BR112019021495A2 - Compostos de ligação ao amhrii para prevenção ou tratamento de cânceres de pulmão - Google Patents

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Abstract

a presente invenção diz respeito a um agente de ligação ao amhrii humano para uso na prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão, e particularmente um câncer de pulmão de células não pequenas (cpcnp), e ainda mais particularmente um cpcnp selecionado dentre um grupo compreendendo cpcnp epidermoide, cpcnp adenocarcinoma, cpcnp de células grandes, cpcnp carcinoma de células escamosas e cpcnp neuroendócrino.

Description

COMPOSTOS DE LIGAÇÃO AO AMHRII PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE CÂNCERES DE PULMÃO
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção diz respeito ao campo de tratamento de câncer de pulmão.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] O câncer de pulmão é a transformação e expansão malignas do tecido pulmonar, e é responsável por 1,3 milhões de mortes no mundo todo anualmente. Ele é a causa mais comum de mortes relacionadas um câncer em homens, e a segunda mais comum em mulheres.
[0003] A Organização Mundial de Saúde classifica o câncer de pulmão em quatro principais tipos histolígicos: (1) carcinoma de células escamosas (COE), (2) adenocarcinoma, (3) carcinoma de células grandes, e (4) carcinoma pulmonar de células pequenas (CPCP). O termo “carcinoma pulmonar de células não pequenas” (CPCNP) inclui os carcinomas de células escamosas, adenocarcinoma e de células grandes.
[0004] Os cânceres de células não pequenas (CPCNP) são agrupados em conjunto pois seu prognóstico e gestão são praticamente idênticos. Existem três subtipos principais: CPCNP carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e carcinoma pulmonar de células grandes. O carcinoma de células escamosas, representando 29% dos cânceres de pulmão, também tem início nos brônquios maiores, mas cresce mais lentamente. O tamanho desses tumores varia em função do diagnóstico. O adenocarcinoma é o subtipo mais comum de CPCNP, representando 32% dos cânceres de pulmão. Ele é uma forma que tem início próximo à superfície de troca de gases do pulmão. A maioria dos casos de adenocarcinoma são associados ao tabagismo. No entanto, entre pessoas que nunca fumaram (nunca fumantes), o adenocarcinoma é a forma mais comum de câncer de pulmão. Um subtipo de adenocarcinoma, o carcinoma bronquioloalveolar, é mais comum em mulheres nunca fumantes, e pode apresentar diferentes
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2/98 respostas ao tratamento. Outros subtipos de CPCNP são tumores pulmonares neuroendócrinos (NE), câncer de pulmão do tipo acinar (AT), e carcinoma de células grandes, uma forma de crescimento rápido, representando 9% dos cânceres de pulmão que crescem próximos à superfície do pulmão.
[0005] O câncer de pulmão de células pequenas (CPCP, também chamado carcinoma de células tipo grão de aveia) é uma forma menos comum de câncer de pulmão. Ele tende a ter início nas maiores vias respiratórias e cresce rapidamente, se tornando consideravelmente grande. O oncogene mais comumente envolvido é o L-myc. A célula do tipo “grão de aveia” contém grânulos neurossecretores densos que fornecem uma associação de síndrome endócrina/paraneoplásica. Ele é inicialmente mais sensível à quimioterapia, mas por fim apresenta um prognóstico pior e é geralmente metastático quando da apresentação. Esse tipo de câncer de pulmão é fortemente associado ao tabagismo.
[0006] Outros tipos de cânceres de pulmão incluem o carcinoma cístico adenóide (cilindroma), carcinoide e o carcinoma mucoepidermoide.
[0007] A detecção precoce é difícil uma vez que os sintomas clínicos geralmente não são percebidos até que a doença tenha alcançado um estágio avançado. Atualmente, o diagnóstico é auxiliado pelo uso de radiografias do tórax, análise do tipo de células contidas no escarro e exame por fibra óptica das passagens bronquiais. Os regimes de tratamento são determinados pelo tipo e estágio do câncer, e incluem cirurgia, radioterapia e/ou quimioterapia. Apesar da pesquisa considerável sobre terapias para a doença, o câncer de pulmão permanece difícil de tratar.
[0008] Tratamentos conhecidos de câncer de pulmão incluem cirurgia, quimioterapia, radioterapia e terapia medicamentosa direcionada.
[0009] A terapia direcionada e particularmente a imunoterapia direcionada tem o potencial de beneficiar pacientes de câncer de pulmão para os quais os tratamentos quimioterápicos ou por radiação convencionais
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3/98 são ineficazes. A imunoterapia direcionada inclui o uso de anticorpos monoclonais.
[0010] Os anticorpos monoclonais bevacizumabe (um anticorpo anti-VEGF) e ramucirumabe (um anticorpo anti-VEGFR2) se destinam a prevenir que tumores produzam novos vasos sanguíneos, enquanto o necitumumab (um anti-EGFR) visa o crescimento por meio da prevenção da ação de outro fator de crescimento. Atualmente, existem pelo menos dois anticorpos destinados a inibidores de checkpoint imune (pembrolizumabe/anti- PD1 e Nivolumab/anti-PDI) aprovados para pacientes de câncer de pulmão. Hoje, remissões de longa duração e taxas de sobrevivência mais longas podem ser obtidas com tais tratamentos imunobaseados tais como inibidores de checkpoint, anticorpos monoclonais, vacinas terapêuticas, e terapia de células adotivas.
[0011] No entanto, ainda existe a necessidade no estado da técnica de ferramentas adicionais para a terapia dos cânceres de pulmão, que podem ser alternativas ou complementares às terapias existentes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] Esta invenção diz respeito a um agente de ligação ao AMHRII humano para uso na prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão. Posteriormente, esta invenção diz respeito a um agente de ligação ao AMHRII humano para uso em um método de prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão em um paciente que sofra de um câncer de pulmão.
[0013] O câncer de pulmão pode ser selecionado dentre um grupo compreendendo câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) e particularmente um CPCNP selecionado dentre um grupo compreendendo CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes, CPCNP carcinoma de células escamosas, CPCNP carcinoma de células pleomórficas e CPCNP neuroendocrine.
[0014] Em modalidades preferenciais, um agente de ligação ao AMHRII humano é utilizado para tratar os cânceres de pulmão especificados
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4/98 acima que expressam o AMHRII na membrana celular em um níve de expressão suficiente.
[0015] Na maioria das modalidades preferenciais, o referido nível de expressão suficiente é expressado como um valor limiar de pontuação de expressão do AMHRII que é detalhado em outro lugar no presente relatório descritivo.
[0016] Em algumas modalidades, o referido agente de ligação ao AMHRII humano consiste em um anticorpo anti-AMHRII monoclonal.
[0017] Em algumas modalidades, o referido agente de ligação ao AMHRII humano consiste em um conjugado fármaco-anticorpo (ADC).
[0018] Em algumas modalidades, o referido agente de ligação ao AMHRII humano consiste em um receptor engenhado de ligação ao AMHRII.
[0019] Em algumas modalidades, o referido agente de ligação ao AMHRII humano consiste em uma célula que expressa um receptor engenhado de ligação ao AMHRII, tal como uma célula CAR T ou uma célula NK T que expressa um receptor engenhado de ligação ao AMHRII.
[0020] Em algumas modalidades, o referido agente de ligação ao AMHRII é combinado com um ou mais agente(s) anticâncer distinto(s).
[0021] Esta invenção também diz respeito a um método para determinar se um indivíduo é elegível para um tratamento de câncer de pulmão com um agente de ligação ao AMHRII conforme definido acima, em que o referido método compreende a etapa de determinar se uma amostra de tecido pulmonar tumoral previamente obtida do referido indivíduo expressam a proteína do AMHRII na superfície celular.
[0022] Esta invenção diz respeito a um método para determinar se um indivíduo é responsive a um tratamento de câncer de pulmão com um agente de ligação ao AMHRII conforme definido acima, em que o referido método compreende a etapa de determinar se a amostra de tecido pulmonar tumoral previamente obtida do referido indivíduo expressa a proteína do AMHRII na superfície celular.
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5/98
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0023] A Figura 1 ilustra as sequências de aminoácidos dos domínios VH e VL de uma pluralidade de variantes do anticorpo monoclonal 3C23. A Figura 1A ilustra o domínio VH de cada variante de anticorpo. A Figura IB ilustra o domínio VL de cada variante de anticorpo.
[0024] A Figura 2 ilustra a expressão do AMHRII por várias linhas de células cancerosas.
[0025] A Figura 2A ilustra a expressão do mRNA do AMHRII por linhas de células cancerosas. Abscissa: da esquerda para a direita na Figura 2A: HCT116 (carcinoma de cólon colorretal), COV434-WT (tumor de granulosa de ovário humano), K562 (leucemia mielogenosa humana) e OV90 (human malignant papillary serous adenocarcinoma). Ordenada: expressão do mRNA do nivel de AMHRII conforme doseado pela RT-qPCR, expressado em unidades arbitrárias (RQ).
[0026] As Figuras 2B a 2F: expressão da membrana da proteína do AMHRII pelas mesmas linhas de células cancerosas que as da Figura 2A: HCT116 (Figura 2B), COV434-WT (Figura 2C), K562 (Figura 2D), NCIH295R (Figura 2E) e OV90 (Figura 2F). Abscissa: intensidade do sinal de fluorescência (corante FL2-A) conforme expressado em unidades arbitrárias. Ordenada: contagem de células.
[0027] A Figura 3 ilustra a expressão do AMHRII por várias células cancerosas pulmonares conforme medidas por citometria de fluxo.
[0028] A Figura 3A ilustra a expressão da membrana da proteína do AMHRII por células de um xenoenxerto derivado de um paciente de Carcinoma de células escamosas (Ref Lu7860). A Figura 3B ilustra a expressão da membrana da proteína do AMHRII por células de um xenoenxerto derivado de um paciente de carcinoma pulmonar de células grandes (Ref Lu7166). A Figura 3C ilustra a expressão da membrana da proteína do AMHRII por células de um xenoenxerto derivado de um paciente de carcinoma de células escamosas (Ref Lu7298). A Figura 3D ilustra a
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6/98 expressão da membrana da proteína do AMHRII por células de um xenoenxerto derivado de um paciente de carcinoma de células escamosas (Ref Lu7414). A Figura 3E ilustra a expressão da membrana da proteína do AMHRII por células de um xenoenxerto derivado de um paciente de carcinoma de células pleomórficas (Ref Lu7558). Abscissa: intensidade de fluorescência (corante FL2-A) expressada em unidades arbitrárias. Ordenada: contagem de células.
[0029] A Figura 3F ilustra a expressão da membrana da proteína do AMHRII por células da margem saudável da CPCNP humano cirurgicamente ressectado (cujo perfil FACS é ilustrado na Figura 3G)
[0030] A Figura 3G ilustra a expressão da membrana da proteína do AMHRII por células de uma amostra fresca de CPCNP humano ressectado cirurgicamente.
[0031] Nas Figuras 3: (i) pico no lado esquerdo: células incubadas com um anticorpo tipo iso não relacionado; (ii) pico nos lados direitos: células incubadas com o anticorpo anti-AMHRII 3C23K.
[0032] Abscissa: intensidade de fluorescência (corante FL2-A) expressada em unidades arbitrárias. Ordenada: contagem de células.
[0033] A Figura 4 ilustra as chances de peso corporal relativo de animais xenoenxertoados com células de câncer de pulmão humano. Os tratamentos tiveram início no dia 18 após a implantação do SC131. O veículo e o GM102 a 20 mg/kg foram administrados bissemanalmente por via intravenosa por 3 semanas. Docetaxel a 20 mg/kg foi administrado lentamente por via intravenosa uma vez no DO. Cisplatina a 5 mg/kg e gemcitabina a 100 mg/kg foram administradas semanalmente por via intraperitoneal por 1 a 3 semanas. Tamanho do grupo inicial: 9 animais. Ordenada: peso corporal relativo conforme expressado em kg (média +/sem). Abscissa: · veículo; GM102 20 mg/kg; A docetaxel 20 mg/kg; ▼ combinação de GM102 e docitaxel; ♦ combinação de cisplatina 5 mg/kg e gemcitabina 100 mg/kg; o combinação de GM102, cisplatina e gemcitabina.
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[0034] A Figura 5 ilustra as mudanças de crescimento tumoral induzidas pelo anticorpo anti-AMHRII 3C23K, em combinação ou não com outros agentes anticâncer, em animais xenoenxertoados com células de câncer de pulmão humano. Os tratamentos tiveram início no dia 18 após a implantação do SC131. Veículo e GM102 a 20 mg/kg foram administrados bissemanalmente por via intravenosa por 3 semanas. Docetaxel a 20 mg/kg foi administrado lentamente por via intravenosa uma vez no DO. Cisplatina a 5 mg/kg e gemcitabina a 100 mg/kg foram administradas semanalmente por via intraperitoneal por 1 a 3 semanas. Tamanho do grupo inicial: 9 animais. Ordenada: volume do tumor conforme expressado em mm3 (média +/- sem). Abscissa: · veículo; GM102 20 mg/kg; A docetaxel 20 mg/kg; ▼ combinação de GM102 e docitaxel; ♦ combinação de cisplatina 5 mg/kg e gemcitabina 100 mg/kg; o combinação de GM102, cisplatina e gemcitabina.
[0035] A Figura 6 ilustra a atividade antitumoral do anticorpo antiAMHRII 3C23K, em combinação ou não com outros agentes anticâncer, em animais xenoenxertoados com células de câncer de pulmão humano. Os tratamentos tiveram início no dia 18 após a implantação do SC131. Veículo e GM102 a 20 mg/kg foram administrados bissemanalmente por via intravenosa por 3 semanas. Docetaxel a 20 mg/kg foi administrado lentamente por via intravenosa uma vez no D0. Cisplatina a 5 mg/kg e gemcitabina a 100 mg/kg foram administradas semanalmente por via intraperitoneal por 1 a 3 semanas. Tamanho do grupo inicial: 9 animais. Ordenada: TC conforme expressado em porcentagem. Abscissa: · veículo; GM102 20 mg/kg; A docetaxel 20 mg/kg; ▼ combinação de GM102 e docitaxel; ♦ combinação de cisplatina 5 mg/kg e gemcitabina 100 mg/kg; o combinação de GM102, cisplatina e gemcitabina.
[0036] A Figura 7 ilustra as mudanças de crescimento tumoral induzidas pelo GM102 (anticorpo anti-AMHRII de baixa fucose) em animais xenoenxertoados com um xenoenxerto de um tumor escamoso de câncer de pulmão de células não pequenas. Cada curva tracejada: animais
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8/98 xenoenxertoados administrados com uma solução de veículo. Cada curva contínua: animais xenoenxertoados administrados com GM102. Abscissa: período de tempo após o início do tratamento, conforme expressado em dias. Ordenada: volume do tumor, conforme expressado em mm3.
[0037] A Figura 8 ilustra as mudanças de crescimento tumoral induzidas pelo GM102 (anticorpo anti-AMHRII de baixa fucose) em animais xenoenxertoados com um xenoenxerto de um tumor escamoso de câncer de pulmão de células não pequenas, no dia 28 após o início do tratamento. As Figuras 8A e 8B, ordenada: volume do tumor, conforme expressado em mm3. A Figura 8A e 8B, abscissa: (i) lado esquerdo: animais xenoenxertoados administrados com uma solução de veículo; (ii) lado direito: animais xenoenxertoados administrados com GM102. Figura 8A: resultados absolutos para cada animal xenoenxertoado testado. Figura 8B: desvio padrão +/- do valor médio calculado a partir dos resultados ilustrados na Figura 8A.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0038] Os inventores demonstraram inesperadamente que o receptor AMHRII é expressado na membrana celular de tecidos de câncer de pulmão de células não pequenas e particularmente the CPCNP epidemoide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes, CPCNP carcinmoma de células pleomórficas, CPCNP carcinoma de células escamosas e subtipos de CPCNP neuroendócrino. Por outro lado, o AMHRII não foi detectado a nível de membrana no CPCP ou CPCNP dos subtipos neuroendocrino ou acinar.
[0039] O termo AMHR-II denota o receptor humano de hormônio anti-Mülleriano do tipo II. A sequência do AMHR-II humano é descrita neste documento como SEQ ID NQ 18 (sem o peptídeo sinal MLGSLGLWALLPTAVEA (SEQ ID NQ: 17)
[0040] Conforme utilizado neste documento, o termo “PDX” é uma abreviatura para a expressão “Xenoenxerto derivado do paciente”.
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Xenoenxertos derivados de pacientes são modelos de cânceres in vivo amplamente utilizados onde o tecido ou as células de um tumor de um paciente são implantados, ou seja, “enxertados”, em um mamífero não humano imunodeficiente, por exemplo, um camundongo imunodeficiente.
[0041 ] Como mostrado nos exemplos contidos neste documento, os inventores constataram que o AMHRII é expressado na membrana celular de tecidos de câncer de pulmão com uma frequência variável a depender do subtipo de câncer de pulmão que é considerado.
[0042] De acordo com o conhecimento dos inventores, a expressão de membrana de AMHRII em células cancerosas pulmonares foi demonstrada pela primeira vez neste documento.
[0043] De forma ilustrativa, como mostrado nos exemplos contidos neste documento, o AMHRII é expressado mais frequentemente por células cancerosas derivadas de tecido tumoral originário de pacientes afetados por um câncer de pulmão epidermóide ou um CPCNP adenocarcinoma CPCNP de células grandes do que por células cancerosasderivadas de tecido tumoral originário de pacientes afetados por a CPCNP de células escamosas ou de células grandes. A relativa alta frequência detectada significa que pacientes de câncer afetados por um desses quatro tipos de cânceres de pulmão são mais frequentemente elegíveis para, ou seja, serão mais frequentemente responsivos a, um tratamento anticâncer direcionado ao AMHRII, mas que um tal tratamento anticâncer será menos frequentemente relevante para tratar pacientes afetados por um CPCNP neuroendocrine.
[0044] Como mostrado nos exemplos contidos neste documento, qualquer câncer de pulmão CPCNP pode ser tratado por um agente de ligação ao AMHRII, desde que as células tumorais do referido tumor nãoginecológico expressem o AMHRII em sua membrana, portanto, desde que a presença de proteínas do AMHRII na membrana celular tumoral possa ser detectada ou determinada de acordo com qualquer método.
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[0045] Portanto, os dados experimentais fornecidos nos exemplos contidos neste documento mostram que o mesmo agente de ligação ao AMHRII, aqui um anticorpo anti-AMHRII monoclonal, é eficaz para se tratar uma pluralidade de cânceres de pulmão CPCNP distintos desde que a proteína alvo do AMHRII seja expressa na membrana das células tumorais.
[0046] Incidentalmente, no campo de ingredientes ativos anticâncer consistindo em moléculas de ligação alvo, por exemplo, anticorpos de ligação alvo, a situação em que o mesmo ingrediente ativo é eficaz para tratar uma pluralidade de cânceres distintos não é sem precedentes. De forma ilustrativa, o anticorpo anti-PDI chamado pembrolizumabe foi autorizado pela Administração de Alimento e Medicamento dos EUA (FDA) como um ingrediente ativo útil no tratamento de uma variedade de tipos distintos de cânceres, desde que os referidos cânceres compartilhem as mesmas características fisiológicas.
[0047] Conforme utilizado neste documento, a expressão do AMHRII na membrana celular de células cancerosas pulmonares significa que as referidas células cancerosas pulmonares expressam o AMHRII em um dado nível quantificável ou maior do que o referido nível quantificável.
[0048] De acordo com algumas modalidades, a responsividade de um indivíduo afetado por um câncer de pulmão a um tratamento com uma molécula de ligação ao AMHRII pode ser avaliada determinando-se se células cancerosas pulmonares de uma amostra previamente coletada do referido indivíduo expressam o AMHRII em sua membrana.
[0049] De acordo com algumas modalidades, a responsividade de um indivíduo afetado por um câncer de pulmão a um tratamento com uma molécula de ligação ao AMHRII pode ser avaliada determinando-se se células cancerosas pulmonares de uma amostra previamente coletada do referido indivíduo expressam o AMHRII em sua membrana acima de um determinado valor limiar.
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[0050] O nível de expressão de membrana do AMHRII que pode ser utilizado em algumas modalidades para determinar a responsividade de um paciente afetado por um câncer não ginecológico a um tratamento com um agente de ligação ao AMHRII, por exemplo, um anticorpo anti-AMHRII, pode ser avaliado com uma variedade de técnicas, que incluem (i) a porcentagem de células tumorais contidas em uma amostra tumoral que expressam o AMHRII em sua membrana, (ii) o número médio de proteínas do AMHRII na membrana celular tumoral e (iii) o perfil de sinal FACS do AMHRII das células tumorais contidas em uma amostra testada de células tumorais.
[0051] De acordo com algumas modalidades, as células cancerosas pulmonares contidas em uma amostra tumoral previamente coletada para um indivíduo afetado por um câncer de pulmão podem ser avaliadas como expressando AMHRII membranoso quando o AMHRII membranoso é detectado em 5% ou mais de células tumorais pulmonares compreendidas na referida amostra tumoral.
[0052] Portanto, em algumas modalidades, um indivíduo afetado por um câncer de pulmão é determinado como sendo responsive a um tratamento com um agente de ligação ao AMHRII quando 5% ou mais de células tumorais pulmonares contidas em uma amostra tumoral previamente coletada do referido indivíduo expressarem o AMHRII em sua membrana.
[0053] Métodos para determinar a frequência (ou seja, a porcentagem) de células tumorais que expressam proteínas de membrana do AMHRII são divulgados em outro lugar no presente relatório descritivo, inclusive nos exemplos contidos neste documento.
[0054] De acordo com algumas modalidades, a responsividade de um paciente afetado por um câncer de pulmão a um tratamento de câncer com um agente de ligação ao AMHRII, por exemplo, um anticorpo antiAMHRII, pode ser avaliada determinando-se o número médio de proteínas
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12/98 do AMHRII presentes na membrana das células tumorais contidas em uma amostra tumoral previamente coletada do referido paciente.
