JPH08304388A - 免疫染色装置 - Google Patents
免疫染色装置Info
- Publication number
- JPH08304388A JPH08304388A JP13985595A JP13985595A JPH08304388A JP H08304388 A JPH08304388 A JP H08304388A JP 13985595 A JP13985595 A JP 13985595A JP 13985595 A JP13985595 A JP 13985595A JP H08304388 A JPH08304388 A JP H08304388A
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- JP
- Japan
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- ultrasonic wave
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- treatment
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 免疫染色の工程に超音波振動を利用する事に
より反応時間を大幅に短縮し且つ再現性が向上する事を
示した。 【構成】 抗原抗体反応の際に超音波振動を与える事に
より抗体の試料への浸透速度が向上し短時間に反応が終
了する。
より反応時間を大幅に短縮し且つ再現性が向上する事を
示した。 【構成】 抗原抗体反応の際に超音波振動を与える事に
より抗体の試料への浸透速度が向上し短時間に反応が終
了する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】組織及び細胞を観察するに当たっ
て、目的の部分を染色する事は常時行われている。最
近、免疫反応の特異的な選択性を利用して目的の部分だ
けを染色する免疫染色技術が開発され利用されている。
本発明は免疫染色を短時間に再現性良く行うために利用
される。
て、目的の部分を染色する事は常時行われている。最
近、免疫反応の特異的な選択性を利用して目的の部分だ
けを染色する免疫染色技術が開発され利用されている。
本発明は免疫染色を短時間に再現性良く行うために利用
される。
【０００２】
【従来の技術】免疫染色に当たっては技術的な問題が２
つあり、１つは免疫反応を行うため長時間を要する事で
あり、他は再現性の良い染色を行うためにはその操作に
細心の注意を要する事である。一般には試料中の抗原に
対して結合する抗体を含む試薬溶液を使用する。このた
め分子量の大きな抗体分子が試料中の抗原の場所まで拡
散により移動しなくてはならず、十分な染色を行うため
には必然的に時間がかかる。一般的には３０分から１時
間が普通である。再現性の良い染色を行うためにはこの
間を一定の環境条件を保たなくてはならず、温度、湿
度、試薬の濃度分布、その他多くの事に細心の注意を払
わなくてはならない。
つあり、１つは免疫反応を行うため長時間を要する事で
あり、他は再現性の良い染色を行うためにはその操作に
細心の注意を要する事である。一般には試料中の抗原に
対して結合する抗体を含む試薬溶液を使用する。このた
め分子量の大きな抗体分子が試料中の抗原の場所まで拡
散により移動しなくてはならず、十分な染色を行うため
には必然的に時間がかかる。一般的には３０分から１時
間が普通である。再現性の良い染色を行うためにはこの
間を一定の環境条件を保たなくてはならず、温度、湿
度、試薬の濃度分布、その他多くの事に細心の注意を払
わなくてはならない。
【０００３】免疫反応を促進するための手段として最も
一般的な方法としては、まず温度を上げ、拡散速度を向
上させる事が考えられ、それなりの効果が得られてい
る。反応時間は２分ではばらつき５分で安定に短縮して
いるが、反応時間はまだ十分に短縮されたとは言えな
い。（表１参照）
一般的な方法としては、まず温度を上げ、拡散速度を向
上させる事が考えられ、それなりの効果が得られてい
