CN101979497A - 一种高效诱导布朗葡萄藻脂肪积累的培养方法 - Google Patents

Abstract

一种高效诱导布朗葡萄藻脂肪积累的培养方法，包括配制培养基及日常添加的营养液，对布朗葡萄藻进行10-18天的生物量积累的培养，然后向布朗葡萄藻培养液中通入CO₂、调整添加营养液的浓度，并使用超声仪在一定的频率下，对微藻培养液进行超声处理，处理1-3次，每次间隔为10s，处理时间为5-60s/次，诱导布朗葡萄藻脂肪积累，用本发明方法培养的布朗葡萄藻，其生物量提高了1-1.5倍，总脂肪含量提高了30％-55％，生长周期缩短了2-3天，且本发明是以通入CO₂的形式补充碳源，在大规模生产布朗葡萄藻诱导脂肪积累的过程中，吸收大量的工业生产过程所产生的CO₂废气，对节能减排、保护环境具有重要的意义。

Description

一种高效诱导布朗葡萄藻脂肪积累的培养方法

技术领域：

本发明涉及一种高效提高布朗葡萄藻-X09的脂肪含量以及开放式高密度养殖布朗葡萄藻-X09的方法。

背景技术

全球面临的能源短缺和环境污染问题促使开发和利用可再生、无污染的生物能源成为一个重要的研究方向。利用微藻生产生物能源具有以下独特的优势：微藻能有效地利用太阳能，通过光合作用固定CO₂，将无机物转化为高不饱和烷烃、油脂等能源物质；微藻生物能源可再生。葡萄藻(Botryococcus.sp)又名丛粒藻，属绿藻门、绿藻纲、葡萄藻科，是一种世界性分布的淡水或微咸水单细胞绿藻。将该藻作为无污染可再生的替代能源生产者引起广泛重视，美、法、日、英、澳、苏、荷和南朝鲜等国都开展了有关研究。研究发现葡萄藻呈串状集落生长，细胞梨形，一般宽3-6μm，长6-12μm，老龄细胞的叶绿体中有淀粉粒，无鞭毛，细胞含色素体1个，环状或叶状，黄绿色，细胞色素为叶绿素a、b、叶黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。群体多为2个或4个细胞组成，大部分细胞呈辐射状排列，群体大小可达50-100μm。其产烃量通常为25％-40％，大大高于其他微生物的含烃量(几乎都低于1％)，并且葡萄藻所产烃的组成和结构与石油极其相似，故又被称为“油藻”，最可望成为工业藻种。但目前，葡萄藻的高密度培养技术并没有很好的解决，仍处在实验室探索阶段，这种状况很大程度上由于葡萄藻生长速度缓慢导致的。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种高效提高布朗葡萄藻-X09的生长速率和脂肪积累能力以及开放式高密度养殖布朗葡萄藻-X09的方法。本发明是根据超声波对生物体的代谢作用，在不破坏细胞的前提下，采用适当的频率、强度和处理时间，以提高布朗葡萄藻-X09的新陈代谢效率，加速细胞生长，用本发明方法培养出的布朗葡萄藻-X09细胞数目比通用方法提高了1-1.5倍，其总脂肪含量提高了30％-55％。

本发明目的之一是提供一种布朗葡萄藻-X09的培养基。

本发明目的之二是提供一种布朗葡萄藻-X09的培养方法。

本发明目的之三是提供一种超声波与培养条件相结合的多条件高效诱导布朗葡萄藻-X09脂肪积累的方法。

本发明提供的能高效提高布朗葡萄藻-X09生物量的培养基，主要包括氮源、磷源、铁盐、氟化钠、氯化钠以及微量元素和水。其中氮源优选硝酸钾，磷源优选磷酸二氢钾，铁盐优选硫酸亚铁，微量元素为氯化钴、硫酸锌、硼酸、硫酸铜、氯化锰、钼酸钠，本发明所述的培养基还可以根据不同的用途添加其他有益营养成分。

