CN110817971A - 一种多金属氧酸盐及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种式(I)所示的多金属氧酸盐，本发明提供的多金属氧酸盐具有很好的水溶性以及抗肿瘤活性，本发明提供的多金属盐酸盐对HeLa和HepG2细胞具有抑制作用，其IC₅₀分别为11.4、18.4μmol·L^‑1。而且，本发明提供的式(I)化合物的制备方法简单，晶体生长条件不苛刻，适合工业化生产。

Description

一种多金属氧酸盐及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种多金属氧酸盐及其制备方法和应用。

背景技术

近几年来，恶性肿瘤已成为当今世界严重危害人类生命健康的常见病和多发病之一，其发病率呈逐年增高的趋势，据世界卫生组织报道，到2020年全球肿瘤发病率将上升50％，因此恶性肿瘤的研究与防治已成为相关领域科学家共同研究的课题。但临床使用的多数抗肿瘤化学药物仍有效率低，选择性差，毒副反应大及肿瘤细胞耐药等缺点。基于这样的情况，寻找新型的抗肿瘤作用强、抗瘤谱广、且毒性小的抗肿瘤药物将是目前国内外关注的热点以及肿瘤药物治疗的主体。

多金属氧酸盐(Polyoxometalates，POMs)又称多酸，包括杂多酸和同多酸，是由d⁰组态的过渡金属离子与氧高度聚合形成的具有空间网络结构的金属-氧簇合物，其抗肿瘤作用研究已有三十多年的历史，具有抗肿瘤作用谱较广、对肿瘤细胞均有一定抑制作用的优点，某些种类的多酸在抑瘤效果上较之现在市售的商品药物更令人满意。尽管POMs类化合物具有一定的抗肿瘤活性，但现有化合物在溶解性、药物活性和细胞内靶点特异性方面还不尽如人意，在医学上的应用仍远远落后于顺铂类等抗肿瘤药物。因此，通过POMs结构的改进和基团修饰，合成不同结构及特性的新分子，改善多酸在生理条件下的稳定性，增强其生物活性，提高其抗肿瘤活性具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种多金属氧酸盐及其制备方法和应用，本发明提供的多金属氧酸盐具有很好的抗肿瘤活性。

本发明提供了一种多金属氧酸盐，具有式(I)所示的分子式，

Na₆Co₃(H₂O)₃₀(OH)₂[H₂W₁₂O₄₂]·4H₂O 式(I)。

优选的，所述式(I)所示的多金属氧酸盐的结构为金属离子Na⁺、Co²⁺通过配位键与[H₂W₁₂O₄₂]^10-连接形成了三维网络结构。

本发明提供了一种多金属氧酸盐的制备方法，包括：

将含钨酸钠的缓冲溶液、硫酸钴水溶液和吗啉混合反应，得到式(I)所示的多金属氧酸盐，

Na₆Co₃(H₂O)₃₀(OH)₂[H₂W₁₂O₄₂]·4H₂O 式(I)。

优选的，所述含钨酸钠的缓冲溶液中钨酸钠的浓度为5～9mg/mL。

优选的，溶液的pH值为4.2～5.2。

优选的，所述硫酸钴水溶液的浓度为15～20mg/mL。

优选的，所述混合反应的温度为40～60℃。

优选的，所述反应的时间为10～25min。

本发明还提供了一种本发明所述的多金属氧酸盐或者本发明所述的制备方法制备的多金属氧酸盐在制备抗癌药物中的应用。

优选的，所述抗癌药物为抗宫颈癌药物或抗肝癌药物。

与现有技术相比，本发明提供了一种式(I)所示的多金属氧酸盐，本发明提供的多金属氧酸盐具有很好的水溶性以及抗肿瘤活性，实验结果表明，本发明提供的多金属盐酸盐对HeLa和HepG2细胞具有抑制作用，其IC₅₀分别为11.4、18.4μmol·L^-1。而且，本发明提供的式(I)化合物的制备方法简单，晶体生长条件不苛刻，适合工业化生产。

