CN116472116A - 流体输送方法 - Google Patents

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CN116472116A CN202180057483.7A CN202180057483A CN116472116A CN 116472116 A CN116472116 A CN 116472116A CN 202180057483 A CN202180057483 A CN 202180057483A CN 116472116 A CN116472116 A CN 116472116A
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H·金姆
A·M·坦托里
邢思远
R·巴拉德瓦杰
B·K·林
F·A·巴瓦
P·P·阿立姆斯扬
N·米凯耶
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Abstract

本文提供了一种用于透化生物样品的流体输送方法。该方法包括将流体输送到第一基板和/或第二基板。第一基板和第二基板中的至少一者包括隔件。该方法还包括在输送之后组装包括第一基板、第二基板、生物样品和隔件的腔室。隔件可以设置在第一基板与第二基板之间。隔件可以被构造成将流体保持在腔室内，并且维持第一基板与第二基板之间的分隔距离。隔件可以被定位成至少部分地围绕第一基板上设置有生物样品的区并且/或者至少部分地围绕设置在第二基板上的阵列。

Description

流体输送方法
背景技术
受试者组织内的细胞由于不同细胞内的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)多变而存在细胞形态和/或功能的差异。细胞在组织内的具体位置(例如，细胞相对于相邻细胞的位置，或细胞相对于组织微环境的位置)可能影响例如细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为，以及与组织中其他细胞的信号传导和交叉对话。
空间异质性先前已经使用在完整组织或部分组织的背景下仅提供少量分析物的数据、或者提供单细胞的许多分析物数据的技术进行了研究，但未能提供关于单细胞在亲本生物样品(例如，组织样品)中的位置的信息。
来自生物样品(例如，在生物样品内)的分析物可以通过破坏(例如，经由透化)来释放。释放的分析物可以迁移到用于捕获的阵列，同时保留分析物的空间背景。释放的分析物可以例如经由试剂介质迁移到阵列上。需要对试剂介质的流体学行为进行优化(例如，经由改善流体输送)的方法和系统，以便保留所释放的分析物的空间背景以供阵列捕获。
发明内容
互联网上可获得并且本说明书中提到的所有出版物、专利、专利申请和信息均以引用方式并入本文，其程度如同单独的出版物、专利、专利申请或信息项各自被具体且单独地指明以引用方式并入本文中一样。在以引用方式并入的出版物、专利、专利申请和信息项与本说明书中包含的公开内容相矛盾的情况下，本说明书旨在取代并且/或者优先于任何这种矛盾的材料。
生物样品内的分析物通常通过破坏(例如，透化)生物样品来释放。破坏生物样品的各种方法是已知的，包括透化生物样品的细胞膜。本文描述了在各种温度下将流体输送不同时间段的方法，其中流体包括例如具有各种去污剂、缓冲剂、蛋白酶和/或核酸酶的缓冲溶液或透化溶液。
此外，本文描述了向生物样品输送流体(例如，透化溶液)的各种方法，包括使用基板保持器。
在一个方面，提供了一种用于将流体输送到设置在第一基板上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法。该方法包括将流体输送到第一基板和/或第二基板。第一基板和第二基板中的至少一者包括隔件。该方法还包括在输送之后组装包括第一基板、第二基板、生物样品和隔件的腔室。隔件设置在第一基板与第二基板之间。隔件被构造成将流体保持在腔室内，并且维持第一基板与第二基板之间的分隔距离。隔件被定位成至少部分地围绕第一基板上设置有生物样品的区并且/或者至少部分地围绕设置在第二基板上的阵列。第一基板的所述区、隔件和第二基板至少部分地包围包括生物样品在内的容积。
在该方法的一些变型形式中，腔室包括部分或完全密封的腔室。第二基板包括远离感兴趣区域定位的疏水区。该疏水区可以被构造成从腔室中去除流体中的气泡。感兴趣区域可以包括生物样品和阵列重叠的区。疏水区可以包括疏水性涂层。分隔距离可以包括至少2μm的距离。分隔距离可以包括介于约5μm至25μm之间的距离。第二基板可以包括隔件。第一基板可以包括隔件。该方法还可以包括在输送流体之前将亲水性涂层施加到第一基板和/或第二基板上。该流体可以包含润湿剂。该流体可以包含一种或多种透化试剂。隔件可以包括被构造成从流体排出气泡的透气隔件部分。该方法还可以包括对第一基板和/或第二基板产生振动。将流体输送到第一基板和/或第二基板可以包括调节腔室的湿度。将流体输送到第一基板和/或第二基板可以包括对靠近第一基板和/或第二基板的区域产生真空。将流体输送到第一基板和/或第二基板可以包括将流体输送到第二基板的某个区域。隔件可以包括部分地围绕流体的三个侧面。将流体输送到第一基板和/或第二基板可以包括将流体输送到第二基板的某个区域。该区域可以设置在第二基板的封闭区之外。封闭区可以由隔件形成。将流体输送到第一基板和/或第二基板可以包括将流体输送到隔件的某个区域。该区域设置在第二基板的封闭区之外。封闭区可以由隔件形成。组装该腔室可以包括响应于输送，以一定角度定位第一基板，使得当第一基板和第二基板处于沿与第二基板正交的轴线的阈值距离内时，第一基板的下降侧与流体的至少一部分接触。该下降侧可以将流体推向部分地围绕流体的三个侧面。该腔室可以包括疏水性图案，该疏水性图案至少部分地围绕流体并且被定位成至少部分地围绕第一基板上的所述区和/或设置在第二基板上的阵列。隔件可以由厚度均匀的材料形成。隔件可以由具有可变厚度的材料形成。隔件可以印刷在第一基板和/或第二基板上。隔件可以包括光致抗蚀剂图案。隔件可以在其一个或多个侧面上包括斜边缘。
在一个方面，提供了一种系统。该系统包括第一基板，该第一基板包括用于粘附生物样品的涂层。该系统还包括其中包括阵列的第二基板。该系统还包括隔件，该隔件设置在第一基板与第二基板之间，并且被构造成将流体保持在包括第一基板、第二基板、生物样品和隔件的腔室内，该隔件进一步被构造成维持第一基板与第二基板之间的分隔距离，该隔件被定位成至少部分地围绕第一基板上的生物样品并且/或者至少部分地围绕设置在第二基板上的阵列。
在一个方面，提供了一种套件。该套件包括其中包括阵列的第二基板。第二基板还包括围绕阵列的隔件。
在另一个方面，提供了一种套件。该套件包括其中包括生物样品的第一基板。第一基板还包括围绕生物样品的隔件。
在一个方面，提供了一种套件。该套件包括被构造成设置在第一基板与第二基板之间的隔件。该套件还包括根据本文所述方法的使用说明。
本文提供了用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，包括：组装包括第一基板、第二基板、生物样品和垫圈的部分密封的腔室，其中该垫圈设置在第一基板与第二基板之间，并且围绕第一基板上的所述区和/或设置在第二基板上的阵列，其中第一基板的所述区、垫圈和第二基板至少部分地包围包括生物样品在内的容积。该方法还包括通过垫圈的一个或多个孔将流体输送到部分密封的腔室，从而将流体输送到阵列和生物样品。
在一些实施方案中，该方法还包括在组装之前，在第一基板的所述区和设置在第二基板上的阵列上提供生物样品。
在一些实施方案中，第一基板、第二基板或两者包括玻璃表面。在一些实施方案中，玻璃表面是载玻片。在一些实施方案中，第一基板和第二基板轴向对准。在一些实施方案中，第一基板和第二基板呈交叉构型。
在一些实施方案中，输送该流体包括使流体流过垫圈的一个或多个孔。输送该流体可以包括使用注射器注射流体通过垫圈的一个或多个孔。在一些实施方案中，注射器被构造成与垫圈的一个或多个孔中的一个孔接合或锁定。在一些实施方案中，输送该流体可以在约5℃至约80℃的温度下进行。
在一些实施方案中，该方法还包括透化生物样品。在一些实施方案中，第二基板可以包括设置在其上的一种或多种干燥的透化试剂。在一些实施方案中，流体将一种或多种干燥的透化试剂溶解。在一些实施方案中，流体包含一种或多种透化试剂。在一些实施方案中，透化进行约1分钟至约90分钟。在一些实施方案中，透化可以包括加热第一基板、第二基板，或第一基板和第二基板两者。在一些实施方案中，生物样品的透化可以通过调控流体的温度来控制。在一些实施方案中，调控流体的温度可以包括将流体加热到至少约40℃。
在一些实施方案中，一种或多种透化试剂可以选自由以下项组成的组：去污剂、酶和缓冲剂。在一些实施方案中，一种或多种干燥的透化试剂包括去污剂和酶中的一者或两者。在一些实施方案中，去污剂包括SDS、N-月桂酰肌氨酸、皂草苷或它们的任何组合中的一者或多者。在一些实施方案中，酶可以包括蛋白酶K、胃蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶或它们的任何组合中的一者或多者。在一些实施方案中，缓冲剂可以包括TE、TAE、TBE或PBS。
在一些实施方案中，输送一种或多种透化试剂可以包括以任何顺序依次输送去污剂、酶和缓冲剂。在一些实施方案中，输送一种或多种透化试剂可以包括将去污剂、酶和缓冲剂作为混合物输送。在一些实施方案中，输送可以包括将一种或多种透化试剂输送到部分密封的腔室两次或更多次。在一些实施方案中，一个或多个孔可以包括疏水性涂层。
本文还提供了用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，该方法包括：组装包括第一基板、第二基板、生物样品和垫圈的部分密封的腔室，其中垫圈设置在第一基板与第二基板之间，并且围绕第一基板上的所述区和/或设置在第二基板上的阵列，其中第一基板、垫圈和第二基板至少部分地包围包括生物样品在内的容积。该方法还包括通过第一基板中的一个或多个通孔或者第二基板中的一个或多个通孔将流体输送到部分密封的腔室，从而将流体输送到阵列和生物样品。
在一些实施方案中，该方法还包括在组装之前，在第一基板的所述区和设置在第二基板上的阵列上提供生物样品。
在一些实施方案中，第一基板、第二基板或两者包括玻璃表面。在一些实施方案中，玻璃表面是载玻片。在一些实施方案中，第一基板和第二基板轴向对准。在一些实施方案中，第一基板和第二基板呈交叉构型。
在一些实施方案中，输送该流体包括使流体流过第一基板中的通孔。在一些实施方案中，输送该流体包括使流体流过第二基板中的一个或多个通孔。输送该流体可以包括使用注射器注射流体通过一个或多个通孔。在一些实施方案中，该注射器被构造成与第一基板中的一个或多个通孔中的一个通孔接合或锁定。在一些实施方案中，该注射器被构造成与第二基板中的一个或多个通孔中的一个通孔接合或锁定。
在一些实施方案中，输送该流体包括通过毛细流动将流体输送到第一基板中的一个或多个通孔。在一些实施方案中，输送该流体包括通过毛细流动将流体输送到第二基板中的一个或多个通孔。
在将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的一些实施方案中，输送该流体在约5℃至约80℃的温度下进行。
在一些实施方案中，该方法包括透化生物样品。在一些实施方案中，基板包括设置在其上的一种或多种干燥的透化试剂。在一些实施方案中，流体将一种或多种干燥的透化试剂溶解。在一些实施方案中，流体包含一种或多种透化试剂。在一些实施方案中，透化进行约1分钟至约90分钟。在一些实施方案中，透化包括加热第一基板、第二基板，或第一基板和第二基板两者。在一些实施方案中，生物样品的透化通过调控流体的温度来控制。在一些实施方案中，调控流体的温度包括将流体加热到至少约40℃。
在一些实施方案中，一种或多种透化试剂可以选自由以下项组成的组：去污剂、酶和缓冲剂。在一些实施方案中，一种或多种干燥的透化试剂包括去污剂和酶中的一者或两者。在一些实施方案中，去污剂包括SDS、N-月桂酰肌氨酸、皂草苷或它们的任何组合中的一者或多者。在一些实施方案中，酶可以包括蛋白酶K、胃蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶或它们的任何组合中的一者或多者。在一些实施方案中，缓冲剂可以包括TE、TAE、TBE或PBS。
在一些实施方案中，输送一种或多种透化试剂可以包括以任何顺序依次输送去污剂、酶和缓冲剂。在一些实施方案中，输送一种或多种透化试剂可以包括将去污剂、酶和缓冲剂作为混合物输送。在一些实施方案中，输送可以包括将一种或多种透化试剂输送到部分密封的腔室两次或更多次。
本文还提供了用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，该方法包括将流体输送到第一基板上的所述区，其中虚拟垫圈围绕第一基板上的所述区并且将流体容纳在所述区内；以及将第二基板与第一基板组装在一起，从而将流体输送到阵列和生物样品。
本文还提供了用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，该方法包括：将流体输送到第二基板上的所述区，其中虚拟垫圈围绕第二基板上的所述区并且将流体容纳在阵列上；以及将第一基板与第二基板组装在一起，从而将流体输送到阵列和生物样品。
在一些实施方案中，在组装之前，在第一基板的所述区和设置在第二基板上的阵列上提供生物样品。
在一些实施方案中，第一基板、第二基板或两者包括玻璃表面。在一些实施方案中，玻璃表面是载玻片。
在一些实施方案中，第一基板和第二基板轴向对准。在一些实施方案中，第一基板和第二基板呈交叉构型。
在一些实施方案中，虚拟垫圈包括疏水性涂层。在一些实施方案中，虚拟垫圈包括一个或多个孔。在一些实施方案中，疏水性涂层是用压模施加的。在一些实施方案中，疏水性涂层是石蜡基蜡。在一些实施方案中，疏水性涂层覆盖第一基板的在第一基板上的所述区之外的全部或一部分。在一些实施方案中，疏水性涂层覆盖第二基板的在第二基板上的阵列之外的全部或一部分。在一些实施方案中，疏水性涂层以图案形式施加。在一些实施方案中，疏水性涂层包括电润湿。
在一些实施方案中，输送该流体包括将流体输送到第一基板。在一些实施方案中，输送该流体包括将流体输送到第二基板。在一些实施方案中，输送该流体包括使流体流过虚拟垫圈的一个或多个孔。在一些实施方案中，输送该流体包括用注射器注射流体通过垫圈的一个或多个孔。
在一些实施方案中，注射器被构造成与虚拟垫圈的一个或多个孔中的一个孔接合或锁定。在一些实施方案中，输送该流体包括通过毛细流动使流体流动。在一些实施方案中，输送该流体在约5℃至约80℃的温度下进行。
在一些实施方案中，该方法包括透化生物样品。在一些实施方案中，第二基板包括设置在其上的一种或多种干燥的透化试剂。在一些实施方案中，流体将一种或多种干燥的透化试剂溶解。在一些实施方案中，流体包含一种或多种透化试剂。在一些实施方案中，透化进行约1分钟至约90分钟。在一些实施方案中，透化包括加热第一基板、第二基板，或第一基板和第二基板两者。在一些实施方案中，生物样品的透化通过调控流体的温度来控制。在一些实施方案中，调控流体的温度包括加热到至少约40℃。
在一些实施方案中，一种或多种透化试剂选自由以下项组成的组：去污剂、酶和缓冲剂。在一些实施方案中，一种或多种干燥的透化试剂包括去污剂和酶中的一者或两者。在一些实施方案中，去污剂包括SDS、N-月桂酰肌氨酸、皂草苷或它们的任何组合中的一者或多者。在一些实施方案中，酶包括蛋白酶K、胃蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶或它们的任何组合中的一者或多者。在一些实施方案中，缓冲剂包括TE、TAE、TBE和PBS。在一些实施方案中，输送一种或多种透化试剂包括以任何顺序依次输送去污剂、酶和缓冲剂。在一些实施方案中，输送一种或多种透化试剂包括将去污剂、酶和缓冲剂作为混合物输送。在一些实施方案中，输送包括将一种或多种透化试剂输送到部分密封的腔室两次或更多次。
在一些实施方案中，围绕生物样品中的一个或多个感兴趣区域将疏水性涂层图案化。
在一些实施方案中，该方法包括对生物样品成像。在一些实施方案中，生物样品是组织切片。在一些实施方案中，生物样品是新鲜冷冻的组织切片。在一些实施方案中，生物样品是固定的生物样品。在一些实施方案中，固定的生物样品是福尔马林固定石蜡包埋的生物样品。
在一些实施方案中，阵列包括多个特征。在一些实施方案中，阵列包括约5,000个特征。在一些实施方案中，多个特征中的一个特征选自由以下项组成的组：珠粒、斑点、喷墨斑点、凹陷、水凝胶囊包和纳米颗粒。在一些实施方案中，多个捕获探针附接到珠粒。在一些实施方案中，多个捕获探针中的一个捕获探针包括(i)捕获结构域；以及(ii)专属于该特征的空间条形码。在一些实施方案中，该捕获探针的捕获结构域包含聚(T)序列。在一些实施方案中，该捕获探针包含以下一者或多者：功能结构域、裂解结构域、独特分子标识符，或它们的任何组合。
本文还提供了套件，其包括：第一基板，该第一基板包括用于粘附生物样品的涂层；第二基板，该第二基板包括阵列；以及垫圈。在一些套件中，垫圈不包括孔。在一些实施方案中，垫圈包括一个用于输送流体的孔。在一些套件中，垫圈包括两个用于输送流体的孔。在一些套件中，第一基板包括一个或多个用于输送流体的通孔。在一些套件中，第二基板包括一个或多个用于输送流体的通孔。在一些套件中，该套件包括石蜡基蜡笔。在一些套件中，该套件包括疏水性涂层压模。在一些套件中，该套件包括逆转录酶和核酸酶。在一些套件中，该套件包括一种或多种透化剂。在一些套件中，第一基板、第二基板和垫圈组装成部分密封的腔室。在一些套件中，该套件包括组装部分密封的腔室的说明。
本文还提供了一种用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板的第二区上的阵列的方法。该方法包括组装包括第一基板、第二基板、生物样品和隔件的部分密封的腔室，其中隔件设置在第一基板与第二基板之间，并且围绕第一基板上的所述区和/或设置在第二基板上的阵列，其中第一基板的所述区、隔件和第二基板至少部分地包围包括生物样品在内的容积。该方法还包括将流体输送到部分密封的腔室，从而将流体输送到阵列和生物样品。
在该方法的一些变型形式中，该方法包括在组装之前，在第一基板的所述区上提供生物样品，并且提供设置在第二基板上的阵列。第一基板、第二基板或两者可以包括玻璃表面。玻璃表面可以包括载玻片。第一基板和第二基板可以轴向对准。第一基板和第二基板可以呈交叉构型。输送该流体包括使流体流过隔件的一个或多个孔。在一些实施方案中，输送该流体包括使用注射器注射流体通过隔件的一个或多个孔。注射器可以被构造成与隔件的一个或多个孔中的一个孔接合或锁定。输送该流体可以在约5℃至约80℃的温度下进行。该方法可以包括透化生物样品。第二基板可以包括设置在其上的一种或多种干燥的透化试剂。流体可以将一种或多种干燥的透化试剂溶解。该流体可以包含一种或多种透化试剂。透化可以进行约1分钟至约90分钟。透化可以包括加热第一基板、第二基板，或第一基板和第二基板两者。生物样品的透化可以通过调控流体的温度来控制。调控流体的温度可以包括加热到至少约40℃。一种或多种透化试剂可以选自由以下项组成的组：去污剂、酶和缓冲剂。一种或多种干燥的透化试剂可以包括去污剂和酶中的一者或两者。去污剂可以包括SDS、N-月桂酰肌氨酸、皂草苷或它们的任何组合中的一者或多者。酶可以包括蛋白酶K、胃蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶或它们的任何组合中的一者或多者。缓冲剂可以包括TE、TAE、TBE和PBS。输送一种或多种透化试剂可以包括以任何顺序依次输送去污剂、酶和缓冲剂。输送一种或多种透化试剂可以包括将去污剂、酶和缓冲剂作为混合物输送。输送可以包括将一种或多种透化试剂输送到部分密封的腔室两次或更多次。一个或多个孔可以包括疏水性涂层。
本文还提供了一种用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板的第二区上的阵列的方法。该方法包括将流体输送到第二基板上的第二区。隔件围绕第二基板上的第二区，并且将流体容纳在阵列上。该方法还包括将第一基板与第二基板组装在一起，从而将流体输送到阵列和生物样品。
在该方法的一些变型形式中，该方法包括在组装之前，在第一基板的所述区上提供生物样品，并且提供设置在第二基板上的阵列。第一基板、第二基板或两者可以包括玻璃表面。玻璃表面可以包括载玻片。第一基板和第二基板可以轴向对准。第一基板和第二基板可以呈交叉构型。输送该流体可以包括使流体流过第一基板中的一个或多个通孔。输送该流体可以包括使流体流过第二基板中的一个或多个通孔。在一些实施方案中，输送该流体包括使用注射器注射流体通过一个或多个通孔。注射器可以被构造成与第一基板中的一个或多个通孔中的一个通孔接合或锁定。注射器可以被构造成与第二基板中的一个或多个通孔中的一个通孔接合或锁定。输送该流体可以包括通过毛细流动将流体输送到第一基板中的一个或多个通孔。输送该流体可以包括通过毛细流动将流体输送到第二基板中的一个或多个通孔。输送该流体可以在约5℃至约80℃的温度下进行。该方法可以包括透化生物样品。第二基板可以包括设置在其上的一种或多种干燥的透化试剂。流体可以将一种或多种干燥的透化试剂溶解。该流体可以包含一种或多种透化试剂。透化可以进行约1分钟至约90分钟。透化可以包括加热第一基板、第二基板，或第一基板和第二基板两者。生物样品的透化可以通过调控流体的温度来控制。调控流体的温度可以包括加热到至少约40℃。一种或多种透化试剂可以选自由以下项组成的组：去污剂、酶和缓冲剂。一种或多种干燥的透化试剂可以包括去污剂和酶中的一者或两者。去污剂可以包括SDS、N-月桂酰肌氨酸、皂草苷或它们的任何组合中的一者或多者。酶可以包括蛋白酶K、胃蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶或它们的任何组合中的一者或多者。缓冲剂可以包括TE、TAE、TBE和PBS。输送一种或多种透化试剂可以包括以任何顺序依次输送去污剂、酶和缓冲剂。输送一种或多种透化试剂可以包括将去污剂、酶和缓冲剂作为混合物输送。输送可以包括将一种或多种透化试剂输送到部分密封的腔室两次或更多次。
本文还提供了一种系统。该系统包括用于粘附生物样品的第一基板。该系统还包括其中包括阵列的第二基板。该系统还包括隔件，该隔件设置在第一基板与第二基板之间，并且被构造成将流体保持在包括第一基板、第二基板、生物样品和隔件的腔室内，该隔件进一步被构造成维持第一基板与第二基板之间的分隔距离，该隔件被定位成至少部分地围绕第一基板上的生物样品以及/或者设置在第二基板上的阵列。
在该系统的一些变型形式中，第一基板包括安装在其上的生物样品。根据前述任一方面所述的系统还可以包括样品保持器。在一些实施方案中，该样品保持器包括第一构件、第二构件和对准机构，其中第一构件包括第一保持机构，该第一保持机构被构造成使第一基板保持设置在第一平面中；第二构件包括第二保持机构，该第二保持机构被构造成使第二基板保持设置在第二平面中；对准机构连接到第一构件和第二构件中的一者或两者，并且被构造成将第一构件和第二构件沿第一平面和/或第二平面对准，使得当第一构件和第二构件对准并且处于沿与第二平面正交的轴线的阈值距离内时，样品与试剂介质的至少一部分接触。该样品保持器还包括调节机构，该调节机构被构造成沿与第二平面正交的轴线移动第二构件并且/或者沿与第一平面正交的轴线移动第一构件，以在第一构件和第二构件对准并且处于沿与第二平面正交的轴线的阈值距离内时组装包括第一基板、第二基板、生物样品和隔件的腔室。
在一些变型形式中，本文提供的系统还包括样品保持器。例如，包括以下部件的系统还可以包括样品保持器，这些部件为：包括用于粘附生物样品的涂层的第一基板；包括阵列的第二基板；以及设置在第一基板与第二基板之间的隔件。另外，包括以下部件的系统还可以包括样品保持器，这些部件为：用于粘附生物样品的第一基板；包括阵列的第二基板；以及设置在第一基板与第二基板之间的隔件。该样品保持器包括第一构件、第二构件和对准机构，其中第一构件包括保持第一基板的保持机构，第二构件包括保持第二基板的第二保持机构，对准机构连接到第一构件和第二构件中的至少一者或者连接到第一构件和第二构件两者，并且被构造成将第一构件和第二构件对准，使得第一基板上的生物样品(或其一部分)与第二基板的阵列对准并接触。
术语“每个”当在关于项目的集合使用时，旨在标识该集合中的各个项目，但不一定是指该集合中的每个项目，除非另有明确说明，或者除非使用背景另有明确指示。
在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数词来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素优于另一个权利要求要素的任何优先级、先后次序或顺序，也不意味着执行方法的多个动作的时间顺序，而是仅用作将具有某一名称的一个权利要求要素与具有用于区分权利要求要素的相同名称(但使用的序数词不同)的另一个要素区分开的标签。类似地，在说明书中使用这些术语本身并不意味着任何要求的优先级、先后次序或顺序。
