CN110894552A - 检测登革病毒的引物、探针、试剂盒和RT-iiPCR方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测领域，公开了检测登革病毒的引物、探针、试剂盒和RT‑iiPCR方法。所述引物和探针的序列为SEQ ID NO.1～3。所述试剂盒包括所述引物和探针，还包括四种核苷酸、阳性质控物、阴性质控物、镁离子缓冲液、反转录酶和taq DNA聚合酶，所述四种核苷酸为dATP、dGTP、dCTP和dUTP。所述检测方法包括以下步骤：提取样品RNA；在热对流PCR管中加入所述样品RNA和使用所述的试剂盒，通过热对流PCR检测设备进行检测。所述检测方法的特异性好，灵敏度高，还具有简便、快速和实用的特点，满足现场和野外环境下对登革病毒的检测需要。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及用于检测登革病毒的引物、探针、试剂盒和RT-iiPCR方法。
背景技术
登革病毒(Dengue Virus，DENV)属于黄病毒科黄病毒属，是一种经蚊媒传播引起的正链RNA病毒。
登革病毒感染后可导致隐性感染、登革热、登革出血热和登革休克综合征，后两种疾病状况的死亡率较高。典型的登革热患者，其临床表现有起病急骤，高热，头痛，肌肉与骨关节剧烈酸痛，部分患者会出现皮疹、出血倾向、淋巴结肿大、白细胞计数减少、血小板减少等。登革热因蚊虫为传播媒介，主要在热带和亚热带地区广泛流行，我国的广东和香港澳门等地也属于流行区，一般每年的7～9月份为高峰发病期。登革热有时会发展成大范围的暴发疫情，对社会经济活动和人民生活健康造成巨大影响。
国际间人员的频繁流动使得登革病毒的传播更为广泛，让疾控和检疫部门的传染病监测和防控面临诸多压力。
因此，需要建立一种能应用于现场甚至野外的登革病毒的核酸检测方法，这对于病原检出和提高疫情应对能力具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出检测登革病毒的引物、探针、试剂盒和RT-iiPCR方法。所述检测方法的特异性好，灵敏度高，还具有简便、快速和实用的特点，满足现场和野外环境下对登革病毒的检测需要。
一种检测登革病毒引物和探针，包括：
两条检测登革病毒的引物，其序列为
正向引物：5’-GCTYAACRYAGTKCTRACAGTTT-3’，(SEQ ID NO.1)
反向引物：5’-CTCDCGCGTTTCAGCATATTGA-3’，(SEQ ID NO.2)
一条检测登革病毒的探针，其序列为
探针：5’-ATTAGAGAGCAGATYTCTGRWRAAC-3’；(SEQ ID NO.3)
所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。
所述引物和探针中Y、R、K、D和W的含义为：R＝A/G，Y＝C/T，K＝G/T，W＝A/T，D＝A/G/T。
优选的，所述荧光基团为FAM、TET、HEX、CY3或JOE。
优选的，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse。
一种检测登革病毒的试剂盒，包括上述的引物和探针。
优选的，所述试剂盒还包括四种核苷酸、阳性质控物、阴性质控物、镁离子缓冲液、反转录酶和taq DNA聚合酶，所述四种核苷酸为dATP、dGTP、dCTP和dUTP。
更优选的，所述阴性质控物为TE缓冲液或超纯水。所述TE缓冲液由Tris和EDTA配置而成，配置用水为无核糖核酸酶的超纯水。
更优选的，所述阳性质控物为含有SEQ ID NO.4序列的pGEM-T载体质粒。所述SEQID NO:4序列包括检测登革病毒的特异性保守序列。
其中检测登革病毒的特异性保守序列为：AGTTTCGAATCGGAAGCTTGCTTAACGTAGTTCTAACAGTTTTTTATTAGAGAGCAGATCTCTGATGAACAACCAACGGAAAAAGACGGG。(SEQ ID NO.4)
本发明采用反转录热对流PCR(RT-iiPCR)的方法对登革病毒进行检测。其中恒温热隔绝式PCR(insulated isothermal PCR,iiPCR)亦称为热对流PCR，是由Krishnan M等人于2002年建立的一种新型简易PCR扩增技术发展起来。iiPCR利用了溶液的热对流原理，即当针对装有液体的容器底部加热时，由于上方表面较冷的液体比重较高，因此会因为重力向下移动；下方受热的液体则因为比重较低，因此会被挤到向上移动，因此会自然形成液体的循环。当较热的液体流动至表面时，又会因为环境的散热而变冷，较冷的液体流动至底部时又会因为受热而变热，所以这种循环可以一直持续下去，从而形成了稳定的温度梯度。如果对受热容器的形状和材质进行特殊设计，找到最适的管径与高度，如市场上的下细上粗的“R-Tube”PCR管，能巧妙的控制对流的时间与散热的速率，就可以形成适合PCR的变性-退火-延伸等反应的局部环境。
