CN110944665A - 用于预防或治疗肺癌的amhrii结合化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人AMHRII结合剂用于预防或治疗肺癌的用途，特别是涉及人AMHRII结合剂用于预防或治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的用途，甚至更特别地涉及人AMHRII结合剂用于预防或治疗选自包括以下的组的NSCLC的用途：表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC和鳞状细胞癌NSCLC及神经内分泌NSCLC。

Description

用于预防或治疗肺癌的AMHRII结合化合物
技术领域
本发明涉及肺癌治疗领域。
背景技术
肺癌是肺组织的恶性转化和扩张，并且每年导致全球130万例死亡。它是男性中癌症相关死亡的最常见原因，在女性中是第二常见原因。
世界卫生组织(World Health Organization)将肺癌分为四种主要的组织学类型：(1)鳞状细胞癌(SCC)，(2)腺癌，(3)大细胞癌，以及(4)小细胞肺癌(SCLC)。术语非小细胞肺癌(NSCLC)包括鳞状癌、腺癌和大细胞癌。
非小细胞肺癌(NSCLC)归为一类，因为它们的预后和治疗方法大致相同。主要有三个亚型：鳞状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌。鳞状细胞癌占肺癌的29％，也始于较大的支气管，但生长较慢。这些肿瘤的大小因诊断而异。腺癌是最常见的NSCLC亚型，占肺癌的32％。它是从肺的气体交换表面附近开始的形式。大多数腺癌病例与吸烟有关。然而，在从不吸烟的人(“从不吸烟者”)中，腺癌是最常见的肺癌形式。细支气管肺泡癌是腺癌的亚型，在女性从不吸烟者中更常见，并且可能对治疗具有不同的响应。NSCLC的其他亚型是神经内分泌肺癌(NE)、腺泡型肺癌(AT)和大细胞癌(快速生长形式)，占在肺表面附近生长的肺癌的9％。
小细胞肺癌(SCLC，也称为“燕麦细胞癌”)是较不常见的肺癌形式。它倾向于在较大的呼吸管中开始，并迅速生长到很大。最常涉及的癌基因是L-myc。“燕麦”细胞含有致密的神经分泌颗粒，使之具有内分泌/副肿瘤综合征关联。它最初对化疗更敏感，但最终预后较差，并且通常在出现时就转移。这类肺癌与吸烟密切相关。
其他类型的肺癌包括类癌、腺样囊性癌(圆柱瘤)和粘液表皮样癌。
由于临床症状通常直到疾病晚期才出现，所以难以早期检测。当前，通过使用胸部x射线、分析唾液中所含细胞的类型以及光纤检查支气管通道来辅助诊断。治疗方案由癌症的类型和阶段决定，并且包括手术、放射疗法和/或化学疗法。尽管已经对该疾病的疗法进行了大量研究，但是肺癌仍然难以治疗。
已知的肺癌治疗包括手术、化学疗法、放射疗法和靶向药物疗法。
靶向疗法、尤其是靶向免疫疗法有可能使更常规的化学疗法或放射治疗对其无效的肺癌患者受益。靶向免疫疗法包括单克隆抗体的使用。
单克隆抗体贝伐单抗(抗VEGF抗体)和雷莫芦单抗(抗VEGFR2抗体)旨在预防肿瘤产生新血管，而耐昔妥珠单抗(抗EGFR)则通过防止另一种生长因子的作用来靶向生长。当前，已批准了至少两种针对肺癌患者的免疫检查点抑制剂(派姆单抗/抗PD1和纳武单抗/抗PD1)靶向抗体。如今，使用这种基于免疫的治疗(诸如检查点抑制剂、单克隆抗体、治疗性疫苗和过继性细胞疗法)可以获得长期的缓解和更长的存活率。
然而，在本领域中仍然需要用于肺癌疗法的另外工具，其可以是现有疗法的替代或补充。
发明内容
本发明涉及人AMHRII结合剂用于预防或治疗肺癌的用途。然后，本发明涉及人AMHRII结合剂在用于预防或治疗患有肺癌的患者的肺癌的方法中的用途。
肺癌可以选自包括非小细胞肺癌(NSCLC)、尤其是选自包括以下的组的NSCLC的组：表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC、鳞状细胞癌NSCLC、多形性细胞癌NSCLC和神经内分泌NSCLC。
在优选的实施方式中，人AMHRII结合剂用于治疗在细胞膜处以足够的表达水平表达AMHRII的以上指定的肺癌。
在最优选的实施方式中，所述足够的表达水平表示为在本说明书其他地方详述的阈值AMHRII表达评分值。
在一些实施方式中，所述人AMHRII结合剂由抗AMHRII单克隆抗体构成。
在一些实施方式中，所述人AMHRII结合剂由抗体药物缀合物(ADC)构成。
在一些实施方式中，所述人AMHRII结合剂由AMHRII结合工程化受体构成。
在一些实施方式中，所述人AMHRII结合剂由表达AMHRII结合工程化受体的细胞(诸如表达AMHRII结合工程化受体的CAR T细胞或NK T细胞)构成。
在一些实施方式中，所述AMHRII结合剂与一种或多种不同的抗癌剂组合。
本发明还涉及用于确定个体是否适合于使用如上定义的AMHRII结合剂的肺癌治疗的方法，其中，所述方法包括确定先前从所述个体获得的肺肿瘤组织样品是否在细胞表面处表达AMHRII蛋白的步骤。
本发明涉及用于确定个体是否对如上所限定的使用AMHRII结合剂的肺癌治疗有响应的方法，其中，所述方法包括确定先前从所述个体获得的肺肿瘤组织样品是否在细胞表面处表达AMHRII蛋白的步骤。
附图说明
图1示出3C23单克隆抗体的多个变体的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。图1A示出每种抗体变体的VH结构域。图1B示出每种抗体变体的VL结构域。
图2示出各种癌细胞系的AMHRII表达。
图2A示出癌细胞系的AMHRII mRNA表达。横坐标：从图2A的左至右：HCT116(结肠结肠直肠癌)、COV434-WT(人卵巢粒层细胞肿瘤)、K562(人骨髓性白血病)和OV90(人恶性乳头状浆液性腺癌)。纵坐标：如通过RT-qPCR测定的AMHRII mRNA表达水平，以任意单位(RQ)表示。
图2B至图2F：通过与图2A相同的癌细胞系的AMHRII蛋白膜表达：HCT116(图2B)，COV434-WT(图2C)，K562(图2D)，NCI-H295R(图2E)和OV90(图2F)。横坐标：以任意单位表示的荧光信号强度(FL2-A染料)。纵坐标：细胞计数。
图3示出如通过流式细胞术测量的各种肺癌细胞的AMHRII表达。
图3A示出来自鳞状细胞肺癌患者来源的异种移植物的细胞(Ref Lu7860)的AMHRII蛋白膜表达。图3B示出来自大细胞肺癌患者来源的异种移植物的细胞(Ref Lu7166)的AMHRII蛋白膜表达。图3C示出来自鳞状细胞肺癌患者来源的异种移植物的细胞(RefLu7298)的AMHRII蛋白膜表达。图3D示出来自鳞状细胞肺癌患者来源的异种移植物的细胞(Ref Lu7414)的AMHRII蛋白膜表达。图3E示出来自多形性细胞肺癌患者来源的异种移植物的细胞(Ref Lu7558)的AMHRII蛋白膜表达。横坐标：荧光强度(FL2-A染料)，以任意单位表示。纵坐标：细胞计数。
图3F示出来自手术切除的人NSCLC的健康边缘的细胞(其FACS曲线在图3G中示出)的AMHRII蛋白膜表达。
图3G示出来自手术切除的人NSCLC新鲜样品的细胞的AMHRII蛋白膜表达。
在图3中：(i)左侧峰：用无关的同种型抗体孵育的细胞；(ii)右侧峰：用3C23K抗AMHRII抗体孵育的细胞。
横坐标：荧光强度(FL2-A染料)，以任意单位表示。纵坐标：细胞计数。
图4示出异种移植有人肺癌细胞的动物的相对体重变化。在SC131植入后第18天治疗开始。每两周i.v.施用20mg/kg的媒介物和GM102一次持续3周。在D0，缓慢i.v.施用20mg/kg的多西他赛一次。每周一次i.p.施用5mg/kg的顺铂和100mg/kg的吉西他滨持续1周至3周。初始组大小：9只动物。纵坐标：相对体重，以kg(平均值+/-平均值标准误差(sem))表示。横坐标：●媒介物；■GM102 20mg/kg；▲多西他赛20mg/kg；▼GM102和多西他赛的组合；◆顺铂5mg/kg和吉西他滨100mg/kg的组合；○GM102、顺铂和吉西他滨的组合。
图5示出在异种移植有人肺癌细胞的动物上由3C23K抗AMHRII抗体与其他抗癌剂组合或不与其他抗癌剂组合诱导的肿瘤生长变化。治疗在SC131植入后第18天开始。每两周i.v.施用20mg/kg的媒介物和GM102一次持续3周。在D0，缓慢i.v.施用20mg/kg的多西他赛一次。每周i.p.施用5mg/kg的顺铂和100mg/kg的吉西他滨一次持续1周至3周。初始组大小：9只动物。纵坐标：肿瘤体积，以mm3(平均值+/-sem)表示。横坐标：●媒介物；■GM102 20mg/kg；▲多西他赛20mg/kg；▼GM102和多西他赛的组合；◆顺铂5mg/kg和吉西他滨100mg/kg的组合；○GM102、顺铂和吉西他滨的组合。
图6示出在异种移植有人肺癌细胞的动物上与其他抗癌剂组合或不与其他抗癌剂组合的3C23K抗AMHRII抗体的抗肿瘤活性。治疗在SC131植入后第18天开始。每两周i.v.施用20mg/kg的媒介物和GM102一次持续3周。在D0，缓慢i.v.施用20mg/kg的多西他赛一次。每周i.p.施用5mg/kg的顺铂和100mg/kg的吉西他滨一次持续1周至3周。初始组大小：9只动物。纵坐标：如以百分比表示的TC。横坐标：●媒介物；■GM102 20mg/kg；▲多西他赛20mg/kg；▼GM102和多西他赛的组合；◆顺铂5mg/kg和吉西他滨100mg/kg的组合；○GM102、顺铂和吉西他滨的组合。
图7示出在异种移植有鳞状非小细胞肺癌肿瘤异种移植物的动物上由GM102(低岩藻糖抗AMHRII抗体)诱导的肿瘤生长变化。每条虚线曲线：施用媒介物溶液的异种移植的动物。每条连续曲线：施用GM102的异种移植的动物。横坐标：治疗开始后的时间段，以天表示。纵坐标：肿瘤体积，以mm3表示。
图8示出在治疗开始后第28天，在异种移植有鳞状非小细胞肺癌肿瘤异种移植物的动物上由GM102(低岩藻糖抗AMHRII抗体)诱导的肿瘤生长变化。图8A和图8B，纵坐标：肿瘤体积，以mm3表示。图8A和图8B，横坐标：(i)左侧：施用媒介物溶液的异种移植的动物；(ii)右侧：施用GM102的异种移植的动物。图8A：测试的每种异种移植的动物的绝对结果。图8B：从图8A中描绘的结果计算出的平均值+/-标准偏差。
具体实施方式
本发明人意外地表明，AMHRII受体在非小细胞肺癌组织的细胞膜处表达、尤其是在表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC、多形性细胞癌NSCLC、鳞状细胞癌NSCLC和神经内分泌NSCLC亚型的细胞膜处表达。相反，在来自神经内分泌亚型或腺泡亚型的SCLC或NSCLC中未检测到膜水平的AMHRII。
术语“AMHR-II”表示人抗苗勒激素II型受体。人AMHR-II的序列在本文中描述为SEQ ID NO.18(缺少信号肽MLGSLGLWALLPTAVEA(SEQ ID NO:17))。
如本文所用，术语“PDX”为表述“患者来源的异种移植物”的首字母缩写。患者来源的异种移植物是高度使用的癌症体内模型，其中将来自患者肿瘤的组织或细胞植入(即“移植”)到免疫缺陷的非人哺乳动物(例如免疫缺陷小鼠)体内。
如本文的示例所示，本发明人发现AMHRII在肺癌组织的细胞膜处以取决于所考虑的肺癌亚型的可变频率表达。
根据本发明人的知识，本文首次显示了AMHRII在肺癌细胞中的膜表达。
说明性地，如本文的示例中所示，AMHRII由来源于源自患有表皮样NSCLC肺癌或腺癌NSCLC大细胞NSCLC肺癌的患者的肿瘤组织的癌细胞表达的频率要高于由来源于源自患有鳞状NSCLC或大细胞NSCLC的患者的肿瘤组织的癌细胞表达的频率。检测到相对高的频率意味着患有这四种肺癌中的一者的癌症患者更频繁地适合于靶向AMHRII的抗癌治疗(即，更频繁地对靶向AMHRII的抗癌治疗有响应)，但是这种抗癌治疗与治疗患有神经内分泌NSCLC的患者较不频繁地相关。
如本文的示例所示，任何NSCLC肺癌都可以通过AMHRII结合剂治疗，前提是来自所述非妇科肿瘤的肿瘤细胞在其膜处表达AMHRII，因此前提是可以根据任何方法检测或确定肿瘤细胞膜处AMHRII蛋白的存在。
因此，本文的示例中提供的实验数据表明，相同的AMHRII结合剂(此处为抗AMHRII单克隆抗体)对于治疗多种不同NSCLC肺癌都是有效的，前提是AMHRII靶蛋白在肿瘤细胞膜处表达。
顺便提及，在由靶结合分子(例如靶结合抗体)构成的抗癌活性成分的领域中，其中相同活性成分对治疗多种不同癌症有效的情况并非前所未有。说明性地，名为派姆单抗的抗PD1抗体已被美国食品和药品管理局(FDA)授权为可用于治疗多种不同种类的癌症的活性成分，前提是所述癌症共有相同的生理特征。
如本文所用，在肺癌细胞的细胞膜处表达AMHRII意指所述肺癌细胞以给定的可定量水平或高于所述可定量水平表达AMHRII。
根据一些实施方式，通过确定来自先前从患有肺癌的个体中收集的样品的肺癌细胞是否在其膜处表达AMHRII，可以评估所述个体对AMHRII结合分子治疗的响应性。
根据一些实施方式，通过确定来自先前从患有肺癌的个体收集的样品的肺癌细胞是否在其膜处高于确定的阈值表达AMHRII，可以评估所述个体对AMHRII结合分子治疗的响应性。
可以在一些实施方式中用于确定患有非妇科癌症的患者对AMHRII结合剂(例如抗AMHRII抗体)治疗的响应性的AMHRII膜表达水平可以用多种技术评估，所述多种技术包括(i)在其膜处表达AMHRII的肿瘤样品中包含的肿瘤细胞的百分比，(ii)肿瘤细胞膜处的AMHRII蛋白的平均数量和(iii)经测试的肿瘤细胞样品中包含的肿瘤细胞的FACS AMHRII信号图。
根据一些实施方式，当在先前从患有肺癌的个体收集的肿瘤样品中包含的5％或更多的肺肿瘤细胞中检测到膜AMHRII时，包含在所述肿瘤样品中的肺癌细胞可以评估为表达膜AMHRII。
因此，在一些实施方式中，当在先前从患有肺癌的个体收集的肿瘤样品中包含的5％或更多的肺肿瘤细胞在其膜处表达AMHRII时，所述个体被确定为对AMHRII结合剂治疗有响应。
用于确定表达膜AMHRII蛋白的肿瘤细胞的频率(例如百分比)的方法在本说明书的其他地方公开，包括在本文的示例中。
根据一些实施方式，通过确定先前从患有肺癌的患者收集的肿瘤样品中包含的肿瘤细胞膜处存在的AMHRII蛋白的平均数量，可以评估所述患者对AMHRII结合剂(例如抗AMHRII抗体)的癌症治疗的响应性。
在一些实施方式中，当先前从患有肺癌的患者收集的肿瘤样品中包含的肿瘤细胞表达的膜AMHRII蛋白的平均数量具有10000个AMHRII蛋白或更多时，所述患者可以归类为对AMHRII结合剂治疗有响应、例如对抗AMHRII抗体治疗有响应。
可以通过使用常规方法进行在肺肿瘤细胞膜处表达的AMHRII蛋白的数量的评估，所述常规方法包括：(a)将含有来自先前从患者收集的肿瘤组织样品的细胞的样品与特异性结合AMHRII蛋白的可检测化合物(诸如荧光标记的抗AMHRII抗体)孵育的步骤，和另外的(b)确定与来自所述样品的每个测试细胞结合的所述可检测化合物的数量(例如，荧光标记的抗AMHRII抗体的数量)的步骤。如在本文的示例中显示的，评估肿瘤细胞膜处表达的AMHRII蛋白的数量可以例如通过使用众所周知的荧光激活细胞分选(FACS)技术来进行。
在另外的其他实施方式中，通过分析先前从患有肺癌的患者收集的肿瘤样品中包含的肿瘤细胞的AMHRII FACS曲线，可以将所述患者归类为对AMHRII结合剂治疗有响应，例如归类为对抗AMHRII抗体治疗有响应。
根据这些其他实施方式，在荧光激活细胞分选(FACS)的方法中，当(i)从用同种型荧光标记的抗体孵育的肿瘤细胞获得的平均荧光强度(MFI)值与(ii)用抗AMHRII荧光标记的抗体孵育的肿瘤细胞的平均荧光强度的比率为1.5或更大时，可以将患有肺癌的患者归类为对AMHRII结合剂治疗有响应，例如归类为对抗AMHRII抗体治疗有响应。
为了确定所述平均荧光强度比率，同种型抗体和抗AMHRII抗体都用相同的荧光剂(诸如赛默飞世尔科学公司(Company ThermoFisher Scientific)出售的Alexa Fluor 488染料)标记，如本文的示例所示。
在一些另外的实施方式中，通过计算允许区分(i)来源于可以用AMHRII结合剂治疗的肺癌的表达膜AMHRII的肺癌细胞和(ii)来源于不可以用AMHRII结合剂治疗的肺癌的表达膜AMHRII的肺癌细胞的AMHRII表达评分，可以确定肺癌个体对AMHRII结合剂治疗的响应性。
因此，本发明人已经确定特别适合于使用本文所述的AMHRII结合剂的癌症治疗的患有肺癌的患者(即，特别是对使用本文所述的AMHRII结合剂的癌症治疗有响应的患有肺癌的患者)涵盖了具有在细胞膜处以足够用于构成待破坏的相关细胞靶标的高水平表达AMHRII的癌症肿瘤的那些患者。
然后，根据这些进一步的实施方式，本发明人已经确定在来自肺癌患者的癌细胞样品中测量的最小AMHRII表达水平可以证实所述患者对使用AMHRII结合剂的治疗有响应，因此可以通过本文所述的AMHRII结合剂治疗所述患者。
因此，当通过测定(i)表达膜AMHRII的肿瘤细胞的频率(例如在其膜处表达AMHRII的肿瘤细胞的百分比)和(ii)所述肿瘤细胞的AMHRII膜表达的水平(例如每细胞的膜AMHRII蛋白的平均数量)来评估先前从患有肺癌的个体收集的样品中包含的肺癌细胞的AMHRII表达水平时，还可以确定所述个体对使用AMHRII结合剂治疗的响应性。
因此，在这些另外的实施方式的一些实施方式中，本发明人确定了肺癌患者对人AMHRII结合剂的响应性、例如对抗人AMHRII抗体的响应性需要在先前从所述患者收集的肿瘤细胞的样品中，(i)所述样品中包含的肿瘤细胞在其膜处具有最少平均数量的人AMHRII蛋白以及(ii)在其膜处表达人AMHRII的细胞的频率(例如在其膜处表达人AMHRII的细胞的百分比)如果至少为阈值。
因此，本文还描述了另一种方法，该方法也可以用于确定特定的AMHRII表达评分值，以允许区分(i)不适合使用AMHRII结合剂的癌症治疗的肺癌患者(即，对使用AMHRII结合剂的癌症治疗无响应的肺癌患者)和(ii)适合使用AMHRII结合剂的癌症治疗的肺癌患者(即，对使用AMHRII结合剂(例如，抗人AMHRII抗体)的癌症治疗有响应的肺癌患者)。
更精确地，根据上述方法的实施方式，患有本文所述的肺癌并且可以针对肺癌用如本说明书所述的AMHRII结合剂来治疗的患者优选为已确定其膜AMHRII表达评分值为1.0或更大的那些患者。
膜AMHRII表达评分可以基于所测试的肺癌细胞的AMHRII表达的免疫组织化学评价，并且是从源自患有肺癌的不同个体的多个肺癌细胞样品测定的膜AMHRII评分的平均值，并且其中，(i)如果未检测到AMHRII表达，则给定肺癌细胞样品的个体膜AMHRII评分被指定为0，(ii)如果检测到显著的AMHRII表达，则给定肺癌细胞样品的个体膜AMHRII评分被指定为1，(iii)如果检测到高的AMHRII表达，则给定肺癌细胞样品的个体膜AMHRII评分被指定为2，和(iv)如果检测到AMHRII的过表达，则给定肺癌细胞样品的个体膜AMHRII评分被指定为3。
实际上，(i)通过上述免疫组织化学评价指定给膜AMHRII表达水平的评分与(ii)每个肺癌细胞表达的AMHRII蛋白的平均数量之间存在关系。在本文的示例中显示，从先前从肺癌患者收集的肺肿瘤细胞的样品开始，通过确定每个细胞的膜AMHRII蛋白的平均数量，也可以评估使得能够指定个体膜AMHRII评分的膜AMHRII表达水平。
根据确定患有肺癌的个体对用AMHRII结合剂的治疗(即，对用抗AMHRII抗体的治疗)的响应性的以上实施方式，对于给定的肺癌细胞样品，通过考虑以下两者测定膜AMHRII表达评分：(i)所述肺癌细胞样品中AMHRII表达细胞的频率和(ii)所述AMHRII表达细胞的膜AMHRII表达的水平。通常，给定的肺癌细胞样品的膜AMHRII表达评分由下式(I)确定：
E评分＝频率x AMHRII_水平，其中
-E评分意指给定的肺癌细胞样品的膜AMHRII表达评分值，
-频率意指针对检测到膜AMHRII表达的所述肺癌细胞样品中包含的细胞的频率，和
-AMHRII_水平意指所述给定的肺癌细胞样品中包含的AMHRII表达细胞的AMHRII膜表达的水平。
说明性地，给定的肺癌细胞样品的E评分确定为1.0，其中，(i)50％的细胞表达AMHRII(频率值为0.5)，并且(ii)AMHRII表达水平(AMHRII_水平)为2。
在一些实施方式中，AMHRII表达评分(或E评分)通过如本文的示例所示的免疫组织学方法确定。根据这些优选的实施方式，通过使用对AMHRII特异性的可检测抗体并通过(i)确定结合有所述抗AMHRII抗体的细胞的频率和(ii)确定由所述可检测的抗AMHRII抗体在结合至膜表达的AMHRII之后产生的信号的强度来评估AMHRII膜表达。
尽管，如本文的示例所示，对于各种肺癌已经确定了具有1.0或更大的膜AMHRII表达评分的表达AMHRII的肺癌细胞，尽管频率不同。
为了确定AMHRII膜表达的水平，检测在细胞膜处的AMHRII应该最优选通过使用对AMHRII具有高亲和力和高特异性的抗AMHRII单克隆抗体来进行，该抗AMHRII单克隆抗体在示例中由3C23K抗AMHRII单克隆抗体来说明。
此外，考虑到确定AMHRII评分，通过免疫组织化学方法确定AMHRII表达最优选涉及在使肺组织样品与适当的检测试剂(例如高亲和力抗AMHRII单克隆抗体，诸如单克隆3C23K抗体，对于结合至AMHRII具有55.3pM的Kd值)接触之前仔细的预处理所述样品。样品预处理应允许增加在细胞表面处表达的AMHRII分子的检测试剂的利用率。说明性地，如本文的示例中所示，预处理方法可以包括诸如以下的特定步骤的适当组合：(i)通过暴露于微波源的高温脱蜡和(ii)用于放大由可以随后与链霉亲和素缀合的可检测试剂复合的AMHRII结合试剂(诸如生物素化的抗AMHRII抗体)的结合产生的信号的系统。由于先前的组织固定步骤，预处理脱蜡步骤对于逆转检测信号消光效应似乎很重要。本发明人已经表明，AMHRII可检测性对用于组织固定步骤的福尔马林的作用是特别灵敏的。
这意味着，尽管AMHRII结合剂可能是用于治疗患有肺癌的患者的相关治疗剂，但优选是先测试肿瘤来源的肺癌细胞的AMHRII表达，以决定特定的患者将施用如本文所述的AMHRII结合剂。
此外，本发明人已经表明抗AMHRII抗体可以有利地用于治疗肺癌。
因此，本发明人在本文中已经表明，靶向AMHRII的药剂可用作预防或治疗这些种类的癌症、尤其是选自包括以下的组的NSCLC的新型治疗工具：表皮样NSCLC、多形性细胞癌NSCLC和神经内分泌NSCLC腺癌NSCLC、大细胞NSCLC和鳞状细胞癌NSCLC及神经内分泌NSCLC。
根据本发明，诸如在“包括以下步骤”中的表述“包括”也理解为“由以下组成”，诸如“由以下步骤组成”也理解为“由以下组成”，诸如“由以下步骤组成”。
AMH受体(AMHR或AMHR2或AMHRII)是具有单个跨膜结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于TGF-β相关蛋白的II型受体家族。II型受体本身结合配体，但需要存在I型受体用于信号转导。Imbeaud等人(1995,Nature Genet,第11卷:382-388)克隆了人AMH II型受体基因。人AMH受体蛋白由573个氨基酸构成：这573个氨基酸中的17个氨基酸、127个氨基酸、26个氨基酸和403个氨基酸分别形成信号序列、胞外结构域(ECD)、跨膜结构域和胞内结构域(含有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域)。
如本文所用，术语“AMHRII”是指具有SEQ ID NO.17的氨基酸序列的人抗苗勒激素II型受体。
抗苗勒激素受体(AMHRII)的表达已在本领域中描述于妇科癌症(即，大部分被免疫髓样细胞浸润的肿瘤)中。AMHRII已被鉴定为用于治疗妇科癌症的靶分子。针对AMHRII的抗体已作为用于治疗这些癌症的治疗性工具产生。可以特别引用在PCT申请No.WO 2008/053330和No.WO 2011/141653中描述的用于治疗卵巢癌的12G4抗AMHRII抗体及其变体，以及PCT申请中描述的3C23K抗AMHRII抗体。还可以提及PCT申请No.WO 2017/025458，其公开了通过使用抗AMHRII抗体药物缀合物来针对卵巢癌的具体治疗策略。
Beck等人(2016,Cell Reports,第16卷:657-671)还描述了抗苗勒激素受体基因(AMHRII基因)的表达。这些作者表明，AMH信号传导是NSCLC中上皮可塑性、存活信号传导和选择性药物抗性的重要因素。Beck等人(2016)的工作提供了关于NSCLC发病的胞内机制的见解，特别是通过报告，通过使用siRNA调节各种感兴趣的基因表达，鉴定和表征NSCLC肿瘤亚组中先前未定义的自分泌信号传导轴(涉及抗苗勒激素及其II型受体)对Hsp90抑制剂吉尼替比和已批准的化学疗法顺铂的响应至关重要。这些作者通过蛋白质印迹实验还发现存在于三种细胞系的细胞(即A549和H1299)中的低丰度的AMH蛋白和AMHR2蛋白，这些蛋白的产生通过SiRNA靶向相应的基因而阻断。
本发明人现在出乎意料地发现，AMHRII还在各种人肺癌细胞的表面处表达，该人肺癌细胞特别包括非小细胞肺癌(NSCLC)细胞，甚至更特别是选自包括以下的组的NSCLC：表皮样NSCLC、多形性细胞癌NSCLC和神经内分泌NSCLC腺癌NSCLC、大细胞NSCLC和鳞状细胞癌NSCLC及神经内分泌NSCLC。本发明人还表明(i)癌细胞的AMHRII基因表达和(ii)相同癌细胞的细胞膜AMHRII蛋白表达之间没有关系。
本发明人关于人肺癌细胞的AMHRII表面表达的发现尤其来自使用抗AMHRII抗体的免疫组织化学测试，所述免疫组织化学测试通过使用先前从肺癌患者获得的人肺肿瘤组织样品进行。本发明人关于人肺癌细胞的AMHRII表面表达的发现也是从用抗AMHRII抗体的免疫组织化学测试获得的，所述免疫组织化学测试在小鼠中对源自人原代肺癌细胞异种移植物的肺肿瘤组织样品进行。