在以上描述和权利要求书中，诸如“……中的至少一者”或“……中的一者或多者”之类的短语之后可以出现要素或特征的联合清单。术语“和/或”也可以出现在两个或更多个要素或特征的清单中。除非与在其中使用这种短语的上下文隐含或明确地矛盾，否则这种短语旨在表示单独列出的任何要素或特征，或者与任何其他所列举的要素或特征组合的任何所列举的要素或特征。例如，短语“A和B中的至少一者”、“A和B中的一者或多者”以及“A和/或B”各自旨在表示“单独的A、单独的B，或者A和B一起”。类似的解释也旨在用于包括三个或更多个项目的清单。例如，短语“A、B和C中的至少一者”、“A、B和C中的一者或多者”以及“A、B和/或C”各自旨在表示“单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，或者A和B和C一起”。上文和权利要求书中使用的术语“基于”旨在表示“至少部分地基于”，使得未列举的特征或要素也是允许的。
本文描述了本公开的多种特征的各种实施方案。然而，应当理解，此类实施方案仅通过举例来提供，在不脱离本公开范围的情况下，本领域技术人员可以想到许多变型形式、变化和替换方案。还应当理解，本文所述具体实施方案的各种替代方案也在本公开的范围内。
附图说明
以下附图展示了本公开的特征和优点的某些实施方案。这些实施方案无意于以任何方式限制所附权利要求书的范围。附图中相同的附图符号表示相同的元件。
图1是显示如本文所述的加条形码捕获探针的一个实例的示意图。
图2是展示可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可以进入非透化细胞并与样品内的目标分析物结合。
图3是示例性的在空间上多重化加条形码的特征的示意图。
图4是示例性分析物捕获剂的示意图。
图5是描述固定有特征的捕获探针与分析物捕获剂之间的示例性相互作用的示意图。
图6A、图6B和图6C是展示可以如何在基于阵列的系统中利用链霉亲和素细胞标签来产生在空间上加条形码的细胞或细胞内容物的示意图。
图7示出了根据一些示例实施方式的示例性空间分析工作流程。
图8描绘了根据一些示例实施方式的用于在载片上制备生物样品的示例工作流程。
图9A是描绘根据一些示例实施方式的夹层构造中组织载片与阵列载片之间的示例性透化溶液相互作用的示意图。
图9B描绘了根据示例实施方式用于执行样品分析的工作流程。
图10是示出根据一些示例实施方式的示例样品处理设备的示意图。
图11是根据一些示例实施方式的示例调节机构的图示。
图12A是根据一些示例实施方式的处于闭合位置的示例样品处理设备的透视图。
图12B是根据一些示例实施方式的处于开启位置的示例样品处理设备的透视图。
图13A示出了根据一些示例实施方式的示例性夹层构造。
图13B示出了根据一些示例实施方式的完全形成的夹层构造，其产生了由一个或多个隔件、第一基板和第二基板形成的腔室。
图13C描绘了图13B的构造的顶视图。
图14描绘了根据一些示例实施方式的用于从腔室排出或去除气泡的示例构造。
图15A至图15C示出了根据一些示例实施方式的设置在第一基板和/或第二基板上的一个或多个隔件的示例构造。
图16A至图16E描绘了根据一些示例实施方式的与一个或多个疏水区结合的一个或多个隔件的示例构造。
图17A至图17E描绘了根据一些示例实施方式的成角度夹层组件的示例工作流程。
图18A是根据一些示例实施方式的成角度闭合工作流程的侧视图。
图18B是根据一些示例实施方式的成角度闭合工作流程的顶视图。
图19A描绘了根据一些示例实施方式的样品处理设备，该样品处理设备包括联接到第一构件的铰链和滑槽。
图19B描绘了根据一些示例实施方式的处于开启构型的样品处理设备，其中第一基板联接到第一构件并且第二构件保持第二基板。
图20A至图20E示出了根据一些示例实施方式的成角度夹层组件的示例工作流程。
图21A至图21C描绘了根据一些示例实施方式的用于夹持具有组织样品的第一基板和第二基板的成角度闭合工作流程的侧视图和顶视图。
图22A至图22B示出了示例性流体输送方案。
图23示出了示例性流体输送方案。
图24示出了示例性流体输送方案。
图25A至图25B示出了示例性流体输送方案。
图26示出了示例性流体输送方案。
图27示出了示例性流体输送方案。
图28示出了根据一些示例实施方式的示例性夹层构造，其中使得第一基板(包括生物样品)和第二基板处于彼此接近的状态。
图29A描绘了示例隔件设计的顶视图。
图29B描绘了示例隔件的顶视图。
图29C描绘了根据一些示例实施方式的示例基板构造。
图30是描绘根据一些示例实施方式的夹层构造中组织载片与阵列载片之间的示例性透化溶液相互作用的示意图。
图31A是根据一些示例实施方式的在透化溶液内具有流动跟踪颗粒的示例夹层构造的图示。
图31B是根据一些示例实施方式的阵列载片上的示例染料的图示。
图32A描绘了根据一些示例性实施方式的示例夹层构造在夹层腔室外部的毛细流动。
图32B描绘了根据一些示例性实施方式的示例夹层构造。
图33描绘了根据一些示例性实施方式的示例夹层构造。
图34展示了根据一些示例实施方式的用于将流体输送到生物样品的方法的流程图。
图35描绘了根据示例实施方式的用于执行样品分析的工作流程的示例参数表。
图36描绘了非夹层对照透化步骤与根据示例实施方式的夹层构造透化步骤之间的比较。
图37描绘了根据一些示例实施方式的空间聚类分析和分析海马转录物Hpca的一个实例。
图38A至图38C描绘了根据一些示例实施方式的使用成角度闭合的夹层组件在示例快速闭合速度下的状态。
图39A至图39C描绘了根据一些示例实施方式的使用成角度闭合的夹层组件在示例中等闭合速度下的状态。
图40A至图40C描绘了根据一些示例实施方式的使用成角度闭合的夹层组件在示例缓慢闭合速度下的状态。
图41A至图41C示出了使用染料条纹法和夹层构造时的示例流速的图形。
图42A至图42D示出了使用染料条纹法和夹层构造时的示例流速的图形。
图43示出了放置在隔件上的试剂介质液滴在夹层闭合之前的示例接触角。
具体实施方式
I.引言
本公开描述了用于生物样品的空间分析的设备、系统、方法和组合物。本章节描述了在本公开随后的章节中提及的某些通用术语、分析物、样品类型和制备步骤。例如，术语和短语：空间分析、条形码、核酸、核苷酸、探针、靶标、寡核苷酸、多核苷酸、受试者、基因组、衔接子、标签、杂交、退火、引物、引物延伸、邻位连接、核酸延伸、聚合酶链式反应(PCR)扩增、抗体、亲和基团、标签、可检测标签、光学标签、模板转换寡核苷酸、夹板寡核苷酸、分析物、生物样品、基于一般空间阵列的分析方法、空间分析方法、免疫组织化学和免疫荧光、捕获探针、底物、阵列、分析物捕获、分配、对所捕获分析物的分析、质量控制和/或类似表述在PCT专利申请公开号WO2020/123320中更详细地描述，该专利申请的全部内容以引用方式并入本文。
(a)空间分析
组织和细胞可以从任何来源获得。例如，组织和细胞可以从单细胞或多细胞生物体(例如哺乳动物)获得。从哺乳动物(例如人)获得的组织和细胞通常具有各种各样的分析物水平(例如，基因表达和/或蛋白质表达)，这可能导致细胞形态和/或功能上的差异。组织内细胞或细胞子集(例如，相邻细胞和/或非相邻细胞)的位置可能影响例如细胞的命运、行为、形态，以及与组织中其他细胞的信号传导和交叉对话。关于哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平(基因表达和/或蛋白质表达)差异的信息还可以帮助医生选择或施用将会有效的治疗，并且可以允许研究人员基于检测到的该组织中不同细胞内分析物水平的差异来鉴定和阐明单细胞或多细胞生物体(例如哺乳动物)中细胞形态和/或细胞功能上的差异。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异还可以提供关于组织(例如，健康组织和患病组织)如何起作用和/或发展的信息。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异还可以提供组织中疾病发病机理的不同机制和组织内治疗性处理的作用机制的信息。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异还可以提供关于哺乳动物组织中的耐药性机制及其发展的信息。多细胞生物体(例如，哺乳动物)组织中不同细胞内分析物存在或不存在的差异可以提供关于多细胞生物体组织中的耐药性机制及其发展的信息。
本文的空间分析方法提供了对哺乳动物组织中的不同细胞内或来自哺乳动物的单细胞内的分析物水平(例如，基因表达和/或蛋白质表达)差异的检测。例如，空间分析方法可以用于检测组织学载片样品中不同细胞内的分析物水平(例如，基因表达和/或蛋白质表达)的差异，从其可以重新组合数据以产生从哺乳动物获得的组织样品的分析物水平(例如，基因表达和/或蛋白质表达)的三维图谱，该三维图谱例如具有一定程度的空间分辨率(例如，单细胞分辨率)。
一直以来，发育中的系统内的空间异质性典型地经由RNA杂交、免疫组织化学、荧光报告蛋白或者预定义的亚群体的纯化或诱导以及随后的基因组图谱分析(例如，RNA-seq)来研究。然而，这类方法依赖于相对小的一组预定义标记物，从而引入了对发现造成限制的选择偏倚。这些现有方法还依赖于先验知识。传统上，RNA测定依赖于有限数量的RNA物质的染色。相比之下，单细胞RNA测序允许对细胞基因表达(包括非编码RNA)进行深入的图谱分析，但是已建立的方法将细胞与它们的天然空间背景分开。
本文所述的空间分析方法以高空间分辨率提供样品内多种分析物的大量分析物水平和/或表达数据，例如，同时保留天然空间背景。空间分析方法包括例如使用捕获探针，该捕获探针包括空间条形码(例如，核酸序列)和捕获结构域，其中空间条形码提供关于该捕获探针在细胞或组织样品(例如，哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的位置的信息，捕获结构域能够结合细胞所产生的以及/或者存在于该细胞中的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)。如本文所述，空间条形码可以是核酸，其具有独特的序列、独特的荧光团或独特的荧光团组合、独特的氨基酸序列、独特的重金属或独特的重金属组合，或者任何其他独特的可检测试剂。捕获结构域可以是能够结合细胞所产生的以及/或者存在于该细胞中的分析物的任何试剂(例如，能够与来自细胞的核酸杂交的核酸(例如，mRNA、基因组DNA、线粒体DNA或miRNA)、包括分析物在内的底物、分析物的结合配偶体，或者特异性地结合分析物的抗体)。捕获探针还可以包括与通用正向引物和/或通用反向引物的序列互补的核酸序列。捕获探针还可以包括切割位点(例如，限制性核酸内切酶的切割识别位点)、光不稳定键、热敏键或化学敏感键。
分析物与捕获探针的结合可以使用多种不同的方法来检测，例如核酸测序、荧光团检测、核酸扩增、核酸连接检测和/或核酸裂解产物检测。在一些实例中，该检测用于将特定空间条形码与细胞(例如，哺乳动物细胞)所产生的以及/或者存在于该细胞中的特定分析物相关联。
捕获探针可以例如附接到表面，例如固体阵列、珠粒或盖玻片。在一些实例中，捕获探针没有附接到表面。在一些实例中，捕获探针可以封装在可渗透的组合物(例如，本文所述的任何基板)的表面内，包埋在该表面内，或者层叠在该表面上。例如，捕获探针可以封装或设置在可渗透的珠粒(例如，凝胶珠粒)内。在一些实例中，捕获探针可以封装在基板(例如，本文所述示例性基板中的任一者，诸如水凝胶或多孔膜)的表面内，包埋在该表面内，或者层叠在该表面上。
在一些实例中，使细胞或包含细胞的组织样品与附接到基板(例如，基板表面)的捕获探针接触，然后该细胞或组织样品透化，以允许分析物从细胞释放并与附接到基板的捕获探针结合。在一些实例中，可以使用多种方法(例如，电泳、化学梯度、压力梯度、流体流动或磁场)将从细胞释放的分析物主动引导至附接到基板的捕获探针。
在其他实例中，可以使用多种方法引导捕获探针与细胞或组织样品相互作用，其中这些方法例如：在捕获探针中包含脂质锚定剂、在捕获探针中包含与膜蛋白特异性地结合或形成共价键的试剂、流体流动、压力梯度、化学梯度，或磁场。
空间分析方法的非限制性方面在以下文献中有所描述：WO 2011/127099、WO2014/210233、WO 2014/210225、WO 2016/162309、WO 2018/091676、WO 2012/140224、WO2014/060483、美国专利号10,002,316、美国专利号9,727,810、美国专利申请公开号2017/0016053；Rodriques等人，Science 363(6434)：1463-1467，2019；WO 2018/045186；Lee等人，Nat.Protoc.10(3)：442-458，2015；WO 2016/007839、WO 2018/045181、WO 2014/163886；Trejo等人，PLoS ONE 14(2)：e0212031，2019；美国专利申请公开号2018/0245142；Chen等人，Science 348(6233)：aaa6090，2015；Gao等人，BMC Biol.15：50，2017；WO 2017/144338、WO 2018/107054、WO 2017/222453、WO 2019/068880、WO 2011/094669、美国专利号7,709,198、美国专利号8,604,182、美国专利号8,951,726、美国专利号9,783,841、美国专利号10,041,949、WO 2016/057552、WO 2017/147483、WO 2018/022809、WO 2016/166128、WO2017/027367、WO 2017/027368、WO 2018/136856、WO 2019/075091、美国专利号10,059,990、WO 2018/057999、WO 2015/161173；以及Gupta等人，Nature Biotechnol.36：1197-1202，2018，这些文献的全部内容以引用方式并入本文，并且能够以任何组合在本文中使用。本文描述了空间分析方法的其他非限制性方面。
能够在本公开中使用的一些通用术语可以在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(b)节中找到。通常，“条形码”是传达信息或能够传达信息(例如，关于样品、珠粒和/或捕获探针中的分析物的信息)的标签或标识符。条形码可以是分析物的一部分，也可以独立于分析物。条形码可以附接到分析物。特定条形码相对于其他条形码可以是独特的。出于本公开的目的，“分析物”可以包括待分析的任何生物物质、结构、部分或组分。术语“目标”可以类似地指感兴趣的分析物。
分析物可以大致分为以下两组之一：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的实例包括但不限于脂类、碳水化合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接或O-连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体、蛋白质的泛素化变体、蛋白质的硫酸化变体、病毒蛋白质(例如，病毒衣壳、病毒包膜、病毒外壳、病毒辅助蛋白、病毒糖蛋白、病毒刺突等)、细胞外蛋白质和细胞内蛋白质、抗体，以及抗原结合片段。在一些实施方案中，分析物可以是肽或蛋白质，包括但不限于抗体和酶。分析物的其他实例可以在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(c)节中找到。在一些实施方案中，可以间接检测分析物，诸如通过检测中间试剂，例如连接的探针(例如连接产物)或分析物捕获剂(例如寡核苷酸缀合的抗体)，诸如本文所述的那些。
“生物样品”通常从受试者获得，以供使用多种技术中的任一种技术进行分析，这些技术包括但不限于活检、手术和激光捕获显微术(LCM)，并且通常包括来自受试者的细胞和/或其他生物材料。在一些实施方案中，生物样品可以是组织切片。在一些实施方案中，生物样品可以是固定的和/或染色的生物样品(例如，固定的和/或染色的组织切片)。染色剂的非限制性实例包括组织学染色剂(例如，苏木精和/或伊红)和免疫学染色剂(例如，荧光染色剂)。在一些实施方案中，可以对生物样品(例如，固定的和/或染色的生物样品)进行成像。生物样品也在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(d)节中有所描述。
在一些实施方案中，用一种或多种透化试剂来透化生物样品。例如，透化生物样品可以促进分析物捕获。示例性的透化剂和透化条件在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(d)(ii)(13)节或示例性实施方案章节中有所描述。
基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移到基板上的特征阵列，其中每个特征与该阵列上的独特空间位置相关联。随后对转移的分析物的分析包括确定分析物的身份和分析物在生物样品内的空间位置。分析物在生物样品内的空间位置基于分析物在阵列上所结合(例如，直接或间接地)的特征和该特征在阵列内的相对空间位置来确定。
“捕获探针”是指能够捕获(直接或间接地)和/或标记生物样品中的分析物(例如，感兴趣的分析物)的任何分子。在一些实施方案中，捕获探针是核酸或多肽。在一些实施方案中，捕获探针包括条形码(例如，空间条形码和/或独特分子标识符(UMI))和捕获结构域。在一些实施方案中，捕获探针可以包括裂解结构域和/或功能结构域(例如，引物结合位点，诸如用于下一代测序(NGS))。
图1是显示如本文所述的示例性捕获探针的示意图。如图所示，捕获探针102任选地通过裂解结构域103(诸如二硫化物接头)与特征101偶联。捕获探针可以包括对后续加工有用的功能序列104。功能序列104可以包括测序仪特异性流动池附接序列(例如，P5或P7序列)的全部或一部分、测序引物序列的全部或一部分(例如，R1引物结合位点、R2引物结合位点)，或者它们的组合。捕获探针还可以包括空间条形码105。捕获探针还可以包括独特分子标识符(UMI)序列106。虽然图1示出空间条形码105位于UMI序列106的上游(5’)，但是应当理解，其中UMI序列106位于空间条形码105的上游(5’)的捕获探针也适合用于本文所述的任何方法中。捕获探针还可以包括捕获结构域107，以促进对目标分析物的捕获。捕获结构域可以具有与核酸分析物的序列互补的序列。捕获结构域可以具有与本文所述的连接探针互补的序列。捕获结构域可以具有与分析物捕获剂中存在的捕获操作序列互补的序列。捕获结构域可以具有与夹板寡核苷酸互补的序列。这类夹板寡核苷酸除了具有与捕获探针的捕获结构域互补的序列之外，还可以具有核酸分析物的序列、与本文所述连接探针的一部分互补的序列，以及/或者本文所述的捕获操作序列。
通常可以选择与多种不同测序系统中的任一种系统及其要求相容的功能序列，这些测序系统例如：Ion Torrent Proton或PGM、Illumina测序仪器、PacBio、OxfordNanopore，等等。在一些实施方案中，可以选择与未商业化的测序系统相容的功能序列。可以使用合适的功能序列的这类测序系统和技术的实例包括(但不限于)Ion TorrentProton或PGM测序、Illumina测序、PacBio SMRT测序和Oxford Nanopore测序。另外，在一些实施方案中，可以选择与其他测序系统(包括未商业化的测序系统)相容的功能序列。
在一些实施方案中，空间条形码105和功能序列104是附接到给定特征的所有探针共用的。在一些实施方案中，附接到给定特征的捕获探针的UMI序列106不同于附接到给定特征的不同捕获探针的UMI序列。
图2是展示可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可以进入非透化细胞并与样品内的分析物结合。捕获探针201包含裂解结构域202、细胞穿透肽203、报告分子204和二硫键(-S-S-)。205代表捕获探针的其他所有部分，例如空间条形码和捕获结构域。
图3是示例性的在空间上多重化加条形码的特征的示意图。在图3中，特征301可以与在空间上加条形码的捕获探针偶联，其中特定特征的在空间上加条形码的探针可以具有相同的空间条形码，但是可以具有不同的捕获结构域，这些捕获结构域被设计成将该特征的空间条形码与多于一种目标分析物相关联。例如，特征可以偶联到四种不同类型的在空间上加条形码的捕获探针，每种类型的在空间上加条形码的捕获探针均具有空间条形码302。与该特征缔合的一种类型的捕获探针包括空间条形码302与多聚(T)捕获结构域303的组合，其被设计成捕获mRNA目标分析物。与该特征缔合的第二种类型的捕获探针包括空间条形码302与随机N聚体捕获结构域304的组合，其用于分析gDNA。与该特征缔合的第三种类型的捕获探针包括空间条形码302与捕获结构域305的组合，该捕获结构域同感兴趣的分析物捕获剂的捕获操作序列互补。与该特征缔合的第四种类型的捕获探针包括空间条形码302与捕获结构域306的组合，该捕获结构域可以特异性地结合能够在CRISPR测定(例如，CRISPR/Cas9)中起作用的核酸分子。虽然在图3中仅示出了四种不同的捕获探针加条形码构建体，但是这些捕获探针加条形码构建体可以被定制用于分析与核酸相关联并且能够与这样的构建体结合的任何给定分析物。例如，图3所示的方案也可以用于同时分析本文所公开的其他分析物，包括但不限于：(a)mRNA、谱系示踪构建体、细胞表面或细胞内的蛋白质和代谢物，以及gDNA；(b)mRNA、可接近的染色质(例如，ATAC-seq、DNase-seq和/或MNase-seq)、细胞表面或细胞内的蛋白质和代谢物，以及扰动剂(例如，CRISPR crRNA/sgRNA、TALEN、锌指核酸酶，和/或如本文所述的反义寡核苷酸)；(c)mRNA、细胞表面或细胞内的蛋白质和/或代谢物、加条形码的标记剂(例如，本文所述的MHC多聚体)，以及免疫细胞受体(例如，T细胞受体)的V(D)J序列。在一些实施方案中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适配体、miRNA、物理环境(例如，温度变化)或任何其他已知的扰动剂。参见例如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)节(例如，分节(i)至(vi))。捕获探针的产生可以通过任何适当的方法实现，包括WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(d)(ii)节中描述的那些方法。
在一些实施方案中，来自生物样品的多于一种分析物类型(例如，核酸和蛋白质)可以使用任何适当的多重分析技术来检测(例如，同时或依次)，诸如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(IV)节中描述的那些技术。
在一些实施方案中，可以使用一种或多种分析物捕获剂来进行对一种或多种分析物(例如，蛋白质分析物)的检测。如本文所用，“分析物捕获剂”是指与分析物(例如，生物样品中的分析物)以及与捕获探针(例如，附接到基板或特征的捕获探针)相互作用以识别分析物的试剂。在一些实施方案中，分析物捕获剂包含：(i)分析物结合部分(例如，其与分析物结合)，例如，抗体或其抗原结合片段；(ii)分析物结合部分条形码；和(iii)捕获操作序列。如本文所用，术语“分析物结合部分条形码”是指与分析物结合部分缔合或以其他方式识别分析物结合部分的条形码。如本文所用，术语“分析物捕获序列”或“捕获操作序列”是指被构造成与捕获探针的捕获结构域杂交、结合、偶联或以其他方式相互作用的区域或部分。在一些实施方案中，捕获操作序列与捕获探针的捕获结构域互补。在一些情况下，分析物结合部分条形码(或其部分)也许能够从分析物捕获剂去除(例如，裂解)。
图4是由分析物结合部分404和分析物结合部分条形码结构域408构成的示例性分析物捕获剂402的示意图。示例性的分析物结合部分404是能够与分析物406结合的分子，该分析物捕获剂能够与在空间上加条形码的捕获探针相互作用。分析物结合部分能够以高亲和力和/或高特异性与分析物406结合。分析物捕获剂可以包括分析物结合部分条形码结构域408，这是能够与捕获探针的捕获结构域的至少一部分或全部杂交的核苷酸序列(例如，寡核苷酸)。分析物结合部分条形码结构域408可以包括本文所述的分析物结合部分条形码和捕获操作序列。分析物结合部分404可以包括多肽和/或适配体。分析物结合部分404可以包括抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。
图5是描述固定有特征的捕获探针524与分析物捕获剂526之间的示例性相互作用的示意图。固定有特征的捕获探针524可以包括空间条形码508以及功能序列506和UMI510，如本文别处所述。捕获探针还可以包括能够与分析物捕获剂526结合的捕获结构域512。分析物捕获剂526可以包括功能序列518、分析物结合部分条形码516，以及能够与捕获探针524的捕获结构域512结合的捕获操作序列514。该分析物捕获剂还可以包括允许捕获剂条形码结构域516与分析物结合部分522偶联的接头520。
