CN110845566B - 达玛烷三萜糖苷化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类达玛烷三萜糖苷化合物及其制备方法和用途。所述的达玛烷三萜糖苷化合物具体为3个从茜草科茜草属植物华腺萼木(Mycetia sinensis(Hemsl.)Craib)中分离得到的化合物。申请人的试验表明，本发明所述的式2所示结构的达玛烷型三萜皂苷具有甜味，其甜度约为蔗糖的200倍，可用作甜味剂，应用于食品、医药等各种行业。
Description
技术领域
本发明涉及从植物中提取分离的活性成分，具体涉及茜草科茜草属植物华腺萼木中提取的达玛烷三萜糖苷化合物及其制备方法和用途。
背景技术
达玛烷型皂苷属于四环三萜类皂苷，是人参、三七、西洋参和绞股蓝等名贵中药材中的重要特征生物活性成分，现代研究表明，达玛烷皂苷具有调节免疫力、抗肿瘤、抗衰老、抗老年痴呆、保护肝肾、抗糖尿病、抗高脂血症、抗心脑血管病、抗神经退行性疾病、抗骨质疏松症、抗抑郁等多种药理作用。目前，已经发现天然存在的达玛烷型三萜化合物200余种，分布于五加科、桦木科、菊科、葫芦科、鼠李科、玄参科、椴树科、山茶科、胡桃科等40余种植物。达玛烷结构为从环氧鲨烯由全椅式构象形成达玛烷骨架，在其C-3位有羟基取代，且为β-构型。此外，C-13位连有β-H，C-8、C-10位有β-CH3，C-14位有α-CH3，C-17位有β-侧链。新的达玛烷化合物，对丰富天然化合物的种类与来源，对开发新的健康产品、天然药物有重要意义。
目前，世界各国科学家们都在开发研究纯天然、甜度高而能量低的甜味剂，以期部分替代蔗糖制作食品。纯天然非糖类甜味剂，在食品工业、大健康产业等方面取得了广泛的应用。可广泛应用于糕点、饮料、罐头、医药、烟草、牙膏、啤酒、酱制品等方面。由于天然甜味剂的低热值，不会产生增加胆固醇的影响，不致龋齿，因此心血管、肥胖、糖尿病等患者均可饮用，老少皆宜。除应用于食品工业外，还用于医药工业作矫味剂(矫正某些药物的异殊、怪味)和辅料(片剂、丸剂、胶囊等)。利用高甜度的天然糖苷与低甜度的低聚糖等互相搭配，取长补短，可以生产出色香味俱佳又甜度适中的保健复合甜味剂。
甜叶菊、罗汉果与甜茶并称为三大甜味植物，其甜味素分别为甜菊苷(Stevioside)、罗汉果苷(Mogroside)、甜茶素(Rubusoside)，甜度均相当于蔗糖的300倍左右。其中：
甜菊苷是一种贝壳松烯类四环二萜配糖体，其分子式为C38H60O18。甜菊苷的特色是资源丰富，还有报道可用于高血压、糖尿病的辅助治疗。目前甜菊苷产量超过5000吨，预计到2022年产值达到7.715亿美元。缺点是甜菊糖带有天然的轻微苦味或青草味，现有技术还无法完全去除或者掩盖，这使得饮料和食品行业还不敢轻易地完全用甜菊糖来简单替换白糖。
罗汉果甜苷主要是罗汉果苷IV和罗汉果苷V，为葫芦烷类四环三萜配糖体，分子式分别为C54H92O24和C60H102O29。罗汉果为我国药食两用植物，我国具有丰富的植物来源，有悠久的应用传统。现代药理学研究发现,罗汉果甜苷具有降血糖、抗氧化、保肝、降脂减肥、润肠通便、抗炎和调节免疫等生理活性，具有较好的功能健康型大健康产品的基础。目前，罗汉果的种植规模已经超过12万亩，罗汉果甜苷产量已经超过400吨。原料局限于果实，且受种植环境限制，原料供应不足是目前限制全球罗汉果甜苷行业扩大规模的主要因素。
甜茶苷与甜菊苷类似，是一种贝壳松烯类四环二萜配糖体，其分子式为C32H50O12，均由相同甙元组成，其区别仅在C13位上少接一分子葡萄糖。甜茶苷的优点是口感佳、味质好、对肥胖症、糖尿病、心血管病、高血压、动脉硬化、龋齿等患者有一定的辅助疗效。甜茶苷可以通过生物技术由甜菊苷制备，既消除了甜菊苷的后苦味，又获得了甜茶苷良好的口感。
天然非糖甜味剂尚远未能满足人们的需求，新的功能性的天然非糖甜味剂如达玛烷型三萜类(Dammarane triterpenoids)天然甜味剂更是人们梦寐以求的目标。目前也尚未见有茜草属植物华腺萼木Mycetia sinensis(Hemsl.)Craib中含有达玛烷型三萜皂苷且将作为甜味剂的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供三例结构新颖的达玛烷三萜糖苷化合物及其制备方法和用途。
本发明所述的达玛烷三萜糖苷化合物为具有下述式1-3所示结构的化合物或其药学上可接受的盐：