[0055] Em algumas modalidades, um paciente afetado por um câncer de pulmão pode ser classificado como responsive a um tratamento com um agente de ligação ao AMHRII, por exemplo, responsive a um tratamento com um anticorpo anti-AMHRII, quando o número médio de proteínas de membrana do AMHRII expressadas pelas células tumorais contidas em uma amostra tumoral previamente coletada do referido paciente for de 10.000 proteínas do AMHRII ou mais.
[0056] A avaliação do número de proteínas do AMHRII expressadas na membrana celular tumoral pulmonar pode ser realizada utilizando-se métodos convencionais compreendendo (a) uma etapa de encubagem de uma amostra contendo as células de uma amostra de tecido tumoral previamente coletada do paciente com um composto detectável que se liga especificamente à proteína do AMHRII, tal como um anticorpo antiAMHRII com rótulo fluorescente, e adicionalmente (b) uma etapa de determinar o número dos referidos compostos detectáveis, por exemplo, o número de anticorpos anti-AMHRII com rótulo fluorescente, ligados a cada célula testada da referida amostra. A avaliação do número de proteínas do AMHRII expressadas na membrana celular tumoral pode ser, por exemplo, realizada utilizando-se a técnica conhecida de separação de células ativadas por fluorescência (FACS), como mostrado nos exemplos contidos neste documento.
[0057] Em ainda outras modalidades, um paciente afetado por um câncer de pulmão pode ser classificado como responsive a um tratamento com um agente de ligação ao AMHRII, por exemplo, classificado como responsive a um tratamento com um anticorpo anti-AMHRII, por análise do perfil FACS do AMHRII das células tumorais contidas em uma amostra tumoral previamente coletada do referido paciente.
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[0058] Ainda de acordo com essas outras modalidades, um paciente afetado por um câncer de pulmão pode ser classificado como responsive a um tratamento com um agente de ligação ao AMHRII, por exemplo, classificado como responsive a um tratamento com um anticorpo anti-AMHRII quando, em um método de separação de células ativadas por fluorescência (FACS), a proporção do (i) valor de intensidade média de fluorescência (MFI) obtida de células tumorais incubadas com um anticorpo isotípico com rótulo fluorescente em relação à (ii) intensidade média de fluorescência das células tumorais incubadas com um anticorpo anti-AMHRII com rótulo fluorescente é de 1,5 ou mais.
[0059] Para se determinar a referida proporção de intensidade média de fluorescência, tanto o anticorpo isotípico quanto o anticorpo antiAMHRII são rotulados com o mesmo agente fluorescente, tal como o corante Alexa Fluor 488 comercializado pela empresa ThermoFisher Scientific, como mostrado nos exemplos contidos neste documento.
[0060] Em algumas modalidades adicionais, a responsividade de um indivíduo com câncer de pulmão a um tratamento com um agente de ligação ao AMHRII pode ser determinada calculando-se uma expressão da pontuação do AMHRII que permita discriminar entre (i) células cancerosas pulmonares de membrana que expressam o AMHRII derivadas de cânceres de pulmão que podem ser tratados com um agente de ligação ao AMHRII e (ii) células cancerosas pulmonares de membrana que expressam o AMHRII derivadas de cânceres de pulmão que não podem ser tratados com um agente de ligação ao AMHRII.
[0061] Portanto, os inventores determinaram que pacientes afetados por um câncer de pulmão que sejam particularmente elegíveis para um tratamento de câncer com um agente de ligação ao AMHRII descrito neste documento, ou seja, que sejam particularmente responsivos a um tratamento de câncer com um agente de ligação ao AMHRII descrito neste documento, incluem aqueles com tumores cancerosos que expressem o
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AMHRII na membrana celular em um nível suficientemente alto por consistirem em alvos celulares relevantes a serem destruídos.
[0062] Então, de acordo com essas modalidades adicionais, os inventores determinaram que uma expressão mínima do nível de AMHRII medido em uma amostra de células cancerosas de um paciente de câncer de pulmão pode confirmar que o referido paciente é responsive a um tratamento com um agente de ligação ao AMHRII e que o referido paciente pode, portanto, ser tratado com um agente de ligação ao AMHRII descrito neste documento.
[0063] A responsividade de um indivíduo afetado por um câncer de pulmão a um tratamento com um agente de ligação ao AMHRII também pode, portanto, ser determinada quando o nível de expressão do AMHRII por células cancerosas pulmonares contidas em uma amostra previamente coletada do referido indivíduo é avaliada tanto pela determinação (i) da frequência de células tumorais que expressa AMHRII membranoso, por exemplo, a porcentagem de células tumorais que expressam o AMHRII em sua membrana quanto (ii) do nível de expressão de membrana do AMHRII pelas referidas células tumorais, por exemplo, o número médio de proteínas membranosas do AMHRII por célula.
[0064] Portanto, em algumas dessas modalidades adicionais, os inventores determinaram que a responsividade de um paciente de câncer de pulmão a um agente de ligação ao AMHRII humano, por exemplo, a um anticorpo AMHRII anti-humano, requer que, em uma amostra de células tumorais previamente coletadas do referido paciente, (i) as células tumorais contidas na referida amostra apresentam um número médio mínimo de proteínas do AMHRII humano em sua membrana e (ii) a frequência das células que expressam o AMHRII humano em sua membrana, por exemplo, a porcentagem de células que expressam o AMHRII humano em sua membrana, se de pelo menos um valor limiar.
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[0065] De forma correspondente, também é descrito neste documento um método adicional que também pode ser utilizado para determinar um valor de pontuação de expressão específico do AMHRII que permita discriminar entre (i) pacientes de câncer de pulmão que não são elegíveis para um tratamento de câncer com um agente de ligação ao AMHRII, ou seja, pacientes de câncer de pulmão que não são responsivos a um tratamento de câncer com um agente de ligação ao AMHRII, e (ii) pacientes de câncer de pulmão que são elegíveis para um tratamento de câncer com um agente de ligação ao AMHRII, ou seja, pacientes de câncer de pulmão que são responsivos a um tratamento de câncer com um agente de ligação ao AMHRII, por exemplo, um anticorpo AMHRII anti-humano.
[0066] Mais precisamente, de acordo com modalidades do método acima, pacientes afetados por um câncer de pulmão descrito neste documento, e que possam ser tratados contra o câncer de pulmão com um agente de ligação ao AMHRII conforme descrito no presente relatório descritivo, são preferencialmente aqueles para os quais foi determinado um valor de pontuação de expressão do AMHRII membranoso de 1,0 ou mais.
[0067] A pontuação de expressão do AMHRII membranoso pode se basear na avaliação imuno-histoquímica da expressão do AMHRII pelas células cancerosas pulmonares testadas e é um valor médio das pontuações do AMHRII membranoso determinadas a partir de uma pluralidade de amostras de células de câncer de pulmão originárias de diferentes indivíduos afetados por um câncer de pulmão, e em que uma pontuação indivíduo de AMHRII membranoso para uma dada amostra de células de câncer de pulmão (i) é atribuída como sendo 0 se nenhuma expressão do AMHRII for detectável, (ii) é atribuída como sendo 1 se uma expressão significativa do AMHRII for detectada e (iii) é atribuída como sendo 2 se uma alta expressão do AMHRII for detectada e (iv) é atribuída como sendo 3 se uma sobreexpressão do AMHRII for detectada.
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[0068] De fato, há uma relação entre (i) a pontuação atribuída à expressão do nível de AMHRII mebranoso por meio da avaliação imunohistoquímica descrita acima e (ii) o número médio de proteínas do AMHRII expressadas por célula de câncer de pulmão. É mostrado nos exemplos contidos neste documento que o nível de expressão do AMHRII membranoso, que permite a atribuição de uma pontuação indivíduo de AMHRII membranoso, também pode ser avaliada determinando-se o número médio de proteínas membranosas do AMHRII por célula, partindo-se de uma amostra de células tumorais pulmonares que foi previamente coletada de um paciente de câncer de pulmão.
[0069] De acordo com as modalidades acima de determinação da responsividade de um indivíduo afetado por um câncer de pulmão a um tratamento com um agente de ligação ao AMHRII, ou seja, a um tratamento com um anticorpo anti-AMHRII, uma pontuação de expressão do AMHRII membranoso é determinada, para uma dada amostra de células de câncer de pulmão, levando-se em conta tanto (i) a frequência de células que expressam o AMHRII na referida amostra de células de câncer de pulmão e (ii) o nível de expressão do AMHRII membranoso pelas referidas células que expressam o AMHRII. Tipicamente, a pontuação de expressão do AMHRII membranoso de uma dada amostra de células de câncer de pulmão é determinada pela seguinte fórmula (I):
E-SCORE=FREQ x AMHRIILEVEL, em que
- E-SCORE significa o valor de pontuação de expressão do AMHRII membranoso para uma dada amostra de células de câncer de pulmão,
- FREQ significa a frequência das células contidas na referida amostra de células de câncer de pulmão para a qual a expressão de membrana do AMHRII seja detectada, e
- AMHRIILEVEL significa o nível de expressão membranosa do AMHRII pelas células que expressam o AMHRII contidas na referida dada amostra de células de câncer de pulmão.
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[0070] De forma ilustrativa, um E-SCORE de 1,0 é determinado para uma dada amostra de células de câncer de pulmão em que (i) 50% das células expressam o AMHRII (valor FREQ de 0,5) e (ii) o nível de expressão do AMHRII (AMHRII LEVEL) é de 2.
[0071] Em algumas modalidades, uma pontuação de expressão do AMHRII (ou E-SCORE) é determinada por métodos imuno-histológicos conforme mostrados nos exemplos contidos neste documento. De acordo com essas modalidades preferenciais, a expressão de membrana do AMHRII é avaliada utilizando-se um anticorpo detectável específico para o AMHRII e (i) determinando-se a frequência de células com o referido anticorpo antiAMHRII ligado a ele e (ii) determinando-se a intensidade do sinal gerado pelo referido anticorpo anti-AMHRII detectável após sua ligação ao AMHRII expressado na membrana.
[0072] Embora, como mostrado nos exemplos contidos neste documento, células cancerosas pulmonares que expressam o AMHRII com uma pontuação de expressão do AMHRII membranoso de 1,0 ou mais foram determinadas para diversos cânceres de pulmão, mesmo que em frequências distintas.
[0073] Para se determinar o nível de expressão de membrana do AMHRII, a detecção do AMHRII na membrana celular deve ser mais preferencialmente realizada utilizando-se um anticorpo anti-AMHRII monoclonal com uma alta afinidade e alta especificidade para o AMHRII, o que é ilustrado nos exemplos pelo anticorpo anti-AMHRII monoclonal 3C23K.
[0074] Além disso, a determinação de expressão do AMHRII por um método imuno-histoquímico com o propósito de se determinar uma pontuação do AMHRII mais preferencialmente envolve um pré-tratamento cuidadoso da amostra de tecido pulmonar antes de contatar a referida amostra com um reagente de detecção apropriado (ou seja, um anticorpo anti-AMHRII monoclonal de alta afinidade, tal como o anticorpo 3C23K monoclonal com um valor Kd de 55,3 pM para ligação ao AMHRII). O pré
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18/98 tratamento da amostra deve permitir o aumento da disponibilidade ao reagente de detecção das moléculas de AMHRII expressadas na superfície celular. De forma ilustrativa, como mostrado nos exemplos contidos neste documento, o método de pré-tratamento pode compreender uma combinação apropriada de etapas específicas tais como (i) uma desparafinagem de alta temperatura por exposição a uma fonte de microondas e (ii) um sistema para amplificar o sinal gerado pela ligação de um reagente de ligação ao AMHRII, tal como um anticorpo anti-AMHRII biotinilado que pode ser subsequentemente complexado com a reagente detectável conjugado de streptavidin. Uma etapa de pré-tratamento de desparafinamento pareceu ser importante para se reverter o efeito de extinção do sinal de detecção em razão da etapa prévia de fixação do tecido. Os inventores demonstraram que a detectabilidade do AMHRII é particularmente sensível à ação da formalina que é usada para a etapa de fixação de tecido.
[0075] Isso significa que, embora um agente de ligação ao AMHRII possa ser um agente terapêutico relevante para tratar pacientes afetados por um câncer de pulmão, será preferível testar previamente para a expressão do AMHRII das células cancerosas pulmonares derivadas do tumor para decidir se um agente de ligação ao AMHRII conforme descrito neste documento será administrado a um paciente específico.
[0076] Além disso, os inventores demonstraram que anticorpos anti-AMHRII podem ser vantajosamente utilizados para tratar cânceres de pulmão.
[0077] Portanto, os inventores demonstraram neste documento que agentes farmacêuticos direcionados ao AMHRII são úteis como novas ferramentas terapêuticas para a prevenção ou o tratamento desses tipos de cânceres, e particularmente um CPCNP selecionado dentre um grupo compreendendo CPCNP epidermóide, CPCNP carcinoma de células pleomórficas e CPCNP neuroendócrino CPCNP adenocarcinoma, CPCNP
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19/98 de células grandes e CPCNP carcinoma de células escamosas e CPCNP neuroendocrine.
[0078] De acordo com a invenção, a expressão “compreendendo”, tal como em “compreendendo as etapas de”, também é entendida como “consistindo em’, tal como em “consistindo nas etapas de” também é entendida como “consistindo em”, tal como “consistindo nas etapas de”.
[0079] O receptor AMH (AMHR ou AMHR2 ou AMHRII) é uma quinase serina/treonina com um único domínio de transmembrana pertencente à família de receptores do tipo II para proteínas relacionadas ao TGF-beta. Os receptores do tipo II ligam o ligante por conta própria, mas requerem a presença de um receptor do tipo I para transdução de sinal. Imbeaud et al. (1995, Nature Genet, Vol. 11: 382-388,) clonou o gene do receptor AMH do tipo II humano. A proteína do receptor AMH humane consiste em 573 aminoácidos: 17, 127, 26, e 403 de 573 aminoácidos formam uma sequência de sinal, domínio extracelular (ECD), dominio de transmembrana, e domínio intracelular contendo um dominio de quinase serina/treonina, respectivamente.
[0080] Conforme utilizado neste documento, o termo “AMHRII” se refere a o receptor humano de hormônio anti-Mülleriano do tipo II com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ17.
[0081] A expressão do receptor do hormônio anti-Mülleriano (AMHRII) já foi descrita no estado da técnica em cânceres ginecológicos, tumores que são amplamente infiltrados por células mielóides imunes. O AMHRII foi identificado como uma molécula alvo para tratar cânceres ginecológicos. Os anticorpos direcionados ao AMHRII foram produzidos como ferramentas terapêuticas para tratar esses cânceres. Pode-se citar particularmente o anticorpo anti-AMHRI112G4 e suas variantes descritas nos pedidos PCT n° WO 2008/053330 e n° WO 2011/141653 para tratar cânceres de ovário, assim como o anticorpo anti-AMHRII 3C23K descrito no pedido
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PCT. Pode-se mencionar também o pedido PCT n° WO 2017/025458, que divulgou uma estratégia de tratamento específica contra câncer de ovário utilizando-se conjugados de anticorpo-medicamento anti-AMHRII.
[0082] A expressão gênica do receptor do hormônio antiMülleriano (gene AMHRII) também foi descrita por Beck et al. (2016, Cell Reports, Vol. 16: 657-671). Esses autores demonstraram que a sinalização do AMH foi um contribuinte importante para a plasticidade epitelial, sinalização de sobrevida, e resistência seletiva ao fármaco no CPCNP. O trabalho de Beck et al. (2016) ofereceu maior clareza sobre os mecanismos intracelulares da patenogênese do CPCNP, particularmente por relatar, por meio da modulação da expressão de diversos genes de interesse utilizandose siRNAs, a identificação e a caracterização de um eixo de sinalização autócrina previamente indefinido em um subconjunto de tumores de CPCNP, envolvendo hormônio anti-Mülleriano, e seu receptor do tipo II, como importantes para resposta ao inibidor de Hsp90 ganetespib e à cisplatina quimioterápica aprovada. Esses autores também constataram, por meio de experimentos de Western blotting, uma baixa abundância de Proteínas AMH e AMHR2 presentes dentro das células de três linhas celulares, a saber A549 e H1299, cuja produção é bloqueada visando-se os respectivos genes por SiRNAs.
[0083] Os inventores constataram agora inesperadamente que o AMHRII também foi expressado na superfície de diversas células de câncer de pulmão humano, que incluem particularmente células de câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) e ainda mais particularmente um CPCNP selecionado dentre um grupo compreendendo CPCNP epidermóide, CPCNP carcinoma de células pleomórficas e CPCNP neuroendócrino CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes e CPCNP carcinoma de células escamosas e CPCNP neuroendócrino. Os inventores também demonstraram que não há relação entre (i) a expressão gênica do AMHRII
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21/98 por células cancerosas e (ii) a expressão da membrana celular proteica do AMHRII pelas mesmas células cancerosas.
[0084] As descobertas dos inventores relativas à expressão superficial do AMHRII por células cancerosas pulmonares derivam, em especial, de ensaios imuno-histoquímicos com um anticorpo anti-AMHRII que foram realizados utilizando-se amostras de tecido pulmonar tumoral humano previamente obtidas de pacientes de câncer de pulmão. As descobertas dos inventores relativas à expressão superficial do AMHRII por células cancerosas pulmonares humanas também foram obtidas a partir de ensaios imuno-histoquímicos com um anticorpo anti-AMHRII que foram realizados em amostras de tecido pulmonar tumoral originárias de xenoenxertos de células cancerosas pulmonares humanas primárias em camundongos.
[0085] Os presentes inventores também demonstraram que anticorpos anti-AMHRII são úteis para tratar cânceres de pulmão humanos que expressam o AMHRII na superfície celular tumoral, e particularmente aqueles cânceres de pulmão que expressam o AMHRII divulgados no presente relatório descritivo, os quais incluem câncer de pulmão de células não pequenas e particularmente CPCNP epidermóide, CPCNP carcinoma de células pleomórficas e CPCNP neuroendócrino CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes e CPCNP carcinoma de células escamosas e CPCNP neuroendócrino. Notavelmente, uma boa atividade anticâncer foi demonstrada com anticorpos anti-AMHRII, bem como com anticorpos antiAMHRII combinados com um agente químico anticâncer, tais como os agentes anticâncer conhecidos docetaxel, cisplatina e/ou gemcitabina.
[0086] Os inventores demonstraram que um anticorpo antiAMHRII que apresentou eficácia antitumoral contra cânceres ginecológicos expressando o AMHRII no estado da técnica também é útil para prevenção ou tratamento de cânceres de pulmão que expressam o AMHRII, e particularmente aqueles cânceres de pulmão que expressam o AMHRII
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22/98 divulgados no presente relatório descritivo, tais como câncer de pulmão de células não pequenas e particularmente CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes e CPCNP carcinoma de células escamosas, CPCNP carcinoma de células pleomórficas e CPCNP neuroendocrine.
[0087] Mais precisamente, é mostrado nos exemplos contidos neste documento que o anticorpo anti-AMHRII chamado 3C23K exerce uma atividade antitumoral in vivo contra câncer de pulmão humano, e particularmente contra os cânceres de células não pequenas divulgados neste documento, incluindo quando o referido tratamento com anticorpo antiAMHRII é combinado com um tratamento com um ou mais agente(s) anticâncer distinto(s) tais como docetaxel, cisplatina e/ou gemcitabina.
[0088] Ainda de forma adicional, os inventores também demonstraram que o anticorpo anti-AMHRII 3C23K não induz nenhum efeito tóxico detectável in vivo, e particularmente nenhuma perda significativa de peso corporal.
[0089] Portanto, a presente invenção diz respeito a um agente de ligação ao AMHRII humano para uso na prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão, particularmente de um câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) e mais especificamente de cânceres de células não pequenas (CPCNP) selecionados dentre um grupo compreendendo CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes, CPCNP carcinoma de células escamosas, carcinoma de células pleomórficas e CPCNP neuroendocrine.
[0090] Esta invenção também diz respeito ao uso de um agente de ligação ao AMHRII humano para a preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão, e particularmente um câncer de pulmão selecionado dentre um grupo compreendendo CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes, CPCNP
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23/98 carcinoma de células escamosas, CPCNP carcinoma de células pleomórficas e CPCNP neuroendocrine.
[0091] Esta invenção também diz respeito a um método para prevenção ou tratamento de câncer de pulmão, e particularmente de um câncer de pulmão selecionado dentre um grupo compreendendo CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes, CPCNP carcinoma de células escamosas, CPCNP carcinoma de células pleomórficas e CPCNP neuroendócrino., em que o referido método compreende uma etapa de administrar a um indivíduo em necessidade de tal um agente de ligação ao AMHRII conforme divulgado no presente relatório descritivo.
[0092] Um agente de ligação ao AMHRII que pode ser utilizado de acordo com a presente invenção não requer uma reprodução da atividade do ligante natural da MIS. Portanto, não há necessidade de que um agente de ligação ao AMHRII, que pode ser utilizado de acordo com a invenção, ative qualquer caminho de sinalização celular após sua ligação ao AMHRII. Em vez disso, é necessária apenas a capacidade do referido agente de se ligar ao AMHRII, uma vez que o referido agente é utilizado exclusivamente para visar uma atividade de indução de citotoxicidade, tal como uma entidade indutora de citotoxicidade, que inclui um conjugado fármaco-anticorpo citotóxico anti-AMHRII, um anticorpo anti-AMHRII indutor de ADCC ou indutor de ADC ou uma célula CAR T que expressa um receptor engenhado de ligação ao AMHRII.
Agente de ligação ao AMHRII
[0093] Conforme utilizado neste documento, um agente de ligação ao AMHRII inclui qualquer agente que se ligue especificamente ao AMHRII e que, quando apresentado de forma apropriada, causará a morte das células alvo que expressam o AMHRII em sua superfície depois que o referido agente tenha se ligado ao AMHRII expressado na membrana celular.