图6A、图6B和图6C是展示可以如何在基于阵列的系统中利用链霉亲和素细胞标签来产生在空间上加条形码的细胞或细胞内容物的示意图。例如，如图6A所示，肽结合的主要组织相容性复合物(MHC)可以单独地与生物素(β2m)缔合并结合到链霉亲和素部分，使得链霉亲和素部分包括多个pMHC部分。这些部分中的每一个都可以与TCR结合，使得链霉亲和素经由多重MHC/TCR结合相互作用与目标T细胞结合。多种相互作用协同起效，能够显著提高结合亲和力。这种提高的亲和力可以改善对T细胞的标记，还可以降低标签从T细胞表面解离的可能性。如图6B所示，捕获剂条形码结构域601可以用链霉亲和素602修饰，然后与生物素化MHC 603的多个分子接触，使得这些生物素化MHC 603分子与链霉亲和素缀合的捕获剂条形码结构域601偶联。得到了加条形码的MHC多聚体复合物605。如图6B所示，捕获剂条形码结构域序列601可以将MHC识别为其相关联的标签，并且还包括任选的功能序列，诸如用于与其他寡核苷酸杂交的序列。如图6C所示，一种示例寡核苷酸是捕获探针606，其包括互补序列(例如，对应于C C C的rGrGrG)、条形码序列和其他功能序列，诸如UMI、衔接子序列(例如，包含测序引物序列(例如，R1或部分R1(“pR1”)，R2)、流动池附接序列(例如，P5或P7，或者它们的部分序列))，等等。在一些情况下，捕获探针606可以首先与特征(例如，凝胶珠粒)缔合，然后从该特征释放。在其他实施方案中，捕获探针606可以与MHC-寡核苷酸复合物605的捕获剂条形码结构域601杂交。然后可以在引物延伸反应中延伸杂交的寡核苷酸(间隔区C C C和间隔区rGrGrG)，从而产生包含对应于两个空间条形码序列(与捕获探针相关联的空间条形码，以及与MHC-寡核苷酸复合物相关联的条形码)中的每一者的序列的构建体。在一些情况下，对应序列中的一者或两者可以是捕获探针606或捕获剂条形码结构域601中的原始序列的互补序列。在其他实施方案中，捕获探针和捕获剂条形码结构域连接在一起。所得构建体可以任选地进一步加工(例如，以添加任何另外的序列和/或用于清除)，然后进行测序。如本文别处所述，衍生自捕获探针606空间条形码序列的序列可以用于识别特征，并且衍生自捕获剂条形码结构域601上的空间条形码序列的序列可以用于识别结合在细胞表面上的特定肽MHC复合物604(例如，当使用MHC肽文库来筛选免疫细胞或免疫细胞群体时)。
对分析物捕获剂的附加描述可以在WO 2020/176788的第(II)(b)(ix)节和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)(viii)节中找到。
至少有两种方法将空间条形码与一个或多个相邻细胞相关联，使得该空间条形码将一个或多个细胞和/或一个或多个细胞的内容物标识为与特定空间位置相关联。一种方法是将分析物或分析物替代物(例如，中间剂)推出细胞并推向在空间上加条形码的阵列(例如，包括在空间上加条形码的捕获探针)。另一种方法是将在空间上加条形码的捕获探针从阵列上裂解，然后将在空间上加条形码的捕获探针推向生物样品以及/或者推到生物样品之中或之上。
在一些情况下，捕获探针可以被构造成从模板(例如，DNA或RNA模板，诸如分析物或中间剂(例如，连接的探针(例如，连接产物)或分析物捕获剂)，或其一部分)或其衍生物引发、复制且因此产生任选地加条形码的延伸产物(参见例如，WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663有关延伸的捕获探针的第(II)(b)(vii)节)。在一些情况下，捕获探针可以被构造成与模板(例如，DNA或RNA模板，诸如分析物或中间剂，或其一部分)形成连接的探针(例如，连接产物)，从而产生用作模板替代物的连接产物。
如本文所用，“延伸的捕获探针”是指在捕获探针的末端(例如，3’或5’端)添加了额外的核苷酸，由此使该捕获探针的全长延伸的捕获探针。例如，“延伸的3’端”表示额外的核苷酸添加到捕获探针的最靠近3’端的核苷酸以延伸该捕获探针的长度，例如，通过用于延伸核酸分子的聚合反应，包括由聚合酶(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)催化的模板化聚合。在一些实施方案中，延伸捕获探针包括向捕获探针的3’端添加核酸序列，该核酸序列与特异性地结合捕获探针的捕获结构域的分析物或中间剂的核酸序列互补。在一些实施方案中，使用逆转录来延伸捕获探针。在一些实施方案中，使用一种或多种DNA聚合酶来延伸捕获探针。延伸的捕获探针包括捕获探针的序列和捕获探针的空间条形码的序列。
在一些实施方案中，将延伸的捕获探针扩增(例如，在本体溶液中或在阵列上)以产生足以用于下游分析(例如，经由DNA测序)的量。在一些实施方案中，延伸的捕获探针(例如，DNA分子)充当扩增反应(例如，聚合酶链式反应)的模板。
空间分析方法的附加变型(在一些实施方案中包括成像步骤)在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(a)节中有所描述。对所捕获分析物(和/或中间剂或其部分)的分析，例如，包括样品去除、延伸捕获探针、测序(例如，对裂解的延伸捕获探针和/或与延伸捕获探针互补的cDNA分子进行测序)、阵列上测序(例如，使用例如原位杂交方法或原位连接方法)、时间分析和/或邻近捕获，在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(g)节中有所描述。一些质量控制措施在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(h)节中有所描述。
空间信息可以提供具有生物重要性的信息。例如，本文所述的方法和组合物能够允许：识别转录组表达谱和/或蛋白质组表达谱(例如，在健康组织和/或患病组织中)；识别非常接近的多种分析物类型(例如，最近邻分析)；确定患病组织中上调和/或下调的基因和/或蛋白质；表征肿瘤微环境；表征肿瘤免疫反应；表征细胞类型和它们在组织中的共定位；以及识别组织内的遗传变体(例如，基于与特定疾病或异常生物标志物相关联的基因表达谱和/或蛋白质表达谱)。
通常，对于基于空间阵列的方法，基板用作将捕获探针直接或间接地附接到阵列特征的支持物。“特征”是充当空间分析中使用的各种分子实体的支持物或储存库的实体。在一些实施方案中，阵列中的一些或全部特征被功能化，以便捕获分析物。示例性基板在WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(c)节中有所描述。阵列的示例性特征和几何属性可以在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(d)(i)节、第(II)(d)(iii)节和第(II)(d)(iv)节中找到。
一般来讲，当生物样品与包括捕获探针的基板(例如，具有嵌入、点样、印刷、制造在基板上的捕获探针的基板，或具有包括捕获探针的特征(例如，珠粒、孔)的基板)接触时，可以捕获分析物和/或中间剂(或其部分)。如本文所用，生物样品与基板的“接触”是指使得捕获探针可以与来自生物样品的分析物相互作用(例如，共价或非共价结合(例如，杂交))的任何接触(例如，直接或间接)。捕获可以主动实现(例如，使用电泳)或被动实现(例如，使用扩散)。分析物捕获在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(e)节中进一步描述。
在一些情况下，可以通过将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，肽、脂质或核酸分子)附接到和/或引入生物样品(例如，生物样品中的细胞)来进行空间分析。在一些实施方案中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个核酸分子)引入生物样品(例如，生物样品中的多个细胞)，以用于空间分析。在一些实施方案中，在将具有条形码的分子附接到和/或引入生物样品之后，可以将生物样品物理分离(例如，解离)成单细胞或细胞群以供分析。一些这样的空间分析方法在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(III)节中有所描述。
在一些情况下，可以通过检测与分析物杂交的多个寡核苷酸来进行空间分析。例如，在一些情况下，可以使用RNA模板化连接(RTL)来进行空间分析。之前已描述过RTL方法。参见例如，Credle等人，Nucleic Acids Res.2017年8月21日；45(14)：e128。通常，RTL包括两个寡核苷酸与分析物(例如RNA分子，诸如mRNA分子)上的相邻或邻近序列的杂交。在与分析物杂交后，连接酶(例如，SplintR连接酶)将这两个寡核苷酸连接在一起，产生连接的探针(例如，连接产物)。连接后，连接的探针(例如，连接产物)从分析物释放。然后可以通过阵列上的捕获探针(例如，代替对分析物的直接捕获)来捕获释放的连接探针(例如，连接产物)，任选地扩增并测序，从而确定生物样品中分析物的位置，并任选地确定生物样品中分析物的丰度。
在分析空间信息期间，获得与分析物相关联的空间条形码的序列信息，该序列信息可以用于提供关于生物样品中分析物的空间分布的信息。可以使用各种方法来获得空间信息。在一些实施方案中，特定的捕获探针和它们捕获的分析物与基板上的特征阵列中的特定位置相关联。
当在分析空间信息期间获得捕获探针和/或分析物的序列信息时，可以通过参考将每个空间条形码与阵列特征位置唯一关联的存储信息来确定捕获探针和/或分析物的位置。以这种方式，特定的捕获探针和所捕获分析物与特征阵列中的特定位置相关联。每个阵列特征位置表示相对于阵列的坐标参考点(例如，阵列位置、基准标记物)的位置。因此，每个特征位置在阵列的坐标空间中均具有一个“地址”或位置。
一些示例性空间分析工作流程在WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的示例性实施方案章节中有所描述。参见例如，WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中以“在本文所述工作流程的一些非限制性实例中，可以将样品浸入……”开头的示例性实施方案。还可参见例如，Visium空间基因表达试剂套件用户指南(例如Rev D，日期：2020年10月)，和/或Visium空间组织优化试剂套件用户指南(例如RevD，日期：2020年10月)。在一些实施方案中，可以使用专用硬件和/或软件来执行空间分析，诸如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(e)(ii)节和/或第(V)节中描述的系统中的任何一种，或者WO 2020/123320的章节“用于成像的对照载片”、“使用对照载片和基板的方法”、“使用对照载片和基板来成像的系统”和/或“样品和阵列对准装置和方法”、“信息标签”中描述的装置或方法中的任何一种或多种。
用于执行空间分析的合适系统可以包括诸如用于容纳生物样品的腔室(例如，流动池或可密封的流体密封腔室)之类的部件。生物样品可以安装在例如生物样品保持器中。一个或多个流体腔室可以经由流体导管连接到前述腔室和/或样品保持器，流体可以经由流体泵、真空源或联接到流体导管产生压力梯度以驱动流体流动的其他装置输送到前述腔室和/或样品保持器中。一个或多个阀也可以连接到流体导管，以调节试剂从储存器到前述腔室和/或样品保持器的流动。
该系统可以任选地包括控制单元，该控制单元包括一个或多个电子处理器、输入接口、输出接口(诸如显示器)和存储单元(例如固态存储介质，诸如但不限于磁存储介质、光存储介质或其他固态存储介质，持久的、可写的和/或可重写的存储介质)。该控制单元可以任选地经由网络连接到一个或多个远程装置。该控制单元(及其部件)一般可以执行本文所述步骤和功能中的任一种。在系统连接到远程装置的情况下，一个或多个远程装置可以执行本文所述步骤或特征中的任一种。该系统可以任选地包括一个或多个用于捕获图像的检测器(例如，CCD、CMOS)。该系统还可以任选地包括用于照射样品的一个或多个光源(例如，基于LED、基于二极管、激光器)、具有特征的基板、来自基板上捕获的生物样品的分析物，以及各种对照和校准介质。
该系统可以任选地包括在有形存储介质和硬件部件(诸如专用集成电路)中的一者或多者中编码和/或实现的软件指令。这些软件指令在由控制单元(特别是电子处理器)或集成电路执行时，可以使得控制单元、集成电路或执行软件指令的其他部件执行本文所述方法步骤或功能中的任一种。
在一些情况下，本文所述的系统可以检测(例如，记录图像)阵列上的生物样品。用于检测阵列上的生物样品的示例性方法在PCT申请号2020/061064和/或美国专利申请序列号16/951,854中有所描述。
在将分析物从生物样品转移到基板上的特征阵列之前，可以将生物样品与阵列对准。生物样品与包括捕获探针的特征阵列对准可以促进空间分析，其可以用于检测生物样品中不同位置内分析物存在和/或水平的差异，例如，以生成分析物存在和/或水平的三维图。用于生成分析物存在和/或水平的二维图和/或三维图的示例性方法在PCT申请号2020/053655中有所描述，空间分析方法在WO 2020/061108和/或美国专利申请序列号16/951,864中有大致描述。
在一些情况下，可以使用一个或多个基准标记物(例如，放置在成像系统的视野中且出现在所产生的图像中的物体)将分析物存在和/或水平的图与生物样品的图像对准，如WO 2020/123320、PCT申请号2020/061066和/或美国专利申请序列号16/951,843的“基板属性”章节、“用于成像的对照载片”章节中所述。基准标记物可以用作参考点或测量标度，用于对准(例如，对准样品和阵列、对准两个基板、确定样品或阵列在基板上相对于基准标记物的位置)以及/或者用于尺寸和/或距离的定量测量。
本文所述的实施方案可以用载片(例如，阵列载片)来绘制复杂组织样品的空间基因表达(例如，在组织载片上)，其中载片利用分析物和/或mRNA转录物捕获和空间条形码技术来进行文库制备。可以将组织(例如，新鲜冷冻的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织，等等)切片，放置在具有数千个加条形码斑点的载片附近，其中每个斑点均含有数百万个捕获寡核苷酸，这些捕获寡核苷酸具有该斑点特有的空间条形码。一旦组织切片被固定、染色和透化，它们就从组织的近侧位置释放与捕获寡核苷酸结合的mRNA。当组织仍在原位时，可能会发生逆转录反应，从而产生掺入空间条形码并保留空间信息的cDNA文库。加条形码的cDNA文库被映射回加条形码斑点的捕获区上的特定斑点。该基因表达数据随后可以在组织切片的高分辨率显微镜图像上分层，使得有可能以空间分辨的方式显现组织形态内任何mRNA或mRNA组合的表达。
II.样品和阵列对准装置和方法
本文所述的空间分析工作流程通常涉及使样品与特征阵列接触。在利用此类工作流程的情况下，将样品与阵列对准在执行空间(例如，空间转录组学)测定中可能很重要。有效产生给定样品的可靠实验数据的能力在很大程度上可能取决于样品与阵列的对准。传统的技术需要将样品直接放置到阵列上。这种方法可能需要熟练的人员和额外的实验时间来制备样品的切片并将样品的切片直接安装在阵列上。样品与阵列未对准可能导致资源浪费、样品制备时间延长以及样品的低效使用，这可能引起样品量受限。
本文所述的系统、方法和计算机可读介质能够实现样品与阵列的高效精确对准，从而有助于本文所述的空间组学(例如，空间转录组学)成像和分析工作流程或测定。样品(诸如部分组织)可以放置在第一基板上。第一基板可以包括载片，用户可以将组织样品放置到该载片上。阵列(诸如试剂阵列)可以被包括(例如，形成)在第二基板上。第二基板可以包括载片，并且阵列可以形成在第二基板上。对样品和阵列使用分开的基板可以有利地允许用户进行本文所述的空间组学(例如，空间转录组学)测定，而无需将样品放置到阵列基板上。本文所述的样品保持器和使用方法可以提高使用者提供用于空间组学(例如，空间转录组学)分析的样品的便利性。例如，本文所述的系统和方法让使用者免于拥有先进的样品或组织切片或安装专门技能就可以操作。对样品和阵列使用分开的基板的额外益处可以包括改进的样品制备和样品成像时间、更强的对感兴趣区域(ROI)做出选择的能力，以及对样品和阵列基板的更有效使用。本文所述的系统、方法和计算机可读介质可以进一步使得用户能够选择样品的最佳切片以提交给测序工作流程。一些组织样品或部分组织样品在安装期间可能受损。例如，组织样品或部分组织样品可能自身折叠。本文所述的系统、方法和计算机可读介质可以进一步使得用户能够在提交给测序工作流程之前确认相关病理学状态和/或生物学状态。
样品基板和阵列基板，以及因此样品和阵列，可以使用本文所述的仪器和方法来对准。由于样品与阵列(诸如试剂阵列)的对准改进，因此本文所述的对准技术和方法可以产生更准确的空间(例如，空间转录组学)测定结果。
在一些实施方案中，本文所述的工作流程包括使设置在第一基板的某个区上的样品与第二基板的至少一个特征阵列接触。在一些实施方案中，该接触包括拉近两个基板的距离，使得第一基板上的样品可以与第二基板上的加条形码的阵列对准。在一些情况下，该接触通过将第一基板和第二基板布置在夹层组件中来实现。在一些实施方案中，工作流程包括将样品安装到第一基板上的在先步骤。
第一基板上的样品与第二基板上的阵列的对准可以手动或自动实现(例如，经由机动化对准)。在一些方面，手动对准可以在最少的光学或机械辅助下完成，然而在将样品的期望的感兴趣区域与加条形码的阵列对准时，可能导致精度有限的问题。此外，由于透化步骤期间所需的时间相对较短，因此对手动完成的对准的调整可能很耗时。
图7示出了根据一些示例实施方式的示例性空间分析工作流程700。工作流程700包括在载片(例如，病理载片)上制备生物样品701、固定该样品，以及/或者对生物样品进行染色702以用于成像。然后，可以使用明场模态(对苏木精和伊红染色的样品成像)和/或荧光(对特征成像)模态在载片上将染色的样品成像。成像可以包括高分辨率成像(例如，可以揭示病理学特征和组织学特征的图像)。任选地，在703处，样品可以在透化之前脱色。在704处，可以将透化溶液施加到生物样品，同时病理载片以“夹层”构造与包括在空间上加条形码的阵列的载片(例如，GEx载片)对准。透化溶液允许分析物和/或mRNA转录物迁移离开样品、扩散穿过透化溶液，然后朝阵列迁移。分析物和/或mRNA转录物与载片上的在空间上加条形码的阵列上的捕获探针相互作用。
在705处，捕获探针可以任选地从阵列上裂解，所捕获分析物可以通过进行逆转录酶第一链cDNA反应而在空间上加条形码。第一链cDNA反应可以任选地使用模板转换寡核苷酸来进行。在706处，可以扩增第一链cDNA(例如，使用聚合酶链式反应(PCR))，其中正向引物和反向引物位于空间条形码和感兴趣的分析物区域的侧翼，从而产生与特定空间条形码相关联的文库。在一些实施方案中，cDNA包含边合成边测序(SBS)引物序列。可以对文库扩增子进行测序和分析，以解码空间信息。
图8描绘了根据一些示例实施方式的用于在载片(例如病理载片)上制备生物样品的示例工作流程701。在载片上制备生物样品可以包括选择病理载玻片801。工作流程701还包括将组织切片放置在载玻片802上。将组织切片放置在载玻片上可以包括将组织放置在载玻片上的任何位置，包括将组织放置在设置在载玻片上的基准上或将组织放置为与设置在载玻片上的基准相关。基准可以包括任何有助于将组织放置在载片上以及/或者有助于组织载片相对于阵列载片对准的标记。工作流程701还包括用苏木精和伊红803或者另一种染色剂或方法将组织染色。工作流程701还包括使用明场(对苏木精和伊红染色的样品成像)或另一种成像技术对载片上的组织804成像。成像可以包括在用户成像系统上的高分辨率成像。该成像可以允许用户确认相关病理以及/或者识别用于分析的任何目标区。
本文所述的涉及在载片上制备生物样品的实施方案可以有利地允许用户：确认组织切片上的病理区域或相关区域、确认选择最佳或未受损的组织切片以供分析、通过放置在病理载片上的任何位置就能够改进阵列与组织的对准。另外，用于在载片上制备生物样品的工作流程可以授予用户或科学家权利以选择要测序的对象(例如，要测序的组织切片)。
图9A是描绘根据一些示例实施方式的夹层构造中组织载片与阵列载片之间的示例性透化溶液相互作用704的示意图。在图9A的示例性构造中，样品(例如，组织样品或生物样品)902设置在病理载片903上，并且夹置在病理载片903与载片904(例如阵列载片，例如基因表达载片)之间，其中载片904组装有在空间上加条形码的捕获探针906。如图所示，载片904位于病理载片903的上方位置。在一些实施方案中，病理载片903可以定位在载片904的上方。当透化溶液905施加到病理载片903与载片904之间的间隙907时，透化溶液905可以产生透化或消化样品902的透化缓冲液，随后组织样品902的分析物(例如，mRNA转录物和/或其他分子)908可以释放，穿过间隙907向捕获探针906扩散，然后结合在捕获探针906上。分析物908(例如，转录物)结合到捕获探针906上后，可以发生逆转录反应，从而产生与特定空间条形码相关联的cDNA文库(例如，其中文库成员包含空间条形码的cDNA文库)。加条形码的cDNA文库(例如，文库成员)可以被映射回捕获探针906的捕获区上的特定斑点。该数据(例如，基因表达数据)随后可以在组织切片的高分辨率显微镜图像上分层(例如，在图8的804处拍摄)，使得有可能以空间分辨的方式显现组织形态内任何mRNA或mRNA组合的表达。
样品902、病理载片903和载片904的夹层构造可以提供优于其他空间分析方法和/或分析物捕获方法的优点。例如，该夹层构造可以减轻用户提高自身的组织切片和/或组织安装专门技能的负担。另外，该夹层构造可以使样品制备/组织成像与加条形码的阵列(例如，在空间上加条形码的捕获探针906)脱离，并且使得能够选择特定的感兴趣区域以供分析(例如，对于大于加条形码的阵列的组织切片)。该夹层构造还有利地实现了空间组学(例如，转录组学)测定，而不必将组织切片902直接放置在阵列载片(例如，载片904)上，这可以降低样品制备期间的成本和错误/问题的风险。该夹层构造还可以通过将目标分子在竖直方向上限制在扩散距离内来提高灵敏度和空间分辨率。
图9B描绘了根据示例实施方式用于执行样品分析的示例性实验工作流程900。如图所示，工作流程900包括脱色步骤951、干燥步骤956、夹层制作(例如透化)步骤958、逆转录步骤960、第二链合成(SSS)步骤962、文库制备步骤964和测序步骤966。脱色步骤951可以包括使组织载片的苏木精脱色。如进一步所示，步骤951可以包括初始染色的组织载片953，以及在脱色过程之后的脱色的组织载片955。在干燥步骤956中，组织载片955可以在37℃或另一温度下干燥一段时间。在步骤958处，组织载片955可以夹置在具有阵列载片(例如，具有加条形码的阵列捕获探针906的载片904)和透化介质(例如，透化溶液905)的样品处理设备中。
在一些方面，在步骤958期间，样品处理设备可以捕获组织切片的图像957。该图像可以包括组织切片和组织载片上的任何基准的低分辨率图像。在步骤960处，工作流程900可以包括在第二基板上进行逆转录。在步骤962处，工作流程900可以包括在第二基板上进行第二链合成。在步骤964处，工作流程900可以包括生成与阵列载片的特定空间条形码相关联的cDNA文库。测序步骤966可以包括对文库扩增子进行测序和分析，以解码空间信息。加条形码的cDNA文库可以被映射回捕获探针906的捕获区上的特定斑点。该基因表达数据随后可以在组织切片的高分辨率显微镜图像上分层。在一些方面，在测序期间或之前，可以捕获组织切片的高分辨率图像967用于上述分层。
上述用于分析生物样品的方法(诸如上述夹层构造)可以使用多种硬件部件来实现。在本章节中，描述了此类部件的实例。然而，应当理解，一般来讲，本文所论述的各种步骤和技术可以使用多种不同的装置和系统部件来执行，但并非所有这些装置和系统部件都被明确地阐述。
图10是示出根据一些示例实施方式的示例样品处理设备1000的示意图。样品处理设备1000(也称为样品保持器1000)包括保持第一基板1006的第一构件1004，样品902可以定位在该第一基板上。第一构件1004可以包括第一保持机构，该第一保持机构被构造成将第一基板1006保持在沿轴线的固定位置，并且将第一基板保持设置在第一平面中。如图所示，样品处理设备1000还包括保持第二基板1012的第二构件1010。第二构件1010可以包括第二保持机构，该第二保持机构被构造成将第二基板1012保持设置在第二平面中。第二基板1012可以包括加条形码的阵列(例如，在空间上加条形码的捕获探针906的阵列)，如上所述。如图所示，样品处理设备1000还包括调节机构1015，该调节机构被构造成移动第二构件1010。调节机构1015可以联接到第二构件1010并且包括线性致动器1020，该线性致动器被构造成沿与第二平面正交的z轴移动第二构件1010。在一些方面，调节机构1015可以替代性地或另外地联接到第一构件1004，例如，被构造成移动第一构件1004。