上述式1所示结构的化合物的化学名称为：达玛-20(22)-烯-3，21-二醇-3-O-(β-D-吡喃葡萄糖基(1→2))-β-D-吡喃葡萄糖苷，英文名称：Dammar-20(22)-en-diol-3-O-(β-D-glucopyranyl-(1→2))-β-D-glucopyranoside。分子式为C42H72O14，[M-H]-799.48，[M+H]801.50，平均分子量801.01。理化性质如下：浅黄色无定型粉末，无臭，易溶于水，吡啶，可溶于甲醇、乙醇，难溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿、环己烷、石油醚。本申请中命名为达玛甜茶苷II(Mycetioside II)，在本申请中也称为化合物1。
上述式2所示结构的化合物化学名称为：达玛-20(22)-烯-3，21-二醇-3-O-((β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6))-β-D-吡喃葡萄糖苷，英文名称：Dammar-20(22)-en-diol-3-O-((β-D-glucopyranyl-(1→2))-(β-D-glucopyranyl-(1→6))-β-D-glucopyranoside。分子式为C48H82O19，[M-H]-961.54，[M+H]963.55，平均分子量963.15。理化性质如下：浅黄色无定型粉末，无臭，易溶于水，吡啶，可溶于甲醇、乙醇，难溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿、环己烷、石油醚。本申请中命名为达玛甜茶苷III(Mycetioside III)，在本申请中也称为化合物2。
上述式3所示结构的化合物化学名称为：达玛-20(22)-烯-3，21-二醇-3-O-((β-D-吡喃葡萄糖基(1→2))-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6))-β-D-吡喃葡萄糖苷-21-O--β-D-吡喃葡萄糖苷，英文名称：Dammar-20(22)-en-diol-3-O-((β-D-glucopyranyl-(1→2))-(β-D-glucopyranyl-(1→6))-(β-D-glucopyranoside)-21-O-β-D-glucopyranoside。分子式为C54H92O24，[M-H]-1123.07，[M+H]1125.09，平均分子量1125.29。理化性质如下：浅黄色无定型粉末，无臭，易溶于水，吡啶，可溶于甲醇、乙醇，难溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿、环己烷、石油醚。本申请中命名为达玛甜茶苷IV(Mycetioside IV)，在本申请中也称为化合物3。
本发明还提供上述达玛烷三萜糖苷化合物的制备方法，主要包括以下步骤：
1)以茜草科茜草属植物华腺萼木(Mycetia sinensis(Hemsl.)Craib)的枝和/或叶为原料，获取其提取物；
2)所得提取物上高速逆流色谱仪进行分离，分段收集流分，以UPLC-MS(超高效液相色谱-质谱联用仪)检识并合并流分，回收溶剂，分别得到白色粉末状逆流色谱纯化物A003、胶状逆流色谱纯化物A004和胶状逆流色谱纯化物A005；其中白色粉末状逆流色谱纯化物A003即为式1所示结构的化合物；其中，
进行高速逆流色谱分离时的固定相和流动相为水与选自以下有机溶剂中的一种或两种以上的选择组成的、对达玛烷皂苷分配系数在0.2～10之间的两相体系：
酯类溶剂、醇类溶剂、酮类溶剂、醚类溶剂、卤代烃类溶剂、烷烃类溶剂、腈类溶剂、酸类溶剂；
3)所得胶状逆流色谱纯化物A004和胶状逆流色谱纯化物A005分别上反相色谱柱层析，以乙腈和水组成的混合溶剂作为流动相进行分离，分别得到式2所示结构的化合物和式3所示结构的化合物。
上述制备方法的步骤1)中，通常是以水和/或低碳醇为溶媒对茜草科茜草属植物华腺萼木的枝和/或叶进行提取，以获取华腺萼木的提取物；其中所述华腺萼木的枝和/或叶可以是新鲜的或干燥的。所述的低碳醇具体可以是体积浓度为10～100％甲醇或体积浓度为10～100％乙醇，优选为体积浓度为50～100％甲醇或体积浓度为50～100％乙醇。在提取时的操作(如提取的方式、提取的时间)等均与现有相同，优选采用加热提取或回流提取。