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[0094] Um agente de ligação ao AMHRII que é utilizado para tratar um câncer de pulmão conforme descrito neste documento também pode ser designado como um “agente terapêutico de ligação ao AMHRII” neste documento.
[0095] Em termos gerais, um agente de ligação ao AMHRII inclui uma proteína ou um ácido nucleico que se liga especificamente ao AMHRII.
[0096] Proteínas de ligação ao AMHRII incluem principalmente as proteínas que compreendem um ou mais regiões de determinação complementar (CDRs) que se originam de um anticorpo anti-AMHRII ou de um fragmento de ligação ao AMHRII de um anticorpo anti-AMHRII, entendendo-se que as referidas proteínas de ligação ao AMHRII podem ser expressadas como receptores quiméricos de antígeno (CARS) por células engenhadas tais como células CAR-T, células NK T ou macrófagos CAR.
[0097] Ácidos nucleicos de ligação ao AMHRII incluem principalmente aptâmeros de ácidos nucleicos que foram particularmente selecionados por suas propriedades específicas de ligação ao AMHRII.
[0098] Em algumas modalidades preferenciais, o agente de ligação ao AMHRII é um anticorpo anti-AMHRII ou um seu fragmento de ligação ao AMHRII.
[0099] Na maioria das modalidades preferenciais, o agente de ligação ao AMHRII é um anticorpo anti-AMHRII monoclonal ou um seu fragmento de ligação ao AMHRII.
[00100] De acordo com essas modalidades preferenciais, anticorpos monoclonais anti-AMHRII incluem anticorpos quiméricos antiAMHRII, anticorpos humanizados anti-AMHRII e anticorpos humanos de AMHRII, assim como os fragmentos de ligação ao AMHRII e seus derivados de ligação ao AMHRII
[00101] Diversos anticorpos de AMHRII são conhecidos no estado da técnica e podem ser utilizados de acordo com a invenção como Agentes de ligação ao AMHRII. Para a finalidade de realizar a presente invenção, o
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25/98 versado na técnica pode utilizar, para fins de ilustração, o anti-AMHRII humano recombinante comercializado pela Creative Biolabs sob a referência n° MHH-57.
[00102] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-AMHRII que pode ser utilizado de acordo com a invenção é a anticorpo humanizado 12G4 divulgado no pedido PCT n° WO 2008/053330.
[00103] Em algumas outras modalidades, os referidos anticorpos anti-AMHRII são os anticorpos humanizados descritos no pedido PCT n° WO 2011/141653, que anticorpos humanizados incluem os anticorpos 3C23 assim como suas variantes, em que suas variantes incluem o anticorpo humanizado 3C23K.
[00104] Em ainda outras modalidades, os referidos anticorpos anti-AMHRII são aqueles descritos no pedido PCT n° WO 2017/025458. De acordo com essas modalidades adicionais, o pedido PCT n° WO 2017/025458 divulgou agentes de ligação ao AMHRII sob a forma de conjugados de anticorpo-medicamento (ADC) em que os referidos anticorpos anti-AMHRII são ligados a um agente citotóxico.
[00105] Um anticorpo monoclonal contra o receptor de hormônio Mülleriano do tipo II (e seus derivados humanizados) foi desenvolvido no estado da técnica para o tratamento de câncer de ovário (vide EP 2097453B1 e patente nQ US 8,278,423, que é incorporado ao presente documento por referência em sua totalidade).
[00106] Dentre os agentes de ligação ao AMHRII que podem ser utilizados de acordo com a invenção, o versado na técnica pode utilizar o anticorpo monoclonal 12G4 (mAb 12G4), ou suas variantes quiméricas ou humanizadas, incluindo um tal anticorpo que foi derivatizado com um fármaco ou rótulo detectável para formar um ADC. O mAbl2G4 produtor de hibridoma foi depositado na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França), de acordo com os termos do tratado de Budapeste,
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26/98 no dia 26 de setembro de 2006) e possui Número de depósito na CNCM 13673. O domínio variável das cadeias leves e pesadas do mAb 12G4 foi sequenciado assim como as regiões de determinação complementar (CDRs) do mAb 12G4 (vide EP 2097453B1 e patente nQ US 8,278,423, que é incorporado ao presente documento por referência em sua totalidade). O mAb 12G4 e suas variantes quiméricas ou humanizadas podem ser utilizados para a produção de ADC conforme divulgados neste documento.
[00107] O pedido PCT n° PCT/FR2011/050745 (publicação internacional n° WO/2011/141653) e a patente nQ US 9,012,607, cada um dos quais que é incorporado ao presente documento por referência em sua totalidade, divulgam novos anticorpos humanizados que são derivados de o anticorpo murino 12G4. Esses anticorpos humanizados podem ser utilizados como agentes de ligação ao AMHRII para os fins da presente invenção. Em modalidades particulares divulgadas no pedido PCT n° WO/2011/141653, os anticorpos são aqueles identificados como o 3C23 e o 3C23K. As sequências de ácidos nucleicos e sequências polipeptídicas desses anticorpos são providas como SEQ ID nQ: 1-16 neste documento. Em alguns aspectos da invenção, os anticorpos anti-AMHRII de interesse podem ser referidos como compreendendo uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID nQ: e a cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: Portanto, em diversas modalidades, anticorpos particularmente preferenciais, incluindo para a geração de ADC, compreendem:
a) uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NQ: 2 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NQ: 4 (sequências VL e VH de 3C23 sem líderes);
b) uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NQ: 6 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NQ: 8 (sequências VL e VH de 3C23K sem líderes);
c) uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NQ: 10 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NQ: 12 (cadeias leves e pesadas de 3C23 sem líderes);
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d) uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NQ: 14 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NQ: 16 (cadeias leves e pesadas de 3C23K sem líderes).
[00108] Outros anticorpos (por exemplo, anticorpos humanizados ou quiméricos) podem ser baseados nas sequências de cadeia leve e pesada mostradas nas Figuras 1A e 1B (por exemplo, anticorpos, tais como anticorpos humanizados ou quiméricos contendo as sequências de CDR divulgadas dentro das Figuras) e podem ser utilizados como agentes de ligação ao anti-MAHRII de interesse, incluindo para a formação de ADCs. Portanto, a invenção também diz respeito ao uso de anticorpos anti-AMHRII compreendendo/contendo CDRs compreendendo (ou consistindo em) as seguintes sequências:
- CDRL-1: RASX1X2VX3X4X5A (SEQ ID NQ 65), onde XI e X2 são, independentemente, S ou P, X3 é R ou W ou G, X4 é T ou D, e X5 é I ou T;
- CDRL-2 é PTSSLX6S (SEQ ID NQ 66) onde X6 é K ou E; e
- CDRL-3 é LQWSSYPWT (SEQ ID NQ 67);
- CDRH-1 é KASGYX7FTX8X9HIH (SEQ ID NQ 68) onde X7 é S ou T, X8 é S ou G e X9 é Y ou N;
- CDRH-2 é WIYPX10DDSTKYSQKFQG (SEQ ID NQ 69) onde X10 é G ou E e
- CDRH-3 é GDRFAY (SEQ ID NQ 70).
[00109] Esta invenção também diz respeito ao uso de ADCs gerados utilizando tais anticorpos anti-AMHRII para tratar câncer de pulmão, e particularmente câncer de pulmão de células não pequenas e câncer de pulmão de células pequenas.
[00110] Anticorpos (por exemplo, quiméricos ou humanizados) dentro do escopo deste pedido incluem aqueles divulgados na tabela a seguir: De forma alternativa, anticorpos monoclonais humanos que se ligam
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28/98 especificamente ao AMHR-II podem ser utilizados para a preparação de ADCs. O anticorpo 3C23K é definido por:
-SEQ ID NQ: 19 para sequência de aminoácidos VH
-SEQ ID NQ: 36 para sequência de aminoácidos VL
[00111] A Tabela 1 abaixo lista anticorpos anti-AMHRII humanizados que podem ser utilizados de acordo com a invenção.
Tabela 1: anticorpos anti-AMHRII
Anticorpo Mutações
Mutações VH SEQID na listagem de seq. Mutações VL SEQID na listagem de seq.
3C23K 19 36
3C23 19 L-K55E 37
3C23KR H-R3Q 20 36
6B78 H-R3Q 20 L-T48I, L-P50S 38
5B42 H-R3Q, H- T73A 21 L-T48I, L-K55E 39
K4D-24 H-Q1R 22 36
6C59 H-Q1R 22 L-S27P, L-S28P 40
K4D-20 H-Y32N 23 36
K4A-12 H-A16T 24 36
K5D-05 H-S31G 25 36
K5D-14 H-T28S 26 36
K4D-123 H-R44S 27 36
K4D-127 H-I69T 28 36
6C07 H-I69T 28 L-M4L, L-T20A 41
5C14 H-I69F 29 36
5C26 H-V67M 30 L-S27P 42
5C27 H-L45P 31 36
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5C60 H-E10K, HK12R 32 36
6013 H-G53E 33 36
6018 H-T93A 34 36
6054 H-S84P 35 L-M4L, L-S9P, LR31W 43
K4D-25 19 L-M4L 44
K4A-03 19 L-I33T 45
K4A-08 19 L-M4L, L-K39E 46
K5D-26 19 L-T22P 47
5008 19 L-Y32D 48
5010 19 L-S27P 42
5018 19 L-Q37H 49
5042 19 L-G97S 50
5044 19 L-S12P 51
5052 19 L-19A 52
5056 19 L-T72A 53
6003 19 L-R31W 54
6005 19 L-M4L, L-M39K 55
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6C16 19 L-I2N 56
6C17 19 L-G63C, L-W91C 57
6C28 19 L-R31G 58
725C02 19 L-I75F 59
725C17 19 L-I2T 60
725C21 19 L-I2T, L-K42R 61
725C33 19 L-Y49H 62
725C42 19 L-M4L, L-T20S, LK39E 63
725C44 19 L-S27P 42
725C57 19 L-T69P 64
Anticorpos anti-AMHRII. Fragmentos de ligação ao AMHRII ou derivados de ligação ao AMHRII de anticorpos anti-AMHRII
[00112] O termo “anticorpo é utilizado no sentido mais amplo e inclui anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de extensão completa ou intactos), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos (vide abaixo) contanto que apresentem a atividade biológica desejada.
[00113] Portanto, conforme utilizado neste documento, o termo “anticorpo coletivamente se refere a imunoglobulinas ou moléculas semelhantes a imunoglobulinas incluindo, a título de exemplo, e sem limitação, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, combinações das mesmas, e moléculas
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31/98 similares produzidas durante uma resposta imune em qualquer vertebrado, por exemplo, em mamíferos tais como humanos, caprinos, coelhos e camundongos, assim como espécies não mamíferas, tais como imunoglobulinas de tubarão. A menos que indicado especificamente em contrário, o termo “anticorpo inclui imunoglobulinas intactas e fragmentos de anticorpos ou fragmentos de ligação do antígeno que se ligam especificamente ao AMHRII para a exclusão substancial de ligação a outras moléculas (ou seja, moléculas não relacionadas a AMHRII). O termo “anticorpo também inclui formas geneticamente engenhadas, tais como anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos murines humanizados), anticorpos heteroconjugados (tais como anticorpos biespecíficos). Vide também Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.); Kuby, J., Immunology, 7th Ed., W.H. Freeman & Co., Nova York, 2013.
[00114] O termo “anticorpo monoclonal, conforme utilizado neste documento, se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto pelas possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em menores quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único antígeno. Além disso, contrariamente a preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epitopes), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador monoclonal não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a invenção podem ser produzidos pelo método hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al, Nature 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, a patente nQ US 4,816,567). Os anticorpos
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32/98 monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos fago utilizando-se as técnicas descritas em Clackson et al, Nature 352:624-628 (1991) ou Marks et al, J. Mol Biol. 222:581 -597 (1991), por exemplo.
[00115] O termo “fragmento de anticorpo se refere a uma porção de um anticorpo intacto e se refere às regiões antigênicas variáveis determinantes de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a, os fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, e Fv, anticorpos lineares, anticorpos scFv, e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[00116] Uma “cadeia pesada de anticorpos, conforme utilizada neste documento, se refere a o maior dentre dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes em todas as moléculas de anticorpo em suas conformações de ocorrência natural.
[00117] Uma “cadeia leve de anticorpos, conforme utilizada neste documento, se refere a o menor dentre dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes em todas as moléculas de anticorpo em suas conformações de ocorrência natural, as cadeias leves k e X se referem aos dois principais isotipos de cadeia leve de anticorpos.
[00118] Conforme utilizado neste documento o termo região determinante de complementariedade ou CDR se refere à parte de duas cadeias variáveis de anticorpos (cadeia leves e pesadas) que reconhecem e se ligam ao antígeno particular. As CDRs são a porção mais variável das cadeias variáveis e fornecem ao anticorpo sua especificidade. Existem três CDRs em cada uma das cadeias variáveis pesadas (VH) e variáveis leves (VF) e, portanto, existe um total de seis CDRs por molécula de anticorpo. As CDRs são primariamente responsáveis pela ligação a um epitopo de um antígeno. As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2, e CDR3, numeradas sequencialmente iniciando a partir do N-terminal, e também são tipicamente identificadas pela cadeia em que a CDR particular é localizada. Portanto, a VHCDR3 se localiza no domínio variável da cadeia
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33/98 pesada do anticorpo em que ela se encontra, enquanto uma VFCDR1 é a CDR1 do domínio variável da cadeia leve do anticorpo em que ela se encontra. Um anticorpo que se liga ao FHR terá uma sequência específica de região VH e região VF, e, portanto, sequências de CDR específicas. Anticorpos com diferentes especificidades (ou seja, diferentes sítios de combinação para diferentes antígenos) possuem diferentes CDRs. Embora sejam os CDRs que variam de anticorpo para anticorpo, apenas um número limitado de posições de aminoácidos dentro das CDRs é diretamente envolvido em ligação do antigeno. Essas posições dentro das CDRs são chamadas resíduos determinantes de especificidade (SDRs).
[00119] As regiões de framework (doravante FR) são os resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de CDR. Cada domínio variável tipicamente possui quatro FRs identificadas como FR1, FR2, FR3 e FR4. Se as CDRs forem definidas de acordo com Rabat, os resíduos de FR de cadeia leve são posicionados aproximadamente nos resíduos 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), e 98-107 (LCFR4) e os resíduos de FR de cadeia pesada são posicionados aproximadamente nos resíduos 1 -30 (HCFR1), 3649 (HCFR2), 66- 94 (HCFR3), e 103-113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada.
[00120] Os fragmentos de anticorpos Fv de cadeia única ou scFv compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Em termos gerais, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente um ligante de polipeptídeos entre os domínios VH e VL, que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação do antigeno. Para uma revisão do scFv, vide Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds. Springer- Verlag, Nova York, pp. 269-315 (1994).
[00121] O termo diacorpos se refere a pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação do antigeno, em que os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um
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34/98 domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH e VL). Utilizando-se um ligante que seja demasiado curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criam dois sítios de ligação do antígeno. Os diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).
[00122] Os diacorpos ou anticorpos biespecíficos podem ser praticamente divididos em duas categorias: moléculas semelhantes à imunoglobulina G (IgG) e moléculas não semelhantes à IgG. Os bsAbs semelhantes a IgG retêm funções efetoras mediadas por Pc tais como citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC), e fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) (Spiess et al., 2015, Mol Immunol., Vol. 67(2): 95-106.). A região Pc de bsAbs facilita a purificação e melhora a solubilidade e a estabilidade. Anticorpos biespecíficos em formatos semelhantes a IgG geralmente possuem meias-vidas de soro mais longas em razão de seu maior tamanho e reciclagem mediada por PcRn (Kontermann et al., 2015, Bispecific antibodies, medicamento Discov Today Vol. 20(7): 838-47). Os bsAbs não semelhantes a IgG são menores, levando a uma penetração aprimorada no tecido (Kontermann et al., 2015, Bispecific antibodies, medicamento Discov Today Vol. 20(7): 838-47).
[00123] De acordo com algumas modalidades preferenciais, anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção compreendem (i) um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga ao AMHRII e (ii) um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga a um antígeno alvo distinto do AMHRII e particularmente um antígeno alvo que pode ser expressado por células cancerosas ou células imunes do microambiente tumoral tais como células T, NK ou macrófagos. Em algumas modalidades, em tais anticorpos biespecíficos, o referido segundo sítio de ligação de antígeno se liga a um
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35/98 antígeno alvo que é o CD3 e permite o engajamento de células T. Este antígeno alvo também pode ser PDL1 para desbloquear as células T ou CD 16 para ativar as NK ou macrófagos.
[00124] Os anticorpos monoclonais especificados neste documento incluem especificamente anticorpos anti-AMHRII “quiméricos” (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que apresentem a atividade biológica desejada (patente nQ US 4,816,567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 :6851-6855(1984)).
[00125] Os anticorpos monoclonais especificados neste documento também incluem anticorpos humanizados anti-AMHRII. Formas “humanizadas” de anticorpos não-humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), tais como camundongo, rato, coelho ou primata não humano com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de framework Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não sejam encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá
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36/98 substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os loops hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
[00126] Os anticorpos monoclonais anti-AMHRII especificados neste documento incluem adicionalmente anticorpos humanos anti-AMHRII. Um anticorpo humano é um anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um humano e/ou foi produzido utilizando-se qualquer uma das técnicas para produção de anticorpos humanos conforme divulgadas neste documento. Esta definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação de antígeno não humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando-se diversas técnicas conhecidas no estado da técnica. Em uma modalidade, o anticorpo humano é selecionado de uma biblioteca de fagos, em que essa biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309314 (1996): Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 (1991)). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos introduzindo-se loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos em que os genes de imunoglobulina endógena foram parcialmente ou completamente inativados. Mediante contestação, a produção de anticorpos humanos é observada, que se assemelha intimamente à observada em humanos em todos aspectos,
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37/98 incluindo rearranjo gênico, montagem, e repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, em nas patentes dos EUA de nQ 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, e nas seguintes publicações científicas: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). De forma alternativa, o anticorpo humano pode ser preparado via imortalização dos linfócitos B humanos produzindo um anticorpo direcionado contra um antígeno alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou podem ser imunizado in vitro). Vide, por exemplo, Cole et al, Monoclonal Antibodies and Terapia para câncer, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991); e Pat. nQ US 5,750,373.
[00127] Conforme utilizado neste documento, mutante de anticorpo ou variante de anticorpo se referem a uma variante de sequência de aminoácidos do anticorpo dependente de espécie em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos do anticorpo dependente de espécie foram modificados. Tais mutantes possuem necessariamente menos do que 100% de identidade ou similaridade de sequência com o anticorpo dependente de espécie. Em uma modalidade, o mutante de anticorpo terá uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade ou similaridade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve ou pesada do anticorpo dependente de espécie, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, e mais preferencialmente pelo menos 95%. A identidade ou a similaridade em relação a esta sequência é definida neste documento como uma porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos (ou seja, mesmo resíduo) ou similar (ou seja, resíduo de aminoácido do mesmo grupo com
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38/98 base em propriedades comuns de cadeia lateral, vide abaixo) com os resíduos de anticorpo dependente de espécie, após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para alcançar a máxima porcentagem de identidade de sequência. Nenhum dentre o N-terminal, o C-terminal, ou extensões, exclusões ou inserções internas na sequência de anticorpo fora do domínio variável deve ser interpretado como afetando a identidade ou similaridade de sequência.
[00128] Anticorpos humanizados podem ser produzidos pela obtenção de sequências de ácidos nucleicos que codificam os domínios de CDR e construção de um anticorpo humanizado de acordo com técnicas conhecidas no estado da técnica.
[00129] Métodos para produção de anticorpos humanizados com base em técnicas convencionais de DNA recombinante e transfecção gênica são conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger M S. et al. 1985). Os anticorpos podem ser humanizados utilizando-se uma variedade de técnicas conhecidas no estado da técnica incluindo, por exemplo, enxertamento de CDR (EP 239,400; Publicação PCT WO91/09967; nas patentes dos EUA de nQ 5,225,539; 5,530,101; e 5,585,089), laminação ou recomposição de superfície (EP 592,106; EP 519,596; Padlan E A (1991); Studnicka G M et al. (1994); Roguska M A. et al. (1994)), e embaralhamento de cadeia (Pat. nQ US 5,565,332). A tecnologia geral de DNA recombinante para a preparação de tais anticorpos também é conhecida (vide Pedido de patente europeu EP 125023 e pedido de patente internacional WO 96/02576).
[00130] Pode ser desejável modificar um anticorpo anti-AMHRII especificado neste documento com relação à função efetora, por exemplo, a fim de aprimorar a citotoxicidade mediada por células dependentes de antígeno (ADCC) e/ou a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isso pode ser alcançado introduzindo-se uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. De forma
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39/98 alternativa ou adicional, o(s) resíduo(s) de cisteína pode(s) ser introduzido(s) na região Fc, permitindo assim a formação de ligação de dissulfeto intercadeia nesta região. O anticorpo homodimérico gerado desse modo pode ter uma melhor capacidade de internalização e/ou melhor destruição celular mediada pelo complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Vide Caron et al, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade antitumoral aprimorada também podem ser preparados utilizando ligantes cruzados heterobifuncionais conforme descrito em Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). De forma alternativa, pode-se engenhar um anticorpo que possua Fcs de região dupla e podem, assim, possuir uma lise de complemento aprimorada e Capacidades de ADCC. Vide Stevenson et al. Anticâncer medicamento Design 3:219-230 (1989). O WO00/42072 (Presta, L.) descreve anticorpos com função aprimorada de ADCC na presença de células efetoras humanas, onde os anticorpos compreendem substituições de aminoácidos em sua região Fc. Preferencialmente, o anticorpo com ADCC aprimorado compreende substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos da UE). Preferencialmente, a região Fc alterada é uma região Fc de IgGI humana compreendendo ou consistindo em substituições em uma, duas ou três dessas posições. Tais substituições são opcionalmente combinadas com substituição(ões) que aumentem a ligação Clq e/ou CDC.