る。反応時間は２分ではばらつき５分で安定に短縮して
いるが、反応時間はまだ十分に短縮されたとは言えな
い。（表１参照）
【０００４】マイクロウエ−ブの照射により免疫染色の
迅速化が行われると言う報告があり、またこのための装
置も市販されている。この方法に対しての難点は条件の
設定が非常に難しい事にある。マイクロウエ−ブを照射
すれば当然試料の温度は上昇するが、この温度を計る方
法がなく、同じ照射容器内にいれたダミ−に温度計を取
り付けて測温し試料温度を推測するにすぎない。新しい
試料の染色に合った条件を決めるには多くの実験をやら
ないと実用になる結果がえらない。
迅速化が行われると言う報告があり、またこのための装
置も市販されている。この方法に対しての難点は条件の
設定が非常に難しい事にある。マイクロウエ−ブを照射
すれば当然試料の温度は上昇するが、この温度を計る方
法がなく、同じ照射容器内にいれたダミ−に温度計を取
り付けて測温し試料温度を推測するにすぎない。新しい
試料の染色に合った条件を決めるには多くの実験をやら
ないと実用になる結果がえらない。
【０００５】染色環境を一定に保つためには自動装置化
が有効な手段であるが、現在市販されている自動免疫染
色装置は省力化を主目的に設計されており、再現性の向
上と言う面からは今一つ物足りないし、染色に時間がか
かる問題は解決していない。
が有効な手段であるが、現在市販されている自動免疫染
色装置は省力化を主目的に設計されており、再現性の向
上と言う面からは今一つ物足りないし、染色に時間がか
かる問題は解決していない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】反応を短時間に行わせ
る事。抗原と抗体の結合は時間の掛かる反応ではないの
で、ここでは抗体が抗原に到達する時間が律速と考えら
れる。如何にして早く抗体を抗原の場に到達させるかが
解決すべき課題である。
る事。抗原と抗体の結合は時間の掛かる反応ではないの
で、ここでは抗体が抗原に到達する時間が律速と考えら
れる。如何にして早く抗体を抗原の場に到達させるかが
解決すべき課題である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】発明者は分子量の大きな
抗体をすばやく抗原の位置に到達させるため、超音波を
利用する事に依って反応所要時間を大幅に減少させる事
に成功した。超音波は元来個体液体界面にエネルギ−を
供給し、ミクロな攪拌を行う事により洗浄に効果を上げ
るが、免疫染色に於いても同様の効果が確認された。
抗体をすばやく抗原の位置に到達させるため、超音波を
利用する事に依って反応所要時間を大幅に減少させる事
に成功した。超音波は元来個体液体界面にエネルギ−を
供給し、ミクロな攪拌を行う事により洗浄に効果を上げ
るが、免疫染色に於いても同様の効果が確認された。
【０００７】但し、超音波のエネルギ−がスライドガラ
スに付着させた試料を洗浄効果に依って剥離させる影響
も無視できない。この点に付いては、慎重な検討が必要
である。
スに付着させた試料を洗浄効果に依って剥離させる影響
も無視できない。この点に付いては、慎重な検討が必要
である。
【０００８】
【作用】試薬に超音波振動を与える事に依ってミクロな
振動が抗体の運動を促し、組織または細胞への浸透を良
くし、抗原との接触の機会を増加させる。またこの振動
に依って抗体の濃度の均一化がはかられ染色むらが減少
する。
振動が抗体の運動を促し、組織または細胞への浸透を良
くし、抗原との接触の機会を増加させる。またこの振動
に依って抗体の濃度の均一化がはかられ染色むらが減少
する。
【０００９】
【実施例】４２ｋＨｚ，３０Ｗの小型超音波洗浄機の洗
浄槽に染色用１次抗体を含む試薬５００μｌを入れ、試
料を塗抹したスライドガラスを塗抹面を下にして浸し
た。試料としては子宮頸部腺癌細胞由来株Hela２２９を
スライドガラスに塗抹し７０％メタノ−ルで２４時間固
定した。本試料は PCNA（proliferateing cell nuclear
antigen ）の検出試験に使用した。また癌患者腹水よ