上述制备方法的步骤2)中，在进行高速逆流色谱分离时的固定相和流动相的溶剂中，所述的酯类溶剂优选为选自醋酸乙酯、醋酸丁酯和醋酸戊酯中的一种或两种以上的组合；所述的醇类溶剂优选为选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇和2-戊醇中的一种或两种以上的组合；所述的酮类溶剂优选为选自丙酮、丁酮、环戊酮、甲基异丁酮和环己酮中的一种或两种以上的组合；所述的醚类溶剂优选为选自乙醚、甲基叔丁基醚、二氧六环、四氢呋喃中的一种或两种以上的组合；所述的卤代烃类溶剂优选为选自二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯化碳中的一种或两种以上的组合；所述的烷烃类溶剂优选为选自正己烷、正庚烷、异辛烷、石油醚(包括沸程30-60℃的石油醚和沸程为60-90℃的石油醚)、汽油中的一种或两种以上的组合；所述的腈类溶剂优选为乙腈；所述的酸类溶剂优选为选自甲酸和/或乙酸。
上述制备方法的步骤2)中，由于高速逆流色谱两相溶剂体系的配比与两相比例相关，因此两相溶剂的总组成比例可根据上下两相的比例做出改变，而不影响上相的组成或者下相的组成，不影响两相溶剂的分配系数。本申请人的试验结果表明，进行高速逆流色谱分离时的固定相和流动相优选选择为以下几种：
(1)优选为乙酸乙酯-醇-水组成的两相体系，其中醇为选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇和2-戊醇中的一种或两种以上的组合；其中当其中的醇为单一的选择(如为单一的乙醇或丁醇)时，在两相体系中所述乙酸乙酯、醇和水的体积比为E：1：W或E：2：W，其中E和W为0.5～20之间相等或不等的数值；进一步的，E优选为1～10之间的数值，更优选为2～5之间的数值；W优选为2～10之间的数值，更优选为3～6之间的数值。更进一步的，优选为乙酸乙酯-乙醇-水(3:2:5)，乙酸乙酯-乙醇-水(4:2:5，体积比)，乙酸乙酯-甲醇-水(3:2:5，体积比)，乙酸乙酯-甲醇-水(4:2:5，体积比)，乙酸乙酯-丁醇-水5:1:6，体积比)，乙酸乙酯-丁醇-水(4:1:5，体积比)，乙酸乙酯-丁醇-水(3:1:4，体积比)，乙酸乙酯-丁醇-水(2:1:3，体积比)，乙酸乙酯-丁醇-水(3:2:5，体积比)，乙酸乙酯-丁醇-水(2:3:5，体积比)、乙酸乙酯-丁醇-水(4:2:5，体积比)。当其中的醇的选择为两种以上的组合时，优选固定相和流动相为由乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水按3:1:1:4和3:1:1:5的体积比组成的两相体系、由乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水按3:1:1:4和3:1:1:5的体积比组成的两相体系。
(2)正己烷-丁醇-水组成的两相体系，其中正己烷、丁醇和水的体积比为3:4:5，4:4:5或5:4:5。
以上比例为两相溶剂体系的比例，这种比例可根据上下相的体积或体积比作出改变，也可在此基础上适当调整，相关改变或调整均在本申请的要求范围内。如，乙酸乙酯：正丁醇：乙醇：水3:1:1:5体积比的两相体系，上相组成比例接近2.81:0.91:0.65:0.77的体积比，下相接近0.19:0.09:0.35:4.23的体积比，两相总组成的比例随着上下相的比例改变而改变。
上述制备方法的步骤2)中，进行高速逆流色谱分离的溶剂体系，可以是上相为固定相，下相为流动相；也可以是下相为固定相，上相为流动相。在进行高速逆流色谱仪分离时，温度通常为10～35℃，主机为正转，也可为反转，转速优选为750～900rpm，流速优选为0.5～15.0mL/min。高速逆流色谱取待分离样品的准备、上样、分段收集流分等操作均与现有技术相同。优选如下：
高速逆流色谱取待分离样品的准备：取经过或不经初步纯化的提取物干品，称重，取上相溶液或下相溶液，或上下相均有的溶液，体积相当于干品质量数的100～1000倍量，溶解干品，离心取上清液，即得。
取不超过高速逆流色谱仪进样环体积的待分离样品，进样注入高速逆流色谱仪，每5～15mL收集1个流分；UPLC-MS检测或TLC检测，分别合并其中含有不同达玛烷皂苷化合物的流分，减压回收溶剂，得到逆流色谱纯化物。
