CN110926890B - 一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法 - Google Patents

一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，具体方法为：称量肝胰腺样品，加入甲醇水溶液后震荡破碎，再加入氯仿和水，涡旋，低温静置，离心，收集第一上清液；第一上清液冻干，加入甲醇水溶液，超声，静置，离心，收集第二上清液；收集第二上清液时剩下的沉淀再加入甲醇水溶液，超声，静置，离心，收集第三上清液；第二上清液和第三上清液混合冻干，加入磷酸盐缓冲液，震荡复溶，高速离心，所得到的第四上清液即为水溶性的鲍肝胰腺代谢物，本发明彻底消除了鲍肝胰腺中的多糖和色素的干扰，操作简单、成本低廉、稳定性强、回收率高，对其它多糖和色素含量高的动植物组织代谢物的提取有借鉴作用。

Description

一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法。
背景技术
鲍被誉为海产“八珍之冠”，具有很高的营养和药用价值，是我国沿海地区一种重要的经济养殖贝类，同时也是一种理想的海洋环境监测指示生物。肝胰腺是鲍重要的消化组织，更是抵抗外部环境应激的重要免疫组织。在对其进行代谢组学研究时，肝胰腺中代谢物的提取是一个重要的环节。在基于核磁共振（NMR）的代谢组学研究中，以甲醇/氯仿/水作为提取溶剂的液–液萃取法在极性代谢物的提取中应用最为广泛。然而此方法不能有效地去除鲍肝胰腺中多糖及色素。多糖及色素会掩盖NMR谱图中一些重要代谢物的信号，从而严重影响这些重要代谢物的定量，使得后续分析无法进行。虽然使用超滤离心管能够有效地去除多糖和色素，但超滤离心管价格昂贵，不适合高通量、大规模使用。因此，有必要建立一种成本低廉、操作简单适用于鲍肝胰腺代谢物的提取方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了供一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，该方法提取得到的鲍肝胰腺代谢物无多糖和色素干扰，有利于后续的研究分析。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，包括以下步骤：
S1、将鲍肝胰腺置于离心管中，往鲍肝胰腺中加入甲醇（分析纯）和水，并加入钢珠，然后置于低温组织研磨仪中在4 ℃下震荡破碎，所述甲醇与水之间的体积百分比为50%～75%；
S2、往步骤S1中加入氯仿和水，混匀后于-4～0℃下静置不少于10 min；
S3、静置后进行离心处理，收集上层溶液转移到另一个离心管中；
S4、将步骤S3中得到的上层溶液置于-80 ℃的真空冷冻干燥机中真空冻干成冻干粉末；
S5、往冻干粉末中加入甲醇（分析纯）和水，经低温超声处理后于-4～0℃下静置不少于10 min，所述甲醇与水之间的体积百分比为80%～90%；
S6、静置后进行离心处理，收集上层溶液转移到另一个离心管中，并保留下层的沉淀；
S7、往步骤S6的沉淀中再加入甲醇（分析纯）和水，经低温超声处理后于-4～0℃下静置不少于10 min，所述甲醇与水之间的体积百分比为80%～90%；
S8、静置后进行离心处理，收集上层溶液并与步骤S6中得到的上层溶液混合；
S9、将步骤S8中得到的上层溶液置于-80 ℃的真空冷冻干燥机中进行真空冻干，得到粉末状的鲍肝胰腺代谢物；
S10、往步骤S9的鲍肝胰腺代谢物粉末中加入磷酸盐缓冲液，充分溶解（以不低于2500 rpm的速度涡旋1min以上）后进行离心处理，收集上层溶液即可得到水溶性的鲍肝胰腺代谢物。
