CN110833118A - 一种促进肌内脂肪积累的饲料及提高小鼠肌内脂肪积累的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促进肌内脂肪积累的饲料,该饲料按照质量百分比计算,包括如下成分:20%~35%的蛋白质,30%~63%的碳水化合物,5%~40%的脂肪、0.5%~3.0%的钙以及5%~10%的纤维素。其中,添加钙是诱导肌内脂肪积累的关键因素,钙的添加量在1.2%时脂肪积累效果最佳。本发明还提供了一种构建高肌内脂肪含量小鼠模型的方法,先用常规饲料适应性喂养小鼠,再通过饲喂小鼠前述的促进肌内脂肪积累的饲料来获得肌内高脂肪含量小鼠模型。此外,本发明还提供了一种提高小鼠肌内脂肪积累的方法,从成肌细胞出发,在培养体系中添加Ca2+,以诱导肌细胞中甘油三酯的积累。本发明对家畜禽饲养业具有指导意义,为开发丰满可口而富有韧性的肉质产品奠定了技术基础。

Description

一种促进肌内脂肪积累的饲料及提高小鼠肌内脂肪积累的 方法
技术领域
本发明属于动物科学技术领域,具体涉及一种促进肌内脂肪积累的饲料及提高小鼠肌内脂肪积累的方法。
背景技术
畜禽机体中的脂肪是维持生命、生长和生产必不可少的因素。在畜禽营养上,脂肪不仅是畜禽重要能量来源,而且供给畜禽必须脂肪酸,并促进脂溶性维生素的吸收利用。此外,肌内脂肪含量是影响畜禽肉质口感的关键因素之一,适量的肌内脂肪含量能够赋予畜禽肉质丰满而鲜嫩的口感。
目前,行业内通常采用在饲料内添加适量脂肪的方法来提升动物体内的脂肪沉积,具有成本较高的缺点,而且采用该方法更有利于沉积皮下脂肪,对肌内脂肪的积累作用有限,从而影响肉质的韧性。
因此,迫切需要研发一种提高动物肌内脂肪积累的方法,对家畜禽饲养业具有指导意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足之处,提供了一种促进肌内脂肪积累的饲料及提高小鼠肌内脂肪积累的方法,通过在促进肌内脂肪积累的饲料中控制钙的含量来诱导肌内脂肪的积累,对家畜禽饲养业具有重要的指导意义
本发明通过以下技术方案实现目的:一种促进肌内脂肪积累的饲料,按照质量百分比计算,包括如下成分:20%~35%的蛋白质,30%~63%的碳水化合物,5%~40%的脂肪、0.5%~3.0%的钙以及5%~10%的纤维素。其中,添加钙是诱导肌内脂肪积累的关键因素,钙的添加量在1.2%时脂肪积累效果最佳。
优选的,所述促进肌内脂肪积累的饲料按照质量百分比计算,包括如下成分:39.75%的玉米粉,20%的酪蛋白,13.2%的麦芽糖糊精,10%的蔗糖,7%的豆油,5%的纤维素,3.5%的无机盐混合物,1.0%的维生素混合物,0.3%的L-胱氨酸,0.25%的重酒石酸胆碱,其中,无机盐混合物包括1.2%的钙。
优选的,所述促进肌内脂肪积累的饲料按照质量百分比计算,包括如下成分:20%的酪蛋白,0.25%的L-胱氨酸,30.8%的糊精和蔗糖混合物,3.5%的豆油,29.5%的猪油,6.9%的纤维素,4.5%的无钙矿物质预混料,1.2%的维生素,3%的碳酸钙以及0.35%的胆碱补充剂。
上述促进肌内脂肪积累的饲料能够用于构建高肌内脂肪含量小鼠模型。
本发明提供了一种构建高肌内脂肪含量小鼠模型的方法,具体包括如下步骤:
S1、采用AIN93G饲料喂养六周龄的c57BL/6小鼠,适应性饲养两周;
S2、八周龄开始,采用上述促进肌内脂肪积累的饲料饲喂小鼠;
S3、促进肌内脂肪积累的饲料饲喂小鼠的周期为八周,即得肌内高脂肪含量小鼠模型。
进一步的,在所述步骤S1至步骤S3中,饲养温度为24~26℃。
进一步的,模型筛选指标为小鼠骨骼肌内的甘油三酯水平。
此外,本发明还提供了一种提高小鼠肌内脂肪积累的方法,从成肌细胞出发,具体包括如下步骤:
S1、将小鼠的成肌细胞进行传代培养;
S2、诱导成肌细胞,使成肌细胞分化;
S3、将分化后的肌细胞静息,平衡细胞状态,然后采用油酸棕榈酸培养基培养以促进甘油三酯的积累,并在培养体系中添加Ca2+
进一步的,在步骤S3中,以CaCl2溶液的形式添加Ca2+,并且Ca2+在所述培养体系中的浓度为1~3mmol/L。
本发明的有益效果:本发明提供了一种促进肌内脂肪积累的饲料,该饲料中钙的质量含量控制在0.5%~3.0%,能够诱导小鼠肌内脂肪的积累,能够应用于构建高肌内脂肪含量小鼠模型。此外,本发明还提供了一种提高小鼠肌内脂肪积累的方法,从成肌细胞出发,通过在培养体系中添加Ca2+,以诱导肌细胞中脂肪含量的积累。本发明对家畜禽饲养业具有指导意义,为开发丰满可口而富有韧性的肉质产品奠定了技术基础。
附图说明
图1为实施例三中四组小鼠骨骼肌中甘油三酯浓度的示意图。
图2为实施例四中不同的钙浓度对小鼠成肌细胞增值活性的影响力示意图。
图3为实施例四中三组分化细胞的甘油三酯积累水平示意图。
图4为实施例四中细胞分化前后的MYOG基因和MYHC基因的相对表达量。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将结合附图和具体的实施例对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明较佳的实施方式。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式。相反地,提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的,不是旨在于限制本发明。
实施例一
本实施例提供了一种促进肌内脂肪积累的饲料,按照质量百分比计算,包括如下成分:39.75%的玉米粉,20%的酪蛋白,13.2%的麦芽糖糊精,10%的蔗糖,7%的豆油,5%的纤维素,3.5%的无机盐混合物,1.0%的维生素混合物,0.3%的L-胱氨酸,0.25%的重酒石酸胆碱,其中,无机盐混合物包括1.2%的钙。
在上述促进肌内脂肪积累的饲料中,总蛋白质的质量含量为20.3%,碳水化合物的质量含量为62.95%,脂肪的含量为7%,钙的添加量为1.2%。
实施例二
本实施例提供了一种促进肌内脂肪积累的饲料,按照质量百分比计算,包括如下成分:
本实施例提供了一种促进肌内脂肪积累的饲料,按照质量百分比计算,包括如下成分:39.75%的玉米粉,20%的酪蛋白,13.2%的麦芽糖糊精,10%的蔗糖,7%的豆油,5%的纤维素,3.5%的无机盐混合物,1.0%的维生素混合物,0.3%的L-胱氨酸,0.25%的重酒石酸胆碱,其中,无机盐混合物包括3.0%的钙。
在上述促进肌内脂肪积累的饲料中,总蛋白质的质量含量为20.3%,碳水化合物的质量含量为62.95%,脂肪的含量为7%,钙的添加量为3.0%。
实施例三
本实施例提供了一种促进肌内脂肪积累的含钙饲料,按照质量百分比计算,包括如下成分:20%的酪蛋白,0.25%的L-胱氨酸,30.8%的糊精和蔗糖混合物,3.5%的豆油,29.5%的猪油,6.9%的纤维素,4.5%的无钙矿物质预混料,1.2%的维生素,3%的碳酸钙以及0.35%的胆碱补充剂。所述的糊精和蔗糖混合物是糊精和蔗糖按照1:1的质量比混合制得。
在上述促进肌内脂肪积累的含钙饲料中,总蛋白质的质量含量为20.25%,碳水化合物的质量含量为30.8%,脂肪的含量为33%,钙的添加量为1.2%。
实施例四
实施例提供了一种促进肌内脂肪积累的含钙饲料,按照质量百分比计算,包括如下成分:20%的酪蛋白,0.25%的L-胱氨酸,30.8%的糊精和蔗糖混合物,3.5%的豆油,29.5%的猪油,6.9%的纤维素,4.5%的无钙矿物质预混料,1.2%的维生素,1.25%的碳酸钙以及2.1%的胆碱补充剂。