附图说明

图1为多金属氧酸盐的晶体结构；

图2为多金属盐酸盐形成的一维链状结构图；

图3为多金属盐酸盐形成的二维链状结构图；

图4为多金属盐酸盐形成的三维链状结构图；

图5为本发明得到的多金属盐酸盐的红外光谱图；

图6为式(I)结构的多金属氧酸盐与ct DNA相互作用的紫外吸收光谱图；

图7为式(I)结构的多金属氧酸盐与BSA相互作用的紫外光谱图；

图8为倒置显微镜下观察Hela细胞形态改变的结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种多金属氧酸盐，具有式(I)所示的分子式，

Na₆Co₃(H₂O)₃₀(OH)₂[H₂W₁₂O₄₂]·4H₂O 式(I)。

本发明中，所述式(I)所示的多金属氧酸盐的结构为金属离子Na⁺、Co²⁺通过配位键与[H₂W₁₂O₄₂]^10-连接形成了三维网络结构，颜色为粉红色；通过X-射线晶体学研究表明，化合物Na₆Co₃(H₂O)₃₀(OH)₂[H₂W₁₂O₄₂]·4H₂O由仲钨酸盐-B阴离子[H₂W₁₂O₄₂]^10-，Co²⁺，Na⁺和结晶水组成；价键计算(BVS)得出仲钨酸阴离子中，W原子的价态平均值为6.09，O原子的价态平均值为-1.949，其中O5为-1.453，O13为-1.245，化合价明显偏低，说明O5与O13被质子化了。在式(I)结构的多金属氧酸盐中一个仲钨酸盐-B阴离子[H₂W₁₂O₄₂]^10-与6个Co、4个Na相连。结构中存在2种环境的配位Co：Co1八面体中的三个氧原子来自两个相邻的仲钨酸盐-B阴离子[H₂W₁₂O₄₂]^10-，而剩余三个配位点被水分子占据；Co3八面体中的两个氧原子来自两个相邻的仲钨酸基团，同时和四个水分子配位。另外，结构中存在2种环境的配位Na，Na2与来自多酸簇的1个端氧及来自结晶水的5个氧配位；Na3与来自多酸簇的1个端氧、来自结晶水的4个氧配位，并与Co3共用一个氧。

本发明提供的式(I)所示的多金属氧酸盐，该多金属氧酸盐具有很好的抗肿瘤活性，对HeLa和HepG2细胞均具有抑制作用。

本发明还提供了一种多金属氧酸盐的制备方法，包括：

将含钨酸钠的缓冲溶液、硫酸钴水溶液和吗啉混合反应，得到式(I-a)或式(I)所示的多金属氧酸盐，

Na₆Co₃(H₂O)₃₀(OH)₂[H₂W₁₂O₄₂]·4H₂O 式(I)。

按照本发明，本发明将本发明提供了一种式(I)所示的多金属氧酸盐，该多金属氧酸盐具有很好的水溶性以及抗肿瘤活性，其可以溶于冷水，且对HeLa、SKOV-3、HepG2、SHY5Y细胞均具有抑制作用；其中，所述含钨酸钠的缓冲溶液中钨酸钠的浓度优选为5～9mg/mL，更优选为7～8mg/mL；所述含钨酸钠的缓冲溶液的pH值优选为4.20～5.20，更优选为4.72～5.08；所述硫酸钴水溶液的浓度优选为15～20mg/mL，更优选为16～18mg/mL；所述混合反应的温度优选为40～60℃，更优选为50～55℃；所述反应的时间优选为10～25min，更优选为15～20min；本发明中，为了是反应更顺利的进行，本发明优选将硫酸钴水溶液滴加到含钨酸钠的缓冲溶液中，然后滴加吗啉溶液，得到混合溶液，将混合溶液反应，得到多金属氧酸盐。