[00131] Anticorpos com ligação Clq alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) são descritos em W099/51642, patente nQ US 6,194,551B1, patente nQ US 6,242,195B1, patente nQ US 6,528,624B1 e patente nQ US 6,538,124 (Idusogie et al). Os anticorpos compreendem uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 e/ou 334 de sua região Fc (Numeração de resíduos da UE).
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[00132] Em algumas modalidades, Agentes de ligação ao AMHRII incluem anticorpo glicoengenhados anti-AMHRII.
[00133] Conforme utilizado neste documento, o termo glicoengenharia se refere a qualquer método reconhecido pela técnica para alterar o perfil de glicoforma da composição de proteína de ligação. Tais métodos incluem a expressão da composição de proteína de ligação em uma célula hospedeira geneticamente engenhada (por exemplo, uma célula CHO) que foi geneticamente engenhada para expressar uma glicosiltransferase ou glicosidase heteróloga. Em outras modalidades, os métodos de glicoengenharia compreendem cultivar uma célula hospedeira sob condições que inclinem para perfis particulares de glicoforma.
[00134] Conforme utilizado neste documento, um “anticorpo glicoengenhado” inclui (i) um anticorpo compreendendo um fragmento Fc hipergalactosilado, (ii) um anticorpo compreendendo um fragmento Fc hipomanosilado, que inclui um fragmento Fc amanosilado, e (iii) um anticorpo compreendendo um fragmento Fc hipofucosilado, que inclui um fragmento Fc afucosilado. Conforme utilizado neste documento, um fragmento glicoengenhado inclui um fragmento Fc com uma glicosilação alterada que é selecionado dentre um grupo compreendendo uma ou mais das seguintes glicosilações alteradas (i) hiper-galactosilação, (ii) hipo-manosilação e (iii) hipo-fucosilação. Por conseguinte, um fragmento Fc glicoengenhado de um anticorpo anti-AMHRII conforme utilizado de acordo com a invenção inclui os exemplos ilustrativos de um fragmento Fc hipergalactosilado, um hipomanosilado e um hipo-fucosilado.
[00135] O versado na técnica pode se referir a técnicas conhecidas para obter anticorpos anti-AMHRII compreendendo hiperfragmentos Fc galactosilados, fragmentos Fc hipomanosiladoos e fragmentos Fc hipofucosilados que são conhecidos por se ligarem aos Receptore Fc com uma maior afinidade do que fragmentos Fc não modificados.
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[00136] Anticorpos anti-AMHRII glicoengenhados incluem anticorpos anti-AMHRII compreendendo um fragmento Fc hipofucosilado, que também pode ser designado como a fragmento Fc de “baixa fucose”.
Conjugados fármaco-anticorpo particularmente conjugados anticorpo-medicamento (ADC)
[00137] Agentes de ligação ao AMHRII que podem ser utilizados para os fins da presente invenção incluem anticorpos especificados neste documento que são conjugados para um agente citotóxico tal como um agente quimioterápico, toxina (ou seja, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos), ou um isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado). Tais conjugados de anticorpo incluem os descritos no pedido PCT n° WO 2017/025458. O pedido PCT n° WO 2017/025458 divulgou particularmente o anticorpo anti-AMHRII 3C23K, assim como os conjugados ADC 3C23K, para o que a atividade anticâncer in vivo é mostrada neste documento contra cânceres humanos não-ginecológicos.
[00138] Agentes citotóxicos incluem toxinas enzimaticamente ativas. Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não ligantes de toxina de difteria, cadeia de exotoxina (da Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modeccina, alfa-sarcina, Proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.
[00139] Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados.
[00140] Conjugados do anticorpo e agente citotóxico são produzidos utilizando-se uma variedade de agentes de acoplamento de
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42/98 proteína bifuncional tais como aqueles divulgados no pedido PCT n° WO 2017/025458.
[00141] Conjugados fármaco-anticorpo preferenciais de conjugados ADC de anticorpo anti-AMHRII são aqueles descritos no pedido PCT n° WO 2017/025458.
Células CAR, incluindo células CAR T, células CAR NK e macrófaqos CAR
[00142] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao AMHRII humano é um receptor de ligação ao AMHRII ou uma célula que expressa o receptor de ligação ao AMHRII, e particularmente um receptor de ligação ao AMHRII que expressa a célula CAR T, uma célula NK do receptor de ligação ao AMHRII, ou um macrófago CAR que expressa o receptor de ligação ao AMHRII.
[00143] Portanto, em algumas modalidades, o agente de ligação ao AMHRII humano é um receptor engenhado de ligação ao AMHRII, e mais preferencialmente um receptor engenhado de ligação ao AMHRII para que sua região de ligação ao AMHRII deriva de um anticorpo monoclonal antiAMHRII divulgado no presente relatório descritivo.
[00144] Tipicamente, o receptor engenhado de ligação ao AMHRII consiste em um Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) compreendendo (i) um domínio extracelular, (ii) um domínio de transmembrana e (iii) um domínio intracelular, e em que o domínio extracelular é uma fração de ligação ao AMHRII que deriva de um anticorpo anti-AMHRII monoclonal divulgado no presente relatório descritivo. Em algumas modalidades, o domínio extracelular do referido receptor engenhado de ligação ao AMHRII compreende (i) uma cadeia de anticorpos VH compreendendo as CDRs derivadas de um anticorpo anti-AMHRII monoclonal divulgado neste documento e (ii) uma cadeia de anticorpos VL compreendendo as CDRs derivadas de um anticorpo anti-AMHRII monoclonal divulgado neste documento. Em algumas modalidades, o domínio extracelular do referido
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43/98 receptor engenhado de ligação ao AMHRII compreende a cadeia VH e a cadeia VL de um anticorpo anti-AMHRII monoclonal divulgado neste documento. Em algumas modalidades, o domínio extracelular do referido receptor engenhado de ligação ao AMHRII é um ScFv compreendendo as CDRs derivadas da cadeia VH e da cadeia CH de um anticorpo anti-AMHRII monoclonal divulgado no presente relatório descritivo, respectivamente. Em algumas modalidades, o domínio extracelular do referido receptor engenhado de ligação ao AMHRII é um ScFv compreendendo a cadeia VH e a cadeia CH de um anticorpo anti-AMHRII monoclonal divulgado no presente relatório descritivo, respectivamente.
[00145] Também é incluído neste documento um agente de ligação ao AMHRII consistindo em uma célula que expressa um tal receptor de ligação ao AMHRII, e particularmente uma célula CAR T, uma célula CAR NK ou um macrófago CAR que expressa um tal receptor de ligação ao AMHRII.
[00146] O termo “Receptor de Antígeno Quimérico” (CAR), conforme utilizado neste documento, se refere a uma proteína fundida compreendendo um domínio extracelular capaz de se ligar a um antígeno, um domínio de transmembrana derivado de um polipeptídeo diferente de um polipeptídeo do qual o domínio extracelular é derivado, e pelo menos um domínio intracelular. O “Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)” é às vezes chamado de um “receptor quimérico”, um “corpo T”, ou um “receptor imune quimérico (CIR).” O “domínio extracelular capaz de se ligar ao AMHRII” significa qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo que possa se ligar ao AMHRII. O “domínio intracelular” significa qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo conhecido por funcionar como um domínio que transmite um sinal para causar a ativação ou a inibição de um processo biológico em uma célula. O “domínio de transmembrana” significa qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo conhecido por abranger a membrana celular e que pode funcionar para ligar the os domínios extracelular e de sinalização. Um
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Receptor de Antígeno Quimérico pode opcionalmente compreender um “domínio de articulação” que serve como um ligante entre os domínios extracelular e de transmembrana.
[00147] As células T CAR são células T autólogas geneticamente engenhadas em que fragmentos de anticorpos (scFv) de cadeia única ou ligantes são ligados ao domínio de sinalização da célula T capaz de facilitar a ativação da célula T (Maher, J. (2012) ISRN Oncol.2012:278093; Curran,
K.J. et al. (2012) J. Gene Med.14:405-415; Fedorov, V.D. et al. (2014) Cancer J.20:160-165; Barrett, D.M. et al. (2014) Annu. Rev. Med.65:333-347).
[00148] Por domínio de sinalização intracelular entende-se a porção do CAR que é encontrada ou é engenhada para ser encontrada dentro da céula T. O “domínio de sinalização intracelular pode ou pode também não conter um domínio de transmembrana que ancora o CAR na membrana plasmática de uma célula T. Em uma modalidade, o “domínio de transmembrana e o “domínio de sinalização intracelular são derivados da mesma proteína (ou seja, CD3Q em outras modalidades; o domínio de sinalização intracelular e o domínio de transmembrana são derivados de diferentes proteínas (ou seja, o domínio de transmembrana de uma CD3Ç e domínio de sinalização intracelular de uma molécula CD28, ou vice-versa).
[00149] Por endodomínio coestimulatório entende-se um domínio de sinalização intracelular ou seu fragmento que é derivado de uma molécula coestimulatória de célula T. Uma lista não limitante de Moléculas coestimulatórias de célula T inclui CD3, CD28, OX-40, 4-1 BB, CD27, CD270, CD30 e ICOS. O endodomínio coestimulatório pode ou pode não incluir um domínio de transmembrana do mesmo ou de um endodomínio coestimulatório diferente.
[00150] Por domínio de ligação de antígeno extracelular entende-se a porção do CAR que reconhece e se liga especificamente ao AMHRII.
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[00151] Em modalidades preferenciais, o domínio de ligação extracelular é derivado de um anticorpo anti-AMHRII monoclonal. Por exemplo, o “domínio de ligação extracelular pode incluir todos ou parte de um domínio Fab de um anticorpo monoclonal. Em certas modalidades, o “domínio de ligação extracelular inclui as regiões de determinação complementar de um anticorpo anti-AMHRII monoclonal particular. Em ainda outra modalidade, o “domínio de ligação extracelular é a fragmento variável de cadeia única (scFv) obtida de um anticorpo anti-AMHRII monoclonal especificados neste documento.
[00152] Em modalidades preferenciais, o domínio de ligação extracelular é derivado de qualquer um dentre os anticorpos monoclonais anti-AMHRII descritos no presente relatório descritivo e particularmente do anticorpo anti-AMHRII monoclonal 3C23K.
/. Domínio de ligação de antígeno extracelular
[00153] Em uma modalidade, o CAR da presente invenção compreende um domínio de ligação de antígeno extracelular de um dos anticorpos monoclonais anti-AMHRII descritos neste documento.
[00154] Em uma modalidade, o domínio de ligação extracelular compreende as seguintes sequências de CDR:
- CDRL-1: RASX1X2VX3X4X5A (SEQ ID NQ 65), onde XI e X2 são, independentemente, S ou P, X3 é R ou W ou G, X4 é T ou D, e X5 é I ou T;
- CDRL-2 é PTSSLX6S (SEQ ID NQ 66) onde X6 é K ou E; e
- CDRL-3 é LQWSSYPWT (SEQ ID NQ 67);
- CDRH-1 é KASGYX7FTX8X9HIH (SEQ ID NQ 68) onde X7 é S ou T, X8 é S ou G e X9 é Y ou N;
- CDRH-2 é WIYPX10DDSTKYSQKFQG (SEQ ID NQ 69) onde X10 é G ou E e
- CDRH-3 é GDRFAY (SEQ ID NQ 70)
II. Ligante entre os domínios VL e VH de KappaMab scFv
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[00155] Em uma modalidade adicional, o VL do anti-AMHRII é ligado ao VH do anti-AMHRII por meio de um ligante flexível. Especificamente, o ligante flexível é um ligante de glicina/serina de cerca de 10-30 aminoácidos (por exemplo 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, ou 5 aminoácidos) e compreende a estrutura (Gly4Ser)3.
III. Espaçadores entre o domínio de ligação de antígeno extracelular e o domínio de sinalização intracelular
[00156] O domínio de ligação de antígeno extracelular é ligado ao domínio de sinalização intracelular pelo uso de um espaçador. O espaçador é configurado para ser flexível o suficiente para permitir a orientação do domínio de ligação de antígeno de tal modo que facilite o reconhecimento e a ligação do antígeno. O espaçador pode derivar das próprias imunoglobulinas do anti-AMHRII e pode incluir a região de articulação de IgGI ou a região CH2 e/ou CH3 de uma IgG.
IV. Domínio de sinalização intracelular
[00157] O domínio de sinalização intracelular compreende toda ou parte da cadeia CD3. CD, também conhecido como CD247, juntamente com o correceptor celular CD4 ou CD8 T é responsável por acoplar o reconhecimento do antígeno extracelular a cascatas de sinalização intracelular.
[00158] Adicionalmente à inclusão do domínio de sinalização da CD3Ç, foi demonstrado que a inclusão de moléculas coestimulatórias aprimora a atividade da célula CAR T em modelos murines e ensaios clínicos. Diversas foram investigadas, incluindo CD28, 4- IBB, ICOS, CD27, CD270, CD30 e OX-40.
[00159] Em certas modalidades, métodos de produção de Células que expressam o CAR são divulgados compreendendo, ou de forma alternativa consistindo essencialmente em: (i) transduzir uma população de células isoladas com uma sequência de ácidos nucleicos que codificam o CAR e (ii) selecionar uma subpopulação de células que foram exitosamente
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47/98 transduzidas com a referida sequência de ácidos nucleicos da etapa (i). Em algumas modalidades, as células isoladas são células T, uma célula T animal, uma célula T de mamífero, uma célula T de felino, uma célula T de canino ou uma célula T humana, produzindo assim as células CAR T. Em certas modalidades, a célula isolada é uma célula NK, por exemplo, uma célula NK animal, uma célula NK de mamífero, uma célula NK de felino, uma célula NK canina ou uma célula NK humana, produzindo assim células NK CAR.
Aplicações terapêuticas de células CAR T, células NK CAR T e macrófagos CAR.
[00160] As células CAR, que incluem as células CAR T, as células CAR NK e os macrófagos CAR descritos neste documento, podem ser utilizados para tratar tumores pulmorares que expressam o AMHRII. As células CAR da presente invenção são preferencialmente utilizadas para tratar tumores pulmorares que expressam o AMHRII em pacientes afetados por um câncer de pulmão descrito neste documento, e particularmente um câncer de pulmão de células não pequenas ou um câncer de pulmão de células pequenas.
[00161] As células CAR da presente invenção podem ser administradas por si só ou em combinação com diluentes, agentes terapêuticos conhecidos, e/ou com outros componentes tais como citocinas ou outras populações celulares que sejam imunoestimuladoras.
[00162] Aspectos do método da presente divulgação se referem a métodos para inibir o crescimento de um tumor em um indivíduo em necessidade dos mesmos e/ou para tratar a paciente de câncer em necessidade dos mesmos. Em algumas modalidades, o tumor é um tumor pulmonar sólido.
[00163] As células CAR conforme divulgadas neste documento podem ser administradas por si só ou em combinação com diluentes, agentes terapêuticos conhecidos, e/ou com outros componentes tais como
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48/98 citocinas ou outras populações celulares que sejam imunoestimuladoras. Elas podem ser de primeira linha, segunda linha, terceira linha, quarta linha, ou terapia adicional. Elas podem ser combinadas com outras terapias. Exemplos não limitantes incluem quimioterapias ou terapias biológicas. Regimes adequados de tratamento serão determinados pelo veterinário ou médico responsável pelo tratamento.
[00164] Composições farmacêuticas compreendendo o CAR da presente invenção podem ser administradas de uma forma apropriada para uma doença a ser tratada ou prevenida. A quantidade e a frequência de administração serão determinadas por fatores como a condição do paciente, e o tipo e a gravidade da doença do paciente, embora dosagens apropriadas possam ser determinadas por ensaios clínicos.
Aplicações terapêuticas
[00165] Como já divulgado em outro lugar no presente relatório descritivo, os agentes de ligação ao AMHRII divulgados neste documento, que incluem (i) os anticorpos anti-AMHRII divulgados neste documento, (ii) os conjugados fármaco-anticorpos divulgados neste documento e (iii) as células CAR (incluindo as células CAR T, as células CAR NK e os macrófagos CAR) divulgados neste documento, consistem em ingredientes ativos que podem ser utilizados para prevenção ou tratamento de cânceres de pulmão que expressam o AMHRII, particularmente câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) e mais precisamente um CPCNP selecionado dentre um grupo compreendendo CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes e CPCNP carcinoma de células escamosas e CPCNP neuroendócrino.
[00166] Métodos de tratamento de câncer que fazem uso de anticorpos de antígeno antitumoral ou células CAR de antígeno antitumoral são conhecidos pelo versado na técnica.
[00167] Em algumas modalidades, pacientes de câncer são testados para determinar se suas células tumorais expressam o AMHRII a
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49/98 seu surface, antes de realizar um tratamento com um agente de ligação ao AMHRII, tais como um anticorpo anti-AMHRII, um anti-AMHRII ADC ou um anti-AMHRII Células CART.
[00168] Um tal ensaio preliminar para detectar a expressão de membrana do AMHRII é preferencial para o tratamento dos cânceres de pulmão que expressam o AMHRII com uma baixa frequência. Em contrapartida, um tal ensaio preliminar para detectar expressão de membrana do AMHRII não pode ser realizado para o tratamento de cânceres que expressam o AMHRII em uma alta frequência, tal como, ilustrativamente, o CPCNP epidermóide.
[00169] Portanto, em algumas modalidades, esta invenção diz respeito a um agente de ligação ao AMHRII conforme especificado neste documento para uso na prevenção ou tratamento de um indivíduo afetado por um câncer de pulmão de AMHRII positivo, que inclui um câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) e particularmente um CPCNP selecionado dentre um grupo compreendendo CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes, CPCNP carcinoma de células escamosas, CPCNP carcinoma de células pleomórficas e CPCNP neuroendócrino.
[00170] Esta invenção diz respeito ao uso de um agente de ligação ao AMHRII para a preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento de um indivíduo afetado por um câncer de pulmão de AMHRII positivo, que inclui um câncer de pulmão, que inclui um câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) e particularmente um CPCNP selecionado dentre um grupo compreendendo CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes, carcinoma de células escamosas NSCL, CPCNP carcinoma de células pleomórficas e CPCNP neuroendócrino.
[00171] Esta invenção também diz respeito a um método para prevenção ou tratamento de um indivíduo afetado por um câncer de pulmão
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50/98 de AMHRII positivo, que inclui um câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) e particularmente um CPCNP selecionado dentre um grupo compreendendo CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes, CPCNP carcinoma de células escamosas, CPCNP carcinoma de células pleomórficas e CPCNP neuroendócrino, em que o referido método compreende uma etapa de administrar ao referido indivíduo um agente de ligação anti-AMHRII.
[00172] Um indivíduo pode ser atribuído como sendo um indivíduo afetado por um câncer AMHRII positivo realizando-se um método de detectar a expressão proteica do AMHRII na superfície celular em uma amostra de tecido pulmomar canceroso previamente obtida do referido indivíduo. A detecção da expressão proteica do AMHRII na superfície celular pode ser realizada de acordo com uma variedade de métodos que são conhecidos pelo versado na técnica. Métodos de detecção da expressão proteica do AMHRII na superfície celular incluem particularmente métodos de imunohistoquímica, assim como métodos de separação de células ativadas por fluorescência que são ilustrados nos exemplos contidos neste documento.
[00173] Esta invenção também diz respeito a um método para determinar se um indivíduo é elegível para um tratamento de câncer de pulmão com um agente de ligação ao AMHRII, ou seja, se um indivíduo é responsive a um tratamento de câncer de pulmão com um agente de ligação ao AMHRII, em que o referido método compreende a etapa de determinar se uma amostra de tecido pulmonar tumoral previamente obtida do referido indivíduo expressa a proteína do AMHRII na superfície celular.
[00174] Portanto, esta invenção também diz respeito a um método para determinar se um indivíduo que é afetado por um câncer de pulmão, em particular um câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP), e particularmente um CPCNP selecionado dentre um grupo compreendendo CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes e CPCNP carcinoma de células escamosas e CPCNP neuroendócrino, é
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51/98 elegível para um tratamento de câncer com um agente de ligação ao AMHRII, ou seja, é responsive a um tratamento de câncer com um agente de ligação ao AMHRII, em que o referido método compreende as etapas de:
a) determinar se as células cancerosas do referido paciente expressam o AMHRII em sua membrana, e
b) concluir que o referido paciente é elegível para um tratamento de câncer de pulmão com um agente de ligação ao AMHRII, ou seja, é responsive a um tratamento de câncer de pulmão com um agente de ligação ao AMHRII se a expressão de membrana de AMHRII pelas referidas células cancerosas pulmonares foi determinada uma etapa a).
[00175] Em modalidades preferenciais do referido método, conclui-se na etapa b) que o referido paciente é elegível (ou seja, responsive) a um tratamento de câncer de pulmão com um agente de ligação ao AMHRII quando (i) um valor de pontuação de expressão do AMHRII é determinado na etapa a) e quando (ii) o referido valor de pontuação de expressão do AMHRII é correspondente a um valor limiar de pontuação ou superior. O valor de pontuação do AMHRII é mais preferencialmente calculado utilizando-se a fórmula (I) descrita em outro lugar no presente relatório descritivo.
[00176] Portanto, de acordo com modalidades preferenciais, a etapa a) do método é realizada por um método imuno-histoquímico, tal como mostrado nos exemplos contidos neste documento.
[00177] As células cancerosas que são utilizadas na etapa a) em termos gerais se originam de uma amostra de biópsia do tecido que tenha sido previamente coletada do referido paciente de câncer.
[00178] Preferencialmente, a etapa a) é realizada utilizando-se um anticorpo anti-AMHRII selecionado entre aqueles especificamente descritos no presente relatório descritivo, e particularmente a anticorpo 3C23K, cuja ligação ao AMHRII pode ser detectada utilizando-se um anticorpo secundário
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52/98 rotulado de acordo com técnicas conhecidas de detecção de anticorpos, tais como aquelas divulgadas nos exemplos contidos neste documento.
