하 리신(K) 박스는 NMT1 및 NMT2 아미노산 서열상에서 강조된다(아미노산 1 내지 80).
N- 말단 시퀀싱은 NMT2가 D-25 및 D-67 부위 모두에서 절단된 것으로 나타났다(도 29). NMT1 및 NMT2 모두의 절단 부위가 상기 효소의 N-말단에 위치하고, C-말단 촉매 도메인에는 위치하지 않으며, 이는 절단된 효소가 아폽토시스 동안 여저히 활성화될 수 있음을 제시한다.
실시예 32
본 실시예의 도 30은 부위-직접 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)에 의한 NMT 절단 부위의 확인을 나타낸다. 일시적으로 야생형을 발현하는 HeLa 세포 및 돌연변이체 V5-NMT 구조체를 STS(2.5 μM)로 인큐베이션하였다. V5-NMT1 또는 V5-NMT2 구조체로 형질전환된 세포는 각각 4 시간 및 5 시간 시점에서 용해시켰다. 웨스턴 블롯팅을 시료들에 대하여 V5 및 α-튜불린(로딩 대조군) 항체를 이용하여 실시하였다.
N-말단 시퀀싱에 의해 밝혀진 NMT 절단 부위를 확인하기 위해, 본 발명자들은 N-말단 태깅 V5-NMT 벡터를 제작하고 Quickchange®의 부위-직접 돌연변이유발 키트(Stratagene)를 이용하여 NMT 절단 부위에서의 점 돌연변이를 생성하였다. 4 시간 동안 STS로 세포 사멸사를 거치도록 유도되어 적절하게 형질전환된 HeLa 세포에서 V5-NMT1의 설계된 D72E 돌연변이는 V5-NMT1의 카스파제-절단을 폐기하는 반면, V5-NMT1 수준은 이러한 세포에서 심하게 감소되었다(도 30). 이는 NMT1에서 카스파제-절단 부위로서 D72를 확인하였다.
N-말단 시퀀싱은 NMT2에 대한 두 개의 카스파제 절단 부위(D25 및 D67)를 밝히기 때문에, 본 발명자들은 D25 및 D67 모두를 글루타메이트(E) 잔기로 독립적[V5-NMT2 (D25E), V5- NMT2 (D67E)] 및 동시[V5-NMT2 (D25,67E)] 변이시켰다.
본 발명자들은, 적절하게 형질진환된 아폽토틱 Hela 세포에서 V5-NMT2 (D25,67E) 이중 돌연변이체의 절단이 심하게 폐기되는 반면, 단일 돌연변이체들 [V5-NMT2 (D25E), V5-NMT2 (D67E)]은 다양한 효과를 갖고, 야생형 V5-NMT2은 아폽토시스 유도 5 시간 후 대부분 절단되었다는 것을 발견하였다(도 3.8). 세포사멸사 동안 단일 돌연변이체의 보전성을 비교한 경우, 본 발명자들은 V5-NMT2(D25E)는 V5-NMT2(D67E)보다 재현성있게 약간 덜 절단되었다는 것을 관찰하였고, 이는 D25가 NMT2의 주요 절단 부위일 수 있는 반면, D67은 이차적인 절단 부위일 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 33
본 실시예의 도 31은 세포가 아폽토시스를 겪었을 때의 미리스토일화 프로파일의 변화를 나타낸다. 자르카트 세포들을 항-Fas(150 ng/㎖) 및 사이클로헥시미드(5 μg/mL)로 세포 사멸사를 유도한 후 25 μM 알키닐-미리스테이트로 신진 대사적으로 표지하였다. 단백질 시료들을 클릭 화학을 사용하여 아지도-비오틴과 반응시키고 NeutrAvidinTM-HRP로 웨스턴 블로팅에 의해 가시화되었다. 웨스턴 블롯팅에 의한 표지 혼입의 평가 전에, 막들을 0.1 M Tris-HCl 또는 0.1 M KOH에서 인큐베이션하였다.
자르카트 T 세포에 항-Fas를 이용하여 아폽토시스를 거치도록 유도하고 다양한 시점(0, 1, 2, 4, 및 8 시간)에서 세포를 수집하기 전에 ω-알키닐-미리스틱 산으로 30 분 동안 신진 대사적으로 표지하였다. 또한, 사이클로헥시미드를 세포에 추가하여 아폽토틱 자극의 일부로 단백질 번역(translation)을 억제시켰고, 이에 의해 아폽토시스 동안 공동-번역 미리스토일화를 블록킹하였다. 세포 용해물을 클릭 화학을 사용하여 아지도-비오틴과 반응시키고, 상술한 바와 같이 NeutrAvidinTM-HRP를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 비오틴화-미리스토일화된 단백질을 가시화하였다(Yap et al., 2010).
