JP2020527707A - 生体試料のイン・サイチュ抗原賦活化およびそのイメージングの方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)上記試料支持体上に固定された上記生体試料を提供するステップと、
b)マイクロ流体チャンバと、このマイクロ流体チャンバの一端にある少なくとも1つの流体入口と、このマイクロ流体チャンバの他端にある少なくとも1つの流体出口と、を含み、流体供給システムからマイクロ流体チャンバを介して圧力下で供給される流体を導くように構成された、マイクロ流体装置を提供するステップであって、マイクロ流体チャンバの少なくとも1つの壁が、試料支持体によって形成され、マイクロ流体チャンバの第1の壁にクランプ機構によって流体密かつ取り外し可能な方法でシールに対して取り付けられ、マイクロ流体チャンバの容積は2.5μlと200μlとの間である、ステップと、
c)試料がマイクロ流体チャンバの内側に面する状態で、上記マイクロ流体チャンバと上記試料支持体とを流体密な方法で一緒に取り付けるステップと、
d)大気圧より高い圧力で温度制御抗原賦活化ステップを実行するステップであって、上記賦活化ステップは、
- 大気圧を超えるマイクロ流体チャンバにおける圧力Pchamberで流体入口を介してエピトープ脱マスキング溶液でマイクロ流体チャンバを満たすステップと、
- マイクロ流体チャンバをインキュベーション温度設定点(TAR)まで加熱し、インキュベーション持続期間tiの間、マイクロ流体チャンバの温度を上記インキュベーション温度設定点に維持するステップと、
- 冷却持続期間tcの間、上記インキュベーション温度設定点未満かつ室温以上の冷却温度までマイクロ流体チャンバを冷却するステップと、
を含み、上記インキュベーション温度設定点TARは約60℃から200℃の間に含まれ、マイクロ流体チャンバにおける圧力Pchamberは1.5バールより大きく、インキュベーション持続期間tiは0.5から30分の間に含まれる、ステップと、
を含む、方法である。
e)少なくとも1つのイメージングプローブを含む複数の試薬を、約1μl/sと約100μl/sとの間の範囲の流量で、流体入口を介してマイクロ流体チャンバ内へ順に注入するステップと、
f)上記少なくとも1つのイメージングプローブと反応した試料の成分によって放出される信号をイメージングするステップと、
g)さまざまなイメージングプローブでステップ(e)とステップ(f)とを繰り返すステップと、をさらに含む。
- 試料上に残っている可能性がある望ましくない物質を除去するために溶出緩衝液が注入される溶出ステップと、
- ブロッキング緩衝液が注入される任意選択の非特異的結合ブロッキングステップと、
- イメージングプローブが注入される試料標識化ステップと、
を含み、
これらのステップのそれぞれは、洗浄緩衝液が注入される任意選択の洗浄ステップによって先行され、
上記少なくとも1つのイメージングプローブは、上記試料内の分析されるべき分子実体を標的とする、標識プローブおよび色素原または蛍光検出分子としての一連の特定の抗体の注入から生じる。
- 約1μl/sと約100μl/sとの間の範囲の初期流量で試薬が注入される第1の流量ステップと、
- シーケンスにおける次の試薬を注入する前に、同じ試薬がより低流量(通常約0.001から約1.0μl/s)で注入され、その試薬を試料と確実にインキュベートする、第2の流量ステップと、
を含む。
(i)試料支持体12上に固定された試料1を提供するステップと、
(ii)マイクロ流体チャンバ40と、このマイクロ流体チャンバの一端にある少なくとも1つの流体入口32と、このマイクロ流体チャンバの他端にある少なくとも1つの流体出口34と、を含み、上記マイクロ流体チャンバ内部の流体物質および試薬を均一な方法で輸送するため、流体供給システム10からマイクロ流体チャンバ40を介して圧力下で供給される流体を導くように構成された、マイクロ流体装置8を提供するステップであって、マイクロ流体チャンバの少なくとも1つの壁が、試料支持体12によって形成され、マイクロ流体チャンバ40の他方の壁33にクランプ機構16によって流体密かつ取り外し可能な方法でシール42に対して取り付けられ、マイクロ流体チャンバの容積は2.5μLと200μlとの間である、ステップと、
(iii)試料1がマイクロ流体チャンバ40の内側に面する状態で、上記マイクロ流体チャンバと上記試料支持体とを流体密な方法で一緒に取り付けるステップと、
(iv)大気圧より高い圧力で温度制御抗原賦活化ステップS1を実行するステップであって、このステップは、