[00179] Preferencialmente, um paciente afetado por um câncer de pulmão compreendido no grupo listado acima de cânceres de pulmão é determinado como sendo elegível (ou seja, responsive) a um tratamento de câncer de pulmão com um agente de ligação ao AMHRII quando um valor de pontuação de expressão do AMHRII membranoso de 1,0 ou mais for determinado em a amostra de células cancerosas originárias do referido paciente de câncer, realizando-se um método de pontuação que permita a determinação da valor E-SCORE de acordo com a fórmula (I) abaixo:
E-SCORE=FREQ x AMHRIILEVEL, em que
- E-SCORE significa o valor de pontuação de expressão do AMHRII membranoso para uma dada amostra de células cancerosas,
- FREQ significa a frequência das células contidas na referida amostra de células de câncer de pulmão para as quais a expressão de membrana do AMHRII é detectada, e
- AMHRII LEVEL significa o nível de expressão membranosa do AMHRII por células que expressam o AMHRII contidas na referida dada amostra de células de câncer de pulmão.
[00180] Portanto, a presente invenção também diz respeito a um método para tratar um paciente afetado por um câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) em que o referido método compreende as etapas de:
a) determinar se uma amostra de tecido tumoral previamente obtida do referido indivíduo expressa a proteína do AMHRII na superfície celular, e
b) tratar o referido indivíduo com um agente de ligação ao AMHRII se a expressão na superfície celular do AMHRII tiver sido determinada na etapa a).
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[00181] Na maioria das modalidades preferenciais, a expressão do AMHRII é determinada na etapa a) quando a referida amostra tumoral possui um valor de pontuação de expressão do AMHRII membranoso “E-SCORE” calculado de acordo com a fórmula descrita acima (I) de 1,0 ou mais, o que inclui um valor E- SCORE de 1,5 ou mais.
[00182] Na maioria das modalidades preferenciais do método acima, o referido agente de ligação ao AMHRII consiste em um anticorpo anti-AMHRII ou seu fragmento conforme especificado neste documento, ou de uma célula CAR (ou seja, uma célula CAR T ou uma célula CAR NK) conforme especificada neste documento.
[00183] Em algumas modalidades, o referido agente de ligação ao AMHRII é utilizado como o único ingrediente ativo anticâncer.
[00184] Em algumas outras modalidades, o tratamento anticâncer com o referido agente de ligação ao AMHRII também compreende submeter o referido indivíduo a um ou mais tratamentos anticâncer adicionais, que incluem tratamento radioterápico e tratamento quimioterápico.
[00185] Portanto, de acordo com tais modalidades adicionais, o tratamento anticâncer com o referido agente de ligação ao AMHRII também compreende a administração ao referido indivíduo de um ou mais ingredientes ativos anticâncer adicionais.
Terapias de combinação
[00186] Como mostrado nos exemplos contidos neste documento, terapias eficazes para câncer de pulmão incluem aquelas em que um anticorpo anti-AMHRII monoclonal é combinado com um ou mais agente(s) anticâncer distinto(s). Os exemplos contidos neste documento ilustram terapias combinadas contra o câncer de pulmão, em que um anticorpo antiAMHRII é combinado com docetaxel ou com uma combinação de cisplatina e gemcitabina.
[00187] Um “agente anticâncer” é definido como qualquer molécula que possa interferir com a biossíntese de macromoléculas (DNA,
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RNA, proteínas etc.) ou inibir a proliferação celular, ou levar à morte celular por apoptose ou citotoxicidade, por exemplo. Entre os agentes anticâncer, pode-se mencionar agentes alquilantes, inibidores topoisomerase e agentes intercaladores, antimetabólitos, agentes de divagem, agentes que interferem com a tubulina, anticorpos monoclonais.
[00188] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” se refere a um material não tóxico que seja compatível com um sistema biológico tal como uma célula, uma cultura celular, um tecido ou um organismo.
[00189] De acordo com um aspecto particular, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo, como ingrediente ativo, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, um agente anticâncer e um AMHR-II que se liga ao anticorpo, e particularmente um anticorpo anti-AMHRII descrito neste documento.
[00190] Em algumas modalidades, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo, como ingrediente ativo, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, um agente anticâncer, e um AMHR-II que se liga ao anticorpo, e particularmente um anticorpo anti-AMHRII descrito neste documento.
[00191] Em algumas modalidades, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo, como ingrediente ativo, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, um agente anticâncer, e um AMHR-II que se liga ao anticorpo, em que o agente anticâncer é selecionado dentre um grupo compreendendo docetaxel, cisplatina, gemcitabina e uma combinação de cisplatina e gemcitabina.
[00192] Outros agentes anticâncer que podem ser utilizados em combinação com um anticorpo anti-AMHRII incluem paclitaxel ou um sal de platina tal como oxaliplatina, cisplatina e carboplatina.
[00193] O agente anticâncer também pode ser selecionado dentre agentes quimioterápicos diferentes dos sais de platina, moléculas pequenas, anticorpos monoclonais, senão pepticorpos antiangiogênese.
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[00194] Os agentes quimioterápicos diferentes dos sais de platina incluem os agentes intercaladores (bloqueio de replicação e transcrição de DNA), tais como as antracilinas (doxorrubicina, doxorrubicina lipossomal pegilado), os inibidores de topoisomerase (camptotecina e derivados: Karenitecina, topotecano, irinotecano), senão SJG-136, os inibidores de histona deacetilase (vorinostat, belinostat, ácido valproico), os agentes alquilantes (bendamustina, glufosfamida, temozolomida), the alcalóides vegetais antimitóticos, tais como os taxanos (docetaxel, paclitaxel), os alcalóides da vinca (vinorelbina), as epotilonas (epotilona ZK, ixabepilona), os antimetabólitos (gemcitabina, elacitarabina, capecitabina), inibidores (ispinesib) da proteína cinesina do fuso (KSP), trabectedina, senão ombrabulina (derivado de combretastatina A-4).
[00195] Dentre as pequenas moléculas existem os inibidores de pol-(ADP-ribose)polimerase (PARP): olaparibe, iniparibe, veliparibe, rucaparibe, CEP-9722, MK-4827, BMN-673, os inibidores de quinase, tais como the inibidores de tirosina-quinase (TKI) entre os quais pode-se mencionar as moléculas anti-VEGFR (sorafenibe, sunitinibe, cediranibe, vandetanibe, pazopanibe, BIBF 1120, semaxanibe, cabozantinibe, motesanibe), as moléculas anti-HER2/EGFR (erlotinibe, gefitinibe, lapatinibe), as moléculas anti-PDGFR (imatinibe, BIBF 1120), as moléculas anti-FGFR (BIBF 1120), os inibidores de tirosina-quinase/aurora quinase (ENMD-2076), o ilnibidor de quinase Src/Abl (saracatinibe), ou também perifosina, temsirolimo (inibidor de mTOR), alvocidibe (inibitor de quinase dependente de ciclina), proteína de volasertibe (inibidor de PFK1 (quinase do tipo polo 1), FY2606368 (inibidor de quinase checkpoint 1 (chk 1), GDC0449 (inibidor de caminho de ouriço), zibotentano (antagonista do receptor ETA), bortezomibe, carfilzomibe (inibidor de proteassoma), citocinas tais como IL-12, IL-18, IL-21, INF-alfa, INF-gama.
[00196] Dentre os anticorpos, pode-se mencionar o anti-VEGF: bevacizumabe, o anti-VEGFR: ramucirumabe, os anti-HER2/EGFRs:
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56/98 trastuzumabe, pertuzumabe, cetuximabe, panitumumabe, MGAH22, matuzumabe, anti-PDGFR alfa: IMC-3G3, o receptor anti-folato: farletuzumabe, o anti-CD27: CDX-1127, o anti-CD56: BB-10901, o antiGDI 05: TRC105, o anti-CD276: MGA271, o anti-AGS-8: AGS-8M4, o antiDRS: TRA-8, o anti-HB-EGF: KHK2866, os antimesotelinas: amatuximabe, BAY 94-9343 (imunotoxina), catumaxomabe (anticorpo bispecifico EpCAM/CD3), o anti-IF2R: daclizumabe, o anti-IGF- 1R: ganitumabe, o antiCTFA-4: ipilimumabe, o anti-PDI: nivolumabe e pembrolizumabe, o antiCD47: Weissman B6H12 e Hu5F9, Novimmune 5A3M3, INHIBRX 2A1, Anticorpos VxP037-01FCI de Frazier, os anti-Fewis Y: Hu3S193, SGN-15 (imunotoxina), o anti-CA125: oregovomabe, o anti-HGF: rilotumumabe, o anti-IF6: siltuximabe, o anti-TR2: tigatuzumabe, a anti-alfa5 beta integrina: volociximabe, o anti-HB-EGF: KHK2866. Os pepticorpos antiangiogênese são selecionados dentre AMG 386 e CVX-241.
[00197] Mais particularmente, é descrita neste documento uma composição farmacêutica compreendendo, como ingrediente ativo, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, um agente anticâncer, e um AMHR-II de ligação ao anticorpo, em que o agente anticâncer é selecionado dentre um grupo compreendendo docetaxel, cisplatina, gemcitabina e uma combinação de cisplatina e gemcitabina.
[00198] Ainda mais particularmente, é descrita neste documento uma composição farmacêutica compreendendo, como ingrediente ativo, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, um agente anticâncer, e um AMHR-II de ligação ao anticorpo, em que o anticorpo mutado humanizado monoclonal denominado 3C23K neste documento e o agente anticâncer é selecionado dentre um grupo compreendendo docetaxel, cisplatina, gemcitabina e uma combinação de cisplatina e gemcitabina.
[00199] Em um aspecto particular, é descrita neste documento uma composição farmacêutica compreendendo, como ingrediente ativo, em
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57/98 combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, um agente anticâncer, e um AMHR-II de ligação ao anticorpo, em uma formulação destinada para administração por via intravenosa ou intraperitoneal.
[00200] Em outro aspecto particular, a invenção diz respeito a uma composição para uso como um produto medicinal na prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão, compreendendo um agente anticâncer e um AMHR-II de ligação ao anticorpo, em uma formulação destinada para administração por via intravenosa ou intraperitoneal.
[00201 ] Em outro aspecto particular, a invenção diz respeito a uma composição para uso como um produto medicinal na prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão, compreendendo um agente anticâncer e um AMHR-II de ligação ao anticorpo, o anticorpo monoclonal e o agente anticâncer sendo destinados para administração separada, simultânea ou sequencial.
[00202] O anticorpo e o agente anticâncer podem ser combinados dentro de uma e a mesma composição farmacêutica, ou podem ser utilizados na forma de composições farmacêuticas separadas, que podem ser administradas simultânea ou sequencialmente. Em particular, os produtos podem ser administrados separadamente, a saber, de forma concomitante, ou independente, por exemplo, com uma lacuna temporal.
[00203] Mais particularmente, a invenção diz respeito a uma composição para uso como um produto medicinal na prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão, compreendendo um agente anticâncer e um AMHR-II de ligação ao anticorpo, em que o anticorpo e o agente anticâncer são combinados dentro da mesma composição farmacêutica.
[00204] De acordo com outro aspecto particular, a invenção diz respeito a uma composição para uso como um produto medicinal na prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão, compreendendo um agente anticâncer e um AMHR-II de ligação ao anticorpo, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da anticorpo anti-AMHRII administrado
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58/98 a um paciente se encontra em uma faixa de cerca de 0,07 mg a cerca de 35000 mg, preferencialmente de cerca de 0,7 mg a cerca de 7000 mg, preferencialmente de cerca de 0,7 mg a cerca de 1400 mg, preferencialmente de cerca de 0,7 mg a cerca de 700 mg, e mais preferencialmente de cerca de 0,7 mg a cerca de 70 mg.
[00205] De acordo com outro aspecto particular, a invenção diz respeito a uma composição para uso como um produto medicinal na prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão, compreendendo um agente anticâncer e um AMHR-II de ligação ao anticorpo, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de agente anticâncer administrado a um paciente se encontra em uma faixa de cerca de 10 mg a cerca de 700 mg, preferencialmente em uma faixa de cerca de 20 mg a cerca de 350 mg, e preferencialmente cerca de 110 mg.
[00206] De acordo com outro aspecto particular, a invenção diz respeito a uma composição para uso como um produto medicinal na prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão, compreendendo um agente anticâncer e um AMHR-II de ligação ao anticorpo, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo administrado a um paciente é de cerca de 70 mg e a dose de agente anticâncer administrado ao paciente é de cerca de 110 mg.
[00207] Em uma modalidade preferencial, a dosagem de agente anticâncer, em particular docetaxel, ou a combinação de cisplatina e gemcitabina, se encontra em uma faixa de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 500 mg/kg, por exemplo 0,1 mg/kg a 300 mg/kg, ou de cerca de 0,1 mg a 20 g por dia.
[00208] Como uma variante, uma maior dose de carga inicial, seguida por uma ou mais doses menores também pode ser administrada. Em outra variante, uma dose de carga inicial que não seja tão alta, seguida por uma ou mais doses maiores, também pode ser administrada.
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[00209] Em uma modalidade particular, o anticorpo anti-AM HR-11 e o agente anticâncer podem ser utilizados em uma proporção em peso de anticorpo/agente anticâncer em uma faixa de cerca de 10/1 a cerca de 0,01/1, em particular de cerca de 10/1 a cerca de 0,05/1, ou de cerca de 5/1 a cerca de 0,1/1.
[00210] De forma ilustrativa, o anticorpo anti-AMHRII e docetaxel podem ser utilizados em uma proporção em peso de anticorpo/docetaxel de 1/1, como mostrado nos exemplos contidos neste documento.
[00211] Ainda de forma ilustrativa, o anticorpo anti-AMHRII e a cisplatina podem ser utilizados em uma proporção em peso de anticorpo/cisplatina de 4/1, como mostrado nos exemplos contidos neste documento.
[00212] Ainda de forma ilustrativa, o anticorpo anti-AMHRII e s gemcitabina podem ser utilizados em uma proporção em peso de anticorpo/gemcitabina de 0,2/1, como mostrado nos exemplos contidos neste documento.
[00213] A invenção descreve adicionalmente um produto compreendendo um anticorpo que se liga ao receptor humano do tipo II do hormônio anti-Mülleriano (AMHR-II) e um agente anticâncer, na forma de uma preparação combinada, para uso simultêneo, sequencial ou separado como um produto medicinal destinado para prevenção ou tratamento de um Câncer de pulmão que expressa o AMHRII.
[00214] Um agente de ligação ao AMHRII conforme divulgado neste documento, e particularmente um anticorpo anti-AMHRII divulgado neste documento, pode ser administrado de diversas formas, que incluem administração oral, administração subcutânea, e administração intravenosa.
[00215] O termo quantidade terapeuticamente eficaz se refere a uma quantidade de um fármaco eficaz para tratar uma doença ou distúrbio em um mamífero. No caso do câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz do medicamento pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o
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60/98 tamanho do tumor; inibir (ou seja, lentamente em certa medida e preferencialmente parar) a infiltração de células cancerosas nos órgãos periféricos; inibir (ou seja, lentamente em certa medida e preferencialmente parar) a metástase tumoral; inibir, em certa medida, crescimento tumoral; e/ou aliviar em certa medida um ou mais dos sintomas associados ao distúrbio. Na medida em que o medicamento pode prevenir o crescimento e/ou matar as células cancerosas existentes, ele pode ser citostático e/ou citotóxico. Para a terapia para câncer, a eficácia in vivo pode, por exemplo, ser medida para a avaliação da duração de sobrevida, da duração de progressão sobrevida livre (PFS), as taxas de resposta (RR), a duração de resposta, e/ou quality de vida.
[00216] Formulações terapêuticas dos agentes (por exemplo, anticorpos) utilizados de acordo com a invenção são preparadas para armazenamento por mistura de um anticorpo com o grau desejado de pureza com transportadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Transportadores, excipientes, ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos a recipientes nas dosages e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de amônio de octadecildimetilbenzil; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzílico; parabenos de alquila tais como parabeno de metila ou propila; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes
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61/98 quelantes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íons formadores de sais tal como sódio; complexos metálicos (ou seja, complexos proteína-Zn); e/ou surfactantes não-iônicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG).
[00217] Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas coloidais de entrega de medicamento (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em “Pharmaceutical Sciences” de Remington, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
[00218] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo podem ser estéreis. Isto é alcançado prontamente por filtragem por meio de membranas de filtragem estéreis.
[00219] Uma composição farmacêutica conforme descrita neste documento pode ser administrada por qualquer via de administração apropriada, por exemplo, por via parenteral, oral, sublingual, vaginal, retal, ou transdérmica, preferencialmente por injeção intravenosa, subcutânea ou intradérmica. A injeção intramuscular, intraperitoneal, intrassinovial, intratecal ou intratumoral também é possível. As injeções podem ser realizadas na forma de um bolo, ou por infusão contínua. Quando a composição de anticorpos e a composição de agente anticâncer são administradas separadamente, essas composições podem possuir formas de administração idênticas ou diferentes.
[00220] As preparações para administração parenteral podem incluir soluções, suspensões ou emulsões estéreis aquosas ou não aquosas. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como azeite de oliva, ou ésteres orgânicos vegetais tal
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62/98 como oleato de etila. Veículos aquosos compreendem água e soluções e emulsões ou suspensões de álcool/água.
[00221] As composições farmacêuticas conforme descritas neste documento vantajosamente compreendem um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Pode-se mencionar, por exemplo, soluções salinas, fisiológicas, isotônicas, tamponadas etc., compatíveis com o uso farmacêutico e conhecidos por um versado na técnica. As composições podem conter um ou mais agentes ou veículos selecionados dentre dispersantes, solubilizantes, estabilizadores, conservantes etc. Agentes ou veículos utilizáveis em formulações (líquidas e/ou injetáveis e/ou sólidas) são em particular metilcelulose, hidroximetilcelulose, carboximetilcelulose, polissorbato 80, manitol, gelatina, lactose, óleos vegetais, acácia etc. As composições podem ser formuladas na forma de suspensões injetáveis, géis, óleos, tabletes, supositórios, pós, cápsulas de gelatina rígida, capsulas macias etc.
[00222] De acordo com um aspecto particular, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo, como ingrediente ativo, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, um agente anticâncer e um anticorpo anti-AMHRII, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo administrado a um paciente se encontra em uma faixa de cerca de 0,07 mg a cerca de 35000 mg, preferencialmente de cerca de 0,7 mg a cerca de 7000 mg, preferencialmente de cerca de 0,7 mg a cerca de 1400 mg, preferencialmente de cerca de 0,7 mg a cerca de 700 mg, e mais preferencialmente de cerca de 0,7 mg a cerca de 70 mg.
[00223] A dosagem do ingrediente ativo depende em particular do método de administração, e é facilmente determinado por um versado na técnica. A quantidade terapeuticamente eficaz (dose unitária) de anticorpo pode variar de 0,01 mg/kg a 500 mg/kg, preferencialmente de 0,1 mg/kg a 500 mg/kg, preferencialmente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, preferencialmente
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63/98 de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg, preferencialmente de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg, e mais preferencialmente de 1 mg/kg a 10 mg/kg, em uma ou mais administrações semanais, por diversas semanas ou meses. A dose unitária eficaz pode, portanto, ser facilmente deduzida de uma dose calculada para um paciente “médio” com um peso de 70 kg.
[00224] De acordo com outro aspecto particular, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo, como ingrediente ativo, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, um agente anticâncer e um anticorpo anti-AMHRII, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de agente anticâncer administrado a um paciente se encontra em uma faixa de cerca de 10 mg a cerca de 700 mg, preferencialmente em uma faixa de cerca de 20 mg a cerca de 350 mg, e preferencialmente é de cerca de 110 mg.
[00225] A dosagem do agente anticâncer depende em particular do método de administração, e é facilmente determinada por um versado na técnica. A quantidade terapeuticamente eficaz (dose unitária) pode variar de 0,2 mg/m2 a 10 g/m2, preferencialmente de 0,2 mg/m2 a 1 g/m2, preferencialmente de 2 mg/m2 a 1 g/m2, preferencialmente de 20 mg/m2 a 1 g/m2, e mais preferencialmente de 20 mg/m2 a 0,5 g/m2, em uma ou mais administrações semanais, por diversas semanas ou meses. A dose unitária eficaz pode, portanto, ser deduzida de uma dose calculada para um paciente “médio” cuja área de superfície corporal seja de cerca de 1,8 m2.
[00226] De acordo com um aspecto ainda mais particular, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo, como ingrediente ativo, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, um agente anticâncer e um anticorpo anti-AMHRII, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de agente anticâncer administrado a um paciente é de cerca de 110 mg, e a quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo administrado ao paciente é de cerca de 70 mg.
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[00227] A invenção também descreve uma composição compreendendo um agente anticâncer e um anticorpo anti-AMHRII que se liga ao receptor humano de hormônio anti-Mülleriano do tipo II (AMHR-II), para uso como um produto medicinal na prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão que expressa o AMHRII.
