CN110891687B - 生物样品中原位抗原修复的方法及其成像 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于样品的原位温度诱导的抗原修复的装置和方法，其中所有步骤均在高于大气压的压力下对固定在样品支撑件上的样品进行，其可以在相同的样品支撑件上进一步进行染色和成像，可选地通过循环多路复用，该循环多路复用通过以快速、高度灵敏和可靠的方式在同一样品上进行多分子读数，使各种分子靶标成像。

Description

生物样品中原位抗原修复的方法及其成像
发明领域
本发明总体上涉及生物样品制备领域，特别是基于样品的原位成像的抗原修复(antigen retrieval)。
发明背景
免疫组织化学(IHC)是一种涉及使用特定探针分子(例如抗体)来检测组织样品中细胞可能表达的特定生物标志物(例如抗原)是否存在的技术。IHC被广泛用于临床和研究领域，例如用于诊断特定疾病(例如某种癌症)或用于研究疾病预后与新型生物标志物表达之间的相关性。IHC的主要应用领域是癌症诊断；但它还具有其它应用领域，包括检测诸如病毒等的传染源(McMahon等，1996；Histochem J，28(3)：157-64)，并有助于诊断其它疾病，例如老年痴呆症(Dandrea等，2001，生物技术组织化学(Biotech Histochem)，76(2)：97-106)。
抗原修复(AR)是IHC的一种预处理技术，用于提高各种类型的组织样品(主要是福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织切片)的抗原性。自最初引入以来，它已迅速被用作各种组织类型和靶标标志物的行业金标准(Shi等，1991，组织化学与细胞化学杂志(JHistochem Cytochem)，39：741-748；US 5,244,787)。
尽管尚不清楚抗原修复过程效果背后的确切机制，但其逆转福尔马林诱导的肽键形成以激活靶表位的作用已成共识。有两种主要方法可用于提高表位的反应性：酶诱导的抗原修复(EIAR)和热诱导的抗原修复(HIAR)。由于酶物质的固有催化特性，EIAR具有更高的潜力干扰组织形态并使靶蛋白位点失去功能(Werner等，1996，组织化学和细胞生物学(Histochemistry and Cell Biology)，105：4253-260)。因此，HIAR是两者中使用更广泛的方法。
有不同的装置和方法来执行HIAR。常规方法是在含有碱性缓冲液的热浴中孵育样品。对于这种方法，作为普遍趋势，在较低的AR温度下，需要更长的培养时间，才能获得相同的抗原性。例如，据报道在60℃过夜培养或在95℃培养1小时均成功用于预-IHC AR(Yamashita，2007，细胞组织化学(Prog Histochem Cytochem)，41(3)：141-2007)。微波处理是另一种常用的方法，其中样品经过恒定功率微波处理或加热-暂停循环(US 5,244,787)。它还用于改善免疫荧光的抗原性(Long和C.Buggs，2008年，分子组织学杂志(J MolHistol).39(1):1-4)和特殊的染色应用(Temel等，2005，生物技术组织化学(BiotechHistochem).80(3-4):123-32)。
也可以结合使用HIAR和EIAR方法。Key等人，公开了含有热稳定酶的AR缓冲液，可用于FFPE样品的微波处理。用这些方法显示了成功的各种乳腺癌标志物的AR，其中AR温度高达100℃(WO 2009/110936)。另一种替代方法为压力辅助的HIAR，其可以将AR介质的温度提高到高于其大气沸腾温度。为此，Angros等人公开了一种在高压环境中执行AR的自动化装置(US7,951,612)。
HIAR可以在不同的环境中执行，也可以在为不同溶液中执行，以提高AR的性能。例如，Gourevitch公开了在AR期间促进样品完整性的新的解决方案(US 2004/0029184)，并且Namimatsu公开了使用含有CCA和NaOH的AR溶液来增强AR性能(US 2002/0182653)。Eriksen公开了掺有各种非离子表面活性剂的AR溶液，以逆转存在于目标表位中的胺基之间的特定交联(US 9,506,928)。
本领域中已知的大量的AR溶液配方能够提高溶液在大气压下的沸点，使得能够在较高的温度下进行AR。Key等人公开了除了用于自动样品温度控制的装置之外，具有不同添加剂和粘度的AR溶液，其沸点增加至高达135℃(US 2006/0134793，WO 2009/085574)。Christensen等人公开了一种卧式AR装置和方法，其中通过使用改良的缓冲剂达到了120℃至130℃的AR温度(US 2010/0136612)。Kram等人公开了包含有机盐或离子液体以达到超过200℃的沸点的AR溶液(WO 2006/066039)。
不同缓冲液的连续应用以提高AR效率在本领域中也是已知的。例如，Gerdes等人公开了用具有不同pH值的AR缓冲液处理样品以检测多种抗原的方法(US 2012/009666)。
减少免疫染色之前样品的预处理时间的另一种方法是提供既可用于FFPE样品的去石蜡和又可用于抗原修复的缓冲液。Aghassi等人公开了含有各种表面活性剂的缓冲剂，其被用于同时去石蜡和AR(US 6,649,368)。
上述方法不足以解决样品处理时间长和效率低的问题，特别是因为在染色过程之前，抗原修复是作为样品制备的一部分进行。
因此，需要新的技术、仪器和工具来执行需要减少处理时间的组织处理方法，因为处理时间的减少能够意味着病理学流水线过程中的更高通量和有限临床实验室资源的更有效利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种样品的原位温度诱导的抗原修复的方法，其中所有步骤均在高于大气压的压力下对固定在样品支撑件上的样品进行，从而使得在对相同的样品支撑件上的样品进染色和成像之前，进行抗原修复。
优选地，提供一种在高于大气压的压力下对样品进行原位温度诱导的抗原修复的方法，该方法能够实现全自动且快速的高温诱导的变性效应和冷却诱导的复性温度，从而实现快速且可重复的温度诱导的目标表位暴露。
优选地，提供一种对固定在样品支撑件上的组织或细胞样品进行原位温度诱导的抗原修复的方法，该方法允许在相同样品支撑件上对所述样品进行随后的染色和成像，其中，通过避免在染色之前将样品经历多个用于抗原修复的处理步骤，以及避免将样品固定在用于抗原修复和染色的多个样品支撑件，从而保持样品的完整性并且减少处理时间。
在另一种实施方式中，优选地，提供一种对固定在样品支撑件上的组织或细胞样品进行原位温度诱导的抗原修复并使所述样品在相同的样品支撑件上进行随后的染色和成像的方法，，其中，将温度诱导的抗原修复步骤后的温度冷却至高于室温的温度，并且随后的染色和成像步骤在高于室温的温度下进行，从而减少处理时间并提高染色效率。
在另一种实施方式中，优选地，提供一种对固定在样品支撑件上的组织或细胞样品进行原位温度诱导的抗原修复的方法，其中，以特定的次序在样品表面处直接对置于相同的样品支撑件的所述样品进行随后的完全可控的成像探针流处理，以执行样品标记和成像的完整循环，并以高通量的方式重复该循环，这有助于对同一样品进行不同标志物的免疫染色并增加可能的样品标记循环次数，而不会降低测定的成像信号的再现性和/或灵敏度。