- 1.5から5バールの間に含まれるマイクロ流体チャンバ40における圧力Pchamberで流体入口32を介してエピトープ脱マスキング溶液でマイクロ流体チャンバ40を満たすステップと、
- マイクロ流体チャンバをインキュベーション温度設定点(TAR)まで加熱し、インキュベーション持続期間tiの間、マイクロ流体チャンバの温度を上記インキュベーション温度設定点に維持するステップと、
- 冷却持続期間tcの間、上記インキュベーション温度設定点未満かつ室温以上の冷却温度までマイクロ流体チャンバを冷却するステップと、
を含み、上記インキュベーション温度設定点TARは約60℃から200℃の間に含まれ、インキュベーション持続期間tiは約0.5から30分の間に含まれ、冷却持続期間tcは約1から30分の間に含まれる、ステップと、
を有利に含むことができる。
(v)少なくとも1つのイメージングプローブを含む複数の試薬を、約1μl/sと約100μl/sとの間の範囲の流量で、流体入口を介してマイクロ流体チャンバ内に順に注入するステップと、
(vi)上記少なくとも1つのイメージングプローブと反応した試料の成分によって放出される信号をイメージングするステップ(S4)と、
をさらに含み、
複数の試薬を順に注入する上記ステップは、
- 試料上に残っている可能性がある抗体のような望ましくない物質を先のサイクルから除去するために溶出緩衝液が注入される溶出ステップ(S2、S2')と、
- イメージングプローブが注入される試料標識化ステップ(S3'、S3''などを含むS3)と、
を含み、
これらのステップのそれぞれは、洗浄緩衝液が注入される任意選択の洗浄ステップによって先行される。
(vii)試料上に残っている可能性がある標識プローブ(たとえば抗体またはマーカー)のような望ましくない物質を除去するために溶出緩衝液が注入される溶出ステップ(S0)と、
(vi)さまざまなイメージングプローブでステップ(iv)とステップ(vii)とを繰り返すステップと、
をさらに含む。
- ブロッキング緩衝液が注入される任意選択のブロッキングステップ(S2')と、
- 前に注入されたブロッキング緩衝液が任意のフロー条件あり、またはなしでインキュベートされる任意選択のインキュベーションステップと、
- 洗浄緩衝液が注入される任意選択の洗浄ステップと、
- イメージングプローブが注入される試料標識化ステップ(S3)と、
- 前に注入されたイメージングプローブが任意のフロー条件あり、またはなしでインキュベートされる任意選択のインキュベーションステップと、
- 洗浄緩衝液が注入される洗浄ステップ(S3a)と、
- イメージング緩衝液が注入される任意選択のプレイメージングステップ(S4')と、
を含み、
試料標識化ステップは、標識プローブを直接、またはイメージングプローブにつながる一連の標識プローブのいずれかを注入するステップを含む。
- 約1μl/sと約100μl/sとの間の範囲の初期流量で試薬が注入される第1の流量ステップと、
- シーケンスにおける次の試薬を注入する前に、同じ試薬がより低流量(通常約0.001から約1.0μl/s)で注入され、その試薬の試料との十分な流れを確実にする、第2の流量ステップと、
を含む。
(実施例1)
連続的な試料標識化サイクルを実行するための可能な多重化プロトコルでのイン・サイチュ(in situ)抗原賦活化および免疫蛍光免疫染色
試料のイン・サイチュ(in situ)高圧温度制御抗原賦活化および免疫蛍光免疫染色のための本発明の方法が、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料上で図1に示したような装置において実施され、連続的な試料標識化サイクルを実行するための任意選択のサイクル多重化で図2に示したようなプロトコルに従う。
試料の種類および所望の用途に応じて、さまざまな種類の試料調製ステップを実現することができる。この例において、前に実行されたFFPE組織試料のための試料調製ステップを典型的な一例としてここで説明する。
まず、マイクロ流体チャンバ40は、自動化することができる流体送達制御システムを介して作動させることができる装置の試薬送達システムを介して、抗原賦活化のための媒体として適切な特性を有する溶液(抗原賦活化溶液)で満たされる(図2AのステップS1')。マイクロ流体チャンバ40内部の圧力は、圧力センサ(たとえばマノメータ)を含む生体試料処理装置の制御システムによって制御される流体供給システム10によって、大気圧より高い圧力値(Pchamber)で生成される(通常約1.5〜5バール、たとえば約2〜3バール)。
イン・サイチュ(in situ)高圧温度誘導抗原賦活化および免疫蛍光免疫染色シーケンス
本発明の方法の初期イン・サイチュ(in situ)高圧温度制御抗原賦活化ステップは、組織および試薬の調製後に開始することができる。