[00228] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos abaixo, sem se limitar de modo algum a eles.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Diferencial de expressão qênica do AMHRII e expressão proteica do AMHRII
A. Materiais e métodos
A. 1. Linhas e culturas celulares
[00229] A linha celular COV434 WT (ECACC N°07071909) foi mantida no DMEM/GlutaMax (Gibco) suplementado com 10% FBS, penicilina 100U/ml e Streptomicina 100ug/ml. Geneticina (Gibco) a 400ug/ml foi adicionada para a linha celular COV434 transfectada com MISRII. A linha celular K562 de eritroleucemia (ATCC® CCL-243™) foi cultivada em suspensão em meio IMDM (Sigma-Aldrich) suplementado com 10% FBS e penicilina/streptomicina e mantida em uma densidade entre 1 x 105 e 1 x 106 células/ml em Frascos de T75. A linha celular OV90 (ATCC® CRL-11732™, adenocarcinoma seroso de ovário) foi cultivada em uma mistura 1:1 de Meio MCDB 105 (Sigma-Aldrich) contendo uma concentração final de 1.5g/1 bicarbonate de sódio e meio 199 (Sigma-Aldrich) contendo uma concentração final de 2,2 g/l de bicarbonate de sódio suplementado com 15% FBS e penicilina/streptomicina. A linha celular NCI-H295R (carcinoma adrenocortical, ATCC® CRF-2128™) foi mantida no meio DMEM:F12 (Sigma-Aldrich) suplementado com iTS+Premix (Coming), 2,5% Nu-Soro (Falcon) e penicilina/streptomicina. As células foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera humidificada com 8% C02 e o meio foi substituído uma ou duas vezes por semana a depender das linhas celulares.
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A.2. Quantificação relativa de MRNA do AMHR2 pelo RT-qPCR
[00230] Extração de FINA. O RN Um total de fragmento de células de 1-5x106 foi preparado utilizando o kit de purificação de RNA Trizol® Plus (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. Em suma, após a extração do fenol/cloroforme, o RNA de células lisadas foi adsorvido na matriz de silica, tratado por DNAse, então lavado e eluído com 30ul de Água livre de RNAse. As concentrações e qualidade do RNA foram avaliadas com espectrofotômetro (NanoDrop, ThermoFisher Scientific).
[00231] Síntese de cDNA. O RNA (1 ug) foi reversamente transcrito utilizando o “kit de síntese de cDNA Maxima H Minus First Strand” (Ambion) e primers oligo-dT por incubação 10 min. a 25 °C para preparação (priming) e 15 min a 50 °C para transcrição reversa seguida por 5 min a 85 °C para inativação da transcrição reversa.
[00232] PCR quantitativo. O PCR quantitativo foi realizado no Light Ciclor 480 (Roche) em microplacas de 96 poços utilizando Luminaris Color HiGreen qPCR Master Mix (Ambion) em um volume final de 20 μΙ. Os seguintes primers foram utilizados para AMHR2, avanço 5’-TCTGGATGGC ACTGGTGCTG-3’ (SEQ ID NQ 71) e reverso 5’AGCAGGGCCAAGATGATGCT-3’ (SEQ ID NQ 72), para TBP, avanço 5’TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3’ (SEQ ID NQ 73) e reverso 5’CACATCACAGCTCCCCACCA-3’ (SEQ ID NQ 74). Aplicações foram realizadas utilizando cDNA modelo (RNA equivalente a 100ng) e o seguinte protocolo: pré-tratamento UDG 2 min a 50 °C, desnaturação 10 min a 95 °C seguida por 40 ciclos de 15s a 95 °C/30s a 60 °C/30s a 70 °C. Uma análise de curvas de fusão foi realizada ao final de cada experimento para controlar a ausência de DNA genômico e primer-dímero. Cada amostra de cDNA e controle (“sem modelo de amostra” e “sem RNA de transcrição reversa”) foi testada em duplicata. Os valores médios de limiar de ciclo (Ct) foram calculados e a quantificação relativa (RQ) do AMHR2 foi expressada como 2 AACt Qpclg AACt=ACtamostra-ACtcalibrador e ÁCt=CtAMHR2-CtTBP· A amOStra de
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HCT116 foi utilizada como calibrador e TBP como gene de controle endógeno para normalização.
[00233] A Tabela 2 abaixo apresenta o nível de expressão do AMHRII nas linhas celulares testadas utilizando o método Q-PCR descrito acima.
Tabela 2
Linha celular Contagem média de amhr2 Contagem média de TBP RQ
HCT116 34,27 22,25 1
COV434 WT 31,34 22,82 11,3
K562 25,31 21,36 268,7
NCI-H295R 26,16 22,83 413,0
OV90 25,65 22,67 526,4
A.3. Avaliação de expressão de membrana do AMHR2 por análise de citometria de fluxo.
[00234] Para a análise de separação de células ativadas por fluorescência (FACS), 4 x 105 células foram incubadas com 25ug/ml de 3C23K por 30 min a 4 °C. Após lavagens com PBS-BSA2%, the anticorpo primário foi detectado por um anticorpo secundário antiespécie conjugado para um fluoróforo. O 3C23K foi detectado por um F(ab’)2 anti-humano conjugado à ficoeritrina (1:1000, Beckman- Coulter, IM0550). Após lavagens com PBS, uma análise FACS das células ressuspensas foi realizada no Canal FL2 da citômetro de fluxo BD Accuri™ C6 (BD Bioscience).
B· Resultados
[00235] Os resultados são ilustrados na Figura 2. Os resultados mostraram que a linha de células recombinantes COV434-WT (cerca de 3% do níivel de expressão gênica do AMHRII medido para a linha celular NCIH295R), embora a linha celular COV434-WT possua um nível significativo de expressão de membrana de proteína humana do AMHRII.
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[00236] Esses resultados mostraram que não há uma correlação estrita entre a expressão gênica do AMHRII e a expressão de membrana proteica do AMHRII.
Exemplo 2: expressão do AMHRII em cânceres de pulmão (amostras de tumores humanos) A. Materiais e métodos
A.1. Objetivo
[00237] Estudo imuno-histoquímico de xenoenxertos de células cancerosas humanas em camundongos (PDXs) para detectar a expressão do receptor do hormônio anti-Mülleriano do tipo 2 (AMHR2) utilizando-se um anticorpo monoclonal 3C23K biotinilado.
A.2. Protocolo e metodologia
- As linhas celulares: fixadas em álcool-formaldeido-ácido acético (AFA) com constituição de blocos celulares
- Tumores humanos: fixação em formalina para amostras externas e em AFA para lâminas do Instituto Curie
- Técnica de imuno-histoquímica (IHC) foi possível após desparafinagem das amostras e desmascaramento a pH9 (recuperador de micro-ondas EZ 15’ a 90 °C, seguido por resfriamento por 20’).
- Detecção de receptor de hormônio anti-Mülleriano do tipo II por técnica de imunoperoxidase e revelação de substrato cromogênico DAB.
- Após bloquear a atividade endógena da peroxidase, as lâminas foram incubadas com anticorpo primário diluído biotinilado (1/800, 8ug/ml_) por 90 minutos à temperatura ambiente. As seções de tecido foram, então, lavadas com PBS e incubadas com complexo de avidina/biotina ABC [vetor] por 30 minutos. Sinais imunorreativosforam detectados utilizando-se uma solução de substrato DAB (tampão de substrato DAB+ / cromogênio líquido DAB+, incubagem de 10 minutos). Por fim, as seções foram levemente contracoloradas com hematoxilina de Mayer (modificação de Lillie).
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- Controles negativos foram obtidos por substituição dos anticorpos primários por imunoglobulina de controle de isotipo (R565) ou apenas por diluente de anticorpo (controle negativo de tampão) no procedimento de coloração himuno-histoquímica.
- Controles positivos foram obtidos utilizando-se células COV434 transfectadas com AMHR2 e amostras tumorais de granulosa humana
- Após processamento, as seções foram observadas por digitalização por meio do Philips IMS. Todos os espécimes foram pontuados independentemente por 2 patologistas.
- A localização da rotulagem foi detalhada: citoplasmática e/ou membranosa.
- A intensidade foi classificada como rotulagem marrom inequívoca de membrana e/ou citoplasma celular tumoral por meio do seguinte sistema de pontuação: a intensidade da rotulagem foi definida como 0 para negativa, 1 para fraca, 2 para moderada, e 3 para forte como mostrado no controle positivo de COV434.
- A frequência foi definida como uma porcentagem de células que expressam o AMHRII. Áreas necróticas foram excluídas da análise. The pontuação histológica global foi estabelecida utilizando-se frequência x média de pontuações de intensidade (0 a 3) acumulando expressão membranosa e citoplasmática.
- Todas as lâminas foram devidamente armazenadas.
B. Resultados
[00238] Os resultados de expressão de membrana do AMHRII por várias células cancerosas pulmonares humanas primárias também são apresentados na Tabela 3, em que a pontuação de expressão do AMHRII é representada para um painel de diferentes amostras de câncer de pulmão.
Tabela 3: expressão do AMHRII por amostras de tecido de câncer de pulmão humano
Tipo de tumor
Porcentagem de amostras positivas
Número de amostras testadas
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CPCP 0% 2
CPCNP (neuroendócrino) 1.2% 78
CPCNP (tipo acilar) 0% 2
CPCNP (epidermóide) 100% 4
CPCNP (carcinoma de células escamosas) 35% 14
CPCNP (adenocarcinoma) 45.8% 24
CPCNP (células grandes) 33% 9
[00239] Os resultados mostraram que o AMHRII é expressado na superfície celular em uma pluralidade de amostras de câncer de pulmão humano, particularmente por amostras de tumores derivadas de CPCNP e mais precisamente por amostras de tumores originárias de pacientes afetados por um CPCNP selecionado dentre o grupo consistindo em CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes e CPCNP carcinoma de células escamosas e CPCNP neuroendócrino.
Exemplo 3: Expressão do AMHRII em cânceres de pulmão
A. Materiais e métodos
A.1. Objetivo
[00240] A study de células cancerosas pulmonares humanas emitido a partir de xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) ou amostras frescas de tumores humanos foi iniciado para detectar a expressão do receptor do hormônio anti-Mülleriano do tipo 2 (AMHR2) utilizando um anticorpo monoclonal 3C23K biotinilado.
A.2. Análise da expressão de membrana do AMHRII por citometria de fluxo
[00241] Preparação das células para análise
- Os tecidos foram dissecados dentro de 1 h da cirurgia, moídos em fragmentos de 1 mm2 e lavados em RPMI contendo penicilina (10%), estreptomicina (10%) e gentamicina (0,1 mg/mL; Sigma-Aldrich).
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- Os fragmentos de tecido foram digeridos por 2-4 h com colagenase e DNAse (2 mg/mL; Sigma-Aldrich) com agitação rápida a 37 QC.
- Muco e fragmentos grandes foram removidos por filtragem por meio da um filtro celular de 40 pm.
- As células viáveis foram obtidas por centrifugação com gradiente Ficoll.
[00242] A quantificação dos sítios de ligação ao AMHRII nas células tumorais ressuspensas foi realizada utilizando-se o QuantumTM Simply Cellular (Bangs Laboratory) de acordo com as instruções do fabricante:
- Em suma, as quatro populações de microesferas rotuladas com uma quantidade calibrada diferente de IgG anti-humana de camundongo específica para a porção Fc de anticorpos de IgG humana foram coradas com a 3C23K anti-AMHRII conjugada de AlexaFluor488. Em tubos FACS, uma gota de cada tubo no kit é adicionada a 50ul de PBS IX:
Esferas B (vazias)
Esferas 1 + 3C23K-AF 10 pg/mL
Esferas 2 + 3C23K-AF 10 pg/mL
Esferas 3 + 3C23K-AF 10 pg/mL
Esferas 4 + 3C23K-AF 10 pg/mL (a concentração pode ser aumentada para 25 pg/ml, se necessário)
- cada população de esfera se liga a quantidades variáveis da 3C23K antiAMHRII conjugada de AlexaFluor488, produzindo uma intensidade correspondente de fluorescência, que é analisada em um Citômetro FACS Canto II (BD).
- Uma curva de calibração foi gerada por plotagem da intensidade média de fluorescência de cada população de esfera versus sua capacidade de ligação a anticorpo (ABC) atribuída.
[00243] Células foram geralmente coradas em tubos eppendorf de 1,5 ml.
- todas as etapas de centrifugação foram feitas a 4 °C.
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- todas as etapas de incubação foram feitas a 4 °C para evitar a internalização dos anticorpos.
- 3,5 milhões de células (COV434-MISRII tripsinizada ou células tumorais recentemente dissociadas) foram centrifugadas a 200-300g pro 5 min e foram lavadas uma vez com PBS f500ul por tubo)
- Lavar com PBS/2% FBS (200-300g por 3 in) gelado e ressuspender em 700 pl de PBS 1X e distribuir 100 pl por tubo FACS para as condições descritas na Tabela 4 abaixo:
Tabela 4
COV434-MISRII Células tumorais frescas
Nenhum anticorpo
R565-AF (controle de isotipo) 10 ug/mL
3C23K-AF 1 ng/mL
3C23K-AF 10 ng/mL
3C23K-AF 100 ng/mL
3C23K-AF 1 pg/mL
3C23K-AF 10 pg/mL (e até 25 gg/ml quando necessário)
- Incubar com anticorpo 3C23K-AF488 em PBS/1% FBS por 30 min a 4 °C
- Lavar em PBS/2%BSA duas vezes (200-300g por 3 min)
- Lavar em PBS duas vezes (200-300g por 3 min)
- Adicionar 300-400ul PBS e analisar no FACS assim que possível. Este protocolo não compreende qualquer etapa de fixação para coloração extracelular para manter a integridade da membrana. Por conseguinte, apenas o AMHRII de membrana é detectado.
A.3. Imuno-histoquímica: protocolo e métodologia
- As linhas celulares: fixadas em álcool-formaldeido-ácido acético (AFA) com constituição de blocos celulares
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- Tumores humanos: fixação em formalina para amostras externas e em AFA para lâminas do Instituto Curie
- A técnica de imuno-histoquímica (IHC) foi possível após amostras de desparafinagem e desmascaramento a pH9 (recuperador de micro-ondas EZ 15’ a 90 °C, seguida por resfriamento por 20’).
- Receptor de hormônio anti-Mülleriano do tipo II detecção por técnica de imunoperoxidase e revelação de substrato cromogênico DAB.
- Após bloquear a atividade endógena da peroxidase, as lâminas foram incubadas com anticorpo primário diluído biotinilado (1/800, 8ug/ml_) por 90 minutos à temperatura ambiente. As seções de tecido foram, então, lavadas com PBS e incubadas com complexo de avidina/biotina ABC [vetor] por 30 minutos. Os sinais imunorreativos foram detectados utilizando a solução de substrato DAB (Tampão de substrato DAB+ / cromogênio líquido DAB+, 10 minutos de incubação). Por fim, as seções foram levemente contracoloradas com hematoxilina de Mayer (modificação de Lillie).
- Os controles negativos foram obtidos por substituição dos anticorpos primários por imunoglobulina de controle de isotipo (R565) ou por diluente de anticorpo (controle negativo de tampão) no procedimento de coloração himuno-histoquímica.
- Os controles positivos foram obtidos utilizando-se células COV434 transfectadas com AMHR2 e amostras tumorais de granulosa humana
- Após processamento, as seções foram observadas por digitalização pelo Philips IMS. Todos os espécimes foram pontuados independentemente por 2 patologistas.
- A localização da rotulagem foi detalhada: citoplasmática e/ou membranosa.
- A intensidade foi classificada como rotulagem marrom inequívoca de membrana e/ou citoplasma celular tumoral por meio do seguinte sistema de pontuação: a intensidade da rotulagem foi definida como 0 para negativo, 1 para fraca, 2 para moderada, e 3 para forte como mostrado no controle positivo de COV434.
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- A frequência foi definida com uma porcentagem de células que expressam AMHRII. As áreas necróticas foram excluídas da análise. A pontuação histológica global foi estabelecida utilizando-se frequência x média de pontuações de intensidade (0 a 3) acumulando expressão membranosa e citoplasmática.
- Todas as lâminas foram devidamente armazenadas.
B. Resultados
a) Controles
- O controle negativo e o controle de isotipo foram desprovidos de reatividade nas células tumorais.
- A amostra de controle positivo (COV434 AMHRII amplificado) mostrou uma imunocoloração difusa das células (pontuação de intensidade: 3). A rotulagem foi homogênea (pontuação de frequência: 100%) com localização citoplasmática e membranosa.
- A amostra de controle de granulosa positiva mostrou uma forte imunocoloração das células tumorais (pontuação de intensidade 3). A rotulagem foi homogênea (pontuação de frequência: 100%) com localização citoplasmática e membranosa.
b) expressão do AMHRII de amostras de xenoenxertos derivados do paciente (PDX) conforme avaliada por IHC.
[00244] É importante observar que a expressão membranosa do AMHR2 é aparentemente subestimada quando as amostras são fixadas em formalina em comparação com amostras processadas em AFA.
[00245] Os resultados de expressão de membrana do AMHRII por diversos tumores humanos xenoenxertoados em camundongos são ilustrados na Tabela 5, em que a pontuação de expressão do AMHRII é representada para um painel de tipos distintos de células.
[00246] Parte dos resultados de expressão do AMHRII por xenoenxertos tumorais humanos são resumidos na Tabela 5 abaixo.
Tabela 5: Expressão do AMHRII em xenoenxertos tumorais humanos
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Tipo de tumor Porcentagem de PDXs positivos Número de PDXs testados
CPCP 0% 13
CPCNP (subtipo não especificado) 15.4% 13
CPCNP (epidermóide) 26.9% 26
CPCNP (adenocarcinoma) 7.7% 39
CPCNP (células grandes) 40% 10
[00247] Os resultados mostraram que o A MHRII é expressado na
superfície celular em uma pluralidade de xenoenxertos de câncer de pulmão humano, particularmente por amostras de tumores derivadas de CPCNP e mais precisamente por amostras de tumores originários de pacientes afetados por um CPCNP selecionado dentre o grupo consistindo em CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes e alguns subtipos de CPCNP ainda não identificados.
c) Expressão do AMHRII de amostras de xenoenxertos derivados do paciente (PDX) conforme avaliada por citometria de fluxo (FACS) [00248] Os resultados ilustrados nas Figuras 3A a 3E mostram que o AMHRII é expressado na membrana de células tumorais originárias de xenoenxertos derivados de um paciente de câncer de pulmão, independentemente do tipo de câncer de pulmão que é considerado. Os resultados ilustrados nas Figuras 3A a 3E mostram que a expressão proteica na membrana do AMHRII é constatada em CPCNP carcinoma de células escamosas (Figuras 3A, 3C, 3D), carcinoma pulmonar de células grandes (Figura 3B) e carcinoma de pulmão de células pleomórficas (Figura 3E).
[00249] Além disso, para as mesmas células de câncer de pulmão, (i) o número de AMHRII por célula, assim como (ii) a porcentagem de células cancerosas AMHRII nas mesmas amostras testadas foram medidos. Os resultados são apresentados na Tabela 6 abaixo.
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Tabela 6: Análise FACS de expressão do AMHRII em células cancerosas pulmonares humanas obtidas de xenoenxertos derivados do paciente
Tipo histológico Número de ref. Número de Receptores AMHRIIs por célula Porcentagem de Células AMHRII positivas (em %) Positivo/negativ 0
Carcinoma de células escamosas Lu7860 519.000 100 +
Carcinoma de células grandes Lu7166 51.000 70 +
Carcinoma de células escamosas Lu7298 150.000 87 +
Carcinoma de células escamosas Lu7414 61.000 63 +
Carcinoma de células pleomórficas Lu7558 46.000 35 +
[00250] Na Tabela 6, a expressão do AMHRII foi analisada, em cada amostra tumoral, ao se (i) determinar o número médio de proteínas do AMHRII presentes na membrana celular tumoral e ao se (ii) determinar a porcentagem de Células membranosas positivas do AMHRII na amostra tumoral. A indicação de se a amostra tumoral correspondente deve ser “positiva” ou “negativa” é apresentada na coluna esquerda da Tabela 6. A indicação “positivo” significa que as células tumorais do paciente de câncer de pulmão expressam o AMHRII significativamente em sua membrana. A indicação “negativo” significa que o AMHRII não foi detectado significativamente na membrana celular tumoral.
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[00251] Os resultados de Tabela 6 mostram que todas as amostras tumorais expressam AMHRII membranoso, embora em diferentes níveis de expressão.
d) Expressão do AMHRII de amostras frescas de tumores humanos conforme avaliada por citometria de fluxo (FACS)
[00252] Os resultados ilustrados nas Figuras 3F e 3G mostram que o AMHRII é expressado na membrana de células tumorais originárias de um CPCNP humano ressectado cirurgicamente (Figura 3G) enquanto o AMHRII não é expressado na membrana das células originárias da margem saudável retirada do mesmo paciente (Figura 3F).
e) Conclusões
[00253] A expressão proteica do AMHR2 foi confirmada para modelos de câncer de pulmão PDX positivos para transcrição de AMHR2. Esses PDXs foram adaptados a partir de cânceres de pulmão (IC8LC10 e SC131). Os níveis de expressão foram moderados, mas significativos, caracterizados pela pontuação global de 1 a 1,5. Esses dados sugerem que outros cânceres diferentes dos cânceres ginecológicos poderíam expressar o AMHR2.
[00254] Esses modelos podem ser utilizados para caracterizar terapias anti-AMHR2 no futuro.
Exemplo 4: Eficácia in vivo de anticorpos anti-AMHRII contra cânceres de pulmão que expressam o AMHRII
Sumário do objetivo
[00255] Analisar a eficácia antitumoral do composto de ensaio GM102 de Gamamab (também denominado anticorpo 3C23K neste documento) utilizado como agente único ou em combinação com docetaxel ou a combinação cisplatina/gemcitabina no modelo de SC131 de xenoenxerto de pulmão de células não pequenas derivadas do paciente, desenvolvido em camundongos fêmeas imunodeficientes.
2. Métodos
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[00256] Cinquenta e quatro (54) camundongos com um crescimento subcutâneo de tumor SC131 (P22.1.3/0) de 62,5 a 220,5 mm3 foram submetidos ao tratamento quando o volume médio e mediano do tumor alcançou 130,76 e 126,00 mm3’ respectivamente.