在一些实施方案中，根据一些示例实施方式，第一基板1006与第二基板1012重叠。该重叠可以沿与第一基板1006正交并且/或者与第二基板1012正交的轴线发生。在一些方面，相机可以捕获重叠区的图像，该图像可以用作本文进一步描述的空间分析的一部分。
图11是根据一些示例实施方式的示例调节机构1015的图示。调节机构1015可以包括移动板1116、衬套1117、有肩螺钉1118、马达托架1119和线性致动器1020。移动板1116可以联接到第二构件1010，并且通过在上方向上朝第一基板406向上移动该移动板1116，可以调节沿z轴(例如，与第二基板1012正交)的分隔距离(例如，间隙907)。移动板1106的这种移动可以通过线性致动器1020来完成，该线性致动器被构造成沿与第二平面正交的轴线以一定速度移动第二构件1010。该速度可以由以能够通信的方式耦接到线性致动器1020的控制器来控制。例如，该速度可以被配置为以介于至少0.1mm/s至2mm/s之间的速度来移动该移动板。在一些方面，移动板(例如，闭合夹层)的速度可以影响透化溶液905内的气泡产生或截留。另外，线性致动器可以被构造成用一定量的力(例如，介于0.1磅至4.0磅之间的力)移动该移动板1106。控制器可以被构造成调节线性致动器1020的速度和/或力的量值，以实现移动板1116的速度和力的期望组合。
在一些方面，移动板(例如，闭合夹层)的速度可以影响透化溶液905内的气泡产生或截留。在“夹持”过程期间，使透化溶液内的气泡产生或截留最小化可能是有利的，因为气泡可能会妨碍分析物经由该溶液迁移到阵列。在一些实施方案中，选择闭合速度以使透化溶液905内的气泡产生或截留最小化。在一些实施方案中，选择闭合速度以缩短试剂介质的流动前沿从与第一基板和第二基板的初始接触点扫过夹层区所花费的时间(本文中也称为“闭合时间”)。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到小于约1100ms。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到小于约1000ms。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到小于约900ms。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到小于约750ms。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到小于约600ms。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到约550ms或更短的时间。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到约370ms或更短的时间。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到约200ms或更短的时间。在一些实施方案中，选择闭合速度以将闭合时间缩短到约150ms或更短的时间。
图12A是根据一些示例实施方式的处于闭合位置的示例样品处理设备1200的透视图。如图所示，样品处理设备1200包括第一构件1204、第二构件1210、图像捕获装置1220、第一基板1206、铰链1215和镜子1216。铰链1215可以被构造成通过沿铰链1215以蛤壳方式开启和/或闭合第一构件1204，来允许第一构件1204以开启或闭合构型定位。
图12B是根据一些示例实施方式的处于开启位置的示例样品处理设备1200的透视图。如图所示，样品处理设备1200包括一个或多个第一保持机构1208，该第一保持机构被构造成保持一个或多个第一基板1206。在图12B的该实例中，第一构件1204被构造成保持两个第一基板1206，然而第一构件1204可以被构造成保持更多或更少的第一基板1206。
在一些方面，当样品处理设备1200处于开启位置时(如图12B所示)，第一基板1206和/或第二基板1212可以装载和定位在样品处理设备1200内，诸如分别在第一构件1204和第二构件1210内。如上所述，铰链1215可以允许第一构件1204闭合在第二构件1210上形成夹层构造(例如，图9所示的夹层构造)。
在一些方面，在第一构件1204闭合在第二构件1210上之后，样品处理设备1200的调节机构(未示出)可以致动第一构件1204和/或第二构件1210，以形成用于透化步骤的夹层构造(例如，使第一基板1206和第二基板1212彼此更靠近，并且处于该夹层构造的阈值距离内)。调节机构可以被构造成控制夹层构造的速度、角度等。
在一些实施方案中，组织样品(例如，样品902)可以在闭合第一构件1204之前，在第一构件1204内对准(例如，经由第一保持机构1208)，使得样品902的期望的感兴趣区域与阵列载片(例如，载片904)的加条形码的阵列对准，例如，当第一基板和第二基板在夹层构造中对准时。这种对准可以手动(例如，由用户)或自动(例如，经由自动化对准机构)完成。在对准之后或之前，可以将隔件施加到第一基板1206和/或第二基板1212，以在夹持期间维持第一基板1206与第二基板1212之间的最小间距。在一些方面，透化溶液(例如，透化溶液905)可以施加到第一基板1206和/或第二基板1212上。第一构件1204然后可以闭合在第二构件1210上形成夹层构造。分析物(例如，mRNA转录物和/或其他分子)908可以被捕获探针906捕获，然后可以被加工用于空间分析。
在一些实施方案中，在透化步骤期间，图像捕获装置1220可以捕获组织902与捕获探针906之间的重叠区(例如，重叠区710)的图像。如果在样品处理设备1200内存在多于一个第一基板1206和/或第二基板1212，则图像捕获装置1220可以被配置为捕获一个或多个重叠区710的一个或多个图像。
可能希望执行组织载片(例如，病理载片903)与阵列载片(例如，具有加条形码的捕获探针906的载片904)的实时对准。在一些实施方式中，这种实时对准可以经由样品处理设备(例如，样品处理设备1000、样品处理设备1200等)的机动化平台和致动器来实现。
因此，本公开的装置可以有利地对准(例如，沿XY轴)7B)。(例如，将第一基板和/或第二基板以对准的方式沿Z轴朝向彼此移动。例如，调节机构1015可以被构造成沿与第一构件1004正交的轴线(例如，沿z轴)移动一个或多个第一构件1004，以便于夹持第一基板和/或第二基板。
第一基板和第二基板的适当对准在空间转录组学应用中可能是有益的，因为样品(例如，生物样品902)可以与基板(例如，捕获探针906)的加条形码的区对准，从而提供精确的空间数据。
III.流体输送方法和套件
生物样品内的分析物通常通过破坏(例如，透化、消化等)生物样品来释放，也可以在不破坏生物样品的情况下释放。本文描述了透化生物样品的各种方法(例如，本文所述的任何透化试剂和/或条件)，包括例如在各种温度下使用各种去污剂、缓冲剂、蛋白酶和/或核酸酶不同的时间段。此外，本文描述了向生物样品输送流体(例如，缓冲液、透化溶液)的各种方法，包括使用基板保持器(例如，夹层组件、夹层构造，如本文所述)。
本文提供了用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法。
在一些实施方案中，参考图9，本文所述的介于组织样品载片(例如，病理载片903)与阵列载片(例如，具有加条形码的捕获探针906的载片904)之间的夹层构造可能需要添加液体试剂(例如，透化溶液905或其他目标分子释放和捕获溶液)来填充间隙(例如，间隙907)。可能希望液体试剂在这些载片之间没有气泡，以便于具有空间信息的目标分子的转移。此外，存在于这些载片之间的气泡可能使得期望的感兴趣区域的图像捕获的至少一部分模糊。因此，可能希望在透化步骤(例如，步骤104)期间确保或鼓励抑制和/或消除这两个载片之间的气泡。
在一些方面，可能可以使用多种填充方法和/或闭合方法来减少或消除这些载片之间的气泡形成。
本文所述的工作流程可以包括使设置在第一基板(例如，第一基板1006、1206等)或第二基板(例如，第二基板1012、1212等)上的液体试剂液滴分别与第一基板(例如，第一基板1006、1206等)或第二基板(例如，第二基板1012、1212等)的至少一部分接触。在一些实施方案中，该接触包括拉近两个基板的距离，使得第一基板上的样品与第二基板上的捕获探针的条形码阵列对准。
在一些实施方案中，液滴包括透化试剂(例如，本文所述的任何透化试剂)。在一些实施方案中，通过在各种温度下输送透化试剂(例如，包含透化试剂的流体)来调控生物样品的透化速率。
在一些实施方案中，透化试剂是干燥的透化试剂。在一些实施方案中，将干燥的透化试剂设置在基板(例如，第一基板、第二基板)上。在一些实施方案中，输送流体(例如，通过本文所述流体输送方法中的任一种)使干燥的透化试剂溶解。在一些实施方案中，使透化试剂溶解导致生物样品透化。在一些实施方案中，经由垫圈中的孔输送流体以使干燥的试剂溶解。在一些实施方案中，穿过通孔输送流体以使干燥的试剂溶解。在一些实施方案中，用流体使干燥的试剂溶解包括使用注射器。在一些实施方案中，用流体使干燥的试剂溶解包括毛细流动。
透化溶液905)可以填充组织载片(例如，载片903)与捕获载片(例如，具有加条形码的捕获探针906的载片904)之间的间隙(例如，间隙907)，以保证或实现具有空间信息的目标分子的转移。本文描述了可以抑制气泡形成和抑制转录物和/或目标分子或分析物的不希望的流动的填充方法的实例。本文所述的夹层构造制作过程中的稳健流控技术可以通过在分子从组织载片移动到捕获载片时减少或防止分子的偏转来保存空间信息。
图13A示出了示例性夹层构造1300，其中使得包括生物样品902(例如，组织切片)的第一基板(例如，病理载片903)和第二基板(例如，包括在空间上加条形码的捕获探针906的载片904)处于彼此接近的状态。如图13A所示，液体试剂液滴(例如，透化溶液905)被引导至第二基板上接近捕获探针906并且介于生物样品902与第二基板(例如，载片904)之间的位置。透化溶液905可以释放分析物，这些分析物能够被阵列的捕获探针906捕获。如进一步所示，一个或多个隔件1310可以定位在第一基板(例如，病理载片903)与第二基板(例如，载片904)之间。一个或多个隔件1310可以被构造成维持第一基板与第二基板之间的分隔距离。虽然一个或多个隔件1310被示为设置在第二基板上，但是除此之外或替代性地，一个或多个隔件1310可以设置在第一基板上。
图13B示出了根据一些示例实施方式的完全形成的夹层构造，其产生了由一个或多个隔件1310、第一基板(例如，病理载片903)和第二基板(例如，载片904)形成的腔室1350。在图13B的该实例中，液体试剂(例如，透化溶液905)填充腔室1350的容积，并且可以产生透化缓冲液，该透化缓冲液允许分析物(例如，mRNA转录物和/或其他分子)从生物样品902向载片904的捕获探针906扩散。在一些方面，透化缓冲液的任何流动都可能使来自生物样品902的转录物和/或分子偏转，因而可能影响用于空间分析的分析物的扩散转移。由一个或多个隔件1310、第一基板和第二基板产生的部分或完全密封的腔室1350可以减少或防止转录物和/或分子在从生物样品902扩散转移到捕获探针906的过程中的不希望的对流运动。
图13C描绘了图13B的构造1325的顶视图。如图所示，一个或多个隔件1310在夹置于第一基板与第二基板之间时，可以完全封闭和包围生物样品902并形成腔室1350。图13C的右侧部分描绘了通过在夹层开始形成时和夹层形成完毕时捕获样品902的图像期间对流减弱的一个实例。可以将此类图像各取一半拼接在一起，以表明在夹持期间扩散占优势并且对流受抑制。
一个或多个隔件1310可以被构造成维持第一基板与第二基板之间的分隔距离。一个或多个隔件1310可以在第一基板上邻近生物样品902放置在第一基板与第二基板之间。一个或多个隔件1310可以在第二基板上邻近阵列906放置在第一基板与第二基板之间。通过这样做，一个或多个隔件1310可以产生腔室(例如，腔室1350)，在整个透化和分析物迁移过程中，溶液(例如，缓冲液、透化溶液905)均容纳在该腔室中。在一些实施方案中，使用了多于一个隔件。
在一些实施方案中，一个或多个隔件1310被构造成将第一基板与第二基板之间的分隔距离维持在介于约2微米与1毫米之间(例如，介于约2微米与800微米之间、介于约2微米与700微米之间、介于约2微米与600微米之间、介于约2微米与500微米之间、介于约2微米与400微米之间、介于约2微米与300微米之间、介于约2微米与200微米之间、介于约2微米与100微米之间、介于约2微米与25微米之间、介于约2微米与20微米之间，或者介于约2微米与10微米之间)，该分隔距离是在与第一基板支撑样品的表面正交的方向上测量的。在一些情况下，该分隔距离为约2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、15微米、16微米、17微米、18微米、19微米、20微米、21微米、22微米、23微米、24微米或25微米。在一些实施方案中，该分隔距离小于50微米。在一些实施方案中，该分隔距离小于25微米。在一些实施方案中，该分隔距离小于20微米。该分隔距离可以包括至少2μm的距离。在一些实施方案中，该分隔距离是在与第一基板支撑生物样品的表面正交的方向上测量的。
在一些实施方案中，一个或多个隔件1310的高度介于约2微米与1毫米之间(例如，介于约2微米与800微米之间、介于约2微米与700微米之间、介于约2微米与600微米之间、介于约2微米与500微米之间、介于约2微米与400微米之间、介于约2微米与300微米之间、介于约2微米与200微米之间、介于约2微米与100微米之间、介于约2微米与25微米之间、介于约2微米与20微米之间，或者介于约2微米与10微米之间)，该高度是在与第一基板支撑样品的表面正交的方向上测量的。在一些情况下，一个或多个隔件1310的高度为约2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、15微米、16微米、17微米、18微米、19微米、20微米、21微米、22微米、23微米、24微米或25微米。在一些实施方案中，一个或多个隔件1310具有小于50微米的高度。在一些实施方案中，一个或多个隔件1310具有小于25微米的高度。在一些实施方案中，一个或多个隔件1310具有小于20微米的高度。
在一些情况下，第一基板与第二基板之间的分隔距离可以维持在介于50微米与1毫米之间(例如，介于50微米与800微米之间、介于50微米与700微米之间、介于50微米与600微米之间、介于50微米与500微米之间、介于50微米与400微米之间、介于50微米与300微米之间、介于50微米与200微米之间、介于50微米与100微米之间)，该分隔距离是在与第一基板支撑样品的表面正交的方向上测量的。
在一些实施方案中，一个或多个隔件1310的高度为约2μm、约12.5μm、约15μm、约17.5μm、约20μm、约22.5μm或约25μm。在一些实施方案中，一个或多个隔件1310的高度为约2μm、约12.5μm、约15μm、约17.5μm、约20μm、约22.5μm或约25μm。在一些实施方案中，隔件的高度为约50μm、约100μm、约200μm、约300μm、约400μm、约500μm、约600μm、约700μm、约800μm、约900μm或约1000μm。在一些方面，一个或多个隔件1310的高度可以在1μm至100μm的范围内。一个或多个隔件1310的高度或厚度可以基于如本文所述的流体的扩散加宽来选择。
一个或多个隔件1310可以由具有均匀厚度的材料或者具有可变(例如，倾斜)厚度的材料形成。在一些实施方案中，隔件材料被选择为可流体密封的。使用基本上可流体密封的隔件材料可以有利于在夹持期间减少由隔件、第一基板和第二基板形成的腔室内的侧向流动，例如，由于该腔室外的毛细流动引起的侧向流动。例如，一个或多个隔件1310可以包含石墨、聚酯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酰胺、聚三氟氯乙烯(PCTFE)、聚(乙烯-共-四氟乙烯)(ETFE)、PEEK(聚醚醚酮)、有机硅弹性体，等等。
在一些实施方式中，腔室1350和一个或多个隔件1310可以在夹持期间减少或抑制流体(例如，透化溶液905)的流动。图30是示意图3000，描绘了根据一些示例实施方式的夹层构造中的组织载片(例如，载片903)与阵列载片(例如，具有捕获探针906的载片904)之间的示例性透化溶液相互作用。如图所示，分析物(例如，mRNA转录物和/或其他分子)可以从组织载片903穿过间隙907朝向阵列载片904释放。如上文关于图9所述，间隙907可以包括透化溶液905，该透化溶液可以促进分析物(例如，mRNA转录物和/或其他分子)释放。如图30的该实例中进一步所示，分析物可以沿Z轴穿过间隙907朝向阵列载片904扩散，也可以沿XY轴扩散。在一些方面，透化溶液905可以包括沿XY轴且具有平均速度U的流动。这种流动可能导致分析物由于该流动而侧向移位，因而可能影响阵列载片904处对分析物(例如，mRNA转录物和/或其他分子)的恰当捕获。在一些实施方式中，为了实现准确的结果和捕获，一定的流量可能是可接受的。例如，当由于流动引起的侧向位移小于侧向扩散加宽(例如，由于沿XY轴扩散引起的位移)时，可以实现可接受的流量。在一些方面，可接受的流量可以基于间隙扩散时间和/或间隙高度来确定。例如，当侧向流速U乘以间隙扩散时间小于间隙907的高度时，流量可能是可接受的。在另一个实例中，当侧向流速U乘以间隙高度的平方除以扩散系数(例如，U*h2/D＜h)时，流量可能是可接受的。流量的示例接受标准可以包括小于某个阈值的侧向流速U，其中该阈值是夹持时间的某一百分比(例如，70％)。侧向流速U的一些示例性可接受值可以包括0.1μm/s至6μm/s。
在一些方面，可以有不同的方法来测量流量。在一个方面，流体(例如，透化溶液905)中可以包括流动跟踪颗粒。图31A是在透化溶液905内具有流动跟踪颗粒3105的示例夹层构造的图示3100。流动跟踪颗粒3105的尺寸可以是5μm至10μm，并且可以从如本文所述的样品保持器的成像系统中看到，以测量由于夹持期间的流动引起的侧向扩散的量。
在另一方面，可以在阵列载片904上包括染料以测量流量。图31B是阵列载片904上的示例染料3110的图示3150。在存在流动的情况下，染料3110可以在夹持期间快速移动并且显示流动方向和/或流量，诸如通过如本文所述的成像。
在一些方面，夹持期间的流量可能受到夹层腔室(例如，腔室1350)外部的毛细流动的影响。图32A描绘了根据一些示例性实施方式的示例夹层构造3200在夹层腔室外部的毛细流动。如图所示，腔室1350包括一个或多个隔件1310和开口3215。不希望受理论束缚，开口3215可以允许透化溶液905的一部分在某些条件下渗漏到腔室1350之外。如图32A的该实例所示，一定量的透化溶液905已从腔室1350的一侧漏出，并且已渗透到载片903下方与载片保持器3212之间的某些位置。如进一步所示，由于透化溶液905在腔室1350外部的毛细流动，可以形成空气-水界面3225。因此，本文提供了减少毛细流动并减小相关流动尖峰的方法和夹层构造。
图32B描绘了根据一些示例性实施方式的一种这样的示例夹层构造3250。在图32B的该实例中，一个或多个隔件1310包括密封隔件，该密封隔件可以是基本上可流体密封的或者可以由基本上可流体密封的材料制成。例如，基本上可流体密封的材料可以包括PTFE(聚四氟乙烯)、有机硅、PCTFE(聚三氟氯乙烯)、聚酰亚胺、ETFE(聚(乙烯-共-四氟乙烯))、PEEK(聚醚醚酮)等。使用基本上可流体密封的隔件1310可以减小或去除随机流动尖峰，并且增加转录物扩散的准确性或可接受性。
在一些方面，可以向载片903和/或载片904添加材料或背衬，以减小或去除来自腔室1350内的过量流体(例如，透化溶液905)的毛细流动的影响。图33描绘了根据一些示例性实施方式的示例夹层构造3300。如图所示，夹层构造3300包括介于载片904与载片保持器3212之间的背衬3305。背衬3305可以施加到载片904的底面或载片保持器3212的上表面。背衬3305可以被构造成防止流体(例如，透化溶液905)在载片904下方行进，并且抑制毛细流动。在一些方面，背衬3305可以包括硅橡胶、有机橡胶、弹性体或其他材料。背衬3305、载片904和/或载片保持器3212可以包括粘合剂或粘合剂表面，以将背衬3305固定到载片904和/或载片保持器3212。
在一些方面，隔件材料可以被选择用于促使放置在隔件上的试剂介质液滴在夹层闭合之前具有期望的接触角。在一些实施方案中，放置在隔件上的试剂介质液滴的期望接触角为40°或更大。在一些实施方案中，放置在隔件上的试剂介质液滴的期望接触角为50°或更大。参见例如图43。选择隔件材料以促使试剂液滴接触角为例如40°或更大或者50°或更大的优点包括但不限于：在夹层闭合之前确保液滴局限在隔件上，使得试剂介质在夹持之前不会渗漏到阵列区中，以及在夹持期间降低在由隔件、第一基板和第二基板形成的腔室中气泡形成/气泡截留的发生率。促使接触角为50°或更大的隔件材料包括但不限于：有机硅弹性体、石墨和聚酯。
在一些方面，一个或多个隔件1310可以经由粘合剂、等离子体处理和紫外线(UV)固化工艺等附接到第一基板和/或第二基板。例如，一个或多个隔件1310可以在一个或多个侧面上包括粘合剂或粘合剂层，使得一个或多个隔件1310可以附接到第一基板和/或第二基板。
图28示出了根据一些示例实施方式的示例性夹层构造2800，其中使得包括生物样品902(例如，组织切片)的第一基板(例如，病理载片903)和第二基板(例如，包括在空间上加条形码的捕获探针906的载片904)处于彼此接近的状态。如图28所示，液体试剂液滴(例如，透化溶液905)可以被引导至第二基板上接近捕获探针906并且介于生物样品902与第二基板(例如，载片904)之间的位置。透化溶液905可以释放分析物，这些分析物能够被阵列的捕获探针906捕获。如进一步所示，一个或多个隔件1310可以定位在第一基板(例如，病理载片903)与第二基板(例如，载片904)之间。在一些实施方案中，一个或多个隔件1310可以包括一个或多个间隔构件，这些间隔构件有助于维持第一基板和第二基板的间距和/或近似平行的布置。这些间隔构件可以连接到第一基板和第二基板中的任一者或两者。在一些方面，术语“隔件”和“垫圈”在本文中用于描述可以有助于维持第一基板和第二基板的间距和/或近似平行的布置的间隔构件，并且这些术语可以互换使用。
在一些实施方案中，一个或多个隔件1310可以在生物样品(例如，组织样品902或感兴趣区域)和/或阵列906周围产生完全或部分封闭的腔室。一个或多个完全封闭的隔件1310可以被构造成任何形状。在一些实施方案中，由一个或多个隔件1310产生的完全封闭(例如，包围)的腔室是正方形或矩形中的一种。在一些实施方案中，一个或多个隔件1310与生物样品902的形状相符。例如，一个或多个隔件1310在本文中被示为具有示例形状、示例高度，并且维持示例分隔距离(例如，12.5μm)，但其他的值和形状也是可能的，并且可以取决于液体试剂、生物样品902、捕获探针906，等等。
图29A描绘了示例隔件设计1310A至1310D的顶视图。如图所示，隔件设计1310A至1310D包括流体分配引导轮廓2911A至2911D和中心孔轮廓2912A至2912D。如进一步所示，隔件设计1310A至1310D可以具有几何图案/形状，诸如圆形切口或特征，用于在分配流体(例如，透化溶液905的液滴)时引导用户(例如，由流体分配引导轮廓2911A至2911D限定的区)。例如，隔件设计1310A示出了从隔件设计1310A的一侧(例如，右侧部分)延伸并且由流体分配引导轮廓2911A限定的矩形突出部。隔件设计1310B示出了从隔件设计1310B的一侧(例如，右侧部分)延伸的圆曲线突出部。该圆曲线突出部可以由流体分配引导轮廓2911B限定。隔件设计1310C示出了从隔件设计1310C的一侧(例如，右侧部分)延伸的圆曲线突出部。该圆曲线突出部可以由流体分配引导轮廓2911C限定。与隔件设计1310B相比，隔件设计1310C可以为该突出部限定较小的面积。隔件设计1310D示出了在隔件设计1310D的右侧部分上的圆形切口。该圆形切口可以由流体分配引导轮廓2911D限定，并且可以在隔件设计1310D的隔件中产生孔2914。隔件设计1310D中的孔2914可以有利地将分配的流体(例如，透化溶液905)液滴保持固定在亲水性表面上。虽然图29A中示出了用于引导用户的某些示例几何结构和形状，但是其他的设计、形状、几何结构等也是可能的。