(i)マイクロ流体チャンバの温度が制御下で室温からインキュベーション温度設定点(TAR)まで加熱される制御された加熱期間と、
(ii)マイクロ流体チャンバの温度(Ti)がインキュベーション温度設定点(TAR)に維持されるインキュベーション期間と、
(iii)マイクロ流体チャンバの温度がインキュベーション温度設定点から冷却温度設定点まで冷却され、マイクロ流体チャンバの冷却は、自然冷却または能動冷却、すなわち制御下のいずれかであり得る、冷却期間と、
を含む温度制御プロトコルを介して制御される。
免疫染色/イメージングシーケンスの各サイクル(S2で始まる最初のサイクルを除く)は、溶出緩衝液を流すことによって組織試料をまず溶出させることで始まり、溶出緩衝液の組成およびpH条件は、試料上に残っている可能性がある望ましくない物質(たとえば抗体のような標識プローブ)を除去するための分析試料によって異なり得る。たとえば、0.05%のTritonX界面活性剤を補充したpH2での0.1Mのグリシン緩衝液を溶出緩衝液として用いることができる。
ブロッキング緩衝液(たとえばクエン酸ナトリウム緩衝液またはウシ血清アルブミンを含むPBS-Tween)が次いで、その後のステップにおいてタンパク質の非特異的結合を低下させるため、マイクロ流体チャンバを介してイメージング試薬シーケンスのシーケンスにおいて任意選択で流される。
イメージングプローブまたはイメージングプローブにつながる標識プローブが次いで、マイクロ流体チャネルを流れるイメージング試薬のシーケンスに導入される。たとえば、標識化プローブにつながる標識プローブのシーケンスは、一次抗体および次いで二次抗体(標識プローブ)が流れてインキュベートされながら、各ステップ間に洗浄緩衝液で試料を洗浄するシーケンスを含む。標識プローブの希釈率は、最適化されたプロトコルまたはベンダーの指示に応じて決定される。
このサイクルの終了後にイメージングが実行される。
以下のTable 1(表1)は、試料の調製(1、2)の、および図3に示すような染色画像につながる本発明の方法のステップS1からS4(3〜8)の一サイクルを試料に受けさせる例を示している。
(i)約2.5分で室温からインキュベーション温度設定点までマイクロ流体チャンバ40を制御加熱すること
(ii)インキュベーション温度設定点で試料をAR溶液と2から5分間インキュベートするためのインキュベーション期間
(iii)約2.5分から7分以内にインキュベーション温度設定点から室温に戻すマイクロ流体チャンバ40の能動冷却
本発明の方法を用いて、4つの異なるマーカー、HER2(ヒト上皮成長因子受容体2)、ER(エストロゲン受容体)、PR(プロゲステロン受容体)およびCK(サイトケラチン)を共発現する領域を有する試料(FFPE乳房切片)上でイン・サイチュ(in situ)高圧温度制御AR処理ステップを行い、以下のように本発明の方法に従って約2から3バールの圧力下において各ステップ間で標的エピトープが再活性化された。
HER2のためのFFPE乳房腫瘍切片のイン・サイチュ(in situ)抗原賦活化および蛍光免疫染色
以下のように2つの異なるプロトコルに従って標準的なスライド上に固定されたFFPE乳房切片からのHER2エピトープ活性化のために本発明の抗原賦活化方法を用いた。
本発明のイン・サイチュ(in situ)抗原賦活化方法とFFPE乳房腫瘍切片上の標準的な抗原賦活化との比較
本発明のイン・サイチュ(in situ)高圧温度制御AR処理方法を、FFPE乳房切片試料を用いた熱浴における標準的なAR手順と比較した。AR処理ステップ後、4つの異なるマーカー(HER2(ヒト上皮成長因子受容体2)、ER(エストロゲン受容体)、PR(プロゲステロン受容体)およびCK(サイトケラチン)の1つについて各試料を染色し、次いで画質およびコントラストを分析および比較した。
2 生体試料処理装置
4 支持機構
6 熱ユニット
8 マイクロ流体装置
9 基板
10 流体供給システム
12 試料支持体
14 ベース構造
16 クランプ機構
17 ヒンジリンケージ
18 クランププレート
19 スペーサ
20 観察通路
22 作動レバー機構
24 熱伝達ユニット
25 通路
26 加熱ユニット(ペルティエ素子)
28 冷却ユニット
30 冷却流体入口/出口
32 流体入口オリフィス
33 第1の面
34 流体出口オリフィス
35 第2の面
36 マイクロ流体入口チャネルネットワーク
37 チャンバ入口オリフィス
38 マイクロ流体出口チャネルネットワーク
39 チャンバ出口オリフィス
40 マイクロ流体チャンバ
42 シール
44 流体供給チャネル
46 流体出口チャネル