[00257] O estudo de eficácia XTS-1526 consistiu em 6 grupos de 9 camundongos cada:
No grupo 1, o veículo foi dosado a 5 ml/kg, por via intravenosa 2qwk x 3;
No grupo 2, GM102 foi dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 3;
No grupo 3, docetaxel foi dosado a 20 mg/kg, lentamente por via intravenosa uma vez no D0;
No grupo 4, GM102 foi dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 1 ou 2 em combinação com docetaxel a 20 mg/kg, lentamente por via intravenosa uma vez no D0;
No grupo 5, cisplatina foi dosada a 5 mg/kg combinada com gemcitabina a 100 mg/kg, tanto por via intraperitoneal qwk x 2 ou 3;
No grupo 6, GM102 foi dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 1 ou 2 com a combinação de cisplatina a 5 mg/kg e gemcitabina a 100 mg/kg, por via intraperitoneal qwk x 1 ou 2.
[00258] De camundongos não inclusos no estudo de eficácia, 2 grupos incluindo 8 camundongos por grupo foram testados:
No grupo 7, GM102 foi dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 3 em combinação com cisplatina a 5 mg/kg, por via intraperitoneal qwk x 3;
No grupo 8, GM102 foi dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 3 em combinação com gemcitabina a 100 mg/kg, por via intraperitoneal qwk x 3.
[00259] Os tumores foram medidos e os camundongos foram pesados três vezes por semana durante o período do experimento. Amostras tumorais frescas foram coletadas de 3 camundongos por grupo sem dose
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78/98 extra no D28 (para inclusão 2 e 3) ou D31 (para inclusão 1) para amostras de tecido congelado instantaneamente e fixadas com formalina. Apenas tecidos congelados instantaneamente avançaram para análise subsequente. As amostras fixadas com formalina foram descartadas após a amostragem.
3· Finalidade do estudo
[00260] O experimento descrito neste relatório visou determinar a eficácia antitumoral de um composto de ensaio de Gamamab, codificado GM102, utilizado sozinho ou combinado com docetaxel ou a combinação cisplatina/gemcitabina no modelo de xenoenxerto de SC131 derivado de um paciente de câncer de pulmão de células não pequenas.
Item de ensaio: GM102 (também denominado 3C23K neste documento)
[00261] O produto anti-AMHR2, GM102 é um mAh humanizado direcionado contra o receptor do hormônio anti-Mülleriano (AMHR2), alternativamente conhecido como receptor Mülleriano de substância inibidora II (MISRII). O AMHR2 está presente durante o período intrauterine no nível de precursores de órgãos sexuais internos femininos (trato Mülleriano), e é restrito ao ovário (células de granulosa) e testículos (células de Leydig) durante a fase adulta. O AMHR2 também é expressado em cerca de 65% dos cânceres ginecológicos tais como de ovário e endométrio (Bakkum JN, Gynecol Oncol, 2007; Sahli I, Biochem, 2004; Anttonen M, Lab Invest, 2011; Song JY, Int J. Oncol, 2009).
[00262] Constatou-se que o anticorpo GM102 apresenta eficácia antitumoral em modelos de xenoenxerto de camundongo utilizando Linhas celulares tumorais humanas transfectadas com AMHR2. Esta eficácia foi documentada como dependente do engajamento de células imunoefetoras ativadas pelo anticorpo otimizado facilitador no nível do tumor. Além disso, constatou-se que a eficácia do GM102 é sinergética com a cartoplatina e o paclitaxel, os principais agentes quimioterápicos utilizados em câncer de ovário (Jacquet A., Cancer Res, 2012).
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Os modelos de xenoenxerto tumoral humano
[00263] Amostras de tumores humanos de diversas origens histológicas foram obtidas com consentimento informado de pacientes tratados em centros de câncer e estabelecidas como xenoenxertos transpantáveis em camundongos imunodeficientes. As amostras enxertadas são material residual de tumores primários ou metastases obtidos antes ou após o tratamento. Esses modelos de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) foram estabelecidos sem cultura in vitro prévia e foram estudados quanto a histologia, citogenicidade, genética e outros marcadores biológicos, e quanto à sua resposta a terapias padrão de base (SOC).
[00264] O modelo de tumor SC131 foi derivado de uma metástase cutânea de câncer de pulmão de células não pequenas com EGFR (R451F) e Kras (G12V) mutados, e TP53 e PTEN do tipo selvagem.
[00265] O SC131 possui baixa resposta ao docetaxel e à combinação cisplatina/gemcitabina, e não responde a outros agentes testados (dados obtidos on camundongos nus suíços).
[00266] O modelo de tumor SC131 leva cerca de 17 dias para obter o máximo de tumores na faixa de 60 a 200 mm3 e de 35 a 40 dias para alcançar 2000 mm3 a partir do dia de implantação.
[00267] SC131 apresenta propriedades caquéticas.
4. Materiais
4.1. Animais e condições de manutenção
[00268] Camundongos fêmeas atímicos (nu/nu) nãocossanguíneos (« HSD: Athymic Nude-Foxnlnu ») pesando 18-25 gramas (ENVIGO, Gannat, França) foram submetidos a aclimatação na instalação para animais com acesso a comida e água ad libitum por pelo menos 6 dias antes da manipulação (Tabela 7).
Tabela 7.: Características dos animais
Espécie
Linhagem
Fornecedor
Sexo
Peso
Idade de recebimento
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Camundongo (Mus musculus) Athymic Nude Foxnlnu ENVIGO, França Fêmea 18-25 5 semanas
4.2. Declaração sobre o bem-estar dos animais
[00269] A autorização para utilizar animais nas instalações do CERFE foi obtida pela Direction des Services Vétérinaires, Ministère de fAgriculture et de Ia Pêche, França (acordo NQ B-91- 228-107). Os cuidados e a acomodação dos animais estão de acordo com a legislação reguladora francesa com relação à proteção de animais de laboratório.
[00270] Todos os experimentos foram realizados de acordo com a legislação francesa com relação à proteção de animais de laboratório e de acordo com a licença atualmente válida para experimentos em animais vertebrados, emitida pelo Ministério Francês de Agricultura e Piscicultura para Guillaume Lang (No. A-75-1927 de 15 de abril de 2012; validade: 5 anos).
4.3. Zootecnia
[00271] Os camundongos foram acomodados em grupos de no máximo 7 animais durante o período de aclimatação e no máximo 6 animais durante a fase experimental. Os camundongos foram acomodados dentro de gaiolas ventiladas individualmente (IVC) de plástico de polussulfona (PSU) (mm 213 L x 362 P x 185 A, Allentown, EUA) com substrato de espiga esterilizado e livre de poeira. Alimento e água foram esterilizados. Os animais foram acomodados sob a ciclo de luz-escuridão (ciclo circadiano de 14 horas de luz artificial) e temperatura ambiente e umidade controladas.
[00272] A pedido, s condições ambientais foram monitoradas e os dados foram retidos nos arquivos centrais de acomodação animal.
4.4. Dieta e suprimento de água
[00273] Água potável foi fornecida ad libitum. Cada camundongo recebeu diariamente a dieta péletes completa (150-SP-25Type, SAFE) ao longo do estudo. O certificado de análise de alimento animal e água foi retido nas instalações da CERFE.
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4.5. identificação de animais
[00274] Todos os animais foram pesados antes de cada experimento e identificados por um padrão único para sistema de numeração por perfuração de orelha.
[00275] Cada gaiola foi identificada por uma etiqueta de papel indicando: número da gaiola, linhagem e número do camundongo, código do tumor, data do experimento.
4.6. Composto de ensaio e formulações
[00276] O veículo PBS IX foi preparado por diluição do PBS 10X (Sigma PBS 10X, # P5493-1L, lote SLBJ2848) a 1/10 em água estéril deionizada. Ele foi armazenado a 4 °C para alíquotas de tratamento e Diluição em GM102 por 30 dias.
[00277] Alíquotas concentradas de GM102 (3C23K) (lote LP01 [R18H2-LP01 ]) foram recebidas no dia 7 de julho de 2016 (4 tubos de 5 ml a 10,1 mg/ml) e foram armazenadas a 4 °C. Em cada dia de dosagem, a solução mãe foi diluída em PBS IX frio para se obter a solução de trabalho de 2 mg/ml. Esta solução foi mantida em gelo ou a 4 °C e protegida da luz até o tratamento, e então o tubo foi mantido à temperatura ambiente durante a injeção. O restante da solução de trabalho após o tratamento foi descartado.
[00278] A solução mãe de docetaxel (Taxotere®, Sanofi, lote 6F255A - Exp: 03-2018) a 10 mg/ml precisa ser diluída, antes de cada dosagem, com 0,9% NaCI a 1/5 para se obter uma concentração de trabalho de 2 mg/ml. A solução mãe é estável por um mês após reconstituição a 4 °C e protegida da luz.
[00279] A solução mãe de cisplatina (Cisplatina-Teva, lote 15A30MF - Exp: 01 -2017) a 0,5 mg/ml estava pronta para o uso. Esta solução foi mantida à temperatura ambiente e protegida da luz até a data de vencimento indicada pelo fornecedor.
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[00280] A solução mãe de gemcitabina (Gemzar®, Lilly, lote C442937D, exp: 02-2018) a 40 mg/ml precisa ser diluída, antes de cada dosagem, com 0,9% NaCI a 1/4 para se obter uma concentração de trabalho de 10 mg/ml. A solução mãe é estável por um mês após reconstituição a 4 °C e protegida da luz.
5· Métodos
5.1. Indução de modelos de enxerto tumoral
[00281] Os tumores da mesma passagem foram transplantados subcutaneamente em 3-24 camundongos (camundongos doadores, passagem (n-1)). Quando esses tumores alcançaram 700 a 2000 mm3, os camundongos doadores foram sacrificados por deslocamento cervical, e os tumores foram assepticamente excisados e dissecados. Após remover as áreas necróticas, os tumores foram cortados em fragmentos medindo aproximadamente 20 mm3 e transferidos para o meio de cultura antes de enxertar.
[00282] Oitenta e nove (89) camundongos foram anestesiados com 100 mg/kg hidrocloreto de ketamina (lote 5D92 - exp: 03-2017, Virbac) e 10 mg/kg xilazina (lote KP0AX9X, Bayer), e então a pele foi asseptizada com a solução de clorexidina, incisada no nível da região interescapular, e um fragmento tumoral de 20 mm3 foi colocado no tecido subcutâneo. A pele foi fechada com presilhas.
[00283] Todos os camundongos do mesmo experimento foram implantados no mesmo dia.
5.2. Fase de tratamento
[00284] Na fase de eficácia XTS-1526, 54 camundongos com um crescimento subcutâneo de tumor SC131 (P22.1.3/0) de 62,5 a 220,5 mm3 foram alocados, de acordo com seu volume tumoral para fornecer volume médio e mediano homogêneos do tumor em cada pata de tratamento. Os tratamentos foram atribuídos aleatoriamente a caixas acomodando até 5 camundongos e foram iniciados 18 dias após a implantação do tumor (taxa
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83/98 de inclusão de 60% com inclusão escalonada). O estudo foi incluso por escalonamento com primeiramente 5 camundongos inclusos por grupo, e então 4 camundongos inclusos por grupo 2 dias depois. O estudo foi concluído 31 dias após o início do tratamento.
Tabela 8
Grupo Agente Média (mm3) Mediana (mm3) SEM
1 vehicle 129,28 126 17,80
2 GM102 20 mg/kg 129,83 126 13,13
3 Docetaxel 20 mg/kg 137,28 126 15,38
4 GM102 20 mg/kg Docetaxel 20 mg/kg 130,33 126 12,15
5 Cisplatina 5 mg/kg Gemcitabina 100 mg/kg 132,67 126 17,50
6 GM102 20 mg/kg Cisplatina 5 mg/kg Gemcitabina 100 mg/kg 125,17 126 16.53
[00285] Para os grupos adicionais 7 e 8, o tamanho do tumor foi maior e mais heterogêneo. Os animais foram inclusos 32 dias após a implantação.
Tabela 9
Grupo Agente Média (mm3) Mediana (mm3) SEM
7 GM102 20 mg/kg Cisplatina 5 mg/kg 310,63 288 57,03
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GM102 20 mg/kg
8 Gemcitabina 100 mg/kg 315,31 320 53,30
5.3. Medição do tumor e observações dos animais
[00286] O volume do tumor foi avaliado medindo-se os diâmetros do tumor, com um compasso, três vezes por semana durante o período de tratamento. A fórmula TV (mm3) = [comprimento (mm) x largura (mm)2]/2 foi utilizada, onde o comprimento e a largura são os diâmetros mais longos e os mais curtos do tumor, respectivamente.
[00287] Todos os animais foram pesados três vezes por semana durante o período de tratamento. O efeito adverso dos diferentes tratamentos foi determinado como:
O peso corporal relativo (RBW) será calculado para cada medição dividindo-se o peso corporal pelo peso corporal no início do tratamento.
A porcentagem de perda de peso corporal individual (% BWL) = 100 - (BWx / BWo x 100), onde BWx é o BW (peso corporal) em qualquer dia durante o tratamento e BWo é o BW no Γ dia de tratamento.
[00288] Os camundongos foram observados todos os dias quanto a aparência física, comportamento e alterações clínicas.
[00289] Todos os sinais de doença, juntamente com qualquer alteração comportamental ou reação ao tratamento, foram registrados para cada animal.
5.4. Esouema do estudo XTS-1526
[00290] Um total de 8 grupos foram utilizados, como resumido na Tabela 9. Para os grupos de 1 a 6, cada grupo incluiu inicialmente 9 camundongos. Para os grupos 7 e 8, cada grupo incluiu inicialmente 8 camundongos.
[00291] No grupo 1, o veículo foi dosado a 5 ml/kg, por via intravenosa duas vezes por semana por 3 semanas.
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[00292] No grupo 2, GM102 foi dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa duas vezes por semana por 3 semanas.
[00293] No grupo 3, docetaxel foi dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa uma vez no D0.
[00294] No grupo 4, GM102 foi dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa duas vezes por semana por 1 ou 2 semanas em combinação com docetaxel a 20 mg/kg, por via intravenosa uma vez no D0.
[00295] No grupo 5, cisplatina foi dosada a 5 mg/kg combinada com gemcitabina a 100 mg/kg, tanto por via intraperitoneal uma vez por semana por 2 ou 3 semanas.
[00296] No grupo 6, GM102 foi dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa duas vezes por semana por 1 ou 2 semanas com a combinação cisplatina a 5 mg/kg e gemcitabina a 100 mg/kg, ambos por via intraperitoneal uma vez por semana para 1 ou 2 semanas.
[00297] No grupo 7, GM102 foi dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa duas vezes por semana por 3 semanas com cisplatina a 5 mg/kg por via intraperitoneal uma vez por semana por 3 semanas.
[00298] No grupo 8, GM102 foi dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa duas vezes por semana por 3 semanas com gemcitabina a 100 mg/kg por via intraperitoneal uma vez por semana por 3 semanas.
[00299] Todas as doses de tratamento foram ajustadas ao peso a cada injeção.
Tabela 10: Dose e cronoqramas de dosagem no estudo de eficácia
XTS-1526
Gr. N 1s agente de ensaio 2S agente de ensaio 3S agente de ensaio
Agente Dose mg/kg Via Cronograma Agente Dose mg/k g Via Cronograma Agente Dose mg/kg Via Cronograma
1 9 veículo IV 2qwk x 3 - - - - -
2 9 GM102 20 IV 2qwk x 3
3 9 - - - - Docetaxel 20 slow IV D0 - - - -
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4 9 GM102 20 IV 2qwk xl- 2 Docetaxel 20 slow IV D0
5 9 - - - - Cisplatina 5 IP DO, D7 e/ou D14 Gemcitabina 100 IP DO, D7 e/ou D14
6 9 GM102 20 IV 2qwk xl- 2 Cisplatina 5 IP DOe D7 Gemcitabina 100 IP DOe D7
7 8 GM102 20 IV 2qwk x 3 Cisplatina 5 IP qwk x3
8 8 GM102 20 IV 2qwk x 3 - - - - Gemcitabina 100 IP qwk x 3
5.5. Ações implementadas em caso de perda de peso corporal ou evento adverso
[00300] Quando qualquer efeito colateral foi observado ou se uma perda de peso corporal >15% comparada ao dia de inclusão foi observada no dia da medição do tumor e o monitoramento de peso corporal (três vezes por semana), o patrocinador foi informado nos prazos mais curtos possíveis a partir da descoberta do efeito colateral/problema.
[00301] Então, as seguintes ações foram implementadas:
- o tratamento foi interrompido para o animal relevante; o tratamento foi retomado em caso de perda de peso corporal < 10%
- DietGel Recovery® foi administrado a todo o grupo em que a perda de peso corporal foi observada e o animal correspondente foi pesado todos os dias até atingir uma perda de peso corporal < 10%; a adição de DietGel Recovery® foi interrompida com perda de peso corporal < 10%.
5.6. Critérios para sacrifício ético
[00302] Os animais foram sacrificados com base nos seguintes critérios:
- Perda de peso corporal (BWL) > 20% comparada ao primeiro dia de tratamento por 48 horas consecutivas (3 medições).
- Alteração geral de comportamento ou sinais clínicos.
- Volume do tumor > 2000 mm3.
5.7. Pontos finais/conclusão do estudo
[00303] Apenas camundongos que atenderam aos critérios de sacrifício ético foram sacrificados no tempo adequado.
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[00304] Todos os grupos experimentais foram concluídos ao final do período do experimento.
[00305] Os pontos finais para o experimento foram:
- uma fase de tratamento de 4 semanas,
- nenhuma fase de acompanhamento.
5·8· Amostragem de sangue, tumor e tecido
5.8.1. Amostragem do tumor
5.8.1.1. Amostragem do tumor para FFPE
- % do tumor foi processada para FFPE: tumor foi fixado em 10% formalina por 24hrs e transferido para etanol 70%, e então enviado para Histalim no endereço a seguir para inclusão em parafina (ou seja, 17 [do estudo principal] amostras tumorais FFPE):
[00306] O horário e a duração exatos de amostragem de fixação com formalina foram registrados para cada amostragem de tumor.
[00307] Durante a edição da emenda 5, o patrocinador decidiu descartar as amostras de FFPE.
5.8.1.2 Amostragem de tumor para congelamento instantâneo
- % do tumor foi processado para congelamento instantâneo: o tumor foi cortado em pedaços de 3x3x3 mm e congelados instantaneamente em nitrogênio líquido, e então transferidos para -80 C° para armazenamento (ou seja, 17 [do estudo principal] + 6 [estudo de tolerabilidade de 2 grupos] amostras tumorais congeladas instantaneamente).
[00308] Os horários exatos de amostragem foram registrados para cada amostragem de tumor.
5.9 Análise dos dados
5.9.1. Processamento dos dados
[00309] Todos os dados brutos foram registrados de formulários apropriados associados a registros enumerados, armazenados e processados por um sistema computacional.
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[00310] O dia 0 foi considerado o primeiro dia de tratamento. Os dias de experimento foram subsequentemente numerados de acordo com esta definição.
[00311] Os registros são expressados como erro padrão médio ± da média (m ± sem).
[00312] As curvas de peso corporal relativo serão obtidas por plotagem do RBW médio contra o tempo para cada grupo experimental. As variações de pesos corporais relativos (pesos corporais relativos do grupo tratado em comparação aos pesos corporais relativos do grupo de controle) serão utilizadas para análise estatística.
[00313] A porcentagem média de perda de peso corporal (% BWL) = 100 - (BWx médio/ BWO médio x 100), onde BWx é o BW médio em qualquer dia durante o tratamento e BWO é o BW médio no primeiro dia de tratamento.
[00314] As curvas de crescimento tumoral foram obtidas por plotagem do volume médio do tumor em mm3 contra o tempo para cada grupo experimental. A variação de volume dos tumores (volume relativo dos tumores do grupo tratado em comparação ao volume relativo dos tumores do grupo de controle) foi utilizada para análise estatística.
[00315] Atrasos individuais no crescimento do tumor (TGD) foram calculados conforme o tempo em dias exigido para tumores individuais atingirem 3 a 5 vezes o volume do tumor inicial. Atraso de crescimento médio foi calculado e reportado nas tabelas.
[00316] O índice de atraso de crescimento de tumor (TGDI) foi calculado conforme o atraso de crescimento médio no grupo tratado dividido pelo atraso de crescimento médio no grupo de controle.
[00317] A proporção de porcentagem entre a média do volume do tumor de um grupo tratado (T) e a média do volume do tumor no grupo de controle (C) foi calculada.
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[00318] Foi feita análise estatística para cada medição pelo teste de comparação não paramétrico de Mann-Whitney. Cada grupo tratado foi comparado com o grupo de controle.
[00319] Estabilização de tumor (TS) foi definida como o número de camundongos apresentando um tamanho de tumor constante durante pelo menos 3 medições consecutivas.
[00320] Regressão parcial de tumor (PR) foi definida como o número de camundongos apresentando um tamanho de tumor menor do que o tamanho de tumor inicial durante pelo menos 3 medições consecutivas.
[00321] Regressão completa de tumor (CR) foi definida como o número de camundongos apresentando um tamanho de tumor de 0 a 13,5 mm3 durante pelo menos 3 medições consecutivas.
[00322] Sobrevivente livre de tumor (TFS) foi definido como o número de regressões completas de tumor registradas até o Grupo do Dia Final.
6· Resultados
6.1. Dados de tolerabilidade, observações clínicas
[00323] Média percentual de alteração no peso corporal durante o período de tratamento é ilustrada na Figura 4.
[00324] Neste estudo, camundongos foram pesados três vezes por semana durante o período experimental.
[00325] No grupo 1, veículo dosado a 5 ml/kg, por via intravenosa 2qwk x 3, foi bem tolerado, mas o efeito caquético do tumor induziu uma máxima média de perda de peso corporal de 8,3% no dia 16 e uma máxima individual de perda de peso corporal de 17,6% no dia 28. Nenhum outro evento adverso foi observado, mas devido ao efeito caquético do tumor, foi dado DietGel Recovery® aos animais a partir da 2- inclusão nos dias 18,21, 25 e 26.