在上述促进肌内脂肪积累的含钙饲料中,总蛋白质的质量含量为20.25%,碳水化合物的质量含量为30.8%,脂肪的含量为33%,钙的添加量为0.5%。
实施例五
本实施例提供了一种构建高肌内脂肪含量小鼠模型的方法,具有操作方便、效果佳的优点。
1.实验材料
1.1实验小鼠:六周龄C57BL/6小鼠,采购于广西医科大学实验动物中心,一共24只,分为四组,每组6只;
1.2 含有0.5%Ca的AIN93G饲料(AIN93G-0.5Ca):按照质量百分比计算,39.75%的玉米粉,20%的酪蛋白,13.2%的麦芽糖糊精,10%的蔗糖,7%的豆油,5%的纤维素,3.5%的无机盐混合物,1.0%的维生素混合物,0.3%的L-胱氨酸,0.25%的重酒石酸胆碱,其中,无机盐混合物包括0.5%的钙;
1.3 含有1.2% Ca的AIN93G饲料(AIN93G-1.2Ca):按照质量百分比计算,39.75%的玉米粉,20%的酪蛋白,13.2%的麦芽糖糊精,10%的蔗糖,7%的豆油,5%的纤维素,3.5%的无机盐混合物,1.0%的维生素混合物,0.3%的L-胱氨酸,0.25%的重酒石酸胆碱,其中,无机盐混合物包括1.2%的钙;
1.4 实施例三中所述的促进肌内脂肪积累的饲料(HFD0.5);
1.5实施例四中所述的促进肌内脂肪积累的饲料(HFD1.2);
1.6 甘油三酯试剂盒和RIPA裂解液,购自北京普利莱基因技术有限公司;
1.7 BCA试剂盒,购自上海碧云天生物技术有限公司;
2. 构建高肌内脂肪含量小鼠模型的实验步骤
2.1 将24只六周龄C57BL/6小鼠分为四组,每组6只,均采用AIN93G-0.5Ca饲料适应性喂养两周,鼠房恒温24~26℃,小鼠达到八周龄;
2.2 从八周龄开始,第一组小鼠继续采用AIN93G-0.5Ca饲料喂养,第二组小鼠采用AIN93G-1.2Ca饲料喂养,第三组小鼠采用HFD0.5饲料喂养,第四组小鼠采用HFD1.2饲料喂养,鼠房恒温24~26℃,此轮喂养周期为八周,小鼠达到十六周龄;
2.3 将四组达到十六周龄的小鼠处死,解剖,取小鼠骨骼肌,通过测定骨骼肌内甘油三酯水平来确定肌内高脂肪含量小鼠模型。
对上述步骤需要说明的是,步骤2.3,具体包括如下步骤:
S2.3.1 向每只小鼠的骨骼肌中添加1mL的RIPA裂解液,采用研磨仪匀浆,获得组织匀浆,一共24管组织匀浆样品;
S2.3.2 将24管组织匀浆样品置于4℃摇床上,翻转过夜以使组织充分裂解,离心收集上清液;
S2.3.3 各管上清液取10µL以测定甘油三酯含量,可选用甘油三酯试剂盒,或按常规甘油三脂含量测定步骤操作;
S2.3.4 各管上清液取10µL以测定总蛋白含量,步骤S2.3.3中的甘油三酯含量用总蛋白含量平衡,得到甘油三酯的浓度(nmol/mg蛋白质),形成图1,从而确定肌内高脂肪含量小鼠模型。
2. 结果
四组小鼠骨骼肌中甘油三酯的浓度如图1所示,第一组至第四组小鼠肌内甘油三脂浓度依次递增,第四组小鼠为肌内高脂肪含量小鼠模型。需要说明的是,第三组小鼠的肌内甘油三脂浓度是第一组的3.7倍,第四组小鼠的肌内甘油三脂浓度是第二组的3.4倍,表明:在相同的钙含量前提下,本发明的饲料相较于普通饲料能够促进小鼠肌内脂肪的积累。此外,第二组小鼠的肌内甘油三脂浓度是第一组小鼠的1.7倍,第四组小鼠的肌内甘油三脂浓度是第三组小鼠的1.6倍,表明:钙对诱导肌内脂肪的积累具有重要作用,钙具有调节脂肪代谢的作用。
实施例四
本实施例提供了一种提高小鼠肌内脂肪积累的方法,以小鼠的成肌细胞作为研究对象,进一步证明了钙能够调节脂肪代谢,对肌内脂肪的积累具有重要作用。