48 シール
50 取り付け装置
51 可動ピストン
53 圧縮空気入口
54 冷却ブロック
56 流体流チャネル
Claims (17)
- 試料支持体(12)上に固定された生体試料(1)のイン・サイチュ(in situ)温度誘導抗原賦活化のための方法であって、
a)前記試料支持体上に固定された前記生体試料を提供するステップと、
b)マイクロ流体チャンバ(40)と、前記マイクロ流体チャンバの一端にある少なくとも1つの流体入口(32)と、前記マイクロ流体チャンバの他端にある少なくとも1つの流体出口(34)と、を含み、流体供給システム(10)から前記マイクロ流体チャンバ(40)を介して圧力下で供給される流体を導くように構成された、マイクロ流体装置(8)を提供するステップであって、前記マイクロ流体チャンバの少なくとも1つの壁が、前記試料支持体によって形成され、前記マイクロ流体チャンバ(40)の第1の壁(33)にクランプ機構(16)によって流体密かつ取り外し可能な方法でシール(42)に対して取り付けられ、前記マイクロ流体チャンバの容積は2.5μLと200μlとの間である、ステップと、
c)前記生体試料(1)が前記マイクロ流体チャンバ(40)の内側に面する状態で、前記マイクロ流体チャンバと前記試料支持体とを流体密な方法で一緒に取り付けるステップと、
d)大気圧より高い圧力で温度制御抗原賦活化ステップS1を実行するステップであって、ステップS1は、
- 大気圧を超える前記マイクロ流体チャンバにおける圧力Pchamberで前記流体入口を介してエピトープ脱マスキング溶液で前記マイクロ流体チャンバを満たすステップと、
- 前記マイクロ流体チャンバをインキュベーション温度設定点(TAR)まで加熱し、インキュベーション持続期間tiの間、前記マイクロ流体チャンバの温度を前記インキュベーション温度設定点に維持するステップと、
- 冷却持続期間tcの間、前記インキュベーション温度設定点未満かつ室温以上の冷却温度まで前記マイクロ流体チャンバを冷却するステップと、
を含み、前記インキュベーション温度設定点TARは約60℃から200℃の間に含まれ、前記マイクロ流体チャンバにおける圧力Pchamberは1.5バールより大きく、前記インキュベーション持続期間tiは0.5から30分の間に含まれる、ステップと、
を含んでなることを特徴とする、方法。 - 前記冷却持続期間tcは1から30分の間に含まれることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記温度制御抗原賦活化ステップS1中の前記インキュベーション温度設定点TARは110℃から200℃の間に含まれることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 前記温度制御抗原賦活化ステップS1中の前記マイクロ流体チャンバにおける前記圧力Pchamberは約2.5から5バールの間に含まれることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インキュベーション持続期間tiは、2から20分の間、好ましくは2から15分の間に含まれることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載の方法を実施するステップを含むサイクル多重化による試料のイン・サイチュ(in situ)イメージングのための方法であって、
e)少なくとも1つのイメージングプローブを含む複数の試薬を、約1μl/sと約100μl/sとの間の範囲の流量で、前記流体入口を介して前記マイクロ流体チャンバ内へ順に注入するステップと、
f)前記少なくとも1つのイメージングプローブと反応した前記試料の成分によって放出される信号をイメージングするステップと、
g)さまざまなイメージングプローブでステップ(e)とステップ(f)とを繰り返すステップと、
をさらに含んでなることを特徴とする、方法。 - 請求項1から6のいずれか一項に記載の方法において用いるのに適した生体試料処理装置(2)であって、支持機構(4)、熱ユニット(6)、マイクロ流体装置(8)、加圧流体供給システム(10)、および制御システムを含み、