图29B描绘了示例隔件1310的顶视图。如图所示，示例隔件1310具有正方形形状，其具有限定腔室1350的正方形中心孔。如进一步所示，中心孔由尺寸2915限定，隔件1310由尺寸2916限定。在一些方面，尺寸2915可以包括大约13mm的大小，尺寸1216可以包括大约25mm的大小。尽管给出了尺寸2915和2916的示例值，但是其他值也是可能的，并且可以基于第一基板和/或第二基板的大小和/或形状来选择。在一些实施方案中，尺寸2915和2916的大小基于例如第二基板上的在空间上加条形码的捕获探针阵列的阵列区的大小来确定。例如，尺寸2915和2916的大小可以被确定成使得隔件围绕阵列区，并且任选地不与阵列区重叠。
在一些方面，仪器(例如，样品保持器1000、样品保持器1200等)可以被构造成有助于为用户分配流体提供引导，例如，通过在流体分配位置提供灯光照明，通过设置标记、印记、机加工图案(诸如，指向隔件1310上的流体分配位置的箭头)。例如，灯可以定位在仪器的基板保持器内或下方，并且可以被构造成照亮基板或隔件上的区，作为指示流体分配位置的视觉引导。
图29C描绘了根据一些示例实施方式的示例基板构造2950。如图所示，基板构造2950包括基板2952和隔件1310以及定位在两者下方的基板保持器2951，光源2953设置在基板保持器2951的表面内或表面上。基板2952设置在基板保持器2951与隔件1310之间，隔件1310定位在基板2952的上方，光源2953定位在基板2952的下方。光源2953可以包括发光二极管(LED)或其他光源。如图所示，光源2953可以被构造成朝向基板2952和隔件1310向上(例如，在上方向上)发射光。在隔件设计1310D的该实例中，灯可以通过孔2914照射，并且通过提供视觉引导来帮助用户在孔2914内分配流体。在其中隔件没有孔的一些实施方案中，来自光源2953(例如，LED)的光可以穿过隔件，从而提供在隔件的照亮位置处分配流体的视觉引导。虽然光源2953被示为在示例基板构造2950中的特定位置，但是光源2953可以定位在仪器的其他位置。例如，光源2953可以定位在基板2952的上方或下方。此外，任何仪器引导件均可以与隔件1310上的视觉标记结合，以引导用户正确地进行流体分配。
图34展示了根据一些示例实施方式的用于将流体输送到生物样品的方法3400的流程图。在各种实施方式中，方法3400(或其至少一部分)可以由样品保持器1000、样品保持器1200、控制器、处理器、其他相关设备和/或前述项的某一部分中的一者或多者来执行。
方法3400可以从操作框3410处开始，在该操作框处，例如，样品保持器可以将流体输送到第一基板和/或第二基板。第一基板和第二基板中的至少一者可以包括隔件。
在一些实施方案中，生物样品可以设置在第一基板上，阵列可以设置在第二基板上。流体可以包括透化试剂或透化溶液。第一基板、第二基板或两者可以包括玻璃表面。第一基板和第二基板可以轴向对准或者以交叉构型对准。隔件可以包括虚拟垫圈。虚拟垫圈可以包括疏水性涂层或溶液。隔件可以包含聚酯或硅材料。隔件可以包括一个或多个孔，也可以不包括孔。隔件可以包括被构造成从流体排出气泡的透气隔件部分。隔件可以由厚度均匀的材料形成。隔件可以在其一个或多个侧面上包括斜边缘。将流体输送到第一基板和/或第二基板可以包括将流体输送到第二基板的某个区域，隔件包括部分地围绕流体的三个侧面。将流体输送到第一基板和/或第二基板可以包括将流体输送到隔件的某个区，该区域定位在第二基板的封闭区之外，该封闭区由隔件形成。将流体输送到第一基板和/或第二基板可以包括将流体输送到第二基板的某个区域，隔件包括部分地围绕流体的三个侧面。将流体输送到第一基板和/或第二基板可以包括对靠近第一基板和/或第二基板的区域产生真空。将流体输送到第一基板和/或第二基板可以包括调节腔室的湿度。第二基板可以包括远离感兴趣区域定位的疏水区，该疏水区可以被构造成从腔室中去除流体中的气泡，并且感兴趣区域可以包括生物样品和阵列重叠的区。
方法3400可以前进到操作框3420，在该操作框处，例如，样品保持器可以组装包括第一基板、第二基板、生物样品和隔件的腔室。
在一些实施方式中，隔件可以设置在第一基板与第二基板之间。隔件可以被构造成将流体保持在腔室内，并且维持第一基板与第二基板之间的分隔距离。该分隔距离可以包括至少2μm的距离。隔件可以被定位成至少部分地围绕第一基板上设置有生物样品的区。隔件可以被定位成至少部分地围绕设置在第二基板上的阵列。第一基板的所述区、隔件和第二基板可以至少部分地包围包括生物样品在内的容积。组装该腔室可以包括响应于输送，以一定角度定位第一基板，使得当第一基板和第二基板处于沿与第二基板正交的轴线的阈值距离内时，第一基板的下降侧与流体的至少一部分接触，该下降侧将流体推向部分地围绕流体的三个侧面。该腔室可以包括疏水性图案，该疏水性图案至少部分地围绕流体并且被定位成至少部分地围绕第一基板上的所述区和/或设置在第二基板上的阵列。该方法还可以包括将亲水性涂层施加到第一基板和/或第二基板上。该方法还可以包括对第一基板和/或第二基板产生振动。腔室可以包括部分或完全密封的腔室。
图14描绘了根据一些示例实施方式的用于从腔室1350排出或去除气泡的示例构造1400。图14描述了腔室1350的顶视图，其中正方形部分包括捕获探针906，圆形部分包括生物样品902，矩形部分包括疏水区1420。疏水区1420可以包括疏水性图案，该疏水性图案不会润湿，并且设置在腔室1350远离感兴趣区(例如，其中生物样品902和捕获探针906重叠的区)定位的一部分中。疏水区1420可以被构造成在透化步骤期间从腔室1350中去除气泡(例如，气泡2015)。
在一些方面，气泡排出特征或气泡去除特征的任何组合可以施加到腔室、第一基板和/或第二基板。例如，透气隔件(例如，隔件1310)可以被构造成排出截留的气泡。另外，设置在第一基板、第二基板和/或隔件上的气泡排出孔可以放置在关键位置以排出气泡。在一些方面，超声处理或振动装置可以被构造成在夹层闭合期间在第一基板和/或第二基板上产生振动，以减少气泡粘附到第一基板或第二基板表面上的机会。此外，可能可以在夹层闭合期间增加腔室的湿度，以促进透化溶液或液体试剂的填充过程。另外，可能可以在闭合期间在腔室中产生真空，以减少或消除气泡截留的机会。
图15A至图15C示出了根据一些示例实施方式的设置在第一基板(例如，病理载片903)和/或第二基板(例如，载片904)上的一个或多个隔件1310的示例构造。虽然在图15A至图15C中示出了载片904(例如，第二基板)，但是根据示例实施方案，示例隔件构造可以等同地应用于第一基板(例如，病理载片903)。在一些方面，图15A至图15C的示例隔件构造可以与如本文所述的成角度闭合工作流程(例如，图17A至图18B的工作流程1700)结合。
图15A是示例腔室1350的顶视图，该腔室部分封闭，一个或多个隔件1310的三个侧面是闭合的。如图所示，透化溶液905的液滴沿腔室1350的开口侧设置在载片904的表面上。在一些方面，第一基板(例如，病理载片903)与液滴905接触的成角度闭合可以将透化溶液推向部分地围绕液滴905的一个或多个隔件1310。在一些实施方式中，一个或多个隔件1310的三个侧面可以至少部分地围绕第二基板(例如，载片904)的捕获探针906和/或第一基板(例如，病理载片903)的生物样品902。透化溶液905可以定位靠近第二基板(例如，载片904)的捕获探针906或者第二基板的任何其他区域。
图15B描绘了完全封闭的另一种示例腔室1350的顶视图。如图所示，一个或多个隔件1310完全包围并封闭腔室1350。如进一步所示，透化溶液905的液滴在腔室1350外部定位在载片904的表面上。如上所述，第一基板(例如，病理载片903)在第二基板(例如，载片904)上的成角度闭合工作流程(例如，工作流程1700)可以使得第一基板的下降侧与液滴905接触，从而将透化溶液905推向腔室1350并使其流到腔室1350内。在图15B的该实例中，一个或多个隔件1310可以至少部分地围绕第二基板(例如，载片904)的捕获探针906和/或第一基板(例如，病理载片903)的生物样品902。
图15C描绘了完全封闭的另一种示例腔室1350的顶视图。如图所示，一个或多个隔件1310完全包围并封闭腔室1350。如进一步所示，透化溶液905的液滴在腔室1350外部定位在一个或多个隔件1310的表面上。如本文所述，第一基板(例如，病理载片903)在第二基板(例如，载片904)上的成角度闭合工作流程(例如，工作流程1700)可以使得第一基板的下降侧与透化溶液905的液滴接触，从而将透化溶液905推向腔室1350并使其流到腔室1350内。在图15C的该实例中，一个或多个隔件1310可以至少部分地围绕第二基板(例如，载片904)的捕获探针906和/或第一基板(例如，病理载片903)的生物样品902。
图16A至图16E描绘了根据一些示例实施方式的与一个或多个疏水区1420结合的一个或多个隔件1310的示例构造。所示的任何或所有示例构造可以与成角度闭合工作流程(例如，工作流程1700)结合，用于夹持第一基板和第二基板并用于形成腔室1350。
图16A描绘了示例腔室1350的顶视图。如图所示，腔室1350包括一个或多个隔件1310的三个侧面，还包括第四个侧面，其中第四个侧面包括疏水区1420。如进一步所示，透化溶液905的液滴位于载片904上靠近疏水区1420的位置。如上所述，第一基板(例如，病理载片903)在第二基板(例如，载片904)上的成角度闭合工作流程(例如，工作流程1700)可以使得第一基板的下降侧与透化溶液905的液滴接触，从而将透化溶液905推向相对侧并使其流到具有一个或多个隔件1310的三个侧面的腔室1350内。
图16B描绘了另一种示例腔室1350的顶视图。如图所示，腔室1350包括放置在腔室1350的四个拐角处的四个隔件1310，以及包括腔室1350的侧面的疏水区1420。在图16B的该实例中，放置在腔室1350的拐角处的隔件1310可以在夹持期间保持第一基板(例如，病理载片903)与第二基板(例如，载片904)之间的最小间距。图16B的疏水区1420可以在透化步骤期间将透化溶液905保留在腔室1350内。在夹持期间，透化溶液905可以填充腔室1350的容积。
在一些方面，可以实施一个或多个隔件1310、疏水区1420等的任何组合，以实现对腔室1350的组装并实现流动和/或气泡抑制。在一些实施方案中，一个或多个隔件1310和/或疏水区1420可以设置在第一基板(例如，病理载片903)或第二基板(例如，载片904)上。
图16C描绘了第二基板(例如，载片904)上的一个或多个隔件1310的示例构造的顶视图。如图所示，一个或多个隔件1310在腔室1350的三个侧面围绕透化溶液905的液滴。
图16D描绘了包括生物样品902和疏水区1420的第一基板(例如，病理载片903)的顶视图。
图16E描绘了与第二基板(例如，图16C的载片904)夹持在一起的第一基板(例如，图16D的病理载片903)的顶视图。如图所示，图16C的一个或多个隔件1310和图16D的疏水区1420的组合形成了图16E的完全封闭的腔室1350。
IV.附加的流体输送方法和套件
本文提供了用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，包括：组装包括第一基板、第二基板、生物样品和垫圈的部分密封的腔室，其中垫圈设置在第一基板与第二基板之间，并且围绕第一基板上的所述区和/或设置在第二基板上的阵列，其中第一基板的所述区、垫圈和第二基板至少部分地包围包括生物样品在内的容积；以及通过垫圈的一个或多个孔将流体输送到部分密封的腔室，从而将流体输送到阵列和生物样品。
本文还提供了用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，包括：组装包括第一基板、第二基板、生物样品和垫圈的部分密封的腔室，其中垫圈设置在第一基板与第二基板之间，并且围绕第一基板上的所述区和/或设置在第二基板上的阵列，其中第一基板、垫圈和第二基板至少部分地包围包括生物样品在内的容积；以及通过第一基板中的一个或多个通孔或者第二基板中的一个或多个通孔将流体输送到部分密封的腔室，从而将流体输送到阵列和生物样品。
本文还提供了用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，包括：将流体输送到第一基板上的所述区，其中虚拟垫圈围绕第一基板上的所述区并且将流体容纳在所述区内；以及将第二基板与第一基板组装在一起，从而将流体输送到阵列和生物样品。
本文还提供了用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，包括：将流体输送到第二基板上的所述区，其中虚拟垫圈围绕第二基板上的所述区并且将流体容纳在阵列上；以及将第一基板与第二基板组装在一起，从而将流体输送到阵列和生物样品。
在一些实施方案中，生物样品设置在第一基板上。在一些实施方案中，阵列(例如，包括捕获探针的基板)在第二基板上。在一些实施方案中，包括生物样品的第一基板和包括阵列(例如，空间阵列)的第二基板处于彼此接近的状态，使得第一基板和第二基板彼此靠近设置。
如本文所用，“部分密封的腔室”是第一基板与第二基板之间的腔室，其中垫圈设置在第一基板与第二基板之间。部分密封的腔室可通过垫圈中的一个或多个孔进入，这些孔允许将流体(例如，缓冲液、透化溶液)输送到部分密封的腔室。在一些实施方案中，部分密封的腔室包括完全围绕(例如，包围)生物样品和/或阵列的垫圈，其中第一基板或第二基板包括用于输送流体的一个或多个通孔。
在本文所述用于输送流体的任何方法的一些实施方案中，第一基板、第二基板或两者可以是本文描述的任何基板。在一些实施方案中，第一基板是玻璃表面。在一些实施方案中，第二基板是玻璃表面。在一些实施方案中，第一基板和第二基板都是玻璃表面。在一些实施方案中，玻璃表面是载玻片。在一些实施方案中，第一基板、第二基板或两者是载玻片。
在一些实施方案中，第一基板和第二基板可以轴向对准。例如，第二基板能够以与第一基板基本上相同的取向放置在第一基板上方，反之亦然。在一些实施方案中，第一基板和第二基板以交叉构型对准。例如，第二基板能够以与第一基板成大约90°角的取向放置在第一基板上方，反之亦然。在一些实施方案中，第二基板能够以相对于第一基板成约40°、约45°、约50°、约55°、约60°、约65°、约70°、约75°、约80°或约85°角的取向放置在第一基板上方，反之亦然。
在一些实施方案中，在对准第一基板和第二基板(例如，轴向、交叉构型)之前，在第一基板上设置垫圈。在一些实施方案中，垫圈围绕(例如，包围)生物样品。在一些实施方案中，在对准第一基板和第二基板之前，在第二基板上设置垫圈。在一些实施方案中，垫圈围绕(例如，包围)基板上的阵列。在一些实施方案中，垫圈没有孔(例如，开口)。在一些实施方案中，垫圈有一个孔。在一些实施方案中，垫圈有两个或更多个孔。在一些实施方案中，垫圈包括一个或多个孔，并且疏水性涂层设置在垫圈中的一个或多个孔处，以有助于防止流体(例如，透化溶液)在输送后溢出。
在一些实施方案中，垫圈可以由橡胶、有机硅或类似材料制成，以与第一基板形成密封。在一些实施方案中，垫圈可以由疏水性材料制成。因此，包括透化溶液在内的不同流体可以输送到垫圈的各个孔中。在一些实施方案中，垫圈底部和垫圈顶部与第一基板和第二基板接触所产生的接合形成了足够大的压力以维持在其中输送流体(例如，缓冲液、透化溶液)的部分密封的腔室。在一些实施方案中，垫圈是虚拟垫圈。
如本文所用，“虚拟垫圈”是这样的疏水性涂层：其功能类似于物理垫圈，使得在该虚拟垫圈内输送的流体被容纳在该虚拟垫圈的周边内。在一些实施方案中，该疏水性涂层有助于将流体(例如，透化溶液)定位在生物样品(包括感兴趣区域)上。在一些实施方案中，在对准(例如，轴向、交叉构型)组装之后，该疏水性涂层控制第一基板与第二基板之间的容积。在一些实施方案中，疏水性涂层是用压模施加的。例如，疏水性涂层可以用压模施加到第一基板、第二基板或两者上。在一些实施方案中，虚拟垫圈是绘制的。在一些实施方案中，虚拟垫圈是用蜡或石蜡基蜡笔绘制的。在一些实施方案中，虚拟垫圈是图案化的。例如，疏水性涂层能够以一定的图案施加到第一基板、第二基板或两者上。在一些实施方案中，疏水性涂层包围生物样品、阵列或两者。在一些实施方案中，疏水性涂层以与本文所述物理垫圈类似的图案施加。例如，疏水性涂层可以没有孔，也可以有一个孔，或者两个或更多个孔。在一些实施方案中，疏水性涂层延伸到包围的生物样品、阵列或两者之外，以防止第一基板与第二基板之间的毛细流动。在一些实施方案中，疏水性涂层以网格图案施加。例如，可以施加(例如，通过本文所述的任何方法施加)疏水性涂层，以包围基板上的一种或多种生物样品、一个或多个阵列(例如，空间阵列)，或两者。在一些实施方案中，可以施加疏水性涂层，以包围基板(例如，第一基板、第二基板)上的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种或更多种生物样品、一个或多个阵列(例如，空间阵列)，或两者。在一些实施方案中，疏水性涂层的图案化是经由电润湿动态地控制的。
在一些实施方案中，隔件用于分隔两个基板(例如，第一基板和第二基板)。隔件可以邻近生物样品放置在第一基板与第二基板之间。通过这样做，隔件可以产生腔室，在整个透化和分析物迁移过程中，溶液(例如，缓冲液、透化溶液)均容纳在该腔室中。在一些实施方案中，使用了多于一个隔件。在一些实施方案中，隔件的高度为约10μm、约12.5μm、约15μm、约17.5μm、约20μm、约22.5μm或约25μm。在一些实施方案中，每个隔件的高度为约50μm、约100μm、约200vm、约300μm、约400μm、约500μm、约600μm、约700μm、约800μm、约900μm或约1000μm。在一些实施方案中，隔件在生物样品(例如，组织样品或感兴趣区域)和/或阵列周围产生完全封闭的腔室。完全封闭的隔件可以是任何形状。在一些实施方案中，完全封闭(例如，包围)的隔件是正方形或矩形中的一种。在一些实施方案中，隔件与生物样品的形状相符。
在一些实施方案中，隔件部分地包围生物样品(例如，感兴趣的组织或区域)或阵列。在一些实施方案中，隔件在一侧、两侧或三侧围绕生物样品。在一些实施方案中，隔件部分地包围生物样品，包围大约至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的周围生物样品。
在一些实施方案中，在本文所公开的系统和/或方法中没有使用隔件。在一些实施方案中，隔件起到如本文所公开的垫圈的作用。
在本文所述的任何流体输送方法的一些实施方案中，包括虚拟垫圈在内的垫圈(例如，本文所述的任何垫圈，隔件)可以施加到生物样品中的感兴趣区域。在一些实施方案中，两个或更多个垫圈(包括两个或更多个虚拟垫圈)可以施加到生物样品中的2个、3个、4个或更多个感兴趣区域。在一些实施方案中，流体(例如，透化溶液)可以输送到2个、3个、4个或更多个感兴趣区域，其中包括虚拟垫圈在内的垫圈基本上包围生物样品中的感兴趣区域。
在一些实施方案中，第一基板、第二基板或两者可以包含通孔。如本领域普通技术人员所理解的，本文所用的“通孔”是基板中的开口(例如，孔、贯穿孔、透孔)。在一些实施方案中，通孔在第一基板中。在一些实施方案中，通孔在第二基板中。在一些实施方案中，基板(例如，第一基板、第二基板)包括两个或更多个通孔。
在一些实施方案中，流体被输送到垫圈的一个或多个孔，或者基板中的通孔。在一些实施方案中，流体通过毛细流动输送到一个或多个孔。在一些实施方案中，流体通过毛细流动输送到通孔。在一些实施方案中，输送流体(例如，输送到孔、通孔)包括使流体流过孔或通孔。在一些实施方案中，流体由注射器输送。在一些实施方案中，注射器与垫圈(例如，包括虚拟垫圈)的孔接合。在一些实施方案中，注射器与基板的通孔接合。在一些实施方案中，流体(例如，缓冲液、透化溶液)由注射器通过通孔输送。在一些实施方案中，输送流体(例如，输送到孔、通孔)包括通过孔(例如，或者连接到孔的储存器)或通孔注射流体。在本文所述的任何输送方法的一些实施方案中，与垫圈或通孔接合的注射器能够实现透化溶液的可再现性加载。例如，注射器可以实现流体(例如，透化溶液)的体积和注射速度的可再现性加载。
例如，图22A示出了示例性的流体输送方案。步骤1示出了包括生物样品(例如，样品902)的第一基板(例如，载片903)，以及第二基板(例如，载片904)上的阵列906(例如，空间阵列)。步骤2示出了将垫圈2210施加为基本上包围(例如，部分地围住)阵列906，然而，垫圈2210可以替代地或附加地被施加为基本上包围生物样品902。图22A所示的示例垫圈2210可以包括两个孔，但垫圈2210也可以包括零个、一个，或者两个或更多个孔。步骤3示出了用于产生部分密封或完全密封的腔室的示例性组件。步骤3还示出了使第一基板和第二基板接近，以形成夹层组件。在图22A中，步骤3示出第一基板和第二基板(例如，分别为载片903和载片904)以交叉构型对准，然而，第一基板和第二基板也能够以各种角度对准。例如，第一基板和第二基板还可以轴向对准(例如，在如本文所述的夹层组件中)。当第一基板(例如，载片903)、第二基板(例如，载片904)和垫圈2210被组装在一起(例如，以夹层组件、本文所述的任何构造)时，可以形成部分密封或完全密封的腔室，其中流体可以输送(例如，通过孔、通过通孔等)到该腔室的部分封闭的容积中。步骤4示出了经由毛细流动将流体(例如，透化溶液905)输送到垫圈的孔中。替代性地，在步骤4处，流体可以在低温(例如，约5℃至约25℃)下输送，然后加热，如图22B所示。步骤5(图22B)示出，对第一基板(例如，载片903)和/或第二基板(例如，载片904)构造加热可以促进生物样品902的透化速率。
图23示出了与图22A至图22B类似的示例性流体输送方案，但如步骤1所示，干燥的透化试剂可以设置在阵列906上。虽然未示出，但是干燥的透化试剂也可以设置在生物样品902上。类似于图22A，施加垫圈2210(步骤2)，然后将第一基板和第二基板(例如，分别为载片903和载片904)组装在一起(例如，夹层组件)(步骤3)。如步骤4所示，可以经由毛细作用输送流体(例如，缓冲液)以使干燥的透化试剂溶解。
图24示出了与图22A至图22B类似的示例性流体输送方案，但如步骤3所示，流体输送机构可以是与垫圈2210(例如，垫圈中的储存器)接合的注射器2415。在步骤4处，可以通过注射器2415将流体注射到孔中。
图25A示出了示例性流体输送方案，其中垫圈2210不包括孔并且设置在第一基板与第二基板(例如，分别为载片903和载片904)之间，其中第一基板和第二基板以交叉构型对准。类似于前面的附图，虽然图25A示出了交叉构型，但是第一基板和第二基板能够以任何角度对准，包括轴向对准(例如，夹层组件)。如图所示，包括生物样品的第一基板可以具有一个或多个通孔2515，其中可以输送(例如，通过毛细作用流过、通过注射器注射等)(图25A)或通过注射器2415注射(图25B)流体，包括透化溶液(例如，透化溶液905)。替代性地或除此之外，第二基板可以具有一个或多个通孔2515，其中可以如本文所述输送流体，包括透化溶液。
图26示出了示例性流体输送方案，包括使用虚拟垫圈(例如，如箭头所指示的疏水性涂层2615)。如步骤1所示，疏水性涂层2615可以被施加为围绕(例如，包围)阵列906，然而，疏水性涂层2615也可以被施加为围绕生物样品902，或两者兼而有之。疏水性涂层2615可以经由压模或绘制来施加，诸如用蜡笔或石蜡基蜡笔绘制来施加。如步骤2所示，可以经由毛细流动将流体(例如，透化溶液)装载到阵列906上。虽然未示出，但是可以经由注射器装载流体。替代性地，干燥的透化试剂可以设置在第一基板和/或第二基板上，然后可以被输送的流体溶解。当第一基板、第二基板和虚拟垫圈(例如，疏水性涂层2615)被组装在一起(例如，以夹层组件、本文所述的任何构造)时，可以形成部分密封的腔室，其中流体可以输送(例如，通过孔、通过通孔)到该腔室的部分封闭的容积中。
图27示出了结合疏水性涂层2615和垫圈2210的构造。如图27所示，垫圈可以包括孔2710。疏水性涂层2615可以施加到未被垫圈覆盖的基板上(例如，在孔2710中)，以保留输送的流体(例如，缓冲液、透化溶液905)。疏水性涂层2615可以在输送流体之前施加到孔(例如，一个或多个孔)。
在一些实施方案中，流体包括透化试剂(例如，本文所述的任何透化试剂)。在一些实施方案中，通过在各种温度下输送透化试剂(例如，包含透化试剂的流体)来调控生物样品的透化速率。例如，流体(例如，透化溶液、缓冲剂)可以在从约5℃至约80℃、从约10℃至约75℃、从约15°至约70℃、从约20℃至约65℃、从约25℃至约60℃、从约30℃至约55℃、从约35℃至约50℃以及从约40℃至约45℃的温度下输送。在一些实施方案中，透化溶液可以为约5℃、约6℃、约7°、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23°、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃，或约80℃。