1.实验材料
1.1 C2C12小鼠成肌细胞,购自于中国医学科学院基础医学研究所;
1.2胎牛血清、马血清和谷氨酰胺,购自Gibco公司;
1.3无钙无谷氨酰胺DMEM培养基(型号:21068028)和DMEM培养基(型号:11195),购自Thermo Fisher公司;
1.4含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基:配制时,将胎牛血清按照10%的体积分数加入DMEM培养基(型号:11195)中;含体积分数为2%马血清的DMEM培养基:配制时,将马血清按照2%的体积分数加入DMEM培养基(型号:11195)中;
1.5 油酸棕榈酸培养基,配制方法:取1.0g的BSA溶解于50mL的无钙无谷氨酰胺DMEM培养基中,加入600μl浓度为 5mol/L的油酸或棕榈酸,37°混匀1h,使油酸(或棕榈酸)完全被包裹,然后采用0.22μm的滤膜过滤除菌,置于4℃条件下备用;
1.6 0.3mol/L的CaCl2溶液(自行配制),并通过0.3mol/L的CaCl2溶液分别配制不同浓度的CaCl2溶液;
1.7青链霉素混合液(100×),采用10000单位青霉素和10000µg链霉素溶于1mL的0.85%NaCl,过滤除菌制得;
1.8 CCK-8试剂盒,购自上海翊圣生物科技有限公司;
1.9 RNA提取试剂盒购自于OMEGA公司,反转录酶、RNA酶抑制剂DEPC等分子试剂购自于Takara公司,PCR引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。
2.钙对C2C12小鼠成肌细胞增值活性的影响力实验
2.1实验步骤
2.1.1复苏C2C12小鼠成肌细胞,制得细胞悬液;
2.2.2将复苏后的细胞悬液接种于96孔板中,每5孔为一组(平行样),共接种九组,每孔的接种量均为100µL,再在96孔板上选取5孔(第十组)作为空白对照,每孔空白对照加入100µL的DMEM培养基,然后将96孔板置于培养箱(37°C,CO2的体积分数为5%)中预培养24h;
2.2.3 向第一组的每孔中加入10µL蒸馏水,向第二组至第九组的各孔中分别加入10µL的不同浓度CaCl2溶液,再将96孔板置于培养箱(37°C,CO2的体积分数为5%)中培养24h;
2.2.4 向第一组至第十组的每孔中加入10µL的CCK-8溶液,再将96孔板置于培养箱(37°C,CO2的体积分数为5%)中培养2h;
2.2.5 完成步骤2.2.4后,通过酶标仪分别测定第一组至第十组溶液在450nm处的吸光度,并通过细胞活力公式计算得出各个组的细胞活力值,绘制成图2。
对于上述步骤需要说明的是,在步骤2.1.1中,复苏细胞的具体流程为:
在步骤2.2.3中,第二组至第九组培养体系中钙浓度分别为0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L以及4.0mmol/L。
在步骤2.2.5,细胞活力计算公式为:细胞活力×100%=[A(加钙)-A(空白)]/[A(未加钙)-A(空白)]×100,其中,A(空白)对应第十组溶液在450nm处的吸光度,A(未加钙)对应第一组细胞溶液在450nm处的吸光度,计算第二组至第九组中某组的细胞活力时,A(加钙)对应某组细胞溶液在450nm处的吸光度。
2.2钙对C2C12小鼠成肌细胞增值活性的影响力分析
如图2所示,当培养体系中钙浓度在1mmol/L至4mmol/L范围内时,对C2C12小鼠成肌细胞增值活性并无明显的损伤,因此,可以通过调节钙含量(在1mmol/L至4mmol/L范围内)的手段来提高小鼠肌内脂肪的积累。
3. 提高小鼠肌内脂肪积累方法的具体实验步骤