前記マイクロ流体装置(8)は、マイクロ流体チャンバ(40)であって、2.5μLと200μlとの間に含まれる容積と、前記マイクロ流体チャンバの一端にある少なくとも1つの流体入口(32)と、前記マイクロ流体チャンバの他端にある少なくとも1つの流体出口(34)と、を有する、マイクロ流体チャンバ(40)を含み、前記マイクロ流体チャンバ内部の前記生体試料と反応させるために前記マイクロ流体チャンバ(40)を介して流体を導くように構成され、前記マイクロ流体チャンバの少なくとも1つの壁が、前記試料支持体によって形成され、1.5バールより大きい、好ましくは2バールより大きい、特に2.5バールより大きい、より好ましくは3バールより大きい前記マイクロ流体チャンバにおける圧力Pchamberを収容するのに十分な程度まで前記試料支持体とマイクロ流体装置との間のシール(42)を圧縮するように構成されたクランプ機構(16)によって前記マイクロ流体チャンバ(40)の第1の壁(33)に流体密かつ取り外し可能な方法で前記シール(42)に対して取り付けられていることを特徴とする、生体試料処理装置。 - 前記マイクロ流体装置は、流体入口オリフィス(32)に接続されたマイクロ流体入口チャネルネットワーク(36)と、流体出口オリフィス(34)に接続されたマイクロ流体出口チャネルネットワーク(38)と、を中に含む光透過性材料の実質的に平坦な基板(9)の形態であり、前記流体入口オリフィス(32)と流体出口オリフィス(34)との両方が、前記基板のチャンバ境界側に対応する前記基板の第1の側(33)に開口していることを特徴とする、請求項7に記載の試料処理装置。
- 第1の面(33)と試料支持体(12)との間のチャンバの高さが、前記試料支持体上に配置された生体組織試料(1)に沿った試薬の移流輸送を保証するように構成された100μm未満であることを特徴とする、請求項7または8に記載の試料処理装置。
- 前記支持機構(4)はベース構造(14)および前記クランプ機構(16)を含み、前記クランプ機構は、顕微鏡で透明基板を介して前記生体試料を見ることを可能にする窓(20)を備えたクランププレート(18)を含むことを特徴とする、請求項7から9のいずれか一項に記載の試料処理装置。
- 前記マイクロ流体装置(8)は、前記マイクロ流体装置のチャンバ側(33)およびシール(42)が前記試料支持体(12)に対向するとともに前記生体試料(1)を覆って下向きの状態で、前記試料支持体(12)の上部に配置されていることを特徴とする、請求項7から10のいずれか一項に記載の試料処理装置。
- 加圧下流体供給システム(10)は、ベース構造に取り付けられた流体供給チャネル(44)および流体出口チャネル(46)を含み、それぞれが、前記クランプ機構の可動クランププレート(18)に面するそのオリフィス端でシール(48)を含み、前記シールは、それぞれ前記マイクロ流体装置の流体入口オリフィス(32)、流体出口オリフィス(34)の周囲の位置で、前記マイクロ流体装置の基板(9)のチャンバに面する側(33)に対して圧縮され、圧縮下の前記シールは、少なくとも1.5バール、好ましくは2バールより大きい、特に2.5バールより大きい、より好ましくは3バールより大きい圧力を支持するように構成されていることを特徴とする、請求項7から11のいずれか一項に記載の試料処理装置。
- 前記熱ユニット(6)は、前記試料支持体(12)の位置より下のベース構造(14)に取り付けられ、前記熱ユニットは、前記試料支持体に熱を伝導し、前記試料支持体のすぐ下に配置されている熱伝達ユニット(24)に任意選択で取り付けられた、たとえばペルティエ素子または複数の積み重ねられたペルティエ素子を含む加熱ユニット(26)を含むことを特徴とする、請求項7から12のいずれか一項に記載の試料処理装置。
- 前記熱ユニットは、たとえば、冷却流体が流れる流体流チャネル(56)のラビリンスを含んで、前記試料支持体(12)の能動冷却を提供する冷却ブロック(54)の形態の冷却ユニット(28)をさらに含むことを特徴とする、請求項7から13のいずれか一項に記載の試料処理装置。
- 前記試料支持体(12)または前記マイクロ流体装置(8)における、および/または加熱ユニット(26)および/または熱伝達ユニット(24)における温度を測定するように構成されたベース構造(14)および/またはクランププレート(18)に統合された1つまたは複数の温度センサをさらに含み、前記1つまたは複数の温度センサは、前記熱ユニットの動作を制御するように構成された温度制御システムの一部を形成していることを特徴とする、請求項7から14のいずれか一項に記載の試料処理装置。
- 前記試料支持体(12)を前記マイクロ流体装置(8)に対して下から押して、前記マイクロ流体装置と試料支持体との間で圧縮された前記シール(42)によるクランプおよび流体封止を改善する調整可能なピストン機構(51)を含むクランプ装置をさらに含むことを特徴とする、請求項7から15のいずれか一項に記載の試料処理装置。
- 前記ピストン機構は、圧縮ガス、たとえば圧縮空気によって作動することを特徴とする、請求項16に記載の試料処理装置。
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