本发明人还显示抗AMHRII抗体可用于治疗在肿瘤细胞表面处表达AMHRII的人肺癌、尤其是本说明书中公开的那些表达AMHRII的肺癌，其包括非小细胞肺癌、尤其是表皮样NSCLC、多形性细胞癌NSCLC和神经内分泌NSCLC腺癌NSCLC、大细胞NSCLC和鳞状细胞癌NSCLC及神经内分泌NSCLC。值得注意的是，抗AMHRII抗体以及与化学抗癌剂(诸如众所周知的抗癌剂多西他赛、顺铂和/或吉西他滨)组合的抗AMHRII抗体已经显示出良好的抗癌活性。
本发明人已经显示，在本领域中已经证明对表达AMHRII的妇科癌症具有抗肿瘤功效的抗AMHRII抗体也可用于预防或治疗表达AMHRII的肺癌，并且尤其是本说明书中公开中的那些表达AMHRII的肺癌，诸如非小细胞肺癌、尤其是表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC和鳞状细胞癌NSCLC、多形性细胞癌NSCLC和神经内分泌NSCLC。
更精确地，在本文的示例中显示，名为3C23K的抗AMHRII抗体对人肺癌、尤其是对本文公开的非小细胞肺癌在体内发挥抗肿瘤活性，包括当所述抗AMHRII抗体治疗与用一种或多种不同的抗癌剂(诸如多西他赛、顺铂和/或吉西他滨)的治疗组合时。
更进一步，本发明人还表明抗AMHRII 3C23K抗体在体内不诱导可检测到的毒性事件，尤其是不诱导显著的体重减轻。
因此，本发明涉及人AMHRII结合剂用于预防或治疗肺癌、特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、更特别是选自包括以下的组的非小细胞肺癌(NSCLC)的用途：表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC、鳞状细胞癌NSCLC、多形性细胞癌和神经内分泌NSCLC。
本发明还涉及人AMHRII结合剂用于制备用于预防或治疗肺癌、尤其是选自包括以下的组的肺癌的药剂的用途：表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC、鳞状细胞癌NSCLC、多形性细胞癌NSCLC和神经内分泌NSCLC。
本发明还涉及用于预防或治疗肺癌、尤其是选自包括以下的组的肺癌的方法：表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC、鳞状细胞癌NSCLC、多形性细胞癌NSCLC和神经内分泌NSCLC，其中，所述方法包括向有需要的个体施用本说明书中公开的AMHRII结合剂的步骤。
可以根据本发明使用的AMHRII结合剂不需要模拟MIS天然配体活性。因此，可以根据本发明使用的AMHRII结合剂在结合至AMHRII之后不需要活化任何细胞信号传导途径。相反，仅需要所述试剂具有与AMHRII结合的能力，因为所述试剂专门用于靶向诱导细胞毒性的活性(诸如细胞毒性诱导实体)，其涵盖抗AMHRII细胞毒性免疫缀合物、ADCC诱导的抗AMHRII抗体或ADC诱导的抗AMHRII抗体或表达AMHRII结合工程化受体的CAR T细胞。
AMHRII结合剂
如本文所用，AMHRII结合剂涵盖特异性结合至AMHRII并且当以适当的方式呈递时将引起在试剂结合细胞膜表达的AMHRII之后在其表面处表达AMHRII的靶细胞死亡的任何所述试剂。
如本文所述的用于治疗肺癌的AMHRII结合剂在本文中也可以称为“治疗性AMHRII结合剂”。
通常，AMHRII结合剂涵盖特异性结合至AMHRII的蛋白或核酸。
AMHRII结合蛋白主要涵盖包括来源于抗AMHRII抗体或抗AMHRII抗体的AMHRII结合片段的一个或多个互补决定区(CDR)的蛋白，应理解所述AMHRII结合蛋白可以由工程化细胞(诸如CAR-T细胞、NK T细胞或CAR巨噬细胞)表达为嵌合性抗原受体(CAR)。
AMHRII结合核酸主要涵盖针对其与AMHRII的特异性结合性质而特别选择的核酸适体。
在一些优选的实施方式中，AMHRII结合剂是抗AMHRII抗体或其AMHRII结合片段。
在最优选的实施方式中，AMHRII结合剂是抗AMHRII单克隆抗体或其AMHRII结合片段。
根据这些优选的实施方式，抗AMHRII单克隆抗体涵盖嵌合性抗AMHRII抗体、人源化抗AMHRII抗体和人AMHRII抗体，以及其AMHRII结合片段和AMHRII结合衍生物。
各种AMHRII抗体是本领域已知的，并且可以根据本发明用作AMHRII结合剂。出于实施本发明的目的，本领域技术人员可以使用用于示例的由Creative Biolabs出售的编号为No.MHH-57的重组人抗AMHRII。
在一些实施方式中，可以根据本发明使用的抗AMHRII抗体是PCT申请No.WO 2008/053330中公开的人源化12G4抗体。
在一些其他实施方式中，所述抗AMHRII抗体是PCT申请No.WO 2011/141653中描述的人源化抗体，所述人源化抗体涵盖3C23抗体以及其变体，所述其变体包括3C23K人源化抗体。
在更进一步的实施方式中，所述抗AMHRII抗体是PCT申请No.WO 2017/025458中描述的那些。根据这些另外的实施方式，PCT申请No.WO 2017/025458公开了抗体药物缀合物(ADC)形式的AMHRII结合剂，其中，所述抗AMHRII抗体连接至细胞毒性剂。
本领域中已经开发了针对苗勒激素II型受体(及其人源化衍生物)的单克隆抗体用于治疗卵巢癌(参见EP 2097453B1和美国专利No.8,278,423，其在此通过引用整体并入)。
在可以根据本发明使用的AMHRII结合剂中，本领域技术人员可以使用单克隆抗体12G4(mAb 12G4)或其嵌合性变体或人源化变体，包括用药物或可检测标记衍生而来以形成ADC的抗体。产生mAbl2G4的杂交瘤根据2006年9月26日的布达佩斯条约条款保藏在国家微生物菌种保藏中心(CNCM，巴斯德研究所，法国75724巴黎第15区克鲁斯博士大街25号)，并且CNCM保藏号为1-3673。已经将mAb 12G4的轻链和重链的可变结构域测序为mAb 12G4的互补决定区(CDR)(参见EP 2097453B1和美国专利No.8,278,423，其在此通过引用整体并入)。mAb 12G4及其嵌合性变体或人源化变体可以用于产生如本文公开的ADC。
PCT申请No.PCT/FR2011/050745(国际公开No.WO/2011/141653)和美国专利No.9,012,607(其各自在此通过引用整体并入)公开了来源于鼠12G4抗体的新型人源化抗体。出于本发明的目的，这些人源化抗体可以用作AMHRII结合剂。在PCT申请No.WO/2011/141653中公开的具体实施方式中，抗体是鉴定为3C23和3C23K的那些抗体。这些抗体的核酸序列和多肽序列在本文中以SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16提供。在本发明的一些方面，感兴趣的抗AMHRII抗体可以称为“包括包含SEQ ID NO:的轻链和包含SEQ ID NO:的重链”。因此，在各种实施方式中，特别优选的抗体(包括用于产生ADC的抗体)包括：
a)包含SEQ ID NO:2的轻链和包含SEQ ID NO:4的重链(无先导序列的3C23 VL序列和3C23 VH序列)；
b)包含SEQ ID NO:6的轻链和包含SEQ ID NO:8的重链(无先导序列的3C23K VL序列和3C23K VH序列)；
c)包含SEQ ID NO:10的轻链和包含SEQ ID NO:12的重链(无先导序列的3C23轻链和3C23重链)；
d)包含SEQ ID NO:14的轻链和包含SEQ ID NO:16的重链(无先导序列的3C23K轻链和3C23K重链)。
其他抗体(例如，人源化抗体或嵌合性抗体)可以基于图1A和图1B中提供的重链序列和轻链序列(例如，抗体，诸如含有所述图内公开的CDR序列的人源化抗体或嵌合性抗体)可以用作感兴趣的抗MAHRII结合剂，包括用于形成ADC的抗体。因此，本发明还涉及包括包含/含有以下序列(或由以下序列组成)的CDR的抗AMHRII抗体的用途：
-CDRL-1：RASX1X2VX3X4X5A(SEQ ID NO.65)，其中X1和X2独立地是S或P、X3是R或W或G、X4是T或D、并且X5是I或T；
-CDRL-2是PTSSLX6S(SEQ ID NO.66)，其中X6是K或E；和
-CDRL-3是LQWSSYPWT(SEQ ID NO.67)；
-CDRH-1是KASGYX7FTX8X9HIH(SEQ ID NO.68)，其中X7是S或T、X8是S或G、并且X9是Y或N；
-CDRH-2是WIYPX10DDSTKYSQKFQG(SEQ ID NO.69)，其中X10是G或E；和
-CDRH-3是GDRFAY(SEQ ID NO.70)。
本发明还涉及使用此类抗AMHRII抗体产生的ADC用于治疗肺癌、尤其是非小细胞肺癌和小细胞肺癌的用途。
在本申请的范围内的抗体(例如，嵌合性抗体或人源化抗体)包括下表中公开的那些：替选地，特异性结合至AMHR-II的人单克隆抗体可以用于制备ADC。3C23K抗体由以下限定：
-对于VH氨基酸序列的SEQ ID NO:19，
-对于VL氨基酸序列的SEQ ID NO:36。
下表1列出了可以根据本发明使用的抗AMHRII人源化抗体。
表1：抗AMHRII抗体
Figure BDA0002320682990000171
Figure BDA0002320682990000181
Figure BDA0002320682990000191
抗AMHRII抗体、抗AMHRII抗体的AMHRII结合片段或AMHRII结合衍生物
术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且包括单克隆抗体(包括全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段(见下文)，只要它们表现出所期望的生物活性。
因此，如本文所用，术语“抗体”统称指代免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，以举例的方式包括但不限于IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM、其组合以及在任何脊椎动物(例如，哺乳动物，诸如人、山羊、兔和小鼠，以及非哺乳动物物种)中免疫应答期间产生的类似分子(诸如鲨鱼免疫球蛋白)。除非另有特别说明，否则术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”，其特异性结合至AMHRII，基本上排除了与其他分子(即与AMHRII不相关的分子)的结合。术语“抗体”还包括经遗传工程化的形式，诸如嵌合性抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合物抗体(诸如，双特异性抗体)。还参见Pierce Catalog andHandbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,111.)；Kuby,J.,Immunology,第7版,W.H.Freeman&Co.,纽约,2013。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即包括所述群体的各个抗体除了可能少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体针对单个抗原是高度特异性的。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰词“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明待使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备、或可以由重组DNA方法制备(参见，例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可以从噬菌体抗体文库使用例如Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)或Marks等人,J.MoI Biol.222:581-597(1991)描述的技术分离。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和Fv片段，直链抗体，scFv抗体，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用的“抗体重链”是指以其天然存在的构象的所有抗体分子中存在的两种类型的多肽链中的较大者。
如本文所用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构象的所有抗体分子中存在的两种类型的多肽链中的较小者，κ轻链和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指识别和结合至特定抗原的抗体的两条可变链(重链和轻链)的部分。CDR是可变链的最可变部分，并为抗体提供其特异性。可变重(VH)链和可变轻(VL)链的每个上都有三个CDR，因此每个抗体分子总共有六个CDR。CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常称为从N末端开始依次编号的CDR1、CDR2和CDR3，并且通常还由特定CDR所在的链来鉴定。因此，VHCDR3位于发现它的抗体重链的可变结构域中，而VLCDR1是来自发现它的抗体轻链的可变结构域的CDR1。结合LHR的抗体将具有特定的VH区序列和VL区序列，因此具有特定的CDR序列。具有不同特异性(即针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管CDR随抗体的不同而不同，但CDR中只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR中的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
“框架区”(以下称为FR)是不同于CDR残基的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有被鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4的四个FR。如果CDR是根据Kabat定义的，则轻链FR残基大约位于残基1-23(LCFR1)、残基35-49(LCFR2)、残基57-88(LCFR3)和残基98-107(LCFR4)，重链FR残基大约位于重链残基中的残基1-30(HCFR1)、残基36-49(HCFR2)、残基66-94(HCFR3)和残基103-113(HCFR4)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH结构域和VL结构域，其中，这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽还包括在VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，这使得scFv可以形成所期望的抗原结合结构。有关scFv的综述，请参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑.Springer-Verlag,纽约,第269-315页(1994)。
术语“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括与同一多肽链(VH和VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而无法在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，并形成两个抗原结合位点。双链抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中更详细地描述。
双链抗体或双特异性抗体可以大致分为两类：免疫球蛋白G(IgG)样分子和非IgG样分子。IgG样bsAb保留了Fc介导的效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)(Spiess等人,2015,MolImmunol.,第67(2)卷:95-106.)。bsAb的Fc区有助于纯化，并改善溶解度和稳定性。IgG样形式的双特异性抗体通常具有更长的血清半衰期，这是因为其尺寸较大以及FcRn介导的再循环(Kontermann等人,2015,Bispecific antibodies.Drug Discov Today第20(7)卷:838-47)。非IgG样bsAb的尺寸较小，导致组织渗透性增强(Kontermann等人,2015,Bispecificantibodies.Drug Discov Today第20(7)卷:838-47)。
根据一些优选的实施方式，根据本发明的双特异性抗体包括：(i)结合至AMHRII的第一抗原结合位点，和(ii)结合至不同于AMHRII的靶抗原、特别是可以由肿瘤环境的癌细胞或免疫细胞(诸如T细胞、NK或巨噬细胞)表达的靶抗原的第二抗原结合位点。在一些实施方式中，在此类双特异性抗体中，所述第二抗原结合位点结合至靶抗原(其是CD3)并且使T细胞接合。该靶抗原还可以是PDL1以解锁T细胞、或是CD16以活化NK或巨噬细胞。
本文指定的单克隆抗体特别包括“嵌合性”抗AMHRII抗体(免疫球蛋白)，其中一部分的重链和/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们展现出所期望的生物活性(美国专利No.4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
本文指定的单克隆抗体也涵盖人源化抗AMHRII抗体。“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合性抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者高变区的残基被具有所期望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体，诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区的残基所取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可能包含在接受者抗体或供体抗体中找不到的残基。这些修饰是为了进一步完善抗体性能进行的。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常是两个可变结构域中的基本上所有，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区都是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。对于另外的细节，请参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
本文指定的单克隆抗AMHRII抗体还涵盖抗AMHRII人抗体。“人抗体”是具有与由人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或使用如本文公开的任何一种用于制备人抗体的技术制成的人抗体。人抗体的该定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术来生产。在一个实施方式中，人抗体选自噬菌体文库，其中噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人.Nature Biotechnology 14:309-314(1996):Sheets等人.Proc.Natl.Acad.Sci.95:6157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter,J.MoI.Biol,227:381(1991)；Marks等人,J.MoI.Biol,222:581(1991))。人抗体也可以通过将人免疫球蛋白基因座引入内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的转基因动物(例如，小鼠)中制成。激发后，观察到人抗体产生，在各个方面都与在人中所见非常相似，包括基因重排、组装和抗体谱。该方法描述于例如美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和以下科学出版物中：Marks等人,Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。替选地，人抗体可以经由产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可以从个体回收或可以在体外免疫)。参见，例如Cole等人,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol,147(l):86-95(1991)；和美国专利No.5,750,373。
如本文所用，“抗体突变体”或“抗体变体”是指物种依赖性抗体的氨基酸序列变体，其中，物种依赖性抗体的氨基酸残基中的一个或多个已经被修饰。此类突变体必须与物种依赖性抗体具有小于100％的序列同一性或类似性。在一个实施方式中，抗体突变体将具有与物种依赖性抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％和最优选至少95％的氨基酸序列同一性或类似性的氨基酸序列。关于该序列的同一性或类似性在本文中定义为在比对序列和引入空位(如有必要)以达到最大序列同一性百分比之后，候选序列中与物种依赖性抗体残基相同(即相同残基)或相似(即来自相同基团的氨基酸残基，基于共同的侧链性质，参见下文)的氨基酸残基的百分比。N末端、C末端或内部延长、缺失或插入可变结构域外部的抗体序列均不得解释为影响序列同一性或类似性。
人源化抗体可以通过获得编码CDR结构域的核酸序列并根据本领域已知技术构建人源化抗体来产生。用于基于常规重组DNA和基因转染技术产生人源化抗体的方法是本领域众所周知的(参见，例如Riechmann L.等人，1988；Neuberger M S.等人，1985)。抗体可以使用本领域已知的多种技术人源化，所述技术包括例如CDR-移植(EP 239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利No.5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、镶饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan E A(1991)；Studnicka G M等人(1994)；Roguska M A.等人(1994))和链更替(shuffling)(美国专利No.5,565,332)。用于制备此类抗体的通用重组DNA技术也是已知的(参见欧洲专利申请EP 125023和国际专利申请WO 96/02576)。
可能期望修饰本文关于效应子功能指定的抗AMHRII抗体，例如以增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代基来实现。替选地或另外地，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使该区域内链间二硫键形成。由此产生的同二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人,J.Exp Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。还可以使用异双功能性交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体，如Wolff等人.CancerResearch 53:2560-2565(1993)中描述的。替选地，抗体可以是经工程化的，其具有双Fc区并因此可以具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等人，Anti-Cancer DrugDesign 3:219-230(1989)。WO00/42072(Presta,L.)描述了在人效应细胞存在下具有改善的ADCC功能的抗体，其中该抗体包含在其Fc区中的氨基酸取代。优选地，具有改善的ADCC的抗体包括在Fc区的位置298、333和/或334(残基的Eu编号)处的取代。优选地，改变的Fc区是包含在这些位置的一个、两个或三个处的取代或由在这些位置的一个、两个或三个处的取代构成的人IgG1 Fc区。此类取代任选地与增加CIq结合和/或CDC的取代组合。
具有改变的CIq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体描述于WO99/51642、美国专利No.6,194,551Bl、美国专利No.6,242,195Bl、美国专利No.6,528,624Bl和美国专利No.6,538,124(Idusogie等人)中。抗体包含在其Fc区的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334(残基的Eu编号)中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方式中，AMHRII结合剂涵盖糖工程化的抗AMHRII抗体。