通过提供如权利要求1的方法已经实现了本发明的目的。
根据本发明的第一方面，本文公开了一种对固定在样品支撑件上的生物样品进行原位温度诱导抗原修复的方法，包括以下步骤：
a)提供固定在所述样品支撑件上的所述生物样品；
b)提供一微流体装置，其包括微流腔室、位于所述微流腔室的一端的至少一个流体入口以及位于所述微流腔室的另一端处的至少一个流体出口，所述微流体装置被构造成引导在压力下从流体进料系统供应的流体通过所述微流腔室，其中，所述微流腔室的至少一个壁由所述样品支撑件构成，并且以与所述的微流腔室的第一壁之间流体密封和可移除的方式，通过夹持结构安装在密封件上，其中，所述微流腔室的体积为2.5μl至200μl；
c)以流体密封的方式将所述微流腔室和所述样品支撑件安装在一起，并且样品朝向微流腔室的内部；
d)在高于大气压的压力下进行温度控制的抗原修复步骤，其中，所述修复步骤包括：
-在高于大气压的微流腔室中的压力Pchamber下，通过流体入口向微流腔室中注入表位暴露溶液；
-将微流腔室加热至孵育温度设定点(TAR)和，并且将微流腔室的温度维持在所述孵育温度设定点一段培养时间ti；
-在冷却时间tc内，将微流腔室冷却至低于所述孵育温度设定点并高于或等于室温的冷却温度，其中所述孵育温度设定点TAR在约60℃至200℃之间，微流腔室中的压力Pchamber大于1.5巴，其中，孵育时间ti为0.5-30分钟。
在一个优选的实施方式中，冷却时间tc可以为1-30min。
在一个优选的实施方式中，在温度控制的抗原修复步骤S1中，孵育温度设定点TAR可以在110℃至200℃之间。
在一个优选的实施方式中，在温度控制的抗原修复步骤S1中，微流腔室中的压力Pchamer可以在2.5至5巴之间。
在一个优选的实施方式中，培养时间ti可以在2至20分钟之间，优选地在2至15分钟之间。
在一个优选的实施方式中，本发明的方法还包括以下步骤：
e)通过流体入口以约1μl/s至约100μl/s之间的流速依次将多种试剂注入微流腔室中，所述的试剂包括至少一种成像探针；
f)成像由与所述至少一种成像探针反应的样品的组分发射的信号；
g)用不同的成像探针重复步骤(e)和(f)；
在一个优选的实施方式中，所述的依次将多种试剂注入包括：
-洗脱步骤，其中注入洗脱缓冲液以去除可能残留在样品上的不期望的物质；
-任选的非特异性结合封闭(blocking)步骤，其中注入封闭缓冲液；
-样品标记步骤，其中注入成像探针；和
其中每一个步骤之前都可以有一个任选的洗涤步骤，在该步骤中注入洗涤缓冲液，
其中所述至少一种成像探针来自于一系列特异性抗体的注入，所述特异性抗体作为标记探针和色原或荧光检测分子，其靶向所述样品中待分析的分子实体。
在一个优选的实施方式中，所述依次注入多种试剂的每个步骤对于每种试剂包括两个流速步骤：
-第一流速步骤，在约1μl/s到约100μl/s的范围内以初始流速注入试剂；
-第二流速步骤，其中以较低的流速(通常从约0.001到约1.0μl/s)注入相同试剂，以确保在按次序注入下一个试剂之前，将所述试剂与样品孵育。
在一个优选的实施方式中，第一流速步骤持续1s至120s。
在一个优选的实施方式中，试剂的第二流速步骤持续约1分钟至约30分钟。
在一个优选的实施方式中，样品标记步骤可以包括注入至少一种标记探针，以与样品中的某些DNA/RNA物质原位杂交，例如标记的RNA或DNA探针。
在一个优选的实施方式中，样品标记步骤可以进一步包括在微流腔室内施加温度循环，以使样品中的DNA/RNA物质与RNA或DNA探针杂交。
在一个优选的实施方式中，成像步骤可以通过荧光显微镜或亮场显微镜进行。
在一个优选的实施方式中，可以在施加温度循环的同时进行洗脱步骤，以确保在用另一样品标记步骤重复该方法之前，去除可能残留在样品上的不希望的原位杂交探针或标记。
本发明的其它目的是通过提供根据权利要求7所述的装置来实现的。
根据本发明的第二方面，本文公开了一种适用于前述权利要求中任一项所述的方法的生物样品处理装置，其包括支撑结构、温度单元、微流体装置、加压流体供给系统和控制系统，该微流体装置包括容积在2.5μl至200μl之间的微流腔室、位于所述微流腔室的一端的至少一个流体入口和位于所述微流腔室的另一端的至少一个流体出口，所述微流体装置被构造成引导流体通过微流腔室，以与所述微流腔室内的样品反应，微流腔室的至少一个壁由样品支撑件构成并以与微流腔室的第一壁之间流体密封和可移除的方式，通过夹紧结构安装在密封件上，所述夹持结构被构造成将样品支撑件和微流体装置之间的密封件压缩到足以容纳微流腔室中的压力Pchamber大于1.5巴、优选大于2巴、尤其大于2.5巴、更优选大于3巴的程度。
在一个优选的实施方式中，微流体装置可以是基本平坦的透光材料基板的形式，其包括连接到流体入口孔的微流体入口通道网络和连接到流体出口孔的微流体出口通道网络，流体入口孔和流体出口孔两者都开口朝向对应于基板的腔室边界侧的基板的第一侧上。
在一个优选的实施方式中，在第一面和样品支撑件之间的腔室的高度小于100μm，其被构造成确保试剂沿着放置在样品支撑件上的生物组织样品的平流传输。
在一个优选的实施方式中，支撑结构包括基座结构和夹持结构，该夹持结构包括设有窗口的夹持板，以允许显微镜通过透明基板观察生物样品。
在一个优选的实施方式中，微流体装置可以位于样品支撑件的顶部，微流体装置的腔室侧和密封件向下朝向样品支撑件并位于生物样品上方。
在一个优选的实施方式中，处于压力下的流体供料系统包括安装在基座结构中的流体供给通道和流体出口通道，每个均包括在面向夹持结构的可移动夹持板的孔口端处的密封件，密封件在围绕微流体装置的流体入口孔或流体出口孔的位置处被压靠在面向微流体装置的基板侧的腔室上，压缩状态下的密封件被构造成能够支撑至少1.5巴，优选大于2巴，特别是大于2.5巴，更优选大于3巴的压力。
在一个优选的实施方式中，温度单元被安装在样品支撑件位置下方的基座结构中，该温度单元包括加热单元，该加热单元任选地被安装在将热量传导至样品支撑件并且位于样品支撑件的正下方的导热单元中。
在一个优选的实施方式中，加热单元包括珀耳帖(Peltier)装置或多个堆叠的珀耳帖(Peltier)装置。
在一个优选的实施方式中，温度单元还包括冷却单元，例如以冷却块的形式，该冷却块包括迷宫式的流体流动通道，以使冷却流体从中流过，以提供对样品支撑件的主动冷却。
在一个实施方式中，样品处理装置还包括集成在基座结构和/或夹持板中的一个或多个温度传感器，该温度传感器被构造成测量样品支撑件或微流体装置和/或加热单元和/或传热装置中的温度，所述一个或多个温度传感器构成温度控制系统的一部分，该温度控制系统被构造成控制温度单元的操作。
附图的简要说明
图1a示出了根据本发明实施方式的生物样品处理装置2，该装置显示为处于关闭状态以备使用。
图1b是图1a的装置的透视图，示出了处于打开状态的夹持结构，其中微流体网络装置被移除；
图1c是图1a的沿1c-1c线的剖视图。
图1d是图1b的沿1d-1d线的剖视图。
图1e是图1a的沿1e-1e线的剖视图。