0 시에서의 미리스토일화 프로파일은 비-아폽토틱 세포에서 이전에 관찰된 공동-번역 미리스토일화 패턴과 상관 관계가 있었다(도 31)(Martin et al., 2008; Yap et al., 2010). 의도적인 낮은 노출은 세포 용해물에서 단지 약간의 미리스토일화된 단백질을 나타낸다. 알카리 처리가 약간의 단백질 밴드들로부터의 표지를 제거하므로, 알카리 내성 아미드 결합(alkali resistant amide bond)을 통하여 ω-알키닐-미리스틱 산이 단백질 내로 혼합된다는 것을 0.1M KOH로 처리된 막에서 확인하였다. 이러한 알카라인 처리는 팔미토일화된 단백질에서 발견된 티오에스테르 결합을 가수분해한다 (Armah and Mensa-Wilmot, 1999; Zhao et al., 2000; Vilas et al., 2006). 1 시간 동안 항-Fas 및 사이클로헥시미드로 아폽토시스의 유도 후, 공동-번역 미리스토일화를 감소되었고, 아마도 단백질 번역은 사이클로헥시미드에 의해 억제되는 것으로 추정된다. 이는 아폽토시스의 2 시간 후-유도에서 시작하고 실험 지속 기간 동안 지속된 전기 영동 미리스토일화된 단백질 프로파일에서의 주요 차이로 도시된 바와 같이 미리스토일화된 단백질의 세포내 함량의 변화로 이어졌다(도 31).
실시예 34
본 실시예의 도 32는 세포가 아폽토시스를 겪었을 때의 NMT 수준의 변화를 나타낸다. 자르카트 세포들을 항-Fas(150 ng/㎖) 및 사이클로헥시미드(5 μg/mL)로 세포 사멸사를 유도한 후 25 μM 알키닐-미리스테이트로 신진 대사적으로 표지하였다. 도 31과 동일하게 단백질 시료들에 NMT1, NMT2 및 GAPDH에 대한 항체들을 이용하여 웨스턴 블로팅을 실시하였다. (*)는 비-특이적 밴드를 나타낸다
이러한 결과들은 비록 NMTs가 세포 사멸사 동안 다양한 범위로 절단되지만, 미리 스토일화 활성은 세포 사멸사 유도 후 8 시간까지 세포에 남아 있는 것을 보여준다.
실시예 35
본 실시예의 도 33은 스타우로스포린 및 사이클로헥시미드로 아폽토시스를 거치도록 하기 위하여 일시적으로 V5-NMT1 및 V5-NMT2를 발현하는 COS7 세포의 유도를 나타낸다. NMT 활성은 펩티드 미리스토일화 분석을 이용하여 분석하고, 웨스턴 블롯팅을 v5 및 알파-튜불린(로딩 대조군)에 대한 항체를 사용하여 시료에서 실시하였다.
도 34은 일시적으로 형질전환된 COS7 세포의 용해물에서의 초기 NMT 활성을 나타낸다. 일시적으로 V5-NMT1 및 V5-NMT2를 발현하는 COS7 세포들을 STS(2.5 μM) 및 사이클로헥시미드(5 μg/㎖)로 인큐베이션하였다. 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이, 미리스토일화 펩티드 분석을 이용하여 NMT 활성을 분석하였다. N-미리스토일트랜스퍼라제 활성을 포스포셀룰로오스 페이퍼 상에 생성 및 검출된 방사성 동위 원소 표지 미리스토일펩티드(myristoylpeptide)의 양으로 계산하였다(King et al.1991, Anal Biochem을 적용). 활성 수준을 t=0 시간에서의 NMT1 활성에 대하여 표준화하였다. NMT1은 중복으로 실시한 3 개의 독립적인 실험의 평균으로 나타낸다. NMT2은 중복으로 실시한 4 개의 독립적인 실험의 평균으로 나타낸다.
도 35는 스타우로스포린(2.5 μM) 및 사이클로헥시미드(5 μg/㎖)로 인큐베이션한 일시적으로 V5-NMT1 및 V5-NMT2를 발현하는 COS7 세포들에서의 NMT 활성을 나타낸다. 일시적으로 V STS(2.5 μM) 및 사이클로헥시미드(5 μg/㎖)로 인큐베이션하였다. 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이, 펩티드 미리스토일화 분석을 이용하여 NMT 활성을 분석하였다. N-미리스토일트랜스퍼라제 활성을 포스포셀룰로오스 페이퍼 상에 생성 및 검출된 방사성 동위 원소 표지 미리스토일펩티드(myristoylpeptide)의 양으로 계산하였다(King et al.1991, Anal Biochem을 적용). NMT 활성을 각 NMT에 대한 t=0 시간에서 100%로 표준화하였다. NMT1은 중복으로 실시한 3 개의 독립적인 실험의 평균으로 나타낸다. NMT2은 중복으로 실시한 4 개의 독립적인 실험의 평균으로 나타낸다. NMTs 모두에 대한 0 시간 시점에 비교하여 차이는 (*)로 표시하고 통계적 유의성(* <p = 0.05, ** <p = 0.005)을 보여준다.