在一些实施方案中，透化试剂是干燥的透化试剂。在一些实施方案中，将干燥的透化试剂设置在基板(例如，第一基板、第二基板)上。在一些实施方案中，输送流体(例如，通过本文所述流体输送方法中的任一种)使干燥的透化试剂溶解。在一些实施方案中，使透化试剂溶解导致生物样品透化。在一些实施方案中，经由垫圈中的孔输送流体以使干燥的试剂溶解。在一些实施方案中，穿过通孔输送流体以使干燥的试剂溶解。在一些实施方案中，用流体使干燥的试剂溶解包括使用注射器。在一些实施方案中，用流体使干燥的试剂溶解包括毛细流动。
在一些实施方案中，控制第一基板、第二基板或两者的温度调控了生物样品的透化。例如，第一基板、第二基板或两者可以设置在基板保持器(例如，本文所述的任何基板保持器)中。在一些实施方案中，加热第一基板、第二基板或两者包括加热透化溶液(例如，包含透化试剂的流体，溶解的干燥透化试剂)和调控生物样品的透化。例如，一旦系统已经平衡(例如，在流体输送之后)并且系统中不存在流动，就可以通过加热来启动透化。在一些实施方案中，冷却第一基板、第二基板或两者包括冷却透化溶液(例如，包含透化试剂的流体，溶解的干燥透化试剂)和调控生物样品的透化。
在一些实施方案中，控制第一基板、第二基板或两者的温度调控了生物样品的透化，包括加热到约25℃至约55℃、约30℃至约50℃、约35℃至约45℃，或约40℃。在一些实施方案中，控制第一基板、第二基板或两者的温度调控了生物样品的透化，包括加热到约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃。
在一些实施方案中，将生物样品透化一段时间。例如，生物样品可以透化约1分钟至约90分钟或两者间的任何时长、约5分钟至约85分钟、约10分钟至约80分钟、约15分钟至约75分钟、约20分钟至约70分钟、约25分钟至约65分钟、约30分钟至约60分钟、约35分钟至约55分钟、约40分钟至约50分钟，或者约45分钟。在一些实施方案中，生物样品在40℃下透化约30分钟。
在一些实施方案中，输送透化试剂包括以任何顺序依次输送去污剂(SDS、N-月桂酰肌氨酸、皂草苷、本文所述的任何其他去污剂，以及它们的组合)、酶(例如，蛋白酶K、胃蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶、核酸酶和本文所述的任何其他酶，以及它们的组合)和缓冲剂(例如，TE、TAE、TBE、PBS、本文所述的任何其他缓冲剂)。在一些实施方案中，输送透化试剂包括将去污剂、酶和缓冲剂作为混合物输送。在一些实施方案中，将透化试剂输送到部分密封的腔室两次或更多次。例如，可以将透化试剂输送不止一次，以充分透化生物样品。例如，可以不止一次输送透化试剂以透化生物样品中的感兴趣区域(例如，在两个或更多个感兴趣区域处)。
在一些实施方案中，向透化试剂中添加染料可以有助于检测填充质量并且显现流体中存在的任何气泡。例如，染料在特定波长下可能是不透明的，并且可以与明场光结合使用并在该特定波长下成像，以检测夹持期间的填充质量和任何气泡。
在一些实施方案中，对生物样品成像。在一些实施方案中，生物样品先在第一基板上成像，之后与第二基板对准。在一些实施方案中，生物样品是组织切片。在一些实施方案中，生物样品是新鲜冷冻的生物样品。在一些实施方案中，新鲜冷冻的生物样品是新鲜冷冻的组织切片。在一些实施方案中，生物样品是固定的生物样品。在一些实施方案中，固定的生物样品是福尔马林固定石蜡包埋的生物样品。
在一些实施方案中，阵列包括多个特征。在一些实施方案中，阵列包括约5,000个特征。在一些实施方案中，多个特征中的一个特征是珠粒。在一些实施方案中，多个捕获探针附接到珠粒。在一些实施方案中，捕获探针包括(i)捕获结构域；以及(ii)专属于该特征的空间条形码。在一些实施方案中，捕获探针的捕获结构域包括聚(T)序列。在一些实施方案中，捕获探针包括一个或多个功能结构域、裂解结构域、独特分子标识符，以及它们的组合。
V.成角度闭合
在一些情况下，通过将第一基板和第二基板布置在如本文所述的成角度夹层组件中来实现接触。例如，在夹持两个载片(例如，病理载片903和载片904)期间，可能可以提供这些载片的成角度闭合以抑制或消除气泡形成。
图17A至图17E描绘了根据一些示例实施方式的成角度夹层组件的示例工作流程1700。如图17A所示，载片1712(例如，载片904、第二基板1012、第二基板1212等)可以定位和放置在基座1704上，载片1712的一侧由弹簧1715支撑。弹簧1715可以从基座1704在上方向上延伸，并且可以被构造成沿与基座1704成不同角度的平面设置载片1712。载片1712的角度可以使得放置在载片1712的表面上的液滴(例如，液滴1705)不会从该表面掉落(例如，由于重力)。该角度可以基于重力与用于使液滴移动远离和移动离开载片1712的任何表面力的关系来确定。基座1704可以包括图12A的第二构件1210的保持器板等。
图17B描绘了放置在载片1712上的液体试剂(例如，透化溶液905)的液滴1705。如图所示，液滴1705位于载片1712接触弹簧1715的一侧，并且位于弹簧1715附近和该弹簧之上(例如，上方)。
如图17C所示，第二载片1706(例如，载片904、第一基板1006、第一基板1206等)可以定位在载片1712之上(上方)，并且以与基座1704基本上平行的角度定位。例如，样品处理设备(例如，样品处理设备1000、样品处理设备1200等)的第一构件(例如，第一构件1004、第一构件1204等)可以被构造成以基本上平行于基座1704的角度保持载片1706。
如图17D所示，可以使载片1706与载片1712接触，使得载片1706的下降侧首先接触液滴1705。在一些方面，载片1706的下降侧可以将液滴1705推向载片1706的相对侧。在一些方面，载片1706可以朝向载片1712下降，以实现载片1706的下降侧与液滴1705接触。在一些方面，载片1712可以朝向载片1706向上移动，以实现载片1706的下降侧与液滴1705接触。
图17E描绘了载片1706与载片1712已实现完全夹层闭合，其中液滴1705定位在两个侧面之间。在一些方面并且如图所示，当载片1706下降到液滴1705上并朝向载片1712移动时(或者随着载片1712朝向载片1706抬起时)，弹簧1715可以压缩，载片1712可以下降到基座1704并且变得与载片1706基本上平行。
图18A是根据一些示例实施方式的成角度闭合工作流程1700的侧视图。图18B是根据一些示例实施方式的成角度闭合工作流程1700的顶视图。如步骤1805所示并且根据图17C至图17D，液滴1705定位在载片1712接触弹簧1715的一侧。
在步骤1810处，成角度载片1706的下降侧首先接触液滴1705。载片1706与液滴1705的接触可以形成线性或低曲率的流动前沿，其随着载片闭合而均匀地填充。
在步骤1815处，载片1706朝向载片1712进一步下降(或者载片1712朝向载片1706抬起)，载片1706的下降侧可以接触液体试剂并且可以将液体试剂推向与下降侧相对的一侧，从而产生可以防止或减少载片之间的气泡截留的线性或低曲率流动前沿。如进一步所示，随着载片1706下降，弹簧1715可以开始压缩。
在步骤1820处，液体试剂的液滴1705填充载片1706与载片1712之间的间隙(例如，间隙907)。液体试剂的线性流动前沿可以通过沿着载片1712和/或载片1706的接触侧挤压液滴1705体积来形成。此外，毛细流动也可以有助于填充间隙区。如步骤1820中进一步所示，弹簧1715可以被完全压缩，使得载片1706、载片1712和基座1704可以基本上彼此平行。
在一些方面，图17至图18的成角度闭合可以使用多种硬件部件来实现。例如，图19A描绘了根据一些示例实施方式的样品处理设备1000，该样品处理设备包括联接到第一构件1004的铰链1915和滑槽1916。铰链1915和/或滑槽1916可以被构造成将第一构件1004和/或第一基板1006相对于第二构件1010和/或第二基板1012成一定角度定位。该角度可以小到0度。
图19B描绘了根据一些示例实施方式的处于开启构型的样品处理设备1200，其中第一基板1206联接到第一构件1204并且第二构件1210保持第二基板1212。在一些方面，经由铰链1915将第一构件1204闭合在第二构件1210之上可以提供本文至少在图17至图18和相应的说明中所描述的成角度闭合。
图20A至图20E示出了根据一些示例实施方式的成角度夹层组件的示例工作流程2000。如图20A所示，基座1704能够以一定角度倾斜定位。载片1712能够以相同或基本上相同的角度平放在基座1704上。可以确定该角度，使得放置在载片1712的表面上的液滴(例如，液滴1705)不会从该表面掉落(例如，由于重力)。该角度可以由重力与用于使液滴移动远离和移动离开载片1712的任何表面力的关系来确定。
图20B描绘了当载片1706和载片1712朝向彼此移动并且载片1706接触液滴1705时，载片1706和载片1712被夹持在一起。在一些方面，在夹持期间，载片1706和载片1712可以平行或相对于彼此成一定角度。在一些实施方案中，载片的角度可以经由样品处理设备(例如，样品处理设备1000、样品处理设备1200等)来实现。
图20C描绘了在夹持载片1706和载片1712期间，在液滴1705内截留的一个或多个气泡2015。
如图20D所示，一个或多个气泡2015可以比液体试剂液滴1705的密度小，因而一个或多个气泡2015可以由于浮力而在上方向上朝上迁移。在一些方面，由于一个或多个气泡2015可以到达顶部(例如，液滴1705的最上部分)，所以这些气泡可以从液滴1705释放或者以其他方式从该液滴去除。
图20E描绘了基座1704、载片1706和载片1712沿轴线变直，一个或多个气泡2015已从液滴1705去除或者已从载片1706和载片1712之间的感兴趣区域去除。
在一些方面，图17至图18和图20的成角度闭合可以响应于检测到液滴1705内的气泡(例如，气泡2015)而发生。除此之外或替代性地，本文所述的成角度闭合可以在每次夹持载片(例如，载片1706和载片1712)期间发生。传感器可以被配置为响应于载片(例如，载片1706)或组织样品(例如，组织样品902)与液滴1705的至少一部分接触来检测液体试剂液滴1705中的气泡。
在一些实施方案中，向透化试剂中添加染料可以有助于检测填充质量并且显现流体中存在的任何气泡。例如，染料在特定波长下可能是不透明的，并且可以与明场光结合使用并在该特定波长下成像，以检测夹持期间的填充质量和任何气泡。
图21A至图21C描绘了根据一些示例实施方式的用于夹持具有组织样品902的第一基板(例如，病理载片903)和第二基板(例如，具有捕获探针906的载片904)的成角度闭合工作流程2100的侧视图和顶视图。
图21A描绘了第一基板(例如，包括样品902的病理载片903)在第二基板(例如，载片904)之上(上方)成角度。如图所示，透化溶液905的液滴位于隔件1310上方，朝向图21A中侧视图的右侧部分。
图21B示出了当第一基板下降时，或者当第二基板上升时，第一基板的下降侧(例如，载片903低于相对侧成角度的一侧)可以接触透化溶液905的液滴。第一基板的下降侧可以将透化溶液905推向相反的方向。例如，在图21B的侧视图中，当夹层构造形成时，透化溶液905可以从右向左推进。
图21C描绘了第一基板与第二基板之间的夹层构造已完全闭合，其中隔件1310与第一基板和第二基板两者接触，并且维持这两者之间的分隔距离。如图21B至图21C的顶视图所示，隔件1310完全封闭和包围组织样品902和捕获探针906，并且隔件1310形成了保持一定体积透化溶液905的腔室1350的侧面。在一些方面，超过腔室1350容积的过量透化溶液905可以分散到腔室1350外部。
在一些方面，图21A至图21C中所示的组织样品902与捕获探针906的对准可以通过样品处理设备(例如，样品处理设备1000、样品处理设备1200等)的对准机构来执行。
在一些方面，成角度闭合(例如，图17至图18和图20的成角度闭合)可以与本文所述的任何流体输送方法结合。
套件
本文还提供了套件，其包括：第一基板，该第一基板包括用于粘附生物样品的涂层(例如，本文所述的任何涂层)；第二基板，该第二基板包括阵列；以及隔件。在一些套件中，隔件设置在第一基板和/或第二基板上。在一些套件中，隔件至少部分地围绕生物样品和/或阵列。在一些套件中，隔件可以设置在第一基板与第二基板之间，并且被构造成将流体维持在包括第一基板、第二基板、生物样品和隔件的腔室内。隔件可以进一步被构造成维持第一基板与第二基板之间的分隔距离。在一些套件中，该套件包括石蜡蜡笔。在一些套件中，该套件包括疏水性涂层压模。在一些套件中，该套件包括逆转录酶和核酸酶。
在一些套件中，该套件包括其中包括阵列的第二基板。第二基板还包括围绕阵列的隔件。在一些套件中，该套件包括其中包括生物样品的第一基板。第一基板还包括围绕生物样品的隔件。在一些套件中，该套件包括被构造成设置在第一基板与第二基板之间的隔件。该套件还包括第一基板和/或第二基板。
该套件还可以包括用于组装包括第一基板、第二基板、隔件、生物样品和阵列的腔室的说明。该套件还可以包括用于在样品保持器中对准第一基板和/或第二基板的说明。该套件还可以包括用于执行本文所述任何方法的说明。
VI.附加的样品和阵列对准装置和方法
本公开进一步描述了用于保持或支撑基板的装置。特别地，所描述的装置包括分别接收第一基板和第二基板的第一构件和第二构件。在一些实施方案中，本公开的装置可以用于将第一基板和第二基板夹持在一起，用于空间转录组学应用。在一些实施方案中，第一基板可以在其表面上支撑样品(例如，生物基板)。在一些实施方案中，第二基板可以包括多个加条形码的探针和/或多种透化试剂。
所描述的用于保持或支撑基板的装置还包括对准机构，该对准机构连接到前述构件中的至少一者，并且将第一构件和第二构件对准。因此，本公开的装置可以有利地对准(例如，沿XY轴)第一基板和第二基板，以及可能位于第一基板和第二基板的表面上的任何样品、加条形码的探针或透化试剂。也就是说，本公开的装置可以通过使第一基板和第二基板以对准的方式彼此接触来促进对样品(例如，生物样品)的分析。
在一些情况下，提供样品保持器。在一些情况下，样品保持器包括第一构件，该第一构件包括保持具有样品的基板的第一保持机构。在一些情况下，样品保持器还包括第二构件，该第二构件包括保持具有特征阵列的第二基板的第二保持机构。对准机构连接到第一构件和第二构件中的至少一者，或者连接到第一构件和第二构件两者。在对准和接触过程中，对准机构用于将第一构件和第二构件对准，从而确保样品和特征阵列也对准并发生接触，以促进对样品的分析。
在一些实施方案中，对准机构可以实现为连接到第一构件和第二构件的旋转致动器。这种旋转致动器的一个实例是铰链。在一些情况下，一旦安装在基板上的样品被定位在第一构件中，并且安装在基板上的特征阵列被定位在第二构件中，这些构件之一围绕铰链轴的旋转便使构件对准，而且还使样品和特征阵列对准。这些构件可以围绕铰链轴旋转，直到样品和特征阵列对准并发生接触。在一些情况下，旋转致动器被实现为折叠构件。折叠构件可以由多种材料形成，包括柔顺材料(诸如橡胶和乙烯树脂)、金属和金属合金，以及塑料。
在某些实施方案中，旋转致动器可以包括至少一个臂。在一些情况下，旋转致动器可以包括多个臂(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个，或者甚至更多个)。在一些情况下，样品保持器被实现为一体式(即单件式)装置。在一些情况下，样品保持器也可以被实现为两件式装置，其中第一构件和第二构件是分开的，但是也能够经由对准机构可再现地连接。当第一构件和第二构件接近时，连接器与接收器接合，从而将第一构件和第二构件对准，而且还将样品与特征阵列对准。应当指出的是，虽然连接器定位在第二构件上，而接收器定位在第一构件上，但是反过来也可以是正确的。此外，第一构件和第二构件各自可以包括隔件1310、具有一个或多个连接器，并且具有一个或多个接收器。
第一保持机构能够以各种方式实现。在一些实施方案中，第一保持机构可以对应于尺寸被确定成接收第一基板的凹陷部。另外，垫圈可以任选地定位在凹陷部内，以维持凹陷部的边缘与第一基板之间的干涉配合。在某些实施方案中，第一保持机构可以对应于一个或多个构件，该一个或多个构件被定位成向第一基板施加力，特别是用于维持第一基板与第一构件之间的接触。此类构件的实例包括但不限于夹子、螺钉和其他螺纹保持紧固件，以及与第一构件按扣紧固或以其他方式接合的构件。这些构件可以向第一基板的样品承载表面和/或第一基板的一个或多个侧面施加力。
一般来讲，第二保持机构可以对应于上文结合第一保持机构论述的任何不同类型的保持机构。第一保持机构和第二保持机构可以是不同的或相同的。
在一些实施方案中，第一构件包括第一孔。例如，第一孔可以被定位成使得当第一基板被保持在第一构件中时，第一孔与第一基板上的样品区域(例如，样品通常位于其中的区域，或者被指定用于放置样品的区域)对准。孔可以被定位成使得样品可以通过第一孔从第一构件的底面(即，与支撑第一基板的表面相对的表面)观察，并且样品的一个或多个图像可以通过第一孔获得。
如上所述，试剂介质可以定位在第一基板或第二基板上。然而，更一般地，第一基板或第二基板还可以包括放置在其上的试剂介质。在某些实施方案中，试剂介质包括透化试剂(例如，固体、液体、凝胶或干燥的透化试剂)。在一些实施方案中，试剂介质包括一种或多种附加组分。例如，附加组分可以包括具有嵌入的透化试剂的水凝胶化合物或水凝胶层。
在一些实施方案中，第二构件包括至少一个孔。更一般地，第二构件可以包括一个或多个(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个，或者甚至更多个)第二孔。在某些实施方案中，当第一构件和第二构件对准时，第二孔与基板上的样品区域的至少一部分对准。第二孔可以用于各种目的。在一些实施方案中，例如，特征阵列和/或样品可以通过第二孔观察或成像。例如，观察/成像可以用于调节特征阵列和样品的相对位置，以改善对准。
在某些实施方案中，第二孔的一个或多个边界表面和第二基板的后表面(即，第二基板的与第二基板面向样品并支撑特征阵列的表面相对的表面)协作形成试剂孔。添加到试剂孔中的试剂溶液(例如，包括透化试剂)由第二孔的边界表面容纳。如果第二基板由可渗透或半渗透材料形成，则试剂溶液可以渗透(例如，通过扩散)通过第二基板的底面并接触样品。
在一些实施方案中，样品保持器包括连接到第一构件的第一调节机构。第一调节机构在平行于支撑样品的第一基板表面的至少一个方向上平移第一基板。在一些实施方案中，第一调节机构在平行于该第一基板表面的两个方向上平移第一基板。
第一调节机构能够以各种方式实现。在一些实施方案中，例如，第一调节机构包括一个或多个指旋螺钉或线性致动器，其可以用于平移第一基板。
除了将第一构件和第二构件对准之外，对准机构还被构造成当第一基板和第二基板(以及第一构件和第二构件)对准时，维持这些基板(和这些构件)之间的分隔距离。例如，可以维持该分隔距离，使得样品的至少一部分接触试剂介质(例如，试剂介质的特征阵列)。
在某些实施方案中，对准机构在第一基板和第二基板(以及第一构件和第二构件)对准时，使第一基板和第二基板维持近似平行的关系。在此类情况下，第一基板与第二基板之间的夹角可以为2度或更小(例如，1度或更小、0.5度或更小、0.25度或更小)。
在一些实施方案中，样品保持器可以包括一个或多个间隔构件，这些间隔构件有助于维持第一基板和第二基板的间距和/或近似平行的布置。间隔构件可以连接到第一构件和第二构件中的任一者或两者。
在某些实施方案中，样品保持器包括第二调节机构。第二调节机构调节第一基板与第二基板之间的分隔距离(即，在与支撑样品的第一基板表面正交的方向上)。在某些实施方案中，调节机构连接到两个构件。
第二调节机构能够以各种方式实现。在一些实施方案中，第二调节机构包括一个或多个指旋螺钉或者可调节的销或柱。在某些实施方案中，第二调节机构包括一个或多个线性致动器。在一些实施方案中，第二调节机构包括定位在第一构件与第二构件之间的可膨胀或可扩张的膜、垫圈或层。
作为分析工作流程中的后续步骤，在样品和特征阵列已经与样品保持器发生接触之后，可以将样品保持器引入热循环仪中，以促进通过特征阵列从样品中捕获分析物。为此，可以将样品保持器直接插入合适的热循环仪中。替代性地，在一些实施方案中，样品保持器可以联接到热循环仪适配器，并且联接的保持器和适配器插入热循环仪中。例如，2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839，575中描述了与样品保持器一起使用的合适的热循环仪适配器，该美国临时专利申请的全部内容以引用方式并入本文。
样品保持器与用于使样品与透化试剂接触以促进分析物捕获的多种不同方案相容。在一些实施方案中，将透化试剂溶液直接沉积在第二基板上(例如，形成包括透化试剂和特征阵列的试剂介质)，并且/或者直接沉积在第一基板上，然后使样品与特征阵列接触。
在某些实施方案中，先将干燥的透化试剂施加或形成为第一基板或第二基板或两者上的层，之后再使其与样品和特征阵列接触。例如，试剂能够以溶液的形式沉积在第一基板或第二基板或两者上，然后干燥。干燥方法包括但不限于旋涂试剂的稀溶液，然后蒸发包含在试剂中的溶剂或试剂本身。替代性地，在其他实施方案中，可以将试剂以干燥形式直接施加到第一基板或第二基板或两者上。在一些实施方案中，涂覆过程可以在分析工作流程之前完成，并且第一基板和第二基板可以预先涂覆后储存起来。替代性地，涂覆过程可以作为分析工作流程的一部分进行。在一些实施方案中，试剂是透化试剂。在一些实施方案中，试剂是透化酶、缓冲液、去污剂，或它们的任何组合。在一些实施方案中，透化酶是胃蛋白酶。在一些实施方案中，试剂是干燥的试剂(例如，不含水分或液体的试剂)。
提供了本文所公开的示例性空间分析工作流程。在一些情况下，该方法包括提供包括生物样品的第一基板和包括多个捕获探针的第二基板。在一些情况下，多个捕获探针包括寡核苷酸探针。在一些情况下，多个捕获探针包括分析物捕获剂，该分析物捕获剂可以检测如本文所述的感兴趣分析物(例如，蛋白质)。这些方法可以按照本领域技术人员确定的顺序来执行。例如，作为示例性概述，第一基板包括生物样品。然后使用本文所述的任何方法对生物样品进行染色。在一些情况下，对生物样品成像，捕获在染色步骤期间产生的染色图案。在一些情况下，然后将生物样品脱色。在脱色后，在一些情况下，将如本文所述包括捕获探针的第二基板添加到第一基板。在一些情况下，使用本文所公开的方法(例如，包含蛋白酶K和SDS的溶液)将生物样品透化。透化将分析物从生物样品中释放出来。然后，分析物从第一基板迁移，并被第二基板捕获。在一些情况下，在捕获后，可以将分析物和/或探针扩增，并且可以使用本文所公开的方法来测定序列。
在空间转录组学测定中将生物样品与加条形码的区比对的当前方法包括用户小心地将生物样品放置到包括多个加条形码的探针的基板上。因此，在一些实施方案中，所描述的装置的优点是为用户提供了用于将样品与加条形码的区对准的对准工具。本公开的装置可以减少测定分析期间的用户错误，从而也降低了样品分析成本。在一些实施方案中，本公开的装置的另一个优点是减少了像差或成像缺陷的数量，这些像差或成像缺陷可能是由于用户在将生物样品与基板的加条形码的区对准时的错误而引起的。在一些实施方案中，本公开的装置允许对样品的感兴趣区进行预筛选。在一些实施方案中，本公开的装置允许检查存档的样品。
在一些情况下，第一基板上的生物样品被染色。可以使用已知的染色技术对样品进行染色，包括Can-Grunwald染色技术、吉姆萨染色技术、苏木精和伊红(H&E)染色技术、苏木精染色技术、哲纳尔氏染色技术、利什曼染色技术、马森三色染色技术、柏氏染色技术、罗氏染色技术、银染色技术、苏丹染色技术、瑞氏染色技术和/或过碘酸希夫(PAS)染色技术。PAS染色通常在福尔马林或丙酮固定后进行。在一些实施方案中，生物样品可以使用如本文别处所述的可检测标签(例如，放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料)来染色。在一些实施方案中，仅使用一种类型的染色剂或一种技术对生物样品进行染色。在一些实施方案中，染色包括生物染色技术，诸如H&E染色。在一些实施方案中，染色包括使用苏木精的生物染色。在一些实施方案中，染色包括使用荧光缀合抗体来识别分析物。在一些实施方案中，使用两种或更多种不同类型的染色剂或者两种或更多种不同的染色技术对生物样品进行染色。例如，可以通过以下方式来制备生物样品：使用一种技术(例如，H&E染色和明场成像)进行染色和成像，之后使用另一种技术(例如，IHC/IF染色和荧光显微术)对同一生物样品进行染色和成像。在一些情况下，第一基板上的生物样品被染色。
在一些情况下，这些方法包括对生物样品成像。在一些情况下，成像发生在夹层组装之前。在一些情况下，成像发生在夹层构造组装时。在一些情况下，成像发生在透化生物样品期间。在一些情况下，使用高分辨率技术(例如，具有300点/平方英寸(dpi)或更大的分辨率)来捕获图像。例如，可以使用明场成像(例如，在苏木精或H&E染色的环境中)或使用荧光显微术来捕获图像，以检测粘附的标签。在一些情况下，使用例如共聚焦显微镜在时间上捕获高分辨率图像。在一些情况下，捕获低分辨率图像。低分辨率图像(例如，约72dpi并且通常具有RGB颜色设置的图像)可以在工作流程的任何点捕获，该任何点包括但不限于分析物的染色、脱色、透化、夹层组装和迁移。在一些情况下，在生物样品透化期间拍摄低分辨率图像。在一些情况下，低分辨率包括任选步骤：对生物样品成像。包括用于在夹层组装之前成像的实施方案，以及在样品处于夹层组件中时(例如，在透化期间)成像的实施方案。包括高分辨率成像的实施方案(在优选的实施方案中，这发生在组装夹层构造之前)和低分辨率成像的实施方案(在优选的实施方案中，这发生在样品处于夹层组件中时)。