一种检测登革病毒的RT-iiPCR方法，包括以下步骤：
提取样品RNA；在热对流PCR管中加入所述样品RNA和使用上述试剂盒，通过热对流PCR检测设备进行检测。
优选的，所述热对流PCR管中，引物的终浓度为0.3～0.8μmol/L，探针的终浓度0.2～0.4μmol/L。其中引物的终浓度表示每一条引物的终浓度。
优选的，所述RT-iiPCR方法的反应程序为：50℃反转录8～10min；95℃热对流PCR反应45～50min。
优选的，本发明采用POCKITTM现场核酸检测设备(台湾瑞基海洋生物科技股份有限公司)进行RT-iiPCR的检测。反应结束后POCKIT设备自动将荧光信号变化的信噪比(S/N)按内置算法和默认的S/N阈值转化为阳性、阴性或有疑问这3类结果，分别以“+”、“-”和“？”的形式显示于仪器的触控屏幕。“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性，“？”表示结果不明确，需重新检测。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)通过所设计的特异性引物和探针，使得本发明所述检测方法的特异性强、灵敏度好；
(2)本发明通过采用RT-iiPCR检测方法，将反转录和PCR扩增整合，属于一步法，操作简单，无需再开盖加样，能有效防止样品受到污染；
(3)本发明采用的热对流PCR方法，具有简便、实用、低成本的优势，且检测仪器易于携带，适合现场甚至野外快速检测；
(4)本发明所述的检测方法用时较短，上机检测50-60min即可得出检测结果。
附图说明
图1为实施例4中特异性试验的检测结果。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
实施例1
一种检测登革病毒的引物和探针，包括：
两条检测登革病毒的引物，其序列为
正向引物：5’-GCTTAACGTAGTTCTAACAGTTT-3’，
反向引物：5’-CTCGCGCGTTTCAGCATATTGA-3’，
一条检测登革病毒的探针，其序列为
探针：5’-ATTAGAGAGCAGATCTCTGATGAAC-3’；
其中检测登革病毒的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
实施例2
一种检测登革病毒的试剂盒，包括实施例1中的引物和探针，还包括四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP和dUTP、阳性质控物、阴性质控物、镁离子缓冲液、MMLV RTase反转录酶和taq DNA聚合酶。
其中阴性质控物为TE缓冲液，TE缓冲液由Tris和EDTA配置而成，配置用水为无核糖核酸酶的超纯水。
其中阳性质控物为含有SEQ ID NO.4序列的pGEM-T载体质粒。
实施例3
一种检测登革病毒的RT-iiPCR方法，包括以下步骤：
提取样品RNA，在热对流专用PCR管(R-Tube)中加入5μL样品RNA，2.5μL的MMLVRTase反转录酶和taq DNA聚合酶的混合液，17.5μL的超纯水，25μL的反应混合液。其中反应混合液中包括四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP和dUTP，实施例1中的引物和探针，以及镁离子缓冲液。每一条引物的终浓度为0.5μmol/L，探针的终浓度0.3μmol/L。
盖好R-Tube反应管的密封帽，于专配的离心机中短暂离心后置于POCKITTM核酸分析仪(台湾瑞基海洋生物科技股份有限公司)中进行检测。
RT-iiPCR检测的反应程序为：
选择“520nm”的单波长模式，检测时长为仪器中系统默认的58min。内建程序设置为：首先执行50℃反转录10min，然后95℃热对流PCR反应约48min。通过仪器显示得出登革病毒的检测结果。
实施例4
特异性检测
该试验选择与登革病毒具有相似感染症状的常见病原体的核酸样本作为特异性试验的参考品，病毒类型包括：黄热病毒疫苗株、基孔肯雅病毒、汉坦病毒、诺如病毒GII型、H7N9型禽流感病毒和A组轮状病毒。
将上述病毒样品与实施例2试剂盒中的阳性质控物和阴性质控物作为试验的检测样品，阳性质控物作为阳性对照，阴性质控物作为阴性对照，采用实施例3中的RT-iiPCR检测方法进行检测。