图1f是图1b的沿1f-1f线的剖视图。
图1g是图1c的横截面图的部分放大图。
图2示出了在本发明方法的原位抗原修复、染色和成像步骤循环中使用的处理次序(2A)，而省略每个主要流程步骤(S1至S4)和在步骤S1下用于AR的温度控制方案之间的任选的缓冲液洗涤步骤(2B)。
图3显示了如实施例2所述在原位抗原修复后进行了免疫染色获得的DAPI(A)和PR(B)通道以及组合(C)的荧光图像。
图4显示了如实施例3中所述的本发明方法的温度控制的AR处理步骤中使用的各种温度控制方案；a：在约1分钟内从室温加热至105℃，在该温度下孵育约10分钟，和在约7分钟内每3℃地冷却至85℃，然后冷却至室温；b：在约1分钟内从室温加热至98℃，在该温度下孵育约10分钟，并在约4分钟内每3℃地冷却至85℃，然后冷却至室温。
图5示出了根据本本发明的方法进行在对(1)标准温度诱导的抗原修复程序或(2)原位抗原修复和洗脱步骤之前，对乳腺癌组织切片进行的各种生物标记物的实施例4的共定位染色期间获得的连续图像。图像次序A到D对应于方案中指示的获取次序。
图6a是根据本发明的一个实施方式的生物处理装置的微流体装置和样品支撑件的示意性截面图；和
图6b是穿过图6a的VIb-VIb线的微流体装置的一段透视图，其示出了用于流体进入和流出微流腔室的微流体通道网络。
发明详述
术语“表位暴露溶液”是指适合于热诱导的表位修复并且是技术人员已知的任何溶液。典型的表位暴露溶液为如“显微镜、免疫组织化学和抗原修复方法：用于光学和电子显微镜”，M.A.Hayat，2002，斯普林格科学+商业媒体纽约(“Microscopy,Immunohistochemistry,and Antigen Retrieval Methods:For Light and ElectronMicroscopy”by M.A.Hayat,2002,Springer Science+Business Media New York)所述的。
参照附图，特别是首先参照图1a-1g和6a-6b，示出了一种根据本发明的实施方式的生物样品处理装置2。生物样品处理装置2被构造成用于进行生物样品的原位温度诱导的抗原修复，并且可以进一步被构造成通过循环多路复用(cycle multiplexing)执行样品的原位成像。生物样品处理装置2被构造成在高于大气压的压力下将试剂注入到微流腔室40中，以便在大气压下在或超过试剂的沸腾温度的温度下加热注入到腔室40中的试剂。在一个优选的实施方式中，该装置被构造成腔室内的压力在1.5至5巴的范围内。
在本发明的一个实施方式中，样品处理装置2包括支撑结构4、温度单元6、微流体装置8、加压流体进料系统10和控制系统(未示出)。
该控制系统包括微处理器，该微处理器从装置2的温度和压力传感器接收温度和压力输入，以自动或基于用户的方式控制温度单元和加压流体进料系统，以控制装置(尤其是注入到微流腔室40的流体和试剂)的温度和流体压力参数。
样品处理装置2含有生物样本支撑件12。生物样品支撑件可以例如是以载玻片的形式，以在显微镜下观察，所述显微镜如众所周知的在组织样品和其它生物样品的显微镜检查。
如最佳的图6a所示，微流体装置8在关闭状态安装在样品支撑件12上，并在它们之间形成微流腔室40。微流体装置包括密封件42，该密封件42被构造成完全围绕腔室40，由此当在一定的夹持力F下将样品支撑件12相对于微流体装置8夹紧时，密封件42在样品支撑件12和微流体装置8之间被压缩到足以承受至少1.5巴以上的压力的程度，并且在实施方式中，达到5巴或更高。因此，可以在抗原修复过程中在1.5至5巴或更高的压力下，供应注入腔室40中的试剂，以便能够在超过大气压下的沸点的温度下加热试剂。
在一个实施方式中，微流体装置8为基本平坦的透光材料的基板9的形式。基板在其中包括连接到流体入口孔32的微流体入口通道网络36和连接到流体出口孔34的微流体出口通道网络38。流体入口孔32和流体出口孔34均开口朝向板的对应于基板9的腔室边界侧的第一侧33。
微流体入口通道网络36连接沿着腔室40的入口边缘延伸的多个孔口37，在此试剂流动到腔室中。微流体出口通道网络38连接沿着腔室40的出口边缘延伸的多个孔口39，在此试剂从腔室40中流出。微流体入口通道网络36和出口通道网络38位于基板内，并且分别被构造成将单个入口32互连到多个腔室入口孔37，和将单个出口互连到多个腔室出口孔39。
根据一个特定方面，微流腔室40被构造成用于所述微流腔室40内的流体的平流传输(advective transport)。第一面33和样品支撑件12之间的腔室的高度优选地小于100μm，以便能够使得并确保试剂沿着放置在样品支撑件上的生物组织样品1的平流传输。平流传输提供了试剂和组织样品之间的最佳交换。低的腔室高度还确保了腔室40内的最小体积，使其能够非常快地被加热，并且如果需要的话，可以被快速地冷却或以期望的受控冷却速率冷却，从而减少了在高温下进行抗原修复的时间。
密封件42可以是垫圈密封件的形式，其部分地嵌入在围绕腔室40、腔室入口孔37和腔室出口孔39的基板9中的相应凹槽中。
支撑结构4包括基座结构14和夹持结构16，该夹紧结构包括由操纵杆结构22操纵的夹持板18。如图1d和1f所示，夹持板18处于向上和打开状态。样品支撑件12可以定位在基座14上，其中生物样品1朝上。微流体装置8可以定位在样品支撑件12的顶部，腔室侧33和密封件42朝下对着样品支撑件12，并且在生物样品上方。为了在显微镜下通过透明基板9观察生物样品1，可以在夹持板18上设置窗口20。可以在夹紧板的底部设置例如由透明聚合物或玻璃制成的隔离板19，以作为夹持板18和微流体装置12之间的界面。
处于压力下的流体进料系统10包括流体供给通道44和流体出口通道46，流体供给通道和流体出口通道包括在其面向夹持板18的孔端处的密封件48。密封件48可以例如是小垫圈或O-形环的形式，其部分地安装在基座14中的对应凹槽中。当装置关闭时，在微流体装置8的流体入口孔32、流体出口孔34周围的位置处，分别将密封压向面向基板9的侧面33的腔室压缩。因此，当将微流体装置放置在样品支撑件12的顶部上时，微流体装置的密封件42被压缩在样品支撑件12上，并且流体进料系统的密封件48在基板9和基座14之间被压缩。压缩和密封装置被构造成支撑至少1.5巴，优选在2-5巴或更大压力。
夹持结构16具有带有杠杆臂作用的铰链连接件17，该铰链连接件允许将例如在30牛顿至500牛顿的高夹紧力施加在微流体网络装置8的基板9上。可以提供这种效果的各种领域中使用的铰接结构是本身众所周知的，因此不需要更详细地描述。在本发明的范围内，可以使用被构造成产生用于将微流体装置向下夹持在基座和样品支撑件上所需的力的各种夹持装置。
流体入口和出口44、46可以如图1g中最佳示出的那样连接至基座结构14的底侧和连接到连接至流体供给和处理系统(未示出)的管道。流体供给和处理系统包括连接到所需试剂供应的泵系统，该泵系统被构造成以超过1.5巴的压力，优选超过2-5巴或更大范围内的压力将试剂输送到生物样品处理装置2。