在一些实施方案中，一种或多种分析物在生物样品中的位置通过免疫荧光来确定。在一些实施方案中，一种或多种可检测标签(例如，荧光团标记的抗体)结合到由第一载片上的探针捕获(与该探针杂交)的一种或多种分析物，并且一种或多种分析物的位置通过在合适的条件下检测这些标签来确定。在一些实施方案中，一种或多种荧光团标记的抗体用于缀合至与第一载片上的探针缔合的部分或与第一载片上的探针杂交的分析物。在一些情况下，当荧光团被合适波长的光激发时，通过对荧光团标记的抗体成像来确定一种或多种分析物的位置。在一些实施方案中，通过将免疫荧光数据与生物样品的图像相关联来确定生物样品中一种或多种分析物的位置。在一些情况下，在透化步骤的整个过程中对组织进行成像。
在某些情况下，可以将生物样品脱色。在一些情况下，脱色发生在透化生物样品之前。使生物样品脱色或褪色的方法是本领域已知的，并且通常取决于施加到样品上的染色剂的性质。例如，H&E染色可以通过在HCl中洗涤样品来脱色。在一些情况下，苏木精通过在HCl中洗涤样品来脱色。在一些实施方案中，脱色可以包括在HCl中洗涤1次、2次、3次或更多次。在一些实施方案中，脱色可以包括向下游溶液(例如，透化溶液)中添加HCl。
在一些情况下，包括样品(例如，组织学组织切片)的基板是水合的。可以通过使样品与不包括透化试剂的缓冲液接触来将样品水合。在一些实施方案中，缓冲液包括盐酸。在一些实施方案中，缓冲液是溶剂。在一些实施方案中，缓冲液是不含任何透化试剂的透化缓冲液。
在一些情况下，可以用干燥的透化试剂来涂覆这些基板中的一者或两者。如上文所提到的，可以将透化试剂以溶液形式沉积在基板上，然后干燥。替代性地，在其他实施方案中，可以将透化试剂以干燥形式直接施加到第一基板上。在一些实施方案中，干燥的透化试剂至少覆盖基板上包括特征阵列的表面区。在一些实施方案中，干燥的透化试剂在基板上覆盖的表面区大于包括特征阵列的表面区。在一些实施方案中，干燥的透化试剂是干燥的胃蛋白酶。在一些实施方案中，干燥的透化试剂是干燥的透化酶、干燥的缓冲液、干燥的去污剂，或它们的任何组合。在一些实施方案中，干燥的去污剂是干燥的辛基苯酚乙氧基化物。
在一些情况下，生物样品可以通过将样品暴露于一种或多种透化剂而被透化。在一些情况下，透化发生在生物样品脱色之后。在一些情况下，透化发生在夹层构造组装之前。在一些情况下，透化发生在夹层构造组装时。用于该目的合适试剂包括但不限于有机溶剂(例如，丙酮、乙醇和甲醇)、交联剂(例如，多聚甲醛)、去污剂(例如，皂草苷、TritonX-100TM、Tween-20TM或十二烷基硫酸钠(SDS))和酶(例如，胰蛋白酶、蛋白酶(例如蛋白酶K))。在一些情况下，透化剂包括蛋白酶K和SDS。
在一些情况下，透化发生约1分钟。在一些情况下，透化发生约5分钟。在一些情况下，透化发生约1分钟、约5分钟、约10分钟、约12分钟、约15分钟、约18分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约36分钟、约45分钟或约1小时。在一些情况下，本文所公开的方法包括向生物样品中添加包括蛋白酶K和SDS的透化剂，添加过程历时1分钟。在一些情况下，本文所公开的方法包括向生物样品中添加包括蛋白酶K和SDS的透化剂，添加过程历时5分钟。
在一些实施方案中，在生物样品透化之后，分析物发生迁移。在一些情况下，分析物从生物样品到第二基板的迁移是被动的(例如，经由扩散)。替代性地，在某些实施方案中，分析物从生物样品的迁移是主动进行的(例如，通过电泳，即通过施加电场来促进迁移)。在一些情况下，第一基板和第二基板可以包含导电环氧树脂。来自电源的电线可以连接到导电环氧树脂，从而允许用户施加电流并且在第一基板与第二基板之间产生电场。在一些实施方案中，与在不施加电场的情况下(例如，经由两个基板的手动对准)随机扩散到匹配基板上相比，电泳透化导致更高的分析物捕获效率和所捕获分析物(例如，在特征阵列上)更好的空间保真度。
在本文所公开方法的任何一些方法之间，这些方法可以包括洗涤步骤(例如，用SSC洗涤(例如，0.1x SSC))。洗涤步骤可以进行一次或多次(例如，1次、2次、3次，在本文所公开的步骤之间)。在一些情况下，洗涤步骤进行约10秒、约15秒、约20秒、约30秒或约1分钟。在一些情况下，共洗涤三次，每次20秒。在一些情况下，洗涤步骤发生在样品染色之前、样品脱色之后、样品透化之前、样品透化之后，或前述时间的任何组合。
在一些实施方案中，在样品与透化剂的初始接触之后，透化剂可以从与样品的接触中移除(例如，通过开启样品保持器)一段时间，该时间短于样品完全透化所需的时间。实际上，只有一部分样品被透化，并且样品中只有一部分分析物可以被特征阵列捕获。
在一些情况下，第一基板和第二基板布置在夹层组件中，例如，如本文所述。需注意，术语“第一基板”和“第二基板”不一定意味着生物样品或捕获探针的特定顺序或位置。例如，在一种情况下，第一基板包括生物样品，第二基板包括捕获探针。在另一种情况下，第一基板包括捕获探针，第二基板包括生物样品。在一些实施方案中，当样品与透化缓冲液接触时，组织透化过程开始。在透化过程期间，分析物从样品中释放出来。在一些实施方案中，从透化样品中释放的分析物扩散到第二基板的表面，然后被捕获在特征阵列上(例如，在加条形码的探针上)。在一些情况下，第一基板与第二基板之间存在间隙。在一些情况下，间隙为约1μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm或更大。在一些实施方案中，第二基板被放置成与第一基板上的样品直接接触，从而确保没有扩散空间分辨率损失。在一些实施方案中，对准机构被构造成当第一基板和第二基板对准时维持第一基板与第二基板之间的分隔距离。在一些实施方案中，对准机构被构造成维持该分隔距离，使得第一基板上的至少一部分样品接触第二基板上的至少一部分试剂介质。在一些实施方案中，第一基板与第二基板之间的分隔距离介于2微米与1毫米之间，该分隔距离是在与第一基板支撑样品的表面正交的方向上测量的。在一些情况下，将第一基板和第二基板分离(例如，拉开)。在一些实施方案中，在第一基板和第二基板分离之后，可以在第一基板上进行样品分析(例如，cDNA合成)。在一些实施方案中，在第一基板和第二基板分离之后，包括生物样品的基板可以丢弃或存档。
在一些情况下，被捕获并可用于检测的分析物的量的减少可以由样品不完全透化所引起的侧向扩散的减少来抵消。一般来讲，测定的空间分辨率由分析物在横向方向(即，与样品表面的法线方向正交)上的扩散程度决定。第一基板上的样品与第二基板上的特征阵列之间的距离越大，横向方向上的扩散程度就越大，并伴随分辨率损失。从最靠近特征阵列的一部分样品释放的分析物具有较短的扩散路径，因此不会像来自离特征阵列最远的样品部分的分析物那样在侧向上扩散得那么远。因此，在一些情况下，样品的不完全透化(通过减小透化剂与样品之间的接触间隔)可以用于在测定中维持足够大的空间分辨率。
在一些情况下，分析工作流程可以在几个方面与上文论述的示例分析工作流程基本上相似，但是可以包括在整个分析过程中控制第一基板和第二基板的温度而不是不控制温度的替代性方法。在一些实施方案中，第一构件和第二构件的温度被降低到低于室温(例如，25℃)的第一温度(例如，20℃或更低、15℃或更低、10℃或更低、5℃或更低、4℃或更低、3℃或更低、2℃或更低、1℃或更低、0℃或更低、-1℃或更低、-5℃或更低)。在一些实施方案中，样品保持器包括温度控制系统(例如，加热和冷却导电线圈)，该温度控制系统使得用户能够控制样品保持器的温度。替代性地，在其他实施方案中，样品保持器的温度在外部进行控制(例如，经由制冷或热板)。在第一步中，设定到或设定在第一温度的第二构件接触第一基板，并且设定到或设定在第一温度的第一构件接触第二基板，从而将第一基板和第二基板的温度降低到第二温度。在一些实施方案中，第二温度等于第一温度。在一些实施方案中，第一温度低于室温(例如，25℃)。在一些实施方案中，第二温度在从约-10℃至约4℃的范围内。在一些实施方案中，第二温度低于室温(例如，25℃)(例如，20℃或更低、15℃或更低、10℃或更低、5℃或更低、4℃或更低、3℃或更低、2℃或更低、1℃或更低、0℃或更低、-1℃或更低、-5℃或更低)。
包括特征阵列的第一基板与干燥的透化试剂接触。在一些实施方案中，第一基板与为凝胶或液体的透化试剂接触。同样在第一步中，样品与缓冲液接触。第一基板和第二基板都被置于较低的温度下，以减缓扩散和透化效率。替代性地，在一些实施方案中，样品可以直接与液体透化试剂接触，而不会由于基板处于第二温度而引起不希望的透化启动。在一些实施方案中，低温减缓或阻止透化启动。
在第二步中，将样品保持器和基板保持在低温下(例如，在第一温度或第二温度下)继续减缓或防止样品透化。在第三步中，加热样品保持器(因此加热第一基板和第二基板)以引发透化。在一些实施方案中，样品保持器被加热到第三温度。在一些实施方案中，第三温度高于室温(例如，25℃)(例如，30℃或更高、35℃或更高、40℃或更高、50℃或更高、60℃或更高)。在一些实施方案中，从样品的透化组织中释放的分析物扩散到第一基板的表面，然后被捕获在第二基板的特征阵列(例如，加条形码的探针)上。在第四步中，将第一基板和第二基板分离(例如，拉开)，停止温度控制。
在一些实施方案中，在第一基板或第二基板(或两者)包括孔的情况下，可以将透化溶液引入一些或所有孔中，然后可以通过闭合样品保持器使样品和特征阵列接触，以将样品透化。在某些实施方案中，可以将透化溶液浸泡到直接施加于样品的水凝胶膜中，并且/或者浸泡到形成特征阵列的特征(例如，珠粒)中。当通过闭合样品保持器使样品与特征阵列接触时，透化溶液促进分析物从样品迁移到特征阵列。
在某些实施方案中，不同的透化剂或不同浓度的透化剂可以输注到阵列特征(例如，珠粒)中或如上所述的水凝胶层中。通过局部改变透化试剂的性质，可以在空间上调节从样品捕获分析物的过程。
第一基板和第二基板可以包含导电环氧树脂。来自电源的电线可以连接到导电环氧树脂，从而允许用户施加电流并且在第一基板与第二基板之间产生电场。在一些实施方案中，与在不施加电场的情况下(例如，经由两个基板的手动对准)随机扩散到匹配基板上相比，电泳透化导致更高的分析物捕获效率和所捕获分析物(例如，在特征阵列上)更好的空间保真度。
当分析物从样品迁移到特征阵列时，可能发生空间分辨率损失，并且扩散迁移的分量发生在横向(例如，侧向)方向上，大致平行于在其上安装样品的第一基板表面。为了解决这种分辨率损失，在一些实施方案中，可以将沉积在具有各向异性扩散的材料上或者输注到该材料中的透化剂施加到样品或特征阵列。第一基板和第二基板通过样品保持器对准并发生接触。包括输注到各向异性材料中的透化溶液的透化层定位在第二基板上。
在一些实施方案中，特征阵列可以构建在输注有透化剂的水凝胶层顶上。水凝胶层可以安装在第二基板上，或者替代性地，水凝胶层本身可以用作第二基板。当第一基板和第二基板对准时，透化剂从水凝胶层中扩散出来，穿过或围绕特征阵列到达样品。来自样品的分析物迁移到特征阵列。特征阵列与样品之间的直接接触有助于减少分析物的侧向扩散，从而减轻如果分析物的扩散路径较长时将会发生的空间分辨率损失。
在一些实施方案中，在样品与透化剂的初始接触之后，一段时间后透化剂可以从与样品的接触中移除(例如，通过开启样品保持器)，该时间短于样品完全透化所需的时间。实际上，只有一部分样品被透化，并且样品中只有一部分分析物可以被特征阵列捕获。
然而，被捕获并可用于检测的分析物的量的减少可以由样品不完全透化所引起的侧向扩散的减少来抵消。一般来讲，测定的空间分辨率由分析物在横向方向(即，与样品表面的法线方向正交)上的扩散程度决定。样品与特征阵列之间的距离越大，横向方向上的扩散程度就越大，并伴随分辨率损失。仅从最靠近特征阵列的样品上部释放的分析物具有较短的扩散路径，因此不会像来自离特征阵列最远的样品部分的分析物那样在侧向上扩散得那么远。因此，样品的不完全透化(通过减小透化剂与样品之间的接触间隔)可以用于在测定中维持足够大的空间分辨率。
在一些情况下，将样品安装到第一基板上包括将组织样品切片(例如，低温恒温器切片)以及随后的固定步骤。在一些情况下，固定步骤可以包括用甲醇固定。在一些情况下，固定步骤包括福尔马林(例如，2％福尔马林)。在一些情况下，这些方法可以进一步包括阻断步骤。阻断步骤可以包括使用阻断探针来减少抗体与阵列的非特异性结合。阻断步骤可以任选地进一步包括使生物样品与去污剂接触。在一些情况下，去污剂可以包括Triton X-100TM。该方法可以进一步包括抗体孵育步骤。在一些实施方案中，抗体孵育步骤实现了抗体与组织样品中的感兴趣抗原的选择性结合。在一些实施方案中，抗体缀合至寡核苷酸(例如，如本文所述的寡核苷酸-抗体缀合物)。在一些实施方案中，抗体不与寡核苷酸缀合。在一些实施方案中，该方法还包括抗体染色步骤。抗体染色步骤可以包括直接免疫染色法，其中标记的抗体直接结合被染色的分析物。替代性地，抗体染色步骤可以包括间接免疫染色法，其中第一种抗体结合被染色的分析物，第二种标记的抗体结合第一种抗体。在一些实施方案中，抗体染色步骤在组装夹层之前进行。在抗体孵育步骤中使用寡核苷酸-抗体缀合物的一些实施方案中，该方法不包括抗体染色步骤。
该方法可以进一步包括使用本文所述的任何适当方法的成像步骤，之后是透化步骤。在一些实施方案中，成像步骤包括免疫荧光。在一些情况下，透化步骤可以包括使用胃蛋白酶和盐酸。在使用夹层阵列工艺的方法中，透化步骤可以包括使用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)。透化步骤之后是如本文进一步描述的标准cDNA合成与文库制备。
实施例
实施例1.示例性流体输送方案
在本文所述的示例夹层制作工作流程中，液体试剂(例如，透化溶液305)可以填充组织载片(例如，载片303)与捕获载片(例如，具有加条形码的捕获探针306的载片304)之间的间隙(例如，间隙307)，以保证或实现具有空间信息的目标分子的转移。本文描述了可以抑制气泡形成和抑制转录物和/或目标分子或分析物的不希望的流动的填充方法的实例。本文所述的夹层构造制作过程中的稳健流控技术可以通过在分子从组织载片移动到捕获载片时减少或防止分子的偏转来保存空间信息。
参考图9A，示出了示例性夹层构造，其中使得包括生物样品902(例如，组织切片)的第一基板(例如，载片903)和第二基板(例如，包括在空间上加条形码的捕获探针906的基板(载片904))处于彼此接近的状态。可以将透化缓冲液(例如，透化溶液905)引入生物样品902与第二基板上的阵列之间，以释放分析物，这些分析物能够被阵列的捕获探针906捕获。
例如，图22A示出了示例性的流体输送方案。步骤1示出了包括生物样品(例如，样品902)的第一基板(例如，载片903)，以及第二基板(例如，载片904)上的阵列906(例如，空间阵列)。步骤2示出了将垫圈2210施加为基本上包围(例如，部分地围住)阵列906，然而，垫圈2210可以替代地或附加地被施加为基本上包围生物样品902。图22A所示的示例垫圈2210包括两个孔，但垫圈2210也可以包括零个、一个，或者两个或更多个孔。步骤3示出了用于产生部分密封或完全密封的腔室的示例性组件。步骤3还示出了使第一基板和第二基板接近，以形成夹层组件。在图22A中，步骤3示出第一基板和第二基板(例如，分别为载片903和载片904)以交叉构型对准，然而，第一基板和第二基板也能够以各种角度对准。例如，第一基板和第二基板还可以轴向对准(例如，在如本文所述的夹层组件中)。当第一基板(例如，载片903)、第二基板(例如，载片904)和垫圈2210被组装在一起(例如，以夹层组件、本文所述的任何构造)时，可以形成部分密封或完全密封的腔室，其中流体可以输送(例如，通过孔、通过通孔等)到该腔室的部分封闭的容积中。步骤4示出了经由毛细流动将流体(例如，透化溶液905)输送到垫圈的孔中。替代性地，在步骤4处，流体可以在低温(例如，约5℃至约25℃)下输送，然后加热，如图22B所示。步骤5(图22B)示出，对第一基板(例如，载片903)和/或第二基板(例如，载片904)构造加热可以促进生物样品902的透化速率。
图23示出了与图22A至图22B类似的示例性流体输送方案，但如步骤1所示，干燥的透化试剂设置在阵列906上。虽然未示出，但是干燥的透化试剂也可以设置在生物样品902上。类似于图22A，施加垫圈2210(步骤2)，然后将第一基板和第二基板(例如，分别为载片903和载片904)组装在一起(例如，夹层组件)(步骤3)。如步骤4所示，经由毛细作用输送流体(例如，缓冲液)以使干燥的透化试剂溶解。
图24示出了与图22A至图22B类似的示例性流体输送方案，但如步骤3所示，流体输送机构是与垫圈2210(例如，垫圈中的储存器)接合的注射器2415。在步骤4处，可以通过注射器2415将流体注射到孔中。
图25A示出了示例性流体输送方案，其中垫圈2210不包括孔并且设置在第一基板与第二基板(例如，分别为载片903和载片904)之间，其中第一基板和第二基板以交叉构型对准。类似于前面的附图，虽然图25A示出了交叉构型，但是第一基板和第二基板能够以任何角度对准，包括轴向对准(例如，夹层组件)。如图所示，包括生物样品的第一基板可以具有一个或多个通孔2515，其中可以输送(例如，通过毛细作用流过、通过注射器注射等)(图25A)或通过注射器2415注射(图25B)流体，包括透化溶液(例如，透化溶液905)。替代性地或除此之外，第二基板可以具有一个或多个通孔2515，其中可以如本文所述输送流体，包括透化溶液。
实施例2.示例性流体输送方案
图26示出了示例性流体输送方案，包括使用虚拟垫圈(例如，如箭头所指示的疏水性涂层2615)。如步骤1所示，疏水性涂层2615被施加为围绕(例如，包围)阵列906，然而，疏水性涂层2615也可以被施加为围绕生物样品902，或两者兼而有之。疏水性涂层2615可以经由压模或绘制来施加，诸如用蜡笔或石蜡基蜡笔绘制来施加。如步骤2所示，经由毛细流动将流体(例如，透化溶液)装载到阵列906上。虽然未示出，但是可以经由注射器装载流体。替代性地，干燥的透化试剂可以设置在第一基板和/或第二基板上，然后可以被输送的流体溶解。当第一基板、第二基板和虚拟垫圈(例如，疏水性涂层2615)被组装在一起(例如，以夹层组件、本文所述的任何构造)时，形成了部分密封的腔室，其中流体可以输送(例如，通过孔、通过通孔)到该腔室的部分封闭的容积中。
图27示出了结合疏水性涂层2615和垫圈2210的构造。如图27所示，垫圈包括孔2710。疏水性涂层2615可以施加到未被垫圈覆盖的基板上(例如，在孔2710中)，以保留输送的流体(例如，缓冲液、透化溶液905)。疏水性涂层2615可以在输送流体之前施加到孔(例如，一个或多个孔)。
实施例3.在夹层阵列中使用分析物捕获剂来捕获分析物
该实施例提供了用于分析生物样品中的分析物的示例性方法。在非限制性实例中，将生物样品切片并放置在第一载片上。在固定(例如，用2％福尔马林)和封闭(例如，用Triton-X)后，将生物样品与一种或多种分析物捕获剂一起孵育。一种或多种分析物捕获剂与寡核苷酸相关联。示例性分析物捕获剂包括如本文所述的抗体-寡核苷酸缀合物。然后根据本文所述的任何方法对样品进行染色(例如，用H&E)和成像。将包括特征阵列的第二载片放置在第一载片附近，形成夹层构造。当这些载片处于夹层构造中时，发生透化。示例性透化条件在本文中进行了描述，可以包括用胃蛋白酶透化，或者用蛋白酶K和SDS透化。在一些实施方案中，用蛋白酶K和SDS将样品至少部分地透化。第二载片包括多个探针，这些探针包括空间结构域和捕获结构域，其中捕获结构域检测生物样品中的寡核苷酸和分析物两者。在一些实施方案中，其中特征阵列被构造用于捕获多种分析物类型，该特征阵列包括一个或多个在空间上多重化加条形码的特征。本文描述了示例性的在空间上多重化加条形码的特征。分析物迁移并被第二载片上的探针捕获，捕获探针延伸以捕获所捕获的寡核苷酸和分析物的互补序列。透化后，拆开夹层构造，然后根据本文所述的任一种方法来扩增该延伸的捕获探针并测序。随后的序列分析用于确定关于从组织样品捕获的分析物的空间信息。
实施例4.免疫染色与夹层组装工作流程相结合
该实施例提供了将免疫染色整合到如本文所述的夹层组装工作流程中的示例性方法。在非限制性实例中，将生物样品切片并放置在第一载片上。在固定(例如，用2％福尔马林或用甲醇)和封闭(例如，用Triton-X)后，对生物样品进行抗体孵育步骤。在抗体孵育步骤之后，该方法还包括抗体染色步骤。抗体染色步骤可以包括直接免疫染色法，其中标记的抗体直接结合被染色的分析物。替代性地，抗体染色步骤可以包括间接免疫染色法，其中第一种抗体结合被染色的分析物，第二种标记的抗体结合第一种抗体。在抗体染色步骤之后，例如通过免疫组织化学或免疫荧光对样品成像。成像后，将包括特征阵列的第二载片放置在第一载片附近，形成夹层构造。当这些载片处于夹层构造中时，发生透化。示例性透化条件可以包括用胃蛋白酶透化，或者用蛋白酶K和SDS透化。分析物迁移到第二载片上的探针并被其捕获，然后探针延伸以捕获所捕获的寡核苷酸和分析物的互补序列。透化后，拆开夹层构造，然后根据本文所述的任一种方法来扩增该延伸的捕获探针并测序。随后的序列分析用于确定关于从组织样品捕获的分析物的空间信息。
实施例5：在夹持期间用于稳健流控技术的填充方法
在本文所述的示例夹层制作工作流程中，液体试剂(例如，透化溶液905)可以填充组织载片(例如，载片903)与捕获载片(例如，具有加条形码的捕获探针906的载片904)之间的间隙(例如，间隙907)，以保证或实现具有空间信息的目标分子的转移。本文描述了可以抑制气泡形成和抑制转录物和/或目标分子或分析物的不希望的流动的填充方法的实例。本文所述的夹层构造制作过程中的稳健流控技术可以通过在分子从组织载片移动到捕获载片时减少或防止分子的偏转来保存空间信息。
图28示出了根据一些示例实施方式的示例性夹层构造2800，其中使得包括生物样品902(例如，组织切片)的第一基板(例如，病理载片903)和第二基板(例如，包括在空间上加条形码的捕获探针906的载片904)处于彼此接近的状态。如图28所示，液体试剂液滴(例如，透化溶液905)被引导至第二基板上接近捕获探针906并且介于生物样品902与第二基板(例如，载片904)之间的位置。透化溶液905释放分析物，这些分析物能够被阵列的捕获探针906捕获。如进一步所示，一个或多个隔件1310定位在第一基板(例如，病理载片903)与第二基板(例如，载片904)之间。一个或多个隔件1310包括一个或多个间隔构件，这些间隔构件有助于维持第一基板和第二基板的间距和/或近似平行的布置。
一个或多个隔件1310被构造成维持第一基板与第二基板之间的分隔距离。一个或多个隔件1310可以在第一基板上邻近生物样品902放置在第一基板与第二基板之间。一个或多个隔件1310可以在第二基板上邻近阵列906放置在第一基板与第二基板之间。通过这样做，一个或多个隔件1310产生了腔室(例如，腔室1350)，在整个透化和分析物迁移过程中，溶液(例如，缓冲液、透化溶液905)均容纳在该腔室中。在一些实施方案中，使用了多于一个隔件。在一些实施方案中，一个或多个隔件1310的高度为约2μm、约12.5μm、约15μm、约17.5μm、约20μm、约22.5μm或约25μm。在一些实施方案中，每个隔件的高度为约50μm、约100μm、约200μm、约300μm、约400μm、约500μm、约600μm、约700μm、约800μm、约900μm或约1000μm。在一些方面，一个或多个隔件1310的高度在1μm至100μm的范围内。一个或多个隔件1310的高度或厚度基于如本文所述的流体的扩散加宽来选择。一个或多个隔件1310可以由具有均匀厚度的材料或者具有可变(例如，倾斜)厚度的材料形成。
一个或多个隔件1310在生物样品(例如，组织样品902或感兴趣区域)和/或阵列906周围产生完全或部分封闭的腔室。一个或多个完全封闭的隔件1310可以被构造成任何形状。在一些实施方案中，由一个或多个隔件1310产生的完全封闭(例如，包围)的腔室是正方形或矩形中的一种。在一些实施方案中，一个或多个隔件1310与生物样品902的形状相符。例如，一个或多个隔件1310在本文中被示为具有示例形状、示例高度，并且维持示例分隔距离(例如，12.5μm)，但其他的值和形状也是可能的，并且可以取决于液体试剂、生物样品902、捕获探针906，等等。
图28示出了根据一些示例实施方式的完全形成的夹层构造的一个实例，其产生了由一个或多个隔件1310、第一基板(例如，病理载片903)和第二基板(例如，载片904)形成的腔室1350。在图28的该实例中，液体试剂(例如，透化溶液905)填充腔室1350的容积，并且产生透化缓冲液，该透化缓冲液允许mRNA转录物和/或分子从生物样品902向载片904的捕获探针906扩散。在一些方面，透化缓冲液的任何流动都可能使来自生物样品902的转录物和/或分子偏转，因而可能影响用于空间分析的分析物的扩散转移。由一个或多个隔件1310、第一基板和第二基板产生的部分或完全密封的腔室1350减少或防止转录物和/或分子在从生物样品902扩散转移到捕获探针906的过程中的不希望的对流运动。