上述制备方法的步骤3)中，所述的反相色谱柱通常为C18制备/半制备色谱柱。在对已经进样胶状逆流色谱纯化物A004的反相色谱柱进行洗脱时，流动相组成中乙腈和水的体积比为5：95～50：50，优选为5：95～40：60；优选按以下操作：以流动相乙腈-水体积比为5:95～20:80为初始浓度，8～20分钟升至30:70～40:60，在此条件下，进样，分离精制，190～280nm波长检测，总运行时间9～20min，收集单峰洗脱液。在对已经进样胶状逆流色谱纯化物A005的反相色谱柱进行洗脱时，流动相组成中乙腈和水的体积比为5：95～50：50，优选为5：95～30：70；优选按以下操作：以流动相乙腈-水体积比为5:95～15:85为初始浓度，设置梯度8～20分钟升至18:82～30:70，在此条件下，进样，分离精制，190～280nm波长检测，总运行时间9～20min，收集单峰洗脱液。在进样时，是将样品用甲醇溶解配成质量浓度为0.1～20mg/mL的溶液。
为了减轻高速逆流色谱仪的负担，优选是对步骤1)所得提取物进行初步纯化后再上高速逆流色谱仪进行分离。所述的初步纯化操作具体可以是将提取物进行大孔树脂柱层析和/或萃取操作，具体的：
当采用大孔树脂柱层析进行纯化时，所述的大孔树脂为能吸附分离达玛烷皂苷的药用级大孔吸附树脂，优选的型号为Amberlite XAD16、X-5、AB-8或DA101等。在对大孔树脂柱进行洗脱时，通常采用醇/水按0：100～95：5的混合溶剂进行梯度洗脱，收集含有达玛烷三萜皂苷的部分，优选是收集醇/水按50：50的体积比组成的混合溶剂进行洗脱的部分。其中的醇为甲醇或。
当采用萃取操作进行纯化时，包括除杂质萃取和/或达玛烷皂苷萃取。对于杂质萃取，优选采用石油醚或正己烷萃取去除叶绿素、甾醇等杂质。对于达玛烷皂苷萃取，优选采用正丁醇或者是含正丁醇的混合溶剂将达玛烷皂苷转移到有机溶剂中。
上述制备方法的步骤2)中所得的白色粉末状逆流色谱纯化物A003的纯度达95％以上(HPLC检测)，如需要进一步提高其纯度，则可将A003上反相色谱柱层析，以甲醇和水组成的混合溶剂作为流动相进行分离，以得到纯化后的式1所示结构的化合物。其中，在流动相组成中甲醇和水的体积比优选为70:30～80:20。具体的操作为：以体积比为70:30～80:20的甲醇-水作为流动相，进样，分离精制，190～280nm波长检测，总运行时间9～20min，收集单峰洗脱液。在进样时，是将样品用甲醇溶解配成质量浓度为0.1～20mg/mL的溶液。
本申请人在试验中发现，上述式2所示结构的化合物具有甜味，其甜度约为蔗糖的200倍。因此，本发明还包括上述式2所示结构的化合物在制备甜味剂中的应用。进一步的，本发明还包括一种甜味剂，其含有上述式2所示结构的化合物。
与现有技术相比，本发明采用高速逆流色谱结合反相制备色谱分离技术，首次从茜草属植物华腺萼木(Mycetia sinensis(Hemsl.)Craib)枝叶分离得到一系列三萜皂苷单体，并确定为达玛烷型三萜皂苷类成分。进一步的，本申请人发现其中式2所示结构的达玛烷型三萜皂苷具有甜味，其甜度约为蔗糖的200倍，因此，式2所示结构的化合物可用作甜味剂应用于食品、医药等各种行业。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：化合物1、2、3的制备
1)获取提取物
称取华腺萼木Mycetia sinensis(Hemsl.)Craib(广西甜茶)干枝叶1Kg，粉碎，加入8倍重量的95％(体积)乙醇，加热回流60min提取，过滤，收集滤液。滤渣再次加入8倍重量的95％(体积)乙醇，加热回流60min提取，过滤。合并滤液，滤液在60℃下用旋蒸仪减压蒸发浓缩至2L。浓缩液加甲醇2L，用石油醚萃取2次，每次用量2L，收集下相，石油醚相回收溶剂后弃去，下相于60℃下旋蒸至2L，得提取液A001。
2)提取物的初步纯化
取提取液A001，上X-5大孔吸附树脂柱
上毕，依次用水、20％(体积)乙醇-水、50％(体积)乙醇-水、95％(体积)乙醇梯度洗脱。LC-MS分析表明50％(体积)乙醇洗脱部分含有达玛烷三萜皂苷化合物1、2、3。将50％(体积)乙醇洗脱液合并，浓缩，减压蒸干得浸膏A002。
3)高速逆流色谱分离
3.1)量取乙酸乙酯600mL、正丁醇200mL、95％(体积)乙醇210.5mL、纯水789.5mL，配制体积比为3:1:1:4的混合溶液，充分振摇后静置0.5h，上下两层完全分层澄清，分离上下层，得到上相溶液与下相溶液，分别超声脱气10min，备用；
3.2)取浸膏A002 1.0g，取步骤3.1)的下相溶液15mL，溶解A002，溶液离心，取上清液备用；