3.1 复苏C2C12小鼠成肌细胞,并将复苏后的细胞传于六孔板上,采用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基,其中,培养基中添加有体积分数为1%的青链霉素混合液,将六孔板置于培养箱(37°C,CO2的体积分数为5%)中进行传代培养。
3.2 当传代培养至培养皿中细胞覆盖率达到90%时,换含体积分数为2%马血清的DMEM培养基,并且培养基中添加有体积分数为1%的青链霉素混合液,以诱导成肌细胞分化;诱导成肌细胞分化过程中,每隔一天换一次含体积分数为2%马血清的DMEM培养基。
3.3 成肌细胞分化5~7天后,用显微镜观察细胞状态,当细胞形成明显的肌纤维时,证明分化完成;同时检测小鼠成肌细胞中的MYOG基因和MYHC基因表达量,当分化后的MYOG基因和MYHC基因表达量相较于分化前呈数十倍递增时,亦证明分化完成。
3.4 细胞完成分化后,采用DMEM培养基,并置于培养箱(37°C,CO2的体积分数为5%)静息12h,以平衡细胞状态,使之更加均匀。
3.5 完成步骤3.4后,采用三组油酸棕榈酸培养基处理分化后的细胞,置于培养箱(37°C,CO2的体积分数为5%)处理24h;每组处理的细胞量相同,三组油酸棕榈酸培养基中均添加有谷氨酰胺,并且谷氨酰胺的浓度均为584mg/L;三组油酸棕榈酸培养基中添加有不同量的0.3mol/L CaCl2溶液,使得第一组油酸棕榈酸培养基中Ca2+浓度为1mmol/L,第二组油酸棕榈酸培养基中Ca2+浓度为2mmol/L,第三组油酸棕榈酸培养基中Ca2+浓度为3mmol/L。
3.6 完成步骤3.5后,分别测定三组分化细胞的甘油三酯积累水平,形成图3。
对上述步骤需要说明的是,步骤3.1中,复苏细胞的具体流程同步骤2.1.1。
在步骤3.3中,MYOG和MYHC的基因序列为公知常识,通过荧光定量PCR来判断细胞分化前后的MYOG和MYHC表达量,具体包括如下步骤:
3.3.1 分别采用RNA提取试剂盒提取分化前和分化后的细胞RNA;
3.3.2 对分化前和分化后的细胞RNA进行逆转录PCR操作,以获得荧光定量PCR的模板,逆转录PCR的cDNA合成体系和PCR反应体系分别详见表1和表2;
3.3.3 对PCR扩增产物进行荧光定量,确定分化前后的MYOG和MYHC表达量,荧光定量PCR反应体系详见表3,MYOG基因荧光定量PCR正、反向引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2,MYHC基因荧光定量PCR正、反向引物分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
如图4所示,C2C12小鼠成肌细胞分化后,其MYOG基因和MYHC基因的表达量是分化前的数十倍。
Figure 620861DEST_PATH_IMAGE001
将置于72°C反应10min,冰浴2min后作为PCR扩增的模板。
Figure 6843DEST_PATH_IMAGE002
RT-PCR扩增程序为:①42°C,60min;②90°C,10min;③4°C,5min。
Figure 255422DEST_PATH_IMAGE003
荧光定量PCR程序为:①95°C,5s;②60°C,1min;③72°C,10s;④重复②和③40个循环;⑤72°C,3min;⑥12°C,2min。
如图3所示,采用油酸棕榈酸培养基处理分化后的细胞,当油酸棕榈酸培养基中的钙浓度达到3mmol/L时,成肌细胞内的甘油三酯积累水平最高,即:小鼠肌内脂肪积累的效果最佳,相较于钙浓度为2mol/L的油酸棕榈酸培养基处理分化后的细胞,提高了肌内0.7倍的甘油三酯积累量。因此,从小鼠成肌细胞水平出发,可以通过控制培养基中钙浓度的方法,来实现提高小鼠肌内脂肪积累的目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种促进肌内脂肪积累的饲料及提高小鼠肌内脂肪积累的方法