り採取した腺癌細胞の塗抹標本を細胞及び腫瘍マ−カ−
の検出に使用した。細胞剥離率試験には細胞浮遊液を塗
抹後９５％ エタノ−ルで２４時間固定した物を使用し
た。
浄槽に染色用１次抗体を含む試薬５００μｌを入れ、試
料を塗抹したスライドガラスを塗抹面を下にして浸し
た。試料としては子宮頸部腺癌細胞由来株Hela２２９を
スライドガラスに塗抹し７０％メタノ−ルで２４時間固
定した。本試料は PCNA（proliferateing cell nuclear
antigen ）の検出試験に使用した。また癌患者腹水よ
り採取した腺癌細胞の塗抹標本を細胞及び腫瘍マ−カ−
の検出に使用した。細胞剥離率試験には細胞浮遊液を塗
抹後９５％ エタノ−ルで２４時間固定した物を使用し
た。
【００１０】１次抗体としてはHeLa培養細胞に対しては
２００倍希釈抗PCNAモノクロナルIgG抗体、転移性腺癌
細胞に対しては４０倍希釈 CEA（carcinoembryonic ant
igen）抗体、８０倍希釈 EMA（epithelial membrane an
tigen）抗体、４０倍希釈 Ber-EP4 及び１６０倍希釈子
宮頸部腺癌培養株 OMC-4 に対する自家製抗体 AD117mを
使用した。標識抗体は４０倍希釈ペルオキシダ−ゼ標識
抗マウスラビット血清を使用した。
２００倍希釈抗PCNAモノクロナルIgG抗体、転移性腺癌
細胞に対しては４０倍希釈 CEA（carcinoembryonic ant
igen）抗体、８０倍希釈 EMA（epithelial membrane an
tigen）抗体、４０倍希釈 Ber-EP4 及び１６０倍希釈子
宮頸部腺癌培養株 OMC-4 に対する自家製抗体 AD117mを
使用した。標識抗体は４０倍希釈ペルオキシダ−ゼ標識
抗マウスラビット血清を使用した。
【００１１】免疫染色の手技は常法に従った。１次抗体
の反応時間を変化させて検出率を調べた。発色剤として
は０．００５％過酸化水素加０．０２％ジアミノベンジ
ジンを使用、対比染色としては HeLa 培養細胞に対して
は１％メチルグリ−ン液、腺癌細胞に対してはギルのヘ
マトキシリン液を使用した。染色試験の結果を表１及び
２に示す。表１には同時に比較した３７℃に加温して染
色を行った例も示す。
の反応時間を変化させて検出率を調べた。発色剤として
は０．００５％過酸化水素加０．０２％ジアミノベンジ
ジンを使用、対比染色としては HeLa 培養細胞に対して
は１％メチルグリ−ン液、腺癌細胞に対してはギルのヘ
マトキシリン液を使用した。染色試験の結果を表１及び
２に示す。表１には同時に比較した３７℃に加温して染
色を行った例も示す。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【表２】
【００１４】表１に見られる如く超音波振動を与える事
に依って、常法では３０分以上かかった PCNA 陽性率が
２分で得られており、しかもばらつきは半分に抑えられ
た。表２に見られるように、CEA については常法の１５
分に対して２分で検出が可能であり、その他のマ−カ−
に付いても大幅に反応時間の削減が可能であった。
に依って、常法では３０分以上かかった PCNA 陽性率が
２分で得られており、しかもばらつきは半分に抑えられ
た。表２に見られるように、CEA については常法の１５
分に対して２分で検出が可能であり、その他のマ−カ−
に付いても大幅に反応時間の削減が可能であった。
【００１５】細胞剥離試験では３種類のスライドガラス
を評価した。細胞剥離防止処理を施していないもの、0.
1% ポリ-L-リシン 処理及び 3-アミノプロピルトリエト
キシシラン処理を施した物を使用した。剥離試験の結果
を表３に示す。心配された細胞の剥離に付いては表３に
示す如くリジンまたはシラン処理を施す事により問題な
い程度に減少させることが出来た。即ち表１、２に見ら
れるように超音波を利用すれば２分間で十分な検出率が
得られる事から剥離細胞率は３％以下に抑えられる。
を評価した。細胞剥離防止処理を施していないもの、0.