절단된 NMTs가 여전히 촉매 활성되었는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 아폽토시스 개시 동안 필터 기반-펩티드 분석을 사용하여 V5-NMTs를 발현하는 일시적으로 형질전환된 세포의 V5-NMT 효소적 활성을 측정하였다. V5-NMT1, V5-NMT2 또는 빈 벡터로 일시적으로 형질전환시킨 COS-7 세포들을 STS/사이클로헥시 미드-매개 세포 사멸사를 거치도록 유도하고, 효소의 소스로 이용하였다. [3H]-미리스토일-CoA 을 이용하여 아폽토시스의 상이한 시간들에서 NMT 활성을 측정하고 미리스토일화가능한 (G->A) truncated Bid 또는 비-미리스토일화가능한 데카펩티드를 기질로 이용하였다(King and Sharma, 1991; Raju and Sharma, 1999). NMT 활성을 포스포셀룰로오스 페이퍼 상에 결합하여 남고 섬광 계수(scintillation counting)에 의해 검출된 방사성 동위 원소 표지 펩티드의 양으로 계산하였다.
형질전환된 COS-7 세포가 유사한 수준의 키메릭(chimeric) NMTs를 발현할지라도, t=0시간에서 V5-NMT1을 발현하는 그것들은 V5-NMT1을 발현하는 것들보다 거의 5-배 높은 NMT 활성을 나타냈다(도 34). 거의 모든 과-발현된 NMT1이 아폽토시스 유도 4 시간 및 8 시간 후 절단되었고, 모든 과-발현된 NMT2가 아폽토시스 유도 8 시간 후 절단되었더라도(도 3.33), 세포 용해물에서 발견된 완전한 V5-NMTs의 양은 아폽토시스 유도 시간이 지남에 따라 감소되었고(도 33), 내인성 NMTs과 유사한 경향으로 이어졌다(도 32). 비록 V5-NMT1의 90% 이상이 아폽토시스 유도 후 4 시간에서 절단되지만(도 3.33), 세포 사멸이 개시된 후 상기 세포들의 NMT 활성은 8 시간까지 비교적 변화가 없었다. t=0 시간에서의 활성과 비교하여, NMT1을 과-발현하는 COS-7 세포의 용해물의 t=2 시간 및 4 시간에서 (유의하지 않으나) NMT 촉매 활성이 약간의 증가 경향이 있었다(도 3.35). 이는, 후-번역 미리스토일화가 개시될 때 V5-NMT1가 아폽토시스 동안 촉매적으로 활성이 있음을 시사한다. 그러나, 본 발명자들은 V5-NMT1로 형질전환된 세포의 0 시간 시점과 비교하여, 아폽토시스 유도 후 8 시간에서의 NMT 활성(20 %, p<0.05)의 유의한 감소를 관찰하였다(도 35).
아폽토시스 유도 8 시간 후 효소적 활성에 있어 V5-NMT2의 카스파제 절단이 통계적으로 유의한(p <0.005) 감소(t=0 시간에서의 활성과 비교하여 33% 감소)를 초래할 때 까지, V5-NMT2를 발현하는 세포의 NMT 활성은 0 시간부터 4 시간까지 유의한 영향을 받지 않았다(도 35). 흥미롭게도, NMT2 수준이 아폽토시스 동안 카스파제 절단으로 인해 대폭으로 감소되더라도(도 33), NMT2 활성의 66%가 아폽토시스 유도 8 시간 후에도 여전히 남아있고(도. 33), 이는 NMT2 또한 아폽토시스 동안 단백질의 후-번역 미리스토일화에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.
실시예 36
본 실시예의 도 36은 재조합 헥사히스티딘(His)-태깅 전장 및 카스파제-절단 hNMT1의 정제를 나타낸다. Ni-NTA 크로마토그래피를 이용하여 정제를 실시하였다 (재료 및 방법 참조). 정제된 단백질들을 쿠마시 블루 겔 염색제로 겔을 염색하여 가시화하였다.(FT: flow through, W: wash and E: eluted fractions
도 37은 재조합 헥사히스티딘(His)-태깅 전장 및 카스파제-절단 hNMT2의 정제를 나타낸다. Ni-NTA 크로마토그래피를 이용하여 정제를 실시하였다 (재료 및 방법 참조). 정제된 단백질들을 쿠마시 블루 겔 염색제로 겔을 염색하여 가시화하였다.(FT: flow through, W: wash and E: eluted fractions).
도 38은 펩티드 미리스토일화 분석을 이용하여 분석한 정제된 전장 및 카스파제-절단 헥사히스티딘(His)-NMT의 NMT 활성을 나타낸다. N-미리스토일트랜스퍼라제 활성을 포스포셀룰로오스 페이퍼 상에 생성 및 검출된 방사성 동위 원소 표지 미리스토일펩티드(myristoylpeptide)의 양으로 계산하였다(King et al.1991, Anal Biochem을 적용). 각 NMT 분석을 세번 실시하였다. 이용된 대조군은 His-NMT1 정제로부터에서 용출 5이다.