优选的，按mg/mL计，步骤S1所述的鲍肝胰腺与甲醇之间的质量体积比为300: 1.0～1.4。
优选的，步骤S2所述的氯仿与步骤S1所述的甲醇之间的体积比为1～3: 1。
优选的，步骤S2所述的氯仿与水之间的体积百分比为45%～55%。
优选的，步骤S2所述的混匀为以不低于2500 rpm的速度涡旋30-90 s。
优选的，步骤S5和S7所述甲醇的添加量均为步骤1所述甲醇的70～80%。
优选的，步骤S5和S7所述低温超声处理为于4 ℃下以不低于100 W的功率超声处理8-12 min。
优选的，步骤S3、S6、S8和S10所述的离心处理为4 °C、10000 g离心10 min。
优选的，步骤S4和步骤S9所述的上层溶液在真空冻干前先进行液氮速冻处理，具体为：将上层溶液置于离心管中再放到液氮中冻成固体。
优选的，步骤S10所述磷酸盐缓冲液的添加量为步骤1所述甲醇的40～50%。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提出了一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，具体方法为：称量肝胰腺样品，加入甲醇水溶液后震荡破碎，再加入氯仿和水，涡旋，低温静置，离心，收集第一上清液；第一上清液冻干，加入甲醇水溶液，超声，静置，离心，收集第二上清液；收集第二上清液时剩下的沉淀再加入甲醇水溶液，超声，静置，离心，收集第三上清液；第二上清液和第三上清液混合冻干，加入磷酸盐缓冲液，震荡复溶，高速离心，所得到的第四上清液即为水溶性的鲍肝胰腺代谢物，可直接上机分析。
本发明在传统的以甲醇/氯仿/水作为提取溶剂的液–液萃取法的基础上，额外增加了高浓度的甲醇溶液提取步骤，具有以下几个方面的优点：（1）额外增加的高浓度甲醇溶液处理步骤可降低多糖和色素等物质的溶解度；（2）提取得到的鲍肝胰腺代谢物无多糖和色素的干扰；（3）经核磁共振检测表明，除多糖和色素外，其他代谢物的谱峰均没有显著变化，回收率高；（4）结合了传统甲醇/氯仿/水的提取方法，操作简单、成本低廉、稳定性强、回收率高。
可见，本发明彻底消除了鲍肝胰腺中的多糖和色素的干扰，操作简单、成本低廉、稳定性强、回收率高，对其它多糖和色素含量高的动植物组织代谢物的提取有借鉴作用。
附图说明
图1为鲍肝胰腺代谢物的NMR谱图（A为使用实施例1中的方法提取得到的鲍肝胰腺代谢物的NMR谱图，B为使用实施例2中的方法提取得到的鲍肝胰腺代谢物的NMR谱图，C为使用实施例3中的方法提取得到的鲍肝胰腺代谢物的NMR谱图，D为使用对比例1中的方法提取得到的鲍肝胰腺代谢物的NMR谱图，E为使用对比例2中的方法提取得到的鲍肝胰腺代谢物的NMR谱图）；
图2为鲍肝胰腺代谢物的部分放大NMR谱图（A为使用实施例1中的方法提取得到的鲍肝胰腺代谢物的NMR谱图，B为使用实施例2中的方法提取得到的鲍肝胰腺代谢物的NMR谱图，C为使用实施例3中的方法提取得到的鲍肝胰腺代谢物的NMR谱图，D为使用对比例1中的方法提取得到的鲍肝胰腺代谢物的NMR谱图，E为使用对比例2中的方法提取得到的鲍肝胰腺代谢物的NMR谱图）。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 使用本发明的方法提取鲍肝胰腺代谢物
具体方法包括以下步骤：
S1、称取300 mg鲍肝胰腺置于5 mL离心管中；
S2、往步骤S1的离心管中加入1.2 mL甲醇和0.6 mL水，并加入钢珠，然后置于低温组织研磨仪中在4 ℃下震荡破碎；
S3、往步骤S2的离心管中加入1.2 mL氯仿和1.2 mL水，以2500 rpm的速度涡旋1min后，置于冰上静置10 min；
S4、静置后4 °C、10000 g离心10 min，将上层溶液转移到另一个离心管中；