如本文所用，术语“糖工程化”是指用于改变结合蛋白组合物的糖型谱(glycoformprofile)的任何本领域公认的方法。这样的方法包括在经遗传工程化以表达异源糖基转移酶或糖苷酶的经遗传工程化的宿主细胞(例如，CHO细胞)中表达结合蛋白组合物。在其他实施方式中，糖工程化方法包括在偏向特定糖型谱的条件下培养宿主细胞。
如本文所用，“糖工程化的抗体”涵盖(i)包含高半乳糖基化的Fc片段的抗体，(ii)包含低甘露糖基化的Fc片段(其涵盖甘露糖基化的Fc片段)的抗体，和(iii)包含低岩藻糖基化的Fc片段(其涵盖岩藻糖基化的Fc片段)的抗体。如本文所用，糖工程化的片段涵盖具有改变的糖基化的Fc片段，其选自包括以下改变的糖基化中的一个或多个的组：(i)高半乳糖基化，(ii)低甘露糖基化和(iii)低岩藻糖基化。结果，来自如根据本发明使用的抗AMHRII抗体的糖工程化的Fc片段涵盖高半乳糖基化的Fc片段、低甘露糖基化的Fc片段和低岩藻糖基化的Fc片段的说明性实例。
本领域技术人员可以参考用于获得包含已知以比非修饰的Fc片段更高的亲和力结合至Fc受体的高半乳糖基化的Fc片段、低甘露糖基化的Fc片段和低岩藻糖基化的Fc片段的抗AMHRII抗体的公知技术。
糖工程化的抗AMHRII抗体涵盖包含低岩藻糖基化的Fc片段(也可以称为“低岩藻糖”Fc片段)的抗AMHRII抗体。
免疫缀合物，特别是抗体药物缀合物(ADC)
可以用于本发明目的的AMHRII结合剂涵盖缀合至细胞毒性剂(诸如化学治疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物))的本文指定的抗体。此类抗体缀合物涵盖PCT申请No.WO 2017/025458中描述的那些。PCT申请No.WO 2017/025458尤其公开了抗AMHRII 3C23K抗体，以及3C23K ADC缀合物，本文显示了其针对非妇科人癌症的体内抗癌活性。
细胞毒性剂涵盖酶促活性毒素。可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、米托菌素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。
多种放射性核素可用于产生放射缀合物抗体。
抗体和细胞毒性剂的缀合物使用多种双官能团蛋白偶联剂(诸如PCT申请No.WO2017/025458中公开的那些)制备。
抗AMHRII ADC抗体缀合物的优选免疫缀合物是PCT申请No.WO 2017/025458中描述的那些。
CAR细胞，包括CAR T细胞、CAR NK细胞和CAR巨噬细胞
在一些实施方式中，人AMHRII结合剂是AMHRII结合受体或AMHRII结合受体表达细胞，特别是AMHRII结合受体表达CAR T细胞、AMHRII结合受体NK细胞或AMHRII结合受体表达CAR巨噬细胞。
因此，在一些实施方式中，人AMHRII结合剂是AMHRII结合工程化受体，最优选是其AMHRII结合区来源于本说明书中公开的单克隆抗AMHRII抗体的AMHRII结合工程化受体。
通常，AMHRII结合工程化受体由包括以下的嵌合性抗原受体(CAR)构成：(i)胞外结构域，(ii)跨膜结构域和(iii)胞内结构域，并且其中，胞外结构域是来源于本说明书中公开的抗AMHRII单克隆抗体的AMHRII结合部分。在一些实施方式中，所述AMHRII结合工程化受体的胞外结构域包含(i)包含来源于本文公开的抗AMHRII单克隆抗体的CDR的抗体VH链和(ii)包含来源于本文公开的抗AMHRII单克隆抗体的CDR的抗体VL链。在一些实施方式中，所述AMHRII结合工程化受体的胞外结构域包含本文公开的抗AMHRII单克隆抗体的VH链和VL链。在一些实施方式中，所述AMHRII结合工程化受体的胞外结构域是包含分别来源于来自本说明书中公开的抗AMHRII单克隆抗体的VH链和CH链的CDR的ScFv。在一些实施方式中，所述AMHRII结合工程化受体的胞外结构域是包含分别来自本说明书中公开的抗AMHRII单克隆抗体的VH链和CH链的ScFv。
本文还涵盖了由表达此类AMHRII结合受体的细胞、尤其是表达此类AMHRII结合受体的CAR T细胞、CAR NK细胞或CAR巨噬细胞构成的AMHRII结合剂。
如本文所用的术语“嵌合性抗原受体”(CAR)是指融合蛋白，其包括能够与抗原结合的胞外结构域、来源于与胞外结构域所来源的多肽不同的多肽的跨膜结构域、以及至少一个胞内结构域。“嵌合性抗原受体(CAR)”有时也称为“嵌合性受体”、“T体”或“嵌合性免疫受体(CIR)”。“能够结合至AMHRII的胞外结构域”意指可以结合至AMHRII的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”意指在细胞中已知用作传递信号以引起生物过程活化或抑制的结构域的任何寡肽或多肽。“跨膜结构域”意指已知跨细胞膜并且可以用于连接胞外结构域和信号传导结构域的任何寡肽或多肽。嵌合性抗原受体可以任选地包含用作胞外结构域和跨膜结构域之间的接头的“铰链结构域”。
CAR T细胞是经遗传工程化的自体T细胞，其中单链抗体片段(scFv)或配体附接至能够促进T细胞活化的T细胞信号传导结构域(Maher,J.(2012)ISRN Oncol.2012:278093；Curran,K.J.等人(2012)J.Gene Med.14:405-415；Fedorov,V.D.等人(2014)Cancer J.20:160-165；Barrett,D.M.等人(2014)Annu.Rev.Med.65:333-347)。
“胞内信号传导结构域”意指CAR的在T细胞内部发现或经工程化以待发现的部分。“胞内信号传导结构域”可以还包含或可以还不包含将CAR锚定在T细胞的质膜中的“跨膜结构域”。在一个实施方式中，“跨膜结构域”和“胞内信号传导结构域”来源于相同蛋白(例如CD3ζ)；在其他实施方式中，胞内信号传导结构域和跨膜结构域来源于不同蛋白(例如CD3ζ的跨膜结构域和CD28分子的胞内信号传导结构域，反之亦然)。
“共刺激内域(endodomain)”意指来源于T细胞共刺激分子的胞内信号传导结构域或其片段。T细胞共刺激分子的非限制性列表包括CD3、CD28、OX-40、4-1BB、CD27、CD270、CD30和ICOS。共刺激内域可以包括或可以不包括来自相同或不同的共刺激内域的跨膜结构域。
“胞外抗原结合结构域”意指CAR的特异性识别AMHRII并结合至AMHRII的部分。
在优选的实施方式中，“胞外结合结构域”来源于抗AMHRII单克隆抗体。例如，“胞外结合结构域”可以包括来自单克隆抗体的Fab结构域的全部或部分。在某些实施方式中，“胞外结合结构域”包括特定的抗AMHRII单克隆抗体的互补决定区。在又一个实施方式中，“胞外结合结构域”是获自本文指定的抗AMHRII单克隆抗体的单链可变片段(scFv)。
在优选的实施方式中，胞外结合结构域来源于本说明书中所述的抗AMHRII单克隆抗体中的任一个、特别来自3C23K抗AMHRII单克隆抗体。
I.胞外抗原结合结构域
在一个实施方式中，本发明的CAR包括来自本文所述的抗AMHRII单克隆抗体中的一者的胞外抗原结合结构域。
在一个实施方式中，胞外结合结构域包含以下CDR序列：
-CDRL-1：RASX1X2VX3X4X5A(SEQ ID NO.65)，其中X1和X2独立地是S或P、X3是R或W或G、X4是T或D、以及X5是I或T；
-CDRL-2是PTSSLX6S(SEQ ID NO.66)，其中X6是K或E；和
-CDRL-3是LQWSSYPWT(SEQ ID NO.67)；
-CDRH-1是KASGYX7FTX8X9HIH(SEQ ID NO.68)，其中X7是S或T、X8是S或G、以及X9是Y或N；
-CDRH-2是WIYPX10DDSTKYSQKFQG(SEQ ID NO.69)，其中X10是G或E，和
-CDRH-3是GDRFAY(SEQ ID NO.70)。
II.κMab scFv的VL结构域和VH结构域之间的接头
在另一个实施方式中，抗AMHRII VL经由柔性接头连接至抗AMHRII VH。具体地，柔性接头是约10个至约30个氨基酸(例如30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个或5个氨基酸)的甘氨酸/丝氨酸接头，并包含结构(Gly4Ser)3。
III.胞外抗原结合结构域和胞内信号传导结构域之间的间隔子
胞外抗原结合结构域通过使用“间隔子”与胞内信号传导结构域相连。间隔子经设计要足够柔性，以允许抗原结合结构域以有助于抗原识别和结合的方式取向。间隔子可以源自抗AMHRII免疫球蛋白本身，并且可以包括IgGl铰链区或IgG的CH2区和/或CH3区。
IV.胞内信号传导结构域
胞内信号传导结构域包含CD3链中的全部或部分。CD也被称为CD247，连同CD4 T细胞共受体或CD8 T细胞共受体一起负责偶联胞外抗原识别至胞内信号传导级联。
除了包括CD3ζ信号传导结构域之外，共刺激分子的纳入已显示增强了鼠科模型和临床试验中的CAR T细胞活性。已经研究了几种，包括CD28、4-IBB、ICOS、CD27、CD270、CD30和OX-40。
在某些实施方式中，公开了产生CAR表达细胞的方法，该方法包括以下或替选地基本上由以下组成：(i)用编码CAR的核酸序列转导经分离的细胞群，以及(ii)选择已用步骤(i)的所述核酸序列成功转导的细胞亚群。在一些实施方式中，经分离的细胞是T细胞、动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫科动物T细胞、犬科动物T细胞或人T细胞，从而产生CAR T细胞。在某些实施方式中，经分离的细胞是NK细胞，例如，动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫科动物NK细胞、犬科动物NK细胞或人NK细胞，从而产生CAR NK细胞。
CAR T细胞、CAR NK T细胞和CAR巨噬细胞的治疗性应用
包括本文所述的CAR T细胞、CAR NK细胞和CAR巨噬细胞的CAR细胞可以用于治疗表达AMHRII的肺肿瘤。本发明的CAR细胞优选用于治疗患有本文所述的肺癌、尤其是非小细胞肺癌或小细胞肺癌的患者中的表达AMHRII的肺肿瘤。
本发明的CAR细胞可以单独施用或与稀释剂、已知的抗癌治疗剂和/或其他组分(诸如细胞因子)或具有免疫刺激性的其他细胞群联合施用。
本发明的方法方面涉及用于抑制有需要的对象中的肿瘤生长和/或用于治疗有需要的癌症患者的方法。在一些实施方式中，肿瘤是实体肺肿瘤。
如本文所公开的CAR细胞可以单独施用或与稀释剂、已知的抗癌治疗剂和/或其他组分(诸如细胞因子)或具有免疫刺激性的其他细胞群联合施用。它们可以是一线疗法、二线疗法、三线疗法、四线疗法或另外疗法。它们可以与其他疗法联合。这样的非限制性实例包括化学疗法或生物制剂。适当的治疗方案将由主治医师或兽医确定。
包含本发明的CAR的药物组合物可以以适合于待治疗或预防的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但施用的量和频率将由诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重性等因素决定。
治疗性应用
如本说明书其他地方已经公开的那样，本文公开的AMHRII结合剂涵盖(i)本文公开的抗AMHRII抗体，(ii)本文公开的抗体药物缀合物和(iii)本文所公开的CAR细胞(包括CAR T细胞、CAR NK细胞和CAR巨噬细胞)，该AMHRII结合剂由可以用于预防或治疗表达AMHRII的肺癌、特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、更准确地是选自包括以下的组的NSCLC的活性成分构成：表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC和鳞状细胞癌NSCLC及神经内分泌NSCLC。
利用抗肿瘤抗原抗体或抗肿瘤抗原CAR细胞的癌症治疗方法是本领域技术人员众所周知的。
在一些实施方式中，测试癌症患者以确定在用AMHRII结合剂(诸如抗AMHRII抗体、抗AMHRII ADC或抗AMHRII CAR T细胞)进行治疗之前，他们的肿瘤细胞是否在其表面处表达AMHRII。
用于检测AMHRII的膜表达的此类初步测试优选用于治疗低频表达AMHRII的肺癌。相反，对于治疗高频表达AMHRII的癌症(诸如用作说明的表皮样NSCLC)，可能不进行用于检测AMHRII的膜表达的此类初步测试。
因此，在一些实施方式中，本发明涉及如本文指定的AMHRII结合剂用于预防或治疗患有AMHRII阳性肺癌的个体的用途，该肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)、尤其是选自包括以下的组的NSCLC：表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC、鳞状细胞癌NSCLC、多形性细胞癌NSCLC和神经内分泌NSCLC。
本发明涉及AMHRII结合剂用于制备预防或治疗患有包括肺癌的AMHRII阳性肺癌的个体的药剂的用途，该肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)、尤其是选自包括以下的组的NSCLC：表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC、鳞状细胞癌NSCL、多形性细胞癌NSCLC C和神经内分泌NSCLC。
本发明还涉及用于预防或治疗患有AMHRII阳性肺癌的个体的方法，该肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)、尤其是选自包括以下的组的NSCLC：表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC、鳞状细胞癌NSCLC、多形性细胞癌NSCLC和神经内分泌NSCLC，其中，所述方法包括向所述个体施用抗AMHRII结合剂的步骤。
通过进行检测先前从个体获得的肺癌组织样品上的细胞表面AMHRII蛋白表达的方法，可以将所述个体指定为患有AMHRII阳性癌症的个体。细胞表面AMHRII蛋白表达的检测可以根据本领域技术人员众所周知的多种方法进行。细胞表面AMHRII蛋白表达检测方法特别涵盖免疫组织化学方法以及荧光激活细胞分选方法，如本文的示例所示。
本发明还涉及用于确定个体是否适合于用AMHRII结合剂的肺癌治疗(即个体是否响应于用AMHRII结合剂的肺癌治疗)的方法，其中，所述方法包括确定先前从所述个体获得的肺肿瘤组织样品是否在细胞表面处表达AMHRII蛋白的步骤。
因此，本发明还涉及用于确定患有肺癌、特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、尤其是选自包括表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC和鳞状细胞癌NSCLC及神经内分泌NSCLC的组的NSCLC的个体是否适合于用AMHRII结合剂的癌症治疗(即响应于用AMHRII结合剂的癌症治疗)的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)确定来自所述患者的癌细胞是否在其膜处表达AMHRII，和
b)推断：如果在步骤a)确定了所述肺癌细胞的AMHRII的膜表达，则所述患者适合于用AMHRII结合剂的肺癌治疗(即对用AMHRII结合剂的肺癌治疗有响应)。
在所述方法的优选的实施方式中，在步骤b)，当(i)在步骤a)确定AMHRII表达评分值时并且当(ii)所述AMHRII表达评分值是阈值评分值或更高时，推断所述患者适合于(即响应于)用AMHRII结合剂的肺癌治疗。AMHRII评分值最优选通过使用本说明书其他地方所述的式(I)计算。
因此，根据优选的实施方式，该方法的步骤a)通过免疫组织化学方法进行，诸如本文的示例所示。
在步骤a)使用的癌细胞通常源自先前从所述癌症患者收集的活检组织样品。
优选地，步骤a)通过使用选自本说明书中具体描述的那些抗体的抗AMHRII抗体、特别是3C23K抗体来进行，该抗体的AMHRII结合可以根据公知的抗体检测技术、诸如本文的示例中公开的那些技术，通过使用经标记的二级抗体来检测。
优选地，当根据下式(I)进行允许测定E评分值的评分方法时，当在来源于患有以上列出的肺癌组中包括的肺癌的癌症患者的癌细胞样品中确定膜AMHRII表达评分值为1.0或更大时，确定所述患者适合于(即响应于)使用AMHRII结合剂的肺癌治疗：
E评分＝频率x AMHRII_水平，其中
-E评分意指给定癌细胞样品的膜AMHRII表达评分值，
-频率意指检测到膜AMHRII表达的所述肺癌细胞样品中所含细胞的频率，并且
-AMHRII_水平意指在所述给定肺癌细胞样品中包含的AMHRII表达细胞的AMHRII膜表达的水平。
因此，本发明还涉及用于治疗患有非小细胞肺癌(NSCLC)的患者的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
a)确定先前从所述个体获得的肿瘤组织样品是否在细胞表面处表达AMHRII蛋白，和
b)如果已经在步骤a)确定了AMHRII的细胞表面表达，则用AMHRII结合剂治疗所述个体。
在最优选的实施方式中，在步骤a)，当所述肿瘤样品具有根据上述式(I)计算的1.0或更大的膜AMHRII表达评分值“E评分”(涵盖1.5或更大的E评分值)时，确定AMHRII表达。
在上述方法的最优选实施方式中，所述AMHRII结合剂由如本文所指定的抗AMHRII抗体或其片段构成、或者由如本文所指定的CAR细胞(例如CAR T细胞或CAR NK细胞)构成。
在一些实施方式中，所述AMHRII结合剂用作唯一的抗癌活性成分。
在一些其他实施方式中，用所述AMHRII结合剂的抗癌治疗还包括使所述个体经受一种或多种另外的抗癌治疗，其包括放射疗法治疗和化学治疗剂治疗。
因此，根据此类其他实施方式，用所述AMHRII结合剂的抗癌治疗还包括向所述个体施用一种或多种另外的抗癌活性成分。
组合疗法
如本文的示例所示，有效的抗肺癌肺疗法涵盖其中将抗AMHRII单克隆抗体与一种或多种不同的抗癌剂组合的那些。本文的示例说明了针对肺癌的组合疗法，其中，抗AMHRII抗体与多西他赛组合或与顺铂和吉西他滨的组合组合。
“抗癌剂”定义为可以干扰大分子(DNA、RNA、蛋白质等)的生物合成或抑制细胞增殖或导致细胞死亡(例如通过凋亡或细胞毒性)的任何分子。在抗癌剂中，可以提及的是烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂和嵌入剂、抗代谢物、裂解剂、干扰微管蛋白的试剂、单克隆抗体。
“药学上可接受的媒介物”是指与生物系统(诸如细胞、细胞培养物、组织或生物体)相容的无毒物质。
根据特定的方面，本发明涉及药物组合物，其包含与药学上可接受的媒介物组合的作为活性成分的抗癌剂和与AMHR-II结合的抗体、特别是本文所述的抗AMHRII抗体。
在一些实施方式中，本发明涉及药物组合物，其包含与药学上可接受的媒介物组合的作为活性成分的抗癌剂和结合AMHR-II的抗体、特别是本文所述的抗AMHRII抗体。
在一些实施方式中，本发明涉及药物组合物，其包含与药学上可接受的媒介物组合的作为活性成分的抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，抗癌剂选自包括以下的组：多西他赛、顺铂、吉西他滨、以及顺铂和吉西他滨的组合。
可以与抗AMHRII抗体组合使用的其他抗癌剂涵盖紫杉醇或铂盐(诸如奥沙利铂、顺铂和卡铂)。
抗癌剂还可以选自除铂盐、小分子、单克隆抗体或其他抗血管形成肽体以外的化学治疗剂。
除铂盐以外的化学治疗剂包括嵌入剂(阻断DNA复制和转录)，诸如蒽环类药物(多柔比星、聚乙二醇化的脂质体多柔比星)，拓扑异构酶抑制剂(喜树碱和衍生物：Karenitecin、拓扑替康、伊立替康)，或者SJG-136，组蛋白脱乙酰酶的抑制剂(伏立诺他、贝利司他、丙戊酸)，烷基化剂(苯达莫司汀、葡磷酰胺、替莫唑胺)，抗有丝分裂植物生物碱(诸如紫杉烷(多西他赛、紫杉醇))，长春花生物碱(长春瑞滨)，埃博霉素(ZK-埃博霉素、伊沙匹隆)，抗代谢物(吉西他滨、艾西拉滨、卡培他滨)，纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂(伊斯平斯)，曲贝替定或者奥瑞布林(康普瑞汀A-4衍生物)。
在小分子中有聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂：奥拉帕尼，艾尼帕利，维利帕尼，卢卡帕尼，CEP-9722，MK-4827，BMN-673，激酶抑制剂(诸如酪氨酸激酶抑制剂(TKI))，其中可以提及的是抗-VEGFR分子(索拉非尼，舒尼替尼，西地尼布，凡德他尼，帕唑帕尼，BIBF1120，瑟玛沙尼，卡博替尼，莫特沙尼)，抗-HER2/EGFR分子(厄洛替尼，吉非替尼，拉帕替尼)，抗PDGFR分子(伊马替尼，BIBF 1120)，抗FGFR分子(BIBF 1120)，极光激酶/酪氨酸激酶抑制剂(ENMD-2076)，Src/Abl激酶抑制剂(塞卡替尼)，或还有哌立福辛，特罗莫司(mTOR抑制剂)，阿沃西地(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)，沃拉舍替(PLK1(保罗样激酶1)蛋白的抑制剂)，LY2606368(检查点激酶1(chk 1)的抑制剂)，GDC-0449(Hedgehog途径抑制剂)，齐波腾坦(ETA-受体的拮抗剂)，硼替佐米，卡非佐米(蛋白酶体抑制剂)，细胞因子(诸如IL-12、IL-18、IL-21、INF-α、INF-γ)。
在抗体中，可以提及的是抗VEGF：贝伐单抗，抗VEGFR：雷莫芦单抗，抗HER2/EGFR：曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、MGAH22、马妥珠单抗，抗PDGFRα：IMC-3G3，抗叶酸受体：法拉图组单抗，抗CD27：CDX-1127，抗CD56：BB-10901，抗CD105：TRC105，抗CD276：MGA271，抗AGS-8：AGS-8M4，抗DRS：TRA-8，抗HB-EGF：KHK2866，抗间皮素：阿玛妥昔单抗、BAY 94-9343(免疫毒素)、卡妥索单抗(EpCAM/CD3双特异性抗体)，抗IL2R：达克珠单抗，抗IGF-1R：加尼妥单抗，抗CTLA-4：易普利姆玛，抗PD1：纳武单抗和派姆单抗，抗CD47：Weissman B6H12和Hu5F9，Novimmune 5A3M3，INHIBRX 2A1，Frazier VxP037-01LC1抗体，抗刘易斯Y：Hu3S193，SGN-15(免疫毒素)，抗CAl25：奥戈伏单抗，抗-HGF：瑞洛妥木单抗，抗IL6：司妥昔单抗，抗TR2：替加妥珠单抗，抗α5β1整合素：沃洛赛昔单抗，抗HB-EGF：KHK2866。抗血管形成肽抗体选自AMG 386和CVX-241。
更具体地，本文描述了药物组合物，其包含与药学上可接受的媒介物组合的作为活性成分的抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，所述抗癌剂选自包括以下的组：多西他赛、顺铂、吉西他滨、以及顺铂和吉西他滨的组合。
甚至更具体地，本文描述了药物组合物，其包含与药学上可接受的媒介物组合的作为活性成分的抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，在本文中称为3C23K的经突变的人源化单克隆抗体和抗癌剂选自包括以下的组：多西他赛、顺铂、吉西他滨、以及顺铂和吉西他滨的组合。
在特定的方面，本文描述了在旨在用于通过静脉内或腹膜内途径施用的制剂中的药物组合物，其包含与药学上可接受的媒介物组合的作为活性成分的抗癌剂和结合AMHR-II的抗体。
在另一个特定的方面，本发明涉及组合物在预防或治疗肺癌中的在旨在用于通过静脉内或腹膜内途径施用的制剂中作为药用产品的用途，所述组合物包含抗癌剂和结合AMHR-II的抗体。
在另一个特定的方面，本发明涉及组合物在预防或治疗肺癌中作为药用产品的用途，所述组合物包含抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，单克隆抗体和抗癌剂旨在用于分开、同时或依序施用。
所述抗体和抗癌剂可以在同一药物组合物内组合，或者可以以同时或依序施用的分开的药物组合物的形式使用。特别地，产品可以分开施用，即同时或独立地施用，例如有时间间隔。
更具体地，本发明涉及组合物在预防或治疗肺癌中作为药用产品的用途，所述组合物包含抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，抗体和抗癌剂在相同药物组合物内组合。
根据另一个特定的方面，本发明涉及组合物在预防或治疗肺癌中作为药用产品的用途，所述组合物包含抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，施用给患者的抗AMHRII抗体的治疗有效量的范围为约0.07mg至约35 000mg、优选约0.7mg至约7000mg、优选约0.7mg至约1400mg、优选约0.7mg至约700mg和更优选约0.7mg至约70mg。
根据另一个特定的方面，本发明涉及组合物在预防或治疗肺癌中作为药用产品的用途，所述组合物包含抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，施用给患者的抗癌剂的治疗有效量的范围为约10mg至约700mg，优选范围为约20mg至约350mg且优选约110mg。
根据另一个特定的方面，本发明涉及组合物在预防或治疗肺癌中作为药用产品的用途，所述组合物包含抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，施用给患者的抗体的治疗有效量为约70mg，施用给患者的抗癌剂的剂量为约110mg。