本发明所使用的布朗葡萄藻-X09的培养基为FN16，其配方如下：

硝酸钾        0.1-1.0g/L      磷酸氢二钾  0.02-0.12g/L

七水硫酸镁    0.1-0.5g/L      二水氯化钙  0.05-0.15g/L

硫酸亚铁      0.01-0.04g/L    柠檬酸      0.05-0.3g/L

氟化钠    0.2-0.9mg/L    氯化钠    0.5-2.5g/L

微量元素  0.5-2ml/L

其中微量元素配方为：

氯化钴      0.01-0.04mg/L    七水硫酸锌  0.22-0.80mg/L

硼酸        2.5-9.45mg/L     五水硫酸铜  0.08-0.32mg/L

四水氯化锰  1.3-5.45mg/L     钼酸钠      0.04-0.15mg/L

加蒸馏水至1L

日常添加溶液配方

溶液A：硝酸钾25-55g/L

本发明所使用的布朗葡萄藻-X09的培养基较好的配方为：

硝酸钾     0.1-0.6g/L      磷酸氢二钾 0.04-0.10g/L

七水硫酸镁 0.1-0.4g/L      二水氯化钙 0.08-0.12g/L

硫酸亚铁   0.01-0.03g/L    柠檬酸     0.08-0.15g/L

氟化钠     0.4-0.9mg/L     氯化钠     0.8-1.9g/L

微量元素   0.5-2ml/L

其中微量元素配方为：

氯化钴     0.01-0.03mg/L   七水硫酸锌 0.32-0.55mg/L

硼酸       3.5-7.45mg/L    五水硫酸铜 0.10-0.22mg/L

四水氯化锰 2.0-4.45mg/L    钼酸钠     0.06-0.10mg/L

加蒸馏水至1L

日常添加溶液配方：

溶液A：硝酸钾30-50g/L

若非特指，本发明培养基配方中所述的化学成分，均为分析纯的市售商品。

应用本发明所提供的利用超声波与培养条件相结合的高效诱导布朗葡萄藻-X09脂肪积累的方法，包括如下步骤：

步骤1：配置FN16培养基以及日常添加的营养液A；

步骤2：布朗葡萄藻-X09生物量积累，按照布朗葡萄藻-X09与培养基体积比按1∶8-1∶15的比例将布朗葡萄藻-X09接种到培养基中，温度20-30℃，pH值6-9，光照5000-200001ux，光照时间10-16小时/天，每天需一次性向微藻培养液中加入溶液A 0.5-2ml/L，培养10-18天即可达到对数生长期末期；布朗葡萄藻-X09生物量较好的积累条件：布朗葡萄藻-X09与培养基体积比按1∶9-1∶12的比例将布朗葡萄藻-X09接种到培养基中，温度22-28℃，pH值7-8，光照12000-200001ux，光照时间11-14小时/天，每天需一次性向微藻培养液中加入溶液A 0.8-1.2ml/L，培养12-15天即可达到对数生长期末期；最好的培养条件为布朗葡萄藻-X09与培养基体积比按1∶10的比例将布朗葡萄藻-X09接种到培养基中，温度26-28℃，光照15000-180001ux，光照时间14小时/天，每天需一次性向微藻培养液中加入溶液A为1ml/L，培养13天时可达到对数生长期末期；