1% ポリ-L-リシン 処理及び 3-アミノプロピルトリエト
キシシラン処理を施した物を使用した。剥離試験の結果
を表３に示す。心配された細胞の剥離に付いては表３に
示す如くリジンまたはシラン処理を施す事により問題な
い程度に減少させることが出来た。即ち表１、２に見ら
れるように超音波を利用すれば２分間で十分な検出率が
得られる事から剥離細胞率は３％以下に抑えられる。
【００１６】
【表３】
【発明の効果】免疫染色の抗原抗体反応を行わせる工程
に超音波振動を与える事により、所要時間が大幅に短縮
されしかも再現性が向上する事が確かめられた。これに
より免疫染色の自動化が容易に行われると共に、信頼性
の向上が期待される。現在の難点が取り除かれる事によ
り免疫染色の応用範囲が広がり、普及に拍車がかかるも
のと期待される。
に超音波振動を与える事により、所要時間が大幅に短縮
されしかも再現性が向上する事が確かめられた。これに
より免疫染色の自動化が容易に行われると共に、信頼性
の向上が期待される。現在の難点が取り除かれる事によ
り免疫染色の応用範囲が広がり、普及に拍車がかかるも
のと期待される。
【表１】 Hela 培養細胞に対する PCNA 陽性率（％） 反応時間 ３０秒 ２分 ５分 １０分 １５分 ３０分 常法 11.7±0.9 16.5±4.9 28.4±5.0 35.7±1.6 55.0±3.0 76.9±3. 5 37℃加温 28.4±7.4 54.4±5.6 77.3±5.1 80.3±4.6 82.8±3.8 80.7±5. 9 超音波法 36.0±7.8 84.0±3.1 92.4±1.2 93.9±2.4 95.1±0.9 90.1±5. 6
【表２】 腺癌細胞に於ける CEA, EMA, Ber-ep4, AD117m の検出 反応時間 ３０秒 ２分 ５分 １０分 １５分 ３０分 CEA 常法 − − ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ 超音波 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ EMA 常法 ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ 超音波 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ Ber-Ep4 常法 ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ 超音波 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ AD117m 常法 − ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ 超音波 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
【表３】 超音波処理による剥離細胞率（％） 処理時間 ３０秒 ２分 ５分 １０分 １５分 ３０分 未処理 9.8±0.7 11.8±0.9 16.3±0.2 22.4±1.5 36.9±1.9 52.6±1.5 リジン 1.7±0.2 3.1±0.2 5.8±0.5 13.3±1.9 21.6±0.9 34.5±1.5 シラン 2.1±0.2 2.4±0.2 3.9±0.3 9.0±0.5 22.1±1.1 37.8±2.4
Claims (2)
- 【請求項１】 染色しようとする試料に接触する試薬溶
液に超音波振動を与える事が出来る事を特徴とする免疫
染色に使用される装置。 - 【請求項２】 請求項１の使用に当たって、染色しよう
とする試料を保持するスライドガラスにシラン処理また
はリジン処理等の接着を強化する処理を行うことを特徴
とする免疫染色方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13985595A JPH08304388A (ja) | 1995-05-09 | 1995-05-09 | 免疫染色装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13985595A JPH08304388A (ja) | 1995-05-09 | 1995-05-09 | 免疫染色装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08304388A true JPH08304388A (ja) | 1996-11-22 |
Family
ID=15255114
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13985595A Pending JPH08304388A (ja) | 1995-05-09 | 1995-05-09 | 免疫染色装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08304388A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7673516B2 (en) | 2006-12-28 | 2010-03-09 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Ultrasonic liquid treatment system |
| US7712353B2 (en) | 2006-12-28 | 2010-05-11 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Ultrasonic liquid treatment system |
| JP2010119388A (ja) * | 2008-10-23 | 2010-06-03 | Akita Prefecture | 非接触撹拌方法、非接触撹拌装置、それを用いた核酸ハイブリダイゼーション反応方法、反応装置、試料中の核酸を検出する方法、核酸検出装置、試料中の抗体を検出する方法、及び抗体検出装置 |
| US7740666B2 (en) | 2006-12-28 | 2010-06-22 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Process for dyeing a textile web |
| JP2012013598A (ja) * | 2010-07-02 | 2012-01-19 | Akita Univ | 免疫組織染色方法および免疫組織染色装置 |
| US9421504B2 (en) | 2007-12-28 | 2016-08-23 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Ultrasonic treatment chamber for preparing emulsions |
-
1995
- 1995-05-09 JP JP13985595A patent/JPH08304388A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7673516B2 (en) | 2006-12-28 | 2010-03-09 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Ultrasonic liquid treatment system |
| US7712353B2 (en) | 2006-12-28 | 2010-05-11 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Ultrasonic liquid treatment system |
| US7740666B2 (en) | 2006-12-28 | 2010-06-22 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Process for dyeing a textile web |
| US9421504B2 (en) | 2007-12-28 | 2016-08-23 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Ultrasonic treatment chamber for preparing emulsions |
| JP2010119388A (ja) * | 2008-10-23 | 2010-06-03 | Akita Prefecture | 非接触撹拌方法、非接触撹拌装置、それを用いた核酸ハイブリダイゼーション反応方法、反応装置、試料中の核酸を検出する方法、核酸検出装置、試料中の抗体を検出する方法、及び抗体検出装置 |
| JP2012013598A (ja) * | 2010-07-02 | 2012-01-19 | Akita Univ | 免疫組織染色方法および免疫組織染色装置 |
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