温度单元6安装在样品支撑件12位置下方的基座结构14中。温度单元包括加热单元26，该加热单元26可以优选地包括珀耳帖(Peltier)装置或多个珀耳帖(Peltier)装置，例如一对堆叠的珀耳帖装置1。然而，加热单元26还可以包括其它例如感应线圈或电阻式电加热器加热器装置等的变型。如所示的实施例中所示，加热单元26可以任选地安装在传热单元24中，该传热单元24将热量传导到样品支撑件12并且位于样品支撑件12的正下方。加热单元26或传热单元24可以与样品支撑件12直接接触，或者以小间隙与样品支撑件12分离。在所示的实施例中，珀耳帖装置26安装在传热单元24中，该传热单元24基本上构成导电块，例如该导电块由金属制成以将热传导至样品支撑件12。可以在加热单元26和样品支撑件12之间的传热单元24中可以设置一个通道25或多个通道，以通过传导和辐射进行传热。替代地或另外地，通道25还可用于将温度传感器安装在温度控制系统中，以控制温度单元6的操作，特别是加热单元26的操作。
温度单元6可以任选地进一步包括冷却单元28，例如以冷却块54的形式，该冷却块包括迷宫式流体流动通道56，以使冷却流体从中流过，以便在高温下抗原修复步骤结束时主动冷却样品支架12。然而，根据变型，可能不需要主动冷却，并且可以例如通过省略冷却单元28或通过冷却单元28的空气冷却而没有冷却流体在冷却单元块内通过来实现被动冷却。温度单元可以通过固定的安装结构或通过夹持装置50被夹紧在基座14上。
夹持装置可以优选地设置有可调节的活塞结构51。活塞结构可以被机械或液压或气动驱动。在一个优选的实施方式中，活塞结构由压缩气体驱动，例如通过入口53在活塞51下方注入压缩空气。活塞结构51用于从下方将样品支撑件12推向微流体装置8，以改进微流体装置8和样品支撑件12之间压缩的密封件42的夹紧和流体密封，并允许自动补偿在样品支撑件12和微流体装置8之间的任何未对准/不平坦，防止在本发明中可能发生的高压下(通常超过3巴)泄漏。活塞结构还可以用来调节冷却单元对加热单元26和基座14的压力。活塞结构的压缩气体驱动优选地提供了样品支撑件12相对于微流体装置8的稳定且精确控制的偏压力。
生物样品处理装置2可以进一步包括集成在基座结构14(例如，在通道25中)和/或夹持板18中的一个或多个温度传感器，该温度传感器被构造成测量样品支撑件12或微流体装置8和/或加热单元26和/或传热单元24中的温度。温度传感器可以包括温度测量领域中众所周知的各种传感器，例如光学检测器、红外检测器。在一个优选实施方式中，温度传感器是电阻传感器。温度传感器也可以连接到流体出口44。一个或多个温度传感器可以构成温度控制系统的一部分，该温度控制系统被构造成用于控制抗原修复处理步骤期间的温度单元的操作等。
在一个实施方式中，温度控制系统和温度单元6被连接到自动化控制系统。控制系统可以包括本领域中已知的反馈元件的任何有用的组合，例如比例、积分和微分反馈元件，以控制用于提供试剂的泵和阀系统和控制根据特定的工艺参数，进行加热和冷却操作的温度单元6。在一个实施方式中，自动控制系统可以包括例如可商购的电子PID控制器，并且可以使用计算机软件来调节自动控制系统的参数。
根据本发明的一个实施方式，参照附图，特别是图2，用于固定在样品支撑件上的样品的原位温度诱导的抗原修复方法可以优选地包括以下步骤：
(i)提供固定在样品支撑件12上的样品1；
(ii)提供一种微流体装置8，其包括微流腔室40、位于所述微流腔室的一端处的至少一个流体入口32和位于所述微流腔室的另一端处的至少一个流体出口34，所述微流体装置被构造成引导在压力下从流体进料系统10供应的流体通过所述微流腔室40，用于以均匀方式在所述微流腔室中输送流体物质和试剂，其中所述微流腔室的至少一个壁由所述样品支撑件12构成，并且以与所述流腔室40另一壁33之间流体密封且可移除的方式，通过夹持结构16安装到密封件42上，并且微流腔室的体积为2.5μL至200μL；
(iii)以流体密封的方式将所述微流腔室和所述样品支撑件安装在一起，并且样品1朝向微流腔室40的内部；
(iv)在高于大气压的压力下进行温度控制的抗原修复步骤S1，其中所述步骤包括：
-在1.5-5巴的微流腔室40中，在压力Pchamber下，通过流体入口32向微流腔室40注入表位暴露溶液；
-将微流腔室加热至孵育温度设定点(TAR)，并且将微流腔室的温度维持在该所述孵育温度设定点一段培养时间ti；
-在冷却时间tc内，将微流腔室冷却至低于所述孵育温度设定点并高于或等于室温的冷却温度，
其中所述孵育温度设定值TAR在约60℃-200℃之间，孵育时间ti在约0.5-30分钟之间，冷却时间tc在约1-30分钟。
根据另一方面，提供了一种根据本发明的固定在样品支撑件上的样品的原位温度诱导的抗原修复的方法，其中所述固定的样品随后被染色，特别是免疫染色并在相同的样品支撑件上成像。
根据另一方面，提供了一种根据本发明的固定在样品支撑件上的样品原位温度诱导的抗原修复的方法，其中所述方法还包括在温度控制的抗原修复步骤S1之后的以下步骤：
(v)通过流体入口以约1μl/s至约100μl/s之间的流速依次将多种试剂注入微流腔室中，所述的试剂包括至少一种成像探针；
(vi)成像由与所述至少一种成像探针(S4)反应的样品的组分发射的信号；
其中，所述的依次将多种试剂注入包括：
-洗脱步骤(S2，S2')，其中注入洗脱缓冲液以去除来自上一循环的潜在的残留在样品上的不期望的物质，例如抗体；
-样品标记步骤，其中注入成像探针(S3，包括S3'，S3'等)；和
-其中在每个步骤之前均可进行任选的洗涤步骤，在该步骤中注入洗涤缓冲液。
根据另一个方面，提供了一种根据本发明的固定在样品支撑件上的样品原位温度诱导的抗原修复方法，其中所述方法在步骤(vi)之后还包括：
(vii)洗脱步骤(S0)，其中注入洗脱缓冲液以除去可能残留在样品上的不期望的物质，例如标记探针(例如抗体或标志物)；
(vi)用不同的成像探针重复步骤(iv)和(vii)；
根据一方面，可以通过关闭加热单元24(自然或被动冷却)或通过用冷却单元强制或主动冷却(例如，通过使冷却液在冷却块54的通道56中流动)来实现将微流腔室的温度降低到所述孵育温度设定点以下的温度。冷却流体的流速可以用于控制冷却程度。可以通过根据降温曲线(即通过设置冷却时间、冷却步骤、斜率(主动冷却))在冷却期间将温度控制系统设置为达到冷却温度设定点(Tc)来控制冷却单元28。冷却时间段可以是离散的，包括两个或以上的温度增量(至第一和随后的冷却温度设定值(Tc))降低。在其它实施方式中，在以自然冷却继续冷却之前，将冷却时间离散化至第一冷却温度设定点(Tc)。
在一个实施方式中，第一冷却温度设定值(T c)为40℃-200℃，其中，所述冷却温度设定值低于孵育温度设定点，特别是低于约40℃至约60℃。例如，可以是大约50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、120℃、140℃、160℃、180℃或200℃。
在一个实施方式中，微流腔室的内部压力值(Pchamber)在大约2至5巴之间，例如2、2.5、3、3.5、4、4.5或5巴。在一个优选的实施方式中，其在1.5至3巴之间，特别是在2至3巴之间。
在另一个实施方式中，孵育温度设定值(TAR)在约60℃和约200℃之间。例如，可以是约60℃、70℃、80℃、90℃、95℃、100℃、110℃、115℃、120℃、140℃、160℃，180℃或200℃。在一个优选的实施方式中，其为110℃至140℃。