본 발명자들은 His-태깅 전장(His-NMT1 및 His-NMT2) 및 카스파제 절두된(His-73NMT1, His-26NMT2 및 His-68NMT2) 인간 NMT 벡터를 제작하여 박테리아 발현 및 단백질 정제에 이용하였다(도 36 및 337). 필터-기반 펩티드 NMT 분석을 이용하여(King and Sharma, 1991; Raju and Sharma, 1999), 본 발명자들은 양 전장 모두 및 카스파제 절단 절두된 NMT1 및 NMT2이 인 비트로 환경에서 대조군에 비해 촉매적으로 활성화된 것을 발견하였다(도 37). NMT2의 절단은, 전장 NMT2에 비해 ~3-배 (His-26NMT2) 및 ~4-배 (His-68NMT2) 이상 활성을 갖는 것으로 보이는 카스파제 절단 절두된 NMT2로서 그의 활성을 향성시키는 것으로 나타난다.
실시예 37
본 실시예의 도 39는 아폽토시스 동안 HeLa 세포에서의 내인성 NMTs의 세포내 분획법(subcellular fractionation)을 나타낸다. HeLa 세포에 사이클로헥시미드(5 μg/㎖)와 함께 DMSO, STS (2.5 μM) 또는 항-Fas(300 ng/㎖)을 처리하여, 재료 및 방법에 상술한 바와 같이 시료들을 5 시간 시점에서 수집하고, 세포내 분획법을 실시하였다. P100 및 S100 분획의 동일한 부피로 NMT1 및 NMT2 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다.
도 40은 아폽토시스 동안 HeLa 세포에서의 외인성 NMTs의 세포내 분획법 후 다양한 분획에서의 NMTs 양의 정량을 나타낸다. 재료 및 방법에 상술한 바와 같이, HeLa 세포에 사이클로헥시미드(5 μg/㎖)와 함께 DMSO, STS (2.5 μM) 또는 항-Fas(300 ng/㎖)을 처리하여, 시료들을 5 시간 시점에서 수집하고, 세포내 분획법을 실시하였다(도 39). P100(P) 및 S100(S) 분획 사이의 전장(Full) 및 절단된 NMT1(A)와 NMT2(B)의 수준을 이미지 J(http://rsbweb.nih.gov/ij/)를 사용하여 정량하였다. 표시된 백분율은 두 분획(P100+S100)의 전체에 걸쳐 각 밴드 수준으로 계산하였다. 그래프는 3 개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다,
도 41은 알키닐-미리스테이트로 표지된 아폽토시스를 겪은 HeLa 세포의 세포내 분획법을 나타낸다. 세포내 분획법(도 39 및 40)전에, HeLa 세포는 아폽토시스의 유도 후 25 μM 알키닐-미리스테이트로 신진 대사적으로 표지하였다. 분획한 후, 단백질 시료들을 클릭 화학을 사용하여 아지도-비오틴과 반응시키고 NeutrAvidinTM-HRP으로 웨스턴 블롯팅에 의해 가시화하였다. 웨스턴 블롯팅에 의한 표지 혼힙 전에, 막을 0.1 M 중성 Tris-HCl(A) 또는 0.1 M KOH(B)에서 인큐베이션하였다.
많은 단백질의 카스파제 절단은 종종 세포내 로컬라이제이션(localization)의 변화를 초래한다(Enari et al., 1998; Zha et al., 2000; Jakobi, 2004; Vilas et al., 2006); 따라서, 아폽토시스 동안 절단된 NMTs의 로컬라이제이션을 나타내기 위해, 본 발명자들은 정상 및 아폽토시스 세포에서의 세포내 분획 실험(도 39)을 실시하였다. 본 발명자들은 NMT1이 비처리된 Hela 세포의 리보솜/막 분획(펠렛의 63.9%)에서 주로 위치하는 것을 발견하였다(도 40). 사이클로헥시미드와 함께 STS 또는 항-Fas로 아폽토시스를 겪도록 유도된 HeLa 세포의 세포질 분획에서 절단된 카스파제-절두 NMT1의 확연한 증가가 있었다(항-Fas 처리된 세포의 세포질에서 54% 및 STS 처리된 세포의 세포질에서 60%)(도 39 및 40). 반면,대다수의 NMT2(61.7%)가 아폽토시스 유도 전에 세포질에 위치하였다(도 39 및 40). 그러나, 보다 큰 카스파제-절단 NMT2 단편(~55 kDa)이 주로 아폽토틱 세포의 막 펠렛에 위치하였다(항-Fas-처리 시 94.7% 및 STS-처리 시 80%)(도 39 및 40)). 세포들을 최대 5 시간 동안 아폽토시스를 겪도록 유도하였기 때문에, 본 발명자들은 본 분획 동안 작은 NMT2 절단 단편(~ 46 kDa)의 존재를 관찰하지 못했다.