在优选的实施方式中，抗癌剂(特别是多西他赛或顺铂和吉西他滨的组合)的剂量的范围为每天约0.01mg/kg至约500mg/kg，例如0.1mg/kg至300mg/kg，或约0.1mg至20g。
作为变型，也可以施用较高的初始负载剂量，然后施用一个或多个较低剂量。在另一个变型中，也可以施用不那么高的初始负载剂量，然后是一个或多个较高剂量。
在特定的实施方式中，抗AMHRII抗体和抗癌剂可以以约10/1至约0.01/1、特别是约10/1至约0.05/1、或约5/1至约0.1/1的范围内的抗体/抗癌剂重量比使用。
示例性地，抗AMHRII抗体和多西他赛可以以1/1的抗体/多西他赛重量比使用，如本文的示例所示。
仍然示例性地，抗AMHRII抗体和顺铂可以以4/1的抗体/顺铂重量比使用，如本文的示例所示。
仍然示例性地，抗AMHRII抗体和吉西他滨可以以0.2/1的抗体/吉西他滨重量比使用，如本文的示例所示。
本发明还描述了联合制剂形式的包含结合人抗苗勒激素II型受体(AMHR-II)的抗体和抗癌剂的产品，用于作为旨在用于预防或治疗表达AMHRII的肺癌的药用产品同时、依序或分开使用。
如本文公开的AMHRII结合剂、尤其是本文公开的抗AMHRII抗体可以以多种方式施用，包括经口施用、皮下施用和静脉内施用。
术语“治疗有效量”是指有效治疗哺乳动物的疾病或病症的药物的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤的大小；抑制(即在一定程度上减慢、优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即，在一定程度上减慢、优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与病症有关的一种或多种症状。在一定程度上，该药物可以阻止生长和/或杀灭现有的癌细胞，它可以抑制细胞生长和/或具有细胞毒性。对于癌症疗法，可以通过例如评估存活的持续时间、无进展存活(PFS)的持续时间、响应率(RR)、响应的持续时间和/或生活质量来测量体内功效。
通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，来制备用于储存的、冻干制剂或水溶液形式的根据本发明使用的试剂(例如，抗体)的治疗性制剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的反离子，诸如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
活性成分也可以被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备的微胶囊(例如分别羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中、或在大乳液中。此类技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。
用于体内施用的制剂可以是无菌的。这容易借由通过无菌过滤膜过滤实现。
如本文所述的药物组合物可以通过任何合适的施用途径，例如通过肠胃外、经口、舌下、经阴道、经直肠或透皮途径，优选通过静脉内、皮下或皮内注射来施用。肌内、腹膜内、滑膜内、鞘内或肿瘤内注射也是可能的。注射可以以团注的形式或通过连续输注进行。当抗体组合物和抗癌剂组合物分开施用时，这些组合物可以是相同或不同的施用形式。
用于肠胃外施用的制剂可以包括无菌的水性溶液或非水性溶液、混悬液或乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)或可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。水性媒介物包括水、醇/水溶液和乳液或混悬液。
如本文所述的药物组合物有利地包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或媒介物。可以提及例如与药物用途相容并且为本领域技术人员已知的盐水、生理溶液、等渗溶液、缓冲溶液等。该组合物可以含有选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等的一种或多种试剂或媒介物。可用于制剂(液体和/或可注射和/或固体)中的试剂或媒介物特别是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚山梨酯80、甘露醇、明胶、乳糖、植物油、阿拉伯胶等。组合物可以配制为可注射混悬液、凝胶、油、片剂、栓剂、粉剂、硬明胶胶囊、软胶囊等的形式。
根据特定的方面，本发明涉及药物组合物，其包含作为活性成分的与药学上可接受的媒介物组合的抗癌剂和抗AMHRII抗体，其中，施用给患者的抗体的治疗有效量的范围为约0.07mg至约35000mg、优选约0.7mg至约7000mg、优选约0.7mg至约1400mg、优选约0.7mg至约700mg且更优选约0.7mg至约70mg。
活性成分的剂量特别取决于施用方法，并且容易被本领域技术人员确定。在持续数周或数月的每周一次或多次施用中，抗体的治疗有效量(单位剂量)可以变化为0.01mg/kg至500mg/kg，优选0.1mg/kg至500mg/kg，优选为0.1mg/kg至100mg/kg，优选0.1mg/kg至20mg/kg，优选0.1mg/kg至10mg/kg并且更优选1mg/kg至10mg/kg。因此，有效单位剂量可以很容易地从体重为70kg的“平均”患者计算出的剂量中推导出来。
根据另一个特定的方面，本发明涉及药物组合物，其包含作为活性成分的与药学上可接受的媒介物组合的抗癌剂和抗AMHRII抗体，其中，向患者施用的抗癌剂的治疗有效量在约10mg至约700mg的范围内，优选在约20mg至约350mg的范围内，并且优选为约110mg。
抗癌剂的剂量特别取决于施用方法，并且容易被本领域技术人员确定。在持续数周或数月的每周一次或多次施用中，治疗有效量(单位剂量)可以变化为0.2mg/m2至10g/m2，优选0.2mg/m2至1g/m2，优选2mg/m2至1g/m2，优选20mg/m2至1g/m2和更优选20mg/m2至0.5g/m2。因此，有效单位剂量可以从体表面积约为1.8m2的“平均”患者计算出的剂量中推导出。
根据甚至更特定的方面，本发明涉及药物组合物，其包含作为活性成分的与药学上可接受的媒介物组合的抗癌剂和抗AMHRII抗体，其中，施用给患者的抗癌剂的治疗有效量为约110mg，并且施用给患者的抗体的治疗有效量为约70mg。
本发明还描述了组合物在预防或治疗表达AMHRII的肺癌中作为药用产品的用途，所述组合物包含抗癌剂和结合人抗苗勒激素II型受体(AMHR-II)的抗AMHRII抗体。
通过以下实施例、但不以任何方式限于以下实施例，进一步说明本发明。
实施例
实施例1：差异的AMHRII基因表达和AMHRII蛋白表达
A.材料和方法
A.1.细胞系和培养物
将COV434 WT细胞系(ECACC No.07071909)维持在补充有10％FBS、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml的DMEM/GlutaMax(Gibco)中。以400μg/ml添加遗传霉素(Gibco)用于COV434 MISRII转染的细胞系。将红白血病K562细胞系(
Figure BDA0002320682990000401
CCL-243TM)悬浮培养在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的IMDM培养基(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))中，并以1x 105至1x 106个细胞/ml的密度维持在T75烧瓶中。将OV90细胞系(
Figure BDA0002320682990000402
CRL-11732TM，卵巢浆液性腺癌)培养在含终浓度为1.5g/l碳酸氢钠的MCDB 105培养基(西格玛奥德里奇)和含终浓度为2.2g/l碳酸氢钠的培养基199(西格玛奥德里奇)(补充有15％FBS和青霉素/链霉素)的1:1混合物中。将NCI-H295R细胞系(肾上腺皮质癌，
Figure BDA0002320682990000403
CRL-2128TM)维持于补充有iTS+Premix(康宁(Corning))、2.5％Nu-Serum(Falcon)和青霉素/链霉素的DMEM:F12培养基(西格玛奥德里奇)中。将细胞在37℃在具有8％CO2的潮湿气氛中生长，并取决于细胞系，每周更换培养基一次或两次。
A.2.通过RT-qPCR的AMHR2 mRNA的相对定量
提取RNA.根据制造商的使用说明，使用
Figure BDA0002320682990000404
Plus RNA纯化试剂盒(Ambion)制备来自1x106至5x106个细胞团块的总RNA。简而言之，在苯酚/氯仿提取后，裂解细胞的RNA吸附在二氧化硅基质上，用DNA酶处理，然后用30μl无RNA酶的水洗涤并洗脱。用分光光度计(NanoDrop，赛默飞世尔科学(ThermoFisher Scientific))评估RNA浓度和质量。
cDNA合成.使用Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒(Ambion)和寡-dT引物通过以下步骤将RNA(1μg)逆转录：在25℃下孵育10min用于引发并在50℃下孵育15min用于逆转录，然后在85℃下孵育5min用于逆转录酶失活。
定量PCR.使用最终体积为20μl的Luminaris Color HiGreen qPCR Master Mix(Ambion)在96孔微孔板中的Light Cycler 480(罗氏(Roche))中进行定量PCR。使用以下引物：对于AMHR2，正向5’-TCTGGATGGCACTGGTGCTG-3’(SEQ ID NO.71)和反向5’-AGCAGGGCCAAGATGATGCT-3’(SEQ ID NO.72)；对于TBP，正向5’-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3’(SEQ ID NO.73)和反向5’-CACATCACAGCTCCCCACCA-3’(SEQ ID NO.74)。使用cDNA模板(100ng当量RNA)和以下方案进行扩增：在50℃下UDG预处理2min，在95℃下变性10min，然后在95℃下15s/在60℃下30s/在70℃下30s进行40个循环。在每个实验结束时进行熔化曲线分析，以控制没有基因组DNA和二聚体引物。一式两份测试每个cDNA样品和对照(“无模板样品”和“无逆转录物RNA”)。计算循环阈值(Ct)的平均值，并将AMHR2相对定量(RQ)表示为2-△△Ct，其中△△Ct＝△Ct样品-△Ct校准品和△Ct＝CtAMHR2-CtTBP。HCT116样品用作校准品，并且TBP作为管家基因用于归一化。
下表2描绘了使用上述Q-PCR方法在测试的细胞系中的AMHRII表达水平。
表2
Figure BDA0002320682990000411
A.3.通过流式细胞术分析评价膜AMHR2表达
为了荧光激活细胞分选(FACS)分析，将4x 105个细胞用25μg/ml的3C23K在4℃下孵育30min。用PBS-BSA2％洗涤后，通过缀合至荧光团的抗物种二级抗体检测一级抗体。通过缀合至藻红素(1:1000，Beckman-Coulter，IM0550)的抗人F(ab’)2检测3C23K。用PBS洗涤后，在BD AccuriTM C6流式细胞仪(BD生物科学(BD Bioscience))的FL2通道中实现了重悬细胞的FACS分析。
B.结果
结果描绘于图2中。结果表明，尽管COV434-WT细胞系具有人AMHRII蛋白的显著膜表达水平，但重组细胞系COV434-WT(对于细胞系NCI-H295R测得的AMHRII基因表达水平约为3％)。
这些结果表明AMHRII基因表达与膜AMHRII蛋白表达之间完全没有相关性。
实施例2：肺癌(人肿瘤样品)中的AMHRII表达
A.材料和方法
A.1.目标
用于使用生物素化的3C23K单克隆抗体检测抗苗勒激素2型受体(AMHR2)表达的小鼠中人癌细胞异种移植物(PDX)的免疫组织化学研究。
A.2.方案和方法
-细胞系：固定在甲醛乙酸醇(AFA)中，具有细胞块构造。
-人肿瘤：外部样品固定在福尔马林中，并且来自居里研究所的载玻片固定在AFA中。
-在将样品脱蜡并在pH9下暴露(在90℃下微波EZ Retriever 15’，然后在20’内冷却)后，免疫组织化学(IHC)技术是可能的。
-通过免疫过氧化物酶技术和DAB生色底物揭示的抗苗勒激素II型受体检测。
-在封闭内源性过氧化物酶活性后，将载玻片用稀释的生物素化的一级抗体(1/800，8μg/mL)在室温下孵育90分钟。然后将组织切片用PBS洗涤，并用亲和素/生物素ABC[载体]复合物孵育30分钟。使用DAB底物溶液(DAB+底物缓冲液/液体DAB+色原体，10分钟孵育)检测免疫反应信号。最后，用梅尔氏苏木精(里利氏改良)将切片轻轻地复染。
-阴性对照是通过在免疫组织化学染色程序中用同种型对照免疫球蛋白(R565)或单独的抗体稀释剂(阴性缓冲液对照)替代一级抗体获得的。
-通过使用AMHR2转染的COV434细胞和人粒层细胞肿瘤样品获得阳性对照。
-处理后，经由Philips IMS通过数字化观察切片。所有样本均由2位病理学家独立评分。
-详细描述了标记的定位：细胞质和/或膜。
-通过以下评分系统将强度分类为肿瘤细胞膜和/或细胞质的明确棕色标记：将标记的强度定义为：0(阴性)，1(弱)，2(中度)，以及3(强，如COV434阳性对照所示)。
-频率定义为AMHRII表达细胞的百分比。从分析中排除了坏死区域。通过使用频率x强度评分平均值(0至3)累积膜表达和细胞质表达来建立总组织学评分。
-将所有载玻片妥善保存。
B.结果
表3还描绘了各种原代人肺癌细胞的AMHRII膜表达的结果，其中，AMHRII表达评分代表一组不同的肺癌样品。
表3：人肺癌组织样品的AMHRII表达
肿瘤类型 阳性样品的百分比 测试样品的数量
SCLC 0％ 2
NSCLC(神经内分泌) 1.2％ 78
NSCLC(腺泡型) 0％ 2
NSCLC(表皮样) 100％ 4
NSCLC(鳞状细胞癌) 35％ 14
NSCLC(腺癌) 45.8％ 24
NSCLC(大细胞) 33％ 9
结果表明，AMHRII在多个人肺癌样品中的细胞表面处表达，该样品尤其是NSCLC来源的肿瘤样品，更确切地说是源自患有选自由以下组成的组的NSCLC的患者的肿瘤样品：表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC和鳞状细胞癌NSCLC及神经内分泌NSCLC。
实施例3：肺癌中的AMHRII表达
A.材料和方法
A.1.目标
开始从患者来源的异种移植物(PDX)或来自新鲜人肿瘤样品的人肺癌细胞的研究以用于使用生物素化的3C23K单克隆抗体检测抗苗勒激素2型受体(AMHR2)表达。
A.2.通过流式细胞术的AMHRII膜表达分析
制备用于分析的细胞
-将组织在手术1h内解剖，切成1-mm2片段，并在含有青霉素(10％)、链霉素(10％)和庆大霉素(0.1mg/mL；西格玛奥德里奇)的RPMI中洗涤。
-将组织片段用胶原酶和DNA酶(2mg/mL；西格玛奥德里奇)在37℃下快速振荡下消化2小时至4小时。
-借由通过40-lm细胞粗滤器过滤去除粘液和大碎片。
-通过Ficoll梯度离心获得活细胞。
根据制造商的使用说明，使用The QuantumTM Simply Cellular(BangsLaboratory)对重悬的肿瘤细胞上的AMHRII结合位点进行定量：
-简而言之，将标记有不同校准量的对人IgG抗体的Fc部分有特异性的小鼠抗人IgG的四个微珠群用AlexaFluor488缀合的抗AMHRII 3C23K染色。在FACS管中，将试剂盒中的每个小瓶的一滴加到50μl的PBS 1X中：
1-珠B(空白)
2-珠1+3C23K-AF 10μg/mL
3-珠2+3C23K-AF 10μg/mL
4-珠3+3C23K-AF 10μg/mL
5-珠4+3C23K-AF 10μg/mL(如果有必要，浓度可以增加至25μg/ml)。
-每个珠群结合不同量的AlexaFluor488缀合的抗AMHRII 3C23K，产生相应的荧光强度，将所述相应的荧光强度在FACS Canto II细胞仪(BD)上分析。
-通过绘制每个珠群的平均荧光强度相对于其指定的抗体结合能力(ABC)来生成校准曲线。
将细胞通常在1.5ml艾本德管中染色。
-所有离心步骤在4℃下进行。
-所有孵育步骤在4℃下进行以避免抗体内化。
-将350万个细胞(经胰蛋白酶化的COV434-MISRII或新鲜解离的肿瘤细胞)以200g至300g离心5分钟，并用PBS洗涤一次(每管500μl)。
-用冰冷的PBS/2％FBS洗涤(200g至300g，持续3min)，并重悬于700μl的PBS 1X中，并通过FACS管分配100μl，条件描述在下表4中：
表4
Figure BDA0002320682990000451
-用PBS/1％FBS中的抗体3C23K-AF488在4℃下孵育30min
-在PBS/2％BSA中洗涤两次(200g至300g，持续3min)
-在PBS中洗涤两次(200g至300g，持续3min)
-加入300μl至400μl的PBS，并尽快在FACS上分析
该方案不包括用于胞外染色的任何固定步骤，以保持膜的完整性。因此，仅检测到膜AMHRII。
A.3.免疫组织化学：方案和方法
-细胞系：固定在甲醛乙酸醇(AFA)中，具有细胞块构造。
-人肿瘤：外部样品固定在福尔马林中，并且来自居里研究所的载玻片固定在AFA中。
-在将样品脱蜡并在pH9下暴露(在90℃下微波EZ Retriever 15’，然后在20’内冷却)后，免疫组织化学(IHC)技术是可能的。
-通过免疫过氧化物酶技术和DAB生色底物揭示的抗苗勒激素II型受体检测。
-在封闭内源性过氧化物酶活性后，将载玻片与稀释的生物素化的一级抗体(1/800，8μg/mL)在室温下孵育90分钟。然后将组织切片用PBS洗涤，并用亲和素/生物素ABC[载体]复合物孵育30分钟。使用DAB底物溶液(DAB+底物缓冲液/液体DAB+色原体，10分钟孵育)检测免疫反应信号。最后，用梅尔氏苏木精(里利氏改良)将切片轻轻地复染。
-阴性对照是通过在免疫组织化学染色程序中用同种型对照免疫球蛋白(R565)或单独的抗体稀释剂(阴性缓冲液对照)替代一级抗体获得的。
-通过使用AMHR2转染的COV434细胞和人粒层细胞肿瘤样品获得阳性对照。
-处理后，经由Philips IMS通过数字化观察切片。所有样本均由2位病理学家独立评分。
-详细描述了标记的定位：细胞质和/或膜。
-通过以下评分系统将强度分类为肿瘤细胞膜和/或细胞质的明确棕色标记：将标记的强度定义为：0(阴性)，1(弱)，2(中度)，以及3(强，如COV434阳性对照所示)。
-频率定义为AMHRII表达细胞的百分比。从分析中排除了坏死区域。通过使用频率x强度评分平均值(0至3)累积膜表达和细胞质表达来建立总组织学评分。
-将所有载玻片妥善保存。
B.结果
a)对照
-阴性对照和同种型对照对肿瘤细胞没有反应性。
-阳性对照样品(经扩增的COV434 AMHRII)显示了细胞的弥散性免疫染色(强度评分：3)。标记对于细胞质定位和膜定位是均匀的(频率评分：100％)。
-阳性粒层细胞对照样品显示出肿瘤细胞的强免疫染色(强度评分：3)。标记对于细胞质定位和膜定位是均匀的(频率评分：100％)。
b)如通过IHC评估的患者来源的异种移植物(PDX)样品的AMHRII表达。
重要的是要注意，当将样品固定在福尔马林中与样品在AFA中处理相比时，AMHR2的膜表达似乎被低估了。
小鼠内异种移植的各种人肿瘤的AMHRII膜表达的结果描绘于表5中，其中，AMHRII表达评分代表一组不同的癌细胞类型。
下表5总结了人肿瘤异种移植物的AMHRII表达的部分结果。
表5：人肿瘤异种移植物中的AMHRII表达
肿瘤类型 阳性PDX的百分比 测试的PDX的数量
SCLC 0％ 13
NSCLC(非指定亚型) 15.4％ 13
NSCLC(表皮样) 26.9％ 26
NSCLC(腺癌) 7.7％ 39
NSCLC(大细胞) 40％ 10
结果表明，AMHRII在多种人肺癌异种移植物中的细胞表面处表达，尤其是NSCLC来源的肿瘤样品，更确切地说是源自患有选自由以下组成的组的NSCLC的患者的肿瘤样品：表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC和一些尚未鉴定亚型的NSCLC。
c)如通过流式细胞术(FACS)评估的患者来源的异种移植物(PDX)样品的AMHRII表 达
图3A至图3E中描绘的结果表明，与考虑的肺癌的种类无关，AMHRII在来源于肺癌患者来源的异种移植物的肿瘤细胞膜处表达。图3A至图3E中描绘的结果表明，在鳞状细胞肺癌(图3A，图3C，图3D)、大细胞肺癌(图3B)和多形性细胞肺癌(图3E)中发现了AMHRII的膜蛋白表达。
此外，对于相同的肺癌细胞，在相同测试样品中测量(i)每细胞的AMHRII数量以及(ii)AMHRII癌细胞的百分比。结果在下表6中描绘。
表6：获自患者来源的异种移植物的人肺癌细胞中AMHRII表达的FACS分析
Figure BDA0002320682990000481
在表6中，通过(i)确定存在于肿瘤细胞膜处的AMHRII蛋白的平均数量和通过(ii)确定肿瘤样品中膜AMHRII阳性细胞的百分比，评估每个肿瘤样品中的AMHRII表达。表6的左栏中显示了将相应的肿瘤样品设置为“阳性”或“阴性”的指示。指示“阳性”意指肺癌患者的肿瘤细胞在其膜处显著表达AMHRII。指示“阴性”意指在肿瘤细胞膜处未显著检测到AMHRII。
表6的结果表明，尽管处于各种表达水平，所有肿瘤样品均表达膜AMHRII。
d)如通过流式细胞术(FACS)评估的新鲜人肿瘤样品的AMHRII表达
图3F和图3G中所描绘的结果表明，AMHRII在来源于手术切除的人NSCLC的肿瘤细胞膜处表达(图3G)，而AMHRII在来源于从相同患者产生的健康边缘的细胞膜处未表达(图3F)。
e)结论
在对AMHR2转录呈阳性的肺癌PDX模型中，已确认AMHR2蛋白表达。这些PDX改自肺IC8LC10癌和肺SC131癌。表达水平中等但显著，特征在于总评分为1至1.5。这些数据表明，除妇科癌症以外，均可以表达AMHR2。
这些模型将来可以用于表征抗AMHR2疗法。
实施例4：抗AMHRII抗体针对表达AMHRII的肺癌的体内功效
1.目标概述
为了分析加马玛布斯(Gamamab)的测试化合物GM102(在本文中也称为3C23K抗体)用作单一药剂或与多西他赛或组合顺铂/吉西他滨联用在免疫缺陷的雌性小鼠中开发的SC131患者来源的非小细胞肺异种移植物模型中的抗肿瘤功效。
2.方法
当平均肿瘤体积和中位肿瘤体积分别达到130.76mm3和126.00mm3时，将五十四(54)只皮下生长的62.5mm3至220.5mm3的SC131肿瘤(P22.1.3/0)的小鼠分配给治疗。
功效研究XTS-1526包括6组小鼠，每组9只：
-在组1中，媒介物以5ml/kg、i.v.2qwk x 3给药；
-在组2中，GM102以20mg/kg、i.v.2qwk x 3给药；
-在组3中，多西他赛以20mg/kg在D0缓慢i.v.给药一次；
-在组4中，与在D0缓慢i.v.以20mg/kg给药一次的多西他赛组合，GM102以20mg/kg、i.v.2qwk x 1或2给药；
-在组5中，与以100mg/kg给药的吉西他滨组合，顺铂以5mg/kg给药，两者均i.p.qwk x 2或3；
-在组6中，与以5mg/kg给药的顺铂和以100mg/kg给药的吉西他滨组合(两者均i.p.qwk x 1或2)一起，GM102以20mg/kg、i.v.2qwk x 1或2给药。
未纳入的功效研究小鼠中，测试了2组，每组包括8只小鼠：
-在组7中，与以5mg/kg、i.p.qwk x 3给药的顺铂组合，GM102以20mg/kg、i.v.2qwkx 3给药；
-在组8中，与以100mg/kg、i.p.qwk x 3给药的吉西他滨组合，GM102以20mg/kg、i.v.2qwk x 3给药。
在实验期间，测量肿瘤，并每周称重小鼠3次。从每组3只小鼠中收集新鲜的肿瘤样品，在D28(对于第2次纳入和第3次纳入)或D31(对于第1次纳入)不对速冻组织和福尔马林固定的样品施加额外剂量。仅将速冻组织向前推进用于后续分析。取样后将福尔马林固定的样品丢弃。
3.研究目的
本报告中描述的实验旨在确定一种单独使用或与多西他赛或组合顺铂/吉西他滨组合使(Gamamab)的测试化合物(编码为GM102)在SC131患者来源的非小细胞肺异种移植物模型中的抗肿瘤功效。
测试项：GM102(在本文中也称为3C23K)
抗AMHR2产品GM102是针对抗苗勒激素受体(AMHR2)(又称为苗勒抑制物质受体II(MISRII))的人源化mAb。AMHR2在子宫内期间以内部雌性性器官前体(苗勒管)的水平存在，并且在成年期期间仅限于卵巢(粒层细胞)和睾丸(睾丸间质细胞)。AMHR2也在约65％的妇科癌症、诸如卵巢和子宫内膜中表达(Bakkum JN,Gynecol Oncol,2007；Sahli I,Biochem,2004；Anttonen M,Lab Invest,2011；Song JY,Int J.Oncol,2009)。
GM102抗体在使用AMHR2转染的人肿瘤细胞系的小鼠异种移植物模型中已显示出展现抗肿瘤功效。已经证明该功效依赖于通过使得能够在肿瘤水平上优化抗体触发的免疫效应细胞的参与。此外，已证明GM102功效与卡铂和紫杉醇(卵巢癌中使用的主要化学治疗剂)具有协同作用(Jacquet A.,Cancer Res,2012)。
人肿瘤异种移植物模型