在另一个实施方式中，孵育时间(ti)通常在2至20分钟之间，特别是2至5或5至10分钟。例如，可以是约2分钟、2.5分钟、4分钟、5分钟、10分钟或20分钟。如果要实现相同的期望效果，优选使ti尽可能短，从而使总的样品处理时间保持很短。
在另一个实施方式中，表位暴露溶液的pH值高于5.5。例如，表位暴露溶液可以具有6或9的pH。可以使用不同的缓冲液组分获得最佳的AR条件。例如，pH为6的柠檬酸钠缓冲液包含吐温20或pH为9的Tris-EDTA缓冲液。在其它实施方式中，更多的酸性溶液(例如pH小于5)也可以用作表位暴露溶液。
在一个实施方式中，成像探针是适于与样品上的特定分子实体相互作用的标记探针。例如，成像探针可以是标记的RNA或DNA序列，用于与样品中的RNA或DNA序列原位杂交(互补序列)。在另一实施方式中，成像探针是直接与靶抗原结合的标记的第一抗体(例如荧光)。
在另一个实施方式中，成像探针是通过注入一系列标记探针(例如特定抗体和显色剂或荧光检测分子)而产生的，其靶向样品中待分析的分子实体。在一个实施方式中，成像探针源自在第一抗体之后注入的标记的第二抗体(例如，荧光)。
根据一个特定的实施方式，所注入的多种试剂的流速为约1μl/s至约30μl/s，例如约5μl/s至约30μl/s(例如约25μl/s)。
根据另一特定实施方式，由从样品支撑件12的壁到微流腔室的相对壁33的距离限定的微流腔室的高度在大约10μm和大约300μm的范围内，并且微流腔室的对角线或直径在约100μm到约56mm之间，形成浅而宽的几何形状。
在另一个实施方式中，依次将多种试剂注入的每个步骤所进行的一段时间，使依次在溶液流动步骤中从微流腔室中冲洗出先前溶液，其中冲洗先前溶液的浓度为降低至先前注入浓度的1％。
在另一个实施方式中，依次将多种试剂注入的每个步骤所进行的一段时间，使所注入的溶液的浓度增加至微流腔室内的预定浓度的99％。
在一个实施方式中，依次将多种试剂注入的每个步骤持续约1s至约120s，例如约5s至约20s(例如约10s)。
在另一个特定的实施方式中，依次将多种试剂注入的每个步骤包括：
-任选的封闭步骤(S2')，其中注入封闭缓冲液；
-任选的孵育步骤，其中在有或没有任何流动条件下孵育先前注入的封闭缓冲液；
-任选的清洗步骤，其中注入清洗缓冲液；
-样品标记步骤，其中注入成像探针(S3)；
-任选的孵育步骤，在有或没有任何流动条件下孵育先前注入的成像探针；
-洗涤步骤，其中注入洗涤缓冲液(S3a)；
-任选的预成像步骤(S4')，其中注入成像缓冲液；
其中样品标记步骤包括直接注入标记的探针或注入成为成像探针的一系列标记探针。
根据一个特定的实施方式，样品标记步骤S3包括注入成为成像探针的一系列标记探针，包括注入第一抗体的第一步(S3')、注入洗涤缓冲液的洗涤步骤(S3”’)和注入标记的第二抗体的另一步(S3”)。
在一个特定实施方式中，样品标记步骤S3包括注入第一抗体的第一步(SB3')、注入洗涤缓冲液的洗涤步骤(SB3”')、注入酶联第二抗体的第二步(SB3”)、注入洗涤缓冲液的洗涤步骤(SB3””)和注入与第二抗体偶联的酶反应的发色团或荧光检测分子的另一步骤SB3*。
在另一个特定的实施方式中，样品标记步骤包括注入第一抗体的第一步(SB3')、注入洗涤缓冲液的洗涤步骤(SC3”')、注入第二抗体的第二步、注入洗涤缓冲液的洗涤步骤(SC3”)、注入酶偶联的第二抗体的第三步骤(SC3””)、注入洗涤缓冲液的洗涤步骤(SC3*)，和注入与第二抗体偶联的酶反应的发色团或荧光检测分子的另一步骤SC3**。
在另一个特定的实施方式中，样品标记步骤包括注入至少一种标记的探针，以便与样品中的某些DNA/RNA物质进行原位杂交，例如标记的RNA或DNA探针。
在另一个特定实施方式中，当样品标记步骤包括注入至少一种标记探针以便与样品中的某些DNA/RNA物质进行原位杂交时，本发明的方法进一步包括在微流腔室内施加样品中某些DNA/RNA物质与RNA或DNA探针(互补序列)的杂交和去杂交步骤所必需的温度循环。例如，微流腔室或样品支撑件外部的加热器可以施加这样的温度循环。例如，可以按照现代病理学(Modern Pathology),2011,24,613–623；doi:10.1038/modpathol.2010.228所述的方法实现原位杂交。然后在固定的杂交探针上进行成像，以用于RNA和DNA序列检测(标记的互补序列探针)。
在一个特定的实施方式中，依次注入多种试剂的每个步骤包括针对每种试剂的两个流速步骤：
-第一流速步骤，以约1μl/s到约100μl/s的初始流速注入试剂；
-第二流速步骤，在依次注入下一试剂之前，以较低的流速(通常为0.001 μl/s至1.0μl/s)注入相同的试剂，以确保所述试剂与样品有足够的通量。
在另一个特定的实施方式中，试剂的第二流速步骤持续约1分钟至约30分钟(例如约2至约15分钟)。
根据一个特定的实施方式，第二流速步骤的持续时间取决于所使用的微流腔室40的体积以及试剂与样品孵育所需的时间。对于典型的第一抗体分子，对于小于100μm的腔室高度，计算的培养时间需要大约1分钟。
在一个实施方式中，成像步骤(vi)通过共聚焦荧光显微镜进行。
在一个实施方式中，成像步骤(vi)通过荧光显微镜进行。
在一个实施方式中，成像步骤(vi)通过亮场显微镜进行。
根据一个特定的实施方式，洗涤缓冲液选自磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Tris缓冲盐水(TBS)。
根据一个特定的实施方式，洗脱缓冲液选自添加有去污剂(TritonX)的低pH(例如pH 2)的溶液。洗脱缓冲溶液可以进一步包含高离子盐浓度(例如，从约0.001M NaCl到约1MNaCl)或离液剂。
根据一个特定的实施方式，封闭缓冲液选自柠檬酸钠缓冲液和添加有蛋白质(例如牛血清白蛋白或血清)和/或去污剂(例如吐温)的PBS。
根据一个特定的实施方式，非特异性结合封闭步骤(S2)是任选的。
根据一个特定的实施方式，样品标记步骤包括注入第一抗体的第一步(S3')、注入洗涤缓冲液的洗涤步骤(S3”')，和注入第二抗体的另一步骤(S3”)。
根据一个特定的实施方式，本发明的第一抗体可以是用于任何免疫组织化学和免疫荧光测定分析的任何合适的抗体，例如在Dabbs，诊断免疫组织化学：治疗学和诊断应用(Diagnostic Immunohistochemistry:theranostic and diagnostic applications)，第4版，2014,ISBN 978-1-4557-4461-9中描述的。例如，合适的抗体是针对临床相关表位的小鼠或兔抗人免疫球蛋白G或Y抗体。
在另一个实施例中，以连续方式施加流体。
根据一个特定实施方式，根据本发明的方法包括至少约2至80个步骤(iv)至(vii)的循环，特别是至少约20至80个步骤(iv)至(vii)的循环。
根据一个特定的实施方式，根据本发明的方法包括2至高达约200个步骤(iv)至(vii)的循环，特别是2至高达约20个循环或2至高达约100个循环。