本发明中，所述混合反应完毕后，优选还将反应液调节pH值至3.20～4.80，析晶，得到式(I)所示的多金属氧酸盐，其中，所述pH值优选为3.40～4.60，更优选3.60～4.30，最优选3.80～4.10；所述调节pH值用酸优选为稀硫酸或稀盐酸。

本发明提供的式(I)化合物的制备方法通过选择特定的pH值的原料物质的水溶液，进而使得混合溶液析晶得到式(I)所示的化合物，该制备方法简单，原料易得，工艺条件可控，可实现规模化生产。

本发明还提供了一种本发明所述的式(I)结构的多金属氧酸盐在制备抗癌药物中的应用；其中，所述抗癌药物优选为抗宫颈癌药物或抗肝癌药物。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

0.35gNa₂WO₄·2H₂O溶于50ml缓冲溶液中，得到溶液pH为4.72；

0.5gCoSO₄溶于30ml水中。边搅拌边将CoSO₄溶液滴加到Na₂WO₄溶液中，滴加30滴吗啉溶液，50℃条件下加热15分钟，冷却，调节pH值在4.7～5.1之间，放置十多天后，长出粉红色块状单晶，即为式(I)结构的多金属氧酸盐。

对得到的粉红色块状单晶的结构进行鉴定，结果如下：

用Bruker Smart CCD Apex(II)衍射仪对得到的产物的结构进行鉴定，具体的，采用

室温296K，θ范围：2.60＜θ＜28.28°。应用经验吸收校正。共收集8597个衍射数据(独立衍射点7860，R_int＝0.451)，hk1值范围：-10≤h≤10，-10≤k≤10，-10≤1≤12。式(I)结构的多金属氧酸盐的晶体学数据及结构精修如表1所示：

表1 式(I)结构的多金属氧酸盐的晶体学数据及结构精修

a：R1＝∑||F_o|-|F_c||/∑|F_o|，b：wR2＝{∑[w(F_o ²-F_c ²)²]/∑[w(F_o ²)²]}^0.5

通过X-射线晶体学研究表明，化合物

Na₆Co₃(H₂O)₃₀(OH)₂[H₂W₁₂O₄₂]·4H₂O由仲钨酸盐-B阴离子[H₂W₁₂O₄₂]^10-，Co²⁺，Na⁺和结晶水组成，该化合物中的多阴离子[H₂W₁₂O₄₂]^10-通过与金属Na⁺、Co²⁺的配位键连接形成了三维网络结构。结构如图1，图1为多金属氧酸盐的晶体结构。

价键计算(BVS)得出仲钨酸阴离子中，W原子的价态平均值为6.09，O原子的价态平均值为-1.949，其中O5为-1.453，O13为-1.245，化合价明显偏低，说明O5与O13被质子化了。在式(I)结构的多金属氧酸盐中一个仲钨酸盐-B阴离子[H₂W₁₂O₄₂]^10-与6个Co、4个Na相连。结构中存在2种环境的配位Co：Co1八面体中的三个氧原子来自两个相邻的仲钨酸盐-B阴离子[H₂W₁₂O₄₂]^10-，而剩余三个配位点被水分子占据；Co3八面体中的两个氧原子来自两个相邻的仲钨酸基团，同时和四个水分子配位。另外，结构中存在2种环境的配位Na，Na2与来自多酸簇的1个端氧及来自结晶水的5个氧配位；Na3与来自多酸簇的1个端氧、来自结晶水的4个氧配位，并与Co3共用一个氧。

多酸簇通过两个Co1连接形成一维链(见图2，图2为多金属盐酸盐形成的一维链状结构图)，每两个多酸簇之间连接一个Co3，通过Co3连接形成二维网(见图3，图3为多金属盐酸盐形成的二维链状结构图)，每层之间由三个钠簇交错连接形成空间三维立体结构(见图4，图4为多金属盐酸盐形成的三维链状结构图)。