3.3)取步骤3.1)的上相溶液作固定相，泵入高速逆流色谱仪分离管，待固定相充满整个分离管后，调节主机为正转，至最大转速(900r/min)，同时将步骤3.1)的下相溶液作流动相泵入，待流动相从柱口流出且固定相不流出，两相溶剂在分离管中达到动态平衡后,取步骤3.2)的上清液15mL，注入进样阀，流速2mL/min的条件下，210nm波长下检测，分离样品，总分离时间350min，每5min收集1个流分。用真空离心浓缩仪将各流分旋干，不同流分分别呈浸膏状、胶状物状、白色固体粉末状。分别取各流分不同形态旋干物1mg，以色谱醇甲醇溶解，UPLC-MS检测。其中流分51～53呈白色粉末状(A003，46.3mg)，为分子量[M-H]-799.48的化合物(即化合物1)，经HPLC检测，纯度为95.2％。流分32～35呈胶状(A004)，含分子量[M-H]-为961.54的化合物(即包含化合物2)；流分28～31(A005)也呈胶状，主含分子量[M-H]-为1123.60的化合物(即包含化合物3)。
4)反相制备色谱分离
4.1)取步骤3)所得的胶状物A004 120mg，加10％(体积)乙腈-水4ml溶解成质量浓度为20mg/mL的溶液A006，备用；
4.2)利用半制备型高效液相色谱仪，采用C18制备色谱柱(10mm×250mm，5μm)，设置流动相乙腈(A相)-水(B相)体积比为30:70,10～12分钟的体积比为36:64，流速3mL/min，梯度洗脱，12～20分钟以乙腈(A相)-水(B相)体积比为30:70的流动相平衡柱子。在此条件下，取步骤1)的溶液A006，每次进样90uL，210nm波长检测，分离样品，总运行时间20min，收集8.3～9.2min的色谱峰。重复42次进样，合并收集液，减压浓缩至大约2ml，冻干得到淡黄色无定形粉末30.2mg(A007)，经HPLC检测，纯度为96.7％，为化合物2；
4.3)取步骤3)所得的胶状物A005 90mg，加10％乙腈-水3ml溶解成质量浓度为大约20mg/mL的溶液A008，备用
4.4)利用半制备型高效液相色谱仪，采用C18制备色谱柱(10mm×250mm，5μm)，设置流动相乙腈(A相)-水(B相)体积比为10:90，10～12分钟的体积比为20:90，流速3mL/min，梯度洗脱，12～20分钟以乙腈(A相)-水(B相)体积比为10:90的流动相平衡柱子。在此条件下，取步骤3)的溶液A008，每次进样80uL，210nm波长检测，分离样品，总运行时间20min，收集8.9～10.0min的色谱峰。重复36次进样，合并收集液，减压浓缩至大约2ml，冻干得到淡黄色无定形粉末9.5mg(A009)，经HPLC检测，纯度为95.6％，为化合物3。
实施例2：化合物1的结构表征
对实施例1所得白色无定形粉末A003进行表征：
Mycetioside II：白色无定型粉末；UV(MeOH)λmax 190nm(末端吸收)；1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR数据见表1；电喷雾高分辨质谱(负离子模式)HRESIMS m/z 799.4811[M-H]-，分子式C42H72O14，计算值799.4844，分子量801.01，不饱和度7。
表1：所得白色粉末A003的1H NMR和13C NMR数据
因此，可确定实施例1所得白色粉末为化合物1，即达玛甜茶苷II(以下Mycetioside II)，其结构如下式1所示，该结构得到核磁共振谱Selective-TOCSY、HSQC、HMBC的确证。
实施例3：化合物2的结构表征
对本实施例1所得淡黄色无定形粉末A007进行表征：
Mycetioside III：淡黄色无定型粉末；UV(MeOH)λmax 190nm(末端吸收)；1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR数据见表2；电喷雾高分辨质谱(负离子模式)HRESIMS m/z961.5407[M-H]-，分子式C48H82O19，计算值961.5450，分子量963.15，不饱和度8。
表2：所得淡黄色粉末A007的1H NMR和13C NMR数据
注：溶剂为氘代甲醇，氢谱500MHz，碳谱125MHz。
因此，可确定实施例1所黄色无定形粉末为化合物2，即达玛甜茶苷III(Mycetioside III)，其结构如下述式2所示，该结构得到核磁共振谱Selective-TOCSY、HSQC、HMBC的确证：
实施例4：化合物3的结构表征
对实施例1所得淡黄色无定形粉末A009进行表征：