根据一个方面，本发明的方法允许通过对多种样品，特别是生物样品，包括组织切片、细胞培养物、蛋白质或核酸制品上的分子谱进行循环多路复用，来对样品进行原位成像。
根据另一方面，提供用于通过本发明的方法进行分析的样品，所述的样品通过不同类型的技术固定，包括福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品、低温固定的组织样品、细胞涂片、活检样品和固定细胞制品。特别地，本发明中所述的方法可以应用于通过交联剂固定的样品，例如整个组织样品、包括但不限于乳腺、肺、扁桃体、淋巴结、前列腺、肠道、肝或肾的组织类型的外科或针式活检样品。该方法还可以应用于固定的肿瘤样品，包括来自癌症的活检样品，例如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌和黑素瘤。该方法还可以应用于流体性质的固定样品，例如体液，例如固定的血液样品或细胞涂片。该方法还可以应用于微生物特性的样品，例如细菌。取决于样品类型和所需应用，可以实现不同类型的样品制备步骤。例如，本发明所述的方法也可以应用于通过交联剂固定的样品，所述样品被切成薄片并且随后被置于诸如显微镜载玻片的支撑件上。适用于所述方法的显微镜载玻片包括涂覆的或带电的载玻片，例如聚赖氨酸涂覆的载玻片或凝胶涂覆的载玻片。所公开的方法也可以用悬浮的自由漂浮样品来进行，例如通过提供具有至少一个具有生物靶标固定和捕获能力的表面的微流体装置的封闭腔变体(例如涂覆有识别分子的表面)，然后将自由漂浮的样品注入腔室。
在替代方案中，通过将自由漂浮的样品固定在对样品具有特定亲和力的样品支撑件表面上，初步获得本发明方法中使用的固定在样品支撑件上的样品。
根据另一方面，标记探针包含成为成像探针的化学染料、抗体和抗体片段或寡核苷酸，所述成像探针例如原位杂交或扩增探针。
可以以任何适当的方式组合上述特征。
本发明方法的显著优点是无须重复安装和拆卸样品盖玻片(尤其是在每个成像周期中)以进行抗原暴露和成像，以上步骤可能会影响样品的完整性并导致再现性的降低并阻碍这一过程的完全自动化，这一优点对于可再现的标签也是必不可少的。
本发明方法的另一个显著优点是减少了诸如抗原修复的预处理之类的步骤的时间和所用试剂体积，使得以较低的试剂消耗获得较高的通量。
除了样品分析之外，根据本发明的方法还可用于多重遗传序列检测(例如通过原位杂交)。
根据权利要求书、详细说明和附图，本发明的其它特征和优点将显而易见。已经描述了本发明，下面的实施例仅是举例说明而非限制。
实施例
实施例1：具有可能的多路复用操作步骤的原位抗原修复和免疫荧光免疫染色以进行连续的样品标记循环
本发明的用于样品的原位高压温度控制的抗原修复和免疫荧光免疫染色的方法通过如图1所示的装置，在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品上实施，并随后进行如图2所示的方案，其具有任选的用于进行连续的样品标记循环的循环多路复用。
a)样品制备实施例
取决于样品类型和所需应用，可以实现不同类型的样品制备步骤。在本实施例中，在此作为典型实例描述之前进行用于FFPE组织样品的样品制备步骤。
首先将生物样品的组织玻片在HistoclearTM溶液中手动脱蜡，然后根据标准程序在EtOH系列中逐渐重新水化。该过程在本发明的装置(“玻片外”)的微流腔室外部执行。然后，样品准备好可用于进行本发明的如上述图1a-1g和6a-6b所示的实施方式所讨论的示例性装置所示的方法。示例性生物样品处理装置2(“玻片上”)用于实施根据本发明的原位抗原修复和免疫荧光免疫染色的方法，其中将样品1(例如按照a制备的样品)被固定在样品支撑件12上，其中，在如前所述的过程中，所述样品支撑件靠着微流体装置8保持，以在微流腔室40周围形成耐压的液密密封件。。
b)制备用于实施本发明方法的装置的实施例
首先，通过装置的试剂输送系统，微流腔室40填充有具有合适特性的溶液作为抗原修复介质(抗原修复溶液)(图2A中的步骤S1')，该试剂输送系统可以通过流体输送控制系统(可以是自动化的系统)来驱动。通过由包括压力传感器(例如压力计)的生物样品处理装置的控制系统控制的流体进料系统10，以高于大气压力(通常为大约1.5-5巴，例如大约2-3巴)的压力值(Pchamber)产生微流腔室40内的压力。
实施例2：原位高压温度诱导的抗原修复和免疫荧光免疫染色次序
本发明的方法的初始原位高压温度控制的抗原修复步骤可以在组织和试剂制备之后开始。
通过生物样品处理装置2的温度控制系统，在高压(大约2至3巴)下进行温度控制的AR处理步骤(图2A中的步骤S1”)，其中微流腔室40中的温度通过温度控制程序被控制，包括：
(i)控制加热阶段，其中在控制下将微流腔室的温度从室温加热到孵育温度设定点(TAR)；
(ii)孵育阶段，其中微流腔室的温度(Ti)保持在孵育温度设定点(TAR)；
(iii)冷却阶段，其中微流腔室的温度从孵育温度设定点冷却到冷却温度设定点，其中微流腔室的冷却可以是自然冷却或主动冷却(即在控制下进行)
孵育温度设定点、冷却温度设定点、加热和冷却时间、温度跨度(temperaturestep size)、斜率将取决于要暴露的表位类型。
温度控制方案如图2B所示。
通常，控制加热阶段(t1至t2)持续约1分钟至约3分钟，孵育温度设定点在约80至约130℃，孵育阶段(t2至t3)持续约2分钟至约20分钟，冷却阶段(t3至t4)持续约1分钟至约20分钟，冷却温度设定点可以是自然冷却后的室温，也可以是比孵育温度设定点低20％至90％的温度。实施例2和3提供了示例性的温度控制方案。
初始免疫染色/成像次序可以在冷却阶段期间或优选在冷却阶段之后立即开始。根据本发明的方法中使用的成像试剂次序(包括洗涤/洗脱溶液、封闭溶液、标记探针溶液等)被用于进行如图2A所述的连续的样品标记和成像循环。这种成像试剂次序通过流体供给系统的流体入口32被连续引入到微流腔室40中。当在多路复用模式下使用该方法时，在第一成像步骤之后，可以重复从抗原修复步骤到另一靶标标记物成像步骤的所有步骤，如下所述。
洗脱步骤(步骤S0或S2，图2A)
免疫染色/成像次序的每个循环(除了从S2开始的第一个循环)均始于首先通过流动洗脱缓冲液洗脱组织样品，流动洗脱缓冲液的组成和pH条件可根据分析样品的不同而变化，以去除可能残留在样品上的不期望的物质(例如抗体之类的标记探针)。例如，添加有0.05％TritonX去污剂的pH 2的0.1M甘氨酸缓冲液可用作洗脱缓冲液。
任选的非特异结合封闭步骤(步骤S2'，图2A)
然后任选地将封闭缓冲液(例如柠檬酸钠缓冲液或具有牛血清白蛋白的PBS-Tween)按照成像试剂的次序流过微流腔室，以在随后的步骤中降低蛋白质的非特异性结合。
样品标记步骤(步骤S3(S3’-S3”)图2A)
然后将成像探针或成为成像探针的标记探针引入在微流体通道中流动的成像试剂中。例如，成为标记探针的标记探针次序包括以下次序，其中第一抗体然后是第二抗体(标记探针)流过并被孵育，同时在每个步骤之间用洗涤缓冲液洗涤样品。标记探针的稀释比例取决于优化的方案或供应商说明。