在癌症中心治疗的患者的知情同意下，获得了各种组织学来源的人肿瘤样品，并将其在免疫缺陷小鼠中建立为可移植的异种移植物。植入的样品是来自治疗前或治疗后获得的原发肿瘤或转移灶的残留物质。这些患者来源的异种移植物(PDX)模型无需事先体外培养即可建立，并已研究了组织学、细胞遗传学、遗传和其他生物学标记及其对护理标准(SOC)疗法的响应。
SC131肿瘤模型源自具有突变的EGFR(R451F)和Kras(G12V)以及野生型TP53和PTEN的非小细胞肺癌的皮肤转移灶。
SC131对多西他赛和顺铂/吉西他滨组合均是低响应者，并且对其他测试剂是无响应者(数据获自瑞士裸小鼠)。
从植入日开始，SC131肿瘤模型大约需要17天以获得60mm3至200mm3的最大肿瘤，并需要35天至40天以达到2000mm3。
SC131显示了恶病质性质。
4.材料
4.1.动物和维持条件
将重达18克至25克的远交无胸腺(nu/nu)雌性小鼠(《HSD：无胸腺裸-Foxn1nu》)(ENVIGO，法国加纳)分配以在动物设施中适应，使其能随意获得食物和水，在操作前持续至少6天(表7)。
表7.：动物特征
Figure BDA0002320682990000511
4.2.动物福利声明
从法国农业和渔业部兽医服务局(The Direction des Services Vétérinaires,Ministère de l'Agriculture et de la Pêche)获得了在CERFE设施中使用动物的许可(协议No.B-91-228-107)。动物护理和圈养符合有关实验动物保护的法国监管法规。
所有实验均根据法国有关实验动物保护的法规以及根据法国农业和渔业部(French Ministry for Agriculture and Fisheries)颁发给Guillaume Lang的当前有效的脊椎动物实验许可证(No.A-75-1927，日期：2012年4月15日；有效期：5年)进行。
4.3.动物饲养
在适应期期间，将小鼠圈养在最多7只动物的组中，并且在实验期期间，将它们圈养在最多6只动物的组中。将小鼠圈养在带有消毒和无尘寝具芯的聚砜(PSU)塑料的单独通风笼(IVC)(mm 213W x 362D x 185H，美国艾伦镇)中。食物和水均已消毒。将动物在明暗周期(14小时的人造光昼夜周期)和控制的室温和湿度下圈养。
根据要求，监测环境条件，并将数据保留在中心动物圈养档案(Central AnimalHouse Archives)中。
4.4.膳食和水供应
随意提供饮用水。在整个研究过程中，每天为每只小鼠提供完全的颗粒饮食(150-SP-25Type，SAFE)。CERFE场所保留了动物食品和水的分析证书。
4.5.动物鉴定
在每次实验前，将所有动物称重，并通过独特的耳模编号系统方式标识。
每个笼都用纸质标签标识，指示：笼号、小鼠品系和数量、肿瘤代码、实验日期。
4.6.测试化合物和制剂
通过在无菌去离子水中以1/10稀释PBS 10X(Sigma PBS 10X，#P5493-1L，批次SLBJ2848)来制备PBS 1X媒介物。将其在4℃下储存以用于处理等分试样和GM102稀释持续30天。
GM102(3C23K)浓缩等分试样(批次LP01[R18H2-LP01])于2016年7月7日收到(4小瓶5ml，10.1mg/ml)，并储存在4℃下。在每个给药日，将原液在冷的PBS 1X中稀释以获得2mg/ml工作溶液。将该溶液保持在冰上或在4℃下并避光直至处理，然后在注射过程中将小瓶保持在室温下。处理后剩余的工作溶液被丢弃。
在每次给药前，10mg/ml的多西他赛(
Figure BDA0002320682990000521
赛诺菲(Sanofi)，批次6F255A-到期日：2018年03月)原液必须用0.9％NaCl以1/5稀释以获得2mg/ml的工作浓度。原液在4℃下复溶后避光稳定一个月。
0.5mg/ml的顺铂(顺铂-Teva，批号15A30MF-到期日：2017年01月)原液是随时可用的。将该溶液保持在室温下并避光，直到供应商到期日为止。
40mg/ml的吉西他滨(
Figure BDA0002320682990000522
礼来(Lilly)，批号C442937D，到期日：2018年02月)原液必须在每次给药前用0.9％NaCl以1/4稀释，以获得10mg/ml的工作浓度。原液在4℃下复溶避光后稳定一个月。
5.方法
5.1.肿瘤移植物模型诱导
将相同代的肿瘤皮下移植到3只至24只小鼠(供体小鼠，传代(n-1))上。当这些肿瘤达到700mm3至2000mm3时，通过颈脱位法处死供体小鼠，将肿瘤无菌切除并解剖。去除坏死区域后，将肿瘤切成测量为约20mm3的片段，并在植入前转移至培养基中。
将八十九(89)只小鼠用100mg/kg盐酸氯胺酮(批次5D92-到期日：03-2017，Virbac)和10mg/kg甲苯噻嗪(批次KP0AX9X，拜耳(Bayer))麻醉，然后用氯己定溶液对皮肤灭菌、在肩胛间区域的水平切开，并将20mm3肿瘤片段放置在皮下组织中。用夹子封闭皮肤。
来自相同实验的所有小鼠均在同一天植入。
5.2.处理期
在XTS-1526功效部分中，根据肿瘤体积分配了54只皮下生长的62.5mm3至220.5mm3的SC131肿瘤(P22.1.3/0)的小鼠，以得出每个治疗组的均匀的平均肿瘤体积和中位肿瘤体积。随机将治疗归至最多可容纳5只小鼠的盒子，并在肿瘤植入后18天开始治疗(60％纳入率(含交错纳入))。将研究交错纳入，每组首先纳入5只小鼠，然后在2天后每组纳入4只小鼠。治疗开始后31天后终止研究。
表8
Figure BDA0002320682990000531
对于另外的组7和组8，肿瘤大小更高且更不均匀。植入后32天将动物纳入。
表9
Figure BDA0002320682990000541
5.3.肿瘤测量和动物观察
在治疗期间，每周三次用卡尺通过测量肿瘤直径来评价肿瘤体积。使用式TV(mm3)＝[长度(mm)x宽度(mm)2]/2，其中，长度和宽度分别是肿瘤的最长直径和最短直径。
在治疗期间，每周对所有动物称重3次。将不同治疗的不良反应确定为：
-对于每次测量，通过将体重除以治疗开始的体重，计算相对体重(RBW)。
-个体体重减轻百分比(％BWL)＝100-(BWx/BW0 x 100)，其中BWx是治疗期间任何一天的BW，并且BW0是治疗第一天的BW。
每天观察小鼠的身体外观、行为和临床变化。
记录每只动物的所有疾病体征以及对治疗的任何行为变化或反应。
5.4.XTS-1526研究设计
总共使用了8组，如表9所概述。对于组1至组6，每组最初包括9只小鼠。对于组7和组8，每组最初包括8只小鼠。
在组1中，媒介物通过静脉内(i.v.)途径每周两次以5ml/kg给药，持续3周。
在组2中，GM102通过静脉内途径每周两次以20mg/kg给药，持续3周。
在组3中，多西他赛在D0通过静脉内途径以20mg/kg给药一次。
在组4中，与在D0通过静脉内途径以20mg/kg给药一次的多西他赛组合，GM102通过静脉内途径每周两次以20mg/kg给药，持续1周或2周。
在组5中，与以100mg/kg给药的吉西他滨组合，顺铂以5mg/kg给药，均通过腹膜内(i.p.)途径每周一次，持续2周或3周。
在组6中，与以5mg/kg给药的顺铂和以100mg/kg给药的吉西他滨组合一起(均通过腹膜内途径每周一次，持续1周或2周)，GM102通过静脉内途径每周两次以20mg/kg给药，持续1周或2周。
在组7中，与通过腹膜内途径每周一次持续3周以5mg/kg给药的顺铂一起，GM102通过静脉内途径每周两次以20mg/kg给药，持续3周。
在组8中，与通过腹膜内途径每周一次持续3周以100mg/kg给药的吉西他滨一起，GM102通过静脉内途径每周两次以20mg/kg给药，持续3周。
在每次注射时根据体重调整所有治疗剂量。
表10：XTS-1526功效研究中的剂量和剂量时间表
Figure BDA0002320682990000551
5.5.在体重减轻或不良事件的情况下实施的行为
如果在肿瘤测量和体重监测(一周三次)当天观察到任何副作用或与纳入当天相比体重减轻≥15％，则从发现副作用/问题的最短延迟内通知主办者。
然后，实施以下行为：
-有关动物停止治疗；如果体重减轻<10％，恢复治疗；
-对观察到体重减轻的整组中给予DietGel
Figure BDA0002320682990000561
并且每天称重相应的动物，直到体重减轻<10％；如果体重减轻<10％，则停止DietGel
Figure BDA0002320682990000562
添加。
5.6.伦理处死的标准
根据以下标准处死动物：
-与治疗第一天相比，连续48小时体重减轻(BWL)≥20％(3次测量)。
-行为或临床体征的一般改变。
-肿瘤体积≥2000mm3。
5.7.终点/研究终止
在适当的时间只处死符合伦理处死标准的小鼠。
所有实验组均在实验期结束时结束。
实验的终点是：
-4周的治疗期，
-没有随访期。
5.8.血液、肿瘤和组织取样
5.8.1.肿瘤取样
5.8.1.1.用于FFPE的肿瘤取样
-将1/2个肿瘤处理用于FFPE：将肿瘤在10％福尔马林中固定24小时，并转移在乙醇70％中，然后送至以下地址处的Histalim进行石蜡包埋(即17个[来自主要研究]FFPE肿瘤样品)：
记录每个肿瘤取样的确切取样时间和福尔马林固定持续时间。
在修改5编辑过程中，主办者决定丢弃FFPE样品。
5.8.1.2.肿瘤取样用于速冻
-将1/2个肿瘤处理用于速冻：将肿瘤切成3x3x3mm片，并在液氮中速冻，然后转移至-80℃用于储存(即17个[来自主要研究]+6个[来自耐受性2组研究]速冻的肿瘤样品)。
记录每个肿瘤取样的确切取样时间。
5.9.数据分析
5.9.1.数据处理
所有原始数据均以适当的结合形式记录在编号寄存器中，储存并由计算机系统处理。
第0天被认为是治疗的第一天。随后根据该定义编号实验的天数。
记录表示为平均值±平均值标准偏差(m±sem)。
平均相对体重曲线将通过绘制每个实验组相对于时间的平均RBW得出。Δ相对体重(治疗组的相对体重相较于对照组的相对体重)将用于统计分析。
平均体重减轻百分比(％BWL)＝100–(平均BWx/平均BW0 x 100)，其中BWx是治疗期间任何一天的平均BW，并且BW0是治疗第一天的平均BW。
肿瘤生长曲线将通过绘制每个实验组相对于时间的平均肿瘤体积(以mm3计)得出。Δ肿瘤体积(治疗组的相对肿瘤体积相较于对照组的相对肿瘤体积)用于统计分析。
将个体肿瘤生长延迟(TGD)计算为个体肿瘤达到初始肿瘤体积的3倍至5倍所需的时间(以天计)。计算中位生长延迟/组，并在表中报告。
将肿瘤生长延迟指数(TGDI)计算为治疗组的中位生长延迟除以对照组的中位生长延迟。
计算治疗组(T)的平均肿瘤体积与对照组(C)的平均肿瘤体积之间的百分比比率。
通过(曼-惠特尼)Mann-Whitney非参数比较检验对每次测量进行统计分析。将每个治疗组与对照组进行比较。
肿瘤稳定性(TS)定义为在至少3次连续测量中呈现恒定肿瘤大小的小鼠的数量。
部分肿瘤消退(PR)定义为在至少3次连续测量中呈现肿瘤大小低于初始肿瘤大小的小鼠的数量。
完全肿瘤消退(CR)定义为在至少3次连续测量中呈现0mm3至13.5mm3肿瘤大小的小鼠的数量。
无肿瘤存活者(TFS)定义为直至组日结束为止记录的完全肿瘤消退的数量。
6.结果
6.1.耐受性数据，临床观察
治疗期间的平均体重变化百分比示于图4中。
在这项研究中，小鼠在实验期间每周称重三次。
在组1中，以5ml/kg、i.v.2qwk x 3给药的媒介物耐受良好，但肿瘤的恶病质作用在第16天诱导最大平均体重减轻8.3％，并且在第28天诱导最大个体体重减轻17.6％。未观察到其他不良事件，但由于肿瘤的恶病质作用，在第18天、第21天、第25天和第26天，向来自第2次纳入的动物给予DietGel
Figure BDA0002320682990000581
在组2中，以20mg/kg、i.v.2qwk x 3给药的GM102耐受良好，其中在第14天的最大平均体重减轻为9.8％且在第16天的最大个体体重减轻为16.8％，与对照组1中观察到的肿瘤的恶病质作用相对应。未观察到其他不良事件，但由于肿瘤的恶病质作用，在第11天、第16天、第18天、从第21天到第27天，向来自第2次纳入的动物给予DietGel
Figure BDA0002320682990000582
在第27天发现27号小鼠死亡，没有任何临床体征。
在组3中，在D0以20mg/kg、i.v.给药一次的多西他赛，与对照组1相比，在第16天诱导了统计学上显著的(从第4天起，p<0.01)最大平均体重减轻17.0％，并且在第19天诱导了最大个体体重减轻23.8％。未观察到其他不良事件，但由于肿瘤的恶病质作用，从第7天到第27天(对于来自第1次纳入的动物，直到第31天)向整组给予DietGel
Figure BDA0002320682990000583
尽管给予了DietGel，在研究结束前必须处死4只小鼠。
在组4中，与在D0以20mg/kg i.v.给药一次的多西他赛组合的以20mg/kg、i.v.2qwk x 1或2给药的GM102，与对照组1相比，在第14天诱导了统计学上显著的(从第4天起，p<0.01)最大平均体重减轻18.1％，并且在第23天诱导了最大个体体重减轻24.1％。未观察到其他不良事件，但由于肿瘤的恶病质作用，在第4天和第5天、然后从第7天到第27天向整组给予DietGel
Figure BDA0002320682990000591
尽管给予了DietGel，在研究结束前必须处死5只小鼠。
在组5中，与以100mg/kg给药的吉西他滨组合的以5mg/kg给药的顺铂(均是i.p.qwk x 2或3)，与对照组1相比，诱导了统计学上显著的(从第2天起，p<0.01)最大平均体重减轻17.5％，并且在第11天诱导了最大个体体重减轻30.1％。由于化合物组合的合并毒性和肿瘤生长的恶病质作用，在第2天和第3天向来自第2次纳入的动物给予DietGel
Figure BDA0002320682990000592
然后在第4天和第7天向整组给予DietGel
Figure BDA0002320682990000593
然后从第9天到第27天向整组给予DietGel
Figure BDA0002320682990000594
(对于来自第1次纳入的动物，直到第31天)。尽管给予了DietGel，在研究结束前必须处死4只小鼠，并在第12天发现1只小鼠死亡。
在组6中，与以5mg/kg给药的顺铂和以100mg/kg给药的吉西他滨(均是i.p.qwk x1或2)组合一起的以20mg/kg、i.v.2qwk x 1或2给药的GM102，与对照组1相比，诱导了显著的(从第2天起，p<0.001)最大平均体重减轻21.1％，并且在第11天诱导了最大个体体重减轻27.5％。由于化合物组合的合并毒性和肿瘤生长的恶病质作用，在第2天和第3天向来自第2次纳入的动物给予DietGel
Figure BDA0002320682990000595
然后从第4天到第27天向整组给予DietGel
Figure BDA0002320682990000596
(对于来自第1次纳入的动物，直到第31天)。尽管给予了DietGel，在研究结束前必须处死7只小鼠。
在另外的组7中，与以5mg/kg、i.p.qwk x 3给药的顺铂一起的以20mg/kg、i.v.2qwk x 3给药并且与肿瘤生长的恶病质作用组合的GM102，在18天诱导了显著的最大平均体重减轻12.3％并且在第28天诱导了最大个体体重减轻28.9％。由于化合物组合的合并毒性和肿瘤生长的恶病质作用，在第9天和第11天、然后从第13天到第28天向动物给予DietGel
Figure BDA0002320682990000597
尽管给予了DietGel，在研究结束前必须处死2只小鼠并且发现1只小鼠死亡。而且，从第8天到研究结束，8只小鼠中有5只小鼠表现出脱屑或/和皮肤干燥。
在另外的组8中，与以100mg/kg、i.p.qwk x 3给药的吉西他滨一起的以20mg/kg、i.v.2qwk x 3给药并且与肿瘤生长的恶病质作用组合的GM102，在11天诱导了显著的最大平均体重减轻13.4％并且在第28天诱导了最大个体体重减轻26.4％。由于化合物组合的合并毒性和肿瘤生长的恶病质作用，第2天到第4天、第7天到第9天、第11天和第12天、然后第14天到第28天向动物给予DietGel
Figure BDA0002320682990000601
尽管给予了DietGel，在研究结束前必须处死3只小鼠并且发现1只小鼠死亡。而且，从第4天到研究结束，8只小鼠中有6只小鼠表现出脱屑或/和皮肤干燥。
6.2.抗肿瘤功效数据
肿瘤生长曲线(平均肿瘤体积随时间的变化)示于图4中。每个治疗组的T/C百分比值呈现于表11中，并示于图5和图6中。统计学分析示于表12中。
在这项研究中，在实验期间每周测量三次肿瘤。
在组2中，以20mg/kg、i.v.2qwk x 3给药的GM102在第16天(对照组结束)未显示任何抗肿瘤功效，其中TGDI＝1.33且最佳T/C＝74.68％。
在组3中，在D0以20mg/kg、i.v.给药一次的多西他赛在第16天(对照组结束)显示出强且统计学显著的(通过曼-惠特曼检验，与对照组1相比，在D4，p<0.01，然后从D7至D16，p<0.001)抗肿瘤功效，其中TGDI>2.71且最佳T/C＝11.00％。此外，在治疗期间观察到9只小鼠中有7只小鼠短暂肿瘤稳定和9只小鼠中有2只小鼠短暂部分肿瘤消退。
在组4中，与在D0以20mg/kg、i.v.给药一次的多西他赛组合的以20mg/kg、i.v.2qwk x 1或2给药的GM102在第16天(组4结束，n＝6只)显示出强且统计学显著的(通过曼-惠特曼检验，与对照组1相比，在D4，p<0.01，然后从D7至D14，p<0.001)抗肿瘤功效，其中TGDI>2.71且最佳T/C＝11.34％。此外，在治疗期间观察到9只小鼠中有6只小鼠短暂肿瘤稳定和9只小鼠中有3只小鼠短暂部分肿瘤消退。
在组5中，与以100mg/kg给药的吉西他滨组合的以5mg/kg给药的顺铂(均是i.p.qwk x 2或3)在第16天(组5结束，n＝6只)显示出统计学显著的(通过曼-惠特曼检验，与对照组1相比，在D4，p<0.01，然后从D7至D11，p<0.001)抗肿瘤功效，其中TGDI＝2.30且最佳T/C＝27.16％。此外，在治疗期期间观察到9只小鼠中有5只小鼠短暂肿瘤稳定。
在组6中，与以5mg/kg给药的顺铂和以100mg/kg给药的吉西他滨(均是i.p.qwk x1或2)组合一起的以20mg/kg、i.v.2qwk x 1或2给药的GM102在第11天(组6结束，n＝7只)显示出统计学显著的(通过曼-惠特曼检验，与对照组1相比，在D2，p<0.05，然后从D4至D11，p<0.001)抗肿瘤功效，其中TGDI＝1.98且最佳T/C＝33.71％。此外，在治疗期间观察到9只小鼠中有6只小鼠短暂肿瘤稳定。
在另外的组7和组8中，由于入组时平均肿瘤体积较高，因此无法与对照组1比较，但是在治疗期间观察到一些短暂肿瘤稳定，对于组合GM102/顺铂为8只小鼠中有5只小鼠，而对于组合GM102/吉西他滨为8只小鼠中有6只小鼠。
7.结论
结果和讨论
SC131肿瘤模型的恶病质作用高于预期，并在媒介物和GM102治疗组中导致相似的体重减轻。因此，可以认为单独使用的GM102耐受良好。
在另一方面，在4个其他组中观察到的毒性部分归因于护理标准多西他赛、顺铂和吉西他滨，并诱导每组中约一半的小鼠死亡。
单独使用的GM102抗体诱导25％的肿瘤生长抑制，该作用尚未达到统计学显著，而护理标准组显示出对肿瘤生长的强烈抑制。该结果令人惊讶，因为最初是基于其膜AMHRII表达(通过IHC评分为1+)选择该模型的。然而，与该研究同时评估SC131 PDX肿瘤上的膜AMHRII表达时，注意到经过几次传代后，膜AMHRII表达下降(评分为0.2+；40％的阳性细胞评分为0.5％)。该数据证实AMHRII表达在某些体外模型和体内模型中是不稳定的，并且膜表达对于AMHRII抗肿瘤功效至关重要。
出于同样的原因，通过将GM102与这些护理标准组合，未观察到抗肿瘤活性增强。
实施例5：抗AMHRII抗体针对表达AMHRII的肺癌的体内功效
A.材料和方法
A.1.通过组织免疫化学的AMHRII膜表达
因此，开发了一种使用缀合至Alexa
Figure BDA0002320682990000621
488的抗AMHRII 3C23K抗体的间接免疫荧光的方法。然后用缀合至Alexa
Figure BDA0002320682990000622
647的兔抗AF488抗体和山羊抗兔抗体分两步进行信号放大。
冷冻组织切片是用保持在-20℃下的低温恒温器Leica CMD1950制成的。将冷冻的组织用OCT化合物固定在金属圆盘上，并且一旦固化后将它们固定在圆盘支架上。实现了7μm的切片，并将其放在Superfrost Plus载玻片(Menzel
Figure BDA0002320682990000623
)上，并立即在-20℃下储存。
将冷冻切片载玻片用PBS 1X再水化，然后通过用300μl冷丙酮(VWR Prolabo)覆盖它们在-20℃下固定10min，并用石蜡膜回收，以确保溶液完全回收所有组织。用PBS冲洗后，将载玻片在室温的湿盒中用300μl封闭缓冲液(PBS1X-BSA 2％-山羊血清10％-TritonX100 0.1％)处理1小时，以封闭抗体与组织组分之间的非特异性相互作用。将在封闭缓冲液中稀释为10μg/ml的3C23K-AF488或同种型对照R565-AF488在室温的湿盒中施加30min。用PBS1X-Triton X100 0.1％洗涤3次(3x10min)后，添加在封闭缓冲液中以1/500稀释的抗AF488抗体(Invitrogen)(300μl)在室温下孵育30min。用PBS1X-Triton X100 0.1％洗涤3次(3x10min)后，添加在封闭缓冲液中以1/500稀释的缀合的抗兔抗体AF647(Invitrogen)(300μl)在室温下孵育30min。实现用PBS1X-Triton X100 0.1％洗涤(3x10min)，然后施加0.5μg/ml的DAPI(西格玛奥德里奇)持续10min。用PBS和H2O冲洗后，将载玻片切片用一滴(50μl)DAKO荧光封固介质固定在盖玻片(24x50mm，Knittel Glass)下，避免气泡空气，并在黑暗中于4℃下储存直至使其成像。
使用配备有由Metavue软件(美谷分子仪器(Molecular Devices))控制的CoolSnap EZ CCD相机的荧光显微镜Leica DM5000B进行图像采集。使用ImageJ免费软件(http://imagej.nih.gov/ij/)进行图像后处理。
A.2.人肺肿瘤异种移植物
从裸小鼠的连续传代的异种移植物中获得肿瘤片段。从供体小鼠中移除后，将肿瘤切成片段(3mm至4mm边缘长度)，并置于含有10％青霉素/链霉素的PBS中。将接受者动物通过吸入异氟烷麻醉，并在侧腹中皮下接受单侧或双侧肿瘤移植物。
将LXFE2226鳞状非小细胞肺癌模型肿瘤异种移植物皮下植入，每只小鼠(来自查尔斯河(Charles River)的NMRI-Foxn1nu)一个肿瘤。实验由两组小鼠组成，在第15天将其中的三只小鼠安乐死，用于通过流式细胞术检测膜AMHRII表达。第一组是媒介物对照组，并且第二组接受研究性抗体GM102，所述抗体以20mg/kg的剂量水平每周两次腹膜内(i.p.)施用。
通过比较达到最佳功效的那些天的组中位相对肿瘤体积(RTV)，将抗肿瘤功效评价为最小T/C值。在两周的无给药的观察期后，实验在第43天终止。
研究设计：
Figure BDA0002320682990000631
B.结果
B.GM 102抗AMHRII抗体针对肺肿瘤的体内活性
肿瘤生长曲线(平均肿瘤体积随时间的变化)示于图7中。在实验期间每周测量三次肿瘤。
图7和图8描绘的结果显示，抗AMHRII抗体GM102在所有治疗的异种移植动物中表现出强的抗肿瘤活性。
在第28天的肿瘤生长测量表明，抗AMHRII抗体GM102导致肿瘤体积急剧减小(p<0.001)，这意味着抗AMHRII抗体(i)阻止了肿瘤生长，并且(ii)有效地引起了最初包含在肿瘤异种移植物中的肿瘤细胞的裂解。
因此，实施例5的结果表明，抗AMHRII抗体针对实际上在其膜处表达AMHRII蛋白的肺癌细胞发挥了高度有效的抗肿瘤作用，而与编码AMHRII的基因的表达水平无关。
Figure BDA0002320682990000651
序列表
<110> 加马玛布斯制药公司
居里研究所
<120> 用于预防或治疗肺癌的AMHRII结合化合物
<130> PR77729/KLP/CJ
<140> EP17305446.1
<141> 2017-04-14
<150> EP17305446
<151> 2017-04-14
<160> 74
<170> BiSSAP 1.3.2
<210> 1
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> "无先导序列的3C_23 VL" <223> "无先导序列的3C_23 VL" <223> "无先导序列的3C_23 VL" <223> "无先导序列的3C_23 VL"
<223> "无先导序列的3C_23 VL" <223> "无先导序列的3C_23 VL"
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<223> "无先导序列的3C_23 VL"
<220>
<223> 无先导序列的3C_23 VL" <223> "无先导序列的3C_23 VL" <223>
"无先导序列的3C_23 VL" <223> "无先导序列的3C_23 VL
<220>
<223> 无先导序列的3C_23 VL" <223> "无先导序列的3C_23 VL
<220>
<223> 无先导序列的3C_23 VL
<220>
<223> 无先导序列的3C_23 VL
<220>
<221> CDS
<222> 1..318
<400> 1
gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48
gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96
gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144
cca acc tcc tcc ctg gaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192
ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240
gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288
ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag 318
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> "来自SEQ ID NO 1的[CDS]:1..318"
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成
构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 1的[CDS]:1..318
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> "无先导序列的3C_23 VH" <223> "无先导序列的3C_23 VH" <223> "无先导序列的3C_23 VH" <223> "无先导序列的3C_23 VH"
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<220>
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<220>
<223> 无先导序列的3C_23 VH
<220>
<223> 无先导序列的3C_23 VH
<220>
<221> CDS
<222> 1..345
<400> 3
cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48
tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96
cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144
ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192
cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240
atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288
aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336
gtc tcg agc 345
<210> 4
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> "来自SEQ ID NO 3的[CDS]:1..345"
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成
构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 3的[CDS]:1..345
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> "无先导序列的3C_23K VL" <223> "无先导序列的3C_23K VL" <223> "无先导序列的3C_23K VL" <223> "无先导序列的3C_23K VL"
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<220>
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<220>
<223> 无先导序列的3C_23K VL" <223> "无先导序列的3C_23K VL
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K VL
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K VL
<220>
<221> CDS
<222> 1..318
<400> 5
gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48
gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96
gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144
cca acc tcc tcc ctg aaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192
ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240
gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288
ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag 318
<210> 6
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> "来自SEQ ID NO 5的[CDS]:1..318"
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成
构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 5的[CDS]:1..318
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> "无先导序列的3C_23K VH"
<223> "无先导序列的3C_23K VH"
<220>
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"无先导序列的3C_23K VH" <223> "无先导序列的3C_23K VH
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K VH" <223> "无先导序列的3C_23K VH
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K VH
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K VH
<220>
<221> CDS
<222> 1..345
<400> 7
cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48
tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96
cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144
ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192
cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240
atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288
aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336
gtc tcg agc 345
<210> 8
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> "来自SEQ ID NO 7的[CDS]:1..345"
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成
构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 7的[CDS]:1..345
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> "无先导序列的3C_23轻链" <223> "无先导序列的3C_23轻链" <223> "无先导序列的3C_23轻链" <223> "无先导序列的3C_23轻链"
<223> "无先导序列的3C_23轻链" <223> "无先导序列的3C_23轻链"
<223> "无先导序列的3C_23轻链"
<223> "无先导序列的3C_23轻链"
<220>
<223> 无先导序列的3C_23轻链" <223> "无先导序列的
3C_23轻链" <223> "无先导序列的3C_23轻链" <223>
"无先导序列的3C_23轻链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23轻链" <223> "无先导序列的
3C_23轻链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23轻链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23轻链
<220>
<221> CDS
<222> 1..639
<400> 9
gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48
gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96
gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144
cca acc tcc tcc ctg gaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192
ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240
gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288
ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag cgg acc gtc gcc gca cca 336
agt gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act 384
gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa 432
gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag 480
agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc 528
acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc 576
tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc 624
aac agg gga gag tgt 639
<210> 10
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> "来自SEQ ID NO 9的[CDS]:1..639"
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成
构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 9的[CDS]:1..639
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> "无先导序列的3C_23重链" <223> "无先导序列的3C_23重链" <223> "无先导序列的3C_23重链" <223> "无先导序列的3C_23重链"
<223> "无先导序列的3C_23重链" <223> "无先导序列的3C_23重链"
<223> "无先导序列的3C_23重链"
<223> "无先导序列的3C_23重链"
<220>
<223> 无先导序列的3C_23重链" <223> "无先导序列的
3C_23重链" <223> "无先导序列的3C_23重链" <223>
"无先导序列的3C_23重链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23重链" <223> "无先导序列的
3C_23重链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23重链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23重链
<220>
<221> CDS
<222> 1..1335
<400> 11
cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48
tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96
cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144
ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192
cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240
atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288
aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336
gtc tcg agc gcc agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc 384
tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc 432
aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc 480
ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga 528
ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc 576
acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag 624
gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 672
cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc 720
ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 768
gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag 816
ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 864
ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc 912
acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 960
gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1008
gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1056
cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1104
ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 1152
ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1200
tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 1248
cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 1296
cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1335
<210> 12
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> "来自SEQ ID NO 11的[CDS]:1..1335"
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成
构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 11的[CDS]:1..1335
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 13
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> "无先导序列的3C_23K轻链" <223> "无先导序列的3C_23K轻链" <223> "无先导序列的3C_23K轻链" <223> "无先导序列的3C_23K轻链"
<223> "无先导序列的3C_23K轻链" <223> "无先导序列的3C_23K轻链"
<223> "无先导序列的3C_23K轻链"
<223> "无先导序列的3C_23K轻链"
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K轻链" <223> "无先导序列的
3C_23K轻链" <223> "无先导序列的3C_23K轻链" <223>
"无先导序列的3C_23K轻链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K轻链" <223> "无先导序列的
3C_23K轻链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K轻链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K轻链
<220>
<221> CDS
<222> 1..639
<400> 13
gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48
gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96
gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144
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agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc 528
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<210> 14
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> "来自SEQ ID NO 13的[CDS]:1..639"
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成
构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 13的[CDS]:1..639
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 15
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> "无先导序列的3C_23K重链" <223> "无先导序列的3C_23K重链" <223> "无先导序列的3C_23K重链" <223> "无先导序列的3C_23K重链"
<223> "无先导序列的3C_23K重链" <223> "无先导序列的3C_23K重链"
<223> "无先导序列的3C_23K重链"
<223> "无先导序列的3C_23K重链"
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K重链" <223> "无先导序列的3C_23K重链
" <223> "无先导序列的3C_23K重链" <223>
"无先导序列的3C_23K重链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K重链" <223> "无先导序列的3C_23K重链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K重链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K重链
<220>
<221> CDS
<222> 1..1335
<400> 15
cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48
tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96
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tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc 432
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ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc 576
acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag 624
gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 672
cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc 720
ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 768
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ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc 912
acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 960
gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1008
gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1056
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ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1200
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cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1335
<210> 16
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> "来自SEQ ID NO 15的[CDS]:1..1335"
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体 <223> 合成
构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 15的[CDS]:1..1335
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<223> "信号肽" <223> 信号肽 <223> 信号肽 <223> 信号肽
<223> 信号肽" <223> 信号肽
<223> 信号肽
<223> 信号肽
<220>
<223> 信号肽" <223> 信号肽 <223> 信号肽 <223>
信号肽
<220>
<223> 信号肽" <223> 信号肽
<220>
<223> 信号肽
<220>
<223> 信号肽
<400> 17
Met Leu Gly Ser Leu Gly Leu Trp Ala Leu Leu Pro Thr Ala Val Glu