Mycetioside IV：淡黄色无定型粉末；UV(MeOH)λmax 190nm(末端吸收)；1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR数据见表3；电喷雾高分辨质谱(负离子模式)HRESIMS m/z1123.5908[M-H]-，分子式C54H92O24，计算值1123.5979，分子量1125.29，不饱和度9。
表3：所得淡黄色粉末A009的1H NMR和13C NMR数据
注：溶剂为氘代甲醇，氢谱500MHz，碳谱125MHz。
因此，可确定实施例1所淡黄色无定形粉末为化合物3，即达玛甜茶苷IV(Mycetioside IV)，其结构如下式3所示，该结构得到核磁共振谱Selective-TOCSY、HSQC、HMBC的确证：
实施例5：化合物1、2、3的制备
重复实施例1，不同的是：
步骤1)中，提取溶媒改为无水甲醇。
步骤2)中，大孔树脂的型号改为DA101，上样完成后，洗脱时依次用水、20％(体积)甲醇-水、50％(体积)甲醇-水、100％(体积)甲醇梯度洗脱，收集50％(体积)甲醇洗脱液，浓缩，减压蒸干。
步骤3.1)中，量取乙酸乙酯933mL、正丁醇358mL、食用酒精901mL、纯水8808mL配制体积比为2.61:1.00:2.52:24.63的混合溶液(总体积为11000mL)。
步骤3.3)中，UPLC-MS检测改为TLC检测，具体方法是分别取各流分不同形态旋干物1mg，以分析醇甲醇溶解，并以实施例1所得化合物1、化合物2、化合物3为对照品，各样品在硅胶G板(MERCK Silica gel 60F 20×20)上点样，以氯仿：甲醇：水65:35:10(下层)展开，喷以10％H2SO4乙醇液(V/V)110℃加热10分钟显色，与对照品具有同样展开距离棕红色斑点的流分。其中流分52～56呈白色粉末状(A003)，TLC斑点与化合物1位置相同。流分37～39呈胶状(A004)，TLC斑点与化合物2位置相同；流分30～34(A005)也呈胶状，TLC斑点与化合物3位置相同。
最终得到白色粉末52.3mg(A003)、淡黄色无定形粉末32.4mg(A007)和淡黄色无定形粉末8.7mg(A009)。
本实施例所得产物分别采用HRESIMS、1HNMR进行表征，确定白色粉末A003为化合物1，淡黄色无定形粉末A007为化合物2，淡黄色无定形粉末A009为化合物3。经HPLC检测，A003纯度为96.3％，，A007纯度为97.2％，A009纯度为95.3％。
实施例6：化合物1、2、3的制备
重复实施例1，不同的是：
步骤1)中，提取溶媒改为水。
步骤2)中，大孔树脂的型号改为AB-8。
步骤3.1)中，量取乙酸乙酯600mL、正丁醇200mL、食用酒精200mL、纯水1000mL，配制体积比为3:1:1:5的混合溶液(总体积为2000mL)。
步骤3.3)中，取步骤3.1)的下相溶液作固定相，取步骤3.1)的上相溶液作流动相。经后续的检测，流分16～19呈白色粉末状(A003)，为分子量[M-H]-为799.48的化合物。流分25～27呈胶状(A004)，为含分子量[M-H]-为961.55的化合物；流分28～31(A005)也呈胶状，主含分子量[M-H]-为1123.60的化合物。
最终得到白色粉末38.6mg(A003)、淡黄色无定形粉末25.8mg(A007)和淡黄色无定形粉末7.3mg(A009)。
本实施例所得产物分别采用HRESIMS、1HNMR、13CNMR进行表征，确定白色粉末A003为化合物1，淡黄色无定形粉末A007为化合物2，淡黄色无定形粉末A009为化合物3。经HPLC检测，A003纯度为96.5％，A007纯度为98.0％，A009纯度为96.0％。
实施例7：化合物1、2、3的制备
重复实施例1，不同的是：
步骤2)按下述操作进行：
取提取液A001，用正丁醇萃取，收集正丁醇相，回收溶剂，得到浸膏A002。
步骤3.1)中，两相体系是由乙酸乙酯、乙醇、正丁醇和水按3.78:1.24:1.00:1.70的体积比组成，总体积为11000mL。
步骤3.3)中，经检测，流分51～53呈白色粉末状(A003，46.3mg)，为分子量[M-H]-为799.48的化合物；流分32～35呈胶状(A004)，含分子量[M-H]-为961.55的化合物；流分28～31也呈胶状(A005)，主含分子量[M-H]-为1123.60的化合物。
最终得到白色粉末42.6mg(A003)、淡黄色无定形粉末29.7mg(A007)和淡黄色无定形粉末7.8mg(A009)。