或者，样品标记步骤的另一个实施例包括注入用于原位杂交的RNA或DNA标记的探针。在这种情况下，该方法进一步包括施加合适的温度循环以确保样品中的RNA或DNA物质与RNA或DNA标记的探针的互补序列杂交。
成像步骤(步骤S4，图2A)
在该循环结束后进行成像。
整个循环过程(步骤S0至S4)可使用不同的成像探针重复高达约50次。
本文提供了本发明方法的应用实施例，用于：
-对FFPE乳腺肿瘤切片的孕激素受体(PR)染色的表位激活
下表1显示了样品的制备(1、2)的实施例，并且对其进行本发明方法的步骤S1至S4(3-8)的一个循环以产生如图3所示的染色图像。
表1
Figure BDA0002363226630000191
Figure BDA0002363226630000201
如表1所述制备样品，然后再次用PBS洗涤载玻片，然后浸入添加有0.25％Triton-X去污剂的PBS中15分钟。然后，将载玻片插入如本文所述的用于实施本发明的方法的装置中。
在本实施例中，温度控制的AR处理步骤S1的整个过程的持续阶段是在高压(大约2至3巴)下保持10分钟进行的，如下所示：
(i)在约2.5分钟内将微流腔室40从室温控制加热到孵育温度设定点；
(ii)在孵育温度设定点将样品与AR溶液培养2至5分钟的孵育阶段，和
(iii)在约2.5分钟至7分钟内将微流腔室40从孵育温度设定点主动冷却回室温。
在高压温度控制的AR处理步骤之后的冷却阶段之后，通过在流体供给系统的流体入口依次将成像试剂序列引入微流控室40中开始样品的免疫染色/成像，其中，成像探针通过注射一系列作为如表1所述的标记探针的抗体(第一和第二抗体)而产生。
第一抗体结合：以15μl/s的流速施加10s，然后培养4分钟(S3’)。
洗涤：PBS以25μl/s的流速施加10s。(S3”’)
第二抗体结合：以15μl/s的流速施加10s，然后培养4分钟(S3”)。
洗涤：PBS以25μl/s的流速施加10s。(S3”’)
成像：免疫荧光染色后，将玻片复染并盖上盖玻片，以在显微镜(S4)下成像。然后，在Zeiss
Figure BDA0002363226630000202
软件上将图像可视化并用
Figure BDA0002363226630000203
进行分析。图3显示了使用所述的样品处理和荧光免疫染色方法获得的图像。显示DAPI通道有助于样品中核的定位。然后，分别显示PR通道和两个通道的组合。如本实施例所示，使用本发明的温度控制辅助方法，样品处理时间已大大减少。
-同一样品上多个标记物的连续表位修复和荧光免疫染色
本发明的方法用于对具有共表达4种不同标志物HER2(人表皮生长因子受体2)、ER(雌激素受体)、PR(孕激素受体)和CK(细胞角蛋白)的区域的样品(FFPE乳腺切片)进行原位高压温度控制的AR处理步骤，其中根据本发明的方法，在大约2到3巴的压力下，在每一步骤之间重新激活靶表位，如下所示：
样品的预处理在微流体装置外部进行，其中样品的脱石蜡作用如上文针对乳腺肿瘤切片所述进行。表2总结了所使用方法的特定方案。
但是，在此实施例中，根据标准程序在微流体装置的外部染色前，先在95℃的热水浴中进行了温度控制的AR处理步骤(“玻片外”)，培养40分钟，以研究温度控制的AR处理步骤在染色循环之间重新激活表位的单独作用。
然后，在经过温度控制的AR处理后，通过4个循环的基于乙酰胺信号放大(Tyramide Signal Amplification)(TSA)荧光免疫染色对样品进行反复免疫染色，并且在下表2所列条件下，对采用本发明方法的样品在微流控装置内原位进行免疫染色。对第四个生物标记物进行染色后，使用SlowFade GoldTM对样品进行复染，以显示细胞核。
表2
Figure BDA0002363226630000211
Figure BDA0002363226630000221
然后在共聚焦显微镜上分别在四个独立通道中获取图像，这些通道分别与成像探针的波长相对应：350、488、594和647nm。
可以看出，本发明的中间抗原修复处理方法允许在短时间内进行到下一个染色循环，这反过来使得每个循环减少到少于约10分钟，同时实现了样品的高效多重标记。
实施例3：FFPE乳腺肿瘤切片中HER2的原位抗原修复和荧光免疫染色
根据以下两种不同方案，将本发明的抗原修复方法用于固定在标准载玻片上的FFPE乳腺切片的HER2表位激活：
样品已按照实施例2的方法进行了预处理(在EtOH中脱蜡和梯度再水化)。然后，将pH为6(赛默飞世尔L pH6)的AR溶液填充到微流腔室中，并将两种不同的温度控制方案应用于温度控制元件，如图4a和4b所示。在第一个方案中，将AR溶液在样品上105℃孵育5至10分钟。然后，使用温度控制系统以3℃/min的速率将腔室逐渐冷却至85℃，然后进行快速、主动的冷却步骤直至达到室温(图4a)。第二种方案显示了另一个变型，其中将样品与AR溶液在98℃下孵育10分钟，然后进行受控的4步冷却和快速冷却步骤(图4b)。
实施例4：在FFPE乳腺肿瘤切片上的本发明的原位抗原修复方法与标准抗原修复方法的比较
在使用FFPE乳腺切片样品的热浴中，将本发明的原位高压温度控制的AR处理方法与标准AR方法进行了比较。在AR处理步骤之后，每个样本都被针对4种不同的标记物中的一种进行染色：HER2(人类表皮生长因子受体2)、ER(雌激素受体)、PR(孕激素受体)和CK(细胞角蛋白)，然后分析并比较图像质量和对比度。
对照样品的AR处理在95℃的热水浴中进行，孵育时间为30分钟。将用本发明的AR方法处理的样品进行如实施例1所述的AR方案。
对于用两种不同的AR方案处理的样品，染色方案保持相同。使用实施例1中所述的方案，唯一的区别是使用基于HRP的显色检测元件代替荧光第二抗体。
图5显示不同生物标记物的每种染色的对比度至少增加了一倍，因此图像质量比玻片外AR后以标准方式进行的染色要高得多，而大大缩短了本发明的处理时间(大约5分钟的高温孵育，而不是30分钟)
图中使用的编号清单
样品1
生物样品处理装置2
支撑结构4
基座结构14
夹持结构16
夹持板18
观察通道20
垫片19
操纵杆结构22
铰链连接17
安装装置50
活动活塞51
压缩空气入口53
温度单元6
传热单元24
通道25
加热单元26
珀耳帖装置
冷却单元28
冷却流体入口/出口30冷却块54
流体流动通道56
微流体装置8
基材9
第一面33
第二面35
流体入口孔32
微流入口通道网络36
腔室入口孔37
微流腔室40
微流出口通道网络38
腔室出口孔39
流体出口孔34
密封件42
流体进料系统10
泵和阀系统(未显示)
流体供给通道44
密封件48
流体出口通道46
密封件48
样品支撑件12
控制系统
温度控制系统
温度传感器
压力控制系统
压力传感器

Claims (23)

1.一种对固定在样品支撑件(12)上的生物样品(1)进行原位温度诱导的抗原修复的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)提供固定在所述样品支撑件上的所述生物样品；
b)提供一微流体装置(8)，其包括微流腔室(40)、位于所述微流腔室的一端的至少一个流体入口(32)和位于所述微流腔室的另一端的至少一个流体出口(34)，所述微流体装置(8)被构造成引导在压力下从流体进料系统(10)供应的流体通过微流腔室(40)，其中，微流腔室的至少一个壁由样品支撑件构成并以与微流腔室(40)的第一壁(33)之间流体密封且可移除的方式，通过夹持结构(16)安装在密封件(42)上，其中，微流腔室的容积在2.5μL至200μL之间；