步骤3：诱导脂肪积累，使用超声生物促进生长仪将培养至对数生长期末期的微藻培养液以15-40kHz的频率，3-10w的功率，处理时间15-60s，处理1-3次，每次时间间隔为10s，进行超声处理，然后向微藻培养液中以0.5-2.5L/min的流量通入浓度为2％-6％的CO₂，每天补充的溶液A降至0.01-0.1ml/L，一次性添加氯化钠4.68-8.78g/L，同时加入100-200mg/L的硫酸亚铁，在诱导培养2天时，再以10-20kHz的频率，2-7w的功率，处理时间5-30s，处理1-2次，每次时间间隔为10s，共诱导培养4天；较好的诱导布朗葡萄藻-X09脂肪积累条件：超声频率为15-30kHz的频率，3-7w的功率，处理时间15-40s，处理2-3次，每次时间间隔为10s，然后以0.8-1.5L/min的流量通入浓度为3％-6％的CO₂，每天补充的溶液A降至0.01-0.05ml/L，一次性添加氯化钠为5.07-7.02g/L，同时加入120-180mg/L的硫酸亚铁，在诱导培养2天时，再以12-20kHz的频率，2-5w的功率，处理时间5-20s，处理1-2次，每次时间间隔为10s，共诱导培养4天；最好的诱导布朗葡萄藻-X09脂肪积累条件：超声频率为20kHz的频率，5w的功率，处理时间25s，处理2次，每次时间间隔为10s，然后以1.2L/min的流速通入浓度为6％的CO₂，每天补充溶液A为15μl/L，一次性添加氯化钠5.85g/L，同时加入150mg/L的硫酸亚铁，在诱导培养2天时，再以12kHz的频率，3w的功率，处理时间10s，处理2次，每次时间间隔为10s，共诱导培养4天。

本发明所提供的布朗葡萄藻-X09的培养基及诱导脂肪积累的方法，使用超声波处理和改变培养基中碳源、氮源、氯化钠和铁元素浓度相结合的方法，非常有利于布朗葡萄藻-X09脂肪的积累，其油脂的含量比氮元素限制的单一诱导方法提高了30％-55％；同时在培养基中加入氟化钠和氯化钠，促进布朗葡萄藻-X09细胞分裂，生长周期比通用培养基缩短了2-3天，其生物量比通用培养基提高了1-1.5倍，而且本发明是以通入CO₂的形式补充碳源，在大规模生产布朗葡萄藻-X09诱导脂肪积累的过程中，吸收大量的工业生产过程所产生的CO₂废气，对节能减排、保护环境具有重要的意义。

附图说明

图1为在FN16培养基中添加不同浓度的氟化钠时布朗葡萄藻-X09的生长曲线。

图2为在FN16培养基中每天添加不同量的溶液A和在通用培养基中培养时布朗葡萄藻-X09的生长曲线。

图3为超声波与培养条件相结合多条件诱导和氮元素单一条件诱导时布朗葡萄藻-X09的生长曲线

图4为诱导脂肪积累阶段加入较高浓度的氮源、低浓度氯化钠和较强的超声处理时布朗葡萄藻-X09的生长曲线

图5为诱导脂肪积累阶段加入低浓度氮源、高浓度NaCl和较低强度的超声处理时布朗葡萄藻-X09的生长曲线

具体实施方式

实施例1

FN16培养基的配方如下：

硝酸钾0.4g/L                磷酸氢二钾0.08g/L

氟化钠分别为0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mg/L

七水硫酸镁0.2g/L            二水氯化钙0.107g/L

硫酸亚铁0.02g/L      柠檬酸0.1g/L

氯化钠1.75g/L        微量元素1ml/L

其中微量元素的配置方法为：氯化钴0.02mg、七水硫酸锌0.44mg、硼5.72mg、五水硫酸铜0.16mg、四水氯化锰3.62mg、钼酸钠0.084mg加蒸馏水至1L。

将上述物质溶解，用蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌20min。在250ml摇瓶中分别加入100mlFN16培养基，其中氟化钠的初始浓度分别为0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mg/L，接种浓度为3.2×10⁵个细胞/毫升，在温度26℃、光∶暗＝14∶10，光强80001ux，摇床转速140r/min等条件下进行培养。经15天培养，布朗葡萄藻-X09的最大生物量能达到4.89×10⁷个细胞/毫升(见图1)。