图14描绘了根据一些示例实施方式的用于从腔室1350排出或去除气泡的示例构造1400。图14描述了腔室1350的顶视图，其中正方形部分包括捕获探针906，圆形部分包括生物样品902，矩形部分包括疏水区1420。疏水区1420包括疏水性图案，该疏水性图案不会润湿，并且设置在腔室1350远离感兴趣区(例如，其中生物样品902和捕获探针906重叠的区)定位的一部分中。疏水区1420被构造成在透化步骤期间从腔室1350中去除气泡(例如，气泡2015)。
在一些方面，气泡排出特征或气泡去除特征的任何组合可以施加到腔室、第一基板和/或第二基板。例如，透气隔件(例如，隔件1310)可以被构造成排出截留的气泡。另外，设置在第一基板、第二基板和/或隔件上的气泡排出孔可以放置在关键位置以排出气泡。在一些方面，超声处理或振动装置可以被构造成在夹层闭合期间在第一基板和/或第二基板上产生振动，以减少气泡粘附到第一基板或第二基板表面上的机会。此外，可能可以在夹层闭合期间增加腔室的湿度，以促进透化溶液或液体试剂的填充过程。另外，可能可以在闭合期间在腔室中产生真空，以减少或消除气泡截留的机会。
图15A至图15C示出了根据一些示例实施方式的设置在第一基板(例如，病理载片903)和/或第二基板(例如，载片904)上的一个或多个隔件1310的示例构造。虽然在图15A至图15C中示出了载片904(例如，第二基板)，但是根据示例实施方案，示例隔件构造可以等同地应用于第一基板(例如，病理载片903)。在一些方面，图15A至图15C的示例隔件构造可以与如本文所述的成角度闭合工作流程(例如，图17A至图18B的工作流程1700)结合。
图15A是示例腔室1350的顶视图，该腔室部分封闭，一个或多个隔件1310的三个侧面是闭合的。如图所示，透化溶液905的液滴沿腔室1350的开口侧设置在载片904的表面上。在一些方面，第一基板(例如，病理载片903)与液滴905接触的成角度闭合将透化溶液推向部分地围绕液滴905的一个或多个隔件1310。在一些实施方式中，一个或多个隔件1310的三个侧面至少部分地围绕第二基板(例如，载片904)的捕获探针906和/或第一基板(例如，病理载片903)的生物样品902。
图15B描绘了完全封闭的另一种示例腔室1350的顶视图。如图所示，一个或多个隔件1310完全包围并封闭腔室1350。如进一步所示，透化溶液905的液滴在腔室1350外部定位在载片904的表面上。如上所述，第一基板(例如，病理载片903)在第二基板(例如，载片904)上的成角度闭合工作流程(例如，工作流程1700)使得第一基板的下降侧与液滴905接触，从而将透化溶液905推向腔室1350并使其流到腔室1350内。在图15B的该实例中，一个或多个隔件1310至少部分地围绕第二基板(例如，载片904)的捕获探针906和/或第一基板(例如，病理载片903)的生物样品902。
图15C描绘了完全封闭的另一种示例腔室1350的顶视图。如图所示，一个或多个隔件1310完全包围并封闭腔室1350。如进一步所示，透化溶液905的液滴在腔室1350外部定位在一个或多个隔件1310的表面上。如本文所述，第一基板(例如，病理载片903)在第二基板(例如，载片904)上的成角度闭合工作流程(例如，工作流程1700)使得第一基板的下降侧与透化溶液905的液滴接触，从而将透化溶液905推向腔室1350并使其流到腔室1350内。在图15C的该实例中，一个或多个隔件1310至少部分地围绕第二基板(例如，载片904)的捕获探针906和/或第一基板(例如，病理载片903)的生物样品902。
图16A至图16E描绘了根据一些示例实施方式的与一个或多个疏水区1420结合的一个或多个隔件1310的示例构造。所示的任何或所有示例构造可以与成角度闭合工作流程(例如，工作流程1700)结合，用于夹持第一基板和第二基板并用于形成腔室1350。
图16A描绘了示例腔室1350的顶视图。如图所示，腔室1350包括一个或多个隔件1310的三个侧面，还包括第四个侧面，其中第四个侧面包括疏水区1420。如进一步所示，透化溶液905的液滴位于载片904上靠近疏水区1420的位置。如上所述，第一基板(例如，病理载片903)在第二基板(例如，载片904)上的成角度闭合工作流程(例如，工作流程1700)使得第一基板的下降侧与透化溶液905的液滴接触，从而将透化溶液905推向相对侧并使其流到具有一个或多个隔件1310的三个侧面的腔室1350内。
图16B描绘了另一种示例腔室1350的顶视图。如图所示，腔室1350包括放置在腔室1350的四个拐角处的四个隔件1310，以及包括腔室1350的侧面的疏水区1420。在图16B的该实例中，放置在腔室1350的拐角处的隔件1310在夹持期间保持第一基板(例如，病理载片903)与第二基板(例如，载片904)之间的最小间距。图16B的疏水区1420在透化步骤期间将透化溶液905保留在腔室1350内。在夹持期间，透化溶液905填充腔室1350的容积。
在一些方面，可以实施一个或多个隔件1310、疏水区1420等的任何组合，以实现对腔室1350的组装并实现流动和/或气泡抑制。在一些实施方案中，一个或多个隔件1310和/或疏水区1420可以设置在第一基板(例如，病理载片903)或第二基板(例如，载片904)上。
图16C描绘了第二基板(例如，载片904)上的一个或多个隔件1310的示例构造的顶视图。如图所示，一个或多个隔件1310在腔室1350的三个侧面围绕透化溶液905的液滴。
图16D描绘了包括生物样品902和疏水区1420的第一基板(例如，病理载片903)的顶视图。
图16E描绘了与第二基板(例如，图16C的载片904)夹持在一起的第一基板(例如，图16D的病理载片903)的顶视图。如图所示，图16C的一个或多个隔件1310和图16D的疏水区1420的组合形成了图16E的完全封闭的腔室1350。
图21A至图21C描绘了根据一些示例实施方式的用于夹持具有组织样品902的第一基板(例如，病理载片903)和第二基板(例如，具有捕获探针906的载片904)的成角度闭合工作流程2100的侧视图和顶视图。
图21A描绘了第一基板(例如，包括样品902的病理载片903)在第二基板(例如，载片904)之上(上方)成角度。如图所示，透化溶液905的液滴位于隔件1310上方，朝向图21A中侧视图的右侧部分。
图21B示出了当第一基板下降时，或者当第二基板上升时，第一基板的下降侧(例如，载片903低于相对侧成角度的一侧)接触透化溶液905的液滴。第一基板的下降侧将透化溶液905推向相反的方向。例如，在图21B的侧视图中，当夹层构造形成时，透化溶液905可以从右向左推进。
图21C描绘了第一基板与第二基板之间的夹层构造已完全闭合，其中隔件1310与第一基板和第二基板两者接触，并且维持这两者之间的分隔距离。如图21B至图21C的顶视图所示，隔件1310完全封闭和包围组织样品902和捕获探针906，并且隔件1310形成了保持一定体积透化溶液905的腔室1350的侧面。
实施例6：从固定在载片上的新鲜冷冻小鼠脑切片有效地将分析物捕获到空间阵列载片上
在夹层条件和非夹层条件下证明了分析物被捕获到在空间上加条形码的阵列上和随后的测序。对于测试(夹持)条件，使用了存档的包含苏木精/伊红染色的新鲜冷冻小鼠脑切片的组织固定标准载玻片。对于对照(非夹持)条件，使用了具有直接固定到阵列区上的苏木精/伊红染色的新鲜冷冻小鼠脑切片的阵列基板载片。在这两种条件下，对组织切片进行苏木精脱色步骤。将根据“夹持”条件处理的载片在37℃下短暂干燥，然后与本文所述的阵列基板以及包含十二烷基肌氨酸钠和蛋白酶K的透化缓冲液一起安装在本文所述的样品处理设备中。仪器中夹层闭合时，将组织切片透化1分钟。对于根据非夹层条件处理的组织固定阵列基板，在不进行夹持的情况下，使用相同的透化缓冲液将切片透化5分钟。对于这两种情况，在透化后，将阵列基板上所捕获的含有多聚A的mRNA转录物逆转录成cDNA，之后进行标准测序文库制备和测序。
图35示出了描绘每斑点基因中位数和每斑点UMI计数中位数的结果。
显示Log10 UMI的视觉热图结果在图36中示出。Log10 UMI计数的空间模式在夹层条件和非夹层条件下是相似的。
图37描绘了空间聚类分析(顶行4805)和海马转录物Hpca的分析(底行4810)。空间模式在夹层条件和非夹层条件下相差无几。
在一些实施方案中，代替将包括组织样品的基板与包括本文所述的空间条形码阵列的基板夹持在一起，可以将包括组织样品的基板与具有包含多个多聚T捕获探针的分布式区的组织优化测定基板夹持在一起。mRNA转录物可以在荧光标记的核苷酸的存在下逆转录，这可以产生与捕获探针连接的荧光cDNA。然后可以对连接的cDNA进行成像。图像亮度和图像锐度可以提供透化和转录物捕获完成程度的指示。
实施例7：使用成角度闭合的夹层组件以及在透化期间使气泡产生/截留最小化的闭合速度
在一个示例方面，夹层构造的成角度闭合(例如，参见工作流程1700和图17A至图18B)在三种不同的闭合速度下进行了测试，分别得到大约370ms(快速)、大约550ms(中等)和大约1100ms(缓慢)的闭合时间。对于每种闭合速度条件，载片1706是其上安装有小鼠冠状脑组织切片的载玻片，载片1712是本文所述的包括在空间上编码的捕获探针阵列的阵列基板。对于快速闭合速度条件(例如，闭合在大约370ms内发生)，观察到液体试剂液滴(例如，液滴1705)填充了两个基板之间的间隙(例如，间隙907，图9)，没有任何气泡截留在试剂介质内和基板之间。参见图38A至图38C。对于中等闭合速度条件(例如，闭合在大约550ms内发生)，观察到液体试剂液滴填充了两个基板之间的间隙，没有任何气泡在试剂介质内截留在基板之间。参见图39A至图39C。对于缓慢闭合速度条件(例如，闭合在大约1100ms内发生)，观察到液体试剂液滴填充了两个基板之间的间隙，有一些气泡2015截留在试剂介质内和基板之间。参见图40A至图40C。然而，即使闭合速度缓慢，在载片1706上的组织切片与载片1112上的阵列区之间也没有观察到气泡。因此，在所有三种闭合速度下都实现了有效的分析物捕获，其中快速和中等的速度降低了在夹层区中的任何位置气泡截留的发生率。快速和中等的闭合速度使气泡产生/截留最小化，这一观察结果在多轮试验中是一致的。
虽然上文描述了示例闭合速度值，但是其他闭合速度也是可能的。
实施例8：使用染料条纹法评估当前流速
为了评估在夹持组织载片和在空间上加条形码的阵列载片期间试剂介质中的侧向流动，使用本文所公开的成角度闭合方法(例如，参见工作流程1700和图17A至图18B)将其上附接有完全封闭的隔件的基因表达(GEx)载片与标准载玻片夹持在一起。对于成角度闭合方法，将GEx载片放置在底部，并且将载玻片定位在GEx载片上方。将试剂介质液滴定位在GEx载片的隔件上，使得载玻片的下降侧在夹层闭合期间将最先与试剂液滴接触。此外，将一个染料斑点置于GEx载片上由隔件封闭的区内。闭合后，将这些载片以夹层构造保持一段时间(例如，30分钟至2小时)，在此期间以每秒1帧的速度捕获视频图像，以显现染料前沿迁移通过试剂介质的情况。对视频图像的强度分布进行了高斯拟合和峰值跟踪分析，以评估封闭夹层腔室内染料条纹的侧向流速。
结果描绘在图41A至图41C中。如图所示，图41A和图41B描绘了侧向流速随时间推移的尖峰。图41C描绘了没有出现侧向流速尖峰的一个实例。如图41A至图41C的实例所示，在某些夹层条件下可能偶尔出现侧向流动尖峰。
进一步观察到，在夹持之后，用于阵列载片的保持机构(例如，载片保持器)偶尔呈现出湿条纹。不希望受理论束缚，由于隔件产生的渗漏密封，可能在载片与载片保持器之间形成毛细流动，从而允许一部分试剂介质渗漏到腔室外部并渗透到载片下方(例如，如图32A所描绘的)。
使用具有改进的流体密封的有机硅隔件或者附接到组织载片和包括隔件的阵列载片底部的有机硅背衬，重复上述染料前沿实验。在这两种情况下，在组织载片和阵列载片的底部上均没有观察到湿条纹(数据未示出)。在这两种情况下，流动尖峰(例如，侧向流速U中的尖峰)基本上被消除。参见例如图42A至图42D，示出了使用染料条纹法和图33的夹层构造3300(使用有机硅背衬)时的示例流速的图形。对于使用具有改进的流体密封的有机硅隔件的实验，观察到类似的结果(数据未示出)。
根据期望的构造，本文描述的主题可以体现在系统、设备、方法和/或制品中。在上述说明中阐述的实施方式并不代表与本文描述的主题相符的所有实施方式。相反，它们仅仅是与所描述的主题相关的方面相符的一些实例。尽管上文已经详细描述了一些变化，但是其他的修改或添加也是可能的。特别地，除了本文阐述的那些特征和/或变化之外，还可以提供另外的特征和/或变化。例如，上文描述的实施方式可以涉及本发明所公开特征的各种组合和子组合，以及/或者上文所公开的若干个其他特征的组合和子组合。此外，附图中描绘的和/或本文描述的逻辑流程不一定需要所示的特定顺序或连续顺序来实现期望的结果。其他实施方式可以在以下权利要求书的范围内。

Claims (40)

1.一种用于将流体输送到设置在第一基板上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，所述方法包括：
将所述流体输送到所述第一基板和/或所述第二基板，其中所述第一基板和所述第二基板中的至少一者包括隔件；以及
在所述输送之后，组装包括所述第一基板、所述第二基板、所述生物样品和所述隔件的腔室，其中所述隔件设置在所述第一基板与所述第二基板之间，并且被构造成将所述流体保持在所述腔室内，并且维持所述第一基板与所述第二基板之间的分隔距离，所述隔件被定位成至少部分地围绕所述第一基板上设置有所述生物样品的区和/或设置在所述第二基板上的所述阵列，其中所述第一基板的所述区、所述隔件和所述第二基板至少部分地包围包括所述生物样品在内的容积。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述腔室包括部分或完全密封的腔室。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二基板包括远离感兴趣区域定位的疏水区，所述疏水区被构造成从所述腔室中去除所述流体中的气泡，并且所述感兴趣区域包括所述生物样品和阵列重叠的区。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疏水区包括疏水性涂层。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分隔距离包括至少2μm的距离。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分隔距离包括介于约5μm至25μm之间的距离。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二基板包括所述隔件。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一基板包括所述隔件。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在输送所述流体之前：
将亲水性涂层施加到所述第一基板和/或所述第二基板上。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述流体包含润湿剂。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述流体包含一种或多种透化试剂。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述隔件包括被构造成从所述流体中排出气泡的透气隔件部分。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括对所述第一基板和/或所述第二基板产生振动。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述流体输送到所述第一基板和/或所述第二基板包括调节所述腔室的湿度。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述流体输送到所述第一基板和/或所述第二基板包括对靠近所述第一基板和/或所述第二基板的区域产生真空。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述流体输送到所述第一基板和/或所述第二基板包括将所述流体输送到所述第二基板的某个区域，所述隔件包括部分地围绕所述流体的三个侧面。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述流体输送到所述第一基板和/或所述第二基板包括将所述流体输送到所述第二基板的某个区域，所述区域位于所述第二基板的封闭区之外，所述封闭区由所述隔件形成。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述流体输送到所述第一基板和/或所述第二基板包括将所述流体输送到所述隔件的某个区域，所述区域位于所述第二基板的封闭区之外，所述封闭区由所述隔件形成。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中组装所述腔室包括响应于所述输送，以一定角度定位所述第一基板，使得当所述第一基板和所述第二基板处于沿与所述第二基板正交的轴线的阈值距离内时，所述第一基板的下降侧与所述流体的至少一部分接触，所述下降侧将所述流体推向部分地围绕所述流体的所述三个侧面。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述腔室包括疏水性图案，所述疏水性图案至少部分地围绕所述流体并且被定位成至少部分地围绕所述第一基板上的所述区和/或设置在所述第二基板上的所述阵列。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述隔件由厚度均匀的材料形成。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述隔件由具有可变厚度的材料形成。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述隔件印刷在所述第一基板和/或所述第二基板上。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述隔件包括光致抗蚀剂图案。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述隔件在所述隔件的一个或多个侧面上包括斜边缘。
26.一种系统，包括：
第一基板，所述第一基板包括用于粘附生物样品的涂层；
第二基板，所述第二基板包括阵列；以及
隔件，所述隔件设置在所述第一基板与所述第二基板之间，并且被构造成将流体保持在包括所述第一基板、所述第二基板、所述生物样品和所述隔件的腔室内，所述隔件进一步被构造成维持所述第一基板与所述第二基板之间的分隔距离，所述隔件被定位成至少部分地围绕所述第一基板上的所述生物样品以及/或者设置在所述第二基板上的所述阵列。
27.一种套件，包括具有阵列的第二基板，其中所述第二基板还包括围绕所述阵列的隔件。
28.一种套件，包括具有生物样品的第一基板，其中所述第一基板还包括围绕所述生物样品的隔件。
29.一种套件，包括被构造成设置在第一基板与第二基板之间的隔件，以及根据前述权利要求中任一项所述的方法的使用说明。
30.一种用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，所述方法包括：
组装包括所述第一基板、所述第二基板、所述生物样品和垫圈的部分密封的腔室，其中所述垫圈设置在所述第一基板与所述第二基板之间，并且围绕所述第一基板上的所述区和/或设置在第二基板上的所述阵列，其中所述第一基板的所述区、所述垫圈和所述第二基板至少部分地包围包括所述生物样品在内的容积；以及
通过所述垫圈的一个或多个孔将所述流体输送到所述部分密封的腔室，从而将所述流体输送到所述阵列和所述生物样品。
31.一种用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，所述方法包括：
组装包括所述第一基板、所述第二基板、所述生物样品和垫圈的部分密封的腔室，其中所述垫圈设置在所述第一基板与所述第二基板之间，并且围绕所述第一基板上的所述区和/或设置在第二基板上的所述阵列，其中所述第一基板、所述垫圈和所述第二基板至少部分地包围包括所述生物样品在内的容积；以及，
通过所述第一基板中的一个或多个通孔或者所述第二基板中的一个或多个通孔将所述流体输送到所述部分密封的腔室，从而将所述流体输送到所述阵列和所述生物样品。
32.一种用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，所述方法包括：
将流体输送到所述第一基板上的所述区，其中虚拟垫圈围绕所述第一基板上的所述区并且将所述流体容纳在所述区内；以及
将所述第二基板与所述第一基板组装在一起，从而将所述流体输送到所述阵列和所述生物样品。
33.一种用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，所述方法包括：
将流体输送到所述第二基板上的所述区，其中虚拟垫圈围绕所述第二基板上的所述区并且将所述流体容纳在所述阵列上；以及
将所述第一基板与所述第二基板组装在一起，从而将所述流体输送到所述阵列和所述生物样品。
34.一种套件，包括：
包括用于粘附生物样品的涂层的第一基板；
包括阵列的第二基板；以及
垫圈。
35.一种用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板上的阵列的方法，所述方法包括：
组装包括所述第一基板、所述第二基板、所述生物样品和隔件的部分密封的腔室，其中所述隔件设置在所述第一基板与所述第二基板之间，并且围绕所述第一基板上的所述区和/或设置在第二基板上的所述阵列，其中所述第一基板的所述区、所述隔件和所述第二基板至少部分地包围包括所述生物样品在内的容积；以及
将所述流体输送到所述部分密封的腔室，从而将所述流体输送到所述阵列和所述生物样品。
36.一种用于将流体输送到设置在第一基板的某个区上的生物样品和设置在第二基板的第二区上的阵列的方法，所述方法包括：
将流体输送到所述第二基板上的所述第二区，其中隔件围绕所述第二基板上的所述第二区并且将所述流体容纳在所述阵列上；以及
将所述第一基板与所述第二基板组装在一起，从而将所述流体输送到所述阵列和所述生物样品。
37.一种系统，包括：
第一基板，所述第一基板用于粘附生物样品；
第二基板，所述第二基板包括阵列；以及
隔件，所述隔件设置在所述第一基板与所述第二基板之间，并且被构造成将流体保持在包括所述第一基板、所述第二基板、所述生物样品和所述隔件的腔室内，所述隔件进一步被构造成维持所述第一基板与所述第二基板之间的分隔距离，所述隔件被定位成至少部分地围绕所述第一基板上的所述生物样品以及/或者设置在所述第二基板上的所述阵列。
38.根据权利要求37所述的系统，其中所述第一基板包括安装在其上的所述生物样品。
39.根据前述权利要求中任一项所述的系统，还包括样品保持器，所述样品保持器包括：
第一构件，所述第一构件包括第一保持机构，所述第一保持机构被构造成将所述第一基板保持设置在第一平面中，
第二构件，所述第二构件包括第二保持机构，所述第二保持机构被构造成将所述第二基板保持设置在第二平面中，
对准机构，所述对准机构连接到所述第一构件和所述第二构件中的一者或两者，并且被构造成将所述第一构件和所述第二构件沿所述第一平面和/或所述第二平面对准，使得当所述第一构件和所述第二构件对准并且处于沿与所述第二平面正交的轴线的阈值距离内时，所述样品与所述试剂介质的至少一部分接触，以及
调节机构，所述调节机构被构造成沿与所述第二平面正交的所述轴线移动所述第二构件并且/或者沿与所述第一平面正交的轴线移动所述第一构件，以在所述第一构件和所述第二构件对准并且处于沿与所述第二平面正交的所述轴线的所述阈值距离内时组装包括所述第一基板、所述第二基板、所述生物样品和所述隔件的所述腔室。
40.根据权利要求26、37和38中任一项所述的系统，还包括样品保持器，所述样品保持器包括：
第一构件，所述第一构件包括保持所述第一基板的保持机构，
第二构件，所述第二构件包括保持所述第二基板的第二保持机构，以及
对准机构，所述对准机构连接到所述第一构件和所述第二构件中的至少一者或者连接到所述第一构件和所述第二构件两者，并且被构造成将所述第一构件和所述第二构件对准，使得所述第一基板上的所述生物样品(或其一部分)与所述第二基板的所述阵列对准并接触。
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