세포들을 아폽토시스의 유도 전 알키닐-미리스테이트로 신진 대사적으로 표지 또는 비표지하고 세포내 분획을 실시한 경우, 본 발명자들은 도 31에 나타낸 바와 같이 아폽토시스 유도 후 미리스토일화 프로파일의 변화를 관찰하였고, 후-번역 미리스토일화된 단백질이 세포질(S100)과 비교하여 주로 막(P100)에 위치한다는 것을 발견하였다(도 40). 이는 이러한 후-번역 미리스토일화된 단백질에 대한 미리스토일 모이어티의 추가가 안정적인 막 앵커링을 제공하는데 충분하다는 것을 제시한다.
실시예 38
본 실시예의 도 42는 아폽토시스 유도에 대한 2-HMA(hydroxymyristic acid)의 효과를 보여준다. 주르카트 T 세포에 HMA(1 mM)를 처리 또는 미처리하고, 아폽토시스를 항-Fas(150 ng/㎖) 및 사이클로헥시미드(5 μg/㎖)로 유도하였다. 대조군 세포들은 DMSO로 처리하였다. 시료들을 0, 2, 4, 6 및 8 시간 시점에서 수집하였다. 세포들을 용해시키고, 시료들을 PARP-1, PAK2, NMT1 및 NMT2(복합 겔)에 대한 항체로 SDS-PAGE에 의해 분리하여 면역블롯팅하였다.
PARP-1의 절단은, 1mM 소디윰 미리스테이트 및 항-Fas로 처리된 세포와 비교하여 1mM HMA 및 항-Fas로 처리된 세포에서 2 시간 더 일찍 발생하였다. 또한, HMA/STS에 노출된 세포에서 유사한 경향이 나타났으나, STS 및 1mM 소디윰 미리스테이트로 처리된 세포보다 아폽토시스 유도 후 2 시간에서 PARP-1 및 PAK2 절단을 더욱 나타내는 HMA/STS 세포의 존재하에서 항-Fas에 노출된 세포에서보다 적은 범위이다(도 42). 또한, NMT1 및 NMT2의 절단의 유사한 자극이 관찰되었다. 이는 NMTs의 억제가 세포에서 아폽토시스의 유도를 촉진함을 나타낸다. NMT의 억제는 아폽토시스의 개시할 가능성이 있으므로, NMTs은 세포에서 종합적으로 친-생존(pro-survival)적 역할을 할 것으로 보인다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허들 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 이러한 특허들 및 문헌들의 공개는 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기술하였으며, 본 발명의 원리를 따르는 변형 및 수정이 가능하고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다는 것은 당업계 통상의 지식을 가진 자에게 잘 인식된다.

Claims (98)

  1. NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 포함하는, NMT2-결손(deficient)인 암 대상 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 NMT2-결손인 암은 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 형질세포 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 대상은 인간인 것인 조성물.
  9. NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 포함하는, 암이 생긴 대상을 치료하기 위한 암 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 암이 생긴 대상은 NMT2-결손(deficient)인 것으로 확인된 것이고;
    상기 암은 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 형질세포 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 포함하며, 암이 생긴 대상을 치료하기 위한 암 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 암이 생긴 대상은, 상기 대상으로부터 분리된 시료에 NMT2에 대한 항체를 접촉시켜, 상기 NMT2에 대한 항체와 상기 시료 내에 존재하는 NMT2 단백질 간의 복합체(complex)를 형성시키는 결합 어세이(binding assay)를 실시한 결과, 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하며; 상기 최소 1 개의 어세이 결과가 상기 시료 내 NMT2 단백질의 양이 대조군에 비해 낮거나 없는 것으로 확인된 것이고;
    상기 암은 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 형질세포 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 삭제
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 NMT2-결손(deficient) 확인은, 상기 대상으로부터 분리된 시료를 NMT2에 대한 항체와 접촉시켜, 상기 항체와 상기 시료 내에 존재하는 NMT2 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하는 것인 조성물.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 결합 어세이는 FACS(fluorescence activated cell sorting), 효소결합 면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 정량적 면역조직화학(quantitative immunohistochemistry), 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer), FRET(Forster resonance energy transfer), 생체분자 형광 상보(biomolecular fluorescence complementation), 질량분석(mass spectrometry), 면역법(immunoblot assay) 또는 공동면역침전법(coimmunoprecipitation assay)을 포함하는 것인 조성물.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 항체와 상기 시료 내 상기 NMT2 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)가 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용되는 것인 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계(pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)인 것인 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 포함하며, 암이 생긴 대상을 치료하기 위한 암 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 암이 생긴 대상은, 상기 대상으로부터 분리된 시료에 NMT2 핵산에 결합하는 검출가능한 표지를 접촉시켜, 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 NMT2 핵산 간의 복합체(complex)를 형성시키는 결합어세이(binding assay)를 실시한 결과, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하며; 상기 최소 1 개의 어세이 결과가 상기 시료 내 NMT2 단백질의 양이 대조군에 비해 낮거나 없는 것으로 확인된 것이고;
    상기 암은 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 형질세포 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 포함하며, 암이 생긴 대상을 치료하기 위한 암 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 암이 생긴 대상은, 상기 대상으로부터 분리된 시료에 NMT2 핵산에 결합하는 검출가능한 표지를 접촉시켜, 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 NMT2 핵산 간의 복합체(complex)를 형성시키는 결합어세이(binding assay)를 실시한 결과, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하며; 상기 최소 1 개의 어세이 결과가 상기 시료 내 NMT2 핵산의 양이 대조군에 비해 낮거나 없는 것으로 확인된 것이고;
    상기 암은 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 형질세포 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 9 항에 있어서, 상기 NMT2-결손(deficient) 확인은, 상기 대상으로부터 분리된 시료를 NMT2 핵산에 결합하는 검출가능한 표지와 접촉시켜, 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 NMT2 핵산 간의 복합체(complex)를 형성시키는 단계를 포함하는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계를 포함하며, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하는 것인 조성물.