<130> YG18101434JJ012
<141> 2018-08-15
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
caatgcactg gagttcggt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ctgggaaggc aacagacat 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
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cgcaagaatg ttctcaggct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
gccaggttga cattggattg 20

Claims (9)

1.一种促进肌内脂肪积累的饲料,其特征在于,按照质量百分比计算,包括如下成分:20%~35%的蛋白质,30%~63%的碳水化合物,5%~40%的脂肪、0.5%~3.0%的钙以及5%~10%的纤维素。
2.根据权利要求1所述的促进肌内脂肪积累的饲料,其特征在于,按照质量百分比计算,包括如下成分:39.75%的玉米粉,20%的酪蛋白,13.2%的麦芽糖糊精,10%的蔗糖,7%的豆油,5%的纤维素,3.5%的无机盐混合物,1.0%的维生素混合物,0.3%的L-胱氨酸,0.25%的重酒石酸胆碱,其中,无机盐混合物包括1.2%的钙。
3.根据权利要求1所述的促进肌内脂肪积累的饲料,其特征在于,按照质量百分比计算,包括如下成分:20%的酪蛋白,0.25%的L-胱氨酸,30.8%的糊精和蔗糖混合物,3.5%的豆油,29.5%的猪油,6.9%的纤维素,4.5%的无钙矿物质预混料,1.2%的维生素,3%的碳酸钙以及0.35%的胆碱补充剂。
4.根据权利要求1-3任一项中所述的促进肌内脂肪积累的饲料,其特征在于,用于构建高肌内脂肪含量小鼠模型。
5.一种构建高肌内脂肪含量小鼠模型的方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
S1、采用AIN93G饲料喂养六周龄的c57BL/6小鼠,适应性饲养两周;
S2、八周龄开始,采用如权利要求1-3任一项中所述促进肌内脂肪积累的饲料饲喂小鼠;
S3、促进肌内脂肪积累的饲料饲喂小鼠的周期为八周,即得肌内高脂肪含量小鼠模型。
6.根据权利要求5所述的构建高肌内脂肪含量小鼠模型的方法,其特征在于,所述步骤S1至步骤S3中,饲养温度为24~26℃。
7.根据权利要求5所述的构建高肌内脂肪含量小鼠模型的方法,其特征在于,模型筛选指标为小鼠骨骼肌内的甘油三酯水平。
8.一种提高小鼠肌内脂肪积累的方法,其特征在于,从成肌细胞出发,具体包括如下步骤:
S1、将小鼠的成肌细胞进行传代培养;
S2、诱导成肌细胞,使成肌细胞分化;
S3、将分化后的肌细胞静息,平衡细胞状态,然后采用油酸棕榈酸培养基培养以促进甘油三酯的积累,并在培养体系中添加Ca2+
9.根据权利要求8中所述的提高小鼠肌内脂肪积累的方法,其特征在于,在步骤S3中,以CaCl2溶液的形式添加Ca2+,并且Ca2+在所述培养体系中的浓度为1~3mmol/L。
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