S5、将步骤S4中得到的上层溶液经液氮速冻后置于-80 ℃的真空冷冻干燥机中真空冻干成冻干粉末；
S6、往冻干粉末中加入0.9 mL甲醇和0.1 mL水（90%甲醇水溶液），于4 ℃下以100W的功率超声处理10 min后转移到冰上静置10 min；
S7、静置后4 °C、10000 g离心10 min，将上层溶液转移到另一个离心管中，并保留原离心管中的沉淀；
S8、往步骤S7中的沉淀中再加入0.9 mL甲醇和0.1 mL水，于4 ℃下以100 W的功率超声处理10 min后转移到冰上静置10 min；
S9、静置后4 °C、10000 g离心10 min，将得到的上层溶液与步骤S7中得到的上层溶液混合；
S10、将步骤S9中得到的上层溶液经液氮速冻后置于-80 ℃的真空冷冻干燥机中真空冻干，得到粉末状的鲍肝胰腺代谢物；
S11、往步骤S10的鲍肝胰腺代谢物粉末中加入550 µL磷酸盐缓冲液（用重水配置，150 mM, pH 7.4, 含0.5 mM TSP作为内标），以不低于2500 rpm的速度涡旋使代谢物粉末溶解后4 °C、10000 g离心10 min，收集上层溶液即可得到水溶性的鲍肝胰腺代谢物。
S12、取550 µL上述提取得到的鲍肝胰腺代谢物溶液到5 mm核磁检测管中，置于核磁共振（NMR）波谱仪中进行检测，观察NMR谱图。
实施例2 使用本发明的方法提取鲍肝胰腺代谢物
具体方法包括以下步骤：
S1、称取300 mg鲍肝胰腺置于5 mL离心管中；
S2、往步骤S1的离心管中加入1.2 mL甲醇和0.6 mL水，并加入钢珠，然后置于低温组织研磨仪中在4 ℃下震荡破碎；
S3、往步骤S2的离心管中加入1.2 mL氯仿和1.2 mL水，以2500 rpm的速度涡旋1min后，置于冰上静置10 min；
S4、静置后4 °C、10000 g离心10 min，将上层溶液转移到另一个离心管中；
S5、将步骤S4中得到的上层溶液经液氮速冻后置于-80 ℃的真空冷冻干燥机中真空冻干成冻干粉末；
S6、往冻干粉末中加入0.9 mL甲醇和0.16 mL水（85%甲醇水溶液），于4 ℃下以100W的功率超声处理10 min后转移到冰上静置10 min；
S7、静置后4 °C、10000 g离心10 min，将上层溶液转移到另一个离心管中，并保留原离心管中的沉淀；
S8、往步骤S7中的沉淀中再加入0.9 mL甲醇和0.16 mL水，于4 ℃下以100 W的功率超声处理10 min后转移到冰上静置10 min；
S9、静置后4 °C、10000 g离心10 min，将得到的上层溶液与步骤S7中得到的上层溶液混合；
S10、将步骤S9中得到的上层溶液经液氮速冻后置于-80 ℃的真空冷冻干燥机中真空冻干，得到粉末状的鲍肝胰腺代谢物；
S11、往步骤S10的鲍肝胰腺代谢物粉末中加入550 µL磷酸盐缓冲液（用重水配置，150 mM, pH 7.4, 含0.5 mM TSP作为内标），以不低于2500 rpm的速度涡旋使代谢物粉末溶解后4 °C、10000 g离心10 min，收集上层溶液即可得到水溶性的鲍肝胰腺代谢物。
S12、取550 µL上述提取得到的鲍肝胰腺代谢物溶液到5 mm核磁检测管中，置于核磁共振（NMR）波谱仪中进行检测，观察NMR谱图。
实施例3 使用本发明的方法提取鲍肝胰腺代谢物
具体方法包括以下步骤：
S1、称取300 mg鲍肝胰腺置于5 mL离心管中；
S2、往步骤S1的离心管中加入1.2 mL甲醇和0.6 mL水，并加入钢珠，然后置于低温组织研磨仪中在4 ℃下震荡破碎；
S3、往步骤S2的离心管中加入1.2 mL氯仿和1.2 mL水，以2500 rpm的速度涡旋1min后，置于冰上静置10 min；