根据上述培养结果可以得知，使用本发明提供的FN16培养基，氟化钠的加入量为0.6mg/L时，其达到对数生长期末期的细胞数是加入氟化钠为0.05mg/L时的1.5倍，并且提前2天进入对数生长期。

实施例2

1、FN16培养基的配方如下：

硝酸钾0.4g/L            磷酸氢二钾0.08g/L

七水硫酸镁0.2g/L        二水氯化钙0.107g/L

硫酸亚铁0.02g/L         柠檬酸0.1g/L

氯化钠1.75g/L           氟化钠0.6mg/L

微量元素1ml/L

其中微量元素的配置方法为：氯化钴0.02mg、七水硫酸锌0.44mg、硼5.72mg、五水硫酸铜0.16mg、四水氯化锰3.62mg、钼酸钠0.084mg加蒸馏水至1L。

将上述物质溶解，用蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌20min。在250ml摇瓶中加入100mlFN16培养基，每天添加溶液A的量分别为0.5、1.0、1.5、2.0ml/L，接种浓度为3.25×10⁵个细胞/毫升，在温度26℃、光∶暗＝14∶10，光强80001ux，摇床转速140r/min等条件下进行培养。

2、通用培养基配方为

硝酸钠1.5g/L                 三水磷酸氢二钾0.04g/L

七水硫酸镁0.075g/L           二水氯化钙0.036g/L

柠檬酸0.006g/L               柠檬酸铁0.006g/L

乙二胺四乙酸二钠0.001g/L     碳酸钠0.02g/L

微量元素1ml/L

其中微量元素配方：硼酸2.86g、一水氯化锰1.81g、七水硫酸锌0.222g、五水硫酸铜0.079g、二水钼酸钠0.390g、六水硝酸钴0.049g加蒸馏水至1L。

将上述物质溶解，用蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌20min。在250ml摇瓶中加入100ml通用培养基，接种浓度为3.25×10⁵个细胞/毫升，在温度26℃、光∶暗＝14∶10，光强80001ux，摇床转速140r/min等条件下进行培养。

根据上述培养结果得知，当每天添加溶液A的量为1.0ml/L时，布朗葡萄藻-X09的最大生物量能达到6.6×10⁷个细胞/毫升(见图2)，培养13天时达到对数生长期末期，其细胞数比通用培养方法提高了1.2倍。

实施例3

1.超声波与培养条件相结合多条件诱导

在300L小型光反应器系统中，加入FN16培养基，布朗葡萄藻-X09与培养基体积比为1∶10的比例将布朗葡萄藻-X09接种到培养基中，接种浓度为2.24×10⁵温度26-28℃，光照15000-180001ux，光照时间14小时/天，每天需向微藻培养液中加入溶液A为1ml/L，培养13天时开始诱导脂肪积累；脂肪诱导积累阶段超声频率为20kHz的频率，5w的功率，处理时间25s，处理2次，然后以1.2L/min的流速通入浓度为6％的CO₂，每天补充溶液A为15μl/L，一次性添加氯化钠5.85g/L，同时加入150mg/L的硫酸亚铁，在诱导培养2天时，再以12kHz的频率，3w的功率，处理时间10s，处理2次，共诱导培养4天。

2.氮源限制的单一诱导方法

在300L小型光反应器系统中，加入FN16培养基，布朗葡萄藻-X09与培养基体积比为1∶10的比例接种，接种浓度为2.24×10⁵个细胞/毫升，培养温度为26-28℃，光照为15000-180001ux，光照时间为14小时/天，每天只补充15μl/L的溶液A，诱导培养4天。

结果表明，用多条件诱导培养布朗葡萄藻-X09，其生长迅速，培养第4天即进入指数生长期，培养可达到的最大细胞密度为6.8×10⁷个细胞/毫升(见图3)，诱导脂肪积累后干重为2.07g/L，高出氮缺乏单因素诱导所得细胞干重的11.3％，经过超声波等多条件诱导后，其脂肪占藻体干重的百分含量可达到45％，总脂肪的产量为932mg/L，其总脂肪占藻体干重的百分含量高出单条件诱导的45.2％，如表1。