c)以流体密封的方式将所述微流腔室和所述样品支撑件安装在一起，所述样品(1)朝向微流腔室(40)的内部；
d)在高于大气压的压力下进行温度控制的抗原修复步骤S1，其中，所述步骤S1包括：
-在高于大气压的微流腔室中的压力Pchamber下，通过流体入口向微流腔室中注入表位暴露溶液；
-将微流腔室加热至孵育温度设定点TAR，并且将微流腔室的温度维持在所述孵育温度设定点一段培养时间ti；
-在冷却时间tc内，将微流腔室冷却至低于所述孵育温度设定点并高于或等于室温的冷却温度，其中所述孵育温度设定值TAR在60℃至200℃之间，微流腔室中的压力Pchamber大于1.5bar，孵育时间ti为0.5-30分钟，并且冷却单元是一个冷却块，所述冷却块包括迷宫式的流体流动通道，以使冷却流体从中流过，以提供对样品支撑件的主动冷却。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷却时间tc在1至30分钟之间。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述温度控制的抗原修复步骤S1中，孵育温度设定点TAR在110℃至200℃之间。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述温度控制的抗原修复步骤S1中，所述微流腔室中的压力Pchamer在2.5至5巴之间。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育时间ti在2至20分钟之间。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育时间ti在2至15分钟之间。
7.一种通过循环多路复用对样品进行原位成像的方法，其特征在于，包括实施如权利要求1所述的方法的步骤，另外还包括以下步骤：
e)通过流体入口以1μl/s至100μl/s之间的流速依次将多种试剂注入微流腔室中，所述的试剂包括至少一种成像探针；
f)对由与所述至少一种成像探针反应的样品的组分发射的信号进行成像；
g)用不同的成像探针重复步骤(e)和(f)。
8.一种适用于如权利要求1所述的方法的生物样品处理装置(2)，其特征在于，包括支撑结构(4)、温度单元(6)、微流体装置(8)、加压流体供给系统(10)、控制系统，用于控制设备和样本支撑件(12)的温度和流体压力参数，其中
所述支撑结构(4)包括可调节活塞结构(51)，所述活塞结构(51)从下方将所述样本支撑件(12)推向所述微流体装置(8)，以改进微流体装置和样品支撑件之间压缩的密封件(42)的夹持和流体密封，
所述微流体装置(8)包括容积在2.5μL至200μl之间的微流腔室(40)、位于所述微流腔室的一端的至少一个流体入口(32)和位于所述微流腔室的另一端的至少一个流体出口(34)，所述微流体装置被构造成引导流体通过微流腔室(40)，以与所述微流腔室内的样品反应，并且所述微流腔室的至少一个壁由样品支撑件构成，并以与微流腔室(40)的第一壁(33)之间流体密封和可移除的方式，通过夹持结构(16)安装在密封件(42)上，所述夹持结构(16)被构造成将样品支撑件和微流体装置之间的密封件压缩到足以容纳微流腔室中的压力Pchamber大于1.5巴的程度。
9.如权利要求8所述的样品处理装置，其特征在于，所述夹持结构(16)被构造成将样品支撑件和微流体装置之间的密封件压缩到足以容纳微流腔室中的压力Pchamber大于2巴的程度。
10.如权利要求8所述的样品处理装置，其特征在于，所述夹持结构(16)被构造成将样品支撑件和微流体装置之间的密封件压缩到足以容纳微流腔室中的压力Pchamber大于2.5巴的程度。
11.如权利要求8所述的样品处理装置，其特征在于，所述夹持结构(16)被构造成将样品支撑件和微流体装置之间的密封件压缩到足以容纳微流腔室中的压力Pchamber大于3巴的程度。
12.如权利要求8所述的样品处理装置，其特征在于，所述微流体装置是平坦的透光材料基板(9)的形式，其包括连接至流体入口(32)的微流体入口通道网络(36)和连接到流体出口(34)的微流体出口通道网络(38)，流体入口(32)和流体出口(34)都开口朝向对应于基板的腔室边界侧的基板的第一壁(33)上。
13.如权利要求8所述的样品处理装置，其特征在于，所述第一壁(33)与样品支撑件(12)之间的腔室的高度小于100μm，其被构造成确保所述试剂沿着放置样品支撑件上的生物样品(1)的平流传输。
14.如权利要求8所述的样品处理装置，其特征在于，所述支撑结构(4)包括基座结构(14)和夹持结构(16)，所述夹持结构包括设置有窗口(20)的夹持板(18)，以允许显微镜通过透明基板观察生物样品。
15.如权利要求8所述的样品处理装置，其特征在于，所述微流体装置(8)位于所述样品支撑件(12)的顶部，所述微流体装置的腔室的第一壁(33)和密封件(42)向下朝向所述样品支撑件并位于生物样品(1)的上方。
16.如权利要求8所述的样品处理装置，其特征在于，处于压力下的所述流体进料系统(10)包括安装在所述基座结构中的流体供给通道(44)和流体出口通道(46)，每个均包括在面向夹持结构的可移动夹持板的孔口端处的密封件(48)，密封件在围绕微流体装置的流体入口(32)或流体出口(34)的位置处被压靠在面向微流体装置的基板(9)的第一壁(33)的腔室上，压缩状态下的密封件被构造成支撑至少1.5巴的压力。
17.如权利要求16所述的样品处理装置，其特征在于，所述压缩状态下的密封件被构造成支撑大于2巴的压力。
18.如权利要求16所述的样品处理装置，其特征在于，所述压缩状态下的密封件被构造成支撑大于2.5巴的压力。
19.如权利要求16所述的样品处理装置，其特征在于，所述压缩状态下的密封件被构造成支撑大于3巴的压力。
20.如权利要求8所述的样品处理装置，其特征在于，所述温度单元(6)被安装在在所述样品支撑件(12)位置下方的基座结构(14)中，所述温度单元包括加热单元(26)，所述加热单元(26)包括一个珀耳帖装置或多个堆叠的珀耳帖装置，可任选地被安装在将热量传导到样品支撑件且位于样品支撑件正下方的传热单元(24)中。
21.如权利要求8所述的样品处理装置，其特征在于，所述温度单元还包括冷却单元(28)。
22.如权利要求8所述的样品处理装置，其特征在于，还包括集成在所述基座结构(14)和/或所述夹持板(18)中的一个或多个温度传感器，所述温度传感器被构造成测量所述样品支撑件(12)或所述微流体装置(8)和/或加热单元(26)和/或传热单元(24)中的温度，所述一个或多个温度传感器构成温度控制系统的一部分，所述温度控制系统被构造成控制温度单元的操作。
23.如权利要求22所述的样品处理装置，其特征在于，所述活塞结构由压缩气体驱动。
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