S4、静置后4 °C、10000 g离心10 min，将上层溶液转移到另一个离心管中；
S5、将步骤S4中得到的上层溶液经液氮速冻后置于-80 ℃的真空冷冻干燥机中真空冻干成冻干粉末；
S6、往冻干粉末中加入0.9 mL甲醇和0.23 mL水（80%甲醇水溶液），于4 ℃下以100W的功率超声处理10 min后转移到冰上静置10 min；
S7、静置后4 °C、10000 g离心10 min，将上层溶液转移到另一个离心管中，并保留原离心管中的沉淀；
S8、往步骤S7中的沉淀中再加入0.9 mL甲醇和0.23 mL水，于4 ℃下以100 W的功率超声处理10 min后转移到冰上静置10 min；
S9、静置后4 °C、10000 g离心10 min，将得到的上层溶液与步骤S7中得到的上层溶液混合；
S10、将步骤S9中得到的上层溶液经液氮速冻后置于-80 ℃的真空冷冻干燥机中真空冻干，得到粉末状的鲍肝胰腺代谢物；
S11、往步骤S10的鲍肝胰腺代谢物粉末中加入550 µL磷酸盐缓冲液（用重水配置，150 mM, pH 7.4, 含0.5 mM TSP作为内标），以不低于2500 rpm的速度涡旋使代谢物粉末溶解后4 °C、10000 g离心10 min，收集上层溶液即可得到水溶性的鲍肝胰腺代谢物。
S12、取550 µL上述提取得到的鲍肝胰腺代谢物溶液到5 mm核磁检测管中，置于核磁共振（NMR）波谱仪中进行检测，观察NMR谱图。
对比例1 使用传统的以甲醇/氯仿/水作为提取溶剂的液–液萃取法提取鲍肝胰腺代谢物
具体方法包括以下步骤：
S1、称取300 mg鲍肝胰腺置于5 mL离心管中；
S2、往步骤S1的离心管中加入1.2 mL甲醇和0.6 mL水（67%甲醇水溶液），并加入钢珠置于低温组织研磨仪中在4 ℃下震荡破碎；
S3、往步骤S2的离心管中加入1.2 mL氯仿和1.2 mL水，涡旋60 s后置于冰上静置10 min；
S4、静置后4 °C、10000 g离心10 min，将上层溶液转移到另一个离心管中；
S5、将步骤S4中得到的上层溶液真空冻干成冻干粉末；
S6、往步骤S5的鲍肝胰腺代谢物粉末中加入550 µL磷酸盐缓冲液（用重水配置，150 mM, pH 7.4, 含0.5 mM TSP作为内标），涡旋溶解后4 °C、10000 g离心10 min，收集上层溶液即可得到水溶性的鲍肝胰腺代谢物。
S7、取550 µL上述提取得到的鲍肝胰腺代谢物溶液到5 mm核磁检测管中，置于核磁共振（NMR）波谱仪中进行检测，观察NMR谱图。
对比例2 使用改良的以甲醇/氯仿/水作为提取溶剂的液–液萃取法提取鲍肝胰腺代谢物
具体方法包括以下步骤：
S1、称取300 mg鲍肝胰腺置于5 mL离心管中；
S2、往步骤S1的离心管中加入1.2 mL甲醇和0.13 mL水（90%甲醇水溶液），并加入钢珠置于低温组织研磨仪中在4 ℃下震荡破碎；
S3、往步骤S2的离心管中加入1.2 mL氯仿和1.2 mL水，涡旋60 s后置于冰上静置10 min；
S4、静置后4 °C、10000 g离心10 min，将上层溶液转移到另一个离心管中；
S5、将步骤S4中得到的上层溶液真空冻干成冻干粉末；
S6、往步骤S5的鲍肝胰腺代谢物粉末中加入550 µL磷酸盐缓冲液（用重水配置，150 mM, pH 7.4, 含0.5 mM TSP作为内标），涡旋溶解后4 °C、10000 g离心10 min，收集上层溶液即可得到水溶性的鲍肝胰腺代谢物。
S7、取550 µL上述提取得到的鲍肝胰腺代谢物溶液到5 mm核磁检测管中，置于核磁共振（NMR）波谱仪中进行检测，观察NMR谱图。