  21. 제 18 항, 제 19 항, 또는 제 20 항에 있어서, 상기 결합 어세이는 검출가능하게 표지된-DNA 또는 RNA 프로브를 이용한 혼성화 어세이(hybridization assay)를 포함하는 것인 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 혼성화 어세이는 정량적 또는 반-정량적인 것인 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 혼성화 어세이는 RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction), 인 시추 혼성화(in situ hybridization), RPA(RNA protection assay), cDNA 및 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이, RDA(representation difference analysis), 차별 표시법(differential display), EST (Expressed sequence tag) 시퀀스 분석, SAGE(serial analysis of gene expression), 또는 LMF(Luminex FlexMAP)를 갖는 다중 리게이션-매개 증폭(muiplex ligation-mediated amplification)인 것인 조성물.
  24. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내 존재하는 NMT2 핵산 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)가 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용되는 것인 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)인 것인 조성물.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 포함하며, 암이 생긴 대상을 치료하기 위한 암 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 암이 생긴 대상은, 상기 대상으로부터 분리된 시료에, 상기 시료 내 미리스토일화된 단백질(myristoylated protein) 또는 검출가능한 아지도-비오틴 표지(azido-biotin labeled)된 미리스토일화된 단백질에 결합하는 항체를 접촉시켜, 상기 검출가능한 아지도-비오틴 표지와 상기 시료 내에 존재하는 미리스토일화된 단백질 간의 복합체(complex)를 형성시키는 결합 어세이(binding assay)를 실시한 결과, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 미리스토일화(myristoylation) 프로파일을 생성하며; 상기 최소 1 개의 미리스토일화 프로파일은 상기 시료 내 미리스토일화된 단백질의 양이 대조군에 비해 낮거나 없는 것으로 확인된 경우, 상기 암이 NMT2-결손(deficient)임을 가리키고;
    상기 NMT2-결손인 암은 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 형질세포 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 삭제
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 대상으로부터 분리된 시료는 ω-알키닐-미리스테이트(ω-alkynyl-myristate) 및 데스티오비오틴 아지도-PEG 비오틴(desthiobiotin azido-PEG biotin)으로 처리되는 것인 조성물.
  31. 제 28 항에 있어서, 상기 결합 어세이는 FACS(fluorescence activated cell sorting), 효소결합 면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 정량적 면역조직화학(quantitative immunohistochemistry), 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer), FRET(Forster resonance energy transfer), 생체분자 형광 상보(biomolecular fluorescence complementation), 질량분석(mass spectrometry), 면역법(immunoblot assay) 또는 공동면역침전법(coimmunoprecipitation assay)을 포함하는 것인 조성물.
  32. 제 28 항에 있어서, 상기 항체와 상기 시료 내 상기 NMT2 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)가 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용되는 것인 조성물.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)인 것인 조성물.
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  68. 다음 단계를 포함하는 생체외에서 NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 이용한 암 치료 대상을 스크리닝하는 방법:
    (a) 암이 생긴 대상으로부터 분리된 시료를 NMT2에 대한 항체와 접촉시켜 상기 항체와 상기 처리된 시료 내에 존재하는 NMT2 단백질 간의 복합체(complex)를 형성시키는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계로, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하며; 및
    (b) 상기 최소 1 개의 어세이 결과가 상기 시료 내 NMT2 단백질의 양이 대조군에 비해 낮거나 없는 것으로 확인된 경우, 상기 대상을 NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 사용하는 치료에 대해 적합한 후보자로 판별하는 단계로서,
    상기 암은 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 형질세포 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 삭제
  70. 제 68 항에 있어서, 상기 결합 어세이는 FACS(fluorescence activated cell sorting), 효소결합 면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 정량적 면역조직화학(quantitative immunohistochemistry), 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer), FRET(Forster resonance energy transfer), 생체분자 형광 상보(biomolecular fluorescence complementation), 질량분석(mass spectrometry), 면역법(immunoblot assay) 또는 공동면역침전법(coimmunoprecipitation assay)을 포함하는 것인 방법.