1 5 10 15
Ala
<210> 18
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<212> PRT
<213> 智人
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<220>
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<400> 18
Pro Pro Asn Arg Arg Thr Cys Val Phe Phe Glu Ala Pro Gly Val Arg
1 5 10 15
Gly Ser Thr Lys Thr Leu Gly Glu Leu Leu Asp Thr Gly Thr Glu Leu
20 25 30
Pro Arg Ala Ile Arg Cys Leu Tyr Ser Arg Cys Cys Phe Gly Ile Trp
35 40 45
Asn Leu Thr Gln Asp Arg Ala Gln Val Glu Met Gln Gly Cys Arg Asp
50 55 60
Ser Asp Glu Pro Gly Cys Glu Ser Leu His Cys Asp Pro Ser Pro Arg
65 70 75 80
Ala His Pro Ser Pro Gly Ser Thr Leu Phe Thr Cys Ser Cys Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Cys Asn Ala Asn Tyr Ser His Leu Pro Pro Pro Gly Ser Pro
100 105 110
Gly Thr Pro Gly Ser Gln Gly Pro Gln Ala Ala Pro Gly Glu Ser Ile
115 120 125
Trp Met Ala Leu Val Leu Leu Gly Leu Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Gly Ser Ile Ile Leu Ala Leu Leu Gln Arg Lys Asn Tyr Arg Val
145 150 155 160
Arg Gly Glu Pro Val Pro Glu Pro Arg Pro Asp Ser Gly Arg Asp Trp
165 170 175
Ser Val Glu Leu Gln Glu Leu Pro Glu Leu Cys Phe Ser Gln Val Ile
180 185 190
Arg Glu Gly Gly His Ala Val Val Trp Ala Gly Gln Leu Gln Gly Lys
195 200 205
Leu Val Ala Ile Lys Ala Phe Pro Pro Arg Ser Val Ala Gln Phe Gln
210 215 220
Ala Glu Arg Ala Leu Tyr Glu Leu Pro Gly Leu Gln His Asp His Ile
225 230 235 240
Val Arg Phe Ile Thr Ala Ser Arg Gly Gly Pro Gly Arg Leu Leu Ser
245 250 255
Gly Pro Leu Leu Val Leu Glu Leu His Pro Lys Gly Ser Leu Cys His
260 265 270
Tyr Leu Thr Gln Tyr Thr Ser Asp Trp Gly Ser Ser Leu Arg Met Ala
275 280 285
Leu Ser Leu Ala Gln Gly Leu Ala Phe Leu His Glu Glu Arg Trp Gln
290 295 300
Asn Gly Gln Tyr Lys Pro Gly Ile Ala His Arg Asp Leu Ser Ser Gln
305 310 315 320
Asn Val Leu Ile Arg Glu Asp Gly Ser Cys Ala Ile Gly Asp Leu Gly
325 330 335
Leu Ala Leu Val Leu Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ala Trp Thr Pro
340 345 350
Thr Gln Pro Gln Gly Pro Ala Ala Ile Met Glu Ala Gly Thr Gln Arg
355 360 365
Tyr Met Ala Pro Glu Leu Leu Asp Lys Thr Leu Asp Leu Gln Asp Trp
370 375 380
Gly Met Ala Leu Arg Arg Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Ala Leu Leu Leu
385 390 395 400
Trp Glu Ile Leu Ser Arg Cys Pro Asp Leu Arg Pro Asp Ser Ser Pro
405 410 415
Pro Pro Phe Gln Leu Ala Tyr Glu Ala Glu Leu Gly Asn Thr Pro Thr
420 425 430
Ser Asp Glu Leu Trp Ala Leu Ala Val Gln Glu Arg Arg Arg Pro Tyr
435 440 445
Ile Pro Ser Thr Trp Arg Cys Phe Ala Thr Asp Pro Asp Gly Leu Arg
450 455 460
Glu Leu Leu Glu Asp Cys Trp Asp Ala Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr
465 470 475 480
Ala Glu Cys Val Gln Gln Arg Leu Ala Ala Leu Ala His Pro Gln Glu
485 490 495
Ser His Pro Phe Pro Glu Ser Cys Pro Arg Gly Cys Pro Pro Leu Cys
500 505 510
Pro Glu Asp Cys Thr Ser Ile Pro Ala Pro Thr Ile Leu Pro Cys Arg
515 520 525
Pro Gln Arg Ser Ala Cys His Phe Ser Val Gln Gln Gly Pro Cys Ser
530 535 540
Arg Asn Pro Gln Pro Ala Cys Thr Leu Ser Pro Val
545 550 555
<210> 19
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 3C23K/3C23
<220>
<223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23
<220>
<223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23
<220>
<223> 3C23K/3C23
<220>
<223> 3C23K/3C23
<400> 19
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
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<220>
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<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 5B42
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<223> 5B42 <223> 5B42 <223> 5B42 <223> 5B42
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<220>
<223> 5B42
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Ala Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
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<220>
<223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59
<220>
<223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59
<220>
<223> K4D-24/6C59
<220>
<223> K4D-24/6C59
<400> 22
Arg Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> K4D-20 <223> K4D-20 <223> K4D-20 <223> K4D-20
<223> K4D-20 <223> K4D-20
<223> K4D-20
<223> K4D-20
<220>
<223> K4D-20 <223> K4D-20 <223> K4D-20 <223> K4D-20
<220>
<223> K4D-20 <223> K4D-20
<220>
<223> K4D-20
<220>
<223> K4D-20
<400> 23
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> K4A-12 <223> K4A-12 <223> K4A-12 <223> K4A-12
<223> K4A-12 <223> K4A-12
<223> K4A-12
<223> K4A-12
<220>
<223> K4A-12 <223> K4A-12 <223> K4A-12 <223> K4A-12
<220>
<223> K4A-12 <223> K4A-12
<220>
<223> K4A-12
<220>
<223> K4A-12
<400> 24
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> K5D05 <223> K5D05 <223> K5D05 <223> K5D05
<223> K5D05 <223> K5D05
<223> K5D05
<223> K5D05
<220>
<223> K5D05 <223> K5D05 <223> K5D05 <223> K5D05
<220>
<223> K5D05 <223> K5D05
<220>
<223> K5D05
<220>
<223> K5D05
<400> 25
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> K5D-14 <223> K5D-14 <223> K5D-14 <223> K5D-14
<223> K5D-14 <223> K5D-14
<223> K5D-14
<223> K5D-14
<220>
<223> K5D-14 <223> K5D-14 <223> K5D-14 <223> K5D-14
<220>
<223> K5D-14 <223> K5D-14
<220>
<223> K5D-14
<220>
<223> K5D-14
<400> 26
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> K4D-123 <223> K4D-123 <223> K4D-123 <223> K4D-123
<223> K4D-123 <223> K4D-123
<223> K4D-123
<223> K4D-123
<220>
<223> K4D-123 <223> K4D-123 <223> K4D-123 <223> K4D-123
<220>
<223> K4D-123 <223> K4D-123
<220>
<223> K4D-123
<220>
<223> K4D-123
<400> 27
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07
<223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07
<223> K4D-127/6C07
<223> K4D-127/6C07
<220>
<223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07 <223>
K4D-127/6C07
<220>
<223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07
<220>
<223> K4D-127/6C07
<220>
<223> K4D-127/6C07
<400> 28
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Thr Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 5C14 <223> 5C14 <223> 5C14 <223> 5C14
<223> 5C14 <223> 5C14
<223> 5C14
<223> 5C14
<220>
<223> 5C14 <223> 5C14 <223> 5C14 <223> 5C14
<220>
<223> 5C14 <223> 5C14
<220>
<223> 5C14
<220>
<223> 5C14
<400> 29
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 5C26 <223> 5C26 <223> 5C26 <223> 5C26
<223> 5C26 <223> 5C26
<223> 5C26
<223> 5C26
<220>
<223> 5C26 <223> 5C26 <223> 5C26 <223> 5C26
<220>
<223> 5C26 <223> 5C26
<220>
<223> 5C26
<220>
<223> 5C26
<400> 30
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Met Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 5C27 <223> 5C27 <223> 5C27 <223> 5C27
<223> 5C27 <223> 5C27
<223> 5C27
<223> 5C27
<220>
<223> 5C27 <223> 5C27 <223> 5C27 <223> 5C27
<220>
<223> 5C27 <223> 5C27
<220>
<223> 5C27
<220>
<223> 5C27
<400> 31
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 5C60 <223> 5C60 <223> 5C60 <223> 5C60
<223> 5C60 <223> 5C60
<223> 5C60
<223> 5C60
<220>
<223> 5C60 <223> 5C60 <223> 5C60 <223> 5C60
<220>
<223> 5C60 <223> 5C60
<220>
<223> 5C60
<220>
<223> 5C60
<400> 32
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Lys Val Arg Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 6C13 <223> 6C13 <223> 6C13 <223> 6C13
<223> 6C13 <223> 6C13
<223> 6C13
<223> 6C13
<220>
<223> 6C13 <223> 6C13 <223> 6C13 <223> 6C13
<220>
<223> 6C13 <223> 6C13
<220>
<223> 6C13
<220>
<223> 6C13
<400> 33
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 6C18 <223> 6C18 <223> 6C18 <223> 6C18
<223> 6C18 <223> 6C18
<223> 6C18
<223> 6C18
<220>
<223> 6C18 <223> 6C18 <223> 6C18 <223> 6C18
<220>
<223> 6C18 <223> 6C18
<220>
<223> 6C18
<220>
<223> 6C18
<400> 34
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 6C54 <223> 6C54 <223> 6C54 <223> 6C54
<223> 6C54 <223> 6C54
<223> 6C54
<223> 6C54
<220>
<223> 6C54 <223> 6C54 <223> 6C54 <223> 6C54
<220>
<223> 6C54 <223> 6C54
<220>
<223> 6C54
<220>
<223> 6C54
<400> 35
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 3C23K <223> 3C23K <223> 3C23K <223> 3C23K
<223> 3C23K <223> 3C23K
<223> 3C23K
<223> 3C23K
<220>
<223> 3C23K <223> 3C23K <223> 3C23K <223> 3C23K
<220>
<223> 3C23K <223> 3C23K
<220>
<223> 3C23K
<220>
<223> 3C23K
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-K55E <223> L-K55E <223> L-K55E <223> L-K55E
<223> L-K55E <223> L-K55E
<223> L-K55E
<223> L-K55E
<220>
<223> L-K55E <223> L-K55E <223> L-K55E <223> L-K55E
<220>
<223> L-K55E <223> L-K55E
<220>
<223> L-K55E
<220>
<223> L-K55E
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S
<223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S
<223> L-T48I, L-P50S
<223> L-T48I, L-P50S
<220>
<223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S <223>
L-T48I, L-P50S
<220>
<223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S
<220>
<223> L-T48I, L-P50S
<220>
<223> L-T48I, L-P50S
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E <223> LT48I,L-K55E
<223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E
<223> LT48I, L-K55E
<223> LT48I, L-K55E
<220>
<223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E <223>
LT48I, L-K55E
<220>
<223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E
<220>
<223> LT48I, L-K55E
<220>
<223> LT48I, L-K55E
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P <223> LS27P,L-S28P
<223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P
<223> LS27P, L-S28P
<223> LS27P, L-S28P
<220>
<223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P <223>
LS27P, L-S28P
<220>
<223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P
<220>
<223> LS27P, L-S28P
<220>
<223> LS27P, L-S28P
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Pro Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L,L-T20A
<223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A
<223> L-M4L, L-T20A
<223> L-M4L, L-T20A
<220>
<223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A <223>
L-M4L, L-T20A
<220>
<223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A
<220>
<223> L-M4L, L-T20A
<220>
<223> L-M4L, L-T20A
<400> 41
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-S27P <223> L-S27P <223> L-S27P <223> L-S27P
<223> L-S27P <223> L-S27P
<223> L-S27P
<223> L-S27P
<220>
<223> L-S27P <223> L-S27P <223> L-S27P <223> L-S27P
<220>
<223> L-S27P <223> L-S27P
<220>
<223> L-S27P
<220>
<223> L-S27P
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P,L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<220>
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L,
L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<220>
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<220>
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<220>
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<400> 43
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Trp Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 44
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-M4L <223> L-M4L <223> L-M4L <223> L-M4L
<223> L-M4L <223> L-M4L
<223> L-M4L
<223> L-M4L
<220>
<223> L-M4L <223> L-M4L <223> L-M4L <223> L-M4L
<220>
<223> L-M4L <223> L-M4L
<220>
<223> L-M4L
<220>
<223> L-M4L
<400> 44
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-I33T <223> L-I33T <223> L-I33T <223> L-I33T
<223> L-I33T <223> L-I33T
<223> L-I33T
<223> L-I33T
<220>
<223> L-I33T <223> L-I33T <223> L-I33T <223> L-I33T
<220>
<223> L-I33T <223> L-I33T
<220>
<223> L-I33T
<220>
<223> L-I33T