[00326] No grupo 2, GM102 dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 3, foi bem tolerado com uma máxima média de perda de
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90/98 peso corporal de 9,8% no dia 14 e uma máxima individual de perda de peso corporal de 16,8% no dia 16, correspondendo ao efeito caquético do tumor como visto no grupo de controle 1. Nenhum outro evento adverso foi observado, mas devido ao efeito caquético do tumor, foi dado DietGel Recovery® aos animais a partir da 2- inclusão nos dias 11, 16, 18, a partir do dia 21 ao dia 27. O Camundongo #27 foi constatado morto no dia 27 sem qualquer sinal clínico.
[00327] No grupo 3, docetaxel dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa uma vez no DO induzido uma estatisticamente significante (p<0,01 a partir do dia 4) máxima média de perda de peso corporal de 17,0% no dia 16 comparada ao grupo de controle 1 e uma máxima individual de perda de peso corporal de 23,8% no dia 19. Nenhum outro evento adverso foi observado, mas devido ao efeito caquético do tumor, foi dado DietGel Recovery® ao grupo todo a partir do dia 7 ao dia 27 (até dia 31 para animais a partir da 1-inclusão). Apesar do DietGel dado, 4 camundongos tiveram de ser sacrificados antes do fim do estudo.
[00328] No grupo 4, GM102 dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 1 ou 2 em combinação com docetaxel a 20 mg/kg, por via intravenosa uma vez no D0 induzido uma estatisticamente significante (p<0,01 a partir do dia 4) máxima média de perda de peso corporal de 18,1% no dia 14 comparada ao grupo de controle 1 e uma máxima individual de perda de peso corporal de 24,1% no dia 23. Nenhum outro evento adverso foi observado, mas devido ao efeito caquético do tumor, foi dado DietGel Recovery® ao grupo total nos dias 4 e 5, então a partir do dia 7 ao dia 27. Apesar do DietGel dado, 5 camundongos tiveram de ser sacrificados antes do fim do estudo.
[00329] No grupo 5, cisplatina dosada a 5 mg/kg combinados com gemcitabina a 100 mg/kg, tanto por via intraperitoneal qwk x 2 ou 3 induzidos uma estatisticamente significante (p<0,01 a partir do dia 2) máxima média de perda de peso corporal de 17,5% comparada ao grupo de controle 1 e uma
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91/98 máxima individual de perda de peso corporal de 30,1% no dia 11. Devido à toxicidade combinada da combinação de composto e o efeito caquético do crescimento do tumor, foi dado DietGel Recovery® aos animais a partir da 2inclusão nos dias 2 e 3, então, ao grupo todo nos dias 4 e 7, então a partir do dia 9 ao dia 27 (até dia 31 para animais a partir da 1- inclusão). Apesar do DietGel dado, 4 camundongos tiveram de ser sacrificados antes do fim do estudo e 1 camundongo foi constatado morto no dia 12.
[00330] No grupo 6, GM102 dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 1 ou 2 com a combinação cisplatina a 5 mg/kg e gemcitabina a 100 mg/kg, tanto por via intraperitoneal qwk x 1 ou 2 induzido uma significante (p<0,001 a partir do dia 2) máxima média de perda de peso corporal de 21,1% comparada ao grupo de controle 1 e uma máxima individual de perda de peso corporal de 27,5% no dia 11. Devido à toxicidade combinada da combinação de composto e o efeito caquético do crescimento do tumor, foi dado DietGel Recovery® aos animais a partir da 2- inclusão nos dias 2 e 3, então ao grupo todo a partir do dia 4 ao dia 27 (até dia 31 para animais a partir da 1- inclusão). Apesar do DietGel dado, 7 camundongos tiveram de ser sacrificados antes do fim do estudo.
[00331] No grupo adicional 7, GM102 dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 3 com cisplatina a 5 mg/kg por via intraperitoneal qwk x 3, e combinado com o efeito caquético do tumor crescimento induzido uma significante máxima média de perda de peso corporal de 12,3% no dia 18 e uma máxima individual de perda de peso corporal de 28,9% no dia 28. Devido à toxicidade combinada da combinação de composto e o efeito caquético do crescimento do tumor, foi dado DietGel Recovery® aos animais nos dias e 9 e 11, então, a partir do dia 13 ao dia 28. Apesar do DietGel dado, 2 camundongos tiveram de ser sacrificados e 1 foi constatado morto antes do fim do estudo. Além disso, 5/8 camundongos mostraram descamação ou/e pele seca a partir do dia 8 ao fim do estudo.
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[00332] No grupo adicional 8, GM102 dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 3 com gemcitabina a 100 mg/kg por via intraperitoneal qwk x 3, e combinados com o efeito caquético do crescimento do tumor induzido uma significante máxima média de perda de peso corporal de 13,4% no dia 11 e uma máxima individual de perda de peso corporal de 26,4% no dia 28. Devido à toxicidade combinada da combinação de composto e o efeito caquético do crescimento do tumor, foi dado DietGel Recovery® aos animais a partir do dia 2 ao dia 4, a partir do dia 7 ao dia 9, nos dias 11 e 12, então a partir do dia 14 ao dia 28. Apesar do DietGel dado, 3 camundongos tiveram de ser sacrificados e 1 foi constatado morto antes do fim do estudo. Além disso, 6/8 camundongos mostraram descamação ou/e pele seca a partir do dia 4 ao fim do estudo.
6.2. Dados de eficácia antitumor
[00333] Curvas de crescimento do tumor (média do volume do tumor ao longo do tempo) são ilustradas na Figura 4. Valores percentuais de T/C para cada grupo de tratamento são apresentados na Tabela 11 e ilustrados nas Figuras 5 e 6. A análise estatística é mostrada na Tabela 12.
[00334] Neste estudo, tumores foram medidos três vezes por semana durante o período experimental.
[00335] No grupo 2, GM102 dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 3, não demonstrou qualquer eficácia antitumor com TGDI=1,33 e melhor T/C=74,68% no dia 16 (fim do grupo de controle).
[00336] No grupo 3, docetaxel dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa uma vez no D0, demonstrou uma forte e estatisticamente significante (p<0,01 no D04, então p<0,001 a partir de D7 a D16 comparado com o grupo de controle 1 pelo teste Man-Witney) eficácia antitumor com TGDI>2,71 e melhor T/C=11,00% no dia 16 (fim do grupo de controle). Além disso, 7/9 estabilizações de tumores transitórias e 2/9 regressões parciais de tumores transitórias foram observadas durante o período de tratamento.
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[00337] No grupo 4, GM102 dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 1 ou 2 em combinação com docetaxel a 20 mg/kg, por via intravenosa uma vez no DO, demonstrou uma forte e estatisticamente significante (p<0,01 no D04, então p<0,001 a partir de D7 a D14 comparado com o grupo de controle 1 pelo teste de Man-Witney) eficácia antitumor com TGDI>2,71 e melhor T/C=11,34% no dia 16 (fim do grupo 4, n=6). Além disso, 6/9 estabilizações de tumores transitórias e 3/9 regressões parciais de tumores transitórias foram observadas durante o período de tratamento.
[00338] No grupo 5, cisplatina dosada a 5 mg/kg combinada com gemcitabina a 100 mg/kg, tanto por via intraperitoneal qwk x 2 ou 3, demonstrou estatisticamente significante (p<0,01 no D04, então p<0,001 a partir de D7 a Dll comparado com grupo de controle 1 pelo teste de ManWitney) eficácia antitumor com TGDI=2,30 e melhor T/C=27,16% no dia 16 (fim do grupo 5, n=6). Além disso, 5/9 estabilizações de tumores transitórias foram observadas durante o período de tratamento.
[00339] No grupo 6, GM102 dosado a 20 mg/kg, por via intravenosa 2qwk x 1 ou 2 com a combinação cisplatina a 5 mg/kg e gemcitabina a 100 mg/kg, tanto por via intraperitoneal qwk x 1 ou 2, demonstrou estatisticamente significante (p<0,05 no D02, Então p<0,001 a partir de D4 a Dll comparado com o grupo de controle 1 pelo teste de ManWitney) eficácia antitumor com TGDI=1,98 e melhor T/C=33,71% no dia 11 (fim do grupo 6, n=7). Além disso, 6/9 estabilizações de tumores transitórias foram observadas durante o período de tratamento.
[00340] Nos grupos adicionais 7 e 8, em comparação com grupo de controle 1 não foi possível devido a uma maior média de volume do tumor na inscrição, mas diversas estabilizações de tumores transitórias foram observadas durante o período de tratamento, 5/8 para a combinação GM102/cisplatina e 6/8 para a combinação GM102/gemcitabina.
Conclusão
Resultados e discussão
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[00341 ] O efeito caquético da SCI 31 modelo de tumor foi maior do que esperado e levou a uma perda de peso semelhante tanto no grupo veículo e no tratado com GM102. Por conseguinte, um pode considerar que GM102 utilizados sozinhos foram bem tolerados.
[00342] Por outro lado, a toxicidade observada nos 4 outros grupos foi parcialmente em razão dos padrões de cuidado de docetaxel, cisplatina e gemcitabina e induziu a morte de cerda de metade dos camundongos em cada grupo.
[00343] O anticorpo GM102 utilizado sozinho induziu 25% de inibição de crescimento de tumor, um efeito que não alcança significância estatística, enquanto o padrão de cuidado dos grupos mostrarma uma forte inibição de crescimento de tumor. Este resultado foi surpreendente uma vez que este modelo foi inicialmente selecionado com base em sua expressão do AMHRII membranoso (pontuou 1+ por IHC). No entanto, quando a expressão do AMHRII membranoso foi avaliada nos tumores SC131 PDX em paralelo a este estudo, notou-se que a expressão do AMHRII membranoso diminuiu após algumas passagens (pontuou 0,2+; 40% de células positivas pontuaram um 0,5%). Este dado confirmou que a expressão do AMHRII é instável em certos modelos in vitro e in vivo e que expressões membranosas são críticas para eficácia antitumor de AMHRII.
[00344] Pela mesma razão, nenhuma potencialização da atividade antitumoral foi observada por combinar GM102 com esses padrões de cuidado.
Exemplo 5: Eficácia in vivo de anticorpos anti-AMHRII contra câncer de pulmão com expressão de AMHRII
A. Materiais e Métodos
A. 1. Expressão de membrana do AMHRII por histo-imunoquímica
[00345] Um método de imunofluorescência indireta foi, portanto, desenvolvido com o anticorpo anti-AMHRII 3C23K conjugados a Alexa Fluor® 488. A amplificação do sinal foi então realizada em duas-etapas com
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95/98 um anticorpo anti-AF488 de coelho e um anticorpo de bode anticoelho conjugados a Alexa Fluor® 647.
[00346] Seções de tecido congelado são feitas com o criostato Leica CMD1950 mantido a -20°C. Tecidos congelados são montados no disco de metal com composto OCT e, uma vez solidificado, foram montados no porta discos. Seções de 7pm foram realizadas e foram colocados nos slides Superfrost Plus (Menzel Glaser) e imediatamente armazenados a 20°C.
[00347] Os slides de seção congelada foram rehidratados com PBS IX e então fixos 10 min a -20°C por cobertura deles com 300μΙ de acetona fria (VWR Prolabo) e recuperados com parafilme para assegurar que todos os tecidos foram totalmente recuperados pela solução. Após levantar com PBS, slides foram tratados com 300μΙ de tampão de bloqueamento (PBSIX-BSA2%-soro de bode 10%-Triton X100 0,1%) 1 hora em uma caixa humidificada uma RT para bloquear interações não específicas entre anticorpos e componentes tecidos. O 3C23K-AF488 ou isotipo de controle R565-AF488 diluído a 10 μg/ml em tampão de bloqueamento foram aplicados por 30 min a RT nas caixas umidificadas. Após 3 lavagens com PBSIX-Triton X100 0,1% (3x10min), anticorpo anti-AF488 (Invitrogen) diluído a 1/500 em tampão de bloqueamento foram adicionados f300u 1) para 30 min de incubação a RT. Após 3 lavagens com PBSIX-Triton X100 0,1% (3x10min), anticorpo anti-coelho AF647 conjugados (Invitrogen) diluído a 1/500 em tampão de bloqueamento foram adicionados (300pl) para 30 min de incubação a RT. Lavagens (3x10min) com PBSIX-Triton X100 0,1% foram realizadas, então DAPI (Sigma-Aldrich) a 0,5ug/ml foram aplicadas por 10 min. Após levantarem com PBS e H2O as seções de slides foram montadas sob lamelas (24x50mm, Knittel Glass) com uma gota de (50ul) de meio de montagem DAKO Fluorescent evitando bolhas de ar e armazenado 4°C no escuro até que seja feita imagem deles.
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[00348] A aquisição de imagens foi realizada utilizando microscópio de fluorescência Leica DM5000B equipado com a câmera CoolSnap EZ CCD controlada pelo software Metavue (Molecular Devices). As imagens pós-tratamento são realizadas utilizando o software gratuito Image J (http://imagej .nih.gov/ij/).
A.2. Xenoenxertos de tumor de pulmão humano
[00349] Fragmentos de tumor foram obtidos a partir de xenoenxertos em passagem em série de camundongos nus. Após a remoção dos camundongos doadores, os tumores foram cortados em fragmentos (34 mm de comprimento da aresta) e colocados em PBS contendo 10% penicilina/estreptomicina. Animais receptores foram anestesiados por inalação de isoflurano e receberam implantes de tumor unilaterais ou bilaterais subcutaneamente nos flancos.
[00350] Xenoenxertos de modelo de tumor de câncer de pulmão de células não pequenas escamoso LXFE2226 foram implantados subcutaneamente com um tumor por camundongo (NMRI-Co.rn/™ a partir de Charles River). O experimento consistiu de dois grupos de camundongos dos quais três deles foram eutanaziados no dia 15 por detectarem expressão do AMHRII membranoso por citometria de fluxo. O primeiro grupo foi um grupo veículo de controle e o segundo grupo recebeu o anticorpo GM102 investigative, que foi administrado intraperitonealmente (i.p.) duas vezes por semana em um nível de dose de 20 mg/kg.
[00351 ] A eficácia antitumor foi avaliada como valor de T/C mínimo por comparação de volumes de tumores medianos relativos do grupo (RTVs) nos dias em que a eficácia máxima foi alcançada. O experimento foi concluído no dia 43 após um período de observação de duas semanas sem dosagem.
Projeto de estudo:
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ID do grupo Terapia Dose Diária Total [mg/kg/dia] Cronograma [Dias de dosagem] Rota de Apl. N9. de Animais
1 PBS como veículo controle 10 nd/kg BIW*4 i.p. 13#
2 GM102 20 BIW*4 (h:0) i.p. 14#
B. Resultados
B. Atividade in vivo da GM 102 anticorpo anti-AMHRII contra tumores de pulmão
[00352] Curvas de crescimento de tumor (média de volume do tumor ao longo do tempo) são ilustradas na Figura 7. Os tumores foram medidos três vezes a semana durante o período experimental.
[00353] Os resultados ilustrados nas Figuras 7 e 8 mostram que o anticorpo anti-AMHRII GM102 demonstrou uma forte atividade antitumoral em todos os animais xenoenxertoados tratados.
[00354] As medidas do crescimento do tumor no dia 28 ilustrado que o anticorpo anti-AMHRII GM102 possui causaram uma redução drástica do volume do tumor (p<0,001), que significa que o anticorpo anti-AMHRII (i) impediu o crescimento do tumor e (ii) causou eficientemente a lise das células tumorais inicialmente contidas nos tumor xenoenxertos.
[00355] Portanto, os resultados do Exemple 5 mostraram que o anticorpo anti-AMHRII exerce um efeito antitumor altamente eficaz contra as células cancerosas pulmonares que na verdade expressam a proteína do AMHRII em sua membrana, independentemente do nível de expressão do gene que codifica AMHRII.
[00356] Tabela 11: Atividade antitumor de GM102, sozinho ou em combinação com padrão de cuidado no SC131 xenoenxerto, estudo de eficácia XTS-1526
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MwiscsTTto Rsu Reta Rzito Crwajrama ,-o -KJ TGDi T.'C% radii 15 StiwlX. ft we5* T= FS CR TFS· it»* esmurwlinjxi
Gt veícclo íV* 15.32: i 3 5 3 Ü
G2 13 Ml 02 20 iV 2w?!o3 12S.5 12,70 1.33 74.-:3% 74,S3% D 1-3 0 Ό 0
G3 Socetss&l 25 s!o.v !’>. >20 »2.71 t: ,00% I t 00% D 10 “ 2 0 5
G4 GM1Ü2 20 ί',·- 2Qwkz!-2 Docetexsl 20 5»Λ· !’ □0 »30.3 »23 »2,71 11.34¾ 11'34% O 13 S 3 0 0 S
G€ Cííplaw? ε := geraiiebii?? ’·30 JP 3Wtz2-3 <32.7 23,74 2 30 27,15% 27.::-% □ 1S 5 0 0 0
GS GM102 20 !'/ 2qw*í-2 Cispi&tins 5 ί QWl;xi-2 • 2S.2 20.4: 1,5$ i 3’7|% D 11 4 5 C 0 G
[00357] XenTech T/C = Médio do volume do tumor de camundongos tratados / Média de volume do tumor de camundongos de controle x100 (calculado no tempo do primeiro sacrifício ético do grupo de controle); TGD (Atraso de crescimento do tumor) = tempo exigido para a média do volume do tumor atingir DO volume do tumor x5; TGDI (índice de crescimento do tumor) = TGD a partir dos tratados/TGD a partir dos camundongos de controle; TS (Estabilização de tumor) = número de camundongos apresentando um tamanho de tumor constante durante pelo menos 3 medições consecutivas; PR (Regressão parcial) = número de camundongos apresentando um tamanho de tumor menor do que o tamanho de tumor inicial durante pelo menos 3 medições consecutivas; CR (regressão completa) = número de camundongos apresentando um tamanho de tumor de 0 a 13 mm3 durante pelo menos 3 medições consecutivas; TFS (Sobrevivente livre de tumor) = número de regressões completas registradas até o grupo do dia final. Os tratamentos tiveram início no dia 18 após implantação.
[00358] Tabela 12: Sumário de Mann-Whitney análise do volume do tumor no modelo de tumor SC131, estudo de eficácia XTS-1526
TESTE MANN-WHITNEY DIA 0 2 4 7 9 11 14 16
veículo - 2qwkx3 vs GM102 20 2qwkx3 ns ns BS ns ns ns ns ns
veículo - 2qwkx3 vs Docetaxel 20 DO ns ns x«. »'»* ***
veículo - 2qwkx3 vs GM 102 20 2gwkxl-2 Docetaxel 20 DO ns ns -«* ”*·» «X» *·*·*
vefciJin - 2nwkx3 vs Císnlatína 5 twkxP-3 nemcitabina 100 owkx?-3 ns ns £·* XV» »«x
^.eicyj.o - 2qw4ix3 vs GM 102 20 2qwkxl-2 cispiatina 5 qwHxi-2 gemeftabina 100 qwkxl-2 ns -ΛΧ·*· xsz
[00359] Comparações de grupo foram realizadas utilizando um teste não paramétrico de Mann-Whitney entre o grupo tratado e o grupo de controle: ns = não significante, * = P < 0,05, ** = P < 0,01 e *** = P < 0,001. Tamanho do grupo inicial: 9 animais.

Claims (10)

1. Agente de ligação ao AMHRII humano, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método de prevenção ou tratamento de um câncer de pulmão em um paciente que sofre de um câncer de pulmão selecionado dentre o grupo que consiste em CPCNP epidermóide, CPCNP adenocarcinoma, CPCNP de células grandes, CPCNP carcinoma de células escamosas, CPCNP carcinoma de células pleomórficas e CPCNP neuroendócrino.
2. Agente de ligação ao AMHRII humano para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado no grupo que consiste em um anticorpo monoclonal anti-AMHRII e seus fragmentos de ligação ao AMHRII
3. Agente de ligação ao AMHRII humano para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal selecionado no grupo que consiste nos seguintes anticorpos:
a) uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NQ: 2 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NQ: 4 (sequências VL e VH de 3C23 sem líderes);
b) uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NQ: 6 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NQ: 8 (sequências VL e VH de 3C23K sem líderes);
c) uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NQ: 10 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NQ: 12 (cadeias leves e pesadas de 3C23 sem líderes);
d) uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NQ: 14 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NQ: 16 (cadeias leves e pesadas de 3C23K sem líderes).
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4. Agente de ligação ao AMHRII humano para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal compreendendo CDRs compreendendo as seguintes sequências:
- CDRL-1: RASX1X2VX3X4X5A, em que Xi e X2 são, independentemente, S ou P, X3 é R ou W ou G, X4 é T ou D, e X5 é I ou T;
- CDRL-2 é PTSSLX6S, em que X6 é K ou E; e
- CDRL-3 é LQWSSYPWT;
- CDRH-1 é KASGYX7FTX8X9HIH, em que X7 é S ou T, X8 é S ou G eX9é You N;
- CDRH-2 é WIYPX10DDSTKYSQKFQG em que Xw é G ou E; e
- CDRH-3 é GDRFAY
5. Agente de ligação ao AMHRII humano para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ligação consiste em um conjugado fármaco-anticorpo (ADC).
6. Agente de ligação ao AMHRII humano para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um receptor engenhado de ligação ao AMHRII.
7. Agente de ligação ao AMHRII humano para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é uma célula que expressa um receptor engenhado de ligação ao AMHRII.
8. Agente de ligação ao AMHRII humano para uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é uma célula CAR T, uma célula CAR NK ou um macrófago CAR que expressa um receptor engenhado de ligação ao AMHRII.
9. Agente de ligação ao AMHRII humano para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ligação ao AMHRII humano é combinado com um ou mais agente(s) anticâncer distinto(s).
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3/3
10. Método para determinar se um indivíduo que sofre de um câncer de pulmão é responsive a um tratamento de câncer com um agente de ligação ao AMHRII conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende a etapa de determinar se uma amostra de tecido tumoral previamente obtida do referido indivíduo expressa a proteína AMHRII na superfície celular.
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