通过实施例1-3提取得到的鲍肝胰腺代谢物和对比例1-2提取得到的鲍肝胰腺代谢物的NMR谱图可以看出（图1和图2），无论与传统的还是改良的以甲醇/氯仿/水作为提取溶剂的液–液萃取法相比，采用本发明的方法提取得到的鲍肝胰腺代谢物无多糖和色素干扰；且除多糖和色素外，其他的代谢物的谱峰没有显著变化，回收率高。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、往鲍肝胰腺中加入甲醇和水，低温震荡破碎，所述甲醇与水之间的体积百分比为50%～75%；
S2、往步骤S1中加入氯仿和水，混匀后于-4～0℃下静置不少于10 min；
S3、静置后进行离心处理，收集上层溶液；
S4、将步骤S3中得到的上层溶液真空冻干成冻干粉末；
S5、往冻干粉末中加入甲醇和水，经低温超声处理后于-4～0℃下静置不少于10 min，所述甲醇与水之间的体积百分比为80%～90%；
S6、静置后进行离心处理，收集上层溶液，并保留下层的沉淀；
S7、往步骤S6的沉淀中再加入甲醇和水，经低温超声处理后于-4～0℃下静置不少于10min，所述甲醇与水之间的体积百分比为80%～90%；
S8、静置后进行离心处理，收集上层溶液并与步骤S6中得到的上层溶液混合；
S9、将步骤S8中得到的上层溶液经真空冻干后得到粉末状的鲍肝胰腺代谢物；
S10、往步骤S9的鲍肝胰腺代谢物粉末中加入磷酸盐缓冲液，充分溶解后进行离心处理，收集上层溶液即可得到水溶性的鲍肝胰腺代谢物。
2.根据权利要求1所述的一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，其特征在于，按mg/mL计，步骤S1所述的鲍肝胰腺与甲醇之间的质量体积比为300: 1.0～1.4。
3.根据权利要求1所述的一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，其特征在于，步骤S2所述的氯仿与步骤S1所述的甲醇之间的体积比为1～3: 1。
4.根据权利要求1所述的一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，其特征在于，步骤S2所述的氯仿与水之间的体积百分比为45%～55%。
5.根据权利要求1所述的一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，其特征在于，步骤S2所述的混匀为以不低于2500 rpm的速度涡旋30-90 s。
6.根据权利要求1所述的一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，其特征在于，步骤S5和S7所述甲醇的添加量均为步骤1所述甲醇的70～80%。
7.根据权利要求1所述的一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，其特征在于，步骤S5和S7所述低温超声处理为于4 ℃下以不低于100 W的功率超声处理8-12 min。
8.根据权利要求1所述的一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，其特征在于，步骤S3、S6、S8和S10所述的离心处理为4 °C、10000 g离心10 min。
9.根据权利要求1所述的一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，其特征在于，步骤S4和步骤S9所述的上层溶液在真空冻干前先进行液氮速冻处理。
10.根据权利要求1所述的一种提取鲍肝胰腺代谢物的方法，其特征在于，步骤S10所述磷酸盐缓冲液的添加量为步骤1所述甲醇的40～50%。
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