检测结果如图1所示：1-8号分别对应黄热病毒疫苗株、基孔肯雅病毒、汉坦病毒、诺如病毒GII型、H7N9型禽流感病毒、A组轮状病毒、阴性对照和阳性对照在520nm波长下的检测结果。
实验结果表明各参考品病毒的检测结果均报告为阴性，即“-”；阴性对照的检测结果报告为阴性，即“-”；阳性对照的检测结果报告为阳性，即“+”，因此说明该试剂盒用于检测具有良好的特异性。
实施例5
灵敏度试验
对实施例2中的阳性质控物(质粒)以10倍梯度进行稀释，得到拷贝数为107、106、105、104、103、102、101和100的阳性质粒，通过实施例3中的检测方法对上述质粒样品进行检测，每组3次重复试验，结果表明能有效检出的最低拷贝数为103的阳性质粒。
实施例6
重复性试验
采用实施例5中拷贝数为106和104的阳性质粒，每组重复检测10次，POCKITTM设备的报告结果均为阳性，即“+”，表明本发明所使用的RT-iiPCR检测方法具备良好的重复性与稳定性。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海国际旅行卫生保健中心（拱北海关口岸门诊部）
<120> 检测登革病毒的引物、探针、试剂盒和RT-iiPCR方法
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctyaacrya gtkctracag ttt 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcdcgcgtt tcagcatatt ga 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
attagagagc agatytctgr wraac 25
<210> 4
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agtttcgaat cggaagcttg cttaacgtag ttctaacagt tttttattag agagcagatc 60
tctgatgaac aaccaacgga aaaagacggg 90
Claims (10)
1.一种检测登革病毒的引物和探针，其特征在于，包括： 两条检测登革病毒的引物，其序列为 正向引物：5’-GCTYAACRYAGTKCTRACAGTTT-3’， 反向引物：5’-CTCDCGCGTTTCAGCATATTGA-3’； 一条检测登革病毒的探针，其序列为 探针：5’-ATTAGAGAGCAGATYTCTGRWRAAC-3’； 所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM、TET、HEX、CY3或JOE。
3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse。
4.一种检测登革病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至3中任一项所述的引物和探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括四种核苷酸、阳性质控物、阴性质控物、镁离子缓冲液、反转录酶和taq DNA聚合酶，所述四种核苷酸为dATP、dGTP、dCTP和dUTP。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控物为TE缓冲液或超纯水。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控物为含有SEQ ID NO.4序列的pGEM-T载体质粒。
8.一种检测登革病毒的RT-iiPCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取样品RNA，在热对流PCR管中加入所述样品RNA和使用权利要求5至7中任一项所述的试剂盒，通过热对流PCR检测设备进行检测。
9.根据权利要求8所述的RT-iiPCR方法，其特征在于，所述热对流PCR管中，引物的终浓度为0.3～0.8μmol/L，探针的终浓度0.2～0.4μmol/L。
10.根据权利要求8所述的RT-iiPCR方法，其特征在于，所述RT-iiPCR方法的反应程序为：50℃反转录8～10min；95℃热对流PCR反应45～50min。
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