采用红外光谱对得到的多金属氧酸盐进行检测，结果如图5所示，图5为本发明得到的多金属盐酸盐的红外光谱图，从图1可以看出，多金属氧酸盐在红外光谱中1076.0cm^-1、942.2cm^-1、868.7cm^-1、843.8cm^-1、705.6cm^-1处出现的特征峰可分别归属于多酸阴离子(νW＝O_d)，ν(W-O_t)，ν(W-O_b)，ν(W-O_c)，(νW-O_c-W)的振动，在3456cm^-1、3416.7cm^-1处的峰为水分子的特征峰。

实施例2

1)式(I)结构的多金属氧酸盐与ct-DNA的相互作用

称取0.4mg ct-DNA溶于50ml PBS(pH＝7.4)缓冲溶液中，用紫外光谱检测吸光度值并按需要稀释至一定浓度，测量260nm和280m处的吸光值：A₂₆₀/A₂₈₀≈1.8，说明实验试剂基本不含蛋白质，符合实验要求。多金属氧酸盐由水溶液配成约2×10^-5M的溶液，在190-800nm范围内扫描全波长，间隔设为1nm，速度为快速进行全扫描。然后用PBS缓冲液稀释到所需浓度，以PBS缓冲液作为空白液，用移液枪向10ml容量瓶中加入3mlct-DNA溶液和不同浓度的多金属氧酸盐，摇匀，恒温静止15min后测量。检测加入不同浓度的多金属氧酸盐时的紫外光谱的变化。

结果见图6，图6为式(I)结构的多金属氧酸盐与ct-DNA相互作用的紫外吸收光谱图，从图中可以看出，式(I)结构的多金属氧酸盐的紫外吸收光谱在192nm处有一吸收峰，随着DNA的逐滴加入，吸收峰逐渐上升，出现增色效应，说明式(I)结构的多金属氧酸盐与ctDNA之间的相互作用是静电作用或沟槽作用，而并非插入性结合作用。

2)式(I)结构的多金属氧酸盐与BSA的相互作用

用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液按一定比例配制成pH＝7.4的PBS磷酸盐缓冲溶液；精密称取BSA，转移至50ml容量瓶中，PBS缓冲液定容，配制的BSA储备液浓度为1.0×10^{- 4}mol/L(牛血清白蛋白的浓度由66kDa的分子量计算)，密封置于4℃环境中保存。在实验期间取0.5ml储备液稀释至5×10^-6mol/L的浓度用。称量一定量的多金属氧酸盐于烧杯中，加蒸馏水溶解后转移至50ml的容量瓶中以制备浓度约为2×10^-5mol/L的储备溶液。在5个10ml容量瓶中分别加入2ml多金属氧酸盐溶液；0.5ml的BSA储备液；0.5ml的BSA储备液和2ml化合物溶液；0.5ml的BSA储备液和4ml化合物溶液；0.5ml的BSA储备液和6ml化合物溶液，最后都使用pH＝7.4的PBS缓冲溶液来定容。以PBS溶液为空白，在紫外-可见分光光谱仪上扫描紫外光谱。每加完一次BSA与化合物溶液之后应摇匀并静置等待作用15min反应完全后，再进行图谱扫描。

结果见图7，图7为式(I)结构的多金属氧酸盐与BSA相互作用的紫外光谱图，从图中可以看出，在室温下，以PBS(pH＝7.4)缓冲溶液做为参比，在190～700nm波长范围内，分别测定浓度为为1.25μM的多酸化合物溶液、BSA溶液以及与BSA物质的量比为1∶1溶液的紫外-可见吸收光谱。从图7可以看出：BSA在210nm处有较强的紫外吸收峰，化合物加入体系后，BSA的紫外吸收峰升高，表明式(I)结构的多金属氧酸盐与BSA发生了相互作用。