表1超声波与培养条件相结合多条件诱导与氮缺乏单条件诱导各指标比较

实施例4

在300L小型光反应器系统中，加入FN16培养基，布朗葡萄藻-X09与培养基体积比为1∶10的比例接种，接种浓度为2.17×10⁵个细胞/毫升，培养温度为26-28℃，光照为15000-180001ux，光照时间为14小时/天，每天加入溶液A 1ml/L，培养13天后，以40kHz的频率，10w的功率，处理时间60s，超声处理1次，然后以0.5-1.0L/min的流速通入浓度为2％的CO₂，每天添加0.1ml/L的溶液A，一次性加入氯化钠的量为4.68g/L，硫酸亚铁的加入量为100mg/L，诱导培养2天后，20kHz的频率，7w的功率，处理时间30s，超声处理1次，共诱导脂肪积累4天。

结果表明，用此方法培养布朗葡萄藻-X09，其生长迅速，培养第3天即进入指数生长期，培养可达到的最大细胞密度为6.5×10⁷个细胞/毫升(见图4)，诱导脂肪积累后干重为1.93g/L，其脂肪占干重的百分含量可达到40％，总脂肪的产量为772mg/L。

实施例5

在300L小型光反应器系统中，加入FN16培养基，布朗葡萄藻-X09与培养基体积比为1∶10的比例接种，接种浓度为1.98×10⁵个细胞/毫升，培养温度为26-28℃，光照为15000-180001ux，光照时间为14小时/天，每天加入1ml/L的溶液A，培养13天后，以15kHz的频率，3w的功率，处理时间15s，超声处理3次，以1.5-2.5L/mi n的流速通入浓度为6％的CO₂，每天添加10μl/L溶液A，一次性加入氯化钠的量为8.78g/L，硫酸亚铁的加入量为200mg/L，诱导培养2天后，再以10kHz的频率，2w的功率，处理时间5s，超声处理2次，每次时间间隔为10s，共诱导脂肪积累4天。

结果表明，用此方法培养布朗葡萄藻-X09生长迅速，培养第3天即进入指数生长期，诱导脂肪积累后的细胞密度为6.45×10⁷个细胞/毫升(见图5)，诱导脂肪积累后干重为1.89g/L，经过诱导后，其脂肪占干重的百分含量可达到48％，总脂肪的产量为907mg/L。实施例3、4、5中诱导条件的不同水平对布朗葡萄藻-X09脂肪积累的影响见表2

表2诱导条件的不同水平对布朗葡萄藻-X09脂肪积累的影响

Claims (9)