  71. 제 68 항에 있어서, 상기 항체와 상기 시료 내 상기 NMT2 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)가 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용되는 것인 방법.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)인 것인 방법.
  73. 삭제
  74. 제 68 항에 있어서, 상기 대상은 인간인 것인 방법.
  75. 다음 단계를 포함하는 생체외에서 NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 이용한 암 치료 대상을 스크리닝하는 방법:
    (a) 암이 생긴 대상으로부터 분리된 시료를 NMT2 핵산에 결합하는 검출가능한 표지와 접촉시켜, 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내에 존재하는 NMT2 핵산 간의 복합체(complex)를 형성시키는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계로서, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 어세이 결과를 생성하며; 및
    (b) 상기 최소 1 개의 어세이 결과가 상기 시료 내 NMT2 핵산의 양이 대조군에 비해 낮거나 없는 것으로 확인된 경우, 상기 대상을 NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 사용하는 치료에 대해 적합한 후보자로 판별하는 단계로서,
    상기 암은 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 형질세포 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 삭제
  77. 제 75 항에 있어서, 상기 결합 어세이는 검출가능하게 표지된-DNA 또는 RNA 프로브를 이용한 혼성화 어세이(hybridization assay)를 포함하는 것인 방법.
  78. 제 77 항에 있어서, 상기 혼성화 어세이는 정량적 또는 반-정량적인 것인 방법.
  79. 제 78 항에 있어서, 상기 혼성화 어세이는 RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction), 인 시추 혼성화(in situ hybridization), RPA(RNA protection assay), cDNA 및 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이, RDA(representation difference analysis), 차별 표시법(differential display), EST (Expressed sequence tag) 시퀀스 분석, SAGE(serial analysis of gene expression), 및 LMF(Luminex FlexMAP)를 갖는 다중 리게이션-매개 증폭(muiplex ligation-mediated amplification)인 것인 방법.
  80. 제 79 항에 있어서, 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내 존재하는 NMT2 핵산 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)는 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용되는 것인 방법.
  81. 제 80 항에 있어서, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)인 것인 방법.
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 다음 단계를 포함하는 생체외에서 NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 이용한 암 치료 대상을 스크리닝하는 방법:
    (a) 암이 생긴 대상으로부터 분리된 시료를 상기 시료 내 미리스토일화된 단백질(myristoylated protein) 또는 검출가능한 아지도-비오틴으로 표지(azido-biotin labeled)된 미리스토일화된 단백질에 결합하는 항체와 접촉시켜, 상기 검출가능한 아지도-비오틴 표지와 상기 시료 내에 존재하는 미리스토일화된 단백질 간의 복합체(complex)를 형성시키는 결합 어세이(binding assay)를 실시하는 단계로서, 상기 결합 어세이는 상기 복합체를 나타내는 최소 1 개의 미리스토일화(myristoylation) 프로파일을 생성하며; 및
    (b) 상기 최소 1 개의 미리스토일화 프로파일은 상기 시료 내 미리스토일화된 단백질의 양이 대조군에 비해 낮거나 없는 것으로 확인되어 상기 암이 NMT2-결손(deficient)임을 가리키는 경우, 상기 대상을 NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 사용하는 치료에 대해 적합한 후보자로 판별하는 단계로서,
    상기 NMT2-결손인 암은 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 형질세포 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제 84 항에 있어서, 상기 대상으로부터 분리된 시료는 알키닐-미리스테이트(ω-alkynyl-myristate) 및 데스티오비오틴 아지도-PEG 비오틴(desthiobiotin azido-PEG biotin)으로 처리되는 것인 방법.
  86. 제 84 항에 있어서, 상기 결합 어세이는 FACS(fluorescence activated cell sorting), 효소결합 면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 정량적 면역조직화학(quantitative immunohistochemistry), 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer), FRET(Forster resonance energy transfer), 생체분자 형광 상보(biomolecular fluorescence complementation), 질량분석(mass spectrometry), 면역법(immunoblot assay) 또는 공동면역침전법(coimmunoprecipitation assay)을 포함하는 것인 방법.
  87. 제 86 항에 있어서, 상기 검출가능한 표지와 상기 시료 내 존재하는 NMT2 핵산 간에 형성된 상기 복합체(complex)를 검출하는 검출기 세트를 갖는 기기(instrumentation)는 상기 시료 내 복합체의 양을 결정하는 데 이용되는 것인 방법.
  88. 제 87 항에 있어서, 상기 기기는 분광계(spectrophotometer), 분광형광계pectrofluorometer), 광학기기(optical device) 또는 전기화학 기기(electrochemical device)인 것인 방법.