本实施例所得产物分别采用HRESIMS、1HNMR进行表征，确定白色粉末A003为化合物1，淡黄色无定形粉末A007为化合物2，淡黄色无定形粉末A009为化合物3。经HPLC检测，A003纯度为97.6％，A007纯度为97.1％，A009纯度为95.1％。
实施例8：化合物2高速逆流色谱溶剂体系的选择
取实施例5-7所得化合物2(Mycetioside II)10.0mg，加纯水10ml溶解，制备成0.10％的溶液A010。
在13ml具塞离心试管中，以A010代替下表中的水，配制如表4的溶剂体系，振摇混合，静置分层，分别抽取上下层300微升，依次置于不锈钢小勺中，用电吹风吹干，然后以纯水复溶，入口尝试甜度。根据上下相甜度，再优化调整溶剂比例，得到上下相甜度大致均等的溶剂体系为优选溶剂体系。6号、10号溶剂体系上相比下相甜，在6号的基础上增加乙酸乙酯比例为乙酸乙酯：正丁醇：水4:4:5，将正丁醇换成乙醇效果相似，换成甲醇效果也相似；在10号的基础上增加正己烷的比例为正己烷：正丁醇：水4:4:5，上下相甜度大致均等，得到优选溶剂体系如表5。
表4化合物2高速逆流色谱溶剂体系的初步选择
表5化合物2高速逆流色谱优选溶剂体系
| 正己烷 | 乙酸乙酯 | 正丁醇 | 乙醇 | 甲醇 | 水 | |
| 1 | 4 | 2 | 5 | |||
| 2 | 4 | 2 | 5 | |||
| 3 | 4 | 2 | 5 | |||
| 4 | 4 | 4 | 5 | |||
| 5 | 3 | 1 | 1 | 5 | ||
| 6 | 3 | 1 | 1 | 5 | ||
| 7 | 3 | 1 | 1 | 4 | ||
| 8 | 3 | 1 | 1 | 4 |
实施例9：化合物2的制备
重复实施例1，不同的是：
步骤3.1)中，两相体系是由乙酸乙酯、正丁醇和水按4:2:5的体积比组成(总体积为2200mL)。
步骤3.3)中，取步骤3.1)的下相溶液作固定相，取步骤3.1)的上相溶液作流动相，只关注精确分子量[M-H]-963.15的化合物。流分32～35呈胶状(A004)，含分子量[M-H]-963.15的化合物。
步骤4.2)中，重复进样次数改为10次，省略步骤4.3)和4.4)。
最终得到淡黄色无定形粉末6.8mg(A007)。
本实施例所得产物经HRESIMS、1HNMR进行表征，确定淡黄色无定形粉末A007为化合物2，经HPLC检测，纯度为97.0％。
实施例10：化合物2的制备
重复实施例9，不同的是：
步骤3.1)中，两相体系是由乙酸乙酯、乙醇和水按4:2:5的体积比组成(总体积为2200mL)
步骤3.3)中，流分34～36呈胶状(A004)，含分子量[M-H]-963.15的化合物。
最终得到淡黄色无定形粉末7.2mg(A007)。
本实施例所得产物HRESIMS、1HNMR进行表征，确定淡黄色无定形粉末A007为化合物2。经HPLC检测，纯度为96.2％。
实施例11：化合物2的制备
重复实施例9，不同的是：
步骤3.1)中，两相体系是由乙酸乙酯、甲醇和水按4:2:5的体积比组成(总体积为2200mL)。
步骤3.3)中，流分30～33呈胶状(A004)，含分子量[M-H]-963.15的化合物。
最终得到淡黄色无定形粉末7.0mg(A007)。
本实施例所得产物HRESIMS、1HNMR进行表征，确定淡黄色无定形粉末A007为化合物2。经HPLC检测，纯度为97.2％。
实施例12：化合物2的制备
重复实施例9，不同的是：
步骤3.1)中，两相体系是由正己烷、正丁醇和水按4:4:5的体积比组成，总体积为2600mL。
步骤3.3)中，流分37～39呈胶状(A004)，含分子量[M-H]-963.15的化合物。
最终得到淡黄色无定形粉末7.3mg(A007)。
本实施例所得产物HRESIMS、1HNMR进行表征，确定淡黄色无定形粉末A007为化合物2。经HPLC检测，纯度为96.4％。
实施例13：化合物2的制备
重复实施例9，不同的是：
步骤1.1)中，配制两相体系为：量取乙酸乙酯600mL、正丁醇200mL、甲醇200mL、纯水800mL，配制体积比为3:1:1:4的混合溶液(总体积为1800mL)。
步骤3.3)中，流分27～30呈胶状(A004)，含分子量[M-H]-963.15的化合物。
最终得到淡黄色无定形粉末6.9mg(A007)。
本实施例所得产物HRESIMS、1HNMR进行表征，确定淡黄色无定形粉末A007为化合物2。经HPLC检测，纯度为98.3％。
实施例14：化合物1、2、3的甜度测定
参照菊糖苷GB8270-1999中甜度的测定方法进行测定。