3)式(I)结构的多金属氧酸盐的体外抗肿瘤性质

(3-1)MTT法测肿瘤细胞活力

选择人宫颈癌细胞(HeLa)和人肝癌细胞(HepG2)对化合物的增殖抑制活性进行了研究。用标准培养基培养细胞，CO₂细胞培养箱孵育细胞，每2～3d换液1次。细胞呈单层生长到70％～90％即可进行细胞传代。把对数生长期的肿瘤细胞调成密度为1×10⁵/ml，在96孔培养板中每孔加入200μL密度为1×10⁵/ml的肿瘤细胞悬液，在37℃、5％CO₂条件下培养，24h后把肿瘤细胞分成空白对照组及实验组(浓度为0.1、1、10、20、50及100μmol·L^-1的式(I)结构的多金属氧酸盐共6组)两大组，用培养基稀释液分别培养24h。培养结束每孔加入新鲜配制的MTT溶液20μL，温育4小时使MTT还原为甲瓒，当在倒置显微镜下看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体时倒掉上清液，每孔加DMSO 150μL震荡溶解细胞，用平板摇床摇匀后，使用酶标仪测定光密度值(OD)(检测波长570nm)。按以下公式计算增殖抑制率：增殖抑制率＝[1-药物试验组吸光度值/对照组吸光度值]×100％。重复试验3次，取平均值。

MTT比色试验结果

如表2和表3所示，与对照组比较，不同浓度的式(I)结构的多金属氧酸盐可使Hepg2和Hela细胞的OD值减小，表明式(I)结构的多金属氧酸盐对Hepg2和Hela细胞的增殖均有抑制作用，且随着浓度的增加细胞的存活率下降，具有药物剂量依赖性，IC₅₀分别为18.4μmol/L，11.4μmol/L。

表2 不同浓度式(I)结构的多金属氧酸盐处理Hepg2肿瘤细胞24h后OD值、抑制率和IC₅₀

表3 不同浓度式(I)结构的多金属氧酸盐处理Hela肿瘤细胞24h后OD值、抑制率和IC₅₀

(3-2)细胞凋亡的形态学观察

不同浓度的式(I)结构的多金属氧酸盐对Hela肿瘤细胞形态学的影响见图8。图8为倒置显微镜下观察Hela细胞形态改变的结果图，其中，a：对照组；b：o.1μmol·L^-1；c：1μmol·L^-1；d：10μmol·L^-1；e：50μmol·L^-1；f：100μmol·L^-1式(I)结构的多金属氧酸盐处理，从图中可以看出，分别用0.1μmol·L^-1、1μmol·L^-1、10μmol·L^-1、50μmol·L^-1及100μmol·L^-1浓度的式(I)结构的多金属氧酸盐处理肿瘤24h后，结果显示正常对照组的肿瘤细胞紧贴瓶底，细胞密集，细胞间连接紧密，呈有规则的多边形，细胞触角较短，圆形细胞少。化合物处理后，细胞较为稀疏，附壁疏松，脱壁，细胞变圆。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种多金属氧酸盐，具有式(I)所示的分子式，

Na₆Co₃(H₂O)₃₀(OH)₂[H₂W₁₂O₄₂]·4H₂O 式(I)。

2.根据权利要求1所述的多金属氧酸盐，其特征在于，所述式(I)所示的多金属氧酸盐的结构为金属离子Na⁺、Co²⁺通过配位键与[H₂W₁₂O₄₂]^10-连接形成了三维网络结构。

3.一种多金属氧酸盐的制备方法，包括：

将含钨酸钠的缓冲溶液、硫酸钴水溶液和吗啉混合反应，得到式(I)所示的多金属氧酸盐，

Na₆Co₃(H₂O)₃₀(OH)₂[H₂W₁₂O₄₂]·4H₂O 式(I)。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述含钨酸钠的缓冲溶液中钨酸钠的浓度为5～9mg/mL。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述含钨酸钠的缓冲溶液的pH值为4.2～5.2。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸钴水溶液的浓度为15～20mg/mL。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述混合反应的温度为40～60℃。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为10～25min。

9.一种权利要求1～2任意一项所述的多金属氧酸盐或者权利要求3～8任意一项所述的制备方法制备的多金属氧酸盐在制备抗癌药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物为抗宫颈癌药物或抗肝癌药物。

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