  89. 삭제
  90. 삭제
  91. NMT2에 대한 항체; 및 제 68 항의 방법에 따라 암 치료에 적합한 대상을 스크리닝하기 위한 사용설명서를 포함하는, NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 이용한 암 치료에 적합한 대상 스크리닝용 키트로서,
    상기 암은 NMT2-결손인 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 형질세포 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
  92. 제 91 항에 있어서, 추가적으로 대조군을 포함하는 것인 키트.
  93. NMT2에 결합하는 핵산; 및 제 75 항의 방법에 따라 암치료에 적합한 대상을 스크리닝하기 위한 사용설명서를 포함하는, NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 이용한 암 치료에 적합한 대상 스크리닝용 키트로서,
    상기 암은 NMT2-결손인 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병 및 형질세포 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
  94. 제 93 항에 있어서, 추가적으로 대조군을 포함하는 것인 키트.
  95. 제 93 항에 있어서, 상기 핵산은 RNA 또는 DNA인 것인 키트.
  96. 미리스토일화된 단백질(myristoylated protein) 또는 아지도-비오틴 표지(azido-biotin labeled)된 미리스토일화된 단백질에 결합하는 항체; ω-알키닐-미리스테이트(ω-alkynyl-myristate), 데스티오비오틴 아지도-PEG 비오틴(desthiobiotin azido-PEG biotin); NeutrAvidin-HRP(horseradish peroxidase); 및 제 84 항의 방법에 따라 암 치료에 적합한 대상을 스크리닝하기 위한 사용설명서를 포함하는, NMT 억제제인 DDD86481 및 독소루비신을 이용한 암 치료에 적합한 스크리닝용 키트로서,
    상기 암은 NMT2-결손인 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성백혈병 및 형질세포 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
  97. 제 96 항에 있어서, 추가적으로 대조군을 포함하는 것인 키트.
  98. 삭제
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2665952C2 (ru) 2011-07-22 2018-09-05 Пасилекс Фармасьютикалз Инк. Синтетическая летальность и лечение рака
PL3325662T3 (pl) 2015-07-17 2024-02-26 Pacylex Pharmaceuticals Inc. Wyciszenie epigenetyczne nmt2
WO2018195727A1 (en) * 2017-04-24 2018-11-01 Tsinghua University Use of autoinducer-related pathway in inducing apoptosis and anti-infective therapy
CN107893119B (zh) * 2017-12-27 2020-09-22 青岛泱深生物医药有限公司 Zcchc12在骨肉瘤中的应用
GB201820660D0 (en) * 2018-12-19 2019-01-30 Imperial Innovations Ltd Cancer treatments
CN111621576B (zh) * 2020-06-18 2022-11-08 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） 用于检测油鱼的rpa引物和探针及检测方法
EP4232032A1 (en) * 2020-10-20 2023-08-30 Pacylex Pharmaceuticals Inc. Use of n-myristoyl transferase (nmt) inhibitors in the treatment of cancer, autoimmune disorders, and inflammatory disorders
US11885808B2 (en) 2021-05-20 2024-01-30 Oneodrek Inc. Predicting prognosis and treatment response of breast cancer patients using expression and cellular localization of N-myristoyltransferase
CA3191934A1 (en) * 2021-05-20 2022-11-20 12987490 Canada Inc. Predicting prognosis and treatment response of breast cancer patients using expression and cellular localization of n-myristoyltransferase
WO2023164776A1 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 Pacylex Pharmaceuticals Inc. Oral pclx-001 in the treatment of human cancer

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008076965A1 (en) * 2006-12-18 2008-06-26 Jack Arbiser Novel palladium complexes inhibit n-myristoyltransferase activity in vitro and cancer growth in vivo
WO2010026365A1 (en) * 2008-09-02 2010-03-11 University Of Dundee N-myristoyl transferase inhibitors
KR102164964B1 (ko) * 2011-07-22 2020-10-14 페이실렉스 파마슈티컬스 인코포레이티드 암의 합성치사 및 치료

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2657259A1 (fr) * 1990-01-25 1991-07-26 Adir Utilisation de la n-myristoyl-(s)-phenylalanine pour l'obtention de medicaments destines au traitement des maladies faisant intervenir la myristoylation.
CN102641503A (zh) * 2004-07-20 2012-08-22 健泰科生物技术公司 血管生成素样4蛋白抑制剂，组合，以及其用途
US20060141504A1 (en) 2004-11-23 2006-06-29 Willman Cheryl L Molecular technologies for improved risk classification and therapy for acute lymphoblastic leukemia in children and adults

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008076965A1 (en) * 2006-12-18 2008-06-26 Jack Arbiser Novel palladium complexes inhibit n-myristoyltransferase activity in vitro and cancer growth in vivo
WO2010026365A1 (en) * 2008-09-02 2010-03-11 University Of Dundee N-myristoyl transferase inhibitors
KR102164964B1 (ko) * 2011-07-22 2020-10-14 페이실렉스 파마슈티컬스 인코포레이티드 암의 합성치사 및 치료

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