1)用天平秤取蔗糖2g,用纯净水溶解，装入100ml容量瓶中，加水至刻度，制成2％蔗糖溶液。
2)用天平秤取待测化合物(化合物1、2、3，按实施例1所述方法制得)，以100ml容量瓶和纯净水，分别制成20mg/100ml、10mg/100ml、8.0mg/100ml、6.7mg/100ml的溶液。
3)对比品尝蔗糖溶液和待测物质溶液，取甜度相当的待测物质溶液的浓度，计算被测物质的甜度：n＝2000/W，其中，n为被测物质甜度，W为100ml溶液中被测物质质量(mg)。
测定结果如下述表6所示。
表6：
Claims (10)
1.具有下述式2所示结构的达玛烷三萜糖苷化合物或其药学上可接受的盐：
2.式1～3所示结构的达玛烷三萜糖苷化合物的制备方法，主要包括以下步骤：
1)以茜草科茜草属植物华腺萼木Mycetia sinensis(Hemsl.)Craib的枝和/或叶为原料，获取其提取物；
2)所得提取物上高速逆流色谱仪进行分离，分段收集流分，以UPLC-MS检识并合并流分，回收溶剂，分别得到白色粉末状逆流色谱纯化物A003、胶状逆流色谱纯化物A004和胶状逆流色谱纯化物A005；其中白色粉末状逆流色谱纯化物A003即为式1所示结构的化合物；其中，
进行高速逆流色谱分离时的固定相和流动相为水与选自以下有机溶剂中的一种或两种以上的选择组成的、对达玛烷皂苷分配系数在0.2～10之间的两相体系：
酯类溶剂、醇类溶剂、酮类溶剂、醚类溶剂、卤代烃类溶剂、烷烃类溶剂、腈类溶剂、酸类溶剂；
3)所得胶状逆流色谱纯化物A004和胶状逆流色谱纯化物A005分别上反相色谱柱层析，以乙腈和水组成的混合溶剂作为流动相进行分离，分别得到式2所示结构的化合物和式3所示结构的化合物；
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，以茜草科茜草属植物华腺萼木的枝和/或叶为原料，以水和/或低碳醇为溶媒进行提取，获取华腺萼木的提取物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的低碳醇为体积浓度为10-100％甲醇或体积浓度为10-100％乙醇。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，
所述的酯类溶剂优选为选自醋酸乙酯、醋酸丁酯和醋酸戊酯中的一种或两种以上的组合；
所述的醇类溶剂优选为选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇和2-戊醇中的一种或两种以上的组合；
所述的酮类溶剂优选为选自丙酮、丁酮、环戊酮、甲基异丁酮和环己酮中的一种或两种以上的组合；
所述的醚类溶剂优选为选自乙醚、甲基叔丁基醚、二氧六环、四氢呋喃中的一种或两种以上的组合；
所述的卤代烃类溶剂优选为选自二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯化碳中的一种或两种以上的组合；
所述的烷烃类溶剂优选为选自正己烷、正庚烷、异辛烷、石油醚、汽油中的一种或两种以上的组合；
所述的腈类溶剂优选为乙腈；
所述的酸类溶剂优选为选自甲酸和/或乙酸。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述进行高速逆流色谱分离时的固定相和流动相为乙酸乙酯-醇-水组成的两相体系，其中醇为选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇和2-戊醇中的一种或两种以上的组合。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：当进行高速逆流色谱分离时的固定相和流动相为乙酸乙酯-醇-水组成的两相体系且其中的醇为单一的选择时，所述乙酸乙酯、醇和水的体积比为E：1：W或E：2：W，其中E和W为0.5～20之间相等或不等的数值。
8.根据权利要求2～6中任一项所述的制备方法，其特征在于：对步骤1)所得提取物进行初步纯化后再上高速逆流色谱仪进行分离。
9.根据权利要求2～6中任一项所述的制备方法，其特征在于：对步骤2)所得白色粉末状逆流色谱纯化物A003上反相色谱柱层析，以甲醇和水组成的混合溶剂作为流动相进行分离，以得到纯化后的式1所示结构的化合物。
10.权利要求1中式2所示结构的化合物在制备甜味剂中的应用。
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