1.一种布朗葡萄藻-X09的培养基，其配方如下：

硝酸钾     0.1-1.0g/L    磷酸氢二钾   0.02-0.12g/L

七水硫酸镁 0.1-0.5g/L    二水氯化钙   0.05-0.15g/L

硫酸亚铁   0.01-0.04g/L  柠檬酸       0.05-0.3g/L

氟化钠     0.2-0.9mg/L   氯化钠       0.5-2.5g/L

微量元素   0.5-2ml/L

其中微量元素配方为：

氯化钴     0.01-0.04mg/L    七水硫酸锌  0.22-0.80mg/L

硼酸       2.5-9.45mg/L     五水硫酸铜  0.08-0.32mg/L

四水氯化锰 1.3-5.45mg/L     钼酸钠      0.04-0.15mg/L

加蒸馏水至 1L

日常添加溶液A：

石硝酸钾    25-55g/L。

2.如权利要求1所述的布朗葡萄藻-X09的培养基，其较好的配方为：

硝酸钾       0.1-0.6g/L     磷酸氢二钾 0.04-0.10g/L

七水硫酸镁   0.1-0.4g/L     二水氯化钙 0.08-0.12g/L

硫酸亚铁     0.01-0.03g/L   柠檬酸     0.08-0.15g/L

氟化钠       0.4-0.9mg/L    氯化钠     0.8-1.9g/L

微量元素     0.5-2ml/L

其中微量元素配方为：

氯化钴     0.01-0.03mg/L    七水硫酸锌 0.32-0.55mg

硼酸       3.5-7.45mg/L     五水硫酸铜 0.10-0.22mg/L

四水氯化锰 2.0-4.45mg/L     钼酸钠     0.06-0.10mg/L

加蒸馏水至 1L

日常添加溶液A：

石硝酸钾  30-50g/L。

3.一种高效诱导如权利要求1、2所述布朗葡萄藻-X09脂肪积累的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)配置布朗葡萄藻-X09培养基以及日常添加的营养液A；

(2)将布朗葡萄藻-X09藻种接种到培养基中，在温度为20-30℃，pH值为6-9，光照为5000-200001ux，光照时间10-16小时/天、每天补充溶液A的条件下对布朗葡萄藻-X09进行10-18天生物量积累的培养。

(3)使用超声仪对生物量积累后的布朗葡萄藻-X09培养液进行超声处理，然后向微藻培养液中通入CO₂、降低溶液A的补充量，并添加氯化钠、硫酸亚铁进行诱导布朗葡萄藻-X09脂肪积累的培养。

4.如权利要求3所述的高效诱导布朗葡萄藻-X09脂肪积累的方法，其特征在于所述的布朗葡萄藻-X09与培养基的接种比例为1∶8-1∶15，生物量积累阶段每天向布朗葡萄藻-X09培养基中加入的溶液A为0.5-2ml/L；较好的接种比例为1∶9-1∶12，每天补充的溶液A为0.8-1.2ml/L。

5.如权利要求3所述的高效诱导布朗葡萄藻-X09脂肪积累的方法，其特征在于布朗葡萄藻-X09生物量积累较好的条件是在温度为22-28℃，pH值为7-8，光照为12000-200001ux，光照时间为11-14小时/天的条件下培养12-15天。

6.如权利要求3所述的高效诱导布朗葡萄藻-X09脂肪积累的方法，其特征在于进行超声处理时的频率为15-40kHz，功率为3-10w，处理1-3次，每次间隔为10s，处理时间为15-60s/次，再向微藻培养液通入CO₂、并调整加入溶液A、氯化钠和硫酸亚铁浓度的条件下，诱导培养2天，再以10-20kHz的频率，2-7w的功率，进行1-2次的超声处理，每次间隔10s，处理5-30s/次，共诱导培养4天。

7.如权利要求3所述的高效诱导布朗葡萄藻-X09脂肪积累的方法，其特征在于较好的诱导条件是在超声频率15-30kHz、功率3-7w、处理时间15-40s/次的条件下处理2-3次，每次时间间隔为10s，然后向微藻培养液中通入CO₂、并调整加入溶液A、氯化钠和硫酸亚铁的浓度，诱导培养2天，再以12-20kHz的频率，2-5w的功率，处理1-2次，每次时间间隔为10s，处理时间5-20s/次，共诱导培养4天。

8.如权利要求3所述的高效诱导布朗葡萄藻-X09脂肪积累的方法，其特征在于在诱导脂肪积累培养时，向微藻培养液中通入CO₂的浓度为2％-6％、流量为0.5-2.5L/min，每天补充的溶液A为0.01-0.1ml/L、氯化钠为4.68-8.78g/L、硫酸亚铁为100-200mg/L。

9.如权利要求3所述的高效诱导布朗葡萄藻-X09脂肪积累的方法，其特征在于向微藻培养液中通入的CO₂优选浓度为3％-6％、流量为0.8-1.5L/min，优选每天补充的溶液A 0.01-0.05ml/L、氯化钠5.07-7.02g/L、硫酸亚铁120-180mg/L。

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