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Thr
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L,L-K39E
<223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E
<223> L-M4L, L-K39E
<223> L-M4L, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E <223>
L-M4L, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-K39E
<400> 46
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-T22P <223> L-T22P <223> L-T22P <223> L-T22P
<223> L-T22P <223> L-T22P
<223> L-T22P
<223> L-T22P
<220>
<223> L-T22P <223> L-T22P <223> L-T22P <223> L-T22P
<220>
<223> L-T22P <223> L-T22P
<220>
<223> L-T22P
<220>
<223> L-T22P
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> L-Y32D
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<220>
<223> L-Y32D <223> L-Y32D <223> L-Y32D <223> L-Y32D
<220>
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<220>
<223> L-Y32D
<220>
<223> L-Y32D
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Asp Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
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<220>
<223> L-Q37H <223> L-Q37H <223> L-Q37H <223> L-Q37H
<220>
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<220>
<223> L-Q37H
<220>
<223> L-Q37H
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
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100 105
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<211> 106
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<213> 人工序列
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<220>
<223> L-G97S <223> L-G97S <223> L-G97S <223> L-G97S
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<223> L-G97S <223> L-G97S
<220>
<223> L-G97S
<220>
<223> L-G97S
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
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Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
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<211> 106
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<213> 人工序列
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<223> L-S12P
<220>
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<220>
<223> L-S12P
<220>
<223> L-S12P
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Pro Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
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<220>
<223> L-19A <223> L-19A <223> L-19A <223> L-19A
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<223> L-19A <223> L-19A
<220>
<223> L-19A
<220>
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<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
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<211> 106
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<213> 人工序列
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<223> L-T72A
<220>
<223> L-T72A <223> L-T72A <223> L-T72A <223> L-T72A
<220>
<223> L-T72A <223> L-T72A
<220>
<223> L-T72A
<220>
<223> L-T72A
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ala Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 106
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<213> 人工序列
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<223> L-R31W <223> L-R31W
<220>
<223> L-R31W
<220>
<223> L-R31W
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Trp Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
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<223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K
<223> L-M4L, L-M39K
<223> L-M4L, L-M39K
<220>
<223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K <223>
L-M4L, L-M39K
<220>
<223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K
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<223> L-M4L, L-M39K
<220>
<223> L-M4L, L-M39K
<400> 55
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Met Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 56
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> L-I2N
<220>
<223> L-I2N <223> L-I2N <223> L-I2N <223> L-I2N
<220>
<223> L-I2N <223> L-I2N
<220>
<223> L-I2N
<220>
<223> L-I2N
<400> 56
Asp Asn Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
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<211> 106
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<213> 人工序列
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L-G63C, L-W91C
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<220>
<223> L-G63C, L-W91C
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Cys Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
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<220>
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<223> L-R31G <223> L-R31G
<220>
<223> L-R31G
<220>
<223> L-R31G
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> L-I75F <223> L-I75F
<223> L-I75F
<223> L-I75F
<220>
<223> L-I75F <223> L-I75F <223> L-I75F <223> L-I75F
<220>
<223> L-I75F <223> L-I75F
<220>
<223> L-I75F
<220>
<223> L-I75F
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Phe Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-I2T <223> L-I2T <223> L-I2T <223> L-I2T
<223> L-I2T <223> L-I2T
<223> L-I2T
<223> L-I2T
<220>
<223> L-I2T <223> L-I2T <223> L-I2T <223> L-I2T
<220>
<223> L-I2T <223> L-I2T
<220>
<223> L-I2T
<220>
<223> L-I2T
<400> 60
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 61
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T,L-K42R
<223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R
<223> L-I2T, L-K42R
<223> L-I2T, L-K42R
<220>
<223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R <223>
L-I2T, L-K42R
<220>
<223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R
<220>
<223> L-I2T, L-K42R
<220>
<223> L-I2T, L-K42R
<400> 61
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 62
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-Y49H <223> L-Y49H <223> L-Y49H <223> L-Y49H
<223> L-Y49H <223> L-Y49H
<223> L-Y49H
<223> L-Y49H
<220>
<223> L-Y49H <223> L-Y49H <223> L-Y49H <223> L-Y49H
<220>
<223> L-Y49H <223> L-Y49H
<220>
<223> L-Y49H
<220>
<223> L-Y49H
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr His
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 63
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L,
L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
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<220>
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
<400> 63
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 64
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> L-T69P <223> L-T69P <223> L-T69P <223> L-T69P
<223> L-T69P <223> L-T69P
<223> L-T69P
<223> L-T69P
<220>
<223> L-T69P <223> L-T69P <223> L-T69P <223> L-T69P
<220>
<223> L-T69P <223> L-T69P
<220>
<223> L-T69P
<220>
<223> L-T69P
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Pro Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> "抗AMHRII抗体的CDRL-1"
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-1
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-1
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-1
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> 位置4的Xaa是S或P
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> 位置5的Xaa是S或P
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> 位置7的Xaa是R或W或G
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> 位置8的Xaa是T或D
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> 位置9的Xaa是I或T
<400> 65
Arg Ala Ser Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Ala
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> "抗AMHRII抗体的CDRL-2 "
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-2
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-2
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-2
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> 位置6的Xaa是K或E
<400> 66
Pro Thr Ser Ser Leu Xaa Ser
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> "抗AMHRII抗体的CDRL-3"
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-3
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-3
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-3
<400> 67
Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 68
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> "抗AMHRII抗体的CDRH-1"
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-1
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-1
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-1
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> 位置6的Xaa是S或T
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> 位置9的Xaa是S或G
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> 位置10的Xaa是Y或N
<400> 68
Lys Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Xaa His Ile His
1 5 10
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> "抗AMHRII抗体的CDRH-2"
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-2
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-2
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-2
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> 位置5的Xaa是G或E
<400> 69
Trp Ile Tyr Pro Xaa Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> "抗AMHRII抗体的CDRH-3"
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-3
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-3
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-3
<400> 70
Gly Asp Arg Phe Ala Tyr
1 5
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> "AMHR2的正向引物"
<223> "AMHR2的正向引物"
<220>
<223> AMHR2的正向引物
<220>
<223> AMHR2的正向引物
<400> 71
tctggatggc actggtgctg 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> "AMHR2的反向引物"
<223> "AMHR2的反向引物"
<220>
<223> AMHR2的反向引物
<220>
<223> AMHR2的反向引物
<400> 72
agcagggcca agatgatgct 20
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> "TBP的正向引物"
<223> "TBP的正向引物"
<220>
<223> TBP的正向引物
<220>
<223> TBP的正向引物
<400> 73
tgcacaggag ccaagagtga a 21
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> "TBP的反向引物"
<223> "TBP的反向引物"
<220>
<223> TBP的反向引物
<220>
<223> TBP的反向引物
<400> 74
cacatcacag ctccccacca 20

Claims (10)

1.人AMHRII结合剂在用于预防或治疗患有选自由以下组成的组的肺癌的患者的肺癌的方法中的用途：表皮样NSCLC、腺癌NSCLC、大细胞NSCLC、鳞状细胞癌NSCLC、多形性细胞癌NSCLC和神经内分泌NSCLC。
2.根据权利要求1所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂选自由以下组成的组：单克隆抗AMHRII抗体及其AMHRII结合片段。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂是选自由以下抗体组成的组的单克隆抗体：
a)包含SEQ ID NO:2的轻链和包含SEQ ID NO:4的重链(无先导序列的3C23VL序列和3C23VH序列)；
b)包含SEQ ID NO:6的轻链和包含SEQ ID NO:8的重链(无先导序列的3C23K VL序列和3C23K VH序列)；
c)包含SEQ ID NO:10的轻链和包含SEQ ID NO:12的重链(无先导序列的3C23轻链和3C23重链)；
d)包含SEQ ID NO:14的轻链和包含SEQ ID NO:16的重链(无先导序列的3C23K轻链和3C23K重链)。
4.根据权利要求1所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂是包括包含以下序列的CDR的单克隆抗体：
-CDRL-1：RASX1X2VX3X4X5A，其中，Xi和X2独立地是S或P，X3是R或W或G，X4是T或D，以及X5是I或T；
-CDRL-2是PTSSLX6S，其中，X6是K或E；和
-CDRL-3是LQWSSYPWT；
-CDRH-1是KASGYX7FTX8X9HIH，其中，X7是S或T，X8是S或G，以及X9是Y或N；
-CDRH-2是WIYPX10DDSTKYSQKFQG，其中，Xw是G或E；和
-CDRH-3是GDRFAY。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的人AMHRII结合剂的用途，其中，所述结合剂由抗体药物缀合物(ADC)构成。
6.根据权利要求1所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂是AMHRII结合工程化受体。
7.根据权利要求1所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂是表达AMHRII结合工程化受体的细胞。
8.根据权利要求7所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂是表达AMHRII结合工程化受体的CAR T细胞、CAR NK细胞或CAR巨噬细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的人AMHRII结合剂的用途，其中，所述人AMHRII结合剂与一种或多种不同的抗癌剂组合。
10.一种用于确定患有肺癌的个体是否对如权利要求1至8中任一项所限定的使用AMHRII结合剂的癌症治疗有响应的方法，其中，所述方法包括确定先前从所述个体获得的肿瘤组织样品是否在细胞表面处表达AMHRII蛋白的步骤。
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